Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Регуляция экспрессии гена альфа-фетопротеина в клетках крысиных гепатом

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Регуляция экспрессии гена альфа-фетопротеина в клетках крысиных гепатом"

г \ ,\п?

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В.ЛОМОНОСОВА БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ Кафедра вирусологии

на правах рукописи УДК 577.218

ЛАЗАРЕВИЧ НАТАЛИЯ ЛЕОНИДОВНА

РЕГУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА АЛЬФА-ФЕТОПРОТЕИНА В КЛЕТКАХ КРЫСИНЫХ ГЕПАТОМ

специальность 03.00.06 - вирусология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1997

Работа выполнена на кафедре вирусологии Московского Государственного Университета и в лаборатории иммунохимии НИИ Канцерогенеза ОНЦ РАМН.

Научные руководители - член-корреспондент РАН, профессор Г.И.Абелев

кандидат биологических наук Т.Л .Эрайзер

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук А.Д.Альштейн

Ведущее учреждение: Институт биологии развития им. Н.К.Кольцова РАН.

Защита состоится " 21 " апреля 1997 г. в 14 час. 30 мин. на заседании Специализированного совета Д 053.05.70 при Московском Государственном Университете им. М.В.Ломоносова по адресу: 119899, Москва, Воробьевы Горы, МГУ, Биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова.

Автореферат разослан " I ^ "марте*. 1997г.

Ученый секретарь специализ о совета Д 053.05.70

доктор биологических наук П.М.Чумаков

кандидат химических наук

В.Н.Каграманов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Альфа-фетопротеин (АФП) был впервые описан как основной компонент эмбриональной сыворотки млекопитающих, который синтезируется висцеральной энтодермой желточного мешка и клетками эмбриональной печени. Сразу после рождения уровень АФП в сыворотке снижается на несколько порядков. Синтез АФП возобновляется при возникновении опухолей печени и тератобластом, а также при химических и механических повреждениях печени, сопровождающихся регенерацией, и при остром вирусном гепатите. Изменение уровня АФП в сыворотке является важным диагностическим признаком и широко используется в клинической практике.

В свете изложенных выше фактов изучение молекулярных и клеточных механизмов, участвующих в регуляции синтеза АФП, представляется важной проблемой современной биологии. Ген АФП входит □ семейство альбуминовых генов, все представители которого локализованы на одной хромосоме, причем гены сывороточного альбумина (СА), АФП и а-альбумина непосредственно примыкают друг к другу (РИС. 1) (Ве1апдег, 1994). Возможно, кластерное расположение этих генов необходимо для координированной регуляции их экспрессии.

В настоящее время полностью клонированы и секвенированы как сам ген АФП, так и его 5'-регуляторный район, в котором выявлен ткане-специфический промотор, три независимых энхансера и сайленсер, по крайней мере частично определяющий падение экспрессии гена АФП во взрослой печени (РИС. 1). Идентифицированы связывающиеся в основном с промотором гена АФП общераспространенные и тканеспецифиче-ские транскрипционные факторы, в том числе так называемые гепатоци-тарные ядерные факторы (ГЯФ), участвующие в регуляции экспрессии большинства генов печени. Однако механизмы, определяющие значительные колебания уровня Синтеза АФП в процессе онтогенеза и при канцерогенезе, пока не ясны.

В настоящей работе моделью для изучения механизмов регуляции экспрессии гена АФП послужила коллекция клонов крысиной гепатомы МсА-ЯН 7777, различающихся по уровню синтеза АФП, полученная в лаборатории иммунохимии НИИ Канцерогенеза ОНЦ РАМН Т.Л.Эрайзер. Мы исходили из предположения, что сравнительное исследование клонов, отобранных из одной клеточной линии по АФП-фенотипу, позволит вы-

явить минимальные различия, влияющие на уровень экспрессии исследуемого гена.

Цель и задачи исследования.

Целью настоящей работы было изучение молекулярных механизмов, участвующих в регуляции экспрессии гена АФП в опухолевых клетках путем сравнения АФП-продуцирующих (АФП*) и АФП-непродуцирующих (АФП) клонов крысиной гепатомы. Для этого предстояло решить следующие экспериментальные задачи:

1. Проанализировать уровни экспрессии мРНК АФП в описанных выше клонах и выбрать для дальнейшего изучения клоны с наиболее различающимися уровнями экспрессии.

2. Сравнить уровни метилирования 5'-регуляторного района гена АФП в АФП' и АФП клонах.

3. Сравнить уровни экспрессии мРНК репортерного гена, контролируемого регуляторными элементами гена АФП, в исследуемых клонах.

4. Изучить закономерности экспрессии генов, кодирующих гепатоцитарные ядерные факторы (НЫР1, НЫРЗ, НЫР4), и попытаться выяснить их роль в поддержании АФП-фенотипа в различных клонах.

5. Провести слияние АФП' и АФП клонов для выяснения преобладающего механизма, определяющего различие уровней экспрессии гена АФП в клонах крысиной гепатомы.

Научная новизна.

Разработан новый эффективный метод трансфекции эукариотических клеток. В ходе работы впервые проведен молекулярно-биологический анализ клонов с различным АФП-фенотипом, полученных из одной клеточной линии, и показано, что эти различия определяются на транскрипционном уровне. Исследованы уровни экспрессии генов АФП, сывороточного альбумина и ГЯФ в АФП' и АФП клонах. Впервые выявлена корреляция между уровнями экспрессии генов АФП и НЫР4 в гепатомных клетках. Обнаружена также корреляция уровней экспрессии гена АФП и генов СА и НЫР1 в исследованных клонах. Получены данные, указывающие на существование в АФП клонах регуляторных факторов, способных подавлять экспрессию гена АФП.

Практическая значимость.

В ходе работы получены новые данные о механизмах регуляции он-ко-эмбрионального маркера АФП, широко используемого в клинической практике. Клоны крысиной гепатомы, охарактеризованные п настоящем

исследовании, представляются многообещающей моделью для выявления моиых транскрипционных факторов, определяющих уровень экспрессии гена АФП п опухолевых клетках. Предложенный новый метод транс-фекции может быть широко использован в молекулярно-биологических исследованиях, проводимых как на первичных культурах, так и на культурах опухолевых клеток.

Апробация работы.

Материалы исследований были представлены на XVIII и XIX конференциях Международного общества онкоэмбриональной биологии и медицины (Москва, 1990 и Сиена, 1991), международных конференциях "Молекулярные аспекты канцерогенеза в печени" (Дельфы, 1994), "Генные технологии в анализе и лечении злокачественных и наследственных заболеваний человека, связанных с развитием" (Санкт-Петербург,

1994), "Развитие, регуляция генов и болезни печени" (Аркашон, 1995), IV Всероссийском симпозиуме по клеточной биологии (Санкт-Петербург,

1995), I Съезде онкологов стран СНГ (Москва, 1996).

Основные результаты работы изложены в 9 публикациях. Диссертация была апробирована на совместном заседании кафедры вирусологии биологического факультета МГУ и лаборатории иммунохимии НИИ Канцерогенеза ОНЦ РАМН.

Структура работы.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения и выводов. Работа изложена на страницах, содержит

рисунков и таблиц. Список литературы включает4'(5публикаций.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В обзоре литературы, включающем девять разделов, описаны структура, функции и закономерности экспрессии онко-эмбрионального белка, АФП, строение регуляторного-района гена АФП, освещена роль ГЯФ и нетканеспецифических транскрипционных факторов в регуляции экспрессии гена АФП.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В этом разделе описаны различные методики, использованные в^ работе. Среди них: выделение нуклеиновых кислот (плазмидной ДНК, ге-

СА АФП аАЛБ

-6.1/-5.9 -4.5/-3.8 -3.1/-2.3

1 Т.П.8.

|РН4|

|5нг!

-5

М., М„

[Щ? -1 О

Рисунок 1. А. Кластер альбуминовых генов человека и структура 5'-регуляторного района гена АФП. >Р - промотор, Б - репрессор, Е1-ЕИ1 - минимальные знхансеры гена АФП. Б. Сайты метилирования (М0 -М „) и гиперчувствительности к ДНКазе! (РН1 - РН4) регуляторного района гена АФП.

номной ДНК и РНК из клеток млекопитающих), фракционирование и очистка нуклеиновых кислот (рестрикция, электрофорез и проч.), гибридизация нуклеиновых кийлот, полимеразная цепная реакция, трансфекция эукариотических клеток, получение соматических гибридов, иммунохими-ческое окрашивание клеток, сканирование и компьютерная обработка результатов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Изучение уровней экспрессии мРНК АФП в АФП* и АФП клонах.

В качестве модели для изучения молекулярных механизмов регуляции экспрессии гена АФП нами были выбраны выделенные ранее Т.Л.Эрайзер клоны крысиной гепатомы McA-RH 7777, различающиеся по АФП-фенотипу. В этой клеточной линии в любой момент логарифмической фазы роста существует достаточно стабильное соотношение числа АФП* и АФП' клеток. АФП фенотип с разной частотой осциллирует в ряду клеточных поколений. Наличие и высокая частота появления ревертантов указывает на то, что наблюдающаяся изменчивость имеет немутационную природу. При клонировании образуются как АФП*, так и АФП клоны, различающиеся по уровню синтеза АФП примерно в 100 раз (Эрайзер, 1984). В настоящей работе были использованы наиболее стабильные клоны с различным АФП-фенотипом, отобранные в ходе нескольких циклов селекции: АФП* клоны АЗА, 921, DB8, А19, СС8 и АФП" клоны 7Е10, 7Е7, СС2, СС6, 1-16, 2-16, ТВ9, 5G9, В1.

АЗА В1 7Е10 509 ТВ9 9-21 1-16 2-16 РВ8 АЗА ТЧ 9-21 06 7777 7Е7 7Е10 А19

Рисунок 2. I. Сравнение клонов с различным АФП-фенотипом по уровню экспрессии мРНК АФП. Нозерн-блот гибридизация суммарной клеточной РНК с радиоактивно мечеными зондами к АФП и САРОН. Справа указаны размеры выявляемых транскриптов в т.н..

II. Наиболее стабильные клоны крысиной гепатомы МсА-ЯН 7777 с различным АФП-фенотипом. Непрямая иммунопероксидазная окраска антителами к АФП крысы. А - АФП' клон 921; Б- АФП клон 7Е10.

На первом этапе работы были исследованы уровни экспрессии мРНК АФП в исходной клеточной линии МсА-РН 7777, гепатоме Зайдела ив 15 клонах, характеризующихся наиболее стабильным АФП-фенотипом.

Экспрессию гена АФП анализировали методами Нозерн-блот и дот-блот гибридизации суммарной клеточной РНК из разных клонов с фрагментом кДНК АФП крысы в жестких условиях. Количество РНК в пробах нормализовали по уровню экспрессии гена САРОН. Параллельно проводили иммунохимическое окрашивание клонов моноклональными антите-

лами к АФП крысы (РИС 2-11). Во всех АФП* клонах выявлен один АФП-транскрипт размером примерно 2.1 т.н., соответствующий мажорному транскрипту, экспрессирующемуся в эмбриональной печени (РИС. 2-I). В большинстве АФП" клонов АФП-транскрипт не выявлялся. В двух АФП клонах 7Е7 и 2-16 обнаружены незначительные количества мРНК АФП. мРНК АФП появляется также на высоких (более 30) пассажах в АФП" клонах и предшествует появлению клонально расположенных АФП-продуцирующих клеток, так называемых ревертантов. Возобновление синтеза АФП в таких клетках указывает на то, что неактивное состояние гена АФП в АФП' клонах не связано с возникновением делеций в структурном гене АФП или его регуляторных элементах. Для того, чтобы избежать неоднозначных результатов, которые могли бы быть вызваны реверсией АФП-фенотипа в отдельных клетках клона, мы старались использовать, особенно для опытов по трансфекции, клоны возможно более ранних пассажей.

Таким образом, обнаруженная корреляция между синтезом АФП и наличием его мРНК в клонах крысиной гепатомы согласуется с литературными данными о том, что в большинстве случаев регуляция экспрессии гена АФП осуществляется на транскрипционном уровне. В то же время, учитывая как литературные данные (Vacher, 1992; Spear, 1994), так и наши наблюдения о не нулевом уровне мРНК АФП в двух клонах, в которых АФП иммунохимически не выявлялся, полностью исключить участие пост-транскрипцинных механизмов в этом процессе пока нельзя.

Уровни экспрессии АФП мРНК в АФП* клонах различаются, хотя по данным иммунохимического анализа во всех из них практически все клетки синтезируют АФП. С помощью дот-блот гибридизации мы показали, что различия по количеству мРНК АФП между АФП* и АФП клонами составляют не менее 102-103 раз, а между различными АФП* клонами - до 10 раз. Для дальнейшего изучения мы выбрали наиболее стабильные по АФП фенотипу АФП* клоны 921, АЗА и АФП' клоны 7Е10, 1-16, максимально различающиеся по количеству мРНК АФП.

2. Сравнение уровней метилирования регуляторного района гена

АФП.

На следующем этапе мы решили проверить, не коррелирует ли различие уровней экспрессии гена АФП в АФП' и АФП клонах с изменением степени метилированности регуляторных элементов гена АФП. В 5'-

концевом районе гена АФП крысы картировано 4 критических сайта метилирования (РИС. 1). Как следует из литературных данных, метилирование чаще всего не является ключевым механизмом регуляции экспрессии гена АФП, но может отражать состояние активности гена и стабилизировать неактивное состояние. В нашем случае при анализе уровня метилирования регуляторного района методом блот-гибридизации ДНК различных клонов после ее расщепления рестриктазами Mspl и Hpall с АФП-зондом мы не выявили каких-либо существенных различий по этому признаку между АФП* и АФП* клонами. Только один из Mspl/Hpall сайтов (примерно -3 т.п.н. от точки начала транскрипции) оказался частично метилирован, причем и в АФП*, и в АФП" клонах. Таким образом, мы предполагаем, что метилирование регуляторного района не только не участвует в регуляции уровня экспрессии гена АФП в исследуемой системе, но и не является индикатором транскрипционной активности этого гена, как это происходит на некоторых стадиях развития печени.

3. Разработка нового метола трансфекции эукаоиотических клеток.

Исходя из того, что различный АФП-фенотип в клонах крысиной ге-патомы определяется на транскрипционном уровне и не связан с мутациями или различной степенью метилирования 5'-регуляторного района, мы предположили, что АФП* и АФП" клоны отличаются по наличию транскрипционных факторов, связывающихся с регуляторными элементами гена АФП и влияющими на их транскрипционную активность. Для проверки этого предположения мы решили провести трансфекционный анализ клонов, наиболее различающихся по уровню экспрессии гена АФП, с помощью генно-инженерных конструкций, содержащих репортерный ген хлорамфеникол-ацетилтрансферазы (CAT) под контролем 7 т.п.н. 5'-регуляторного района.

Однако специфика клеточной системы, на которой проводились исследования, поставила перед нами определенные проблемы. В ходе предварительных экспериментов оказалось, что при временной экспрессии в используемых нами клетках уровень синтеза репортерного белка крайне низок и недостаточен для получения адекватных результатов. В связи с необходимостью достижения стабильной интеграции вектора в геном клетки и с учетом высокой фенотипической изменчивости в клетках исследуемой линии, мы попытались подобрать наиболее эффективный способ трансфекции.

Рисунок 3. Трансфекция клеток крысиной гепатомы McA-RH 7777 плазмидой pCMV-LacZ методом точечного давления. Окраска на р-галактозидазу. А - клеточный монослой, окрашенный через 48 ч после трансфекции (малое увеличение); Б - кластер окрашенных клеток.

Оказалось, что при трансфекции клеток крысиной гепатомы McA-RH 7777 стандартные методы не позволяют достичь достаточно высокой эффективности стабильной трансформации. Так, для кальций-фосфатной методики эта величина составляла 10 5, а для методики с использованием полибрена - 1-3x10'3.

Для решения стоявших перед нами задач мы разработали новый метод трансфекции, основанный на диффузии макромолекул через поры, временно возникающие в плазматической мембране клетки при механической деформации. Ранее подобный принцип был использован McNeil и соавторами при разработке метода бомбардировки клеток стеклянными шариками в присутствии раствора ДНК (McNeil, 1987). Мы заменили бомбардировку точечным механическим давлением через покровное стекло. Кроме того, воздействие механического давления было дополнено осмотическим шоком, использовавшимся ранее для введения в клетки белков (Okada, 1982; Lieber, 1987).

Суть нового метода заключается в том, что покровные стекла с культивируемыми на них клетками помещают клетками вниз в раствор, содержащий ДНК, и поочередно надавливают в нескольких местах на покровное стекло загнутой вниз стерильной стальной иглой. При необходимости обратимость деформации клеток контролируют под иннертирован-ным микроскопом в стерильных условиях.

Этот метод трансфекции был испытан на различных линиях клеток: гепатоме McA-RH 7777 крысы, линии фибробластов Rat 2/5, первичных фибробластах кур, линиях пакующих клеток v-crip, i|/2-crip и BOSC23. Ока-

залось, что метод применим для всех использованных типов клеток, но эффективность трансфекции значительно варьирует от линии к линии. Кроме того, оптимальные условия трансфекции (плотность монослоя, время после пересева, сила механического воздействия) для различных клеток могут различаться и должны быть оптимизированы для каждой конкретной линии. Оптимальные параметры предлагаемого метода были подобраны нами для линии крысиной гепатомы.

Оказалось, что используемые клетки обладают высокой способностью переносить обратимую механическую деформацию и быстро восстанавливают исходную форму. Оптимальную силу механического воздействия на данный тип клеток легко подобрать, учитывая их выживаемость, т.е. долю выживших после давления в общем числе трансфициро-ванных клеток. Наилучшая выживаемость наблюдается через 48 ч после пересева при субконфлюентном монослое. Наибольшее разрушение клеточного монослоя происходит в точке давления. Оптимальное количество точек давления составляет 20-30 на покровное стекло.

Эффективность временной трансфекции мы определяли, трансфи-цируя клетки плазмидой pCMV-LacZ. Частоту стабильной трансформации определяли при трансфекции рБУ2-пео.

Наивысшая эффективность трансфекции (соотношение числа трансфицированных клеток в случае временной трансфекции или числа образовавшихся в ходе селекции клонов для стабильной трансформации к числу трансфицированных клеток) достигалась при концентрации ДНК от 0,2 до 2,0 мкг на покровное стекло. Эффективность временной трансфекции клеток гепатомы крысы, которую оценивали по окраске клеток на Р-галактозидазу, составляла 2-15х10 г. Окрашенные клетки располагались кластерами, содержащими 20-60 окрашенных клеток, часто они располагались вокруг поврежденного о точке давления участка монослоя (РИС. 3) Стабильно трансформированные клоны, устойчивые к возникали с частотой 1-2х10"г, что соответствует 1-2х103 клонов на 1 мкгДНК.

В опытах по котрансфекции клеток гепатомы крысы плазмидами рСМУ-Ьасг и рБ\/2-пео показано, что 80% клонов клеток, устойчивых к экспрессируют бактериальную (3-галактозидазу.

Оказалось, что предложенный метод позволяет вводить в клетки не только ДНК, но и антитела и другие белки. Предложенный метод является наиболее простым и дешевым среди так называемых "механических методов" введения макромолекул в живые клетки. Он может быть использован для эффективной трансфекции различных типов клеток, в том числе

тех, на которых стандартные методы трансфекции не позволяют достичь высокой эффективности.

4. Анализ экспрессии репортерных генов под контролем регулятоо-ных элементов гена АФП в АФГТ и АФП" клонах.

Таким образом, разработанный нами новый эффективный метод трансфекции позволил провести стабильную трансформацию клонов с различным АФП-фенотипом генно-инженерными конструкциями, содержащими репортерные гены под контролем полного 5'-регуляторного района длиной 7 т.п.н. или его элементов.

На первом этапе этой части работы мы котрансфицировали АФГТ и АФП' клоны плазмидой р7000-САТ, содержащей репортерный ген хло-рамфеникол-ацетилтрансферазы под контролем 7 т.п.н. 5'-регуляторного района гена АФП, и вектором pSV2-neo, несущим ген устойчивости к нео-мицину. Отобранные в ходе селекции с G.,,, колонии стабильно .трансформированных клеток переносили на нитроцеллюлозные фильтры. Каждый фильтр делили на две части: одну из них использовали для гибридизации РНК клеток, иммобилизованных на фильтре, с АФП-зондом, другую - с САТ-зондом. Эффективность трансфекции проверяли после денатурации, обработки РНКазой и повторной гибридизации ДНК, оставшейся на фильтре, с САТ-зондом. Качество переноса колоний контролировали окраской гематоксилином по Караччи после гибридизации.

В проанализированных таким образом 12 клонах выявлена корреляция между экспрессией эндогенного гена АФП и трансфицированного гена CAT: репортерный ген транскрибируется только в АФП* и неактивен в АФП клонах (РИС. 4). Эти данные подтверждают предположение о том, что различные уровни экспрессии гена АФП в исследуемых клонах определяется различным набором транскрипционных факторов, связывающихся с 7-килобазным 5'-регуляторным районом гена.

Для того, чтобы попытаться оценить вклад каждого из ранее идентифицированных регуляторных элементов гена АФП в активацию экспрессии этого гена на нашей системе, мы использовали набор плазмид, содержащих репортерный ген люциферазы под контролем определенных регуляторных элементов. Для этого клетки клонов 921, АЗА, 7Е10, 1-16, 216 и исходной клеточной линии котрансфицировали репортерной конструкцией и вектором, несущим ген устойчивости к неомицину, и отбирали на устойчивость к Gm. Клетки, прошедшие отбор, наращивали и использовали одновременно для окраски на АФП и выделения нуклеиновых

А Б В

Рисунок 4. Корреляция экспрессии гена АФП и репортерного гена CAT в стабильно трансформированных АФП' и АФП клонах. А - гибридизация с АФП-зондом; Б - гибридизация с САТ-зондом; В - окраска гематоксилином по Ка-раччи. 50 - АФП' клон 921; 51, 52 - АФП клоны 7Е10 и СС2.

кислот. РНК, выделенную из смешанной популяции трансформированных клеток,, использовали для дот-блот гибридизации с радиоактивно мечеными пробами на АФП, люциферазу и контрольный ген GAPDH. ДНК из трансфицированных клонов использовали для контроля интеграции ре-портерной конструкции в геном. Для того, чтобы нивелировать влияние количества встроившихся копий и места их интеграции, использовали неклонированные популяции трансформированных клеток.

Как и следовало ожидать на основании предыдущей серии экспериментов, в АФП" клонах 7Е10 1-16 и 2-16 количество мРНК репортерого гена люциферазы под контролем всех пяти исследованных сочетаний регу-лягорных элементов практически не отличалось от фонового уровня, наблюдавшегося в клетках, несущих ген люциферазы без промотора, или от клеток, трансфицированных только pSV2-neo. В положительных клонах АЗА, 921 и исходной линии клеток McA-RH 7777 обнаружены различия между количеством мРНК репортерного гена при использовании различных сочетаний промоюра и энхансероп. Оказалось, что и □ исходной ли-

нии, и в отдельных клонах существенное влияние на экспрессию репор-терного гена оказывает промоторно-релрессорный участок (РИС I), а добавление любого из энхансеров снижает, либо незначительно увеличивает активность промотора. Интересно, что в клонах АЗА и 921 полный ре-гуляторный район (7 т.п.н.) значительно менее активен, чем промоторно-репрессорный участок, в то время, как в исходной линии его активность более чем в 10 раз превосходит промоторную.

Полученные нами результаты указывают на то, что для исследуемых нами клонов крысиной гепатомы различия в АФП-фенотипе определяются различным набором транс-действующих регуляторных факторов, имеющих сайты связывания в 5'-регуляторном районе гена, и, прежде всего, в

его промоторно-репрессорной области, i

5. Сравнение уровней экспрессии генов ГЯФ и СА в клонах с различным АФП-Фенотипом.

Наиболее распространенными транс-факторами, определяющими экспрессию генов, специфичных для печени, являются так называемые ГЯФ, к которым относят несколько семейств регуляторных белков: HNF1, С/ЕВР, HNF3 и HNF4 (Tronche, 1992). Хотя экспрессия этих факторов не ограничивается только клетками печени, именно в этом органе выявляются максимальные количества ГЯФ. Тканевая специфичность экспрессии любого из печеночных генов достигается, по-видимому, одновременным участием нескольких гепатоцитарных факторов в регуляции этого процесса.

В регуляторном районе гена АФП ранее были выявлены сайты связывания белков семейств HNF1, HNF3 и С/ЕВР. Представители каждого из этих семейств обладают различными транс-активационными характеристиками, а белки семейств HNF1 и С/ЕВР способны образовывать как го-MO-. так и гетеродимеры, модулирующие их индивидуальные свойства.

При исследовании уровней экспрессии некоторых ГЯФ в клонах с различным АФП-фенотипом мы впервые обнаружили корреляцию уровней экспрессии генов АФП и HNF4 (РИС. 6). Во всех АФП* клонах обнаружен высокий уровень экспрессии гена HNF4. Единственный из проанализированных АФП1 клонов, в котором выявляется значительный уровень экспрессии гена HNF4, морфологически отличается от АФП /HNF4 клонов. Из описанных в настоящее время ГЯФ HNF4, относящийся к семейству стероидных рецепторов, играет, по-видимому, наиболее существенную роль в пйддержании гепатоцитарного фенотипа и значительно

АФП

АЗА 7Е7 1-16 7Е10 7777 2-16 9-21 509 7Е10

Н№4

СА

-2.1

-2.3

-1.4

вАРОН

Рисунок 5. Сравнение клонов с различным АФП-фенотипом по уровню экспрессии мРНК НЫЯ4. Нозерн-блот гибридизация суммарной клеточной РНК с радиоактивно мечеными зондами к АФП, НЫР4 и САРОН. Справа указаны размеры выявляемых транскриптов в т.н.

Рисунок 7. Нозерн-блот гибридизация суммарной клеточной РНК с радиоактивно мечеными зондами к АФП, СА и ОАРОН. Справа указаны размеры выявляемых транскриптов в т.н.

1-16 ТВ9 2-16 509 06 7777 АЗА 9-21 7Е10 7Е10 7Е10

Н№4 пео

кЛ *зк ш

-4.5

АФП

ч-2.1

М ч-1.4

САРОН

V ^ V

I ъ§

•^гг—

9-21 7Е7 7Е10 7Е10 НМР-4

3.6

"^з.г

V.»

АФП

-2.1

С-'.*"'.

"-'.л

ч' ?!

САРЭН

-1.4

Рисунок 6. Сравнение клонов с различным АФП-фенотипом по уровню экспрессии нт.

I. Нозерн-блот гибридизация суммарной клеточной РНК с радиоактивно мечеными зондами к НЫР1, АФП и САРйН. Справа указаны размеры выявляемых транскриптов в т.н..

II. Непрямая иммунопероксидазная окраска клонов с различным АФП-фенотипом антителами к Н1МР1 крысы. А - АФП' клон 921; Б- АФП клон 7Е10.

определяет уровни экспрессии других регуляторных белков печени, НЫР1 и НМРЗ. Действительно, оказалось, что, хотя уровень экспрессии мРНК НЫР1 в исследованных клонах существенно ниже, он подчиняется той же закономерности, что и уровень Н1МР4 (РИС 5-11). Более того, иммунохими-чески НЫР1 выявляется в подавляющем большинстве клеток в АФП* клонах и практически не обнаруживается в АФП клонах (РИС 5-1).

В то же время, уровни экспрессии генов семейства НЫРЗ оказались сходными во всех проанализированных клонах.

Во всех АФП* клонах отмечено повышение количества мРНК СА, аналога АФП, синтезируемого взрослой печенью (РИС 7). Так как в промоторах АФП и СА выявлены сайты связывания HNF1, который способен активировать экспрессию этих генов in vivo и in vitro, можно предположить, что корреляция уровней АФП и СА в клонах крысиной гепатомы может определяться именно этим транскрипционным фактором.

6. Трансфекция вектора, экспрессируюшего HNF4. в АФП клон. Для того, чтобы проверить, существует ли прямая связь между неактивным состоянием гена АФП и отсутствием HNF4 в АФП клонах, клон 7Е10 (АФП7НЫР4 ) был котрансфицирован экспрессирующим вектором pLEN4S-HNF4, любезно предоставленным J.Darnell, и pSV2-/ieo. После селекции на G4ie была получена популяция стабильно трансформированных клеток и изолировано шесть ее субклонов. При иммунохимическом анализе количество АФП* клеток в пяти субклонах и неклонированной популяции оказалось незначительным: примерно 1 на 1000. Такая же доля АФП* клеток наблюдалась в контрольных клонах, трансфицированных только pSV2-neo, и в нетрансфицированных клегках того же пассажа. В ю же время, в одном из субклонов было выявлено примерно 20% клонально расположенных АФП-продуцирующих клеток. Количество АФП* клеток на протяжении 10 пассажей практически не изменялось. Появление популяции АФП* клеток в этом случае может быть связано с переключением транскрипции какого-либо регуляторного фактора на одном из первых пассажей после изоляции этого субклона.

Одновременно с этим во всех субклонах и неклонированной популяции трансформированных клеток наблюдалось значительное повышение количества HNF1, причем этот белок выявлялся в подавляющем большинстве клеток. Результаты иммунохимических исследований подтвердились при сравнении количества мРНК HNF4, HNF1 и АФП в трансфицированных и нетрансфицированных клетках. Кроме того, было выявлено повышение уровня экспрессии гена СА, который, как и АФП, может активи-роватся факторами семейства HNF1.

Таким образом, данные по корреляции количества мРНК HNF4 и АФП в клонах крысиной гепатомы и результаты, полученные нами в этой части работы, позволяют предположить, что:

- либо HNF4 необходим, но не достаточен для активации экспрессии гена АФП в опухолевых клетках,

- либо НМР4 не участвует в регуляции гена АФП, но в регуляции экспрессии этих генов принимает участие общий регуляторный фактор.

Кроме того, значительное повышение количества НЫР1 в клетках после трансформации вектором, экспрессирующим НЫР4, подтверждают литературные данные о том, что НЫР4 является основным регулятором экспрессии гена НЫР1. В то же время, на исследуемой нами системе увеличение уровня синтеза НМР1 не достаточно для активации экспрессии гена АФП, как это наблюдалось на некоторых других гепатомных линиях.

7. Слияние АФП* и АФП' клонов.

Все изученные к настоящему времени транскрипционные факторы, взаимодействующие с регуляторными элементами гена АФП, являются либо активаторами транскрипции, либо, в зависимости от собственной концентрации и присутствия других факторов, могут выполнять как акти-ваторные, так и репрессорные функции. К последней группе регуляторов транскрипции относятся нетканеспецифические факторы АР-1, МР-1, глю-кокортикоидные и ретиноидные гормон-рецепторные комплексы. Есть данные, указывающие на существование гепатоспецифических негативных регуляторов, определяющих подавление экспрессии гена АФП в процессе развития, однако, они пока не идентифицированы.

Для того, чтобы попытаться выяснить, какие регуляторные факторы, негативные или позитивные, определяют различный АФП фенотип исследуемых нами клонов, мы решили проверить, будет ли экспрессироваться ген АФП в соматических гибридах АФП* и АФП" клонов.

Для достижения этой цели были использованы клетки АФП" клона 7Е10, несущие ген устойчивости к неомицину (7Е10Ы), полученные на предыдущих этапах работы, и клетки АФП* клона 921 (921Н) и АФП 7Е10 (7Е10Н), зараженные ретровирусом рРБ-Нудго, несущим ген устойчивости к гигромицину. Для получения стоков вируса с высоким титром использовали пакующие клетки ВОЭС 23, трансфицированные предложенным выше методом.

Слияние проводили стандартным методом с использованием ПЭГ. АФП*/АФП" гибриды отбирали, проводя двойную селекцию на неомицин и гигромицин. Прошедшими двойную селекцию считались гибриды, в которых после селекции насчитывалось более 100 клонов. Таким образом, было получено два гибрида 921Нх7Е10Ы и контрольный гибрид 7Е10Нх7Е101Ч.

921 921Н 7Е10Н 7Е10 7Е10^Е.ОМх7Е10Мх 7Е10Н,7Е10М, 7Е10Мх 7Е10^

-2.1

АФП

вАРОН

Рисунок 8. Соматическая гибридизация АФП' и АФП клонов 921 и 7Е10. Нозерн-блот гибридизация суммарной клеточной РНК из полученных гибридов и исходных клонов с радиоактивно мечеными зондами к АФП и вАРОН. Справа указаны размеры выявляемых транскриптов в т.н..

Для того, чтобы нивелировать влияние сайта встраивания вектора в геном и возможного выбрасывания хромосом в отдельных клетках, дальнейшие анализы проводили на смеси гибридных клонов. Иммунохимиче-ским методом показано, что доля АФП* клеток в АФП*/АФП' гибридах крайне незначительна (менее 2% клеток) и не превышает аналогичного показателя в контрольном гибриде. Как и в случае возникновения ревер-тантов в исходном АФП" клоне, АФП4 клетки располагаются кластерами.

I

Исходные клоны 921 и 7Е10 различаются по морфологии, а гибридные клетки по этому признаку похожи на АФП" клон. В то же время, практически во всех гибридных ядрах выявляется белок НNР1, не идентифицируемый в АФП" клоне. С помощью полимеразной цепной реакции показано присутствие специфической последовательности ретровирусного вектора рРБ-Нудго, которым был маркирован АФП' клон, в ДНК гибридных клеток. Данные иммунохимических анализов подтверждаются результатами Но-зерн-блот гибридизации с АФП и НЫЕ1 зондами (РИС.8).

Таким образом, в АФГТ/АФГТ гибридах происходит подавление экспрессии гена АФП, которое определяется, по-видимому, наличием, в клоне 7Е10 негативного регулятора транскрипции, которого нет в АФП' клонах. Появление редких АФП* клеток определяется, по-видимому, теми же механизмами, что и возникновение ревертантных клеток в исходных клонах. Важно отметить, что падение экспрессии гена АФП не связано с падением уровня НЫР1, который является одним из потенциальных регуляторов промотора АФП.

Заключение.

Таким образом, в настоящей работе нам удалось исследовать некоторые молекулярные механизмы, определяющие различия уровней экспрессии гена АФП в клонах крысиной гепатомы МсА-ЯН 7777. Нами показано, что различия эти контролируются главным образом на транскрипционном уровне и определяются различным набором трансфакторов, связывающихся с регуляторными элементами гена. По-видимому, как в нашем, так и в других случаях, главную роль в поддержании определенного уровня экспрессии гена АФП играет промоторно-репрессорный элемент и связывающиеся с ним факшры. На основании данных соматической гибридизации мы предполагаем существование в АФП клонах тканеспецифического негативного регулятора, блокирующего экспрессию гена АФП. Так как такой фактор еще не идентифицирован, охарактеризованная ними система может оказаться адекватной моделью для его выявления. Нам представляется, что при отсутствии в клетке негативного регулятора активность работающего промотора определяется набором других транскрипционных факторов и соотношением их форм с различными активационными свойствами.

ВЫВОДЫ

1. Предложен простой и быстрый метод введения в культивируемые клетки ДНК, антител и других белков. Эффективность временной трансфекции при использовании предлагаемого метода составляет 0,5-1,5x10 ', при стабильной трансформации эта величина достигает 2x10 Метод применим для различных типов клеток и может быть успешно использован для трансфекции клеток, на которых стандартные методы позволяют достичь крайне низкой эффективности. Новый метод

использован в экспериментах по трансфекции, проведенных в ходе данной работы.

2. Исследованы уровни экспрессии мРНК АФГ1 в полученной ранее коллекции клонов крысиной гепатомы McA-RH 7777, контрастно отличающихся по уровню синтеза этого белка. В АФГГ клонах выявляется единственный транскрипт размером 2.1 т.н., в АФП клонах мРНК АФП практически не выявляется. Для дальнейшего изучения выбраны клоны, наиболее различающиеся по уровню экспрессии гена АФП.

3. С помощью трансфекционного анализа АФП* и АФП клонов с использованием репортерных конструкций, содержащих полный 5'-регуляторный район гена АФП или сочетания его отдельных элементов, показано, что различия уровней экспрессии гена АФП в клонах с различным АФП-фенотипом определяются на транскрипционном уровне и связаны с различным набором транс-действующих факторов, связывающихся с регуляторным районом гена АФП и, прежде всего, с его промоторно-репрессорной областью.

4. Уровни метилирования 5'-регуляторного района гена АФП в АФП' и АФП клонах не отличаются.

5. Выявлена корреляция между уровнями экспрессии печеночных генов АФП и СА и специфического гепатоцитарного транс-фактора HNF1. Возможно, именно этот фактор определяет координированную экспрессию генов АФП и СА в АФП' клонах.

6. В АФП-продуцирующих и -непродуцирующих клонах крысиной гепатомы впервые выявлена корреляция между уровнями экспрессии i енов АФП и HNF4.

7. При трансфекции в АФП /HNF4 клон вектора, экспрессирующего HNF4, во всех клетках активируется синтез HNF1 и значительно повышается количество мРНК СА. Существенного повышения синтеза АФП в большинстве субклонов, трансформированных HNF4, не происходит. Это указывает на то, что:

- либо HNF4 необходим, но не достаточен для активации экспрессии i она АФП в опухолевых клетках,

- либо HNF4 не участвует в регуляции гена АФП, но в регуляции экспрессии этих генов принимает участие общий регуляторный фактор.

8. Получены соматические гибриды АФП' и АФП клонов. Экспрессия гена АФП п гибридных клетках подавлена. Эти данные, указывают на существование в АФП клонах регуляторного фактора (факторов), способных подавлять экспрессию гена АФП.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. N.L.Lazarevich, T.L.Eraiser, A.T.Tikhonenko. Alpha-fetoprotein gene 5 -flanking region directs expression of the reporter gene only in AFP-positive clones of McA-RH 7777 rat hepatoma. - "Oncodevelopmental proteins and clinical applications." XVIIIth Meeting of the International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine, Moscow, USSR, September 23-27, 1990. Abstract book, 1990,67.

2. T.L.Eraiser, N.L.Lazarevich., A new effective method for introduction of macromolecules into eukariotic cells in vitro. Application to proteins, antibodies and DNA-constructs. - "From bas'ic researh in oncology to clinical application with special reference to cancer in women." XIX Meeting of the International Society of Oncodevelopmental Biology and Medicine, Siena, Italy, October 13-17, 1991. Abstract book, 1991, 296.

3. T.L.Eraiser and N.L.Lazarevich. Cell clones of rat hepatoma maintaining experimentally controlled alpha-fetoprotein production. - "Molecular aspects of liver carcinogenesis", Delphi, Greece, January 8-18, 1994. Abstract book, 1994.

4. N.L.Lazarevich, T.L.Eraiser, I.F.Poddubnaya, E.V.Varga. Alpha-fetoprotein (AFP) and hepatocyte nuclear factor-4 (HNF-4) gene expression correlates in McA-RH 7777 rat hepatoma cell clones. "Liver Development, Gene Regulation and Desease", Arcachon, France, May 1995. Abstract book, 100.

5. N.L.Lazarevich, E.V.Varga, I.F.Poddubnaya and T.L.Eiaisei. Studying of alpha-fetoprotein (AFP) gene expression in AFP-producing and non-pioducing rat hepatoma cell clones. 23rd Meeting of the Federation of the European Biochemical Societies, August 13-18, 1995, Basel, Switzeland, Abstract book.

6. Н.Л.Лазаревич, Е.В.Варга, И.Ф.Поддубная и Т.Л.Эрайзер. Клопы крысиной гепатомы, продуцирующие или не продуцирующие альфа-фетопротеин (АФП), различаются по уровню экспрессии некоторых гепатоцитарных ядерных факторов. Материалы IV Всероссийского симпозиума по клеточной биологии. Цитология, 1996, т. 38, вып. 2, стр. 238.

7. Т.Л.Эрайзер и Н.Л.Лазаревич. Трансфекция точечным давлением: быстрый и эффективный способ введения макромолекул в клетки млекопитающих. Молекулярная биология, 1996, т. 30, вып. 2, стр. 430-435.

8. Е.В.Варга, И.Ф.Поддубная, Т.Л.Эрайзер и Н.Л.Лазаревич. Изучение влияния ретиноевой кислоты на уровни экспрессии альфа-фетопротеина и некоторых гепатоцитарных ядерных факторов в клонах крысиных гепатом. Материалы I Съезда онкологов стран СНГ, Москва, 1996, 80.

9. G.I.Abelev and N.L.Lazarevich. Alpha-Fetoprotein: Solved and Unsolved Problems., McGill Journal of Medicine, 1996, v. 2, N 2, в печати.