Механизмы транскрипционной регуляции гепатоцитарного ядерного фактора 4

Альперн, Даниил Валерьевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Механизмы транскрипционной регуляции гепатоцитарного ядерного фактора 4
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Механизмы транскрипционной регуляции гепатоцитарного ядерного фактора 4"

На правах рукописи

003452443

Альперн Даниил Валерьевич

МЕХАНИЗМЫ ТРАНСКРИПЦИОННОЙ РЕГУЛЯЦИИ ГЕПАТОЦИТАРНОГО ЯДЕРНОГО ФАКТОРА 4

03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Л'

МОСКВА 2008

003452443

Работа выполнена в ГУ Российском Онкологическом научном центре имени H.H. Блохина Российской академии медицинских наук

Научные руководители:

Академик РАН, доктор биологических наук, профессор Доктор биологических наук

Абелев Гарри Израилевич Лазаревич Наталия Леонидовна

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор Доктор биологических наук, профессор

Чумаков Петр Михаилович Добров Евгений Николаевич

Ведущая организация:

ФГУП Институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов ГосНИИгенетика, г. Москва.

по защите докторских и кандидатских диссертаций при Московском государственном университете имени М.В, Ломоносова по адресу 119992, Москва, Ленинские горы, МГУ, НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского, ауд. 536.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан «27» октября 2008г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

Защита состоится «28» ноября 2008 г. в

часов на заседании совета Д 501.001.76

кандидат биологических наук,

Крашенинников И.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

В процессе развития организма дифференцировка клеток происходит в результате действия внешних стимулов, которые активируют внутриклеточные сигнальные каскады реакций и приводят к модуляции транскрипции определенных групп генов Одним из основных критериев уровня дифференцировки является экспрессия так называемых тканеспецифических генов Эти гены отвечают за синтез белков, обеспечивающих функционирование данного типа клеток в структуре ткани и органа Регуляцию их экспрессии осуществляют тканеспецифические факторы транскрипции, которые в свою очередь контролируются общими транскрипционными сигналами

Гепатоцитарные ядерные факторы (ГЯФ) играют центральную роль в установке и поддержании дифференцировки гепатоцитов, а также регулируют процессы пролиферации и морфогенеза Множество исследований демонстрирует, что одним из ключевых ГЯФ в регуляции дифференцировки клеток печени является НМЧа [0(1от е! Ы, 2004, Ратг е1 а/,2003, Кугтш е1 а1, 2006] Кроме того, эксперименты, проведенные в нашей лаборатории, показывают, что нарушение экспрессии НЫР4а является важным этапом прогрессии гепатоцеллюлярных карцином, а восстановление его экспрессии в культуре клеток дедифференцированной гепатокарциномы мыши приводит к частичной реверсии злокачественного фенотипа [ЬагагеуюЬ а а/, 2004]

Регуляция экспрессии гена ИМР4а другими гепатоцитарными ядерными факторами на разных этапах развития активно изучается Однако до сих пор остается неясным, чем определяется нарушение экспрессии 1ШР4а, а также других тканеспецифических транскрипционных факторов в опухолях, и участвуют ли в этом процессе нетканеспецифические сигнальные каскады, особенно те из них, изменение активности которых происходит на разных стадиях канцерогенеза.

Экспрессия гена НИР4а осуществляется с двух независимых промоторов, в результате чего образуются две группы изоформ Н№'4иР2 и 11ЫГ4аР I. Изоформы НЫР4аР2 экспрессируются в эмбриональной печени и в норме не обнаруживаются после рождения, их замещают изоформы Н№4аР1 В то же время, экспрессия Н№4иР2 может возобновляться на ранних этапах гепатоканцерогенеза и свидетельствует о начальных этапах процесса дедифференцировки [Ьа7аге\'1сК а <¡1,2004, Флейшман и др, 2008]

Существуют немногочисленные указания на то, что различные нетканеспецифические факторы также могут участвовать в регуляции экспрессии НЫР4а К их числу относится онкосупрессор р53, белок, мутации которого часто встречаются в различных типах опухолей Являясь транскрипционным фактором, р53 играет важнейшую

роль в регуляции клеточного цикла и индукции апоптоза при повреждении ДНК Есть данные о том, что инактивация гена р53 может приводить к блоку дифференцировки гепатоцитов [ОишЫс е* а/, 2001]

Цитокины семейства трансформирующих факторов роста р (ТОРР) являются вероятными кандидатами на роль связующего звена между печеньспецифическими и общими сигнальными путями, задействованными в процессе канцерогенеза Факторы этого семейства участвуют в поддержании морфологических и дифферепцировочных свойств, а также в контроле пролиферации и апоптоза как в печени, так и в других эпителиальных тканях [ТЫегу е! а!, 2002]

Цели и задачи исследования

Целью настоящей работы являлось исследование механизмов регуляции транскрипции центрального фактора гепатоцитарной дифференцировки НЫР4а при гепатоканцерогенезе и проверка предположения об участии факторов р53 и ТОрр в этом процессе В ходе работы планировалось выяснить возможное место компонентов общих сигнальных путей р53 и ТОрр в регуляции системы тканеспецифической экспрессии генов печени Указанная цель подразумевала решение следующих задач

1 Анализ спектра экспрессии гепатоспецифических транскрипционных факторов в печени мышей, нокаушых по гену р53

2 Создание линии клеток НерС2 с инактивированным р53 и анализ ассоциированного с этим изменения спектра экспрессии гепатоспецифических генов, определяющих уровень дифференцировки клеток

3 Исследование механизмов дифференциальной регуляции альтернативных промоторов гена НЫР4а мыши и человека при подавлении экспрессии гена р53 и индукции ТОРР-зависимого сигнального пути в клетках гепатомы человека НерС2

4 Изучение механизмов ТОрр-зависимого переключения экспрессии изоформ гена НЫ[74а на этой модели

Научная новизна и практическая ценность работы

В настоящей работе представлено исследование влияния факторов нетканеспецифических сигнальных путей на экспрессию центрального регулятора дифференцировки гепатоцитов ЮЛ^а

Многочисленные исследования показывают, что прогрессия гепатокарцином может быть связана с нарушением функций ГЯФ Одним из важнейших ГЯФ является НШЧа, который рассматривается как ключевой регулятор гепатоцитарной дифференцировки. В нашей лаборатории было показано, что подавление экспрессии НЫР4а является частым

событием при прогрессии гепатокарцином, а его экзогенная экспрессия в клетках дедифференцированной гепатокарциномы мыши вызывает реверсию злокачественного фенотипа Кроме того, активация экспрессии эмбриональных изоформ НЫК4аР2 в печени может свидетельствовать о ранних этапах опухолевой трансформации В последние годы появились данные о нарушении экспрессии ЯЛг/г4а в карциномах почки и кишечника, что позволяет рассматривать этот фактор как потенциальный опухолевый супрессор для некоторых типов эпителиальных тканей

За последнее десятилетие накоплено большое количество данных о механизмах взаимной регуляции между гепатоцитарными ядерными факторами Однако до сих пор остается актуальным вопрос о взаимодействии сети ГЯФ с общими сигнальными каскадами Существуют указания на то, что именно НМР4а может выступать в качестве связующего звена между сетью тканеспецифических регуляторов транскрипции и общими клеточными сигнальными путями Частным случаем этой проблемы является вопрос о механизмах подавления активности ИNF4a в канцерогенезе, которое происходит в результате нарушения внутриклеточных каскадов сигнальных реакций Таким образом, исследование возможных механизмов регуляции экспрессии НЫР4а представляет не только теоретическое, но практическое значение

В нашей работе мы впервые показали, что экспрессия гена НЫР4а может изменяться при инактивации опухолевого супрессора р53 Ранее были опубликованы данные о том, что в печени нокаутных по гену р53 мышей может происходить накопление недодифференцированных клеток-предшественников гепатоцитов В ходе нашего исследования мы выяснили, что инактивация р53 повышает уровень экспрессии эмбриональных изоформ Н№4а в печени взрослой мыши и в культуре клеток гепагомы человека Мы продемонстрировали, что подавление функции р53 в клетках гепатомы человека приводит к активации альтернативного промотора Р2 гена I!Ы1:4а

Мы показали, что при активации ТСрр-сшналыюго пути в культуре гепатомы человека происходит переключение экспрессии изоформ НКР4а с взрослых на эмбриональные, свидетельствующее о снижении уровня дифференцировки Кроме этого мы выяснили, что этот процесс связан с индукцией одного из важнейших клеточных сигнальных путей - каскада МАРК

Выявление механизмов регуляции экспрессии гена НЫР4а представляется важным для разработки новых подходов для терапии опухолей печени, а также для понимания фундаментальных основ процесса дифференцировки в ходе эмбрионального развития животных и человека

Апробация работы

Диссертация была апробирована 15 мая 2008 года на совместном заседании кафедры вирусологии Биологического факультета МГУ им М В Ломоносова и отдела иммунохимии НИИ Канцерогенеза ГУ РОНЦ им Н Н Блохина РАМН Материалы работы докладывались на международных и отечественных научных конференциях и школах молодых ученых «Динамика клеточных сигнальных путей», Осло, Норвегия, 2008, Летняя школа по ядерным рецепторам, Брегенц, Австрия, 2008, Летняя школа «Молекулярные механизмы регенерации», Спетсес, Греция, 2007, Лекционный курс «Трансдифференцировка в бета-клетки поджелудочной железы», Бат, Великобритания, 2007, «Функциональная геномика и протеомика», Анталия, Турция, 2006, 13 съезд Европейской Конференции по раковым исследованиям (ЕССО), Париж, Франция, 2005, 9 международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология- наука XXI века», Пущино, Россия, 2005

Публикации

По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ, в том числе 2 статьи в отечественных журналах и 8 тезисов международных конференций

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 121 странице машинописного текста, содержит 19 рисунков, 1 таблицу. Она включает в себя следующие разделы «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты исследования и их обсуждение», «Заключение», «Выводы», «Список литературы» Список литературы содержит 121 источник, в том числе 7 в отечественных рецензируемых изданиях

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Инактивация гена HNF4a является важной детерминантой канцерогенеза целого ряда эпителиальных тканей Вопрос об участии нетканеспецифических сигнальных путей в регуляции транскрипции HNF4a до сих пор остается актуальным Настоящее исследование было направлено на выявление факторов, которые могут дифференциально регулировать активность промоторных элементов гена I!NF4a и вызывать нарушение его экспрессии, наблюдаемое при гепатоканцерогенезе

1. В печени взрослых р5У1' мышей происходит активации экспрессии эмбриональных изоформ HNF4aP2

Для проверки предположения о возможном участии р53 в регуляции процесса дифференцировки клеток печени мы решили сравнить уровни экспрессии гепатоспецифических генов в нормальных и нокаутных по гену р53 мышах

Из образцов тканей печени и мышцы нормальных и нокаутных по гену р53 мышей выделяли тотальную РНК и проводили реакцию обратной транскрипции с последующей полимеразной цепной реакцией (ПЦР) со специфическими праймерами к исследуемым генам Для подтверждения точности выравнивания проводили ПЦР с праймерами к гену глицеральдегидтрифосфат дегидрогеназы (GAPDH, Glyceraldehyde-3-Phosphale Dehydrogenase) После выравнивания были исследованы уровни экспрессии функциональных генов и транскрипционных факторов печени, характеризующих уровень дифференцировки гепатоцитов альфа-фетопротеина (АФП), альбумина, HNF4a, HNFla, HNFI0, FOXA1, FOXA2, HNF6, FTF (Рисунок 1)

В этой серии экспериментов наиболее значимым изменением транскрипционной программы при инактивации р53 оказалась активация во взрослой печени р53 мышей транскрипции группы эмбриональных изоформ HNF4aP2. Согласно литературным данным, в печени нормальной взрослой мыши на долю эмбриональных изоформ приходится не более 1% суммарного количества мРНК HNF4a [Nakhei el at, 1998] Наряду с активацией транскрипции HNF4aP2, в печени р53 ' мышей произошло снижение уровня мРНК HNF4aPl Этот факт указывает на возможное участие белка р53 в регуляции экспрессии гена HNF4a На уровень экспрессии других генов, кодирующих дифференцировочные маркеры и транскрипционные факторы, характерные для дифференцированных гепатоцитов, таких как альбумин, HNFla, HNFlfi, FOXAl, FOXA2, HNF6 и FTF, нокаут р53 существенного влияния не оказал

Активация экспрессии эмбриональной формы белка HNF4a в печени нокаутных по гену р53 мышей представляется значимой по нескольким причинам. Во-первых, ранее в нашей лаборатории была описана активация HNF4aP2 на ранних этапах

Рисуаок 1. Анализ экспрессии гепатоспецифических генов в печени р53"/" мышей методом ОТ-ПЦР.

Фотография электрофореза продуктов ОТ-ПЦР со специфическими праймерами к указанным генам. р53" - печень и мышца мышей, нокаутных по гену р53\ р53" -печень и мышца нормальной взрослой мыши. ПЦР с праймерами к гену САРйН использовали для выравнивания количества РНК, взятого в реакцию; контроль -негативный контроль (ПЦР без обратной транскрипции).

гепатоканцерогенеза. Активация экспрессии НЫР4аР2, наблюдаемая в абсолютном большинстве образцов опухолей печени мыши и человека, позволяет рассматривать этот фактор как возможный маркер гепатоканцерогенеза [Флейшман е/а/, 2008].

В свою очередь, инактивация р53 является частым событием при гепатоканцерогенезе. Можно предположить, что р53 участвует в контроле дифференцировки гепатоцитов, подавляя экспрессию эмбриональной изоформы транскрипционного фактора Н№4а в печени, которая отвечает за активацию генов, характерных для незрелых предшественников гепатоцитов. В таком случае нарушение функции р53 могло бы стать причиной активации экспрессии эмбриональной изоформы Н№4аР2 при канцерогенезе и частичной дедифференцнровки опухолевых клеток.

2. Инактивация р53 в культуре клеток НерС2 при помощи ми-РНК приводит к индукции экспрессии НОТ4аР2

Для проверки гипотезы о возможном влиянии подавления транскрипционной активности р53 на уровень экспрессии Н№4аР2 в клетках гепатоцитарного происхождения мы решили провести эксперименты по инактивации р53 в клетках культуры гепатомы человека Нер02 и оценить изменение уровней транскрипции двух групп изоформ НЫР4а. Исходно, в Нер02 экспрессируются изоформы Н№4аР1 и по литературным данным р53 дикого типа [Вгезэас е1 а!, 1990]. При помощи лентивирусной инфекции мы провели трансдукцию клеток линии Нер02 лентивирусным вектором, кодирующим малые интерферирующие РНК к гену р53 (ми-р53). Максимальный уровень снижения количества р53-позитивных клеток при трансформации ми-р53 составил примерно 70% (Рисунок 2 А).

Для проверки эффективности подавления синтеза р53 миРНК проводили Вестерн-

р53 -/- р53 +/+

бАРОН АФП

Альбумин

НМР4а

НШаРг

ШР4аР1

НШа

НМР1Р

РохА1

РохА2

НШ

А ______ НеРС2_______ Б Нервг

м«-р53

Рисунок 2. Инактивация р53 в клетках линии геиатомы человека Нерв2 приводит к индукции синтеза Н№4аР2 изоформ. А. Иммунофлуоресцентное окрашивание антителами к р53, НЫР4аР2 и Н№4аР1 клеток гепатомы человека Нер02 (левая панель) и их производных с подавленным при помощи миРНК синтезом р53 (правая панель). Окрашивание клеток антителами к белку р53 проводили после его индукции доксорубицином (с1ох, 0.5 мкг/мл) в течение 24 часов. Увеличение х200, врезки в правом верхнем углу - увеличение х400. Здесь и далее - Оох - доксорубицин, ми-р53 - линия НерС2, стабильно экспрессирующая миРНК к р53. Б. Вестерн-блот анализ клеточных лизатов НерС2 и НерС2, экспрессирующих миРНК к р53, с антителами к р53. Индукцию р53 проводили с помощью доксорубицина, который вносили в культуральную среду в концентрации 0.5 мкг/мл, инкубацию проводили в течение 24 часов. Выравнивание количества белка осуществляли по связыванию с антителами к а-тубулину. В. ОТ-ПЦР анализ проводили с использованием специфических праймеров к Н№4аР1 и НМР4аР2. ПЦР с праймерами к гену САРОН использовали для выравнивания количества РНК, взятого в реакцию.

блот анализ контрольных клеток линии Нерв2 и клеток Нер02, трансформированных ми-р53, антителами к р53 (Рисунок 2 Б). Индукция р53 при помощи доксорубицина (0.5 мкг/мл) приводит к значительному увеличению содержания этого белка в клетках НерС2, в то время как в линии, экспрессирующей ми-р53 обнаруживаются лишь следовые его количества (Рисунок 2 А, Б). Эти эксперименты подтвердили, что использованная ми-р53 действительно значительно подавляет уровень синтеза этого белка в клетках Нер02.

Для проверки влияния подавления функции р53 на активность Р1 и Р2 промоторов гена НИР4а, мы исследовали изменения уровней экспрессии РНК двух групп изоформ в клетках гепатомы человека НерС2, трансформированной вектором, экспрессирующим ми-р53, методом ОТ-ПЦР (Рисунок 2 В). Дифференциальное исследование уровней транскрипции двух групп изоформ НИР4а показало, что инактивация р53 приводит к

индукции экспрессии НЫР4аР2, в то время как уровень экспрессии изоформ НЫН4аР 1 не меняется

Иммунофлуоресцентную окраску клеток на изоформы ЬШБ^а проводили с использованием антител к НММсП-аб, распознающих изоформы, транскрибирующиеся с промотора Р1, или НЫ(;4и7-а9 - для изоформ, контролируемых промотором Р2 (Рисунок 2 А) Было обнаружено, что подавление функции р53 вызывает значительное увеличение количества клеток, синтезирующих эмбриональные изоформы Н№4аР2, в то время как в контрольных клетках синтез эмбриональных изоформ выявляется лишь в небольшом проценте клеток Необходимо отметить, что так же, как и в эксперименте с оценкой количества РНК различных изоформ методом ПЦР, уровень синтеза взрослых изоформ ЮЛ^аР! в клетках гепатомы НерС2 не зависел от экспрессии р53

3. Снижение уровня р53 вызывает акт ивацию промотора Р2 в клетках НерС2

Экспрессия эмбриональных изоформ мРНК HNF4a происходит с альтернативного промотора Р2 Для того чтобы проверить, осуществляется ли р53-зависимое изменение уровня экспрессии эмбриональных изоформ НЫЬ'4аР2 в опухолевых клетках за счет регуляции соответствующего промотора, мы решили выяснить, будет ли инактивация р53 с помощью малых интерферирующих РНК (миРНК) в культуре клеток Нер02 приводить к изменению транскрипционной активности Р2 Для этого мы клонировали проксимальный Р2 промоторный участок гена НЫГ4а мыши размером 934 п о (-921Л13 п о) в экспрессирующий вектор рОЬЗ-Вазю, содержащий репортерный ген люциферазы

Полученную генетическую конструкцию рОЬЗ-НОТ4аР2 трансфицировали в клетки линии Нер02, а также в ее клоны, стабильно экспрессирующие миРНК к р53 В параллельных экспериментах те же клетки трансфицировали вектором рОЬЗ-Вазю, лишенным промотора

Для контроля эффективности трансфекдии и выравнивания полученных результатов в этих и последующих экспериментах проводили котрансфекцию клеток репортерными конструкциями совместно с вектором рКЬ-'ГК (Ргоп^а), кодирующим ген люциферазы ЯгтЦа гет/огпчз С помощью системы двойной люциферазной детекции последовательно определяли активность обоих люциферазных генов гена люциферазы светлячка, кодируемого плазмидами рС1,3-Ва51с и рОЬЗ-НЫ[-4аР2, а также гена люциферазы ЯетПа гет/огтк, по люциферазной активности которого производили нормализацию результатов измерений

Инактивация р53 в клетках Нер02 привела к повышению активности репортерного гена под контролем фрагмента промотора Р2 гена НЫР4а в 3-4 раза (Рисунок 3) Таким образом, в клетках линии гепатомы человека НерС2 при инактивации р53 происходит

о Нер02

■ Нер02 ♦ лш-р53

г*

рС13-Ва51С рС13-НМР4аР2

Рисунок 3. Влияние инактивации р53 на активность регуляторного района Р2 гена ШЧУ4а в клетках линии гепатом ы человека НерСЗ. Клетки НерС2 и НерС2, стабильно экспрессирующие миРНК к р53, ко-трансфицировали векторами рОЬЗ-Ва5|'с или р01,3-рНЫР4аР2, через 24 часа после трансфекции измеряли активность люциферазы. Изменение активности репортерного гена определяли как отношение активности люциферазы в клетках Нер02, экспрессирующих миРНК к р53, к активности в котрольном препарате НерС2, котрансфицированном той же репортерной конструкцией.

индукция активности иромоторного элемента Р2 гена НА'Р~4а, которая определяется проксимальным регуляторным участком размером 934 п. о.

На основании полученных нами результатов можно сделать вывод, что отсутствие р53 ведет к недостаточной дифференцировке клеток гепатоцитарного происхождения, которая маркируется экспрессией маркера эмбриональных гепатоцитов Н№4аР2. Можно предположить, что при нормальном развитии гепатоцитов из предшественников гепатобластов р53 участвует в подавлении экспрессии гена НЫР4а с альтернативного промотора Р2. Инактивация р53 приводит к индукции в гепатоцитах взрослой мыши, а также в клетках гепатомы человека НерС2 экспрессии эмбриональных изоформ Н№4и. Полученные данные позволяют заключить, что это накопление вероятнее все вызвано отменой негативной регуляции промотора Р2 транскрипционным фактором р53.

4. Биоинформатический анализ нуклеотидиой последовательности иромоторного элемента Р2 гена НОТ4а мыши и человека

Действие регуляторов транскрипции на гены-мишени опосредованно рсспонсивными элементами, находящимися в той или иной области иромоторного района этого гена. Исследуя механизмы регуляции активности проксимального промотора Р2 гена НИР4а, мы решили выяснить, может ли белок р53 непосредственно связываться с последовательностью этого промотора. Для оценки возможности /ирдне-активации регуляторного элемента Р2 белком р53, а также другими транскрипционными факторами, мы провели анализ последовательности проксимального промотора Р2 мыши и человека, используя программное обеспечение МаЙ-чрейог из пакета Оепогших.

При анализе Р2 промотора (-1500/+50 п о.) мыши программа не выявила присутствия возможных сайтов связывания белка р53 Однако при проверке гомологичного фрагмента промотора Р2 гена HNF4a человека нами был обнаружен потенциальный сайт связывания белка р53 в районе -255/-233 п о Указанная область в последовательности промотора мыши содержит несколько замен по сравнению с последовательностью регуляторного района человека Безусловно, однозначно интерпретировать полученные биоинформатические данные нельзя, так как они нуждаются в экспериментальной проверке, однако они указывают на возможность связывания белка р53 с промотором Р2, которое обуславливает подавление его активности и снижение уровня экспрессии HNF4aP2 в печени при нормальном развитии.

Ранее сообщалось, что проксимальный Р2 промотор гена HNF4a мыши содержит вероятный сайт связывания Smad белков, так называемый SBE (Smad binding element) [Briancon et al, 2004] Анализируя последовательность промоторного участка Р2 гена HNF4a мыши и человека с помощью программы Matlspector, мы также обнаружили в обеих последовательностях консервативный сайт SBE в районе -248/-244 п о Белки Smad являются ключевыми элементами TGFp-индуцируемого сигнального пути, фосфорилирование которых происходит в ответ на связывание цитокина TGFp с рецептором Кроме этого, мы выявили сайты связывания транскрипционных регуляторов HNF1, Pdx, HNF6 и GATA, которые по многочисленным литературным данным являются регуляторами экспрессии HNF4a

Необходимо отметить, что в промоторной последовательности Р2 HNF4a человека сайт SBE (-24S/-244 п о) находится непосредственно между двумя полу-сайтами связывания белка р53 (-256/-233 п о ), образующими его консенсусную последовательность. Можно предположить, что регуляция экспрессии гена HNF4a по крайней мере частично осуществляется кооперативным действием р53 и TGFp-зависимых сигнальных путей

5. Действие цитокввов TGFfll в TGFp2 проводит к изменению баланса экспрессируемых изоформ HNF4a в культуре клеток HepG2

Эксперименты, ранее проведенные в нашей лаборатории, выявили, что одноступенчатая прогрессия ГК мыши, ассоциированная с репрессией гена HNF4a, сопровождается гиперэкспрессией факторов семейства TGFp и, в частности, TGFp2 [Овчинников, 2004] Мы решили исследовать действие факторов TGFpl и 2 на изменение спектра экспрессии печеньспецифических генов в культуре гепатомы человека HepG2

ТСР[]

Рисунок 4. Влияние цитокинов семейства ТСКр на экспрессию печеньспецифических генов в культуре НерС2. Клетки инкубировали в культуральной среде с 5 нг/мл ТОРр! (дорожки 1 и 3) или ТОрр2 (дорожки 2 и 4) в течение 24 или 4В часов, после чего из клеток выделяли РНК и проводили ОТ-ПЦР Н/О - клетки, не обработанные цитокином Реакцию с праймерами к гену САР ОН использовали для выравнивания количества РНК, взятого в реакцию.

Для того чтобы выяснить, влияет ли активация сигнальных путей, регулируемых ТСРр, на экспрессию гена НМР4а и других гепатоцитарных ядерных факторов и маркеров дифференцировки в клетках гепатомы НерС2, мы инкубировали их в присутствии 5 нг/мл ТОРр1 или ТСРр2 в течение 24 или 48 часов и анализировали экспрессию интересующих нас генов методом ОТ-ПЦР со специфическими праймерами.

Мы обнаружили, что эффект, оказываемый на клетки гепатомы Нер02 цитокинами семейства ТОРр, сходен с изменениями, наблюдаемыми в печени р53 мышей -происходит активация экспрессии эмбриональных изоформ Н№4аР2 и частичное подавление уровня экспрессии взрослых изоформ Н№4аР1 (Рисунок 4). Было показано, что оба указанных цитокина оказывают сходный эффект на экспрессию изоформ. Через 24 часа после добавления цитокинов наблюдается максимальная индукция экспрессии эмбриональных изоформ ЬПМР4аР2, а через 48 часов уровень транскрипции взрослых изоформ 11ЫР4аР1 достигает минимума.

Необходимо отметить, что наряду с подавлением экспрессии РПчГР4аР], через 48 часов происходит репрессия респонсивного по отношению к НОТ4а гена НЫР1а, который в свою очередь является активатором транскрипции НМ-ЧссРР Можно говорить о том, что действие факторов семейства Тврр на линию человеческой гепатомы приводит к нарушению авторегуляторной петли, включающей в себя факторы семейств НЫР4а и НОТТа. При воздействии Тйрр в клетках НерС2 наблюдалось также подавление экспрессии С/ЕВРа, гепатоцитарного ядерного фактора, участвующего в активации экспрессии промотора Р1 гена НИР4а [На1г18 е/я/, 2006]. Возможно, снижение экспрессии с/еЬра является событием, предшествующим падению уровня транскрипции НОТ4аРР

Р1 (32 Р1 (32 н/'о

СгАРПЖ НКТ4а1'1

С/ЕВРа Л;н.б\ мин

Кроме того, под действием ТвРр в клетках Нер02 происходит подавление экспрессии основного маркера дифференцированных гепатоцитов, альбумина Экспрессия этого гена частично регулируется транскрипционным фактором Н№Ча Можно предположить, что подавление экспрессии гена альбумина происходит вследствие снижения транскрипции ЬЮТ4аР1, которая приводит к снижению уровня НИР ¡а

Экспрессия других гепатоцитарных ядерных факторов и дифференцировочных маркеров клеток печени в исследуемой системе не претерпела значимых изменений

Таким образом, полученные результаты указывают на то, что факторы семейства Тврр оказывают значительное влияние на регуляцию экспрессии !ШГ4а В результате их действия может происходить активация экспрессии эмбриональных изоформ [ 1№4а и падение экспрессии взрослых изоформ Можно предположить несколько механизмов, лежащих в основе изменения баланса экспрессии двух групп изоформ 1) действие факторов ТОРр изменяет активность одного из промоторов, в результате чего изменяется внутриклеточное соотношение групп изоформ, которое приводит к модуляции активности второго промотора, те имеет место авторегуляция, 2) активация ТвИр сигнального пути приводит к переключению активности промоторов НЫР4а, которое может происходить посредством других транскрипционных факторов, но не через авторегуляцию

В пользу первой возможности могут свидетельствовать литературные данные о негативной регуляции Р2 промотора изоформами гена ПЫР4а, экспрессирующимися с Р1 [Впапсоп г/ а!, 2004] Можно предположить, что подавление активности промотора Р1 приводит к снижению внутриклеточного уровня изоформ НМР4аР1, которое в свою очередь снимает репрессорное действие, оказываемое в норме на промотор Р2 Однако, из результатов ОТ-ПЦР (Рисунок 4) видно, что активация промотора Р2 происходит быстрее, чем подавление Р1 Таким образом, для подтверждения того или иного механизма необходимы дополнительные эксперименты

6. Компоненты ГСрр сигнального пути активируют промотор Р2 напрямую, в то время как репрессия промотора Р1 опосредована дополнительными факторами

Для проверки гипотезы о том, что активация ТОРр-сигнального пути может приводить к активации экспрессии транскрипционных факторов, которые опосредуют действие цитокинов на изменение активности промоторов Р1 и Р2 гена ЬпГ4а, мы решили использовать блокатор цитоплазматического белкового синтеза циклогексимид Этот эксперимент должен был показать, требуется ли синтез каких-либо дополнительных белковых молекул для ТОрр-зависимой активации экспрессии ЬШР4аР2 и подавления Н№4аР1

НерС2

+ НЫР4а7

САРОН

НЫР4аР2

яимз

НЫР4аР1

НЫР1(3

АроА4 АФП

ШШЯЯШШШёщ

Рисунок 6. Гиперэкспрессия изоформы HNF4а7 не приводит к подавлению экспрессии HNF4aPl изоформ. Оценка уровня экспрессии изоформ НМР4а и других печень специфических генов при гиперэкспрессии НЬ!Р4а7 в клетках линии гепатомы человека Нерв2 методом ОТ-ПЦР.

Клетки линии Нерв2 обрабатывали циклогексимидом в концентрации 25 мкг/мл за один час до внесения в культуральную клеточную среду ТСрр2 (5 нг/мл). После добавления цитокина клетки инкубировали еще 24 часа для оценки временной зависимости действия ТОРр2. Затем клетки собирали, выделяли РНК и проводили ОТ-ПЦР. Используя специфические праймеры, мы оценивали уровни экспрессии двух групп изоформ гена НЫР4а, транскрипция которых регулируется промоторами РI и Р2 (Рисунок 5). В необработанных клетках экспрессируются в основном изоформы РГЫР4аР1 и обнаруживаются лишь следовые количества НМР4аР2. В клетках, обработанных цитокином, наблюдается обратная ситуация - преобладают изоформы Н№4аР2, в то время как НЫР4аР1 присутствуют в минорных количествах. Добавление цитокина ТСРР2 к клеткам, обработанным циклогексимидом, не меняет уровень экспрессии НМР4аР1, однако индуцирует транскрипцию НЫР4аР2. Сам по себе циклогексимид не влияет на уровень активности промоторов НЫР4а. Аналогичные результаты были получены нами при использовании цитокина Тврр1 (данные не представлены).

Таким образом, можно сделать вывод о том, что индукция экспрессии НЫР4аР2 при активации ТвРр сигнального пути происходит напрямую. В то же время, ингибирование активности промотора Р1 происходит опосредованно и требует дополнительного белкового синтеза.

Полученные результаты позволили предположить, что подавление экспрессии изоформ Н№4аР1, которое происходит параллельно с активацией транскрипции Н№4ссР2, может быть связано с ингибирующим действием на промотор Р1 эмбриональных изоформ гена НЫР4а, синтезирующихся с промотора Р2.

Для проверки выдвинутой гипотезы в нашей лаборатории была создана линия клеток гепатомы человека HepG2, стабильно экспрессирующая HNF4a7 Анализ спектра экспрессии изоформ HNF4a, а также других генов, экспрессия которых на наш взгляд могла подвергнуться изменениям, был проведен с помощью ОТ-ПЦР со специфическими праймерами (Рисунок 6) Для подтверждения того, что HNF4a7 трансформированная линия экспрессирует именно экзогенный HNF4a7, мы проводили ОТ-ПЦР со специфическими праймерами к HNF4a и маркерной последовательности Flag, которая находится в экспрессирующем векторе непосредственно после кодирующего участка гена HNF4a и, как было показано ранее, не влияет на транскрипционные свойства образующегося белка

Мы обнаружили, что стабильная экспрессия HNF4a7 не влияет на транскрипцию изоформ HNF4aPl Таким образом, предположение о том, что активация транскрипции изоформы HNF4aP2 достаточна для репрессии промотора Р1 в этой системе, не подтвердилось Следовательно, активация TGFP-зависимого сигнального пути приводит к изменению активности промоторов Р1 и Р2 гена HNF4a в результате индукции механизмов, не связанных с взаимной регуляцией двух групп изоформ Тот факт, что подавление белкового синтеза приводит к блокированию TGFp-зависимого ингибирования транскрипции «взрослых» изоформ HNF4a может говорить о двух возможных механизмах регуляции HNF4a активация TGFp-сигнального пути приводит к индукции синтеза какого-то транскрипционного репрессора, либо к подавлению экспрессии транс-активатора промотора Р1 По всей вероятности, репрессия Р1 промотора не связана с активацией экспрессии гена HNF4aP2

7. Факторы TGFpi и TGFp2 способны активировать экспрессию репортерного гена под контролем Р2 промотора HNF4a мыши

Для определения механизма действия цитокинов семейства TGFp на экспрессию гена HNF4a в клетках гепатомы мы решили исследовать их влияние на активность промотора Р2 Основываясь на результатах описанных выше экспериментов, мы сделали вывод о том, что активация промотора Р2 связана с непосредственной индукцией TGFP-зависимого сигнального каскада и не требует синтеза дополнительных регуляторов транскрипции Чтобы подтвердить, что цитокины TGFp активируют экспрессию изоформ HNF4aP2 именно на транскрипционном уровне, мы решили оценить их влияние на активность промотора Р2 Для этого мы использовали полученную ранее репортерную конструкцию pGL3-HNF4aP2

Клетки линии HepG2 были трансфицированы плазмидой pGL3-HNF4aP2, содержащей ген люциферазы под контролем промотора Р2, или контрольным вектором

HepG2

цгм

+ 25 ч + 25 ч

TGFp

GAPDH HNF4aP2 HNF4aP1

+ 24 ч

Рисунок 5. TGFp индуцированная активации экспрессии HNF4aP2 происходит напрямую и не требует белкового синтеза de novo, в отличие от супрессии промотора Р1. Оценка уровня экспрессии изоформ HNF4a при активации TGFp сигнального пути и ингибировании белкового синтеза циклогексимидом (ЦГМ) методом ОТ-ПЦР. Внесение в культуральную среду цитокина TGFP2 (5 нг/мл) через час после добавления циклогексимида

приводит к активации экспрессии HNF4aP2, но подавляет экспрессию HNF4aP 1.

рСЬЗ-Вазю, не содержащим промотора. Через 24 часа после трансфекции клеткам меняли культуральную среду и добавляли в нее цитокины ТОИр! или ТОРр2 до концентрации 5 нг/мл. Клетки инкубировали в течение следующих 24 часов, после чего проводили измерение активности люциферазы. Оказалось, что цитокины Тйрр 1 и ТОРр2 повышают активность промотора Р2 в среднем в 4.4 и в 2.8 раз соответственно по сравнению с необработанными клетками (Рисунок 7). Полученные результаты свидетельствуют о том, что участок промотора Р2 гена НЫР4а мыши, клонированный в вектор рОЬЗ-Ва81С, способен транс-активироваться в результате индукции ТСРр-зависимых сигнальных каскадов.

8. Ингибирование передачи сигнала от рецептора Тврр препятствует подавлению синтеза Н№4аР1 и активации Н^4аР2

Исследования роли цитокинов семейства Тйрр в гепатоканцерогенезе в основном сконцентрированы на изучении ТСррг В то же время, существуют указания на то, что механизмы действия ТСРр2 и ТйРР1 могут значимо отличаться. Несмотря на то, что действие цитокинов ТОРр1 и Т0РР2 осуществляется посредством связывания с одним и тем же рецепторным гетеродимером, аффинность ТОР|}2 значительно ниже, и он предпочтительнее активирует его в комплексе с бетагликаном. В нашей лаборатории было показано, что в печени нормальной мыши экспрессии цитокинов ТСРр не происходит. Однако ТОрр1 экспрессируется во всех проанализированных ГК мыши, независимо от степени злокачественности и уровня дифференцировки, в то время как гиперэкспрессия Тйрр2 наблюдается исключительно в дедифференцированных ГК [Овчинников, 2004] Мы

Рисунок 7. Действие цитокинов семейства ТСК|) на активность регуляторного района Р2 гена Н1ЧР4а мыши. Клетки НерС2 трансфицировали векторами рОЬЗ-Вазю или рСЬЗ-НЫР4аР2, через 24 часа после трансфекции в среду вносили цитокины ТОРр! или ТОрр2 (5 нг/мл). Активность люциферазы измеряли через следующие 24 часа. Изменение активности репортерного гена определяли как отношение активности люциферазы в опыте к активности в контрольном препарате, не обработанном цитокином.

pGL3-Basic pGL3-HNF4aP2

решили сфокусировать наше исследование TGFp-зависимой регуляции экспрессии hnf4a на действии TGFß2, так как результаты предыдущих исследований подтверждают, что именно его экспрессия может быть ассоциирована с опухолевой прогрессией и дедифференцировкой.

Для того чтобы удостоверится, что эффекты, которые оказывает TGFß2 на экспрессию гена HNF4a, специфичны и связаны именно с активацией TGFß-рецептора первого типа, мы использовали ингибитор киназного домена TGFP рецептора 1 III (SB-055124). Клетки гепатомы HepG2 обрабатывали ингибитором киназного домена SB-055124 в концентрации 1 мкМ вместе с цитокином TGFß2 (5 нг/мл). Клетки инкубировали 24 часа, фиксировали и проводили иммунофлуоресцентное окрашивание специфическими антителами к различным группам изоформ белка HNF4a (Рисунок 8 А). Мы обнаружили, что ингибирование киназного домена TGFßRl блокирует TGPß-зависимую активацию экспрессии HNF4aP2 и подавление экспрессии HNF4aPl.

Мы также проверили, как меняется активность промотора Р2 гена HNF4a при одновременном действии TGFP2 и ингибитора киназного домена TGFßRl. Для этого мы провели серию трансфекций клеток линии HepG2 репортерной конструкцией pGL3-HNF4aP2 и обрабатывали их цитокином TGFß2, ингибитором TGFßRl или совместно ингибитором и цитокином. Активность люциферазы измеряли через 24 часа после обработки. Как мы и предполагали, активность промоторного элемента в клетках, которые инкубировали в культуральной среде с SB-055124 и TGFß2, не отличалась от таковой для образцов, не обработанных цитокином (Рисунок 8 Б).

HepG2

anti HNFiaP2

« SB-055124 ♦ SB-055124 * TGF02

Рисунок 8. Ингибитор киназного домена TGF0R1 SB-055124 блокирует TGF0-зависимое переключение экспрессии изоформ HNF4a. А. Иммунофлуоресцентное окрашивание клеток линии HepG2 специфическими антителами к различным группам изоформ белка HNF4a при активации TGFp сигнального пути и использовании ингибитора киназного домена TGFpRl SB-055124. Увеличение х200, врезки в правом верхнем углу - увеличение х400. Б. Изменение активности репортерного гена люциферазы в клетках HepG2 при внесении в культуральную среду цитокина TGFP2 и ингибитора киназного домена TGFPR1 (Объяснение в тексте).

Таким образом, можно заключить, что действие, оказываемое TGFP2 на экспрессию двух групп изоформ FlNF4a, осуществляется посредством передачи сигнала именно через рецептор TGFpRl, который способен активировать внутриклеточные каскады белковых взаимодействий, приводящих к модулированию транскрипции генов-мишеней.

Действие цитокина TGFP2 оказывает плейотропный эффект на транскрипционную программу клетки. Сигнал, индуцируемый активацией рецептора TGFp, ведет к индукции не только так называемого классического сигнального пути, включающего в себя каскад

Smad белков Эксперименты на различных клеточных линиях демонстрируют участие в Smad-независимом каскаде реакций таких сигнальных систем, как белки семейства малых ГТФаз Ras, а также компонентов системы МАРК ERK/JNK/p38 [Yue and Mulder, 2000]

9. Направленный мутагенез предполагаемого сайта связывания Smad в промоторе Р2 гена HNF4a человека не приводит к изменению активности этого промотора под действием TGF02

Наличие в Р2 промоторе сайта связывания Smad4, обнаруженного в результате анализа нуклеотидной последовательности, заставило нас предположить, что TGFfl-зависимая индукция Р2 происходит именно в результате активации каскада Smad белков Для проверки этого предположения мы решили провести эксперименты по направленному мутагенезу потенциального сайта SBE в промоторе Р2 гена HNF4a человека.

В результате клонирования Р2 промотора HNF4a человека в репортерный вектор pGL3-Basic, мы получили вектор pGL3-hIINF4aP2, содержащий фрагмент проксимального промотора Р2 размером 531 п о (-513/+18 относительно ATG) Сайт-направленный мутагенез Smad-респонсивного элемента промотора Р2 осуществляли при помощи ПЦР с праймерами, содержащими двухнуклеотидные замены, которые нарушали консенсусную последовательность SBE В качестве матрицы для ПЦР использовали сконструированный нами вектор pGL3-hHNF4aP2 В результате мы получили вектор pGL3-hP[NF4aP2_SBEmut, содержащий ген люциферазы под контролем фрагмента проксимального промотора Р2 гена HNF4a человека размером 531 п о с двумя заменами по положениям -248 и -247 в предполагаемом сайте SBE

Затем мы провели серию опытов по трансфекции полученных репортерных конструкций pGL3-hHNF4aP2 и pGL3-hHNF4aP2_SBEmut в клетки линии HepG2 На следующий день после трансфекции в культуральную среду вносили TGFP2 в концентрации 5 нг/мл Уровень люциферазной активности измеряли через 24 часа после начала инкубации с цитокином TGFP2.

Эта серия экспериментов показала, что под действием фактора TGFp2 происходит активация промоторного элемента Р2 гена HNF4a человека размером 531 п о приблизительно в 2 раза Мутация в предполагаемом сайте SBE не вызывает значимого подавления активности клонированного промоторного элемента (Рисунок 9)

Исходя из возможных механизмов TGFp-зависимой регуляции экспрессии гена HNF4a, можно предположить, что действие TGFP2 в исследуемой системе реализуется за счет активации Smad-независимых сигнальных путей Для проверки этой гипотезы мы провели серию экспериментов по инактивации Smad4 при помощи миРНК По

рО|Л-Ва51С рС13-ИНМР4аР2 р01_3-|1НиР4аР2

ЗВЕпнЛ

Рисунок 9. Действие Твгр2 на активность регуляторного района Р2 гена Н1ЧЕ4а человека и регуляторного района с мутантным 8ВЕ Клетки Нер02 трансфицировали векторами рСЬЗ-Ваз1с, рвРЗ-ИНЫР4аР2 или рОЬЗ-ЬРГЫР4аР25ВЕти1, через 24 часа после траисфекции в среду вносили цитокин ТОРр2 (5 нг/мл). Активность люциферазы измеряли через следующие 24 часа.

предварительным результатам инактивация указанного эффекторного компонента БтасР сигнального каскада не влияет на ТСРр-зависимую индукцию экспрессии НЫР4аР2, что свидетельствует в пользу БшасРнезависимого механизма регуляции Р2 (данные не представлены). Тем не менее, эти эксперименты нуждаются во всестороннем анализе и будут продолжены

10. Ингибирование МЕК сигнального пути блокирует ТСРр-зависимое подавление экспрессии изоформ НМ"4аР1, но не влияет на активацию Н№4аР2

Поскольку в литературе встречаются указания на то, что факторы ТОРр могут активировать каскад МАРК и изменять экспрессию генов через ЭтасРнезависимый путь, мы решили проверить, участвуют ли компоненты МЕК/ЕЯК сигнального пути в Тврр-зависимой регуляции транскрипции НЫГ4а в исследуемой системе.

Клетки линии Нер02 обрабатывали специфическим ингибитором МЕК РЭ 98059 в концентрации 20 мкМ, а также цитокином ТОРР2 (5 нг/мл). Ингибитор РЭ 98059 блокирует МЕК, киназу из класса МАРК и, соответственно, передачу сигнала от рецептора ТСрр к киназе ЕЯК., которая фосфорилирует транскрипционные факторы и регулирует транскрипцию генов-мишеней. Через 24 часа после начала инкубации проводили окрашивание специфическими антителами к двум группам изоформ НЫР4аР2 и НМ^аРР Мы обнаружили, что ингибирование киназы ЕЯК приводит к подавлению лишь одного из двух эффектов, оказываемых цитокином ТОРр2 на активность промоторов ЯЛТ4а, а именно препятствует ингибированию активности промотора РР ТОРр-зависимая индукция синтеза «эмбриональных» изоформ РПч(Р4аР2 в клетках гепатомы человека НерС>2 при ингибировании МЕК сохраняется (Рисунок 10 А).

Полученный результат позволил нам сделать вывод о том, что действие, которое оказывает индукция ТОРр сигнального пути на активность промоторов гена ЯЛ^а,

опосредованно запуском нескольких сигнальных путей. Активность промотора Р1 в исследуемой системе регулируется при участии МАРК, в то время как за регуляцию промотора Р2 отвечают, по всей видимости, другие сигнальные каскады.

Ранее было описано, что в клетках НерС2 активация МАРК приводит к снижению экспрессии НЫИ4а, которое связано с нарушением образования энхансер-промоторного комплекса. Ключевую роль в образовании указанного комплекса играет гепатоцитарный ядерный фактор С/ЕВРа, экспрессия которого также снижается при активации МАР-киназного каскада [На1г15 2006]. Мы продемонстрировали, что под действием цитокинов Тврр! и ТСРр2 происходит падение экспрессии фактора С/ЕВРа. Руководствуясь этими данными, мы решили проверить, как будет изменяться уровень синтеза С/ЕВРа в клетках НерС2 под действием ТОРР2 и при ингибировании МАРК сигнального пути.

Для этого мы проводили окрашивание клеток гепатомы человека НерС2 специфическими антителами к белку С/ЕВРа через 24 часа после внесения в культуральную среду цитокина ТОРр2 и/или ингибитора каскада МАРК Р0-98059. Было обнаружено, что под действием Тврр2 в клетках Нер02 происходит подавление синтеза белка С/ЕВРа, однако при ингибировании МАР-киназы ЕЯК этого подавления не наблюдается (Рисунок 10 Б). Таким образом, ТОрр-зависимое подавление С/ЕВРа

Нервг

Нерйг

: ж

¡ш

|у| за лги 1 Шйг^ вся тт

2|| - Ч шш \ ■к Я

Рисунок 10. Иигибирование киназы МЕК приводит к блокированию ТСЕ|1-зависимого подавления синтеза 1ШК4аР1 и С/ЕВРа, но не влияет на активацию НХГ4аР2. А. Иммунофяуоресцентное окрашивание клеток линии НерС2 специфическими антителами к различным группам изоформ белка РПЧР4а при активации ТОРр-сигнального пути и использовании ингибитора каскада МАРК. Б. Иммунофлуоресцентное окрашивание клеток линии НерС2 специфическими антителами к белку С/ЕВРа при активации ТОРр-сигнального пути и использовании ингибитора каскада МАРК. Клетки НерС2 обрабатывали специфическим ингибитором МЕК РО 98059 в концентрации 20 мкМ, а также цитокином ТОРр2 (5 нг/мл) в течение 24 часов, затем проводили окраску антителами к С/ЕВРа. Увеличение х200, врезки в правом верхнем углу - увеличение х400.

опосредованно именно активацией МАР-киназного сигнального пути, так же, как и подавление активности промотора Р1 гена HNF4a

Можно предположить, что наблюдаемое нами TGFp-индуцированная репрессия транскрипции изоформ HNF4aPI связана с подавлением экспрессии С/ЕВРа, ключевого фактора, обеспечивающего взаимодействие энхансера с Р1 промотором гена HNF4a

Однако наше наблюдение о том, что блокирование белкового синтеза при индукции TGFp-зависимых сигнальных путей отменяет к подавление экспрессии HNF4aPl изоформ, свидетельствует о том, что ключевую роль в TGFp-зависимом подавлении активности промотора Р1 в исследуемой системе играет не отсутствие активатора, а наличие репрессора этого промотора

11. Кооперация р53 и TGFP-сигнальных путей в регуляции транскрипции HNF4a

В серии предварительных экспериментов мы показали, что инактивация р53 может приводить к подавлению TGFp-зависимой репрессии Р1 промотора гена HNF4a В результате иммуногистохимического окрашивания клеток HepG2, экспрессирующих миРНК к р53, мы обнаружили, что в них может быть частично нарушен сигнальный путь, приводящий к TGFP-зависимому подавлению синтеза HNF4aPl Обработка этих клеток цитокином TGFP2 и последующее окрашивание антителами к различным изоформам HNF4a выявило наличие целой группы клеток, синтезирующих HNF4aPl В то же время активация экспрессии HNF4aP2 в клетках с ми-р53 при внесении TGFP2 происходит без каких-либо нарушений по сравнению с клетками HepG2 Наши наблюдения согласуются с литературными данными, в которых р53 дикого типа участвовал в подавлении экспрессии Р1 промотора HNF4a Важно отметить, что р53 с мутантным ДНК-связывающим доменом оказался не способен подавить экспрессию HNF4aPl [Maeda el at, 2006]

В пользу р53-зависимого подавления экспрессии HNF4ccP2 при активации TGFp-сигнального каскада также свидетельствуют данные, полученные в нашей лаборатории в экспериментах на клетках линии гепатомы человека Huh-7 [Hsu et al, 1993], экспрессирующих мутантный р53 Было показано, что обработка клеток Huh-7 цитокином TGFP2 в течение 24 часов приводит к активации экспрессии HNF4aP2, однако подавления экспрессии HNF4aPl в этих клетках не наблюдается [Доннер, неопубликованные данные] Однозначно интерпретировать эти данные нельзя, однако это может указывать на то, что TGFP-зависимая репрессия Р1 промотора гена HNF4a происходит при участии транскрипционного фактора р53 Возможно в отсутствие р53 или в случае, если р53 несет мутацию в ДНК связывающем домене, происходит блокировка TGFp-зависимого образования транскрипционного комплекса, репрессирующего Р1 промотор гена HNF4a

Заключение

В настоящей работе было проведено исследование роли опухолевого еупресеора р53 и TGFß в регуляции экспрессии гена HNF4a, кодирующего центральный регулятор дифференцировки гепатоцитов Оба указанных фактора регулируют нормальный клеточный рост, а нарушения функций сигнальных путей, регулируемых TGFß или р53, увеличивают вероятность возникновения опухолей

Мы показали, что в печени р53 мышей происходит индукция экспрессии эмбриональных изоформ гена HNF4a, HNF4aP2. Эксперименты на клетках гепатомы человека HepG2, в которых экспрессия р53 была подавлена при помощи малых интерферирующих РНК, подтвердили наши данные об активации транскрипции изоформ HNF4aP2 в отсутствие р53 Таким образом, нами был сделан вывод о том, что изменение активности одного из важнейших регуляторов клеточного цикла р53 может приводить к нарушению реализации дифференцировочной программы гепатоцитов, которое обусловлено изменением экспрессии важнейшего регулятора дифференцировки HNF4a

Мы также показали, что TGFß-зависимая активация сигнальных каскадов в клетках линии гепатомы человека HepG2 приводит к переключению синтеза изоформ HNF4a с взрослых на эмбриональные Ингибирование цитоплазматического белкового синтеза показало, что при индукции TGFß-сигнального пути активация экспрессии HNF4aP2 изоформ происходит без участия дополнительно синтезируемых регуляторов транскрипции, в то время как подавление экспрессии взрослых PINF4aP I изоформ требует дополнительного белкового синтеза Мы показали, что в результате действия TGFß происходит активация промоторов Р2 гена HNF4a как мыши, так и человека, а ингибирование киназного домена рецептора TGFß первого типа (TGFßRl) подавляет активацию Р2 промотора и блокирует переключение экспрессии изоформ HNF4a Эксперименты по направленному мутагенезу потенциального сайта связывания Smad не подтвердили нашего предположения о Smad-зависимой активации экспрессии HNF4aP2

Исследование возможной активации МАРК под действием TGFß2 в этой системе показало, что под действием ингибитора фосфорилирования киназы ERK происходит блокирование сигнала от TGFß2 к PI промотору гена HNF4a, и TGFß-зависимого подавления экспрессии изоформ HNF4aPl не наблюдается

Существуют указания на то, что TGFß-зависимое подавление активности промотора PI может быть связанно с кооперативным вкладом р53 и TGFß-сигналыюго пути в регуляцию транскрипции гена HNF4a Однако это предположение нуждается в дополнительной экспериментальной проверке Кроме этого остается открытым вопрос о возможной роли Smad белков в активации Р2 промотора, а также поиск

непосредственного транскрипционного репрессора промотора Р1 Мы ожидаем, что проводимые в нашей лаборатории эксперименты по инактивации компонентов сигнального каскада 8тас1 белков помогут дать ответ на эти вопросы

Выводы

1 Впервые показано, что инактивация онкосупрессора р53 может индуцировать транскрипцию эмбриональных Р2 изоформ центрального регулятора дифференцировки гепатоцитов I ЮТ4и в печени взрослых мышей

2 Инактивация р53 в клетках гепатомы человека Нер02 вызывает повышение активности промотора Р2 гена ИЫЬ'4а

3 В клетках гепатомы НерС2 факторы ТСрр регулируют баланс изоформ НЫР4а за счет активации Р2 и подавления Р1 промоторов этого гена

4 ТОрр-зависимое подавление активности промотора Р1 происходит только после синтеза регуляторных белков, оказывающих репрессирующее действие на Р1 Активация Р2 промотора происходит без дополнительного белкового синтеза

5 Нарушение сайта связывания ТОРр-рсспонсшшого регулятора транскрипции белка БтасМ в промоторе Р2 не отражается на ТСрр-зависимой активации Р2

6 Подавление экспрессии Н№4аР1 в результате действия "ГОРр2 определяется активацией МАРК сигнального каскада

7 ТОрр-индуцированная репрессия промотора Р1 ассоциирована с подавлением транскрипции гена С/ЕВРа, одного из ключевых активаторов экспрессии 11КР4аР 1

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Лазаревич Н JI, Альперн Д.В. Гепатоцитарный ядерный фактор 4 в развитии и канцерогенезе эпителиальных тканей (2008) Молекулярная биология, том 42 (5) 763-781

2 Альперн Д.В., Макарова М В , Чернобельская О А , Флейшман Д И , Лазаревич Н Л р53 и TGFP регулируют экспрессию эмбриональной изоформы Гепатоцитарного Ядерного Фактора 4 в клетках гепатомы человека (2008) Российский Биотерапевтический Журнал, том 7(3) 56-69

3 Alpern D., Makarova М, Fleishman D, Chemobelskaya О, Lazarevich N Regulation of HNF4a expression by TGFp and p53 FEBS/ESF 16th Protein Kinase Meeting "Dynamics of Cell Signal Systems", September 25-29, Norway, Oslo , Abstract book, p 1

4 Лазаревич НЛ, Флейшман ДИ, Макарова MB, Альперн Д.В., Шавочкина ДА, Морозова О В , Патютко Ю И Гепатоцитарный ядерный фактор 4 в прогрессии опухолей печени Материалы IV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, 11-15 мая 2008, Новосибирск стр 417

5 Alpern D., Lazarevich N , Makarova М , Fleishman D, Chemobelskaya О Expression of HNF4alpha is switched under influence of TGFbeta and p53 Beta Cell Therapy Training Course "Transdifferentiation to Beta Cells", Bath, UK, June 26-28, 2007, 16-17

6 Fleishman D I, Makarova M V , Alpern D.V., Shavochkina D A , Kuznetzova A G , Morozova О V, Patyutko YI, Lazarevich N L Gene expression alterations in hepatocarcinogenesis EMBO/FEBS advanced course "Molecular Mechanisms in Signal Transduction and Cancer", August 15-24, 2007, Spetses Island, Greece, Abstract book, p 28

7 Lazarevich N, Fleishman D , Chemobelskaya О, Alpern D., Makarova M , Kuznetsova A, Shavochkina D , Morozova О , Patyutko Y Dysfunction of tissue-specific transcriptional network is an important determinant of hepatocellular carcinoma progression Budapest, Hungary 1-4 July 2006 EACR-19 Meeting Proceedings, 174

8 Альперн Д., Лазаревич H , Чернобельская О , Флейшман Д , Овчинников Д, Макарова М Влияние р53 и TGFp на экспрессию эмбриональной изоформы гепатоцитарного ядерного фактора 4 Материалы VI Международной конференции «Молекулярная генетика соматических клеток» 12-16 декабря 2005 г, Звенигород стр 40-41

9 Lazarevich N L , Fleishman D I, Chemobelskaya О A , Alpern D.V., Makarova M V, Morozova О V , Patyutko Yu I, Engelhardt N V Tissue-specific transcription factors network in hepatocellular carcinoma progression ECCO XIII Conference, 30 October - 3 November, 2005, Pans, France Eur J Cancer, 2005, v 3, No 2 (Suppl), p 215

10 Альперн Д.В., Лазаревич НЛ, Овчинников ДА, Чернобельская OA Изучение экспрессии гепатоспецифических генов в р53-/- мышах Биология- наука XXI века 9 международная Путинская школа-конференция молодых ученых Пущино, 18-22 апреля 2005 г Сборник тезисов, 5

Подписано в печать 27.10.2008 Формат 60x88 1/16. Объем 1.75 п.л. Тираж 100 экз. Заказ № 765 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119991 г.Москва, Ленинские горы, д.1 Главное здание МГУ, к. А-102

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Альперн, Даниил Валерьевич

ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

Цели и задачи исследования.

Научная новизна и практическая ценность работы.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.И

Гепатоцитарный ядерный фактор HNF4a.

Структура и функции HNF4a.

Структура белка.

Структура гена и изоформы.

Модуляция транс-активационных функций изоформ.

Функции HNF4a.

Метаболизм.

Клеточная адгезия и морфогенная активность.

Регуляция клеточного цикла.

Дифференцировочный фактор.

Диабет.

Гепатоканцерогенез.

Специфичность экспрессии и роль HNF4a на отдельных этапах онтогенеза.

Ранний эмбриогенез.

Поздний эмбриогенез и взрослый организм.

Регуляция экспрессии гена HNF4a.

Регуляция активности промотора Р1.

Регуляция активности промотора Р2.

Факторы, участвующие в регуляции экспрессии HNF4a.

Печеньспецифические факторы транскрипции.

HNF1.

С/ЕВР.

FoxA (HNF3).

HNF6 (Onecut).

COUP-TF.

GATA.

Нетканеспецифические аспекты регуляции активности HNF4a.

Опухолевый супрессор р53.

Участие белка р53 в процессе клеточной дифференцировки.

Последствия инактивации р53 у мышей.

Негативная регуляция АФП белком р53.

Негативная регуляция экспрессии HNF4aPl белком р53.

Трансформирующий фактор роста (TGFP).

TGFP лиганд.

Рецепторы TGFP.

Белки Smad.

TGFP сигнальный путь.

Альтернативные сигнальные пути.

TGFp-зависимая регуляция экспрессии HNF4a.

Кооперация р53 и TGFP сигнальных путей.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Список использованных растворов и сред.

Животные.

Клеточные линии.

Плазмидные конструкции.

Трансформация клеток Е. Coli.

Трансфекция и инфекция клеток линии HepG2.

Анализ активности репортерного гена люциферазы.

Выделение РНК.

Выделение высокомолекулярной геномной ДНК.

Выделение препаративных количеств плазмидной ДНК.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) с обратной транскрипцией (ОТ).

Клонирование промоторного участка Р2 гена HNF4a мыши.

Клонирование промоторного участка Р2 гена HNF4a человека и направленный мутагенез.

Электрофорез нуклеиновых кислот в агарозном геле.

Иммунофлуоресцентное окрашивание препаратов.

Вестерн-Блот гибридизация.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

В печени взрослых р53~/ мышей происходит активация экспрессии эмбриональной изоформы HNF4a7.

Инактивация р53 в культуре клеток HepG2 при помощи ми-РНК приводит к индукции экспрессии HNF4aP2.

Снижение уровня р53 вызывает активацию промотора Р2 в культуре клеток

IIepG2.

Биоинформатический анализ нуклеотидной последовательности промоторного элемента Р2 гена HNF4a мыши и человека.

Действие цитокинов TGFpi и TGF02 проводит к изменению баланса экспрессируемых изоформ HNF4a в культуре клеток HepG2.

Компоненты TGFP сигнального пути активируют промотор Р2 напрямую, в то время как репрессия промотора Р1 происходит опосредованно дополнительными факторами.

Факторы TGFpi и TGFP2 способны активировать экспрессию репортерного гена под контролем Р2 промотора HNF4a мыши.

Ингибирование передачи сигнала от рецептора TGFP препятствует подавлению синтеза HNF4aPl и активации HNF4aP2.

Направленный мутагенез предполагаемого сайта связывания Smad в промоторе Р2 гена HNF4a человека не приводит к изменению активности этого промотора под действием TGFP2.

Ингибирование МЕК сигнального пути блокирует TGFp-зависимое подавление экспрессии изоформ HNF4aPl, но не влияет на активацию HNF4aP2.

Возможная кооперация р53 и TGFp-сигнальных путей в регуляции транскрипции

HNF4a.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Механизмы транскрипционной регуляции гепатоцитарного ядерного фактора 4"

Формирование органов и тканей многоклеточного организма происходит в результате процессов деления и последующей специализации определенных групп клеток. Эти процессы регулируются в пространстве и времени. Переход клеток из менее специализированных типов в более специализированные называется клеточной дифференцировкой. Он сопровождается различными изменениями, которые можно оценивать физическими или биохимическими параметрами. Меняется размер клеток, их форма, полярность, степень подвижности и уровень метаболической активности. Процесс дифференцировки клеток может приводить к значительному изменению их морфологических или биохимических показателей, однако, за редким исключением, он не затрагивает изменений в последовательности ДНК. Таким образом, все указанные изменения происходят в результате модификации генетической программы клетки. Она характеризуется активностью определенной группы генов, которые позволяют клетке выполнять свои специализированные функции, в то же время гены, активность которых не востребована в данный момент в конкретном типе клеток, оказываются заблокированными. Изменение генетической программы или спектра экспрессирующихся в клетке генов может приводить к ее переходу в другой тип или утрате дифференцировки.

В процессе развития организма дифференцировка клеток происходит в результате действия на клетку внешних сигналов в виде ростовых факторов, которые активируют внутриклеточные сигнальные каскады реакций. В свою очередь эти каскады приводят к модуляции транскрипции определенной группы генов, которые формируют так называемые регуляторные сети. Сложная система иерархических взаимодействий в этих сетях может выражаться в том, что изменение уровня транскрипции одного или нескольких генов приводит к модификации всей генетической программы клетки.

По мере повышения специализации в клетке начинается экспрессия так называемых тканеспецифических генов, которая являются одним из основных критериев уровня дифференцировки. Эти гены отвечают за синтез белков, обеспечивающих функционирование данного типа клеток в структуре ткани и органа. Регуляцию их экспрессии осуществляют тканеспецифические факторы транскрипции, которые в свою очередь контролируются общими транскрипционными сигналами.

Дифференцировка клетки обычно сопровождается постепенным снижением числа активных генов. В то же время происходит увеличение активности отдельных генов, выполняющих специализированные функции. Этот процесс контролируетсявнутриклеточной системой регуляторов экспрессии генов, которые осуществляют тонкую настройку транскрипционной программы клетки при помощи сети тканеспецифических факторов транскрипции.

Регуляторная сеть гепатоспецифических ядерных факторов (ГЯФ, HNF -Hepatocyte nuclear factors) является одной из наиболее изученных моделей тканеспецифической регуляции экспрессии генов. Гепатоцитарные ядерные факторы играют центральную роль в установке и поддержании дифференцировки гепатоцитов. Они не только контролируют экспрессию гепатоспефических генов, но и регулируют процессы пролиферации и морфогенеза. Группа ГЯФ включает в себя пять семейств транскрипционных факторов HNF1, Fox A, HNF4, HNF6 и С/ЕВР, экспрессия которых выявляется не только в клетках печени, однако именно в них достигается максимальный уровень синтеза представителей всех семейств. Вероятно, тканевая специфичность экспрессии генов печени достигается в результате одновременного действия нескольких факторов [Лазаревич, 2000].

Одним из важных аспектов канцерогенеза наряду с нарушением механизмов регуляции клеточной смерти (апоптоза) и размножения (пролиферации), является утрата опухолевыми клетками дифференцировочного статуса. Так же, как и дифференцировка, обратно направленный процесс происходит в результате изменения спектра экспрессирующихся в клетке генов, которое обусловлено нарушением скоординированной работы факторов транскрипции.

Дедифференцировка опухолевых клеток, наблюдаемая в процессе гепатоканцерогенеза, ассоциирована с подавлением экспрессии целого ряда генов, кодирующих функциональные белки печени, компоненты межклеточных и адгезионных контактов, опухолевые супрессоры, а также тканеспецифические транскрипционные факторы.

Множество исследований демонстрирует, что гепатоцитарный ядерный фактор HNF4a играет одну из ключевых ролей в регуляции дифференцировки клеток печени. Сайты связывания этого транскрипционного фактора выявлены приблизительно в половине активно транскрибирующихся генов печени и поджелудочной железы человека [Odom et al., 2004]. Он регулирует экспрессию большинства остальных ГЯФ и играет решающую роль в развитии и нормальном функционировании печени и поджелудочной железы [Parviz et al., 2003 ; Kyrmizi et al., 2006]. Кроме того, эксперименты, проведенные в нашей лаборатории, показывают, что нарушение экспрессии HNF4a является важным этапом прогрессии гепатоцеллюлярных карцином, а восстановление его экспрессии вкультуре клеток дедифференцированной гепатокарциномы (ГК) мыши приводит к частичной реверсии злокачественного фенотипа [Lazarevich et al., 2004].

Регуляция экспрессии гена HNF4a другими гепатоцитарными ядерными факторами на разных этапах развития активно изучается. Однако до сих пор остается неясным, чем определяется нарушение экспрессии HNF4a, а также других тканеспецифических транскрипционных факторов в опухолях, и участвуют ли в этом процессе нетканеспецифические сигнальные каскады, особенно те из них, изменение активности которых происходит на разных стадиях канцерогенеза.

Экспрессия гена HNF4a осуществляется с двух независимых промоторов, в результате чего образуются две группы изоформ HNF4aP2 и HNF4aPl. Изоформы HNF4aP2 экспрессируются в эмбриональной печени и в норме не обнаруживаются после рождения, их замещают изоформы HNF4aPl. В то же время, экспрессия HNF4aP2 может происходить на ранних этапах гепатоканцерогенеза и свидетельствует о начальных этапах процесса дедиффереицировки [Lazarevich et al., 2004 ; Флейшман и др., 2008].

Существуют немногочисленные указания на то, что в регуляции экспрессии HNF4a могут участвовать различные нетканеспецифические факторы. К их числу относится онкосупрессор р53, белок, мутации которого часто встречаются в различных типах опухолей. Являясь транскрипционным фактором, р53 играет важнейшую роль в регуляции клеточного цикла и индукции апоптоза при повреждении ДНК [Bargonetti and Manfredi, 2002]. Есть данные о том, что инактивация гена р53 может приводить к блоку дифференцировки гепатоцитов [Dumble et al., 2001].

Цитокины семейства трансформирующих факторов роста р (TGF|3) являются вероятными кандидатами на роль связующего звена между печеньспецифическими и общими сигнальными путями, задействованными в процессе канцерогенеза. Факторы этого семейства участвуют в поддержании морфологических и дифференцировочных свойств, а также в контроле пролиферации и апоптоза как в печени, так и в других эпителиальных тканях [Thiery, 2002].

Роль TGFP в канцерогенезе двойственна. TGFpi был открыт как фактор, стимулирующий рост опухолей, но в дальнейшем было показано, что на некоторые виды опухолей он может оказывать супрессирующее действие [Massague, 1998]. Результаты недавних исследований свидетельствуют о том, что действие цитокинов TGF|3 на опухолевые клетки зависит от стадии канцерогенеза и особенностей исходной ткани, из которой произошла опухоль [Rossmanith and Schulte-Hermann, 2001 ; Breuhahn et al., 2006 ; Fransvea et al., 2008].

Цели и задачи исследованияЦелью настоящей работы являлось исследование механизмов регуляции транскрипции центрального фактора гепатоцитарной дифференцировки НЫР4а при гепатоканцерогенезе и проверка предположения об участии факторов р53 и ТСРр в этом процессе. В ходе работы планировалось выяснить возможное место компонентов общих сигнальных путей р53 и ТСРр в регуляции системы тканеспецифической экспрессии генов печени.

Указанная цель подразумевала решение следующих задач:1. Анализ спектра экспрессии гепатоспецифических транскрипционных факторов в печени мышей, нокаутных по гену р53.

2. Создание линии клеток Нер02 с инактивированным р53 и анализ ассоциированного с этим изменения спектра экспрессии гепатоспецифических генов, определяющих уровень дифференцировки клеток.

3. Исследование механизмов дифференциальной регуляции альтернативных промоторов гена НИР4а при подавлении экспрессии гена р53 и индукции ТОрр-зависимого сигнального пути в клетках гепатомы человека Нер02.

4. Изучение механизмов ТОрр-зависимого переключения экспрессии изоформ гена НЫР4а на этой модели.

Научная новизна и практическая ценность работыВ настоящей работе представлено исследование влияния факторовнетканеспецифических сигнальных путей на экспрессию центрального регулятора дифференцировки гепатоцитов ЬЮТ4а.

Многочисленные исследования показывают, что прогрессия гепатокарцином может быть связана с нарушением функций гепатоцитарных транскрипционных факторов. Одним из важнейших ГЯФ является 1-ЮТ4а, который рассматривается как ключевой регулятор гепатоцитарной дифференцировки. В нашей лаборатории было показано, что подавление экспрессии НИР4а является частым событием при прогрессии гепатокарцином, а его экзогенная экспрессия в клетках дедифференцированной гепатокарциномы мыши вызывает реверсию злокачественного фенотипа. Кроме того, активация экспрессии эмбриональных изоформ НИР4аР2 в печени может свидетельствовать о ранних этапах опухолевой трансформации. В последние годы появились данные о нарушении экспрессии 1ЮТ4а в карциномах почки и кишечника, чтопозволяет рассматривать этот фактор как потенциальный опухолевый супрессор для некоторых типов эпителиальных тканей.

За последнее десятилетие накоплено большое количество данных о механизмах взаимной регуляции между гепатоцитарными ядерными факторами. Однако до сих пор остается актуальным вопрос о взаимодействии сети ГЯФ с общими сигнальными каскадами. Существуют указания на то, что именно HNF4a может выступать в качестве связующего звена между сетью тканеспецифических регуляторов транскрипции и общими клеточными сигнальными путями. Частным случаем этой проблемы является вопрос о механизмах подавления активности HNF4a в канцерогенезе, которое происходит в результате нарушения внутриклеточных каскадов сигнальных реакций.

Таким образом, исследование возможных механизмов регуляции экспрессии HNF4a представляет не только теоретическое, но практическое значение.

В нашей работе мы показали, что экспрессия гена HNF4a может изменяться при инактивации опухолевого супрессора р53. Ранее были опубликованы данные о том, что в печени нокаутных по гену р53 мышей может происходить накопление недодифференцированных клеток-предшественников гепатоцитов. В ходе нашего исследования мы выяснили, что инактивация р53 повышает уровень экспрессии эмбриональных изоформ HNF4a в печени взрослой мыши и в культуре клеток гепатомы человека. Мы продемонстрировали, что подавление функции р53 в клетках гепатомы человека приводит к активации альтернативного промотора Р2 гена HNF4a.

Мы показали, что при активации TGFP-сигнальиого пути в культуре гепатомы человека происходит переключение экспрессии изоформ HNF4a со взрослых на эмбриональные, свидетельствующее о снижении уровня дифференцировки. Кроме этого мы выяснили, что этот процесс связан с индукцией одного из важнейших клеточных сигнальных путей - MAP киназного каскада.

Выявление механизмов регуляции экспрессии гена HNF4a представляется важным для разработки новых подходов для терапии опухолей печени, а также для понимания фундаментальных основ процесса дифференцировки в ходе эмбрионального развития животных и человека.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Альперн, Даниил Валерьевич

выводы

1. Впервые показано, что инактивация онкосупрессора р53 может индуцировать транскрипцию эмбриональных Р2 изоформ центрального регулятора дифференцировки гепатоцитов НЫР4а в печени взрослых мышей.

2. Инактивация р53 в клетках гепатомы человека Нер02 вызывает повышение активности промотора Р2 гена НЫР4а.

3. В клетках гепатомы Нер02 факторы ТОИР регулируют баланс изоформ НМР4а за счет активации Р2 и подавления Р1 промоторов этого гена.

4. ТОрр-зависимое подавление активности промотора Р1 происходит только после синтеза регуляторных белков, оказывающих репрессирующее действие на Р1. Активация Р2 промотора происходит без дополнительного белкового синтеза.

5. Нарушение сайта связывания ТОрр-респонсивного регулятора транскрипции белка 8тас14 в промоторе Р2 не отражается на ТОрр-зависимой активации Р2.

6. ТОрр-зависимое подавление экспрессии НЫР4аР1 связано с активацией МАРК сигнального каскада.

7. ТОрр-индуцированная репрессия промотора Р1 ассоциированна с подавлением транскрипции гена С/ЕВРа, одного из ключевых активаторов экспрессии НЫР4аР1.

Заключение

Настоящее исследование было посвящено изучению роли опухолевого супрессора р53 и ТОБр в регуляции экспрессии гена ЬЮТ4а, кодирующего центральный регулятор дифференцировки гепатоцитов. Оба указанных фактора регулируют нормальный клеточный рост, а нарушения функций сигнальных путей, регулируемых ТОРр или р53, увеличивают вероятность возникновения опухолей.

Транскрипционный фактор р53 функционирует как опухолевый супрессор, влияя на ' экспрессию генов регуляторов клеточного цикла, а также различных дифференцировочных факторов [ТакеЬауаэЫ-Зигик! е/ а1, 2003]. Его инактивация наблюдается более чем в половине всех опухолей.

Ранее было показано, что в печени мышей, нокаутных по р53, значительно повышается количество овальных клеток, морфологически схожих с гепатобластами — эмбриональными низкодифференцированпыми предшественниками гепатоцитов [ЭшпЫе е1 а1., 2001].

Цитокины семейства ТОРр известны своим плейотропным эффектом - они играют важную роль в регуляции клеточного цикла и таких процессах, как пролиферация клеток, дифференцировка, апоптоз и формирование внеклеточного матрикса [Мо^акаБ е/ а1, 2001]. Их роль в канцерогенезе противоречива, однако большинство исследователей сходится во мнении, что ТОРр подавляет рост и способность клеток к метастазироваиию в дифференцированных опухолях, но оказывает противоположное действие на низкодифференцированные инвазивные опухоли [Мигаока-Соок е^ а1., 2005]. Показано, что экспрессия ТОРр 1 ассоциирована с прогрессией гепатокарцином и индукцией эпителиально-мезенхимального перехода [Ргапзуеа е( а1, 2008].

Целью нашей работы стало исследование возможной роли р53 и ТОРр в регуляции экспрессии гена Н№4а. Мы показали, что в печени р53/" мышей происходит индукция экспрессии эмбриональных изоформ гена 1ШР4а, НЫР4аР2, наряду с репрессией взрослых Н№4аР1. Эксперименты на клетках гепатомы человека Нер02, в которых экспрессия р53 была подавлена при помощи малых интерферирующих РНК, подтвердили данные об активации транскрипции изоформ НЫР4аР2 в отсутствие р53. Мы предположили, что эффект, оказываемый р53 на уровень РГЫР4аР2. может быть связан с его действием на альтернативный промотор этого гена. Для проверки этой гипотезы мы клонировали фрагмент регуляторного района Р2 гена НЫР4а размером 934 п. о. в экспрессирующий вектор с люциферазным репортером и обнаружили, что в отсутствие р53 его активность увеличивается в 3 раза.

Таким образом, нами был сделан вывод о том, что изменение активности одного из важнейших регуляторов клеточного цикла р53 может приводить к нарушению реализации дифференцировочной программы гепатоцитов, которое обусловлено изменением экспрессии важнейшего регулятора дифференцировки НИР4а [Альперн и др., 2008].

Мы также показали, что индукция экспрессии эмбриональных изоформ гена НЫР4а может происходить под действием цитокинов семейства ТОРр. ТОрр-зависимая активация сигнальных каскадов в клетках линии гепатомы человека НерС2 приводит к переключению экспрессии изоформ гена НМЧа с взрослых на эмбриональные. Эксперименты по ингибированию цитоплазматического белкового синтеза показали, что при индукции ТОРр-сигнального пути активация экспрессии НИР4аР2 изоформ происходит без участия дополнительно синтезируемых регуляторов транскрипции, в то время как подавление экспрессии взрослых ЬЮТ4аР1 изоформ требует дополнительного белкового синтеза. Мы показали, что в результате действия ТОРр происходит активация промоторов Р2 гена НЫР4а как мыши, так и человека, а ингибирование киназного домена рецептора ТйРр первого типа (ТрЫ) подавляет активацию Р2 промотора и блокирует переключение экспрессии изоформ гена 1ЮТ4а. Предположение о том, что ТОРР-индуцированное подавление транскрипции изоформ НЫР4аР1 происходит в результате накопления в клетке эмбриональных изоформ 1ГЫР4аР2 по механизму негативной авторегуляции было опровергнуто с помощью экспериментов по трансфекции вектора, кодирующего НЫР4а7, в клетки гепатомы человека Нер02 и анализа уровня транскрипции изоформ НЫР4а.

В литературных источниках существует множество данных о роли ТОРр1 в дифференцировке гепатоцитов, в то время как действие ТОРр2 на активацию ТОРР-сигнального пути считается схожим. В то же время данные, полученные в нашей лаборатории, свидетельствуют о том, что прогрессия гепатокарцином ассоциирована именно с гиперэкспрессией ТОРр2. По этой причине мы сфокусировали дальнейшие исследования по ТОРр-зависимой регуляции экспрессии НИР4а именно на ТОРр2.

В поисках возможного механизма активации промотора Р2 при индукции ТОРр-зависимого сигнального пути мы проанализировали последовательность Р2 на наличие потенциальных сайтов связывания различных транскрипционных факторов. В проксимальной части Р2 был обнаружен сайт связывания белков Бтас!, основных эффекторных молекул классического ТОРр-индуцируемого сигнального пути. Мы предположили, что активация промотора Р2 под действием ТОРр2 может происходить именно в результате 8тас1-сигиалыюго пути и связывания комплекса этих белков с промотором. Однако эксперименты по направленному мутагенезу сайта связывания Бшас! не подтвердили это предположение.

В литературных источниках встречается все больше упоминаний о возможности ТОРр-зависимой активации реакций МАР-киназного каскада, посредством которого происходит регуляция экспрессии большого числа ТОРР-респонсивных генов. Мы решили изучить возможность активации МАР-киназ под действием ТОРр2 в исследуемой системе. Оказалось, что под действием ингибитора фосфорилирования киназы ЕШС происходит блокирование сигнала от ТОРР2 к Р1 промотору гена НЫР4а, и ТОРр~ зависимого подавления синтеза изоформ НЫР4аР 1 не наблюдается. Важно отметить, что ТОРр-зависимая активация изоформ РПчГР4аР2 не зависит от активности МАР-киназного каскада.

Существуют указания на то, что ТОРр-зависимое подавление активности промотора Р1 может быть связанно с кооперативным вкладом р53 и ТОрр-сигнального пути в регуляцию транскрипции гена НЫР4а. Однако это предположение нуждается в дополнительной экспериментальной проверке. Кроме того, остается открытым вопрос о возможной роли Бтас! белков в активации Р2 промотора, а также поиск непосредственного транскрипционного репрессора промотора Р1. Мы ожидаем, что проводимые в нашей лаборатории эксперименты по инактивации компонентов сигнального каскада 8тас1 белков помогут дать ответ на эти вопросы.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Альперн, Даниил Валерьевич, Москва

1. Альперн Д.В., Макарова М.В., Чернобельская О.А., Флейшман Д.И.,Лазаревич Н.Л. (2008). "р53 и TGFP регулируют экспрессию эмбриональной изоформы HNF4a в клетках гепатомы человека." Российский Биотерапевтический Журнал 7(3): 62-70.

2. Лазаревич Н.Л. (2004). "Молекулярные механизмы прогрессии опухолей печени." Успехи биологической химии 44: 365-418.

3. Лазаревич Н.Л. (2003). "Изменения спектров экспрессии генов при гепатоканцерогенезе и прогрессии опухолей печени." Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук, Москва, МГУ.

4. Лазаревич Н.Л. (2000). "Молекулярные механизмы экспрессии гена альфа-фетопротеина." Биохимия 65(1): 117-33.

5. Лазаревич Н.Л.,Альперн Д.В. (2008). "Гепатоцитарный ядерный фактор 4 (PINF4) в развитии и канцерогенезе эпителиальных тканей." Молекулярная биология 42(5): 786797.

6. Лазаревич Н.Л.,Флейшман Д.И. (2008). "Тканеспецифические транскрипционные факторы в прогрессии эпителиальных опухолей." Биохимия 73(5): 713-734.

7. Овчинников Д.А. (2004). "Факторы, влияющие на пролиферацию и апоптоз в мышиных гепатокарциномах различного уровня дифференцировки." Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук, Москва, МГУ.

8. Флейшман Д-И-, Морозова О.В.,Лазаревич Н.Л. (2008). "Экспрессия тканеспецифических генов в гепатокарциномах мыши различного уровня дифференцировки." Вестник Онкологического Научного Центра 19(2): 22-27.

9. Abelev G.I., Eraiser T.L. (1999). "Cellular aspects of alpha-fetoprotein reexpression in tumors." Semin Cancer Biol 9(2): 95-107.

10. Abelev G.I., Lazarevich N.L. (2006). "Control of differentiation in progression of epithelial tumors." Adv Cancer Res 95: 61-113.

11. Akhurst R.J., Derynck R. (2001). "TGF-beta signaling in cancer—a double-edged sword." Trends Cell Biol 11(11): S44-51.

12. Almog N., Rotter V. (1997). "Involvement of p53 in cell differentiation and development." Biochim BiophysActa 1333(1): Fl-27.

13. Anastasiadis A.G., Lemm I., Radzewitz A., Lingott A., Ebert Т., Ackermann R., Ryffel G.U.,Schulz W.A. (1999). "Loss of function of the tissue specific transcription factor

14. HNF1 alpha in renal cell carcinoma and clinical prognosis." Anticancer Res 19(3A): 210510.

15. Ang S.L., Rossant J. (1994). "HNF-3 beta is essential for node and notochord formation in mouse development." Cell 78(4): 561-74.

16. Ang S.L., Wierda A., Wong D., Stevens K.A., Cascio S., Rossant J.,Zaret K.S. (1993). "The formation and maintenance of the definitive endoderm lineage in the mouse: involvement of HNF3/forkhead proteins." Development 119(4): 1301-15.

17. Atfi A., Baron R. (2008). "p53 brings a new twist to the Smad signaling network." Sci Signal 1(26): pe33.

18. Bailly A., Torres-Padilla M.E., Tinel A.P., Weiss M.C. (2001). "An enhancer element 6 kb upstream of the mouse HNF4alphal promoter is activated by glucocorticoids and liver-enriched transcription factors." Nucleic Acids Res 29(17): 3495-505.

19. Bargonetti J., Manfredi J.J. (2002). "Multiple roles of the tumor suppressor p53." Curr Opin Oncol 14(1): 86-91.

20. Bartoov-Shifman R., Hertz R., Wang H., Wollheim C.B., Bar-Tana J.,Walker M.D. (2002). "Activation of the insulin gene promoter through a direct effect of hepatocyte nuclear factor 4 alpha." J Biol Chem 277(29): 25914-9.

21. Bhowmick N.A., Zent R., Ghiassi M., McDonnell M., Moses H.L. (2001). "Integrin beta 1 signaling is necessary for transforming growth factor-beta activation of p38MAPK and epithelial plasticity." J Biol Chem 276(50): 46707-13.

22. Bissell D.M., Roulot D., George J. (2001). "Transforming growth factor beta and the liver." Hepatology 34(5): 859-67.

23. Bressac B., Galvin K.M., Liang T.J., Isselbacher K.J., Wands J.R., Ozturk M. (1990). "Abnormal structure and expression of p53 gene in human hepatocellular carcinoma." Proc Natl Acad Sci USA 87(5): 1973-7.

24. Breuhahn K., Longerich T., Schirmacher P. (2006). "Dysregulation of growth factor signaling in human hepatocellular carcinoma." Oncogene 25(27): 3787-800.

25. Briancon N., Weiss M.C. (2006). "In vivo role of the HNF4alpha AF-1 activation domain revealed by exon swapping." EMBOJ25(6): 1253-62.

26. Brown K.A., Pietenpol J.A., Moses H.L. (2007). "A tale of two proteins: differential roles and regulation of Smad2 and Smad3 in TGF-beta signaling." J Cell Biochem 101(1): 9-33.

27. Budanov A.V., Sablina A.A., Feinstein E., Koonin E.V.,Chumakov P.M. (2004). "Regeneration of peroxiredoxins by p53-regulated sestrins, homologs of bacterial AhpD." Science 304(5670): 596-600.

28. Bulla G.A.,Fournier R.E. (1994). "Genetic analysis of a transcriptional activation pathway by using hepatoma cell variants." Mol Cell Biol 14(11): 7086-94.

29. Calvisi D.F., Factor V.M., Loi R., Thorgeirsson S.S. (2001). "Activation of beta-catenin during hepatocarcinogenesis in transgenic mouse models: relationship to phenotype and tumor grade." Cancer Res 61(5): 2085-91.

30. Cartharius K., Freeh K., Grote K., Klocke B., Haltmeier M., Klingenhoff A., Frisch M., Bayerlein M., Werner T. (2005). "Matlnspector and beyond: promoter analysis based on transcription factor binding sites." Bioinformatics 21(13): 2933-42.

31. Chao C., Saito S., Kang J., Anderson C.W., Appella E.,Xu Y. (2000). "p53 transcriptional activity is essential for p53-dependent apoptosis following DNA damage." EMBO J 19(18): 4967-75.

32. Chen C.A., Okayama H. (1988). "Calcium phosphate-mediated gene transfer: a highly efficient transfection system for stably transforming cells with plasmid DNA." Biotechniques 6(7): 632-8.

33. Chen W., Fu X., Sheng Z. (2002). "Review of current progress in the structure and function of Smad proteins." Chin Med J (Engl) 115(3): 446-50.

34. Chiba N., Suwa T., Ilori M., Sakuma M., Kitajima M. (2004). "Advanced gastric endocrine cell carcinoma with distant lymph node metastasis: a case report and clinicopathological characteristics of the disease." Gastric Cancer 7(2): 122-7.

35. Cicchini C., Filippini D., Coen S., Marchetti A., Cavallari C., Laudadio I., Spagnoli F.M., Alonzi T.,Tripodi M. (2006). "Snail controls differentiation of hepatocytes by repressing HNF4alpha expression." J Cell Physiol 209(1): 230-8.

36. Cicchini C., Laudadio I., Citarella F., Corazzari M., Steindler C., Conigliaro A., Fantoni A., Amicone L.,Tripodi M. (2008). "TGFbeta-induced EMT requires focal adhesion kinase (FAK) signaling." Exp Cell Res 314(1): 143-52.

37. Clotman F., Libbrecht L., Gresh L., Yaniv M., Roskams T., Rousseau G.G.,Lemaigre F.P. (2003). "Hepatic artery malformations associated with a primary defect in intrahepatic bile duct development." J Hepatol 39(5): 686-92.

38. Coffinier C., Barra J., Babinet C.,Yaniv M. (1999). "Expression of the vHNF 1 /HNF1 beta homeoprotein gene during mouse organogenesis." Mech Dev 89(1-2): 211-3.

39. Cordenonsi M., Dupont S., Maretto S., Insinga A., Imbriano C.,Piccolo S. (2003). "Links between tumor suppressors: p53 is required for TGF-beta gene responses by cooperating with Smads." Cell 113(3): 301-14.

40. Cordenonsi M., Montagner M., Adorno M., Zacchigna L., Martello G., Mamidi A., Soligo S., Dupont S.,Piccolo S. (2007). "Integration of TGF-beta and Ras/MAPK signaling through p53 phosphorylation." Science 315(5813): 840-3.

41. Dell H., Hadzopoulou-Cladaras M. (1999). "CREB-binding protein is a transcriptional coactivator for hepatocyte nuclear factor-4 and enhances apolipoprotein gene expression." J Biol Chem 274(13): 9013-21.

42. Derynck R.,Zhang Y.E. (2003). "Smad-dependent and Smad-independent pathways in TGF-beta family signalling." Nature 425(6958): 577-84.

43. Drewes T., Senkel S., Holewa B., Ryffel G.U. (1996). "Human hepatocyte nuclear factor 4 isoforms are encoded by distinct and differentially expressed genes." Mol Cell Biol 16(3): 925-31.

44. Dumble M.L., Knight B., Quail E.A., Yeoh G.C. (2001). "Hepatoblast-like cells populate the adult p53 knockout mouse liver: evidence for a hyperproliferative maturation-arrested stem cell compartment." Cell Growth Differ 12(5): 223-31.

45. Duncan S.A., Nagy A., Chan W. (1997). "Murine gastrulation requires HNF-4 regulated gene expression in the visceral endoderm: tetraploid rescue of Hnf-4(-/-) embryos." Development 124(2): 279-87.

46. Engel M.E., McDonnell M.A., Law B.K., Moses H.L. (1999). "Interdependent SMAD and JNK signaling in transforming growth factor-beta-mediated transcription." J Biol Chem 274(52): 37413-20.

47. Esteve P.O., Chin H.G., Pradhan S. (2005). "Human maintenance DNA (cytosine-5)-methyltransferase and p53 modulate expression of p53-repressed promoters." Proc Natl Acad Sci USA 102(4): 1000-5.

48. Ferrer J. (2002). "A genetic switch in pancreatic beta-cells: implications for differentiation and haploinsufficiency." Diabetes 51(8): 2355-62.

49. Fransvea E., Angelotti U., Antonaci S., Giannelli G. (2008). "Blocking transforming growth factor-beta up-regulates E-cadherin and reduces migration and invasion of hepatocellular carcinoma cells." Hepatology 47(5): 1557-66.

50. Galarneau L., Pare J.F., Allard D., Hamel D., Levesque L., Tugwood J.D., Green S.,Belanger l. (1996). "The alpha 1-fetoprotein locus is activated by a nuclear receptor of the Drosophila FTZ-F1 family." Mol Cell Biol 16(7): 3853-65.

51. Garrison W.D., Battle M.A., Yang C., Kaestner K.H., Sladek F.M., Duncan S.A. (2006). "Hepatocyte nuclear factor 4alpha is essential for embryonic development of the mouse colon." Gastroenterology 130(4): 1207-20.

52. Hatzis P., Kyrmizi I., Talianidis I. (2006). "Mitogen-activated protein kinase-mediated disruption of enhancer-promoter communication inhibits hepatocyte nuclear factor 4alpha expression." Mol Cell Biol 26(19): 7017-29.

53. Hatzis P., Talianidis I. (2001). "Regulatory mechanisms controlling human hepatocyte nuclear factor 4alpha gene expression." Mol Cell Biol 21(21): 7320-30.

54. Hayhurst G.P., Lee Y.H., Lambert G., Ward J.M., Gonzalez F.J. (2001). "Hepatocyte nuclear factor 4alpha (nuclear receptor 2A1) is essential for maintenance of hepatic gene expression and lipid homeostasis." Mol Cell Biol 21(4): 1393-403.

55. Hertz R., Magenheim J., Berman I., Bar-Tana J. (1998). "Fatty acyl-CoA thioesters are ligands of hepatic nuclear factor-4alpha." Nature 392(6675): 512-6.

56. Ho J., Benchimol S. (2003). "Transcriptional repression mediated by the p53 tumour suppressor." Cell Death Differ 10(4): 404-8.

57. Holewa B., Zapp D., Drewes T., Senkel S.,Ryffel G.U. (1997). "HNF4beta, a new gene of the HNF4 family with distinct activation and expression profiles in oogenesis and embryogenesis of Xenopus laevis." Mol Cell Biol 17(2): 687r94.

58. Hsu I.C., Tokiwa T., Bennett W., Metcalf R.A., Welsh J.A., Sun T.,Harris C.C. (1993). "p53 gene mutation and integrated hepatitis B viral DNA sequences in human liver cancer cell lines." Carcinogenesis 14(5): 987-92.

59. Hwang-Verslues W.W., Sladek F.M. (2008). "Nuclear receptor hepatocyte nuclear factor 4alphal competes with oncoprotein c-Myc for control of the p21/WAFl promoter." Mol Endocrinol 22(1): 78-90.

60. Janda E., Lehmann K., Killisch I., Jechlinger M., Herzig M., Downward J., Beug H.,Grunert S. (2002). "Ras and TGFbeta. cooperatively regulate epithelial cell plasticity and metastasis: dissection of Ras signaling pathways." J Cell Biol 156(2): 299-313.

61. Kaartinen V., Voncken J.W., Shuler C., Warburton D., Bu D., Heisterkamp N.,Groffen J. (1995). "Abnormal lung development and cleft palate in mice lacking TGF-beta 3 indicates defects of epithelial-mesenchymal interaction." Nat Genet 11(4): 415-21.

62. Kaestner K.H., Hiemisch H., Schutz G. (1998). "Targeted disruption of the gene encoding hepatocyte nuclear factor 3gamma results in reduced transcription of hepatocyte-specific genes." Mol Cell Biol 18(7): 4245-51.

63. Kaestner K.H., Katz J., Liu Y., Drucker D.J., Schutz G. (1999). "Inactivation of the winged helix transcription factor HNF3alpha affects glucose homeostasis and islet glucagon gene expression in vivo." Genes Dev 13(4): 495-504.

64. Kamiya A., Inoue Y.,Gonzalez F.J. (2003). "Role of the hepatocyte nuclear factor 4alpha in control of the pregnane X receptor during fetal liver development." Hepatology 37(6): 1375-84.

65. Kardassis D., Pardali K., Zannis V.I. (2000). "SMAD proteins transactivate the human ApoCIII promoter by interacting physically and functionally with hepatocyte nuclear factor 4." J Biol Chem 275(52): 41405-14.

66. Korchynskyi O., ten Dijke P. (2002). "Identification and functional characterization of distinct critically important bone morphogenetic protein-specific response elements in the Idl promoter." J Biol Chem 277(7): 4883-4891

67. Kretzschmar M., Liu F., Hata A., Doody J., Massague J. (1997). "The TGF-beta family mediator Smadl is phosphorylated directly and activated functionally by the BMP receptor kinase." Genes Dev 11(8): 984-95.

68. Kuo C.J., Conley P.B., Chen L., Sladek F.M., Darnell J.E., Jr., Crabtree G.R. (1992). "A transcriptional hierarchy involved in mammalian cell-type specification." Nature 355(6359): 457-61.

69. Kyrmizi I., Hatzis P., Katrakili N., Tronche F., Gonzalez F.J.,Talianidis I. (2006). "Plasticity and expanding complexity of the hepatic transcription factor network during liver development." Genes Dev 20(16): 2293-305.

70. Ladias J. A., Karathanasis S.K. (1991). "Regulation of the apolipoprotein AI gene by ARP-1, a novel member of the steroid receptor superfamily." Science 251(4993): 561-5.

71. Lastres P., Letamendia A., Zhang H., Rius C., Almendro N., Raab U., Lopez L.A., Langa C., Fabra A., Letarte M.,Bernabeu C. (1996). "Endoglin modulates cellular responses to TGF-beta I." J Cell Biol 133(5): 1109-21.

72. Lewis J., Burstein E., Reffey S.B., Bratton S.B., Roberts A.B.,Duckett C.S. (2004). "Uncoupling of the signaling and caspase-inhibitory properties of X-linked inhibitor of apoptosis." J Biol Chem 279(10): 9023-9.

73. Li J., Ning G., Duncan S.A. (2000). "Mammalian hepatocyte differentiation requires the transcription factor HNF-4alpha." Genes Dev 14(4): 464-74.

74. Li T.,Chiang J.Y. (2007). "A novel role of transforming growth factor betal in transcriptional repression of human cholesterol 7alpha-hydroxylase gene." Gastroenterology 133(5): 1660-9.

75. Lucas B., Grigo K., Erdmann S., Lausen J., Klein-Hitpass L.,Ryffel G.U. (2005). "HNF4alpha reduces proliferation of kidney cells and affects genes deregulated in renal cell carcinoma." Oncogene 24(42): 6418-31.

76. Luo K., Lodish H.F. (1997). "Positive and negative regulation of type II TGF-beta receptor signal transduction by autophosphorylation on multiple serine residues." EMBO J 16(8): 1970-81.

77. Macleod K.F., Sherry N., Hannon G., Beach D., Tokino T., Kinzler K., Vogelstein B.,Jacks T. (1995). "p53-dependent and independent expression of p21 during cell growth, differentiation, and DNA damage." Genes Dev 9(8): 935-44.

78. Maeda Y., Hwang-Verslues W.W., Wei G., Fukazawa T., Durbin M.L., Owen L.B., Liu X.,Sladek F.M. (2006). "Tumour suppressor p53 down-regulates the expression of the human hepatocyte nuclear factor 4alpha (HNF4alpha) gene." Biochem J400(2): 303-13.

79. Maeda Y., Seidel S.D., Wei G., Liu X., Sladek F.M. (2002). "Repression of hepatocyte nuclear factor 4alpha tumor suppressor p53: involvement of the ligand-binding domain and histone deacetylase activity." Mol Endocrinol 16(2): 402-10.

80. Magenheim J., Hertz R., Berman I., Nousbeck J., Bar-Tana J. (2005). "Negative autoregulation of HNF-4alpha gene expression by HNF-4alphal." Biochem J 388(Pt 1): 325-32.

81. Massague J. (1998). "TGF-beta signal transduction." Annu Rev Biochem 67: 753-91.

82. Massague J.,Chen Y.G. (2000). "Controlling TGF-beta signaling." Genes Dev 14(6): 62744.

83. Massague J., Seoane J., Wotton D. (2005). "Smad transcription factors." Genes Dev 19(23): 2783-810.

84. Massague J., Wotton D. (2000). "Transcriptional control by the TGF-beta/Smad signaling system." EMBOJl9(S): 1745-54.

85. Mendel D.B., Hansen L.P., Graves M.K., Conley P.B., Crabtree G.R. (1991). "HNF-1 alpha and HNF-1 beta (vHNF-1) share dimerization and homeo domains, but not activation domains, and form heterodimers in vitro." Genes Dev 5(6): 1042-56. .

86. Missero C., Calautti E., Eckner R., Chin J., Tsai L.H., Livingston D.M., Dotto G.P. (1995). "Involvement of the cell-cycle inhibitor Cipl/WAFl and the ElA-associated p300 protein in terminal differentiation." Proc Natl Acad Sci USA 92(12): 5451-5.

87. Montoliu L., Blendy J.A., Cole T.J.,Schutz G. (1995). "Analysis of perinatal gene expression: hormone response elements mediate activation of a lacZ reporter gene in liver of transgenic mice." Proc Natl Acad Sci USA 92(10): 4244-8.

88. Morrisey E.E., Tang Z., Sigrist K., Lu M.M., Jiang F., Ip H.S.,Parmacek M.S. (1998). "GATA6 regulates HNF4 and is required for differentiation of visceral endoderm in the mouse embryo." Genes Dev 12(22): 3579-90.

89. Moustakas A., Heldin C.H. (2005). "Non-Smad TGF-beta signals." J Cell Sci 118(Pt 16): 3573-84.

90. Moustakas A., Souchelnytskyi S., Heldin C.H. (2001). "Smad regulation in TGF-beta signal transduction." J Cell Sci 114(Pt 24): 4359-69.

91. Muraoka-Cook R.S., Dumont N., Arteaga C.L. (2005). "Dual role of transforming growth factor beta in mammary tumorigenesis and metastatic progression." Clin Cancer Res 11(2 Pt 2): 937s-43s.

92. Nakhei H., Lingott A., Lemm I., Ryffel G.U. (1998). "An alternative splice variant of the tissue specific transcription factor HNF4alpha predominates in undifferentiated murine cell types." Nucleic Acids Res 26(2): 497-504.

93. Niehof M., Borlak J. (2008). "HNF4 alpha and the Ca-channel TRPC1 are novel disease candidate genes in diabetic nephropathy." Diabetes 57(4): 1069-77.

94. Niehof M., Borlak J. (2005). "RSK4 and PAK5 are novel candidate genes in diabetic rat kidney and brain." Mol Pharmacol 67(3): 604-11.

95. Oda H., Nozawa K., Hitomi Y., Kakinuma A. (1995). "Laminin-rich extracellular matrix maintains high level of hepatocyte nuclear factor 4 in rat hepatocyte culture." Biochem Biophys Res Commun 212(3): 800-5.

96. Ogden S.K., Lee K.C., Wernke-Dollries K., Stratton S.A., Aronow B.,Barton M.C. (2001). "p53 targets chromatin structure alteration to repress alpha-fetoprotein gene expression." J Biol Chem 276(45): 42057-62.

97. Oklu R., Hesketh R. (2000). "The latent transforming growth factor beta binding protein (LTBP) family." Biochem J352 Pt 3: 601-10.

98. Ozdamar B., Bose R., Barrios-Rodiles M., Wang H.R., Zhang Y., Wrana J.L. (2005). "Regulation of the polarity protein Par6 by TGFbeta receptors controls epithelial cell plasticity." Science 307(5715): 1603-9.

99. Pardali K., Moustakas A. (2007). "Actions of TGF-beta as tumor suppressor and pro-metastatic factor in human cancer." Biochim Biophys Acta 1775(1): 21-62.

100. Pearson G., Robinson F., Beers Gibson T., Xu B.E., Karandikar M., Berman K.,Cobb M.H. (2001). "Mitogen-activated protein (MAP) kinase pathways: regulation and physiological functions." Endocr Rev 22(2): 153-83.

101. Peinado H., Ballestar E., Esteller M.,Cano A. (2004). "Snail mediates E-cadherin repression by the recruitment of the Sin3A/histone deacetylase 1 (HDAC1)/HDAC2 complex." Mol Cell Biol 24(1): 306-19.

102. Perlman R., Schiemann W.P., Brooks M.W., Lodish H.F.,Weinberg R.A. (2001). "TGF-beta-induced apoptosis is mediated by the adapter protein Daxx that facilitates JNK activation." Nat Cell Biol 3(8): 708-14.

103. Piek E., Roberts A.B. (2001). "Suppressor and oncogenic roles of transforming growth factor-beta and its signaling pathways in tumorigenesis." Adv Cancer Res 83: 1-54.

104. Rana B., Xie Y., Mischoulon D., Bucher N.L., Farmer S.R. (1995). "The DNA binding activity of C/EBP transcription factor is regulated in the G1 phase of the hepatocyte cell cycle." J Biol Chem 270(30): 18123-32.

105. Roberts A.B. (2002). "The ever-increasing complexity of TGF-beta signaling." Cytokine Growth Factor Rev 13(1): 3-5.

106. Roberts A.B., Russo A., Felici A., Flanders K.C. (2003). "Smad3: a key player in pathogenetic mechanisms dependent on TGF-beta." Ann N YAcadSci 995: 1-10.

107. Rossmanith W., Schulte-Hermann R. (2001). "Biology of transforming growth factor beta inhepatocarcinogenesis." Microsc Res Tech 52(4): 430-6.

108. Runyan C.E., Schnaper H.W., Poncelet A.C. (2003). "Smad3 and PKCdelta mediate TGF-beta 1-induced collagen I expression in human mesangial cells." Am J Physiol Renal Physiol 285(3): F413-22.

109. Sablina A.A., Chumakov P.M., Kopnin B.P. (2003). "Tumor suppressor p53 and its homologue p73alpha affect cell migration." J Biol Chem 278(30): 27362-71.

110. Satohisa S., Chiba H., Osanai M., Ohno S., Kojima T., Saito T.,Sawada N. (2005). "Behavior of tight-junction, adherens-junction and cell polarity proteins during HNF-4alpha-induced epithelial polarization." Exp Cell Res 310(1): 66-78.

111. Sheahan S., Bellamy C.O., Dunbar D.R., Harrison D.J., Prost S. (2007). "Deficiency of G1 regulators P53, P21Cipl and/or pRb decreases hepatocyte sensitivity to TGFbeta cell cycle arrest." BMC Cancer 7: 215.

112. Shen C.N., Slack J.M., Tosh D. (2000). "Molecular basis of transdifferentiation of pancreas to liver." Nat Cell Biol 2(12): 879-87.

113. Shi Y., Massague J. (2003). "Mechanisms of TGF-beta signaling from cell membrane to the nucleus." Cell 113(6): 685-700.

114. Sladek F.M., Zhong W.M., Lai E., Darnell J.E., Jr. (1990). "Liver-enriched transcription factor HNF-4 is a novel member of the steroid hormone receptor superfamily." Genes Dev 4(12B): 2353-65.

115. Song Y.H., Ray K., Liebhaber S.A., Cooke N.E. (1998). "Vitamin D-binding protein gene transcription is regulated by the relative abundance of hepatocyte nuclear factors 1 alpha and lbeta." J Biol Chem 273(43): 28408-18.

116. Spagnoli F.M., Cicchini C., Tripodi M., Weiss M.C. (2000). "Inhibition of MMH (Met murine hepatocyte) cell differentiation by TGF(beta) is abrogated by pre-treatment with the heritable differentiation effector FGF1." J Cell Sci 113 ( Pt 20): 3639-47.

117. Spath G.F., Weiss M.C. (1997). "Hepatocyte nuclear factor 4 expression overcomes repression of the hepatic phenotype in dedifferentiated hepatoma cells." Mol Cell Biol 17(4): 1913-22.

118. Spath G.F., Weiss M.C. (1998). "Hepatocyte nuclear factor 4 provokes expression of epithelial marker genes, acting as a morphogen in dedifferentiated hepatoma cells." J Cell Biol 140(4): 935-46.

119. Sporn M.B., Roberts A.B. (1990). "TGF-beta: problems and prospects." Cell Regul 1(12): 875-82.

120. Stoffel M., Duncan S.A. (1997). "The maturity-onset diabetes of the young (MODY1) transcription factor HNF4alpha regulates expression of genes required for glucose transport and metabolism." Proc Natl Acad Sci USA 94(24): 13209-14.

121. Sund N.J., Ang S.L., Sackett S.D., Shen W., Daigle N., Magnuson M.A.,Kaestner K.H. (2000). "Hepatocyte nuclear factor 3beta (Foxa2) is dispensable for maintaining the differentiated state of the adult hepatocyte." Mol Cell Biol 20(14): 5175-83.

122. Takebayashi-Suzuki K., Funami J., Tokumori D., Saito A., Watabe T., Miyazono K., Kanda A.,Suzuki A. (2003). "Interplay between the tumor suppressor p53 and TGF beta signaling shapes embryonic body axes in Xenopus." Development 130(17): 3929-39.

123. Takiguchi M. (1998). "The C/EBP family of transcription factors in the liver and other organs." IntJExp Pathol 79(6): 369-91.

124. Tanaka K., Sato M., Tomita Y., Ichihara A. (1978). "Biochemical studies on liver functions in primary cultured hepatocytes of adult rats. I. Hormonal effects on cell viability and protein synthesis." JBiochem 84(4): 937-46.

125. Taraviras S., Monaghan A.P., Schutz G., Kelsey G. (1994). "Characterization of the mouse HNF-4 gene and its expression during mouse embryogenesis." Mech Dev 48(2): 67-79.

126. Thiery J.P. (2002). "Epithelial-mesenchymal transitions in tumour progression." Nat Rev Cancer 2(6): 442-54.

127. Thiery J.P., Sleeman J.P. (2006). "Complex networks orchestrate epithelial-mesenchymal transitions." Nat Rev Mol Cell Biol 7(2): 131-42.

128. Tian J.M.,Schibler U. (1991). "Tissue-specific expression of the gene encoding hepatocyte nuclear factor 1 may involve hepatocyte nuclear factor 4." Genes Dev 5(12A): 2225-34.

129. Timchenko N.A., Wilde M., Darlington G.J. (1999). "C/EBPalpha regulates formation of S-phase-specific E2F-pl07 complexes in livers of newborn mice." Mol Cell Biol 19(4): 2936-45.

130. Torres-Padilla M.E., Fougere-Deschatrette C.,Weiss M.C. (2001). "Expression of HNF4alpha isoforms in mouse liver development is regulated by sequential promoter usage and constitutive 3' end splicing." Mech Dev 109(2): 183-93.

131. Tronche F., Ringeisen F., Blumenfeld M., Yaniv M., Pontoglio M. (1997). "Analysis of the distribution of binding sites for a tissue-specific transcription factor in the vertebrate genome." JMol Biol 266(2): 231-45.

132. Tsai J.F., Chuang L.Y., Jeng J.E., Yang M.L., Chang W.Y., Hsieh M.Y., Lin Z.Y.,Tsai J.H. (1997). "Clinical relevance of transforming growth factor-beta 1 in the urine of patients with hepatocellular carcinoma." Medicine (Baltimore) 76(3): 213-26.

133. Vousden K.FI. (2000). "p53: death star." Cell 103(5): 691-4.

134. Wang L., Wu Q., Qiu P., Mirza A., McGuirk M., Kirschmeier P., Greene J.R., Wang Y., Pickett C.B.,Liu S. (2001). "Analyses of p53 target genes in the human genome by bioinformatic and microarray approaches." J Biol Chem 276(47): 43604-10.

135. Wilkinson D.S., Tsai W.W., Schumacher M.A., Barton M.C. (2008). "Chromatin-bound p53 anchors activated Smads and the mSin3A corepressor to confer transforming-growth-factor-beta-mediated transcription repression." Mol Cell Biol 28(6): 1988-98.

136. Wrana J.L., Attisano L., Wieser R., Ventura F., Massague J. (1994). "Mechanism of activation of the TGF-beta receptor." Nature 370(6488): 341-7.

137. Yang Z.Y., Perkins N.D., Ohno T., Nabel E.G., Nabel G.J. (1995). "The p21 cyclin-dependent kinase inhibitor suppresses tumorigenicity in vivo." Nat Med 1(10): 1052-6.

138. Yingling J.M., Wang X.F., Bassing C.H. (1995). "Signaling by the transforming growth factor-beta receptors." Biochim Biophys Acta 1242(2): 115-36.

139. Yue J., Mulder K.M. (2000). "Requirement of Ras/MAPK pathway activation by transforming growth factor beta for transforming growth factor beta 1 production in a Smad-dependent pathway." J Biol Chem 275(40): 30765-73.

140. Zaret K. (1994). "Genes that control the formation of the liver." Hepatology 19(3): 794-6.

141. Zavadil J., Bitzer M., Liang D., Yang Y.C., Massimi A., Kneitz S., Piek E.,Bottinger E.P. (2001). "Genetic programs of epithelial cell plasticity directed by transforming growth factor-beta." Proc Natl Acad Sci USA 98(12): 6686-91.

142. Zavadil J., Cermak L., Soto-Nieves N. Bottinger E.P. (2004). "Integration of TGF-beta/Smad and Jaggedl/Notch signalling in epithelial-to-mesenchymal transition." EMBOJ 23(5): 1155-65.

143. Zawel L., Dai J.L., Buckhaults P., Zhou S., Kinzler K.W., Vogelstein B.,Kern S.E. (1998). "Human Smad3 and Smad4 are sequence-specific transcription activators." Mol Cell 1(4):

144. Zhong W., Mirkovitch J., Darnell J.E., Jr. (1994). "Tissue-specific regulation of mouse hepatocyte nuclear factor 4 expression." Mol Cell Biol 14(11): 7276-84.611.7.

Информация о работе

Альперн, Даниил Валерьевич
кандидата биологических наук
Москва, 2008
ВАК 03.00.03

Диссертация

Механизмы транскрипционной регуляции гепатоцитарного ядерного фактора 4 - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы