Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Индукция гепатоцитарной дифференцировки клеток слюнной железы мыши

ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Индукция гепатоцитарной дифференцировки клеток слюнной железы мыши"

На правах рукописи

ПЕТРАКОВА ОЛЬГА СЕРГЕЕВНА

ИНДУКЦИЯ ГЕПАТОЦИТАРНОЙ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ КЛЕТОК СЛЮННОЙ ЖЕЛЕЗЫ МЫШИ

03.03.04 — клеточная биология, цитология, гистология

3 1 ОКТ 2013

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2013

005536562

Работа выполнена в лаборатории проблем клеточной пролиферации Федерального государственного бюджетного учреждения науки «Института биологии развития имени Н.К. Кольцова» Российской академии наук

Научный руководитель: доктор биологических наук

Васильев Андрей Валентинович ФГБУН «Институт биологии развития имени Н.К. Кольцова» РАН, заместитель директора по научной работе

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Макарова Ольга Васильевна ФГБУ «НИИ морфологии человека» РАМН, заместитель директора по научной работе, зав. лабораторией иммуноморфологии воспаления

доктор биологических наук, профессор Егоров Егор Евгеньевич ФГБУН «Институт молекулярной биологии имени В.А. Энгельгардта» РАН, в.н.с. лаборатории молекулярной кариологии и основ клеточной терапии

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

учреждение науки «Институт цитологии» Российской академии наук.

Защита состоится 19 ноября 2013 г. в 15 часов 30 минут на заседании диссертационного совета Д 501.001.52 при Московском Государственном Университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119234, Москва, Ленинские горы, д.1, стр.12, Биологический факультет МГУ, ауд. М-1. Факс:8(495)939-17-46; e-mail: dis_kalsov@mail.ru

С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета Московского Государственного Университета имени М.В. Ломоносова

Автореферат разослан »

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук Е.Н. Калистратова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Актуальной проблемой современной клеточной биологии является изучение пластичности клеточного фенотипа и возможностей дифференцировки клеток в пределах одного зародышевого листка. Интерес клеточных биологов к in vitro дифференцировке клеток обусловлен тем, что данный процесс может помочь в решении ряда фундаментальных и прикладных задач, таких как установление гистогенетического родства различных клеточных типов, изучение регуляторных генных путей, in vitro моделирование болезней, тестирование лекарств, получение целевых клеток в достаточном для заместительной клеточной терапии количестве. Понимание молекулярно-генетических механизмов, которые задействованы при дифференцировке в те или иные типы клеток, поможет повысить эффективность дифференцировки и избежать потенциальных негативных эффектов.

С наибольшей эффективностью дифференцировка клеток осуществляется в пределах одного зародышевого листка. Что касается энтодермального зародышевого листка, то на данный момент накопилось много сведений о дифференцировке прогениторных клеток печени и поджелудочной железы как in vitro, так и in vivo (Yi et al., 2012). Однако печень и поджелудочная железа являются малодоступными источниками клеток. В то же время сложность терапии печени и недостаток донорских органов обусловливают поиск новых альтернативных источников клеток. Поднижнечелюстная слюнная железа имеет смешанное эктодермально-энтодермальное происхождение (Okumura et al., 2003; Larsen et al., 2010). Между ацинусом и начальной частью гранулярного протока слюнной железы располагается ниша, содержащая факультативные прогениторные клетки (Van Keymeulen et al., 2011; Okumura et al., 2012), имеющие энтодермальное происхождение (Tsuji, Nagai, 1993). Доступность клеточного материала слюнной железы делает этот источник клеток перспективным для дальнейшего изучения (Шубникова, Погодина, 2000; Baek et al., 2012), поднижнечелюстная слюнная железа может стать удобным источником энтодермальных клеток для заместительной терапии патологий печени. Однако на данный момент отсутствуют подробные сведения об экспрессии ключевых регуляторных генов в клетках слюнной железы и молекулярно-генетических механизмах, ответственных за дифференцировку этих клеток, не разработаны оптимальные дифференцировочные протоколы.

Все изложенное выше определило цель и задачи исследования.

Цель работы: изучить способность протоковых клеток поднижнечелюстной слюнной железы мыши к дифференцировке в гепатоцитарном направлении in vitro для исследования фенотипической пластичности клеток в пределах энтодермального зародышевого листка.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Разработать методы культивирования клеток поднижнечелюстной слюнной железы и прогениторных клеток печени мыши и провести сравнительную характеристику культуры клеток слюнной железы и прогениторных клеток печени.

2. Провести сравнительный анализ культур клеток слюнной железы и прогениторных клеток печени по экспрессии ключевых для гепатоцитарной дифференцировки регуляторных факторов и маркеров методами ПЦР-РВ и анализом профилей экспрессии генов глубоким секвенированием в масштабах целого транскриптома.

3. Разработать программу дифференцировки культуры клеток слюнной железы мыши в гепатоцитарном направлении. Проанализировать степень гепатоцитарной дифференцировки клеток слюнной железы мыши методами ПЦР-РВ и иммуноцитохимии, а также определить функциональную активность полученных клеток в сравнении с прогениторными клетками печени в 3D условиях культивирования.

4. Изучить влияние деметилирующих агентов на экспрессию ключевых для гепатоцитарной дифференцировки регуляторных генов и маркеров. Проанализировать влияние деметилирующих агентов на гепатоцитарную дифференцировку клеток слюнной железы.

Научная новизна.

Впервые поведен сравнительный анализ экспрессии регуляторных генов и маркеров культуры клеток поднижнечелюстной слюнной железы и печени мыши, детально исследована экспрессия генов, характерных для протоковых клеток слюнной железы, проанализировано около 29000 мРНК транскриптов. Впервые обнаружена экспрессия маркера адгезии эпителиальных клеток ЕрСАМ в клетках слюнной железы.

Показано, что клетки поднижнечелюстной слюнной железы имеют значительное сходство с другими типами энтодермальных клеток, экспрессируют ряд маркеров прогениторных клеток (ЕрСАМ, CD90, CD133, Sca-1, c-Kit), а также маркеры, характерные для клеток печени ALB, AFP, СК19 и c-Met. Культура клеток поднижнечелюстной слюнной железы экспрессирует мРНК ранних маркеров энтодермы Hnf-За и Sox9.

После дифференцировки клетки слюнной железы, подобно гепатоцитам, приобретают способность к синтезу мочевины. Вальпроевая кислота, являющаяся деметилирующим агентом, способна увеличить специфичность и эффективность гепатоцитарной дифференцировки клеток поднижнечелюстной слюнной железы.

Практическая значимость.

Результаты, полученные в данном исследовании, могут быть использованы для оптимизации протоколов дифференцировки энтодермальных клеток из предшественников, для выяснения гистогенетического родства энтодермальных клеток и для уточнения их происхождения. Полученные результаты делают возможным разработку принципиально новых методов получения энтодермальных клеток для регенеративной медицины.

Апробация диссертации.

Материалы диссертации доложены и обсуждены на: Конференциях молодых ученых ИБР РАН (Москва, 2010, 2011); IV Всероссийской научной школе-конференции «Стволовые клетки и регенеративная медицина» (Москва, 2011); III Конференции «Биология стволовых клеток: фундаментальные аспекты» (Москва, 2011).

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ, из них статей в журналах, соответствующих Перечню ВАК - 2, тезисов докладов и материалов конференций - 3, получены положительные решения о выдаче 2 патентов.

Личное участие автора.

Анализ литературы, планирование работы, сбор материала, отработка методик, постановка и выполнение экспериментов, обработка и интерпретация результатов выполнены непосредственно автором. Автор лично участвовал в апробации результатов исследования, подготовке и написании основных публикаций по выполненной работе.

Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа изложена на 145 страницах, содержит 23 рисунка, 10 таблиц и состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 195 цитируемых источника, приложения.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Животные. В работе использовали самцов мышей линии C57BL/6 в возрасте 12-20 недель, полученных из питомника лабораторных животных «Пущино». Животных содержали в стандартных условиях со свободным доступом к пище и воде. Все процедуры были проведены согласно правилам, установленным комиссией по биоэтике ИБР РАН. При работе с животными руководствовались приказом Минздрава РФ №267 от 19.06.2003 г.

Выделение и культивирование клеток слюнной железы и печени мыши. Под глубоким хлороформным наркозом у животных извлекали слюнные железы и печень, переносили в пробирки со средой DMEM/F12 1:1 (Gibco) и 40 мкг/мл гентамицина. Стерильными глазными ножницами измельчали органы на кусочки размером около 2x2 мм, дважды промывали PBS и проводили ферментативную обработку 4 мг/мл раствором коллагеназы IV типа (Sigma) в течение 30 - 40 мин при 37°С. Суспензии клеток пипетировали и пропускали через фильтр с диаметром пор 40 мкм. Клетки дважды промывали средой, центрифугировали 2 мин при 100 g, затем ресуспендировали в полной среде, содержащей: DMEM/F12 1:1, 10% FBS (HyClone), 2 мМ глутамина (Gibco), 1% ITS (Invitrogen) и 10 нг/мл EGF (Invitrogen). Клетки культивировали на покрытых коллагеном I типа культуральных чашках (Corning) в стандартных условиях при 37°С и 5% СОг. После достижения конфлуентного слоя, клетки пассировали в соотношении 1:3 с использованием 0,25% трипсина (РАА), среду меняли каждые 3 дня.

Иммуноцитохимия. Клетки фиксировали 4% ПФА 10 мин, промывали PBS с 0,1% тритоном Х100 и проводили блокировку 1% BSA в PBS в течение 30 мин. С первичными антителами инкубировали в PBS 60 мин при 37°С в разведении 1:200 - 1:500. Отмывали 3 раза по 10 мин в PBS при 37°С. С вторичными антителами инкубировали в PB S (разведение 1:1000) в течение 40 мин при 37°С. Отмывали 3 раза по 10 мин, добавляя во время последней

отмывки DAPI (Sigma). Анализировали под флуоресцентным микроскопом Olympus 1X51.

Проточная цитофлуориметрия. Моноклеточную суспензию клеток инкубировали с антителами в разведении 1:500 - 1:1000 в течение 60 мин. Отмывали 3 раза по 10 мин в PBS и фиксировали 1% ПФА 5 мин. Промывали 10 мин PBS, ресуспендировали в 1 мл PBS. Анализировали с помощью проточного цитофлуориметра Cell Lab Quanta™ (Beckman Coulter) не менее 10000 клеток на пробу.

Выделение тотальной РНК и ПЦР-РВ. Выделение тотРНК из клеток проводили с помощью набора AllPrep DNA/RNA Mini Kit (Qiagen) по инструкциям производителя. Определение концентрации тотРНК осуществляли на минифлуориметре Qubit с помощью RNA Assay Kit (Invitrogen). Для обратной транскрипции использовали Superscript II (Invitrogen) со случайными праймерами по инструкциям производителя. В реакцию брали 500 нг тотРНК. ПЦР-РВ проводили с помощью набора с красителем EVA Green (Синтол) на приборе CFX96 (BioRad). Условия реакции: предварительная инкубация при 95°С 5 мин для активации ДНК-полимеразы и 40 циклов: денатурация при 95°С 30 сек; отжиг при 57- 59°С 30 сек; элонгация при 72°С 45 сек. Детекцию флуоресценции в канале Fam и первичную обработку результатов осуществляли программным обеспечением прибора в автоматическом режиме. В качестве внутреннего стандарта для вычисления концентрации всех мРНК использовали мРНК гена домашнего хозяйства GAPDH.

Анализ профилей экспрессии генов с помощью глубокого секвенирования. Выделение мРНК, синтез кДНК и подготовку библиотек для глубокого секвенирования проводили с помощью наборов mRNA Sequencing Sample Preparation Kit (Illumina), NEBNext mRNA Library Preparation Reagent Set for Illumina (New England Biolabs), QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen) и MinElute Gel Extraction Kit (Qiagen), согласно инструкциям производителей. Формирование кластеров фрагментов кДНК и секвенирование осуществляли с помощью наборов реагентов (Illumina) по инструкциям производителя на кластерной станции и секвенаторе GAIIx. Проводили одноконцевое чтение транскриптомной библиотеки, длина чтений составляла 72 нуклеотида. Управление процессом и обработку данных проводили с помощью ПО SCS v. 2.10/RTA1.8 (Illumina). В результате были получены чтения в формате FASTQ. Процедура обработки данных включала в себя следующие этапы: 1) Фильтрация по качеству. Все чтения были отфильтрованы по качеству с помощью программы fastq_quality_filter. Чтения проходили фильтр, если все буквы чтения имели качество не ниже 25. 2) Выравнивание на транскриптом мыши (ftp://ftp.ncbi.nih.gov/genomes/M_musculus/RNA/).

Индукция гепатоцитарной дифференцнровки для клеток слюнной железы. Клетки слюнной железы на первом пассаже переводили на гепатоцитарную ростовую среду. Состав гепатоцитарной ростовой среды: DMEM/F12 + 10% FBS; + 1% GlutaMax; + 1% ITS; + 0,03 мМ Nicotinamide; + 20 нг/мл HGF; + 20 нг/мл EGF. Дифференцировку вели в двух вариантах: в первом варианте в течение первых 5 дней клетки обрабатывали деметилирующим агентом - 1 мМ вальпроевой кислотой (УРА). Во втором варианте клетки не

подвергали воздействию VPA. По истечении 5 дней VPA удаляли и далее клетки обоих вариантов дифференцировали по одинаковой схеме: 5 дней инкубировали с 20 нг/мл ВМР2; с 11 по 15 день клетки культивировали с добавлением 10 нг/мл OSM и 0,1 мкМ дексаметазона; последующие 5 дней к клеткам добавляли факторы N2 и В27 до 1%. На 20-й день клетки подвергали анализу в 2D и 3D условиях культивирования.

Приготовление коллагенового геля. Коллаген I типа растворяли в стерильной 0,1% уксусной кислоте до концентрации 5 мг/мл. В отдельную пробирку добавляли компоненты в очередности: NaOH (Sigma) до концентрации 0,023мМ, Na2C03 (ПанЭко) до 0,26%, 10х DMEM (Sigma) до 1х, 100% GlutaMax (Gibco) до 2мМ, 100% HEPES (Gibco) до 1%, FBS (HyClone) до 10%. Затем добавляли раствор коллагена до конечной концентрации 4%. Суспензию клеток в PBS вносили до концентрации клеток 1x10б на 1 мл геля. Гель инкубировали в чашках Петри при 37°С 30 мин, после полимеризации геля в чашки добавляли по 2 мл среды. Клетки в геле культивировали в С02 инкубаторе в стандартных условиях.

Определение уровня синтеза мочевины клетками. Концентрацию мочевины определяли в среде культивирования с помощью набора Urea Assay Kit (BioVision) по инструкциям производителя. Для клеток в 3D условиях культивирования пробы отбирали на1,5,10и15 день инкубации клеток в геле. За 24 часа до взятия пробы производили замену среды. Количество мочевины определяли по интенсивности хромогенной реакции на планшетном ридере Start Fax 2100 (Awareness Technology Inc).

Статистическая обработка данных. Все эксперименты проводили в трех повторах на клетках от трех разных животных. Каждая процедура была проведена в трех технических повторах, осуществляемых в одинаковых условиях. При оценке достоверности различий показателей использовали t-критерий Стьюдента. Различия считали статистически достоверными, если уровень значимости был р<0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Морфологическая характеристика культур клеток слюнной железы и печени. После выделения прогениторные клетки печени (ПКП) прикреплялись к покрытому коллагеном I типа пластику на 1 -2 день культивирования, клетки слюнной железы (КСЖ) — на 2-3 день. По морфологии прикрепившиеся клетки были полигональными, одноядерными, имели небольшой размер (7-11 мкм) и высокое ядерно-цитоплазматическое соотношение. На 4-5 день происходило формирование плотных колоний, монослой формировался на 6-7 день (рис. 1А, 1Б). На данном этапе клетки, полученные из печени и слюнной железы, были практически неотличимы визуально. На 10-15 день культивирования отмечалась гетерогенность клеток в культуре: КСЖ и ПКП образовывали группы мелких не дифференцированных активно делящихся клеток и более крупных многоядерных (рис. 1В, 1Г). Время удвоения клеточной популяции составило около 42 часов для КСЖ и 63 часа для ПКП. Клетки были способны проходить более 20 пассажей (далее пассирование не проводили).

КСЖ при культивировании способны к дифференцировке в ацинарном и протоковом направлениях (Гвазава с соавт., 2011). По всей видимости, обнаруженные нами крупные многоядерные клетки в культуре КСЖ, представляют собой дифференцированные клетки, возникающие в культуре de novo. Sato et al. (2007) провели субклонирование прогениторных клеток слюнной железы человека. Были получены культуры, являющиеся потомками одной клетки. При последующем культивировании в этих культурах возникала гетерогенность: появлялись кластеры крупных клеток, слабо окрашиваемых антителами к инсулину и глюкагону. Таким образом, прогениторные клетки слюнной железы в культуре проявляют способность к спонтанной дифференцировке.

Рис. 1. Морфология КСЖ и ПКП, фазовый контраст, длина

мерного отрезка — 100 мкм. А) КСЖ; Б) ПКП -монослойная культура, нулевой пассаж; В) КСЖ; Г) ПКП -монослойная культура, первый пассаж -образование гетерогенности клеток: группы мелких активно пролиферирующих клеток (тонкие стрелки) и крупных

многоядерных клеток (толстые стрелки).

Нами установлено, что формирование кластеров дифференцированных клеток происходит при увеличении плотности посева культуры КСЖ. Подобные морфологические изменения отмечены также другими авторами при культивировании прогениторных клеток слюнной железы мыши и крысы (Окитига & а1., 2003; ЬПзаШгш <?/ а!., 2004). По мере увеличения числа пассажей способность образовывать крупные многоядерные клетки снижается. Аналогичные изменения были обнаружены при культивировании КСЖ крысы (ВаекеГа/., 2012).

2. Иммуноцитохимическая характеристика культуры клеток слюнной железы в сравнении с прогениторными клетками печени.

Иммунофенотипирование клеток проводили на первом пассаже. В обеих культурах обнаружена высокая экспрессия цитокератинов (СК) 8 и 18, характерных для железистого эпителия энтодермального происхождения, а также СК19, экспрессирующегося в прогениторных клетках (рис. 2). Клеточная локализация СК8 и СК18 была одинакова в изучаемых культурах, тогда как для СК19 наблюдались различия. В ПКП СК19 локализовался около ядра, для КСЖ помимо этого была характерна локализация под клеточной мембраной. КСЖ

■■ . - -■ - * - ч' " V Г, ■А ■\'> ■ • ■ * I. '■?. ■! *ЙЙ»' Ф sr • '¿¡>1 - л - , - - ■ р </. • ' - - ; шттттшт í-síá^fc-siíísáte« - i.-;-. ■ _ ь . -.S -Р-^.'- : У.. •„••"• - ..-^мл. ■ ш " * ■ ' •¡••-..„■-.г... <<•.. .у-у" у:-' -У.;. Ул' л ■ '* —-—

■> ' .. - v. у ..-< " - - ; . —»- ■ •: . V '. í - - '' -г- • -iT-;. 'Л ШШ^- - г - |И ¿ ■■ '-V'A •>• .. ■ - ч v:.-;. ч' Í 'У •■Л-.-." у,-;4 - • . "■' .?■ " " vi ' i, . ■ ' ■ . . -mm ' : • if J, 4 x^ ^ & -'-cb.

» i .. •■•!■- . . 4 . .

окрашивались антителами к СК14, который характерен для клеток, ассоциированных с базальной мембраной, и к СТ)4(Я, который характерен для протоковых клеток и представляет собой субъединицу рецептора к ламинину. ПКП были отрицательны по этим маркерам (рис. 2).

A Iff HIB г -

д V -VV*:. - E Ні кз

« — К £'-' >j..* 4 v. л M

H 0 1 і * П ■ % * р • •• / • ^ * «'* •• -

Рис. 2. Иммуноцитохимия КСЖ и ПКП, флуоресцентная микроскопия. Ядра - DAPI антигены - Alexa Fluor 488, длина мерного отрезка - 100 мкм. А) КСЖ, СК8; Б) КСЖ, СК14 В) КСЖ, СК18; Г) КСЖ, СК19; Д) ПКП, СК8; Е) ПКП, СК14; Ж) ПКП, СК18; 3) ПКП, СК19 И) КСЖ, CD49f; К) КСЖ, ALB; Л) КСЖ, AFP; M) КСЖ, CYP Р450 1А1; H) ПКП, CD49f О) ПКП, ALB; П) ПКП, AFP; Р) ПКП, CYP Р450 1 AI.

А \ ' 4 % * • - ' • Г ' * , * Б В • • " . '* г

д ' ' » " » - " * ■ ч s Е ж 4 « •* • « • 3

и К л " ' ' ■ M

Рис. 3. Иммуноцитохимия КСЖ и ПКП, флуоресцентная микроскопия. Ядра - DAP1, антигены - Alexa Fluor 488 или Alexa Fluor 546, длина мерного отрезка - 100 мкм. А) КСЖ, Hnf-ЗР, Alexa Fluor 488; Б) КСЖ, Hnf-3p, DAPI; В) КСЖ, Hnf-4a, Alexa Fluor 488; Г) КСЖ, Hnf-4a, DAPI; Д) ПКП, Hnf-3p, Alexa Fluor 488; E) ПКП, Hnf-ЗР, DAPI; Ж) ПКП, Hnf-4a, Alexa Fluor 488; 3) ПКП, Hnf-4a, DAPI; И) КСЖ, NGF; К) КСЖ, инсулин; Л) ПКП, NGF; M) ПКП, инсулин.

Клетки обеих культур слабо окрашивались антителами к альбумину (ALB), апьфа-фетопротеину (AFP) и цитохрому (CYP) Р450 1А1 (рис. 2). Для обеих культур характерна специфичная окраска антителами к ядерным гепатоцитарным факторам Hnf-3ß и Hnf-4a (рис. ЗА-ЗЗ), что свидетельствует о том, что изучаемые культуры клеток имеют энтодермальное происхождение. Обе культуры экспрессировали фактор роста нервов (NGF). КСЖ экспрессировали инсулин, тогда как ПКП были отрицательны по этому маркеру (рис. ЗИ-ЗМ).

Результаты иммуноцитохимического анализа свидетельствуют о том, что изучаемые культуры клеток в целом имеют сходные характеристики. Однако в отличие от ПКП, КСЖ экспрессируют маркеры протоковых клеток и связаны с базальной мембраной. Кроме того, для КСЖ характерна экспрессия инсулина, которая не наблюдается в ПКП.

3. Анализ клеток мыши методом проточной цитометрии. Анализ изучаемых энтодермальных клеток методом проточной цитометрии проводили на первом пассаже. Как в культуре КСЖ, так и в ПКП наблюдается высокий процент ALB+, AFP+, СК19+ и c-Met+ клеток (таблица 1). Уровень CD45+ клеток в КСЖ соответствует фоновому значению, в то время как в ПКП наблюдается около 3% CD45+ клеток. Около 90% КСЖ экспрессируют протоковые маркеры CD49f и CD29, являющиеся субъединицами рецептора к ламинину (Patel et al., 2006; Louren?o et al, 2007). Обе изучаемые культуры содержат высокую долю клеток, экспрессирующих маркеры стволовых клеток: CD90, CD133, Sca-1. Однако в культуре ПКП, как правило, доля позитивных по данным маркерам клеток выше. ЕрСАМ экспрессируется в 69,12% КСЖ и в 12,17% ПКП.

Таблица 1. Анализ КСЖ и ПКП методом проточной цитометрии. Показана доля позитивных

Маркер КСЖ-ср±ст ПКП-ср±с

AFP 73,34 ± 4,87 71,87 ±2,50

ALB 82,57 ± 2,72 89,8 ± 4,75

CD29 93,27 ± 0,97 52,23 ±3,18

CD45 0,12 ±0,10 2,96 ± 0,82

CD49f 87,82 ± 3,40 1,71 ±0,23

CD90 3,70 ± 0,67 21,13 ± 2,31

CD133 9,98 ± 1,55 31,14 ±0,67

c-Kit 2,13 ±0,16 1,87 ±0,47

c-Met 67,4 ± 6,29 69,88 ±0,71

CK19 93,79 ± 2,11 70,20 ± 4,82

EpCAM 69,12 ±2,38 12,17 ±0,41

Sca-1 2,19 ±0,06 10,92 ± 1,29

In vivo AFP+ клетки располагаются во вставочных и исчерченных протоках поднижнечелюстной слюнной железы. Данные клетки являются прогениторными клетками слюнной железы, которые способны дифференцироваться в секретирующие и в миоэпителиальные клетки (Tsuji, Nagai, 1993). C-Met располагается в основном на эпителиальных клетках протоков слюнных желез. Как известно, c-Met является рецептором HGF, который регулирует морфогенез слюнной железы и способствует ветвлению протоков слюнных желез (Ikarí et al., 2003).

Согласно нашим данным, около 70% КСЖ экспрессируют молекулу адгезии эпителиальных клеток ЕрСАМ. In vivo ЕрСАМ экспрессируется в прогениторных эпителиальных клетках и вовлечен в такие процессы как клеточная миграция, пролиферация, организация клеточного пласта (Trzpis et al., 2007). В печени ЕрСАМ экспрессируется в стволовых клетках каналов Геринга и в прогениторных клетках желчных протоков (Schmelzer et al., 2007). В КСЖ ЕрСАМ обнаружен нами впервые.

Таким образом, полученная культура КСЖ содержит в основном протоковые клетки, позитивные по CD29, CD49f, ЕрСАМ, CK 19, AFP и слабо позитивные по ALB. Культура ПКП представлена гетерогенной клеточной популяцией. Около 3% клеток данной культуры экспрессируют гемопоэтический маркер CD45. По ЕрСАМ позитивны только 12% клеток. Вероятно, ЕрСАМ+ клетки в культуре ПКП представляют собой преимущественно гепатические клетки каналов Геринга (Schmelzer et al., 2007). Помимо этого, значительная доля ПКП экспрессирует маркеры CD90, CD133, Sca-1. Экспрессия данных маркеров характерна как для ЕрСАМ+ гепатических стволовых клеток, так и для овальных клеток печени (Walkup, Gerber, 2006; Schmelzer et al., 2007; Oertel, Shafritz, 2008).

4. Исследование транскриптомов культур слюнной железы и печени мыши. Сравнительный анализ экспрессии генов в масштабах целого транскриптома проводили для КСЖ и ПКП мыши на первом пассаже по поверхностным антигенам и маркерам, характерным для различных клеток печени, а также по транскрипционным факторам, необходимым для гепатоцитарной дифференцировки. В целом изучаемые культуры клеток сходны по экспрессии различных клеточных маркеров. На высоком уровне детектируются экспрессия мРНК маркеров прогениторных клеток {ЕрСАМ, NCAM, c-Kit, CD44, СК19) и рецептора HGF c-Met. Экспрессия маркеров дифференцированных клеток была низкой {1ААТ, ALB, TDO, РЕРСК).

Для оценки функциональной активности клеток провели анализ экспрессирующихся в них мРНК регуляторных генов. В КСЖ по сравнению с ПКП значительно ниже (примерно в 100 раз) экспрессия Gata4 и Gataö, необходимых для инициации экспрессии специфичных для печени гепатоцитарных ядерных факторов (Murry, Keller, 2008; Zaret, Grompe, 2008). Соответственно в КСЖ ниже экспрессия гепатоцитарных ядерных факторов Hnf-la, Hnf-lß, Hnf-3ß, Hnf-4a, но выше экспрессия ранних маркеров энтодермы Sox9 и Hnf-За. Гены, ответственные за клеточную миграцию (Hhex, ТЬхЗ, ОС-2), экспрессируется в изучаемых клетках на сопоставимом уровне. В обеих культурах присутствует экспрессия Jagl и генов семейства Notch. В печени данные гены участвуют в формировании желчных протоков, в поджелудочной железе экспрессия данных генов характерна для экзокринных клеток (Zong et al., 2009; Swales et al., 2012). Notch и Jagl участвуют в формировании протоков слюнных желез. Таким образом, изучаемые культуры клеток различаются по экспрессии ключевых транскрипционных факторов. В культуре ПКП присутствуют системы регуляторных сигналов, направляющих дифференцировку как в протоковом направлении, так и в гепатоцитарном. В культуре КСЖ присутствуют гены, характерные для ранней энтодермы, а также

регуляторные факторы, способствующие формированию протоковых структур. Наряду с активной экспрессией генов внутриклеточной передачи сигнала от ретиноевой кислоты, эти особенности сближают КСЖ с клетками поджелудочной железы.

В целом, проведенный различными методами сравнительный анализ культур КСЖ и ПКП мыши выявил значительное сходство данных энтодермальных клеток. Полученные результаты позволяют предположить, что КСЖ, подобно ПКП и клеткам поджелудочной железы, будут иметь высокий потенциал к дифференцировке в пределах энтодермального зародышевого листка.

5. Иммуноцитохимический анализ дифференцировки клеток слюнной железы. Гепатоцитарную дифференцировку КСЖ проводили на первом пассаже, одновременно исследовали действие VPA на дифференцировку. Клетки, подвергнутые дифференцировке после воздействия VPA, были названы КСЖ-диф-VPA, клетки, прошедшие дифференцировку без воздействия VPA, были названы КСЖ-диф. На 20-й день КСЖ-диф и КСЖ-диф-VPA были проанализированы методом иммуноцитохимии по маркерам клеток печени: AFP, ALB и СК19 (рис. 4). В качестве контроля были использованы КСЖ и ПКП на первом пассаже.

Рис. 4. Анализ гепатоцитарной дифференцировки КСЖ, флуоресцентная микроскопия. Ядра клеток -DAPI, антигены - Alexa Fluor 488, длина мерного отрезка -100 мкм.

A) КСЖ-диф, AFP; Б) КСЖ-диф, ALB;

B) КСЖ-диф, CK 19; Г) КСЖ-диф-VPA, AFP; Д) КСЖ-диф-VPA, ALB; Е) КСЖ-диф-VPA, СК19; Ж) КСЖ, AFP; 3) КСЖ, ALB; И) КСЖ СК19; К) ПКП ALB; Л) ПКП AFP; M) ПКП СК19.

После проведения дифференцировки в КСЖ увеличивается экспрессия раннего маркера гепатоцитарной дифференцировки - AFP, а также ALB, характерного для гепатоцитов (рис. 4). В КСЖ-диф-VPA, уровень экспрессии ALB оказался выше. Кроме того, при использовании VPA быстрее происходит потеря экспрессии маркера протокового направления дифференцировки - СК19. Это может говорить о том, что VPA ускоряет дифференцировку КСЖ.

6. ПЦР-РВ анализ гепатоцитарной дифференцировки клеток слюнной железы. На 20-й день КСЖ-диф и КСЖ-диф-УРА были проанализированы методом ПЦР-РВ по ключевым регуляторным факторам и маркерам, характерным для различных клеток печени. Для удобства интерпретации результатов, после нормализации по САРБН, уровни экспрессии исследуемых генов в КСЖ на первом пассаже были приняты за 1, уровни экспрессии соответствующих генов других культур были выражены относительно КСЖ на первом пассаже.

Согласно данным ПЦР-РВ, уровень экспрессии ядерных гепатоцитарных факторов Нп/-4а, Нп/-ЗР и Нп/-6 в КСЖ-диф возрос до уровня, наблюдаемого в контрольной культуре ПКП (рис. 5). Однако уровень экспрессии Нп/-3а в КСЖ-диф остается высоким, по сравнению с ПКП (выше примерно в 8 раз). Воздействие УРА оказывает не однозначное влияние на экспрессию регуляторных генов в дифференцированных клетках. В КСЖ-диф-УРА по сравнению с КСЖ-диф, снижается экспрессия генов, характерных для ацинарного (Рфа) и протокового (Н1гех1 и ТЬхЗ) направлений дифференцировки. Это может говорить о том, что УРА облегчает дифференцировку КСЖ в гепатоцитарном направлении и уменьшает дифференцировочный потенциал этих клеток в других направлениях. Однако после воздействия УРА в дифференцированных клетках не происходит увеличения экспрессии ключевого регуляторного гена Нп/-4а, экспрессия которого возрастает в КСЖ-диф до уровня, наблюдаемого в ПКП.

5

Рис. 5. ПЦР-РВ

анализ

гепатоцитарной дифференциров ки для ключевых регуляторных генов.

КСЖ

ПКП

КСЖ-диф-УРА

Что касается маркеров, протокового маркера СК19

КС'Ж-диф

характерных для клеток печени, то экспрессия остается низкой в КСЖ-диф, однако уровень экспрессии характерного для протоковых клеток CYP Р450 7AI в 3 раза выше, чем в ПКП (рис. 6).

В целом в дифференцированных КСЖ значительно увеличивается экспрессия ранних гепатоцитарных маркеров (AFP и 1ААТ). Увеличение экспрессии более поздних дифференцировочных маркеров (G6P, РЕРСК, TAT, ALB и TDO) выражено слабее. Таким образом, в 2D условиях культивирования происходит успешная инициация гепатоцитарной дифференцировки и осуществление начальных ее этапов. Эффект от воздействия УРА на дифференцировку КСЖ не однозначен: с одной стороны снижается экспрессия маркеров протокового направления и повышается экспрессия маркеров гепатоцитов - ALB и TDO, что может говорить об увеличении специфичности и

ускорении процесса дифференцировки. С другой стороны уровень экспрессии более ранних гепатоцитарных маркеров в КСЖ-диф-VPA, как правило, ниже, чем в КСЖ-диф.

156

КСЖ ПКП КСЖ-диф КСЖ-диф-VPA

Рис. 6. Анализ гепатоцитарной дифференцировки методом ПЦР-РВ для маркеров, характерных для различных клеток печени.

Dong et al. (2009) показали, что после воздействия VPA значительно повышается эффективность гепатоцитарной дифференцировки ES клеток мыши и уменьшается степень их спонтанной дифференцировки в структуры, напоминающие клетки желчных протоков. Авторы предполагают, что одним из механизмов, ускоряющих дифференцировку ES клеток, может быть остановка клеточного цикла в G0/G1 фазах, которая происходит при воздействии VPA. Блокировка клеточного цикла способствует потере плюрипотентности и дифференцировке ES клеток. VP А также увеличивает эффективность дифференцировки коммитированных клеток. После воздействия 5мМ VPA на клетки костного мозга человека, увеличивается ацетилирование гистонов НЗ и Н4, что способствует деметилированию ДНК данных клеток (Dong et al., 2013). При последующей дифференцировке в гепатоцитарном направлении, данные клетки экспрессируют альбумин и синтезируют мочевину более эффективно, чем клетки, не подвергавшиеся воздействию VPA. Предположительно, увеличение эффективности дифференцировки клеток костного мозга связано с деметилированием генов, вовлеченных в гепатоцитарную дифференцировку. Ряд авторов предполагают, что деметилирующие агенты способны вызывать дедифференцировку клеток и, таким образом, возвращать клетки к общему энтодермальному предшественнику, что улучшает дифференцировку в пределах энтодермального зародышевого листка (Liu et al., 2013). Скорее всего, существует несколько путей воздействия деметилирующих агентов на дифференцировочный потенциал клеток. Мы предполагаем, что механизм влияния VP А на эффективность дифференцировки клеток, связан, прежде всего, с деметилированием генов-мишеней и, следовательно, увеличением их доступности для факторов роста и цитокинов, используемых в дифференцировочном протоколе.

7. Определение уровня синтеза мочевины клетками в 3D условиях. Основной детоксикационной функцией печени является синтез мочевины из аммиака, осуществляемый гепатоцитами. Определение способности синтезировать мочевину широко используют в качестве теста на функциональную активность клеток при гепатоцитарной дифференцировке (You et al., 2013).

Определение способности клеток синтезировать мочевину проводили в 3D условиях культивирования, которые в большей мере соответствуют условиям, в которых клетки находятся в организме. Отбор проб проводили на 1,5, 10 и 15 день культивирования клеток в геле. За 24 часа до отбора пробы меняли среду. Для контроля использовали ПКП и КСЖ на первом пассаже.

50

Рис. 7. Уровень синтеза мочевины клетками в 3D условиях. По оси X -время культивирования клеток в геле (сутки), по оси Y - концентрация мочевины в среде культивирования в мМ на 1x10 клеток за 24 часа.

1день 5день Юлень 15день

На первом пассаже в 2D условиях КСЖ и ПКП практически не синтезируют мочевину (рис. 7). Клетки приобретают способность синтезировать мочевину в 3D условиях культивирования. Увеличение уровня синтеза мочевины исследуемыми клетками в коллагеновом геле в течение всего периода наблюдения говорит о том, что 3D условия культивирования способствуют дифференцировке данных клеток. К 15-му дню инкубации КСЖ в геле, уровень синтеза ими мочевины достигает 24 мМ на 1x106 клеток за 24 часа. Для сравнения: свежевыделенные гепатоциты мыши синтезируют около 350 мМ мочевины на 1х106 клеток за 24 часа. Высокий уровень синтеза мочевины КСЖ может отображать их значительный потенциал к дифференцировке в гепатоцитарном направлении в определенных условиях культивирования. ПКП активнее синтезируют мочевину в 3D условиях: к 15-му дню уровень синтеза мочевины ПКП в 7,6 раз меньше, чем у первичной культуры гепатоцитов. После дифференцировки способность КСЖ синтезировать мочевину возрастает, причем, в случае использования VPA, КСЖ синтезируют мочевину на сопоставимом с контрольными ПКП уровне. Дифференцировка КСЖ позволяет получить клетки, способные к выполнению некоторых функций гепатоцитов. Деметилирующие агенты способны увеличить эффективность дифференцировки.

Проведенная нами гепатоцитарная дифференцировка затрагивает не только регуляторные гены КСЖ, но и влияет на функциональные характеристики этих клеток. Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что КСЖ способны к дифференцировке в гепатоцитарном направлении с достаточной эффективностью.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Изучение пластичности клеток и их способности к дифференцировке является актуальной проблемой клеточной биологии. Не менее актуальна разработка программ дифференцировки с целью получения функционально активных клеток, пригодных для трансплантации. Наиболее обнадеживающие результаты продемонстрированы при использовании гистогенетически родственных клеток (Yi et al., 2012). КСЖ имеют энтодермальное происхождение и являются перспективными для применения в регенеративной медицине. In vitro КСЖ представляют собой активно пролиферирующую культуру, таким образом, возможно получить достаточное их количество из небольшого биоптата.

Проведенная нами работа позволяет расширить понимание молекулярно-генетических процессов, происходящих при гепатоцитарной дифференцировке КСЖ. Сравнение КСЖ с ПКП дает представление о близости данных клеточных типов, а также позволяет оценить степень гепатоцитарной дифференцировки КСЖ относительно целевых клеток. Полученные нами результаты имеют как фундаментальное, так и прикладное значение.

КСЖ демонстрируют значительное сходство с другими типами энтодермальных клеток. Подобно ПКП, КСЖ экспрессируют ряд маркеров прогениторных клеток (ЕрСАМ, CD90, CD133, Sca-1, c-Kit). Подавляющая часть популяции КСЖ позитивна по ALB, AFP, СК19 и c-Met. В плотной культуре КСЖ способны к спонтанной дифференцировке. При этом наблюдается экспрессия маркеров как гепатоцитарного, так и панкреатического направлений. КСЖ экспрессируют мРНК ранних маркеров энтодермы Hnf-ia и Sox9, в то время как экспрессия Gata4 и Gataö, необходимых для инициации гепатоцитарной дифференцировки, в них примерно в 100 раз ниже, чем в ПКП. Уровень экспрессии мРНК гепатоцитарных ядерных факторов Hnf-la, Hnf-3ß и Hnf-4a в КСЖ также ниже, по сравнению с ПКП. Высокий уровень экспрессии Hnf-За и элементов внутриклеточной передачи сигнала от ретиноевой кислоты сближает КСЖ с протоковыми клетками поджелудочной железы. Таким образом, по профилю генной экспрессии КСЖ имеют сходство с энтодермапьными клетками, полученными из других источников.

После проведения дифференцировки в гепатоцитарном направлении, экспрессия ключевых регуляторных генов в КСЖ достигает уровня, характерного для контрольных ПКП. Значительно повышается экспрессия клеточных маркеров, характерных для начальных этапов гепатоцитарной дифференцировки СAFP и 1ААТ). Увеличение экспрессии более поздних дифференцировочных маркеров (G6P, РЕРСК, TAT, ALB и ТОО) выражено слабее. Это говорит о том, что инициация и начальные этапы гепатоцитарной дифференцировки КСЖ происходят достаточно эффективно в 2D условиях культивирования. Последующий анализ клеток в 3D условиях показал, что проведенная дифференцировка затрагивает не только экспрессию регуляторных генов и клеточных маркеров, но также модулирует функциональные характеристики КСЖ. После дифференцировки способность к синтезу мочевины КСЖ возрастает до уровня, сопоставимого с контрольными ПКП. Способность синтезировать мочевину является одной из основных

детоксикационных функций печени. Таким образом, КСЖ обладают значительным потенциалом к дифференцировке в гепатоцитарном направлении и способны к восполнению некоторых функций гепатоцитов.

Деметилирующие агенты облегчают перепрограммирование клеток и способны увеличить специфичность и эффективность дифференцировки. Однако VPA оказывает неоднозначное влияние на экспрессию генов КСЖ, вызывая снижение уровня экспрессии некоторых регуляторных генов. Таким образом, необходимо подбирать оптимальные условия, при которых не происходит аттенуирования экспрессии целевых генов.

ВЫВОДЫ

1. Полученная нами культура клеток поднижнечелюстной слюнной железы мыши представлена активно пролиферирующими эпителиальными протоковыми клетками энтодермального происхождения. Подобно прогениторным клеткам печени, клетки слюнной железы экспрессируют ряд маркеров прогениторных клеток (ЕрСАМ, CD90, CD133, Sca-1, c-Kit). Подавляющая часть культуры клеток слюнной железы позитивна по альбумину, альфа-фетопротеину, цитокератину 19 и c-Met.

2. По экспрессии различных клеточных маркеров и регуляторных генов, культивированные клетки слюнной железы проявляют значительное сходство с энтодермальными клетками печени и поджелудочной железы. Культура клеток слюнной железы экспрессирует мРНК ранних маркеров энтодермы Hnf-ia и Sox9, а также ядерных гепатоцитарных факторов.

3. Разработанный протокол in vitro дифференцировки культуры клеток слюнной железы в гепатоцитарном направлении изменяет экспрессию регуляторных генов и специфических клеточных маркеров и позволяет получить клетки, способные к выполнению некоторых функций гепатоцитов.

4. Использование деметилирующих агентов повышает эффективность гепатоцитарной дифференцировки культуры клеток слюнной железы, при этом увеличивается экспрессия маркеров гепатоцитарной дифференцировки и снижается экспрессия маркеров протоковых клеток.

5. Протоковые клетки поднижнечелюстной слюнной железы в культуре проявляют значительную фенотипическую пластичность и способны к дифференцировке в гепатоцитарном направлении.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи:

1. Петракова О.С., Черниогло Е.С., Терских В.В., Калистратова E.H., Васильев A.B. (2012). Использование клеточных технологий в лечении патологий печени. Acta Naturae, 3(14), 81-96.

2. Петракова О.С., Ашапкин В.В., Воротеляк Е.А., Брагин Е.Ю., Штратникова В.Ю., Черниогло Е.С., Суханов Ю.В., Терских В.В., Васильев A.B. (2012). Влияние 30-условий культивирования на дифференцировку энтодермальных клеток. Acta Naturae, 4(15), 48-58.

Патенты:

1. Положительное решение о выдаче патента заявки на полезную модель № 2012158224/15 (091712) от 01.04.2013 г. «Клеточный имплантат для лечения заболеваний печени и поджелудочной железы». Петракова О.С., Гвазава И.Г., Васильев A.B., Терских В.В., Суханов Ю.В.

2. Положительное решение о выдаче патента заявки на изобретение №2012140913/10 (065980) от 13.05.2013 г. «Способ получения клеток для заместительной клеточной терапии патологий печени». Петракова О.С., Кирпичников М.П., Ашапкин В.В., Суханов Ю.В., Васильев A.B., Терских В.В., Супруненко Е.А.

Тезисы конференций:

1. Конференция молодых ученых ИБР РАН, 13-17 декабря 2011 г., Москва. Петракова О.С., Черниогло Е.С., Васильев A.B., Терских В.В. Изучение возможностей трансдифференцировки клеток энтодермы. Онтогенез, 2012, 43(4), 242-243.

2. III Конференция «Биология стволовых клеток: фундаментальные аспекты», ИБР РАН, Москва, 7 июня 2011 г. Васильев A.B., Роговая О.С., Петракова О.С., Давыдова Д.А., Киселева Е.В., Гвазава И.Г., Дашинимаев Э.Б. Пластичность стволовых клеток - границы и возможности. Сборник тезисов конференции, 2011, 26-28.

3. Конференция молодых ученых ИБР РАН, 16-17 декабря 2010 г., Москва. Петракова О.С., Черниогло Е.С., Васильев A.B. Сравнительная характеристика энтодермальных клеток в условиях in vitro. Онтогенез, 2011,42(5), 329.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проект 11-04-12061-офи-М-2011).

СПИСОК с

КСЖ - клетки слюнной железы ПКП - прогениторные клетки печени ПЦР-РВ - полимеразная цепная реакция с детекцией в реальном времени

ПФА - параформальдегид

1ААТ - alpha-1-antitrypsin AFP - alpha-fetoprotein ALB - albumin

BMP - bone morphogenetic protein BSA - bovine serum albumin CK - cytokeratin (цитокератин) CYP - cytochrome P450 DAPI - 4',6-diamidino-2-phenylindole EGF - epidermal growth factor EpCAM - epithelial cell adhesion molecule

ES - embryonic Stem cells FBS - fetal bovine serum FGF - fibroblast growth factor

G6P - glucose 6-phosphate

GAPDH - glyceraldehyde-3-phosphate

dehydrogenase

HGF - hepatocyte growth factor Hhex - hematopoietically expressed homeobox

Hnf - hepatocyte Nuclear Factor

ITS - insulin - transferrin - selenium

NGF - nerve growth factor

OSM - oncostatin M

PBS - phosphate-buffered saline

PEPCK - phosphoenolpyruvate

carboxykinase

Ptfla - prospero-related homeobox 1 TAT - tyrosine aminotransferase Tbx - T-box

TDO - tryptophan 2,3-dioxygenase VPA - valproic acid (вальпроевая кислота)

Заказ № 53-а/10/2013 Подписано в печать 14.10.2013 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; e-mail.zak@cfr.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Петракова, Ольга Сергеевна, Москва

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Институт биологии развития имени Н.К. Кольцова» Российской академии наук

На правахрукописи

и42и1363765

Петракова Ольга Сергеевна

ИНДУКЦИЯ ГЕПАТОЦИТ АРНОЙ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ КЛЕТОК СЛЮННОЙ ЖЕЛЕЗЫ МЫШИ

Специальность 03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: д.б.н., А.В. Васильев

Москва 2013

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ..................................................................................................5

ВВЕДЕНИЕ....................................................................................................................................7

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ...............................................................................................14

1.1.Клеточные механизмы регенерации печени 14

1.2.Клеточная терапия патологий печени с использованием донорских гепатоцитов 19

1.3.Альтернативные источники клеточного материала для клеточной терапии печени...............

.........................................................................................................................................................23

1.3.1. Плюрипотентные клетки: ES и iPS 23

1.3.2. Постнатальные клетки 26

1.3.2.1. Стволовые и прогениторные клетки печени 26

1.3.2.2. ГСК и МСК костного мозга, пуповинной крови, жировой ткани ..........................................................................................................................28

1.3.2.3. Клетки амниотической жидкости 31

1.3.2.4. Клетки энтодермального происхождения 33

1.3.3. Методика прямого перепрограммирования - использование генетических конструкций для перепрограммирования соматических клеток 34

1.4.Молекулярно-генетические механизмы гепатоцитарной дифференцировки..............37

1.5.Использование деметилирующих агентов для дифференцировки клеток 42

1.6.Проблемы и перспективы развития клеточной терапии патологий печени 46

1.7.Строение поднижнечелюстной слюнной железы мыши 48

1.8.Культивирование клеток слюнной железы........................................................................49

1.9.Культивирование клеток в коллагеновом геле для анализа дифференцировочного потенциала клеток in vitro..........................................................................................................51

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.....................................................................................53

2.1.Материалы 53

2.1.1. Животные 53

2.1.2. Реактивы 53

2.2.Методы 59

2.2.1. Выделение и культивирование постнатальных клеток поднижнечелюстной слюнной железы и прогениторных клеток печени мыши

............................................................................................................................................59

2.2.2. Приготовление коллагенового геля, культивирование энтодермальных клеток в ЗЭ условиях, контракция коллагенового геля.............60

2.2.3. Приготовление парафиновых срезов коллагенового геля 60

2.2.4. Иммуноцитохимия и окраска клеток на Б-актин.........................61

2.2.5. Определение пролиферативной активности клеток с помощью бром дезоксиуридина......................................................................................................61

2.2.6. Проточная цитометрия 63

2.2.7. Выделение тотальной РНК из клеток 63

2.2.8. ПЦР с обратной транскрипцией для клеток слюнной железы и прогениторных клеток печени мыши 64

2.2.9. Электрофорез в агарозном геле.......................................................64

2.2.10. Количественная ПЦР.........................................................................64

2.2.11. Анализ профилей экспрессии генов с помощью глубокого секвенирования65

2.2.12. Анализ действия деметилирующих агентов на клетки слюнной железы мыши в сравнении с прогениторными клетками печени 66

2.2.13. Индукция гепатоцитарной дифференцировки для клеток слюнной железы 66

2.2.14. Определение уровня синтеза мочевины энтодермальными клетками ............................................................................................................................................67

2.2.15. Статистическая обработка данных 68 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 69 3.1 .Морфологическая характеристика культур клеток слюнной железы мыши в 20 и 30

условиях культивирования в сравнении с прогениторными клетками печени................69

3.2.Определение пролиферативной активности клеток слюнной железы в сравнении с прогениторными клетками печени мыши в 2Т> и ЗЭ условиях 75

З.З.ОТ-ПЦР для культур клеток слюнной железы и прогениторных клеток печени мыши в 2D и 3D условиях культивирования.........................................................................................76

3.4.Иммуноцитохимическая характеристика клеток слюнной железы в сравнении с прогениторными клетками печени...........................................................................................78

3.5.Исследование транскриптомов культур клеток слюнной железы и прогениторных клеток печени мыши 81

3.6.Анализ клеток слюнной железы и прогениторных клеток печени мыши методом проточной цитометрии...............................................................................................................90

3.7.Воздействие вальпроевой кислоты на клетки слюнной железы и прогениторные клетки печени мыши 98

3.8.Дифференцировка клеток слюнной железы мыши в гепатоцитарном направлении...............

.........................................................................................................................................................102

3.9.Анализ гепатоцитарной дифференцировки клеток слюнной железы мыши в 2D условиях ........................................................................................................................................................103

3.9.1. Анализ гепатоцитарной дифференцировки клеток слюнной железы мыши методом иммуноцитохимии 103

3.9.2. Анализ гепатоцитарной дифференцировки клеток слюнной железы мыши методом ПЦР-РВ...................................................................................................106

3.10. Анализ гепатоцитарной дифференцировки клеток слюнной железы мыши в 3D условиях...........................................................................................................................................112

3.10.1. Определение степени контракции коллагенового геля дифференцированными клетками слюнной железы мыши 112

3.10.2. Определение уровня синтеза мочевины в 3D условиях дифференцированными клетками слюнной железы мыши 114

4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ...............................................................................................................120

ВЫВОДЫ.........................................................................................................................................123

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ......................................................................................................124

ПРИЛОЖЕНИЕ 146

СПИСОК с

ГСК - гемопоэтические стволовые клетки

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота кДНК - комплементарная дезоксирибонуклеиновая кислота КСЖ - клетки слюнной железы МСК - мезенхимные стволовые клетки ОТ - обратная транскриптаза ОТ-ПЦР - полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией ПКП - прогениторные клетки печени ПФА - параформальдегид ПЦР - полимеразная цепная реакция ПЦР-РВ - полимеразная цепная реакция с детекцией в реальном времени РНК - рибонуклеиновая кислота тотРНК - тотальная рибонуклеиновая кислота

ААТ - alpha-1-antitrypsin AFP - alpha-fetoprotein ALB - albumin

BMP - bone morphogenetic protein BrdU - 5-bromo-2'-deoxyuridine BSA - bovine serum albumin СВР - CREB-binding protein CD - cluster of differentiation Cdx2 - caudal type homeobox 2

C/EBP - CCAAT-enhancer-binding protein CK - cytokeratin

c-Kit - cell growth factor receptor Kit c-Met - cell met proto-oncogene tyrosine kinase

CYP - cytochrome P450

Cxcr4 - chemokine (C-X-C motif) receptor

4

DAPI - 4',6-diamidino-2-phenylindole Dlk-1 - delta-like 1 homolog DMEM - Dulbecco's Modified Eagle Medium

DMSO - dimethyl sulfoxide

DNAse - deoxyribonuclease

dNTP - deoxyribonucleotide triphosphate

DPBS - Dulbecco's Phosphate-Buffered

Saline

E-cadherin - endothelial cadherin

EGF - epidermal growth factor

EpCAM - epithelial cell adhesion molecule

ES - embryonic Stem cells

FBS - fetal bovine serum

FGF - fibroblast growth factor

Foxa - forkhead box A

G6P - glucose 6-phosphate

GAPDH - glyceraldehyde-3-phosphate

dehydrogenase

Gata4 - GATA binding protein 4

Gata6 - GATA binding protein 6 G-CSF - granulocyte - colony stimulating factor

GLP-1 - GIDl-like protein

GMP - Good Manufacturing Practice

GSC - goosecoid homeobox

HEPES - 4-(2-hydroxyethyl)-1 -

piperazineethanesulfonic acid

HepParl - hepatocyte paraffin-1

Hesxl - homeobox, ES cell expressed 1

Hex (Hhex) - hematopoietically expressed

homeobox

Hlf - hepatic leukemia factor HGF - hepatocyte growth factor Hnf - hepatocyte Nuclear Factor ICAM - intercellular adhesion molecule IL - interleukin

iPS - induced Pluripotent Stem cells

KGF - keratinocyte growth factor

ITS - insulin - transferrin - selenium

LIF - leukemia inhibitory factor

Mafa - maf musculoaponeurotic

fibrosarcoma oncogene homolog A

NEFH - neurofilament, heavy polypeptide

NGF - nerve growth factor

Ngn3 - neurogenin 3

OC-1 -onecut 1

OSM - oncostatin M

Otx2 - orthodenticle homeobox 2

PCR - polymerase chain reaction Pdxl - pancreatic and duodenal homeobox 1

PEPCK - phosphoenolpyruvate

carboxykinase

PI - propidium iodide

Ptfl a - prospero-related homeobox 1

RNA - ribonucleic acid

RNase - ribonuclease

Sea - stem cell antigen

Sox - SRY-related HMG-box

SP - side population cells

Sppl - secreted phosphoprotein 1

TAT - tyrosine aminotransferase

Tbx - T-box

TDO - tryptophan 2,3-dioxygenase

Thy-1 - thymocyte differentiation antigen-1

Tjp - tight junction protein

TGF - transforming growth factor

TNF - tumor necrosis factor

VE-cadherin - vascular endothelial

cadherin

VEGER2 - vascular endothelial growth factor receptor 2 VPA - valproic acid WNT - wingless-Int

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы.

Актуальной проблемой современной клеточной биологии является изучение пластичности клеточного фенотипа и возможностей дифференцировки клеток в пределах одного зародышевого листка.

Интерес клеточных биологов к in vitro дифференцировке клеток обусловлен тем, что данный процесс может помочь в решении ряда фундаментальных и прикладных задач, таких как установление гистогенетического родства различных клеточных типов, изучение регуляторных генных путей, in vitro моделирование болезней, тестирование лекарств, получение целевых клеток в достаточном для заместительной клеточной терапии количестве. Понимание молекулярно-генетических механизмов, которые задействованы при дифференцировке в те или иные типы клеток, поможет моделировать процесс перепрограммирования и избежать потенциальных негативных эффектов.

Основными подходами к осуществлению дифференцировки клеток in vitro является использование различных цитокинов и факторов роста, имитирующих процессы, происходящие в эмбриональном развитии или репарации ткани, методика прямого перепрограммирования с использованием специфических генетических конструкций, применение деметилирующих агентов, облегчающих перепрограммирование (Graf, Enver, 2009; Jopling et al., 2011).

Дифференцировка клеток в пределах одного зародышевого листка представляется наиболее перспективной в плане практического применения, так как клеткам одного зародышевого листка не требуется длительных дифференцировочных протоколов, процесс дифференцировки проходит быстрее и эффективнее. Что касается энтодермального зародышевого листка, то на данный момент накопилось достаточно много сведений о дифференцировке клеток печени и поджелудочной железы как in vitro, так и in vivo (Yi et al., 2012). Однако как печень, так и поджелудочная железа являются малодоступным источником

клеток для заместительной клеточной терапии. В то же время сложность терапии органов энтодермального происхождения и недостаток донорских органов обусловливают поиск новых альтернативных источников клеток.

По данным статистики в Российской Федерации количество пациентов с различными хроническими и острыми заболеваниями печени превосходит 200 ООО человек в год. Несмотря на достижения современной медицины, лечение хронических и острых патологий печени с использованием стандартных терапевтических приемов оказывается недостаточным. Смертность при патологиях определенной степени тяжести сохраняется на уровне 80-90%. В связи с недостаточной эффективностью и ограниченными возможностями традиционных методов лечения в настоящее время наряду с пересадкой печени и экстракорпоральной детоксикацией разрабатываются методики заместительной клеточной терапии. Несмотря на некоторые успехи, полученные в опытах на лабораторных животных, безопасный и достаточно эффективный подход еще не найден (Zaret, Grompe, 2008). Основной задачей является поиск легкодоступных клеток, способных с достаточной эффективностью дифференцироваться в гепатоцитарном направлении.

Поднижнечелюстная слюнная железа имеет смешанное эктодермально-энтодермальное происхождение (Okumura et al., 2003; Larsen et al., 2010). Между ацинусом и начальной частью гранулярного протока слюнной железы мыши располагается ниша, содержащая факультативные прогениторные клетки (Van Keymeulen et al., 2011; Okumura et al., 2012), имеющие энтодермальное происхождение (Tsuji, Nagai, 1993). Доступность клеточного материала слюнной железы делает этот источник клеток перспективным для дальнейшего изучения (Шубникова, Погодина, 2000; Baek et al., 2012). На данный момент накоплено достаточно сведений, касающихся культивирования in vitro клеток слюнной железы, выделенных у человека и различных животных. При культивировании in vitro клетки поднижнечелюстной слюнной железы активно пролиферируют и способны проходить значительное число пассажей (Гвазава с соавт., 2011).

Клетки слюнной железы человека и некоторых животных (мышь, крыса, свинья) в культуре позитивны по цитокератину 19 и, зачастую, по альфа-фетопротеину (Okumura et al., 2003; Hisatomi et al., 2004, Sato et al., 2007). При определенных условиях культивирования клетки приобретают способность синтезировать глюкагон, альбумин или инсулин. Клетки слюнной железы выполняют в организме не только экзокринную, но и эндокринную функции. Эндокринная функция слюнных желез обеспечивается синтезом целого ряда биологически активных веществ (инсулина, фактора роста нервов, фактора роста эпителия, тимоциттрансформирующего фактора и др.) (Нечаева, Бродский, 1973; Бабаева, Шубникова, 1979), что также может давать вклад в репарацию дефектов.

Таким образом, клетки поднижнечелюстной слюнной железы являются легко доступным источником энтодермальных эпителиальных клеток во взрослом организме. Однако на данный момент отсутствуют подробные сведения об экспрессии ключевых регуляторных генов в клетках слюнной железы и молекулярно-генетических механизмах, ответственных за дифференцировку этих клеток, не разработаны оптимальные дифференцировочные протоколы.

Все изложенное выше определило цель и задачи исследования.

Цель работы:

Изучить способность протоковых клеток поднижнечелюстной слюнной железы мыши к дифференцировке в гепатоцитарном направлении in vitro для исследования фенотипической пластичности клеток в пределах энтодермального зародышевого листка.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Разработать методы культивирования клеток поднижнечелюстной слюнной железы и прогениторных клеток печени мыши и провести сравнительную характеристику культуры клеток слюнной железы и прогениторных клеток печени.

2. Провести сравнительный анализ культур клеток слюнной железы и прогениторных клеток печени по экспрессии ключевых для гепатоцитарной

дифференцировки регуляторных факторов и маркеров методами ПЦР-РВ и анализом профилей экспрессии генов глубоким секвенированием в масштабах целого транскриптома.

3. Разработать программу дифференцировки культуры клеток слюнной железы мыши в гепатоцитарном направлении. Проанализировать степень гепатоцитарной дифференцировки клеток слюнной железы мыши методами ПЦР-РВ и иммуноцитохимии, а также определить функциональную активность полученных клеток в сравнении с прогениторными клетками печени в 3D условиях культивирования.

4. Изучить влияние деметилирующих агентов на экспрессию ключевых для гепатоцитарной дифференцировки регуляторных генов и маркеров. Проанализировать влияние деметилирующих агентов на гепатоцитарную дифференцировку клеток слюнной железы.

Научная новизна работы.

Впервые поведен сравнительный анализ экспрессии регуляторных генов и маркеров культуры клеток поднижнечелюстной слюнной железы и печени мыши, детально исследована экспрессия генов, характерных для протоковых клеток слюнной железы, проанализировано около 29000 мРНК транскриптов. Впервые обнаружена экспрессия маркера адгезии эпителиальных клеток ЕрСАМ в клетках слюнной железы.

Показано, что клетки поднижнечелюстной слюнной железы имеют значительное сходство с другими типами энтодермальных клеток, экспрессируют ряд маркеров прогениторных клеток (ЕрСАМ, CD90, CD 133, Sca-1, c-Kit), а также маркеры, характерные для клеток печени ALB, AFP, СК19 и c-Met. Культура клеток поднижнечелюстной слюнной железы экспрессирует мРНК ранних маркеров энтодермы Hnf-Sa и Sox9.

После дифференцировки клетки слюнной железы, подобно гепатоцитам, приобретают способность к синтезу мочевины. Вальпроевая кислота, являющаяся

деметилирующим агентом, способна увеличить специфичность и эффективность гепатоцитарной дифференцировки клеток поднижнечелюстной слюнной железы.

Практическая значимость.

Результаты, полученные в данном исследовании, могут быть использованы для оптимизации протоколов дифференцировки энтодермальных клеток из предшественников, для выяснения гистогенетического родства энтодермальных клеток и для уточнения их происхождения. Полученные результаты делают возможным разработку принципиально новых методов получения энтодермальных клеток для регенеративной медицины.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Постнатальные клетки поднижнечелюстной слюнной железы мыши являются близкими по своему происхождению с клетками печени и поджелудочной железы и, таким образом, обладают значительным потенциалом к дифференцировке в пределах энтодермального зародышевого листка.

2. Дифференцировка клеток слюнной железы в гепатоцитарном направлении позволяет получить клетки, способные к восполнению некоторых функций гепатоцитов.

3. Деметилирующие агенты способны облегчать перепрограммирование клеток и увеличивать эффективность дифференцировочных протоколов.

Апробация диссертации.

Материалы диссертации доложены и обсуждены на:

1. Конференции молодых ученых ИБР РАН, 13-17 декабря 2011 г., Москва. Петракова О.С., Черниогло Е.С., Васильев A.B., Терских В.В. Изучение возможностей тра