Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изменения спектров экспрессии генов при гепатоканцерогенезе и прогрессии опухолей печени

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изменения спектров экспрессии генов при гепатоканцерогенезе и прогрессии опухолей печени"

ЛАЗАРЕВИЧ НАТАЛИЯ ЛЕОНИДОВНА

ИЗМЕНЕНИЯ СПЕКТРОВ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ ПРИ ГЕПАТОКАНЦЕРОГЕНЕЗЕ И ПРОГРЕССИИ ОПУХОЛЕЙ ПЕЧЕНИ

03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

МОСКВА 2003

Работа выполнена в лаборатории Иммунохимии НИИ Канцерогенеза РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН

Научный консультант:

доктор биологических наук, академик РАН,

профессор Абелев Гарри Израилевич

Официальные оппоненты:

член-корр. РАН, доктор биологических наук,

профессор Гвоздев Владимир Алексеевич

доктор биологических наук, профессор Копнин Борис Павлович доктор биологических наук, профессор Бродский Всеволод Яковлевич

Ведущая организация:

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Защита диссертации состоится 11 июня 2003 г. в часов

на заседании диссертационного совета Д 501.001.76

при Московском Государственном Университете им. М.В. Ломоносова

по адресу: 119992, Москва, ГСП-2, Ленинские Горы, МГУ, НИИ физико-

химической биологии им. А.Н. Белозерского, лабораторный корпус А, ауд. 536.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова

Автореферат разослан «_» _2003 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук Н.О. Калинина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Гепатоцеллюлярная карцинома (ГК) - самая частая опухоль печени и одна из наиболее распространенных форм рака в мире. Основными факторами риска для развития ГК являются хронические инфекции вирусами гепатита В или С и длительное воздействие химических гепатоканцерогенов, таких как афлатоксин В1 (Bosch, 1999). Анализ генетических нарушений и изменений в экспрессии генов позволил выявить ряд факторов, вовлеченных в процесс гепатоканцерогенеза. Он включает гены, кодирующие факторы роста (TGF-a, TGF-ß, HGF и их рецепторы), опухолевые супрессоры (Rb, р53), компоненты Wnt-сигнального пути, молекулы межклеточных контактов и адгезионные белки (Buendia, 2000).

Развитие опухолевого фенотипа представляет собой многостадийный процесс, обусловленный накоплением генетических нарушений. Следствием таких нарушений является приобретение опухолью все более злокачественного фенотипа. Этот процесс, получивший название опухолевой прогрессии, является важным свойством злокачественных новообразований различного происхождения, но всегда определяется свойствами исходной ткани, давшей начало опухоли.

Прогрессия ПС сопровождается снижением уровня дифференцировки, подавлением экспрессии ткане-специфических генов, увеличением скорости пролиферации клеток, утратой эпителиальной морфологии, приобретением инвазивности и способности к метастазироваяию. Прогрессия ГК связана с утратой опухолями дифференцированного фенотипа, в то же время, карциномы часто сохраняют способность к ре-дифференцировке (Абелев, 2003). В настоящее время описано множество сигнальных путей, важных для контроля функций печени и пролиферации, однако молекулярные основы прогрессии ГК остаются недостаточно изученными.

Определяющую роль в регуляции экспрессии большинства генов, специфичных для печени, играет соотношение в клетке уровней так называемых гепатоцитарных ядерных факторов (ГЯФ), к которым относят несколько семейств регуляторных белков: HNF1, С/ЕВР, HNF3, HNF4 и HNF6 (Tronche and Yaniv, 1992). Между уровнями экспрессии различных ГЯФ существуют тесные связи (Лазаревич, 2000; Locker, 2001), однако иерархические отношения между представителями различных семейств факторов пока исследованы недостаточно полно.

Ядерный рецептор HNF4a играет ключевую роль в эмбриональном развитии печени и в поддержании дифференцированного гепатоцитарного фенотипа (Li et al., 2000; Hayhurst et al., 2001). Однако роль HNF4a и других ткане-специфических ре^^тат^ов^ транскрипции в гепатоканцерогенезе в настоящее время практически не изучена.

Для решения этой проблемы мы использовали новую экспериментальную систему, в которой из медленнорастущей дифференцированной ПС мьппи (мГК) одномоментно выщепился инвазивный высоко злокачественный вариант (6ГК). Мы рассчитывали, что сравнение вариантов мГК и 6ГК позволит идентифицировать генетические пути, определяющие основные свойства прогрессии ГК, и приступить к разработке подходов к реверсии злокачественного фенотипа ГК. Универсальность регуляторных механизмов, выявленных при изучении этой системы, была проверена на клонах крысиной гепатомы с разным уровнем экспрессии опухолевого маркера альфа-фето протеина (АФП), в химически индуцированных ГК мышей независимого происхождения и в образцах ГК человека.

Цели и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в изучении молекулярных механизмов прогрессии ГК и проверки выдвинутой нами гипотезы о роли транскрипционных факторов, специфических для печени, в гепатоканцерогенезе. В ходе работы решались следующие основные задачи:

1. Характеристика биологических свойств новой экспериментальной системы прогрессии ГК мышей от vivo.

2. Анализ профиля экспрессии гепато-специфических белков и транскрипционных факторов при прогрессии ГК.

3. Изучение эффектов ре-экспрессии HNF4a в культуре клеток дедифференцированной ГК.

4. Проверка универсальности выявленных закономерностей на панели независимо индуцированных ГК мышей с разного уровня дифференцировки.

5. Определение спектров экспрессии и возможной роли ГЯФ в регуляции экспрессии гена опухолевого маркера АФП в клонах крысиной гепатомы и их соматических гибридах.

6. Поиск причин подавления транскрипции HNF4a при де-дифференцировке ГК.

7. Исследование уровней экспрессии HNF4cc в образцах ГК человека.

8. Выявление потенциальных эффекторов и маркеров гепатоканцерогенеза и прогрессии опухолей печени методом гибридизации с кДНК микрочипами.

Научная новизна работы. Исследования молекулярных механизмов, лежащих в основе опухолевой прогрессии ГК, были значительно осложнены отсутствием четких экспериментальных моделей гепатоканцерогенеза in vivo. Поэтому научная новизна исследования во многом определяется использованием уникальных моделей: коллекции химически индуцированных ГК мышей, системы ГК мышей общего происхождения, различающихся по скорости роста и уровню дифференцировки, и набором клонов крысиной гепатомы, отличающихся по уровню экспрессии АФП. Создание и характеристика

экспериментальных систем близкого происхождения, различающихся по выраженности определенного ряда признаков, позволило провести сравнительный анализ экспрессии генов, определяющих прогрессию и де-дифференцировку опухолей печени.

В работе показано, что прогрессия ГК сопровождается координированным подавлением уровней мРНК гепато-специфических генов. Впервые проведен полный анализ уровней экспрессии транскрипционных факторов, определяющих дифференцировку печени, при возникновении и прогрессии ГК ш vivo. Впервые установлено, что на ранних этапах канцерогенеза происходит активация транскрипции эмбриональной формы HNF4a. В то же время, при прогрессии ГК выявлено изменение экспрессии целого блока ткане-специфических транскрипционных факторов. В работе впервые продемонстрирована ключевая роль HNF4al в поддержании дифференцированного статуса опухолей печени и показана возможность частичной реверсии злокачественного фенотипа при экзогенной экспрессии этого гена. В ходе этих исследований идентифицирован ряд новых транскрипционных мишеней HNF4al.

В то же время, показано, что причиной подавления экспрессии HNF4al стало изменение функции транскрипционных регуляторов этого гена, и выявлена последовательность, определяющая негативную регуляцию HNF4al в быстрорастущем варианте ГК.

Выявленные закономерности носят, по-видимому, общий характер, поскольку HNF4ocl и ряд регулируемых им генов имеют сходные паттерны экспрессии в различных модельных системах, а их репрессия четко коррелирует с дедифференцировкой клеток. Более того, вами впервые обнаружено подавление транскрипции HNF4al в образцах дедифференцированных ГК человека.

Экспрессия гена опухолевого маркера АФП в исследованных системах коррелирует с транскрипцией HNF4al и ряда других ГЯФ. Впервые показана способность HNF4al активировать экспрессию АФП. Методом соматической гибридизации установлено существование механизма негативной регуляции гена АФП, вероятно опосредованной репрессией HNF4al.

Впервые проведено исследование профилей экспрессии генов при прогрессии ГК методом гибридизации с кДНК микрочипами. Выявлены гены, потенциально определяющие ход опухолевой прогрессии, возможные маркеры гепатоканцерогенеза, новые HNF4al респонсивные гены и возможные эффекторы его экспрессии.

Практическая ценность работы. Изучение механизмов, определяющих прогрессию ГК, относится к фундаментальным исследованиям природы опухолевого роста и имеет прямое отношение к разработке методов терапии злокачественных опухолей.

з

Исследование содержит ряд новых экспериментальных подходов и теоретических концепций для изучения гепатоканцерогенеза. Результаты работы имеют прямое отношение к разработке методов диагностики и регрессии опухолей. Определение способов повышения уровня дифференцировки ГК может привести как к усилению чувствительности опухолей к терапии, так и к созданию новых методов их лечения. В ходе работы получены новые данные о механизмах регуляции оико-эмбрионального маркера АФП, широко используемого в клинической практике. Кроме того, в исследовании выявлены гены, потенциально являющиеся маркерами возникновения и прогрессии опухолей печени.

Модельные системы, охарактеризованные в настоящем исследовании, представляются многообещающей моделью для комплексного изучения механизмов, отвечающих за поддержание дифференцировочиого статуса опухолей печени, и идентификации генов, определяющих прогрессию ГК.

Апробация работы. Диссертация апробирована на совместной научной конференции лабораторий иммунохимии опухолей, цитогенетики, генетики опухолевых клеток, регуляции клеточных и вирусных онкогенов НИИ канцерогенеза Российского онкологического научного центра им. H.H. Блохина РАМН 4 ноября 2002 г. Материалы исследований, представленных в работе, докладывались на международных конференциях и симпозиумах, в том числе XVIII, XXV и XXIX конференциях Международного общества онкоэмбриональной биологии и медицины (Москва, 1990; Монтре, 1997; Барселона, 2001), 23, 24 и 27 конференции Федерации Европейских биохимических обществ (Базель, 1995; Амстердам, 1997; Лисабон, 2001), 7 и 8 Международных конгрессах «Развитие, регуляция генов и болезни печени» (Аркашон, 1995; Орвиетто, 1999), I Съезде онкологов стран СНГ (Москва, 1996), IV Всероссийском симпозиуме по клеточной биологии (Санкт-Петербург, 1996), Конференции CSH лаборатории «Регуляция экспрессии генов в норме и при патологии» (Ныо-Йорк, 1997), Международном симпозиуме «Современные проблемы молекулярной генетики и клеточной биологии» (Москва, 2000), 6 и 7 Европейских конференциях по гепатоканцерогенезу (Вена, 1999; Кастиадас, 2001), Конференциях «Механизмы дифференцировки и патогенеза печени» Федерации американских обществ экспериментальной биологии (Колорадо, 1998, 2000 и 2002), 16 и 17 конференциях Европейского общества исследователей рака (Халкидики, 2000; Гранада, 2002), 11 конференции Европейских раковых организаций (Лиссабон, 2001), III Съезде Биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002) и на ученых советах НИИ Канцерогенеза РОНЦ РАМН.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 35 печатных работ

Структура и объем работы. Диссертация изложена на..... страницах машинописного

текста (12 шрифт, полуторный интервал), содержит 34 рисунка и 10 таблиц. Она состоит из глав: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты исследования», «Обсуждение результатов», «Выводы» и «Список литературы». Список литературы содержит ....источников, в том числе ... в отечественных рецензируемых изданиях.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ИЗУЧЕНИЕ МЕХАНИЗМОВ ОДНОСТУПЕНЧАТОЙ ПРОГРЕССИИ ПЕРЕВИВАЕМЫХ ГК МЫШЕЙ

Для изучения закономерностей экспрессии генов при прогрессии ГК была использована коллекция перевиваемых ГК мышей, полученная в НИИ Канцерогенеза РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН О.В. Морозовой и Н.В.Энгельгардт. Первичные ПС были индуцированы у гибридов F1 линий С57В1 и DBA по стандартной методике химического гепатоканцерогенеза: инициация (диэтилнитрозамин) - промоция (фенобарбитал). Полученные опухоли перевивали подкожно суспензией опухолевой ткани в ростовой среде (Энгельгардт и др., 2000). ГК отличались по степени дифференцировки и скорости роста. В ходе исследования одна из медленнорастущих дифференцированных опухолей (мГК) на третьем пассаже в одном из привитых животных резко увеличила скорость роста, дав начало быстрорастущему дедифферекцированному варианту (6ГК) Рнгельгардт и др., 2000) (Рис. 1). В то время как для мГК интервал между пассажами in

vivo составлял 5-7 месяцев, 6ГК требовала перевивки каждые 2 недели. Оба варианта сохраняли соответствующий фенотип при пассировании in vivo.

В отличие от мГК, клетки которой не способны расти in vitro, из 6ГК была получена клеточная культура НЗЗ, характеризующаяся слабой адгезией к субстрату и тенденцией к трехмерному росту (Энгельгардт и др., 2000).

Рисунок X. Генеалогическое древо ГК. Временная шкала перевивки опухолей. Каждый прямоугольник обозначает животное, которому были привиты медленнорастущий (мГК, светло-серый цвет) или быстрорастущий (6ГК, темно-серый цвет) варианты ГК, стрелкой отмечено животное, использованное для получения культуры клеток 6ГК (ЮЗ).

мГК

Я «Ж

НЗЗ

6ГК

- й

ымь ьч

kj> IV

Утрата эпителиальной морфологии при прогрессии ГК

мГК имеет типичную для ее дольчатой структуры базальную мембрану, состоящую из коллагенов I и IV типа, ламинина, энтактина и фибронектина (Кудрявцева и др., 2001). В мГК все клетки взаимодействуют с внеклеточным матриксом. На Рисунке 2А представлена мембранная локализация коллагена IV типа в образце мПС, типичная для всех компонентов ЕСМ. В 6ГК синтезируются те же компоненты матрикса, но клеточная адгезия значительно нарушена. В отличие от мГК, большая часть клеток не образует контактов с матриксом (Рис. 2А).

Белок плотных контактов ZO-1 локализуется на мембране клеток мГК, но не 6ГК (Рис. 2). Этот факт наряду с перераспределением домен-специфических маркеров свидетельствует об утрате полярности в 6ГК (Энгельгардг и др., 2000). Сходные закономерности выявлены в распределении Е-кадхерина - основного белка адгезионных контактов эпителиальных клеток: в мГК он выявлялся сплошной линией на базолатеральном домене плазматической мембраны (Рис. 2А). В 6ГК антитела к Е-кадхерину слабо окрашивают цитоплазму, однако на мембране клеток Е-кадхерин не выявляется (Рис. 2А) (Кудрявцева и др., 2001).

Таким образом, при прогрессии от мГК к 6ГК произошла утрата эпителиальных признаков: исчезновение клеточной полярности, ослабление межклеточных контактов и связи с внеклеточным матриксом. Совместно с Е.В.Варга мы показали, что эти явления сопровождаются изменениями в экспрессии некоторых генов, кодирующих компоненты межклеточных контактов и адгезионные молекулы.

Взаимодействие клеток с внеклеточным матриксом обеспечивают соответствующие рецепторы, интегрины. В ходе прогрессии в 6ГК произошла активация транскрипции гена аЗ субъединицы интегрина (Рис. 2Б), которая характерна для незрелых и трансформированных гепатоцитов. Вероятно, рецептор a3ßl определяет дифференцировочный ответ клеток на ЕСМ (Lora et al., 1998).

В мГК, характеризующейся усилением межклеточных и матриксных контактов, выявлена гиперэкспрессия мРНК Е-кадхерина и ß-катенина по сравнению с нормальной печенью (Рис. 2В). В 6ГК произошло значительное подавление экспрессии основного компонента щелевых

Рисунок 2. Утрата эпителиальной морфологии при прогрессии ГК. А. Окраска криостатных срезов мГК и 6ГК гематоксилин/эозином или антителами к коллагену IV типа, ZO-1 и Е-кадхерину. Б, В. Экспрессия генов, связанных с поддержанием эпителиальной морфологии. Б. Нозерн-блот гибридизация РНК из нормальной печени, независимо индуцированной медленнорастущей опухоли (мГК-1), мГК, 6ГК и культуры клеток ЮЗ с кДНК пробами к коннексину 32 (Сх32) и аЗ субъединице интегрина (Itgo3). Равенство количества РНК, нанесенной на форез, проверяли по окраске бромистым этидием (28S РНК). В. ОТ-ПЦР с праймерами к Е-кадхерину, ß-катенину и Snail. Для контроля равенства количества РНК, взятой в реакцию, приведены результаты ОТ-ПЦР с праймерами к HPRT. Здесь и далее «-»- реакция без добавления обратной транскриптазы - контроль на отсутствие в образце примесей к ДНК.

контактов печени Сх32 (Рис. 2Б) и Е-кадхерина (Рис. 2В). Уровень экспрессии партнера Е-кадхерина ß-катенина в мГК и 6ГК не отличается (Рис. 2В), однако иммунохимическая окраска выявила изменение мембранной локализации ß-катенина в мГК на цитоплазматическую в 6ГК. Значительное падение экспрессии Е-кадхерина в 6ГК является, вероятно, следствием гиперэкспрессии гена Snail (Рис. 2В), транскрипционного фактора, определяющего эпителиально-мезенхимальный переход и способного репрессировать промотор Е-кадхерина (Baffle et al., 2000; Cano et al., 2000).

Активация теломеразы при прогрессии ГК

Активность теломеразы является одним из ключевых событий неопластической трансформации, по крайней мере, в человеческих клетках, где она определяет приобретение неограниченного репликативного потенциала (Hann and Weinberg, 2002). Неоднократно показано, что активация теломеразы является важным прогностическим маркером ПС человека (Ideetal., 1996).

Активность теломеразного комплекса в нормальной печени и опухолевых образцах была исследована TRAP-методом (telomeric repeat amplification protocol). Мы установили, что

c-myc

mTERT

ODO

HPRT

л x ф

у Ьй Ь£ СО А I— L* Ю

С s \о X

л

X «

У ®

с

S

Ю

СО «

X

о

о

-Я ' ч>:' х ~ 5? '¿Щ

ifjfK"" - - , . ,, X. T ■ T*

«mw» ^¡^^¿»«Пфр?*;

Рисунок 3. Прогрессия ГК сопровождается индукцией теломеразной активности. А. Теломеразную активность определяли TRAP методом. К" - отрицательный контроль реакции без добавления клеточного экстракта, К t°C - реакция с инактивированным нагреванием экстрактом НЗЗ. Б. Электрофорез продуктов ОТ-ПЦР с праймерами к c-myc, mTERT, ODC и HPRT (контроль количества РНК).

прогрессия ГК сопровождается существенным повышением теломеразной активности в образцах 6ГК и НЗЗ, при полном отсутствии в мГК (Рис. ЗА). Таким образом, в исследуемой системе активность теломеразы отражает ход опухолевой прогрессии.

Активность теломеразного комплекса определяется экспрессией его субъединицы TERT (Bodnar et al., 1998). Совместно с О.АЛеремновой экспрессия гена TERT была выявлена методом ОТ-ПЦР в 6ГК и культуре клеток ЮЗ; в мГК и нормальной печени мыши продукты транскрипции этого гена не выявляются (Рис. ЗБ). Ключевым регулятором транскрипции TERT является онкоген c-myc (Lingner et al., 1997), гиперэкспрессия которого характерна для разных типов опухолей. Действительно, активация гена TERT при прогрессии происходит параллельно с гиперэкспрессией c-myc и его классической транскрипционной мишени - гена орнитин-декарбоксилазы (ODC) (Рис. ЗБ) (Cheremnova et al., 2001). По-видимому, именно активация с-тус могла стать причиной повышения теломеразной активности при прогрессии ГК.

Экспрессия гепато-специфических генов при прогрессии ГК

Снижение уровня дифференцировки наряду с сохранением способности к ре-дифференцировке является характерной особенностью прогрессии ГК. Для определения дифференцировочного статуса изучаемых опухолей мы исследовали уровни экспрессии гепато-специфических белков, а также опухолевого маркера АФП.

При сравнении уровней экспрессии около 60 генов, определяющих функционирование взрослой печени, в мГК, 6ГК, культуре клеток ЮЗ, нормальной печени взрослой мыши и независимо индуцированной высокодифференцированной ГК (мГК-1) методом ОТ-ПЦР оказалось, что дифференцированные опухоли мГК и мГК-1 по профилю ткане-специфической экспрессии чрезвычайно близки к нормальной печени. Наиболее значительное различие между нормальной печенью и мГК выражалось в существенной индукции онко-эмбрионального маркера АФП (Рис. 4).

Прогрессия ГК сопровождается координированной репрессией целого блока гепато-специфических генов: АФП, сывороточного альбумина (СА), транстиретина (I IP), альфа-1 антитрипсина (al-AT), аполипопротеинов (Аро) Al, A2I, А4, В, С2, СЗ, фенилаланин-гидроксилазы (РАН), белка, связывающего жирные кислоты L-типа (LFABP), печеночной пируват-киназы (L-PK), цитохрома Р450 ША (СурЗА), глюкокиназы (Glk), ретанол-связывающего белка (RBP), альдолазы В (AldB), HGF-подобного белка (HGFL), инсулинового ростового фактора (IGF)-l, фактора роста фибробластов (FGF)-l и ТФН (Рис. 4).

Профили экспрессии гепатоцитарных генов в культуре ЮЗ и ее опухолевом предшественнике 6ГК практически идентичны. Исключение составляют АФП и рецептор IGF1, экспрессия которых восстанавливается в культуральном варианте опухоли.

II ни

2 2 \0 С X I

Рисунок 4. Падение экспрессии гепато-специфических генов при прогрессии ГК. ОТ-ПЦР анализ уровней экспрессии мРНК в мГК-1 (дорожка 2), мГК (3, 4), 6ГК (5, 6), нормальной печени (7), культуре ЮЗ (8, 9) и Н№Г4-К1ае трансфицированном клоне (10). НРЯТ - контроль количества РНК, взятой в реакцию.

Таким образом, в ходе прогрессии в 6ГК произошло значительное подавление гепато-специфической экспрессии генов, соответствующее типичному для карцином антигенному упрощению опухолей (АЬе1еу, 1965). В то же время де-дифференцированный вариант несет отпечаток гепатоцитарного происхождения, сохраняя экспрессию ряда генов, специфичных для печени (ТФН и аполипопротеины).

Прогрессия ГК сопровождается подавлением экспрессии всех изоформ НИ¥4а Так как опухолевая прогрессия в исследуемой модели произошла очень быстро, мы предположили, что она может быть следствием нарушения работы одного (или нескольких) мастер-генов, определяющего дифференцировку гепатоцитов. Наиболее вероятными кандидатами на роль таких ключевых регуляторов представляются транскрипционные факторы

и, прежде всего, ГЯФ, играющие определяющую роль в установлении и поддержании гепатоцитарного фенотипа.

Мы предположили, что причиной по крайней мере некоторых фенотипических изменений, произошедших в ходе прогрессии, могло стать нарушение нормальной функции ядерного рецептора HNF4a, являющегося важным регулятором дифференцировки (Li et al., 2000) и морфогенеза печени (Spath and Weiss, 1998). Действительно, по сравнению с мГК, в 6ГК и ее клеточной культуре полностью подавлена экспрессия HNF4a (Рис. 5).

В настоящее время описано 8 изоформ HNF4a с различными транс-активационными свойствами. Варианты а1-аб транскрибируются с основного промотора Р1, а7 и а8 изоформы HNF4 отличаются от других вариантов N-концевой последовательностью, транслируемой с полностью отличающегося первого экзона ID (Nakhei et al., 1998). Транскрипция этих форм регулируется альтернативным промотором Р2, расположенным на расстоянии 45.5 т.п.н. к 5' концу от Р1 (Thomas et al., 2001). Эти формы экспрессируются в эмбриональной печени, Р-клетках поджелудочной железы и линиях де-дефференцированных гепатом m vitro (Nakhei et al., 1998), в то время как «zl-аб варианты преобладают во взрослой печени и дифференцированных культурах гепатом (Nakhei et al., 1998; Torres-Padilla et al., 2001). Активность Р1 и P2 промоторов регулируется разными механизмами, а соотношение в клетке двух групп изоформ (обозначены далее как al и <х7) может влиять на поддержание гепатоцитарного фенотипа в клетке.

Используя специфические праймеры к HNF4al или HNF4a7, мы установили, что изоформы HNF4al одинаково представлены в дифференцированных ГК и нормальной печени, и не экспрессируются в 6ГК и ЮЗ. Варианты HNF4a7 практически не выявляются в нормальной взрослой печени, их экспрессия значительно индуцирована в мГК и мГК-1, и подавлена в 6ГК и НЗЗ (Рис. 5).

Таким образом, на ранних этапах возникновения ГК в исследуемой модели произошла активация экспрессии изоформ HNF4a7, типичных для незрелых и дедифференцированных гепатоцитов, в то время как прогрессия ГК сопровождалась одновременным подавлением транскрипции всех вариантов HNF4a. Последнее наблюдение позволяет предположить существование прямой или косвенной взаимосвязи между активностью Р1 и Р2 промоторов.

Гепатоцитарные ядерные факторы в прогрессии ГК

Гепато-специфическая экспрессия генов и дифференцировочный статус печеночных клеток преимущественно контролируются комбинаторным действием пяти семейств ГЯФ. Эти факторы образуют регуляторную сеть, обеспечивающую четкую координацию различных печеночных

функций на уровне экспрессии генов. Основная часть данных о взаимной регуляции ГЛФ получена в исследованиях на нокаутных мышах и не всегда отражает ситуацию во взрослой печени.

Некоторые летераггурные данные указывают на то, что гепатоканцерогенез m vivo (Kalkuhl et al., 1996; Wang et al, 1998) и де-дифференцировка в культурах гепатомных клеток сопровождаются изменением экспрессии ряда транскрипционных факторов, специфических для печени: HNF1 и HNF4al экспрессируются в основном в дифференцированных культурах ПС, зато транскрипция vHNFl и HNF4a7 наблюдается в основном в де-дифференцированных гепатомных линиях (Cereghini et al., 1988; Nakhei et al., 1998). Более того, было показано, что HNF4al может индуцировать эпителиальный морфогенез и восстановление экспрессии некоторых гепатоцитарных генов в культуре де-дифференцированной гепатомы (Spath and Weiss, 1998). Тем не менее, ни в одном из опубликованных исследований не проводилось полного анализа гепато-специфической сети транскрипционных факторов на моделях гепатоканцерогенеза in vivo.

Для того чтобы восполнить этот пробел и получить более полную картину гепато-специфической регуляции транскрипции при гепатоканцерогенезе, мы провели сравнительное исследование уровней экспрессии ГЯФ и близких транскрипционных факторов в нормальной взрослой печени, мГК, мГК-1, 6ГК и культуре НЗЗ (Рис. 5).

л

É £ £ |ñ I X 3 «D С X

Л

i £ els

iss юсх

vHNFl

GATA4

GATA6

COUP-TFI

HNF3«

HNF3ß

C/HBPß

C/EBP5

COUP-TFII

i-и-1 i-1

1234S6789

Рисунок 5. Изменения в экспрессии генов, кодирующих транскрипционные факторы, при прогрессии ГК. ОТ-ПЦР анализ уровней экспрессии мРНК в мПС-1 (дорожка 2), мГК (3, 4), 6ГК (5, 6), нормальной печени (7) и культуре НЗЗ (8, 9). НРЯТ - контроль количества РНК, взятой в реакцию.

Профиль экспрессии, сходный с HNF4a, был выявлен для HNF6, который может активировать транскрипцию HNF4a и HNF3P (Samadani et al., 1996), фактора транскрипции фетопротеина (FTF) (Pare et al., 2001) и ядерного рецептора PXR, на ранних стадиях развития являющегося прямой транскрипционной мишенью HNF4a (Li et al., 2000). Эти гены экспрессируются в нормальной печени и дифференцированных ГК, но полностью репрессированы в 6ГК и ее клеточной культуре (Рис. 5). В 6ГК произошло также резкое падение экспрессии гена HNF1, прямой мишени HNF4a и наиболее распространенного активатора гепато-специфических промоторов (Tronche et al., 1997, Locker, 2002), vHNFl, необходимого для транскрипции HNF4a на ранних стадиях развития (Lee et al., 2000) и преобладающего в недифференцированных гепатоцитах (Cereghini, 1996), С/ЕВРа, характерного для покоящихся гепатоцитов (Rana et al., 1995), HNF3y, преобладающего во взрослой печени, и раннего энтодермального фактора GATA4, участвующего в формировании печени и регуляции генов на ранних стадиях эмбриогенеза. Необходимо отметить, что, хотя гены vHNFl и GATA4 существенно репрессированы в 6ГК, в культуре НЗЗ их экспрессия четко и воспроизводимо выявляется. Это свидетельствует о том, что эти гены испытывают заметное влияние клеточного микроокружения или цитокинов in vivo, но не in vitro.

По сравнению с нормальной печенью и мГК, в 6ГК отмечена значительная активация гена COUP-TFI. Сиротские ядерные рецепторы COUP-TF активируют транскрипцию гена vHNFl (Power, 1996), могут действовать как ко-факгоры HNF4a (Ktístáki and Talianidis, 1997) или конкурировать с HNF4a и другими ядерными рецепторами за общие сайты связывания в регуляторных районах генов. COUP-TF рассматриваются в основном как антагонисты HNF4a в регуляции транскрипции печеночных генов (Qiu et al., 1996). Важно отметить, что COUP-TFI -единственный из исследованных факторов, уровень транскрипции которого обратно коррелирует с экспрессией HNF4a и существенно повышается в ходе прогрессии ГК.

Экспрессия HNF3P критична для формирования зачатка печени на самых ранних этапах эмбрионального развития (Ang et al., 1994), этот фактор, вероятно, вовлечен в регуляцию генов HNF3a, HNF4a и HNF1 в висцеральной энтодерме (Duncan, 1998), но не во взрослой печени (Sund et al., 2000). В опухолевых образцах уровни мРНК HNF3P и его транскрипционной мишени HNF3a существенно не отличаются от уровня, детектируемого в нормальной печени. Это говорит о том, что прогрессия ГК и репрессия гена HNF4o не являются следствием утраты HNF3p. или -<jt. Аналогичный профиль экспрессии имеют С/ЕВРр, участвующий в контроле пролиферации гепатоцитов и вовлеченный в регенерацию печени (Greenbaum et al., 1998), С/ЕВР8 и COUP-TFE Так как активность белков С/ЕВР может модулироваться на пост-

транскрипционном уровне, полученной информации недостаточно, чтобы исключить их участие в гепатоканцерогенезе, но она позволяет исключить эти белки из числа возможных кандидатов на исходную причину прогрессии.

Таким образом, при прогрессии от мГК х 6ГК в исследуемой системе произошло координированное изменение уровней экспрессии ряда транскрипционных факторов, влияющих на установление и поддержание гепатоцитарного фенотипа: HNF4a, HNF1, vHNFl, HNF3y, HNF6, C/EBPa, FTF, GATA4, COUP-TF1 и PXR. Эти данные указывают на то, что наблюдавшаяся одноступенчатая прогрессия связана с нарушением контроля дифференцировки, который был вызван утратой целого блока ГЯФ с взаимосвязанной регуляцией.

Судя по результатам инактивации ГЯФ (Duncan et al, 1997; Ang et al., 1994; Barbacci et al., 1999), наиболее важными и специфическими регуляторами гепатоцитарной дифференцировки в ходе развития являются HNF4a, HNF30 и vHNFl. В то время как уровень мРНК HNF3P в ходе прогрессии не изменился, а подавленная в 6ГК транскрипция vHNFl сохранилась в культуре ЮЗ, транскрипция всех изоформ HNF4a в 6ГК подавлена полностью. Кроме того, список генов, экспрессия которых претерпела существенные изменения в ходе прогрессии, включает в себя значительное количество генов-мишеней HNF4a и HNF1. Исходя из этих соображений, мы предположили, что HNF4a является наиболее подходящим кандидатом на роль фактора, нарушение функции которого стало причиной по крайней мере некоторых фенотипических изменений, наблюдающихся при прогрессии ГК.

HNF4« HNF4a1 HNF4a7 Сх32 HPRT

Рисунок б. Восстановление уровней транскрипции генов при ре-экспрессии HNF4al в культуре клеток ЮЗ. ОТ-ГТЦР со специфическими праймерами к HNF4 (al и а7 изоформы), HNFla, HNF3y, HNF6, COUP-TFI, FTF и коннексину 32. k-Fl - контрольная культура, F1-1, -3 и -5 - клоны с максимальным уровнем экспрессии HNF4al-Flag. HPRT - контроль количества РНК, взятой в реакцию.

Ре-экспрессия HNF4al в культуре клеток 6ГК ведет к восстановлению транскрипции ряда гепато-специфических генов и установлению эпителиальной морфологии

Для проверки выдвинутой гипотезы мы проанализировали последствия ре-экспрессии HNF4a в культуре клеток 6ГК. Для этой цели была использована конструкция pCMV-HNF4-Flag, содержащая под контролем CMV промотора кДНК HNF4al крысы, несущую на С-конце Flag-эпитоп для иммунохимической идентификации экзогенного белка. Уровень экспрессии HNF4a в изолированных клонах проверяли методом ОТ-ПЦР с праймерами к С-концу HNF4 и последовательности Flag, и иммунохимическим окрашиванием энти-Flag антителами.

При иммунохимической окраске amn-Flag антителами было установлено, что во время первых недель культивирования происходит существенное уменьшение количества HNF4-FIag экспрессирующих клеток. Это наблюдение указывает на существование т vitro селекции в пользу клеток со сниженной экспрессией HNF4al.

Экспрессия HNF4-Flag привела к изменениям в экспрессии гепато-специфических генов (Рис. 4, дорожка 10 и Рис. 6). В сотрудничестве с ОЛ.Черемновой мы обнаружили четкую активацию гепато-специфических регуляторов HNF1, FTF, HNF6, HNF4a7 и HNF3y, подавление транскрипции COUP-TF1, индукцию уровней Аро Al, А4, В, al-AT, Сур7А и Сх32. Необходимо отметить, что отсутствие достоверной индукции некоторых других проанализированных генов могло быть связано с гетерогенностью популяции Н№4-трансфицированных клеток в отношении уровня экспрессии трансгена, вызванной селекцией in vitro.

Таким образом, ре-экспрессия HNF4al в культуре клеток 6ГК вызывает индукцию ряда гепато-специфических генов, в том числе транскрипционных факторов, метаболических ферментов и молекул клеточных контактов. Однако быстрая селекция in vitro против клеток, экспрессирующих HNF4al, сделала невозможным дальнейший анализ влияния этого белка на морфологические и пролиферативные свойства трансфицированных клеток, требующий продолжительного культивирования клеточных культур.

Эта проблема была частично решена трансфекцией в культуру ЮЗ экспрессирующего вектора pLEN4S-HNF4, определяющего невысокий уровень экспрессии HNF4al под контролем металлотионеинового промотора. Экзогенная экспрессия HNF4al и его функциональная активность были подтверждены методом ОТ-ПЦР с праймерами к HNF4al и транскрипционной мишени HNF1 соответственно (Рис. 7Б).

Совместно с Е.И.Кудрявцевой мы установили, что в большинстве H33-HNF4 клонов трансфекция привела к значительным изменениям клеточной морфологии. После нескольких недель культивирования клоны стали образовывать эпителиальные островки с плотными контактами, маркируемыми окраской антителами к ZO-1 (Рис. 7А). Е-кадхерин, ключевой

НЗЗ-Риго

НЗЗ-НИР4-2

с

о *

К-

О N

-аде** - V *•«'«*

1 2 3 4 5

НЫР4

НР!*Т

Рисунок 7. Восстановление эпителиальной морфологии при ре-экспрессии Н№4а1 в культуре клеток НЗЗ. А. Фазовый контраст и иммунохимическая окраска антителами к коллагену IV типа и 20-1 контрольной культуры НЗЗ-Риго И типичного клона НЗЗ-Н№4-2, трансфицированного вектором рЬЕК48-ШР4. Б. ОТ-ПЦР РНК из мГК( дорожка 1), 6ГК (2), контрольной культуры НЗЗ-Риго (3) и клона НЗЗ-Н?№4-2 (6 и 14 пассажи - дорожки 4 и 5 соответственно) с праймерами к НКР4а, №\Т1 и НРЯТ (контроль количества РНК).

компонент клеточной адгезии, на мембране таких эпителиальных островков не выявлялся, что указывает на то, что восстановление эпителиальной морфологии определяется механизмами, независимыми от Е-кадхерина. Необходимо отметить, что ни при культивировании, ни при клонировании исходной культуры ЮЗ или контрольных ЮЗ-Риго клонов островки с эпителиальной морфологией не возникали.

В эпителиальных островках НЭТ4-трансфицированных клонов наблюдалась характерная для культур эпителиальных клеток локализация компонентов ЕСМ. Фибриллы энтактина, фибронектина, ламинина и коллагена IV типа (Рис. 7А) располагались вдоль межклеточных контактов. Эти результаты указывают на то, что клетки, экспрессирукмцие Н№4а1, могут образовывать более сформированную базальную мембрану, чем клетки исходной культуры. Таким образом, восстановление эпителиального фенотипа сопровождается нормализацией контактов клеток с матриксом.

В соответствии с результатами, полученными в предыдущей серии экспериментов, мы наблюдали существенное снижение уровней мРНК НОТ4а1 и некоторых Н№4-респонсивных генов после продолжительного культивирования трансфицированных клонов (Рис. 7Б, дорожка 5). Кроме того, после двух месяцев культивирования ЮПЧ-трансфицированные клоны начинали терять эпителиальные свойства. Эти данные позволяют предположить существование взаимосвязи между гепато-специфической регуляторной сетью и механизмами, определяющими контроль клеточной пролиферации.

Таким образом, ре-экспрессия НЫР4а1 в культуре клеток 6ГК вызывает сдвиг в сторону эпителиальной морфологии, сопровождающийся восстановлением межклеточных контактов и контактов клеток с матриксом, и восстановление экспрессии некоторых печеночных генов. Эти наблюдения прямо указывают на ключевую роль ГЮТ4а в поддержании дифференцировочного статуса гепатоцитов и возможность частичной реверсии злокачественного фенотипа ГК путем ре-экспрессии НЫР4а1.

Регуляторный район 1ШГ4а1 в клетках 6ГК неактивен

При трансфекции культуры НЗЗ конструкцией, содержащей ген люциферазы под контролем 5' 7.4 т.п.н. регуляторного района НОТ4а1, активность репортерного гена не выявляется. Это говорит о том, что снижение экспрессии НЖ4а в 6ГК определяется на транскрипционном уровне, и не связано с мутацией, перестройкой или другим повреждением промотора или кодирующей части гена НОТ4а. Репрессия гена НШЧсс в 6ГК вызвана, вероятно, изменением уровня его транскрипционных регуляторов.

Экспрессия репортерного гена люциферазы под контролем фрагментов регуляторного района Н№4а1

я за &

Iм

л

Б

о го и

X

Й 15 я

| 10

24.06

3.88

~1ШГ

9.7

3

-1

-6800/+27 -1400/+27 -363/+27

•22В/+27 -34/+27

Рисунок 8. Анализ транскрипционной активности фрагментов регуляторного района 1ЮТ4а1 в культуре клеток ЮЗ. Снизу указаны фрагменты регуляторного района, определяющие экспрессию репортерного гена люциферазы. Результаты исследований нормализованы по активности ко-трансфицированного гена люциферазы ЯепШа гет/отпаз, относительную активность люциферазы светлячка в каждом случае определяли как отношение нормализованной интенсивности люминесцентного сигнала в образце к аналогичной величине в контрольных клетках, трансфицированных исходным вектором р2ХХ!С.

Для того чтобы определить, какой район регуляторного района НОТ4а1 определяет снижение уровня его экспрессии при прогрессии ГК, была проведена временная трансфекция культуры ЮЗ набором репортерных конструкций, содержащих ген люциферазы светлячка под контролем фрагментов регуляторного района Н№4а1 от -6.8 т.п.н. до +27 п.н, (Рис. 8).

Мы установили, что удаление участка от -6.8 т.п.н. до -1.4 т.п.н. не оказывает существенного влияния на активность репортерного гена. В то же время, обнаружено примерно 20-кратное повышение активности репортерного гена под контролем фрагмента -363 п.н./+27 п.н. регуляторного района НОТ4а1. Удаление участка -363 п.н./-228 п.н. ведет к снижению репортеряой активности. Эти данные указывают на существование в де-дифференцированном варианте ГК негативного регулятора транскрипции НОТ4а1, связывающегося с районом -1.4 т.п.н./-363 п.н., а также демонстрируют способность фрагмента -363 п.н /+27 п.н. активировать транафипцию Н№4а1 в культуре 6ГК при отсутствии репрессорных цис-элементов.

Таким образом, подавление транскрипции НМБ4а1 при одноступенчатой прогрессии от иГК к 6ГК могло стать следствием усиления действия репрессора, действующего на регуляторный район этого гена. Можно ожидать, что идентификация механизмов, ставших

причиной подавления экспрессии HNF4al в 6ГК, позволит выявить ключевые изменения сигнальных путей, ставшие причиной прогрессии ГК в исследуемой модели.

При прогрессии от мГК к 6ГК изменился уровень экспрессии целого ряда регуляторов гепатоцитарной дифференцировки. Прогрессия произошла скачкообразно на раннем пассаже, что дает основание предполагать, что ее причиной стало изменение в функционировании одного или немногих ключевых генов. Сведений о проанализированных факторах пока недостаточно для того, чтобы утверждать, что изменение в экспрессии одного из них является причиной всех остальных изменений. Однако кандидатами на эту роль в первую очередь являются регуляторы, изменившие уровень экспрессии в 6ГК и ЮЗ, первоначальный уровень транскрипции которых не восстановился после ре-экспрессии HNF4al в ЮЗ: ткане-специфические факторы C/EBFa, GATA4 и транскрипционные регуляторы Snail и с-тус.

ЗАКОНОМЕРНОСТИ ЭКСПРЕССИИ ГЕПАТО-СПЕЦИФИЧЕСКИХ ГЕНОВ В ГК МЫШИ РАЗНОГО УРОВНЯ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ

На следующем этапе работы мы решили проверить, какие из выявленных нами при анализе прогрессии ГК закономерностей экспрессии генов являются общими для процесса дифференцировки опухолей. Для этого нами была использована коллекция независимо индуцированных диэтилиитрозамином и фенобарбиталом перевиваемых ГК мышей, полученная в НИИ Канцерогенеза РОЩ РАМН.

Из этой коллекции было отобрано 12 опухолей, которые по скорости роста и уровню дифференцировки можно условно разделить на две группы: медленнорастущие высокодифференцированные ГК и быстрорастущие низкодифференцированные ГК. Эти опухоли были параллельно исследованы двумя методами: результаты гистологического анализа уровня дифференцировки ГК были сопоставлены с данными ОТ-ПЦР анализа уровней экспрессии печень-специфических генов и некоторых других вероятных эффекторов гепатоканцерогенеза.

Уровень дифференцировки ГК оценивали по гистологическим препаратам, описание которых проводили в сотрудничестве с B.C. Турусовым и О.В. Морозовой (Лаборатория канцерогенных веществ НИИ Канцерогенеза РОНЦ РАМН). Степень дифференцировки определялась следующими факторами: сохранилась ли в опухоли хотя бы частично балочная структура печени; состоит ли опухоль из клеток эпителиального типа; одинаковы ли клетки по размеру и плоидиости; каков пролиферативный статус опухолевых клеток; есть ли очаги некрозов; врастают ли в опухоль тяжи соединительной ткани. Результаты этой части работы суммированы в Табл. 1.

В исследуемую панель вошло 12 опухолей (в том числе описанные ранее мГК и 6ГК), пять из которых были описаны как дифференцированные, а семь - как недифференцированные ГК.

Таблица 1. Гистологическая характеристика независимо индуцированных ГК мышей.

№ в панели Название Гистологическое описание Скорость роста

2 BDF1 415 (мГК) Высокодифференцированная, медленнорастущая гепатокарцинома. 5-7 мес

3 F1 326 Первичный высокодифференцированный гепатоцеллюлярный рак печени с лимфоидным инфильтратом, рядом четко ограниченный участок некроза опухоли печени. 4-5 мес

4 DBF 235 ?3 Высокодифференцированная гепатоцеллюлярная опухоль с участками некроза. 3-4 мес

5 DBF 268 <?10 Высокодифференцированный гепатоцеллюлярный рак. Дольчатое строение, клетки различаются по размеру. Много митозов. 5-6 мес.

6 DBF $5 Высокодифференцированный гепатоцеллюлярный рак. Альвеолярно-солидная опухоль, состоит из клеток с обширной зернистой цитоплазмой. Ядра округлые, пузырьковидные, имеют от 1 до 4 ядрышек. Редкие митозы. Встречаются Купферовскис клетки. Структура не сохранена (нет долек и балок). Декомплексация клеток. 5-6 мес.

7 BDF1 674 (6ГК) Очень низкодифференцированный гепатоцеллюлярный рак. Полиморфная опухоль: мелкие клетки с малым количеством цитоплазмы и гиперхромным ядром, а также гигантские и многоядерные клетки. Много митозов и апоптотичсских телец. 2 недели

8 DBF 265 с?8 Низкодифференцированная опухоль. В жировой клетчатке узлы низкодифференцированной опухоли с большим количеством митозов, есть участки саркоматозного роста и тяжи соединительной ткани. 1 мес.

9 DBF 216 <515 Низкодифференцированная опухоль. В подкожной жировой клетчатке узлы низкодифференцированной опухоли, состоящей из темных круглых клеток, есть тяжи соединительной ткани. 2-3 мес.

10 D2 378 Низкодифференцированная опухоль. 2 мес.

И 371 <?14 Низкодифференцированная опухоль, состоящая из тесно лежащих клеток со светлым ядром, образующих железистоподобные комплексы и тяжи, а также множество структур, напоминающих протоки. Имеются крупные участки некроза и склероза. Печеночные структуры не обнаруживаются. Опухоль, возможно, эпителиального происхождения 3 мес.

12 Н36 DBF 684 Низкодифференцированный гепатоцеллюлярный рак. Опухоль солидного строения, состоит из ряда узлов, состоящих из клеток, преимущественно округлых, тесно лежащих, не образующих никаких структур, с ядрами округлой формы разного размера, то мелких темных, то более крупных с четкими зернышками хроматина, иногда гиперхромных. Цитоплазма эозинофильная, нередко вахуолизированая. 2-3 мес.

13 BDF 666 (асцит) Очень низкодифференцированный гепатоцеллюлярный рак. Резко выраженный полиморфизм, кроме мелких клеток с гиперхромными ядрами и многочисленных гигантских клеток, встречаются округлые и вытянутые клетки. Очень много митозов, мало апоптотических телец. Имеются очаги некроза. 2 мес.

Тотальная РНК из образцов опухолей и нормальной печени взрослой мыши (№1 в панели) была использована для анализа уровней экспрессии генов методом ОТ-ПЦР (совместно с О.А.Черемновой и Д.А. Флейшман).

Экспрессия гена СА, основного маркера дифференцированных гепатоцитов, выявляется в печени и в пяти медленнорастущих опухолях, которые при гистологическом анализе были признаны высокодифференцированными (Рис. 9А). Таким образом, гистологическая классификация подтверждается на уровне экспрессии генов.

HNF4a экспресеируегся только в печени и пяти высокодифференцированных опухолях. В семи недифференцированных быстрорастущих гепатомах экспрессия гена HNF4a не обнаружена. Таким образом, уровень дифференцировки ПС четко коррелирует с уровнем экспрессии гена HNF4a. Аналогичным образом экспрессируются взрослые изоформы HNF4al-a6 (Рис. 9А). Важно отметить, что во всех дифференцированных опухолях произошла индукция эмбриональных изоформ HNF4a7-о8, которые практически не экспрессируются во взрослой печени. В де-дифференцированных ПС наблюдалась одновременная утрата экспрессии всех изоформ HNF4a.

в дифф. ГК нэдифф. ГК

Sr

~1Г

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 111213

Л X

Ç дифф. ГК нвдифф. ГК

в__

С I-II-1

1 2 3 4 S в 7 8 9 10111213

Рисунок 9. Экспрессия гепато-специфическнх генов в опухолях различной степени дифференцировки. А. Гены, транскрипция которых строго коррелируют с уровнем дифференцировки и скоростью роста опухоли. Б. Гены, транскрипция которых нестрого коррелирует с уровнем дифференцировки, скоростью роста опухоли и экспрессией гена №*!Р4а. Электрофорез продуктов ОТ-ПЦР в агарозном геле. 1 - нормальная печень взрослой мыши; 2-13 - образцы ГК (см. табл. 1).

При сравнении уровней экспрессии других ГЯФ и некоторых генов, являющихся вероятными маркерами гепатоканцерогенеза, по характеру экспрессии в ГК разных уровней дифференцировки мы выделили три группы факторов:

11 Гены, экспрессия которых четко связана со степенью дифференпировки. скоростью роста опухолей и уровнем экспрессии НМ^а (в Табл. 2 выделены темно-серым цветом). К этой группе генов относятся НМР1, уН№1, НЫРЗу, С/ЕВРа, РТР и СА, которые транскрибируются в нормальной печени и дифференцированных опухолях, а также ген СОиР-ТИ, гиперэкспрсссирующийся в де-дефференцированных ГК (обратная корреляция с уровнем дифференцировки) (Рис. 9А). Вероятно, именно репрессия (или, в случае СОЦР-ТТС, активация) генов, входящих в эту группу, могут играть наиболее существенную роль в процессе де-дифференцировки при гепатоканцерогенезе. Полное совпадение паттернов экспрессии этой группы генов предполагает возможность кооперативной регуляции их экспрессии. Важно отметить, что большинство генов этой группы по результатам предыдущей серии экспериментов являются прямыми или опосредованными мишенями Н№4а.

2) Гены, активность которых нестрого связана с дифференцировочным статусом ГК: НОТб, С/ЕВРр, АФП, ОАТА4, РИП, Сх32, аЗ интегрин, БпаП, и Е-кадхерин (не более трех несовпадений, в Табл. 2 эти гены обозначены светло-серым цветом) (Рис. 9Б). Отсутствие экспрессии онко-эмбрионального маркера АФП в некоторых дедифференцированных ГК вероятно стало следствием репрессии транс-факторов, регулирующих транскрипцию АФП, и свидетельствует об их наибольшей злокачественности по сравнению с другими опухолями. По-видимому, гены этой группы могут быть вовлечены в развитие злокачественного фенотипа ГК, но не являются определяющими для этого процесса, а регуляция их экспрессии напрямую не связана с активностью ЬШР4а.

3) Геиы, -чкспрессирующиеся независимо от Н№4а и не коррелирующие с уровнем дифференцировки: НОТЗа, НОТЗр, вАТАб, СОЦР-ТИ1, с-шус и (3-катенин (Табл. 2). Экспрессия 1ЮТЗа и ЬЮТЗР сохраняется в части недифференцированных ГК, но, по-видимому, не является достаточной для сохранения гепато-специфического паттерна экспрессии и поддержания эпителиальной морфологии клеток. Повышение уровней экспрессии генов с-тус и (5-катенина во всех ГК по сравнению с нормальной печенью указывает на то, что их гиперэкспрессия является ранним событием гепатоканцерогенеза и не является непосредственной причиной де-дифференцировки клеток. Уровни транскрипции БАТАб и СОЦР-ТРП в ГК по сравнению с нормальной печенью не изменяются.

Таким образом, нами выявлена корреляция между морфологическими признаками дифференцировки ГК, экспрессией гепато-специфических маркеров и статусом гепатоцитарного

Таблица 2. Закономерности экспрессии генов в ГК разного уровня дифференцировки.

Гены, экспрессия которых по данным ОТ-ПЦР анализа четко коррелирует с уровнем дифференцировки опухоли, обозначены темно-серым цветом, частично коррелирующие - светло-серым. «+»- ген экспрессируется; «-»- ген неактивен; «+/-»- слабая экспрессия гена.

регулятора ШЧР4а. Важно отметить, что в группу генов, четко связанных с дифференцировочным статусом ГК, попали исключительно ткане-специфические регуляторы транскрипции. Между большинством из них просматриваются четкие регуляторные связи, центральную роль в этой регуляции играет Н№4а1. Единственный фактор этой группы, транскрипция которого, по всей видимости, не индуцируется Н№4а1 в культуре клеток 6ГК, С/ЕВРа, при прогрессии ПС репрессирован не полностью, и представляется маловероятным,

что критические изменения в дифференцировочной программе клетки могли быть вызваны колебанием уровня его экспрессии.

Итак, в этой части исследования на коллекции химически индуцированных ГК мышей независимого происхождения с различным уровнем дифференцировки нам удалось подтвердить основные закономерности ткане-специфической регуляции генов, выявленные ранее на экспериментальной модели одноступенчатой прогрессии. Эти данные указывают на существование зависимости между дифференцировочным статусом опухоли, ее эпителиальными характеристиками, скоростью роста и паттерном экспрессии ткане-специфических регуляторов транскрипции. В совокупности с полученными ранее результатами эти данные подтверждают важную роль ядерного рецептора HNF4al в поддержании дифференцировочного статуса опухолей печени.

ИЗУЧЕНИЕ МЕХАНИЗМОВ РЕГУЛЯЦИИ ГЕНА АФП В КЛОНАХ КРЫСИНОЙ

ГЕПАТОМЫ

Различия в уровне синтеза АФП определяются на транскрипционном уровне

Как подчеркивалось ранее, важнейшим маркером гепатоканцерогенеза, используемым в клинической практике, является онко-эмбриональный белок АФП. В то время как за последние годы был достигнут существенный прогресс в характеристике регуляторных цис-элементов, определяющих его экспрессию в различных системах, и идентифицировано значительное количество связывающихся с ними регуляторных факторов, причины активации этого гена в опухолях печени остаются неясными. Вероятнее всего, ре-экспрессия АФП в ГК вызывается изменениями в спектре экспрессии регулирующих его белков, и можно предполагать, что эти изменения специфичны для гепатоцитарных клеток.

Экспериментальной моделью для изучения механизмов регуляции гена АФП послужила коллекция клонов крысиной гепатомы McA-RH 7777, различающихся по АФП-фенотипу, полученная в лаборатории Иммунохимии НИИ Канцерогенеза РОНЦ РАМН Т.Л. Эрайзер (Eraiser and Khamzina, 1988). Нами были использованы наиболее стабильные АФП-продуцирующие (АФП4) и АФП-непродуцирующие (АФП") клоны, устойчиво сохраняющие АФП-фенотип в ряду поколений и различающиеся по уровню синтеза АФП примерно в 100-1000 раз.

Мы установили, что уровень экспрессии гена АФП коорелирует с полученными ранее результатами иммунохимической окраски клонов: во всех АФИ1" клонах экспрессируется один транскрипт АФП размером 2.1 т.н., в АФП" клонах соответствующая мРНК не выявляется. Таким образом, различия в АФП фенотипе исследуемых клонов определяются на транскрипционном уровне. В АФП1" и АФП" клонах не было выявлено различий в уровне

метилирования, а также крупных перестроек или делеций регуляторных или кодирующих районов гена АФП. Экспрессия гена АФП в АФГГ клопах может быть индуцирована при воздействии ретиноевой кислотой, что свидетельствует о том, что репрессия гена АФП в этих клонах обратима и определяется транс-действующими механизмами (Варга и др., 1999).

Разработка нового метода трансфекции эукариотических клеток

При трансфекции клеток крысиной гепатомы McA-RH 7777 стандартные методы не позволяют достичь достаточной эффективности трансфекции. Для решения стоявших перед нами задач был разработан новый метод трансфекции, основанный на диффузии макромолекул через поры, временно возникающие в плазматической мембране клетки при механической деформации. Воздействие механического давления было дополнено осмотическим шоком, использовавшимся ранее для введения в клетки белков (Okada et al., 1982; Lieber et al., 1987).

Суть нового метода заключается в том, что покровные стекла с культивируемыми на них клетками помещают клетками вниз в раствор, содержащий ДНК, и поочередно надавливают в нескольких местах на покровное стекло загнутой вниз стерильной стальной иглой. При необходимости обратимость деформации клеток контролируют под инвертированным микроскопом в стерильных условиях. Оптимальное количество точек давления составляет 20-30 на покровное стекло.

Эффективность временной трансфекции при использовании предлагаемого метода составила 0.5-1.5x10"', при стабильной трансформации эта величина достигала 2х10'2. Метод применим для различных типов клеток и, хотя требует отработки условий давления дня определенных клеточных линий, может быть успешно использован для трансфекции клеток, на которых стандартные методы позволяют достичь крайне низкой эффективности, а также для введения в эукариотические клетки антител и других белков (Эрайзер и Лазаревич, 1996).

Анализ экспрессии репортерных генов под контролем регуляторных элементов гена АФП в АФГ? иАФТГ клонах

Разработанный нами метод трансфекции позволил провести трансфекционный анализ клонов с различным уровнем экспрессии гена АФП с помощью генно-инженерных конструкций, содержащих репортерные гены под контролем 7 т.п.н. 5'-регуляторного района АФП.

Мы установили, что в 12 клонах с разным АФП-фенотипом экспрессия репортерного гена хлорамфеникол-ацетилтрансферазы (CAT) строго коррелирует с уровнем транскрипции гена АФП. Методом гистоблотинга и дот-блот гибридизации было показано, что репортерный ген под контролем полного регуляторного района АФП транскрибируется только в АФП+ и не выявляется в АФП" клонах (Лазаревич и др., 1995). Эти данные подтвердили предположение о том, что различные уровни экспрессии гена АФП в исследуемых клонах определяется

различным набором транскрипционных факторов, связывающихся с 7-килобазным 5'-регуляторным районом гена.

Экспрессия гепато-специфических белков в АФП* и АФ1Г клонах

Для дальнейших исследований были выбраны наиболее контрастные и стабильные по синтезу АФП клон 921 (АФГГ) и клоны 7Е10, 7Е7 и 1-16 (АФГГ). АФП+ и АФП- клоны отличаются также по уровню экспрессии ряда ГЯФ: в клоне 921 выявляются высокие уровни экспрессии HNF1 и HNF4a, а в АФП- клонах мРНК этих генов практически не выявляется (Варга и др., 1999). Иммунохимическими методами было показано, что HNF1 и HNF4a локализуются в ядрах АФП+ клеток (Кустова и др., 2001).

Различия между АФП1" и АФП" клонами по уровню экспрессии ключевых гепато-специфических регуляторов транскрипции не могли не сказаться на транскрипции функциональных печеночных генов.

АФП относится к семейству альбуминовых генов наряду с генами СА, альфа-альбумина (а-АЛБ) и витамин Д связывающего белка (ДСБ), экспрессирукяцимися во взрослой печени. Альбуминовые гены тандемно расположены на одной хромосоме, что, вероятно, связано с существованием механизмов их координированной регуляции. Регуляторные элементы этих генов гомологичны, их транскрипция существенно зависит от ГЯФ. Факторы HNF1 способны связываться с промоторами всех четырех генов, сайты HNF3 и С/ЕВР описаны в регуляторных районах АФП и СА. Наиболее вероятными «координаторами» экспрессии альбуминовых генов представляются факторы семейства HNF1 (Лазаревич, 2000).

В клонах крысиной гепатомы транскрипция альбуминовых генов происходит координировано (Рис. 10, дорожки 2-5, 12): гены СА, а-АЛБ и ДСБ экспрессируются в АФП+ клоне, хотя уровни мРНК СА и а-АЛБ существенно снижены по сравнению со взрослой печенью. В АФП" клонах, за исключением клона 1-16, в котором наблюдается низкий уровень экспрессии а-АЛБ и ДСБ, гены семейства альбумина не экспрессируются.

Таким образом, в исследуемой системе регуляция альбуминовых генов осуществляется по «эмбриональной» схеме: экспрессия АФП и СА происходит одновременно, причем уровень транскрипции гена АФП существенно преобладает. Подобная схема регуляции описана для ряда других относительно дифференцированных гепатом и обычно совпадает с сохранением экспрессии ГЯФ (Torres-Padilla et al., 2001).

В параллельных экспериментах были исследованы уровни транскрипции других маркеров гепатоцитарной дифференцировки. Оказалось, что, в отличие от АФГГ, АФП4" клоны экспрессируют ТТР, L-PK, L-FABP, ApoCl, АроЕ, РАН, ШН, и RBP. В то же время, в АФП" клонах повышены уровни экспрессии IGF1 и HGFL.

л

tc: ф соматические ? < гибриды с

+ с

1 2 3 4 5 6 7 8 9 101112

ДСБ

(3-актин

ТТР

АФП

схАЛБ

СА

Рисунок 10. Экспрессия гепато-специфических генов в клонах крысиной гепатомы и ее соматических гибридах. Электрофорез продуктов ОТ-ПЦР со специфическими праймерами. 1 - негативный контроль обратной транскрипции без добавления фермента; 2 - 7Е7; 3 - 1-16, 4 -7Е10; 5 - АФГГ клон 9-21; 6 - 9-21х7Е10; 7 -9-21x1-16; 8 - 7Е10х1-1б; 9 - 9-21х7Е7; 10 -7Е10х7Е7; 11 - 7Е7х7Е7; 12 - нормальная печень взрослой крысы.

Наиболее существенные различия уровня экспрессии выявлены для генов, прямо или косвенно (через Н№1) регулируемых Н№4а. Большинство этих генов изменило свою экспрессию в ходе прогрессии ПС мышей. Таким образом, несмотря на важные отличия этих экспериментальных систем, в них прослеживается четко выраженное сходство - изменение экспрессии целого блока ткане-специфических регуляторов транскрипции и ассоциированное с ним падение уровня транскрипции дифференцировочных маркеров печени.

В то же время, в АФП" клонах идентифицирован белок А2/3, синтез которого обратно коррелирует с уровнем АФП. Антитела к этому белку были получены в ходе гибридомного анализа клеточных клонов, контрастных по продукции АФП, его синтез в гепатомах антагонистичен экспрессии АФП (Эрайзер и др., 1996). А2/3 относится к белкам клеточного стресса и индуцируется солями тяжелых металлов (Ета1зег е* а!., 1998).

Уникальность описанной системы заключается в том, что клоны общего происхождения с разным АФП-фенотипом отличаются, по-видимому, по минимальному набору транскрипционных факторов.

Сравнение спектров экспрессии транскрипционных факторов в АФП* и АФГГ клонах По литературным данным, большинство ГЯФ имеет сайты связывания в регуляторных элементах гена АФП и прямо или косвенно участвует в регуляции его экспрессии (Лазаревич, 2000). Поскольку АФП-фенотип в исследуемой системе определяется на транскрипционном уровне, был проведен подробный анализ спектра экспрессии транскрипционных факторов, определяющих регуляцию гепато-специфических генов, в АФП4 и АФП" клонах методом ОТ-ПЦР (Рис. 11, дорожки 2-5, 12).

> + л

с с *

0 9 соматические »

— < < гибриды |

- %

г

г

п

1 2 3 4 5 6 7 8 9 101112

ф соматические о < гибриды Ф

I-1 )-1

1234 56769 10 1112

ß-актин ' HNF1 HMF3y HNF4a

HNF4a7 щ^щ; HNF4a1

С/ЕВРа

Рисунок 11. Экспрессия генов транскрипционных факторов печени в клонах крысиной гепатомы и ее соматических гибридах. Электрофорез продуктов ОТ-ПЦР со специфическими праймерами. Порядок нанесения образцов - как на Рис. 13.

Мы установили, что в клонах крысиной гепатомы экспрессия генов, кодирующих HNF4a и регулируемые им факторы HNF1, HNF3y и HNF6, строго коррелирует с АФП* фенотипом. Использование специфических праймеров к двум группам изоформ HNF4a показало, что в клоне 921 активны оба промотора HNF4a, в то время как в АФП" клонах подавлена экспрессия всех вариантов HNF4a.

Другая группа транскрипционных факторов, включающая C/EBPa, vHNFl, HNF3a, FTF и COUP-TFII, экспрессируется в клонах 921 (АФП4) и 1-16 (АФП). Уровни экспрессии С/ЕВРа и vHNFl в клонах 921 и 1-16 по данным полуколичественного метода ОТ-ПЦР совпадают. Уровни транскрипции HNF3a, COUP-TFII и FTF в клоне 921 значительно выше, чем в клоне 1-16. В клонах 7Е10 и 7Е7 транскрипция всех этих факторов подавлена. То, что экспрессия факторов этой группы в клоне 1-16 недостаточна для транскрипционной активности гена АФП, указывает на то, что перечисленные факторы не играют определяющей роли в регуляции экспрессии гена АФП.

Уровень экспрессии ядерного рецептора COUP-TFI в АФП" клонах выше, чем в клоне 921. Во взрослой печени экспрессия этого фактора использованным методом не регистрируется.

Таким образом, анализ экспрессии ткане-специфических транскрипционных факторов в клонах гепатомы показал, что изменение АФП фенотипа ассоциировано с различиями в уровне экспрессии целой группы ГЯФ, важнейшим из которых представляется HNF4a. Другая группа генов (C/EBPa, vHNFl, HNF3a, FTF и COUP-TFII,) тоже, вероятно, регулируется координировано, но не является критической для экспрессии гена АФП.

Получение соматических гибридов АФП* и А ФЛ клонов

Практически все описанные к настоящему времени гепато-специфические транскрипционные факторы, способные влиять на экспрессию гена АФП, - активаторы транскрипции. По нашему мнению, предложенные к настоящему времени модели регуляции гена АФП не объясняют высокую стадие- и ткане-специфичность его репрессии. Это предполагает возможность существования механизмов негативной регуляции гена во взрослой печени. Для того чтобы выяснить, какие регуляторные механизмы, негативные или позитивные, определяют экспрессию АФП в этой системе, совместно с И.Ф. Кустовой нами были получены соматические гибриды клонов гепатомы с различным АФП-фенотипом (Кустова и др., 2001). Метод соматической гибридизации позволяет выяснить, фенотип какой из гибридизуемых линий наследуется гибридами, то есть активирующий или подавляющий механизм регуляции гена является преобладающим.

Исходные клоны, использованные для гибридизации, были трансфицированы векторами, несущими гены устойчивости к разным антибиотикам, и ген флуоресцирующего белка ОБР. После трансформации клетки использовали для слияния. Схема эксперимента представлена на Рис. 12.

После слияния клетки подвергали двойной селекции. Прошедшими двойную селекцию считали гибриды, в которых после селекции насчитывалось не менее 100 клонов. Дальнейшие исследования проводили на смешанной популяции гибридных клеток: этим сглаживался эффект

921 АФП-

7Е10. 7Е7.1-16 АФП-

рРЭЗ-Нудго/ рВаЬе-Риго

АФП+

N00+

вРР+

АФП-Нудго+/ Риго+

гибридизация и селекция в418+Нудго/Риго

АФП ?

Ыео+

Нудго+/Риго+ 6РР+

Рисунок 15. Схема соматической гибридизации

случайного встраивания ретровирусного вектора в геном и возможной потери хромосом в отдельных клетках В результате слияния было получено шесть соматических гибридов. Три из них образованы АФП* и АФ1Г клонами (921х7Е10, 921x1-16 и 921х7Е7). Три других гибрида, полученные при слиянии двух отрицательных клонов, были использованы для контроля стабильности АФП-фенотипа в соматических гибридах (7Е10х1-16, 7Е10х7Е7 и 7Е7х7Е7).

Экспрессия АФПк других альбуминовых генов в соматических гибридах подавлена При иммуногистохимическом окрашивании во всех гибридных культурах белок АФП не определялся. Флуоресцирующий белок СНГ, которым был маркирован АФГТ клон, выявлялся во всех АФП'хАФГГ гибридах, что свидетельствует о присутствии в гибридах генома АФГТ клеток (Рис. 13). Таким образом, клетки, прошедшие двойную селекцию, действительно являются соматическими гибридами слитых клонов, изначально маркированных генами устойчивости к различным антибиотикам и белком СгРР.

Методами Нозерн-блот гибридизации и ОТ-ПЦР ни в одном из гибридов не было обнаружено продуктов транскрипции гена АФП (Рис. 10, дорожки 6-11). Параллельно с АФП в гибридах произошло подавление транскрипции родственных генов С А, а-АЛБ, ДСБ, а также дифференцировочного маркера ТТР. Таким образом, результаты иммунохимического окрашивания,

921 вРР-Ыео

7Е10-Нудго

921 ЭРР-Ыео х 7Е10-Нудго

Рисунок 13. Подавление синтеза АФП в соматических гибридах АФП* и АФП" клонов. Иммуногисгохимический анализ исходных клонов и соматических гибридов. Флюоресценция белка вРР, маркирующего АФП* клон и непрямая иммунопероксидазная окраска антителами к АФП крысы.

Нозерн-блот гибридизации и ОТ-ПЦР однозначно указывают на то, что в соматических гибридах происходит репрессия гена АФП и других альбуминовых генов.

Видимо, наблюдаемое подавление экспрессии гена АФП происходит за счет наличия в АФП" клонах некого негативного транскрипционного фактора (или факторов), которого нет в клетках клона 921. Этот предполагаемый фактор может связываться с регуляторпым районом гена АФП, или действовать опосредовано, подавляя экспрессию ключевого активатора гена АФП.

Закономерности экспрессии транскрипционных факторов в соматических гибридах

Спектры экспрессии основных печень-специфических транскрипционных факторов в исходных клонах и соматических гибридах были исследованы методом ОТ-ПЦР (Рис. 11, дорожки 6-11). По характеру экспрессии эти факторы можно разделить на четыре группы.

1. Как было отмечено ранее, гены Н№1, Н№37, Н№6, НЫР4а1 и -а7 экспрессируются только в АФГГ клоне 921. Во всех соматических гибридах, как и в АФП" клонах, экспрессия этих факторов подавлена. В гибридах клонов 921 и 1-16, экспрессирующнх С/ЕВРа, продукты транскрипции этого гена не выявляются.

Таким образом, для этой группы факторов характерно полное подавление экспрессии в соматических гибридах, что позволяет предположить существование механизма координированной репрессии их транскрипции.

2. Экспрессия уН№1, НОТЗа и ПТ, которые в некоторых экспериментальных системах могут участвовать в регуляции гена НОТ4а, выявляется в клонах 921 и 1-16, а также в гибридах клона 1-16. Таким образом, экспрессия факторов этой группы недостаточна для активации гена АФП. СОЦР-ТИ экспрессируется во взрослой печени, клонах 921 и 1-16 и большинстве соматических гибридов. Факторы этой группы имеют небольшие различия по экспрессии в соматических гибридах, и, по-видимому, не имеют существенного значения для регуляции транскрипции гена АФП и факторов первой группы.

3. Ядерный рецептор СОЦР-ТИ - единственный из транскрипционных факторов, уровень транскрипции которого в исходных клонах обратно коррелирует с активностью гена АФП. В регуляторных элементах АФП описаны функциональные сайты связывания ядерных рецепторов, с которыми может взаимодействовать СОЦР-ТП. Этот факт позволяет рассматривать СОЦР-ПЧ как возможный негативный регулятор транскрипции АФП. Однако то, что в соматических гибридах экспрессия этого гена снижается параллельно с репрессией АФП, а также отсутствие СОЦР-ТИ в нормальной печени, где ген АФП не активен, указывают на то, что этот фактор не является негативным регулятором, определяющим полную репрессию АФП.

4. Остальные исследованные факторы не имеют общих закономерностей в характере экспрессии. Уровни их транскрипции в исходных клонах, соматических гибридах и нормальной

печени существенно не различаются (HNF3P, С/ЕВРР и GATA4), либо не связаны с АФП-фенотипом (GATA6).

Таким образом, при соматической гибридизации АФП4" и АФГГ клонов происходит подавление экспрессии гена АФП, что указывает на существование в АФГГ клонах механизма репрессии этого гена. Такая репрессия может осуществляться как за счет наличия в АФГГ клонах негативного регулятора транскрипции АФП, так и за счет существования механизма подавления экспрессии активационных факторов, к которым прежде всего относятся ГЯФ. Анализ закономерностей экспрессии ГЯФ в клонах крысиной гепатомы и их соматических гибридах позволил выявить группу генов, экспрессия которых четко коррелирует с АФП-фенотипом исходных клонов и репрессируется в соматических гибридах параллельно с подавлением транскрипции кластера альбуминовых генов. Эта группа генов включает HNF1, HNF3y, HNF4a и HNF6. Литературные данные и результаты, полученные нами при исследовании регуляторных взаимосвязей гепатоцитарных факторов в ГК мышей, указывают на то, что именно экспрессия взрослых изоформ HNF4a может определять уровни транскрипции других генов этой группы.

Экзогенная экспрессия HNF4a и HNF1 в АФ1Г клонах крысиной гепатомы

Для того, чтобы проверить, какую роль играют эмбриональные и взрослые формы HNF4a в экспрессии ГЯФ и других гепатоцитарных генов в клонах крысиной гепатомы, совместно с И.Ф.Кустовой мы провели трансфекцию АФГГ клона 7Е10 векторами, экспрессирующими под контролем CMV промотора кДНК HNF4al или HNF4a7 крысы, несущие на С-конце Flag эпитоп для иммунохимической идентификации экзогенного белка.

Уровень экспрессии экзогенного HNF4a в отдельных клонах проверяли методом ОТ-ПЦР с праймерами, специфическими к С-концу HNF4a и последовательности Flag, а также иммунохимическим окрашиванием знти-Flag антителами (Рис. 14А). Во всех 7E10-HNF4alFlag клонах экзогенный HNF4a выявлялся в ядрах клеток, при этом доля окрашенных клеток варьировала от 95 до 30 процентов. В НЫР4а7-трансформированных клетках наблюдалось существенное замедление роста клеток по сравнению с 7E10-HNF4alFlag клонами и контрольной культурой, напоминающее описанную выше селекцию против HNF4-экспрессирующих клеток в культуре ЮЗ. В таких клетках достоверной ядерной окраски не обнаруживалось, хотя методом ОТ-ПЦР с праймерами к С-концу HNF4a и последовательности Flag регистрировалась низкая, но достоверная экспрессия трансгена. Для анализа уровней экспрессии генов методом ОТ-ПЦР бьшо отобрано по 3 варианта трансфицированных клонов с максимальным уровнем экспрессии трансгена и количеством Flag-позитивных клеток (Рис. 14Б).

Мы установили, что экзогенная экспрессия Н№4а1 приводит к активации экспрессии транс-факторов Н№1, Н№Ча7 и восстановлению транскрипции гена АФП. Транскрипция других альбуминовых генов в исследуемой системе не зависит от НЭДЧа.

Экспрессия Н№4а7-Р^ происходит на существенно более низком уровне и вызывает менее выраженную индукцию экспрессии ГОЛ7!, некоторое повышение уровня но не

достаточна для ре-экспрессии гена АФП. Это может быть связано как с отбором в пользу НОТЗс^-неэкспрессирующих клеток, так и с различием активационных свойств двух типов изоформ, различающихся по М-концевой последовательности.

Рисунок 14. Влияние экзогенной экспрессии Н№4а1, Н1\Т4а7 (А, Б), ШШ и уН1Ш (В) в АФП" клоне крысиной гепатомы 7Е10 на транскрипцию гепато-специфических генов.

7Е10

7Е10-НЫР4а1-Р1ад

A. Окраска контрольной культуры 7Е10-Риго (К-) и клона 7Е10-Н№4а1-1^-3 антителами к Р1а§-эпитопу. Б, В. Электрофорез продуктов ОТ-ПЦР в агарозном геле. Б. 1 - АФП* клон 921; 2 -АФП" клон 7Е10-Риго; 3-5 - 7Е10-НТ\Т4а1-Иа8 клоны 2, 3, 8 соответственно; 6-8 - 7Е10-ЮТ4а7-Г^ клоны 2, 4, 6 соответственно; 9 -негативный контроль обратной транскрипции.

B. 1 - АФП* клон 921; 2 - АФП" клон 7Е10-№о; 34 - 7Е10-уН№1 клоны 2 и 1 соответственно; 5-6 - 7Е10-НРП?1 клоны 1 и 3 соответственно; 7 - негативный контроль обратной транскрипции.

+ .

§ § уН№1 Н№1 -

< < I—

1

II

4 5

1

Способность Н№4о1 активировать транскрипцию гена АФП указывает на то, что в АФП-клоне 7Е10 нет прямого репрессора транскрипции АФП, и наблюдавшееся в соматических гибридах подавление экспрессии этого гена является следствием непрямой негативной регуляции. Вероятно, в АФП" клонах экспрессируется прямой или опосредованный репрессор гена Н№4а1, который, в свою очередь, необходим для экспрессии регулируемых им генов НОТЛ, 1ЮТ4а7 и АФП. НЫР4а1-зависимая активация АФП может происходить как за счет прямого связывания Н№4а с 011-1 сайтами в регуляторном районе АФП, так и за счет активации белков семейства Н№1, способных регулировать транскрипцию всех альбуминовых генов.

Для проверки последнего предположения совместно с ДА Овчинниковым была проведена трансфекция клопа 7Е10 векторами, экспрессирующими кДНК Н№1 или уНЫИ крысы. После селекции и клонирования было отобрано по два клона, экспрессирующих НОТ! или уН№1 .

Методом ОТ-ПЦР мы установили, что экспрессия НОТ!, но не уШЛ"!, достаточна для активации транскрипции а7 изоформы Н№4 (Рис. 14В). Это согласуется с данными о том, что в Р2 промоторе Н№4а, определяющем транскрипцию эмбриональных изоформ, содержится функциональный сайт связывания Ш№1, а также указывает на то, что активация НЫР4а7 при экзогенной экспрессии НИРЧа! опосредована ШчФ1. Экспрессия активирует

транскрипцию гена ЬЮТ1 (но не наоборот), однако на уровне, недостаточном для активации последним Р2 промотора Н№4а.

В клонах 7Е10-НГО1 зарегистрировано повышение уровня экспрессии а1 изоформы Н№4, однако этой индукции не достаточно для ре-экспрессии гена АФП. Это согласуется с полученными нами ранее результатами по индукции гепато-специфической экспрессии в АФП" клонах ретиноевой кислотой: значительное повышение синтеза Н№1 во всех обработанных клетках недостаточно для активации гена АФП (Варга и др., 1996). Таким образом, Н№4-зависимая ре-экспрессия гена АФП, выявленная в предыдущей серии экспериментов, не опосредована факторами семейства Н№1, а является, по всей видимости, результатом прямой активации регуляторных элементов АФП Н№4а1.

Обобщив результаты исследований, проведенных на клонах крысиной гепатомы с различным АФП-фенотипом, мы пришли к следующему заключению: подавление экспрессии АФП в АФП" клонах связано с наличием в них механизма негативной регуляции транскрипции АФП. По всей видимости, негативный регулятор действует не непосредственно на ген АФП, а подавляет экспрессию НОТ4а1, отсутствие которого определяет отсутствие транскрипции АФП, Ю4Р1, НМБ4а7 и, возможно, других факторов, имеющих сходные профили экспрессии.

Закономерности экспрессии транскрипционных факторов и других гепато-специфических генов, описанные в этой части работы, во многом сходны с данными, полученными при

исследовании ГК мышей. Фактор HNF4al является важным звеном ткане-специфической регуляции в опухолевых клетках печени, его транскрипция характерна для более дифференцированных клеток, а экзогенная экспрессия этого фактора в клетках, утративших значительную часть гепато-специфических функций, ведет к повышению уровня дифференцировки и активации транскрипции ряда регуляторных факторов и функциональных печеночных генов. В то же время, механизмы подавления экспрессии HNF4al при де-дифференцировке остаются невыясненными. Учитывая эти соображения, изучение механизмов влияния HNF4al на дифференцировочный статус гепатоцитов и поиск возможного репрессора его транскрипции могут иметь важное значение для понимания механизмов гепатоканцерогеиеза.

АНАЛИЗ СПЕКТРОВ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ В ГК МЫШЕЙ И КРЫС МЕТОДОМ ГИБРИДИЗАЦИИ С кДНК МИКРОЧИПАМИ

Для дальнейшего поиска генов, задействованных в прогрессии ГК и подавлении экспрессии гена HNF4a, в сотрудничестве с исследователями Медицинского колледжа имени Альберта Эйнштейна, Нью-Йорк, США был использован высокоэффективный метод изучения спектров генной экспрессии - гибридизация с кДНК микрочипами, который позволяет проводить одновременный анализ уровней транскрипции нескольких тысяч генов в исследуемых образцах.

В этой части исследования была проведена гибридизация кДНК, полученной из образцов нормальной печени взрослых мышей, мГК, 6ГК, культуры клеток ЮЗ и их производных с серийно напечатанными на стеклянном носителе кДНК микрочипами на 9000 генов мыши, изготовленными в Медицинском колледже им. А. Эйнштейна. В ходе каждого эксперимента проводилась одновременная гибридизация с двумя типами меченых проб - образцом одной из опухолей (опытная проба, красная флуоресценция) и образцом нормальной печени, общим для всех гибридизаций и используемым для нормализации результатов (контрольная проба, зеленая флуоресценция). Для сравнения результатов независимых гибридизаций проводили нормализацию полученных данных относительно общей контрольной пробы (нормальная печень). Последовательности считали дифференциально экспрессирующимися, если соотношения нормализованных результатов эксперимента для двух опытных образцов различались более чем в два раза. Проведенный таким образом анализ позволил идентифицировать несколько групп дифференциально экспрессирующихся генов.

Гены, дифференциально экспрессирующиеся при прогрессии ГК

При анализе результатов гибридизации образцов мГК и 6ГК с кДНК микрочипами на 9000 генов мыши было выявлено 250 генов, экспрессия которых повышается при прогрессии

более чем в 2 раза (бГК/мГК>2). В Таблице 3 представлено 30 генов с более чем 4-кратным уровнем индукции. Они кодируют транскрипционные факторы; белки, участвующие в передаче сигнала или контролирующие пролиферацию; метаболические фермешы; транспортные и адгезионные молекулы, а также ряд неохарактеризованных пока последовательностей кДНК (ЕБТз). Изменения экспрессии некоторых генов этой группы описаны ранее при развитии других типов опухолей: так, например, гиперэкспрессия фибронектина является частым событием в опухолях простаты. 5 из 25 генов представленных генов с максимальным уровнем активации оказались ТСР-Р-индуцируемыми, что указывает на вовлеченность сигнального пути, регулируемого факторами этого семейства, в прогрессию опухолей печени.

Гены, максимально активированные при прогрессии ГК

Таблица 3. Гены, максимально активированные при прогрессии ГК. Здссь и далее ТФ -транскрипционный фактор, ЕБТэ - неохарактеризованная экспрсссируемая последовательность кДНК (здесь и далее скобках приведен номер в геномном банке). Звездочкой отмечены ТйГ-р респонсивные гены. Пояснения в тексте.

Одновременно было установлено, что при прогрессии ПС существенно снижается экспрессия 380 генов, причем 110 из них - более чем в 5 раз. В Таблице 4 приведены первые 30 генов из этого списка. Последовательности, перечисленные в Таблице 4, отражают некоторые общие закономерности регуляции генной экспрессии при развитии злокачественного фенотипа опухолей печени. Более половины наиболее значительно репрессированных генов кодирует сывороточные белки, синтезируемые в печени, существенную часть из них составляют ингибиторы протеиназ. Эти изменения отражают процесс координированной утраты гепато-специфических функций при прогрессии ПС. Приведенные данные позволяют предположить, что именно активация протеиназ в отсутствие их ингибиторов могла привести к нарушению морфологии и повышению инвазивности быстрорастущей опухоли. Данные о подавлении экспрессии ряда сывороточных белков, например ТТР и АроС2, полученные ранее методом ОТ-ПЦР, согласуются с результатами гибридизации с микрочипами, что является дополнительным подтверждением ее специфичности.

Гены, максимально репрессированные при прогрессии ГК

Ингибитор трипсин» а, НЗ цепь

408.8 308.4

Сывороточный балок

В-фибриноген

Сывороточный балок

а2ниакрогпобуяин

280.3

Сывороточный белок

Кининоген

Фактор крагуляцмнТГ

177.7

Сывороточный балок

Сывороточный Сопок"

1717

Р-компонент амилоида

Ингибитор плазмина а2

85.5

Сывороточный балок

Сывороточный балоТ

82.7

аД-иикро глобулин

69.6

Сывороточный балок

Сывороточный белок"

Тряистиретин

43.5

^фибриноген

38.1

Сывороточный белок

к С

35.5

Сывороточный белок

■РВР1

35.1

Сывороточный белок

Ингибитор трипсина а. Н2 цепь

34.6

Сывороточный белок

Фактор комплемента В

34.1

Сывороточный белок

Сывороточный белок"

Ассоциированный с регенерацией серпйн 1

32.0

Плазминогвн

23.9

Сывороточный белок

Лейкоцитарный ингибитор протеаз

20.1

Сывороточный белок

Алолипопротеин С1

18.7

Сывороточный белок

Алолипопротеин СИ

ЯеяЗВ

18.3

45.0

Сывороточный белок

Диффервнцировка. клеточная адгезия

Эсгераза1

56.8

Компо^етплотн^ Детоксификация, гидропаза

Цнтохром Р450. индуцируемый стероидами

40.8

Метаболизм

Таблица 4. Гены, максимально репрессированные при прогрессии ГК. Пояснения в тексте.

ННР4ой-респоияиные гены Сравнение профилей экспрессии генов в культуре клеток 6ГК и двух ее клонах, трансфицированных вектором рШМБ-ШДЧ позволило выявить ряд новых НЫР4а1-респонсивных генов, уровни транскрипции которых в исходной культуре и трансфицированных клонах отличались более, чем в 2 раза. Вследствие невысокого уровня экспрессии трансгена (см. выше) этот подход позволил выявить лишь гены, наиболее существенно зависящие отН№4а1. Было выявлено 20 генов, экспрессия которых снижена в 6ГК и активируется при трансфекции, и 32 гена, гиперэкспрессирующихся при прогрессии и подавленных во всех трансфицированных клонах. В Таблице 5 приведены гены, экспрессия которых наиболее четко зависит от НОТ4а. Они кодируют транскрипционные факторы, регуляторы клеточного цикла, ростовые факторы, молекулы клеточной адгезии, транспортные белки и метаболические ферменты. Полученные данные указывают на важную роль НОТ4а1 в интеграции ткане-специфических и общераспространенных сигнальных путей, обеспечивающих поддержание эпителиальной морфологии, контроль клеточного деления и дифференцировки гепатоцитов.

HNF4a1 респонсивные гены

Название Функция НЗЗ/Н4

HNF4¡hi1^¡

Антиген рака кишечника 33 ТФ, активирован в опухолях кишечника £1

р47 ОпдЗ) ТФ 2.1

Трансформирующий антиген гипофиза 1 ТФ, экспрессируется в эмбриональной печени 2.2

TG взаимодействующий фактор ТФ, связывает сайт ЯХЯ, ко-репрессор? 2.3

TGF-B1 индуцируемый транскрипт 4 ТФ, репрессор 2.7

Гистоновая ацетилтрансфераза HAT1 Ацетилироаание гиетонов 4

PCNA Активация клеточного цикла 3.7

Cdc25b Регуляция клеточного цикла 2.8

р21 (СОКГЛАЬакгивируемая киназа 1 Эффектор ГТФаз, подвижность и морфогенез 2

Плацентарный ростовой фактор Фактор роста, пролиферация и миграция 3.5

Фибронектин 1 Клеточная адгезия 2.5

S100 кальций-связывакмций белок А11 Связывание ионов Са, цитокин 2.8

Гексокиназа1 Гликолиз 2.2

Антиген CD9 Транспорт жирных кислот 2.5

Кателсин Z(X) Внутриклеточная деградация пептидов 3.3

Карбоксилелтидаза ЕЛН Расщепление балков 3.3

ESTs (АА125404) ? 2.6

ESTs (AA467S78) ? 3.8

ESTs (АА290313) 7 3

SI HNF4jb(Í-Í ' ' У 1

EST« гомологичный CREB (AA213299) ТФ, активатор алкоголь-дегидрогеназы 0.32

Ядерный рецептор LXR а ТФ, регуляция гомеостаза холестерола 0.5

Мах димеризационный белок 4 ТФ, репрессор, антагонист туе 0.47

Фактор фрагментации ДНК Активатор апоптоза 0.4

Е2 убиквитин-связывающий фермент Селективное связывание с убиквитином 0.43

Ингибитор а-трипеина, тяжелая цепь 2 Печеночный ингибитор протеаз 0.37

Глицерол-З-фосфат ацилтрансфераза Синтез фосфолипидов в печени 0.47

АТР-связывающая кассета 1 Переносчик цАМФ (холестерол) 0.43

Фосфодиэстераза ЗА Регуляция транспорта цНТФ 0.25

ESTs (W64241) ? 0.37

Таблица 5. Н>Т4а1-респонсивные гены. В верхней части таблицы приведены гены, репрессируемые Н№4а1, в нижней - гены, активируемые в Ю3-Н№4 трансформированных клетках.

Возможные маркеры гепатоканцерогенеза

При компьютерном анализе профилей экспрессии генов ПС мыши выявлено более 20 потенциальных опухолевых маркеров, экспрессия которых более чем в 5 раз повышена во всех исследованных ГК по сравнению с нормальной печенью (Табл. б). Эти последовательности включают гены, по литературным данным связанные с гепатоканцерогенезом (металлотионеин, аспарагин синтетаза, остеопонгин, С044), маркеры других типов опухолей (аннексии 2, кавеолин, СО 9, (33151, РЙТи) и ^охарактеризованные последовательности кДНК (ЕвТв). Большинство генов этой группы кодирует секретируемые и мембранные белки, которые представляют наибольший интерес для диагностического и терапевтического использования. Мы ожидаем, что проводимое в настоящее время изучение закономерностей экспрессии этих генов в образцах опухолей мышей и человека может привести к идентификации новых маркеров гепатоканцерогенеза.

Название мГК 6ГК нзз Маркер опухолей Маркер ГК

Остеопонтин 80 1« 113 + +

Секреторный лейкоцитарный ингибитор протеаз 74 6 б -

Антиген отторжения опухолей а 11 б -

Металлотионеин 1 20 16 7 + +

Аспарагин синтетаза и б 10 + +

Аннексин2 (р36 /Калпактин I тяжелая цепь 10 б 17 +

Кавеолин АА138693 10 33 32 +

АТФаза АТР2А1 10 17 30

FGF рецептор 1 9 14 10 +

Основной белок vault в 3 2 +

Тропомицин 4 в 13 17

DnaJ гомолог 10 7 7 6

L6 антиген 6 а 7 +

Митохондриальный рибосомный белок S7 б 6 1

ESTs W2082& в и 13

Са/кальмодулин-зависимая ПК б is 13

Кавеолин W13196 6 б 11 ♦

CD44 антиген 6 12 +

CD9 антиген 5 17 10 +

Эндотелиальный маркер опухолей 8 S 9 7 +

Усилитель | жламентации NeddS S 3 4 *

Паннексин S 4 4

CD151 антиген 3 в 10 +

Таблица 6. Потенциальные маркеры гепатоканцерогенеза. Цифрами обозначен уровень повышения экспрессии гена по сравнению с нормальной печенью (усредненные результаты трех независимых гибридизаций). Здесь и далее для разных фрагментов одного и того же гена в скобках приведен номер в геномном банке. Две правые колонки отражают наличие литературных данных на начало 2003 года.

Гены, дифференциально экспрессирующиеся в ГК мышей разного уровня дифференцировки и клонах крысиной гепатомы, различающихся по синтезу АФП

Полученные нами результаты указывают на существование общих механизмов регуляции гепато-специфической экспрессии генов в двух экспериментальных системах, описанных в настоящем исследовании - мышиных ГК общего происхождения, различающихся уровнем дифференцировки, и клонах крысиной гепатомы, контрастных по синтезу АФП. В обеих системах подавление гепато-специфической транскрипции ассоциировано с репрессией гена НЫР4а1, ре-экспрессия которого ведет к частичному восстановлению дифференцировочных свойств клеток. И в том, и в другом случае имеются основания предполагать, что подавление транскрипции гена РШР4а1 определяется прямым или опосредованным действием пока неидентифицированного негативного регулятора его экспрессии. Если такой регулятор существует, он может оказаться ключевым звеном в де-дифференцировке клеток, сопровождающей прогрессию ГК.

Для того чтобы определить список возможных кандидатов на роль такого репрессора, мы провели сравнительный анализ спектров дифференциально экспрессирующихся генов в ГК мышей и клонах крысиной гепатомы. При гибридизации образцов РНК из клонов 921 (АФП4) и 7Е10 (АФГГ) с кДНК микрочипами на 27000 генов (нормализационным контролем служил образец нормальной печени взрослой крысы) было выявлено 3040 генов, более чем в два раза активированных в АФГГ клоне по сравнению с АФП4 и нормальной печенью. Из этого списка генов были отобраны последовательности, уровень транскрипции которых в 6ГК более чем в два раза повышен по сравнению с мГК (см. Табл. 3). После удаления из этого перечня 1ЮТ4а1-респонсивных генов (см. Табл. 5) и генов, гиперэкспрессирующихся во всех опухолях по сравнению с нормальной печенью (то есть не связанных со статусом НОТ4а1, см. Табл. 6), мы получили список из 19 последовательностей. В Таблице 7 приведены относительные уровни их экспрессии относительно нормальной печени, а также указана хромосомная локализация гомологичных последовательностей в геноме человека. Важно отметить, что две последовательности из этого списка в геноме человека картированы хромосомных локусах, наиболее часто амплифицированных в ГК, в которых предполагается наличие неидентифицированных пока онкогенов.

Мы ожидаем, что проверка закономерностей экспрессии этих генов в коллекции ГК мышей с разным уровнем дифференцировки и скоростью роста и в образцах человеческих опухолей позволит выбрать из приведенных списков наиболее вероятные эффекторы гепатоканцерогенеза и приступить к исследованию их биологической роли при прогрессии опухолей печени.

Потенциальные супрессоры дифференцировки

Название Функция Локус мГК 6ГК i

MAD2 подобный белок 1 Контроль клеточного цикла 4д27 1.1 2.4|

Rab3b, Ras семейство Везикулярный транспорт? 1р32-р31 1.1 4.5

CdcZa Контроль клеточного цикла 10q21.1 1.6 3.8

Инозитол 1,4,5-трифосфат Выведение ШШ 3.2 15

рецептор 3 внутриклеточного Са ■¡ИИ

Циклин G (AA4S8196) Регуляция пролиферации 5q32-q34 1.5 3.0

Циклин G (АА067318) Регуляция пролиферации 5q32-q34 1.2 3.3

ИнтегринаЗ Рецептор ЕСМ тшт 1.9 4.2

ESTs гомол. Сепенопоотеина N ? 1р36.13? 1.5 3.11

Киназа пируват-дегидрогеназы 3 Метаболизм глюкозы Хр22.11 1.1 2.4|

Эпсин2 Эндоцитоз 17р11.2 1.5 з.зР

Цитохезин 3 Активация аг1 7р22.3 0.9 5.71

Гексокиназа 1 Гликолиз 10q22 1.5 9.9

Кальцион (рецептор ITP) Са-зависимая передача сигнала 10q26.3 2.4 6.9

Филамин А, альфа Подвижность клеток Xq28 2.3 7.11

РНК связывающий белок 3 Процессинг РНК Хр11.2 2.7 5-4I

Хромобокс гомолог 3 Рейрессор транскрипции 7р15.2 1.3 2.5 i

ESTs, KIAA0417 (W20829) Фолдинг белков? 10q26.11 6.1 24.11

PDGFa Пролиферация, межклеточная сигнализация 7р22 2.4 5.0

Хромобокс гомолог 6 Релрессор транскрипции 22q13.1 1.6 3.7|

ÍAFP-

AFP-

2.1

0.6

1.5

1.2

0.6

1.3

0.6

1.0

0.7

1.3

1.2

1.1

0.8

1.1

2.7

0.9

5.7

2.9

1.0

JEH

2Щ

6.31

4.0Í

2.8В

5М,

ад

2.31

3.11

4.0

4.1

4.1

2.41

ZW

ЗИ Ü

1161

6.41

гм

Таблица 7. Потенциальные супрессоры дифференцировки. Гены, экспрессия которых обратно коррелирует с транскрипцией Н№4а1, при прогрессии ГК и в клонах крысиной гепатомы. В таблице приведена хромосомная локализация соответствующих последовательностей в геноме человека и отмечены локусы, наиболее часто амплифицированные в ГК человека. Цифры отражают уровни экспрессии, нормализованные относительно нормальной печени, или их соотношение в сравниваемых образцах.

Экспрессия НИР4а1 в образцах ГК человека подавлена На основании данных о важной роли репрессии гена Н№4а1 в прогрессии и де-дифференцировке ПС мышей представлялось целесообразным проверить, вовлечен лиН№4а1 в развитие злокачественного фенотипа ПС человека. В сотрудничестве с хирургическим отделением опухолей печени и поджелудочной железы НИИ Клинической онкологии РОНЦ РАМН нами начата работа по анализу уровней экспрессии ГЯФ в образцах ГК человека. К настоящему времени проанализировано два клинических случая.

Больной Р, женщина 32 лет, анализ на вирусы гепатита А, В, С и И отрицательный. Первичный низкодифференцированный рак печени солидно-альвеолярного строения с инвазивной псевдокапсулой. Очень высокий уровень АФП в крови (4150 ед /мл).

Больной А, женщина 72 лет, анализ на НВУ негативный, АФП в норме. Узел в печени имеет строение низкодифференцированного гепатоцеллюлярного рака с участками некроза и фиброза. Дистрофические изменения гепатоцитов. Через 4 месяца после удаления опухоли обнаружены метастазы в толстый кишечник.

Р. А.

I-1 I-

ПОП Нервг -

Рисунок 15. Подавление экспрессии ОТ4а1 в образцах ГК человека. Электрофорез продуктов ОТ-ПЦР с праймерами к Н№4а человека, сто а1, а7 изоформам и р-актину (контроль количества РНК) в агарозном геле. Для контроля специфичности реакции использована РНК из культуры клеток человеческой гепатобластомы НерС2.

Анализ РНК, выделенной из образцов ГК и окружающей неопухолевой ткани, методом ОТ-ПЦР с праймерами к Н№4а человека и его а1 и а7 изоформам (Рис. 15) показал, что в обоих случаях в опухоли произошло существенное снижения уровней транскрипции НОТ4а по сравнению с окружающей неопухолевой тканью. Это снижение определяется подавлением экспрессии взрослых форм Н№4а, в то время как эмбриональная форма а7, не характерная для взрослой печени, выявляется и в опухоли, и в окружающей ее ткани каждого пациента. На основании этих данных можно предположить, что активация Н№4а7 может отражать ранние трансформационные события и связана с нарушением нормальной структуры печени и/или воздействием ростовых факторов.

Важно отметить, что в случае А в опухоли наблюдалось полное подавление экспрессии Н№4а1, которое коррелировало с отсутствием в крови онко-эмбрионального маркера АФП, полной потерей печеночной архитектуры, метаболическими нарушениями и приобретением способности к метасгазированию. Можно предположить, что отсутствие экспрессии АФП в этом случае отражает полную де-дифференцировку опухолевых клеток и является следствием подавления экспрессии гепато-специфических регуляторных факторов, участвующих в регуляции гена АФП.

Таким образом, мы показали, что в ГК человека может происходить падение уровня экспрессии Н№4а, более того, полученные данные являются существенным указанием на то, что Н№4а вовлечен в процесс гепатоканцерогенеза у человека, а подавление его экспрессии может быть неблагоприятным прогностическим фактором, отражающим приобретение клетками ГК де-дифференцированного высоко злокачественного фенотипа. Мы ожидаем, что дальнейшее исследование закономерностей экспрессии гепато-специфических генов в образцах человеческих опухолей позволит определить роль ткане-специфических регуляторов в гепатоканцерогенезе, а также проверить клиническую значимость других регуляторных закономерностей, выявленных при анализе описанных выше экспериментальных систем.

Эти данные могут иметь важное прикладное значение благодаря описанной нами на модели ГК мышей возможности частичной реверсии злокачественного фенотипа при восстановлении экспрессии HNF4al. В частности, способность HNF4al индуцировать экспрессию генов, ответственных за детоксикацию и метаболизм лекарственных веществ в печени открывает новые перспективы для повышения чувствительности опухолей печени к терапии.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В этой работе нами впервые выдвинута и обоснована гипотеза о том, что одним из ключевых событий гепатоканцерогенеза является изменение экспрессии гепатоцитарных ядерных факторов (ГЯФ), регулирующих экспрессию большинства функциональных генов печени.

Мы провели характеристику биологических свойств новой экспериментальной модели прогрессии химически индуцированных перевиваемых ГК мышей, в которой дифференцированный медленнорастущий вариант in vivo дал начало быстрорастущей де-дифференцированпой опухоли. Наблюдаемая прогрессия затрагивает фундаментальные свойства клеток печеночного происхождения, такие как морфологические, ростовые и функциональные характеристики. Прогрессия ГК мыши произошла скачкообразно и, вероятно, стала следствием единичного молекулярного события.

Опухолевая прогрессия ГК сопровождается глубокими изменениями в дифференцировочном статусе клетки. Координированное подавление активности целого блока гепато-специфических генов позволило предположить, что изменения, наблюдаемые при прогрессии ГК, могут быть вызваны нарушениями в экспрессии ключевых регуляторов транскрипции генов печени, каковыми являются гепатоцитарные ядерные факторы. В настоящее время четко показана определяющая роль этой группы факторов в формировании и дифференцировке нормальной печени, однако их значение при гепатоканцерогенезе практически не исследовалось. Важнейшим из гепато-специфических регуляторов транскрипции генов во взрослой печени представляется ядерный рецептор HNF4al (Duncan, 2003).

Действительно, при прогрессии ГК нами впервые выявлено подавление экспрессии целого блока гепато-специфических транскрипционных регуляторов, в том числе HNF4al. Ре-экспрессия этого гена в де-дифференцированной быстрорастущей ГК мыши вызывает частичную реверсию злокачественного фенотипа - восстановление транскрипции генов маркеров дифференцировки и установление эпителиальной морфологии. Таким образом, репрессия HNF4al стала причиной по крайней мере части существенных фенотипических изменений, произошедших в ходе прогрессии. В то же время получены свидетельства

существования механизмов регуляции гена HNF4al, ответственных за его репрессию в ходе прогрессии ГК.

Вероятно, причиной прогрессии ГК стал фактор, находящийся в пути передачи сигнала выше, чем HNF4 al. Ни один из рассмотренных в настоящем исследовании гепато-специфических регуляторов транскрипции на эту роль не подходит. Методом гибридизации с микрочипами выявлены гены, потенциально определяющие утрату HNF4 al при прогрессии опухолей, и возможные маркеры злокачественного фенотипа. Описанная система представляется удобной моделью для дальнейшего анализа механизмов прогрессии ГК и описания закономерностей ткане-специфической регуляции транскрипции при гепатоканцерогенезе.

Важно отметить, что основные закономерности гепато-специфической экспрессии, выявленные на модели прогрессии ГК мышей, сохраняются в клонах крысиной гепатомы и химически индуцированных ГК мышей независимого происхождения. Более того, впервые описанное нами подавление транскрипции HNF4al в образцах ГК человека указывает на сохранение роли этого фактора в злокачественной трансформации гепатоцитов разной видовой специфичности. Данные о том, что экспрессия генов HNF4a и онко-эмбрионального маркера АФП во всех изученных системах регулируются координировано и впервые продемонстрированная способность HNF4al активировать транскрипцию АФП объясняют наблюдаемое в клинической практике отсутствие синтеза АФП в крайне де-дифференцированных вариантах ГК.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что HNF4a играет ключевую роль в интеграции гепато-специфических регуляторных путей и базовых механизмов контроля клеточной пролиферации и дифференцировки. Мы рассчитываем, что дальнейшее изучение свойств этого белка и особенностей его регуляции приведет к созданию новых диагностических и терапевтических подходов к лечению опухолей печени.

ВЫВОДЫ

1. Впервые выдвинута и обоснована гипотеза о том, падение уровней экспрессии гепато-специфических транскрипционных факторов является одним из ключевых событий при прогрессии опухолей печени.

2. Охарактеризована экспериментальная система прогрессии ГК, в которой из медленнорастущей дифференцированной ГК мыши in vivo одномоментно вьпцепился высоко злокачественный быстрорастущий вариант. Прогрессия ГК сопровождается утратой эпителиальной морфологии, приобретением способности к росту in vitro, снижением уровня дифференцировки и активацией теломеразы.

3. Впервые проведен полный анализ уровней экспрессии транскрипционных факторов, определяющих дифференцировку печени, при возникновении и прогрессии ГК m vivo. Единственным транскрипционным фактором, активирующимся на ранних этапах канцерогенеза, является эмбриональная форма HNF4a7. При прогрессии ПС произошло изменение экспрессии целого блока ткане-специфических транскрипционных факторов (HNF4a, HNF1, vHNFl, HNF3y, HNF6, С/ЕВРа, FTF, GATA4, COUP-TFI, PXR).

4. Ре-экспрессия гена HNF4al приводит к частичной реверсии опухолевого фенотипа: приобретению эпителиальной морфологии и восстановлению транскрипции генов, кодирующих транскрипционные факторы и дифференцировочные маркеры.

5. Выявленные закономерности подтверждены при анализе независимо индуцированных ГК мышей и клонов крысиной гепатомы, отличающихся по уровню экспрессии онко-эмбрионального маркера АФП.

6. Экспрессия гена АФП и гепатоцитарных ядерных факторов в опухолях происходит координировано, определяющую роль в установлении уровня транскрипции АФП играет негативная регуляция.

7. Репрессия гена HNF4al при прогрессии ГК происходит на транскрипционном уровне. Впервые показано наличие в районе -1.4 т.п.н. /-363 п.н. последовательности, определяющей негативную регуляцию гена HNF4.

8. Подавление экспрессии гена HNF4al впервые описано в де-дифференцированных ГК человека.

9. Методом гибридизации с кДНК микрочипами выявлены гены, потенциально определяющие ход опухолевой прогрессии, возможные маркеры гепатоканцерогенеза и новые HNF4-peenoHCHBHbie гены.

10. Транскрипционный фактор HNF4al играет ключевую роль в интеграции ткане-специфических и общераспространенных сигнальных путей, обеспечивающих дифференцировку гепатоцитов, и может частично нормализовать злокачественный фенотип.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. N.L. Lazarevich, T.L. Eraiser, А.Т. Tikhonenko (1990). Alpha-fetoprotein gene 5'-flanking region directs expression of the reporter gene only in AFP-positive clones of McA-RH 7777 rat hepatoma. XVDI Meeting of the International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine (ISOBM), Moscow, USSR, September 23-27,1990. Abstract book, 67.

2. T.L. Eraiser and N.L. Lazarevich (1994). Cell clones of rat hepatoma maintaining experimentally controlled alpha-fetoprotein production. "Molecular aspects of liver carcinogenesis", Delphi, Greece, January 8-18, Abstract book.

3. N.L. Lazarevich, T.L. Eraiser, I.F. Poddubnaya, E.V. Varga (1995). Alpha-fetoprotein (AFP) and hepatocyte nuclear factor-4 (HNF-4) gene expression correlates in McA-RH 7777 rat hepatoma cell clones. International Congress "Liver Development, Gene Regulation and Disease", Areachon, France, May 8-12. Abstract book, 100.

4. N.L. Lazarevich, E.V. Varga, I.F. Poddubnaya, T.L. Eraiser (1995). Studying of alpha-fetoprotein (AFP) gene expression in AFP-producing and non-producing rat hepatoma cell clones. 23 Meeting of the Federation of the European Biochemical Societies (FEBS), August 13-18, Basel, Switzerland, Abstract book, 285.

5. Т.Л. Эрайзер и Н.Л. Лазаревич (1996). Трансфекция точечным давлением: быстрый и эффективный способ введения макромолекул в клетки млекопитающих. Молекулярная биология, 30(2): 430-435.

6. G.I. Abelev and N.L. Lazarevich (1996). Alpha-Fetoprotein: Solved and Unsolved Problems. McGill Journal of Medicine, 2(2): 127-134.

7. Т.Л. Эрайзер, A.K. Язова, B.C. Полторанина, Н.И. Куприна, Л.Я. Шипова, А.Б. Лункина, Н.Л. Лазаревич и Г.И. Абелев (1996). Антиген, экспрессирующийся альтернативно альфа-фетопротеину в гепатомах крыс. Бюлл. Эксп. Биол. Мед., 122(11): 536-540.

8. Н.Л. Лазаревич, Е.В. Варга, И.Ф. Поддубная, Т.Л. Эрайзер (1996). Клоны крысиной гепатомы, продуцирующие или не продуцирующие альфа-фетопротеин (АФП), различаются по уровню экспрессии некоторых гепатоцитарных ядерных факторов. Материалы IV Всероссийского симпозиума по клеточной биологии. Цитология, 38(2): 218.

9. Е.В.Варга, И.Ф.Поддубная, ТЛ.Эрайзер и Н.Л. Лазаревич (1996). Изучение влияния ретиноевой кислоты на уровни экспрессии альфа-фетопротеина и некоторых гепатоцитарных ядерных факторов в клонах крысиных гепатом. I Съезд онкологов стран СНГ, Москва. Сборник тезисов, 80.

10. N.L. Lazarevich, E.V. Varga, I.F. Kustova, T.L. Eraiser (1997). Retinoic acid induces the expression of alpha-fetoprotein, serum albumin and hepatocyte nuclear factor 1 gene expression in alpha-fetoprotein-negative clones of rat hepatoma MoA-RH 7777. FEBS Special Meeting «Cell Signalling Mechanisms», June 29 - July 2, Amsterdam, Holland, Abstract book, P9-117.

11. N.L. Lazarevich, I.F. Poddubnaya, E.V. Varga, T.L. Eraiser (1997). Somatic cell hybrids of alpha-fetoprotein-producing and non-producing McA-RH 7777 rat hepatoma cell clones do not produce alpha-fetoprotein. Cold Spring Harbor Laboratory Meeting «Regulation of Liver Gene Expression in Health and Disease», April 30-May 4, New York, USA, Abstract book, 103.

12. E.V. Varga, I.F. Kustova and N.L. Lazarevich (1997). Alpha-fetoprotein gene expression increases under retinoic acid treatment in rat hepatoma clones. XXV ISOBM Meeting, September 19-24, 1997, Montreux, Switzerland. Tumor Biology, 18 (S2), 106.

13. T.L. Eraiser, A.K. Yazova, V.S. Poltoranina, N.I. Kuprina, E.R, Karamova, L.Ya. Shipova, N.L. Lazarevich, G.I. Abelev (1998). Inducible protein in rat hepatomas with expression alternative to alpha-fetoprotein. Int. J. Cancer, 75: 371-378.

14. N.L. Lazarevich, E.I. Kudijavtseva, E.V. Varga, O.V. Morozova, O.A. Cheremnova, D.A. Ovchinnikov, A.Y. Shapiguzov, V.S. Turusov, N.V. Engelhardt (1998). Expression of liver-specific

genes and hepatocyte nuclear factors in the new model of slow- and fast-growing transplantable mouse hepatomas. FASEB Research Conference "Mechanisms of Liver Growth and Differentiation in Health and Disease", Snowmass, Colorado, July 11-16. Abstract book, 1-22.

15. E.I. Kudijavtseva, N.L. Lazarevich, E.V. Varga, O.V. Morozova, O.A. Cheremnova, D.A. Ovchinnikov, A.Y. Shapiguzov, V.S. Turusov, N.V. Engelhardt (1998). HNF4 gene is involved in regulation of hepatocellular carcinoma differentiation status. XXVIISOBM Meeting, August 30 -September 4, Umea, Sweden. Tumor Biology, 19 (S2):59.

16. E.B. Варга, И.Ф. Кустова и H.JI. Лазаревич (1999). Влияние ретиноевой кислоты на экспрессию альфа-фетопротеина и гепатоцитарных ядерных факторов в клонах крысиной гепатомы. Молекулярная биология, 33(2): 235-242.

17. E.V. Varga, E.I. Kudijavtseva, N.V. Engelhardt, O.V. Morozova, O.A. Cheremnova, D.A. Ovchinnikov, A.Y. Shapiguzov and N.L. Lazarevich (1999). Decrease of HNF4 mRNA level correlates with rapid progression of HCC. 34th Annual Meeting of European Association for the Study of the Liver. Naples, Italy, 8-12 April. J. Hepatology, 30(S1): 209.

18. N.L. Lazarevich, E.I. Kudrjavtseva, E.V. Varga, O.V. Morozova, O.A. Cheremnova, D.A. Ovchinnikov, A.Y. Shapiguzov, V. Ruda and N.V. Engelhardt (1999). Expression of liver-specific genes and hepatocyte nuclear factors in the new model of slow- and fast-growing transplantable mouse hepatomas. 8 International Congress "Liver Development, Gene Regulation and Disease". Orvieto, Italy, June 2-5. Abstract book, 62.

19. E.I. Kudrjavtseva, N.L. Lazarevich, N.V. Engelhardt (1999). Co-cultures as a useful models for the study of AFP-gene regulation. 8 International Congress "Liver Development, Gene Regulation and Disease". Orvieto, Italy, June 2-5. Abstract book, 57.

20. N.L. Lazarevich, E.I. Kudrjavtseva, E.V. Varga, O.V. Morozova, O.A. Cheremnova, D.A. Ovchinnikov, A.Y. Shapiguzov, V. Ruda, N.V. Engelhardt (1999). Slow-growing and fast-growing transplantable mouse hepatocarcinomas as the model for study of hepatoma differentiation mechanisms. Role of HNF4. 6 European Meeting on Hepatocarcinogenesis. Vienna, Austria, September 23-25. Abstract book, П-10.

21. E.V. Varga, E.I. Kudryavtzeva, O.A. Cheremnova, D.A. Ovchinnikov, A.Y. Shapiguzov, O.V. Morozova, N.V. Engelhardt and N.L.Lazarevich (1999). The re-expression of liver-specific genes in dedifferentiated hepatocarcinoma variant. The American Society for Cell Biology 39 Annual Meeting, Washington, USA, December, Mol. Biol. Cell, 10 (S): 176.

22. Н.Л. Лазаревич (2000). Молекулярные механизмы регуляции экспрессии гена альфа-феторпротеина. Биохимия, 65(1): 139-158.

23. N.L. Lazarevich, E.I Kudijavtseva, E.V. Varga, O.V. Morozova, O.A. Cheremnova, D.A. Ovchinnikov, A.Y. Shapiguzov, and N.V. Engelhardt (2000). A new model for studying of hepatocarcinogenesis in mice: slow growing and fast growing transplantable hepatocarcinomas. 16 Meeting of the European Association for Cancer Research, Halkidiki, Greece, 30 May-3 June, Abstract book, p. 179-180.

24. N.L. Lazarevich, E.I Kudijavtseva, E.V. Varga, O.V. Morozova, O.A. Cheremnova, D.A. Ovchinnikov, A.Y. Shapiguzov, N.V. Engelhardt (2000). Multiple phenotypic alterations during in vivo progression of transplantable mouse hepatocarcinoma. FASEB Research Conference "Mechanisms of Liver Growth and Differentiation in Health and Disease", Snowmass, Colorado, July 29-August 3. Abstract book, 33.

25. D.A. Ovchinnikov, O.A. Cheremnova, E.V. Varga, E.I. Kudijavtseva, O.V. Morozova, A.Y. Shapiguzov, N.V. Engelhardt and N.L. Lazarevich (2000). Effects of HNF4 reexpression on the differentiation status of fast-growing mouse hepatocarcinoma. I European Life Science Organization Meeting, Geneva, Switzerland, September 2-6. Eur. J. Cell Biol., 52 (SI): 117.

26. G.I. Abelev, N.L. Lazarevich, T.L. Eraiser (2000). Alpha-fetoprotein: molecular and cellular aspects of regulation. International symposium "Current Problems of Molecular Genetics and Cell Biology". Москва, ИБГ PAH, 19-21 октября.

29. E.V. Varga, O.A. Cheremnova, D.A. Ovchinnikov, E.I. Kudijavtseva, O.V. Morozova, A.Y. Shapiguzov, N.V. Engelhardt and N.L. Lazarevich (2000). New model of hepatocellular carcinoma progression: the key role of HNF4 gene switch-off. American Association for Cancer Research Conference «Mouse Models of Cancer» La Jolla, USA, November 29-December 3. Abstract book, A30.

27. E.V. Varga, O.A. Cheremnova, D.A. Ovchinnikov, E.I. Kudijavtseva, O.V. Morozova, D.I. Fleishman, N.V. Engelhardt, N.L. Lazarevich (2001). Steroid family nuclear receptor HNF4 expression increases differentiation level in hepatocellular carcinoma. 27 FEBS Annual Meeting, FEBS J., 268 (SI): 68.

28. O.A. Cheremnova, E.V. Varga, D.A. Ovchinnikov, E.I. Kudijavtseva, O.V. Morozova, N.V. Engelhardt and N.L. Lazarevich (2001). Association of mTERT and c-myc gene expression with hepatocarcinoma progression. XXIXISOBM Meeting, Barcelona, Spain, September 29-October 3. Tumor Biology, 22(S2):56.

29. E.B. Варга, O.A. Черемнова, Д.А. Овчинников, А.Ю. Шапигузов, Е.И. Кудрявцева, О.В. Морозова, Н.В. Энгельгардт и Н.Л. Лазаревич (2001). Экспрессия тканеспецифических генов при прогрессии гепатокарцином мыши. Генетика, 37(6): 803-810.

30. И.Ф. Кустова, Е.В. Варга, Т.Л. Эрайзер и Н.Л. Лазаревич (2001). Подавление экспрессии гена альфа-фетопротеина в соматических гибридах АФП-положительного и АФП-отрицательного клонов крысиной гепатомы. Генетика, 37(10): 1-9.

31. N.L. Lazarevich, E.V. Varga, O.A. Cheremnova, D.A. Ovchinnikov, E.I. Kudijavtseva, O.V. Morozova, N.V. Engelhardt (2001). Tumor progression on a new model of mouse transplantable hepatocarcinomas: comparative analyses of main properties and gene expression. 7 European Meeting on Hepatocarcinogenesis, October 12-15, Castiadas, Italy, Abstract book, 88.

32. N.L. Lazarevich, E.V. Varga, E.I. Kudijavtseva, O.A. Cheremnova, D.A. Ovchinnikov, O.V. Morozova, N.V. Engelhardt (2001). Studying of mechanisms involved in the maintenance of hepatoma differentiation status. Role of HNF4. 11 European Cancer Conference, 21-25 October, Lisbon, Portugal, Eur. J. Cancer, 37(S6): 126-127.

33. N.L. Lazarevich, O.A. Cheremnova, E.V. Varga, D.A. Ovchinnikov, E.I. Kudijavtseva, O.V. Morozova, D.I. Fleishman, N.V. Engelhardt (2002). Comparative analyses of main properties and gene expression during mouse hepatocellular carcinoma one-step progression. European Association for Cancer Research (EACR) 17 Meeting, Rev. Oncol., 4(S1): 91-92.

34. И.Ф. Кустова и Н.Л. Лазаревич (2002). Молекулярные механизмы, определяющие различия уровня экспрессии гена альфа-фетопротеина в клонах крысиной гепатомы. Тезисы Ш Съезда Биохимического общества, Санкт-Петербург, с. 404-405.

35. N.L. Lazarevich, O.A. Cheremnova, E.V. Varga, D.A. Ovchinnikov, D.I. Fleishman, E.I. Kudijavtseva, O.V. Morozova, N.V. Engelhard (2002). Tumor progression of mouse transplantable hepatocarcinomas: analyses of biological properties and gene expression. FASEB Research Conference "Mechanisms of Liver Growth, Differentiation and Molecular Pathogenesis of Hepatic Diseases", Snowmass, Colorado, Abstract book, X-15.

»1 207 6

Издательство ООО "МАКС Пресс". Лицензия ИД № 00510 от 01.12.99 г. Подписано к печати 06.05.2003 г. Формат 60x90 1/16. Усл.печ.л. 3,0. Тираж 110 экз. Заказ 316. Тел. 939-3890, 928-2227, 928-1042. Факс 939-3891. 119899, Москва, Воробьевы горы, МГУ.

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Лазаревич, Наталия Леонидовна

Список сокращений.

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Структура и свойства нормальной печени.

2.2. Эпидемиология и патологические свойства ГК.

2.3. Стадии гепатоканцерогенеза.

2.4. Патогенез ГК.

2.4.1. Хронический вирусный гепатит.

2.4.2. Вирус гепатита В.

2.4.3. Вирус гепатита С.

2.4.4. Химические канцерогены.

2.4.5. Наследственные генетические нарушения.

2.5. Свойства опухолевой клетки.

2.5.1. Независимость от ростовых сигналов.

2.5.2. Нечувствительность к сигналам, запрещающим рост.

2.5.3. Уклонение от программы апоптоза.

2.5.4. Неограниченныйрепликативный потенциал.

2.5.5. Способность к ангиогенезу.

2.5.6. Генетическая нестабильность.

2.5.7. Способность к инвазии и метастазированию.

2.5.8. Снижение уровня дифференцировки.

2.6. Генетические механизмы гепатоканцерогенеза.

2.6.1. Ранние изменения при гепатоканцерогенезе.

2.6.2. Поздние события гепатоканцерогенеза.

2.7. Гепатоцитарные ядерные факторы и их роль в регуляции генов печени.

2.7.1. Семейство 11NF1.

2.7.2. Семейство С/ЕВР.

2.7.3. Семейство HNF3.

2.7.4. Семейство HNF4.

2.7.5. Семейство HNF6.

2.7.6. FTF.

2.7.7. Семейство GA ТА.

2.7.8. Семейство COUP-TF.

2.7.9. Основные этапы формирования печени.

2.7.10. Спектры экспрессии ГЯФ в печени и других органах.

2.7.11. Регуляционная иерархия ГЯФ.

2.7.12. ГЯФ в генетических заболеваниях человека.

2.7.13. ГЯФ при вирусных инфекциях.

2.7.14. ГЯФ при канцерогенезе.

2.8. Регуляция экспрессии гена АФП.

2.8.1. Структура гена АФП и продукты его транскрипции.

2.8.2. Синтез АФП в норме и при патологии.

2.8.3. Механизмы регуляции экспрессии гена АФП.

2.8.4. Регуляторные цис-элементы гена АФП.

2.8.5. Транскрипционные факторы, участвующие в регуляции экспрессии гена АФП.

2.8.6. Возможная модель регуляции гена АФП.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1. Список использованных растворов и сред.

Ф 3.2. линии перевиваемых гепатокарцином.

3.3. Клеточные линии.

3.4. Трансформация клеток Е. Coli.

3.5. Выделение нуклеиновых кислот.

3.6. Электрофорез нуклеиновых кислот в неденатурирующих агарозных гелях.

3.7. Метод "Обратная Транскрипция - Полимеразная Цепная Реакция" (ОТ-ПЦР).

3.8. Нозерн-блот гибридизация.

3.9. Определение активности теломеразы методом TRAP

Telomerase Repeat Amplification Protocol).

3.10. Авторадиография.

3.11. Иммунохимическое выявление белков.

3.12. Получение гистологических препаратов ГК мышей.

3.13. Гибридизация с кДНК микрочипами.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

4.1. ИЗУЧЕНИЕ МЕХАНИЗМОВ ОДНОСТУПЕНЧАТОЙ ПРОГРЕССИИ ПЕРЕВИВАЕМЫХ ГК МЫШЕЙ.

4.1.1. Сравнение биологических свойств бГКимГК.

4.1.2. Утрата эпителиальной морфологии при прогрессии ГК. щ 4.1.3. Активация теломеразы при прогрессии ГК.

4.1.4. Экспрессия гепато-специфических генов при прогрессии ГК.

4.1.5. Прогрессия ГК сопровождается подавлением экспрессии всех изоформ HNF4a.

4.1.6. Гепатоцитарныеядерные факторы в прогрессии ГК.

4.1.7. Восстановление экспрессии HNF4<xl в культуре клеток 6ГК ведет к восстановлению транскрипции некоторых гепато-специфических генов и установлению эпителиальной морфологии.

4.1.8. Регуляторныйрайон HNF4ol1 в клетках 6ГКнеактивен.

4.2. ЗАКОНОМЕРНОСТИ ЭКСПРЕССИИ ГЕПАТО-СПЕЦИФИЧЕСКИХ ГЕНОВ

В ГК МЫШИ РАЗЛИЧНОГО УРОВНЯ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ.

4.3. ИЗУЧЕНИЕ МЕХАНИЗМОВ РЕГУЛЯЦИИ ГЕНА АФП В КЛОНАХ КРЫСИНОЙ ГЕПАТОМЫ.

4.3.1. Различия в уровне синтеза АФП определяются на транскрипционном уровне.

4.3.2. Разработка нового метода трансфекции эукариотических клеток.

4.3.3. Анализ экспрессии репортерных генов под контролем регуляторных элементов гена А ФП в А ФП+ и АФП- клонах.

4.3.4. Экспрессия гепато-специфических белков в АФП+ и А ФП- клонах.

4.3.5. Сравнение спектров экспрессии транскрипционных факторов в А ФП+ и А ФП- клонах.

4.3.6. Получение соматических гибридов АФП+ и АФП- клонов.

4.3.7. Синтеза АФП в полученных гибридах не наблюдается.

4.3.8. Экспрессия генов семейства альбумина в сомати ческих гибридах.

4.3.9. Закономерности экспрессии транскрипционных факторов в соматических гибридах.

4.3.10. Экзогенная экспрессия HNF4a и HNF1 в АФП- клонах крысиной гепатомы

4.4. АНАЛИЗ СПЕКТРОВ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ В ГК МЫШЕЙ И КРЫС МЕТОДОМ ГИБРИДИЗАЦИИ С кДНК МИКРОЧИПАМИ.

4.4.1. Гены, дифференциально экспрессирующиеся при прогрессии ГК.

• 4.4.2. HNF4a 1-респонсивные ген ы.

4.4.3. Возможные маркеры гепатоканцерогенеза.

4.4.4. Гены, дифференциально экспрессирующиеся в ГК мышей разного уровня дифференцировки и клонах крысиной гепатомы, различающихся по синтезу

4.5. Экспрессия HNF4al в образцах ГК человека подавлена.

5. ОБСУЖДЕНИЕ.

5.1. Изменения ткане-специфической экспрессии генов при прогрессии ГК.

5.1.1. Одноступенчатая прогрессия перевиваемых ГК мыши.

5.1.2. Экспрессия транскрипционных факторов, определяющих гепатоцитарный фенотип, при прогрессии ГК.

5.1.3. Экспрессия HNF4a при гепатоканцерогенезе и прогрессии опухолей.

5.1.4. HNF4al - важный регулятор дифференцировки гепатоцитов.

5.1.5. Что стало причиной репрессии HNF4a?.

5.2. Регуляция экспрессии гена АФП.

53. Изменения профилей экспрессии генов при прогрессии ГК.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изменения спектров экспрессии генов при гепатоканцерогенезе и прогрессии опухолей печени"

• Гепатоцеллюлярная карцинома (ГК) - самая частая опухоль печени и одна из наиболее распространенных форм рака в мире. Основными факторами риска для развития ГК являются хронические инфекции вирусами гепатита В (HBV) или (HCV) и длительное воздействие химических гепатоканцерогенов, таких как афлатоксин В1 (Bosch, 1999). Анализ генетических нарушений и изменений в экспрессии генов позволил выявить ряд факторов, вовлеченных в процесс гепатоканцерогенеза. Он включает гены, кодирующие факторы роста (TGF-a, TGF-P, HGF и их рецепторы), опухолевые супрессоры (Rb, р53), компоненты Wnt-сигнального пути, молекулы межклеточных контактов и адгезионные белки (Buendia, 2000).

Развитие опухолевого фенотипа представляет собой многостадийный процесс, обусловленный накоплением генетических нарушений. Следствием таких нарушений является приобретение опухолью все более злокачественного фенотипа. Этот процесс, получивший название опухолевой прогрессии, является важным свойством злокачественных новообразований различного происхождения, но всегда определяется свойствами исходной ткани, давшей начало опухоли.

• Прогрессия ГК сопровождается снижением уровня дифференцировки, подавлением экспрессии ткане-специфических генов, увеличением скорости пролиферации клеток, утратой эпителиальной морфологии, приобретением инвазивности и способности к метастазированию. Прогрессия ГК связана с утратой опухолями дифференцированного фенотипа, в то же время, карциномы часто сохраняют способность к ре-дифференцировке (Абелев, 2003). В настоящее время описано множество сигнальных путей, важных для контроля функций печени и пролиферации, однако молекулярные основы прогрессии ГК остаются недостаточно изученными.

Определяющую роль в регуляции экспрессии большинства генов, специфичных для печени, играет соотношение в клетке уровней так называемых гепатоцитарных ядерных факторов (ГЯФ), к которым относят несколько семейств регуляторных белков: HNF1, С/ЕВР, HNF3, HNF4 и HNF6 (Tranche and Yaniv, 1992). Между уровнями экспрессии различных ГЯФ существуют тесные связи (Лазаревич, 2000; Locker, 2001), однако иерархические отношения между представителями различных семейств факторов пока исследованы недостаточно полно.

Ф Ядерный рецептор HNF4a играет ключевую роль в эмбриональном развитии печени и в поддержании дифференцированного гепатоцитарного фенотипа (Li et al., 2000; Hayhurst et al., 2001). Однако роль HNF4a и других ткане-специфических регуляторов транскрипции в гепатоканцерогенезе в настоящее время практически не изучена.

Для решения этой проблемы мы использовали новую экспериментальную систему, в которой из медленнорастущей дифференцированной ГК мыши (мГК) одномоментно

• выщепился инвазивный высоко злокачественный вариант (6ГК). Мы рассчитывали, что сравнение вариантов мГК и 6ГК позволит идентифицировать генетические пути, определяющие основные свойства прогрессии ГК, и приступить к разработке подходов к реверсии злокачественного фенотипа ГК. Универсальность регуляторных механизмов, выявленных при изучении этой системы, была проверена на клонах крысиной гепатомы с разным уровнем экспрессии опухолевого маркера альфа-фетопротеина (АФП), в химически индуцированных ГК мышей независимого происхождения и в образцах ГК человека.

Цели и задачи исследования

Цель настоящей работы состояла в изучении молекулярных механизмов прогрессии ГК и проверки выдвинутой нами гипотезы о роли транскрипционных факторов, специфических для печени, в гепатоканцерогенезе.

В ходе работы решались следующие основные задачи:

1. Характеристика биологических свойств новой экспериментальной системы

• прогрессии ГК мышей in vivo.

2. Анализ профиля экспрессии гепато-специфических белков и транскрипционных факторов при прогрессии ГК.

3. Изучение эффектов ре-экспрессии HNF4a в культуре клеток дедифференцированной ГК.

4. Проверка универсальности выявленных закономерностей на панели независимо индуцированных ГК мышей с разного уровня дифференцировки.

5. Определение спектров экспрессии и возможной роли ГЯФ в регуляции экспрессии гена опухолевого маркера АФП в клонах крысиной гепатомы и их соматических гибридах.

6. Поиск причин подавления транскрипции HNF4a при де-дифференцировке ГК.

7. Исследование уровней экспрессии HNF4a в образцах ГК человека.

8. Выявление потенциальных эффекторов и маркеров гепатоканцерогенеза и прогрессии опухолей печени методом гибридизации с кД1 Ж микрочипами.

Научная новизна работы ф Исследования молекулярных механизмов, лежащих в основе опухолевой прогрессии

ГК, были значительно осложнены отсутствием четких экспериментальных моделей гепатоканцерогенеза in vivo. Поэтому научная новизна исследования во многом определяется использованием уникальных моделей: коллекции химически индуцированных ГК мышей, системы ГК мышей общего происхождения, различающихся по скорости роста и уровню дифференцировки, и набором клонов крысиной гепатомы, отличающихся по уровню экспрессии АФП. Создание и характеристика экспериментальных систем близкого происхождения, различающихся по выраженности определенного ряда признаков, позволило провести сравнительный анализ экспрессии генов, определяющих прогрессию и де-дифференцировку опухолей печени.

В работе показано, что прогрессия ГК сопровождается координированным подавлением уровней мРПК гепато-специфических генов. Впервые проведен полный анализ уровней экспрессии транскрипционных факторов, определяющих дифференцировку печени, при возникновении и прогрессии ГК in vivo. Впервые установлено, что на ранних этапах канцерогенеза происходит активация транскрипции эмбриональной формы HNF4a. В то же время, при прогрессии ГК выявлено изменение экспрессии целого блока ткане-специфических транскрипционных факторов. В работе впервые продемонстрирована ключевая роль HNF4al в поддержании дифференцированного статуса опухолей печени и показана возможность частичной реверсии злокачественного фенотипа при экзогенной экспрессии этого гена. В ходе этих исследований идентифицирован ряд новых транскрипционных мишеней HNF4al.

В то же время, показано, что причиной подавления экспрессии HNF4al стало изменение функции транскрипционных регуляторов этого гена, и выявлена последовательность, определяющая негативную регуляцию HNF4al в быстрорастущем варианте ГК.

Выявленные закономерности носят, по-видимому, общий характер, поскольку HNF4al и ряд регулируемых им генов имеют сходные паттерны экспрессии в различных модельных системах, а их репрессия четко коррелирует с дедифференцировкой клеток. Более того, нами впервые обнаружено подавление транскрипции HNF4al в образцах дедифференцированных ГК человека.

Экспрессия гена опухолевого маркера АФП в исследованных системах коррелирует с транскрипцией HNF4al и ряда других ГЯФ. Впервые показана способность HNF4al активировать экспрессию АФП. Методом соматической гибридизации установлено существование механизма негативной регуляции гена АФП, вероятно опосредованной репрессией HNF4al.

Впервые проведено исследование профилей экспрессии генов при прогрессии ГК методом гибридизации с кДНК микрочипами. Выявлены гены, потенциально определяющие ход опухолевой прогрессии, возможные маркеры гепатоканцерогенеза, новые HNF4al респонсивные гены и возможные эффекторы его экспрессии.

Практическая ценность работы

Изучение механизмов, определяющих прогрессию ГК, относится к фундаментальным исследованиям природы опухолевого роста и имеет прямое отношение к разработке методов терапии злокачественных опухолей.

Исследование содержит ряд новых экспериментальных подходов и теоретических концепций для изучения гепатоканцерогенеза. Результаты работы имеют прямое отношение к разработке методов диагностики и регрессии опухолей. Определение способов повышения уровня дифференцировки ГК может привести как к усилению чувствительности опухолей к терапии, так и к созданию новых методов их лечения. В ходе работы получены новые данные о механизмах регуляции онко-эмбрионального маркера АФП, широко используемого в клинической практике. Кроме того, в исследовании выявлены гены, потенциально являющиеся маркерами возникновения и прогрессии опухолей печени.

Модельные системы, охарактеризованные в настоящем исследовании, представляются многообещающей моделью для комплексного изучения механизмов, отвечающих за поддержание дифференцировочного статуса опухолей печени, и идентификации генов, определяющих прогрессию ГК.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Лазаревич, Наталия Леонидовна

выводы

1. Впервые выдвинута и обоснована гипотеза о том, падение уровней экспрессии гепато-специфических транскрипционных факторов является одним из ключевых событий при прогрессии опухолей печени.

2. Охарактеризована экспериментальная система прогрессии ГК, в которой из медленнорастущей дифференцированной ГК мыши in vivo одномоментно выщепился высоко злокачественный быстрорастущий вариант. Прогрессия ГК сопровождается утратой эпителиальной морфологии, приобретением способности к росту in vitro, снижением уровня дифференцировки и активацией теломеразы.

3. Впервые проведен полный анализ уровней экспрессии транскрипционных факторов, определяющих дифференцировку печени, при возникновении и прогрессии ГК in vivo. Единственным транскрипционным фактором, активирующимся на ранних этапах канцерогенеза, является эмбриональная форма HNF4a7. При прогрессии ГК произошло изменение экспрессии целого блока ткане-специфических транскрипционных факторо! (HNF4a, HNF1, vHNFl, HNF3y, HNF6, C/EBPa, FTF, GATA4, COUP-TFI, PXR).

4. Ре-экспрессия гена HNF4al приводит к частичной реверсии опухолевого фенотип? приобретению эпителиальной морфологии и восстановлению транскрипции гено кодирующих транскрипционные факторы и дифференцировочные маркеры.

5. Выявленные закономерности подтверждены при анализе независи) индуцированных ГК мышей и клонов крысиной гепатомы, отличающихся по уров] экспрессии онко-эмбрионального маркера АФП.

6. Экспрессия гена АФП и гепатоцитарных ядерных факторов в опухолях происхо i координировано, определяющую роль в установлении уровня транскрипции АФП иг{ негативная регуляция.

7. Репрессия гена HNF4al при прогрессии ГК происходит на транскрипциоь уровне. Впервые показано наличие в районе -1.4 т.п.н. /-363 п.н. последователь» определяющей негативную регуляцию гена HNF4.

8. Подавление экспрессии гена HNF4al впервые описано в де-дифференцирова ГК человека.

9. Методом гибридизации с кДНК микрочипами выявлены гены, потенщ-определяющие ход опухолевой прогрессии, возможные маркеры гепатоканцероге) новые HNF4-pecnoHCHBHbie гены.

10. Транскрипционный фактор HNF4al играет ключевую роль в интеграции специфических и общераспространенных сигнальных путей, обеспечга дифференцировку гепатоцитов, и может частично нормализовать злокачественный фе j I

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В этой работе нами впервые выдвинута и обоснована гипотеза о том, что одним из ключевых событий гепатоканцерогенеза является изменение экспрессии гепатоцитарных ядерных факторов (ГЯФ), регулирующих экспрессию большинства функциональных генов печени.

Мы провели характеристику биологических свойств новой экспериментальной модели прогрессии химически индуцированных перевиваемых ГК мышей, в которой дифференцированный медленнорастущий вариант in vivo дал начало быстрорастущей де-дифференцированной опухоли. Наблюдаемая прогрессия затрагивает фундаментальные свойства клеток печеночного происхождения, такие как морфологические, ростовые и функциональные характеристики. Прогрессия ГК мыши произошла скачкообразно и, вероятно, стала следствием единичного молекулярного события.

Опухолевая прогрессия ГК сопровождается глубокими изменениями в дифференцировочном статусе клетки. Координированное подавление активности целого блока гепато-специфических генов позволило предположить, что изменения, наблюдаемые при прогрессии ГК, могут быть вызваны нарушениями в экспрессии ключевых регуляторов транскрипции генов печени, каковыми являются гепатоцитарные ядерные факторы. В настоящее время четко показана определяющая роль этой группы факторов в формировании и дифференцировке нормальной печени, однако их значение при гепатоканцерогенезе практически не исследовалось. Важнейшим из гепато-специфических регуляторов транскрипции генов во взрослой печени представляется ядерный рецептор HNF4al (Duncan, 2003).

Действительно, при прогрессии ПС нами впервые выявлено подавление экспрессии целого блока гепато-специфических транскрипционных регуляторов, в том числе HNF4al. Ре-экспрессия этого гена в де-дифференцированной быстрорастущей ПС мыши вызывает частичную реверсию злокачественного фенотипа — восстановление транскрипции генов маркеров дифференцировки и установление эпителиальной морфологии. Таким образом, репрессия HNF4al стала причиной по крайней мере части существенных фенотипических изменений, произошедших в ходе прогрессии. В то же время получены свидетельства существования механизмов регуляции гена HNF4al, ответственных за его репрессию в ходе прогрессии ГК.

Вероятно, причиной прогрессии ГК стал фактор, находящийся в пути передачи сигнала выше, чем HNF4 al. Ни один из рассмотренных в настоящем исследовании гепато-специфических регуляторов транскрипции на эту роль не подходит. Методом гибридизации с микрочипами выявлены гены, потенциально определяющие утрату HNF4 al при прогрессии опухолей, и возможные маркеры злокачественного фенотипа. Описанная система представляется удобной моделью для дальнейшего анализа механизмов прогрессии ГК и описания закономерностей ткане-специфической регуляции транскрипции при гепатоканцерогенезе.

Важно отметить, что основные закономерности гепато-специфической экспрессии, выявленные на модели прогрессии ПС мышей, сохраняются в клонах крысиной гепатомы и химически индуцированных ПС мышей независимого происхождения. Более того, впервые описанное нами подавление транскрипции HNF4al в образцах ГК человека указывает на сохранение роли этого фактора в злокачественной трансформации гепатоцитов разной видовой специфичности. Данные о том, что экспрессия генов HNF4a и онко-эмбрионального маркера АФП во всех изученных системах регулируются координировано и впервые продемонстрированная способность HNF4al активировать транскрипцию АФП объясняют наблюдаемое в клинической практике отсутствие синтеза АФП в крайне де-дифференцированных вариантах ГК.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что HNF4a играет ключевую роль в интеграции гепато-специфических регуляторных путей и базовых механизмов контроля клеточной пролиферации и дифференцировки. Мы рассчитываем, что дальнейшее изучение свойств этого белка и особенностей его регуляции приведет к созданию новых диагностических и терапевтических подходов к лечению опухолей печени.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Лазаревич, Наталия Леонидовна, Москва

1. Абелев, Г.И. (1979). Эмбриональные антигены в опухолях. Анализ в системе альфа-фетопротеина. В кн.: "Опухолевый рост как проблема биологии развития", п/р В.И. Гельштейн, Наука, 148-173.

2. Абелев, Г.И. (2000). Механизмы дифференцировки и опухолевый рост. Биохимия, 65:127-138.

3. Абелев, Г.И. (2003). Дифференцировочные антигены в опухолях зависимость от механизмов канцерогенеза и прогрессии опухолей. Мол. Биол., 37: 1-8.

4. Варга, Е.В., Кустова, И.Ф., Лазаревич, Н.Л. (1999). Влияние ретиноевой кислоты на экспрессию АФП и гепатоцитарных ядерных факторов в клетках крысиной гепатомы. Мол. Биол., 33: 273-281.

5. Варга, Е.В., Черемнова, О.А., Овчинников, Д.А., Шапигузов, А.Ю., Кудрявцева, Е.И., Морозова, О.В., Энгельгардт, Н.В., Лазаревич, Н.Л. (2001). Экспрессия тканеспецифических генов при прогрессии гепатокарцином мыши. Генетика, 37: 803-810.

6. Глейберман, А.С. (1982). Синтез альфа-фетопротеина в первичных культурах гепатоцитов взрослых мышей. Бюлл. Эксп. Биол. Мед., 1: 55-58.

7. Копнин, Б.П. (2000). Мишени действия онкогенов и опухолевых супрессоров: ключ к пониманию базовых механизмов канцерогенеза. Биохимия, 65: 5-33.

8. Кудрявцева, Е.И., Морозова, О.В., Рудинская, Т.Д., Энгельгардт, Н.В. (2001). Нарушение межклеточных контактов и взаимодействия клеток с внеклеточным матриксом в быстрорастущей гепатокарциноме мышей. Арх. Патол., 4: 33-37.

9. Кустова, И.Ф., Варга, Е.В., Эрайзер, Т.Л. и Лазаревич, Н.Л. (2001). Подавление экспрессии гена альфа-фетопротеина в соматических гибридах АФП-положительного и АФП-отрицательного клонов крысиной гепатомы. Генетика, 37: 1330-1339.

10. Лазаревич, Н.Л. (1997). Регуляция экспрессии гена альфа-фетопротеина в клетках крысиных гепатом. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук. Москва.

11. Лазаревич, Н.Л. (2000). Молекулярные механизмы регуляции экспрессии гена альфа-фетопротеина. Биохимия, 65: 139-158.

12. Татаринов, Ю.С. (1964). Содержание эмбриоспецифического а-глобулина в сыворотке плода, новорожденного и взрослого человека в случаях первичного рака печени. Вопр. Мед. Химии, 2: 584-589.

13. Турусов, B.C. (1985). Экспериментальные модели друхстадийного канцерогенеза. Эксп. Онкол., 7: 5-12.

14. Урываева, И.В., Бродский, В. (1972). Особенности репродукции гепатоцитов при регенерации печени мыши. Цитология, 14: 1214-1228.

15. Урываева, И.В., Фактор, В.М. (1975). Фракция роста печени, ее состав по плоидности клеток и изменение при старении. Онтогенез 6: 458-465.

16. Чумаков, П.М (2000). Функция гена р53: выбор между жизнью и смертью. Биохимия, 65:34-47.

17. Энгельгардт, Н.В., Кудрявцева, Е.И., Морозова, О.В., Рудинская, Т.Д., Турусов, B.C. (2000). Скачкообразная прогрессия перевиваемой гепатокарциномы мышей, сопряженная с утратой полярности клеток. Арх. патол., 62: 24-29.

18. Энгельгардт, Н.В., Урываева, Н.В., Лазарева, М.Н. (1977). Локализация альфа-фетопротеина в регенерирующей печени мыши. Вестник АМН СССР, 3: 3-6.

19. Эрайзер, Т.Л., Хамзина, Л.С., Абелев, Г.И. (1987). Внутриклональная изменчивость в клеточной линии гепатомы McA-RH 7777, выявляемая анализирующим клонированием. Бюлл. Эксп. Биол. Мед., 3: 324-327.

20. Эрайзер, Т.Л. и Лазаревич, Н.Л. (1996). Трансфекция точечным давлением: быстрый и эффективный способ введения макромолекул в клетки млекопитающих. Молекулярная биология, 30:430-435.

21. Эрайзер, Т.Л., Язова, А.К., Полторанина, B.C., Куприна, Н.И., Шипова, Л.Я., Лункина, А.Б., Лазаревич, Н.Л. и Абелев, Г.И. (1996). Антиген, экспрессирующийся альтернативно альфа-фетопротеину в гепатомах крыс. Бюлл. Эксп. Биол. Мед., 122: 536-540.

22. Abelev, G.I. (1965). Antigenic structure of chemically-induced hepatomas. Progr. Exp. Tumor Res., 7: 104-157.

23. Abelev, G.I. (1971). Alpha-fetoprotein in ontogenesis and its association with malignant tumors. Adv. Cancer Res., 14:295-358.

24. Abelev, G.I. (1978). Experimental study of alpha-fetoprotein reexpression in liver regeneration and hepatocellular carcinomas. In: Cell Differentiation and Neoplasia, Saunders, G.G. (Ed.), Raven Press, New York, 257-269.

25. Abelev, G.L (1993). Alpha-fetoprotein biology. Sov. Sci. Rev. D. Physicochem. Biol., 11: 85-109.

26. Abelev, G.I. and Eraizer, T.L. (1999). Cellular aspects of alpha-fetoprotein reexpression in tumors. Seminars in Cancer Biology (Tumor Markers), 9: 95-104.

27. Abelev, G.I., Assecritova, I.V., Kraevsky, N.A., Perova S., Perevodchikova, N. (1967). Embrional serum alpha-globin in cancer patients: diagnostic value. Int. J. Cancer, 2: 551-558.

28. Abelev, G.I., Perova, S., Khramkova, N.I., Postnikova, Z.A., Irlin, I. (1963). Production of embrional alpha-globulin by the transplantable mouse hepatomas. Transplant. Bull., 1: 174-180.

29. Aberle, H., Bauer, A., Stappert, J., Kispert, A., Kemler, R. (1997). J3-catenin is a target for the ubiquitin-proteasome pathway. EMBO J., 16: 3797-3804.

30. Adachi, M, Suematsu, S., Suda, Т., Watanabe, D., Fukuyama, R, Ogasawara, J., Tanaka, T. (1996). Enhanced and accelerated lymphoproliferation in Fas-null mice. Proc. Natl. Acad Sci. USA, 93:2131-2136.

31. Adjei, A.A. (2001). Blocking oncogenic Ras signaling for cancer therapy. J. Natl. Cancer Inst., 93: 1062-1074.

32. Aguilar, F., Hussain, S.P., Cerutti, P. (1993). Aflatoxin B1 induces the transversion of G->T in codon 249 of the p53 tumor suppressor gene in human hepatocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 85868590.

33. Andrews, G.K., Dziadek, M, Tamaoki, T. (1982). Expression and methylation of the mouse alpha-fetoprotein gene in embryonic, adult and neoplastic tissues. J. Biol. Chem., 257: 5148-5153.

34. Ang, S.-L., Wierda, A., Wong, D., Stevens, K.A., Cascio, S., Rossant, J., Zaret, K.S. (1993). The formation and maintenance of the definitive endoderm lineage in the mouse: involvment of HNF3/forkhead proteins. Development, 119: 1301-1315.

35. Ang, S.L., Rossant J. (1994). HNF-3 beta is essential for node and notochord formation in mouse development. Cell, 78: 561-74.

36. Apergis, G.A., Crawford, N., Ghosh, D., Steppan, C.M., Vorachek, W.R., Wen, P., Locker, J. (1998). A novel nk-2-related transcription factor associated with human fetal liver and hepatocellular carcinoma. J. Biol. Chem., 273: 2917-2925.

37. Arceci RJ, King AA, Simon MC, Orkin SH, Wilson DB (1993). Mouse GATA-4: a retinoic acid-inducible GATA-binding transcription factor expressed in endodermally derived tissues and heart. Mol. Cell. Biol., 13: 2235-2246.

38. Ayer, D. (1999). Histone deacetylases: transcriptional repression with SINers and NuRDs. Trends Cell. Biol., 9:193-198.

39. Bach, I. and Yaniv, M. (1993). More potent transcriptional activators or a transdominant inhibitor of the HNF1 homeoprotein family are generated by alternative RNA processing. EMBO J., 12: 42294242.

40. Bailly, A., Torres-Padilla, M.E., Tinel, A.P., Weiss, M.C. (2001). An enhancer element 6 kb upstream of the mouse HNF4alphal promoter is activated by glucocorticoids and liver-enriched transcription factors. Nucleic Acids Res., 29: 3495-3505.

41. Barbacci, E., Reber, M., Ott, M.O., Breillat, C., Huetz, F., Cereghini, S. (1999). Variant hepatocyte nuclear factor 1 is required for visceral endoderm specification. Development, 126: 4795-4805.

42. Barth, A.I., Nathke, I.S., Nelson, W.J. (1997). Cadherins, catenins and APC protein: inteiplay between cytoskeletal complexes and signaling pathways. Curr. Opin. Cell Biol., 9: 683-690.

43. Batlle, E., Sancho, E., Franci, C., Dominguez, D., Monfar, M., Baulida, J., Garcia De Herreros, A. (2000). The transcription factor snail is a repressor of E-cadherin gene expression in epithelial tumour cells. Nat. Cell Biol., 2: 84-89.

44. Batsche, E., Muchardt, C., Behrens, J., Hurst, H.C., Cremisi, C. (1998). RB and c-Myc activate expression of the E-cadherin gene in epithelial cells through interaction with transcription factor AP-2. Mol. Cell. Biol., 18: 3647-3658.

45. Baumheuter, S., Courtois, G., Crabtree, G.P. (1988). A variant nuclear protein in dedifferentiated hepatoma cella binds to the same functional sequences in the (3-fibrinogene promoter as HNF-1. EMBO J., 7: 2485-2493.

46. Baumheuter, S., Mendel, D.B., Conley, P.B., Kuo, C.J., Turk, C., Graves, M.K., Edwards, C.A., Courtois, G., Crabtree, G.R. (1990). HNF1 shares three sequence motifs with the POU domain proteins and is identical to LF-B1 and APF. Genes Dev., 4: 372-379.

47. Becker, J., De Nechaud, В., Potter, V.R. (1976). Two rat hepatoma cell lines for studying the unballanced blocked ontogeny hypothesis. In: W.H.Fishman, W.H., Sell, S. (Eds.) Oncodevelopmental gene expression. Academic Press, NY, 259-270.

48. Belanger, L., Sylvie, R., Allard, D. (1994). New albumin gene 3' adjacent to the a 1-fetoprotein locus. J. Biol. Chem., 269: 5481-5484.

49. Belayew, A. and Tilghman, S.M. (1982). Genetic analysis of a-fetoprotein synthesis in the mouse. Mol. Cell. Biol., 2: 1427-1435.

50. Bello-Fernandez, C., Packham, G., Cleveland, J.L. (1993). The ornithine decarboxylase gene is a transcriptional target of c-Myc. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7804-7808.

51. Berenblum, I. (1941). The cocarcinogenic action of croton resin. Cancer Res., 1: 44-50.

52. Bergsland, E.K., Venook, A.P. (2000). Hepatocellular carcinoma. Curr. Opin. Oncol., 12: 357-361.

53. Bergstrand, C. G., Czar, В (1956). Demonstration of a new protein fraction in serum from the human fetus. Scand. J. Clin. Lab. Invest., 8: 174-179.

54. Blankenhorn, E.P., Duncan, R., Huppi, K., Potter, M. (1988). Chromosomal localization of the regulator of mouse a-fetoprotein, Afr-1. Genetics, 119: 687-691.

55. Blumenfeld, M., Maury, M., Chouard, Т., Yaniv, M. and Condamine, H. (1991). Hepatic nuclear factor 1 (HNF1) shows a wider distribution than products of its known target genes in developing mouse. Development, 113: 589-599.

56. Bodnar, A.G., Ouellette, M., Frolkis, M., Holt, S.E., Chiu, C.P., Morin, G.B., Harley, C.B., Shay, J.W., Lichtsteiner, S., Wright, W.E. (1998). Extension of life-span by introduction of telomerase into normal human cells. Science, 279: 349-352.

57. Bracke, M.E., Van Roy, F.M., Mareel, M.M. (1996). The E-cadherin/catenin complex in invasion• and metastasis. Curr. Top. Microbiol. Immunol., 213 : 123-161.

58. Brechot, C., Gozuacik, D., Murakami, Y. and Paterlini-Brechot, P. (2000). Molecular bases for the development of hepatitis В virus (HBV)-related hepatocellular carcinoma (HCC) Sem. Cancer Biol., 10:211-231.

59. Bressac B, Kew M, Wands J, Ozturk M (1991). Selective G to T mutations of p53 gene in hepatocellular carcinoma from southern Africa. Nature, 350:429-431.

60. Brooks, A.R., Blackhart, B.D., Haubold, K., Levy-Wilson, B. (1991). Characterization of tissue-specific enhancer elements in the second intron of the human apolipoprotein В gene. J. Biol. Chem., 266: 7848-7859.

61. Brooks, A.R., Levy-Wilson, B. (1992). Hepatocyte nuclear factor 1 and C/EBP are essential for the activity of the human apolipoprotein В gene second-intron enhancer. Mol. Cell. Biol., 12: 11341148.

62. Buendia, M.A. (2000). Genetics of hepatocellular carcinoma. Semin. Cancer Biol., 10: 185-200.

63. Bulla, G.A. and Fournier, R.E.K. (1994). Genetic analysis of a transcriptional activation pathway by using hepatoma cell variants. Mol. Cell. Biol., 14: 7086-7094.

64. Bulla, G.A. and Fournier, RE.K. (1992). Direct selection of hepatoma cell variants deficient in alpha 1-antitrypsin gene expression. Somat. Cell. Mol. Genet., 18: 361- 370.

65. Burgess-Beusse, B.L. and Darlington, G.J. (1998). C/EBPa is critical for the neonatalacute-phase response to inflammation. Mol. Cell. Biol., 18: 7269-7277.

66. Buzard, G. and Locker, J. (1990). The transcription control region of the rat a-fetoprotein gene. DNA sequence, 1: 33-48.

67. Cadoret, A., Ovejero, C., Saadi-Kheddouci, S., Souil, E., Fabre, M., Romagnolo, В., Kahn, A., Perret, C. (2001). Hepatomegaly in transgenic mice expressing an oncogenic form of beta-catenin. Cancer Res., 61: 3245-3249.

68. Calvisi, D.F., Factor, V.M., Loi, R., Thorgeirsson, S.S. (2001). Activation of beta-catenin during hepatocarcinogenesis in transgenic mouse models: relationship to phenotype and tumor grade. Cancer Res., 61: 2085-2091.

69. Camper, S.A. and Tilghman, S.M. (1989). Postnatal repression of the a-fetoprotein gene is enhancer independent. Genes Dev., 3: 537-546.

70. Cantwell, C.A., Sterneck, E., Johnson, P.F. (1998). Interleukin-6-specific activation of the C/EBP5 gene in hepatocyte is mediated by Stat3 and Spl. Mol. Cell. Biol., 18: 2108-2117.

71. Cascio, S. and Zaret, K.S. (1991). Hepatocyte differentiation initiates during endodermal-mesenchymal interactions prior to liver formation. Development, 113: 217-225.

72. Cereghini, S. (1996). Liver-enriched transcription factors and hepatocyte differentiation. FASEB J., 10: 267-282.

73. Cereghini, S., Blumenfeld, M., Yaniv, M. (1988). A liver-specific factor essential for albumin transcription differs detveen differentiated and dedifferntiated rat hepatoma cells. Genes Dev., 2: 957-974.

74. Cereghini, S., Ott, M.O., Power, S., Maury M. (1992). Expression patterns of vHNFl and HNF1 homeoproteins in early postimplantation embryos suggest distinct and sequential developmental roles. Development, 116: 783-797.

75. Chang, M.H., Chen, D.S., Hsu, H.C., Hsu, H.Y., Lee, C. Y. (1989). Maternal transmission of hepatitis В virus in childhood hepatocellular carcinoma. Cancer, 64: 2377-2380.

76. Chartier, F.L., Bossu, J.P., Laudet, V., Fruchart, J.C., Laine, B. (1994). Cloning and sequencing of cDNAs encoding the human hepatocyte nuclear factor 4 indicate the presence of two isoforms in human liver. Gene, 147: 269-272.

77. Chen, P.L., Riley, D.J., Chen, Y., Lee, W.H. (1996). Retinoblastoma protein positivly regulates terminal adiposyte differentiation through direct interaction with C/EBPs. Genes Dev. 10:2794-2804.

78. Chen, H., Egan, J. O., Chiu, J. F. (1997). Regulation and activities of alpha-fetoprotein. Crit. Rev. Eukaryot. Gene. Expr. 7,11-41.

79. Chevrette, M., Guertin, M., Turcotte, В., Belanger, L. (1987). The rat a-fetoprotein gene: characterization of the 5-flanking region and tandem organization with the albumin gene. Nucl. Acids Res., 15:1338-1339.

80. Chouard, Т., Blumenfeld, M., Bach, I., Vandekerhove, J., Ceregini, S., Yaniv, M. (1990). A distal dimerization domain iz essential for DNA-binding by the atypical HNF-1 homeodomain. Nucl. Acids• Res., 18: 5853-5863.

81. Cirillo, L., Zaret, K. (1999). An early developmental transcription factor complex that is more stable on nucleosome core particles than on free DNA. Mol. Cell, 4: 961-969.

82. Clark, K.L., Halay, E.D., Lai, E., Burley, S.K. (1993). Co-ciystal structure of the HNF3/fork head DNA-recognition motif resembles histone H5. Nature, 364:412-420.

83. Coffinier, C., Thepot, D., Babinet, C., Yaniv, M., Barra J. (1999). Essential role for the homeoprotein vHNFl/HNFlbeta in visceral endoderm differentiation. Development, 126:4785-4794.

84. Coffinier, C., Varra, J., Babinet, C., Yaniv, M. (1999a). Expression of the vHNFl/HNFlbeta homeoprotein gene during mouse organogenesis. Mech. Dev., 89: 211-213.

85. Coffinier, C., Gresh, L., Fiette, L., Tranche, F., Schutz, G., Babinet, C., Pontoglio, M., Yaniv, M., Barra, J. (2002). Bile system morphogenesis defects and liver dysfunction upon targeted deletion of HNFlbeta. Development, 129:1829-1838.

86. Colombo, M. (1999). Hepatitis С virus and hepatocellular carcinoma. Semin. Liver Dis., 19: 263269.

87. Cooke, N.E., McLeod, J.F., Wang, X.K., Ray, K. (1991). Vitamin D binding protein: genomic structure, functional domains, and mRNA expression in tissues. J. Steroid Biochem. Mol. Biol., 40: 787-793.

88. Cooke, N.E. (1986). Rat vitamin D binding protein. Determinationof the full-length primary structure from cloned cDNA. J. Biol. Chem., 261:3441-3450.

89. Costa, R.H., Grayson, D.R, Darnell, J.E., Jr. (1989). Multiple hepatocyte-enriched nuclear factors function in the regulation of transthyretin and al-antitiypsin genes. Mol. Cell. Biol., 9:1415-1425.

90. Courtois, C., Baumhuenter, S., Grabtree, G.R. (1988). Purified hepatocyte nuclear factor-1 interacts with a family of hepatocyte-specific promoters. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 78:4694-4698.

91. D'Arville, C.N., Nouri-Aria, K.T., Johnson, P., Williams, R. (1991). Regulation of insulin-like growth factor П gene expression by hepatitis В virus in hepatocellular carcinoma. Hepatology, 13: 310-315.

92. De Simone, V. and Cortese, R. (1991). Transcripional regulation of liver-specific gene expression. Curr. Opin. Cell. Biol., 3:960-965.

93. De Simone, V., De Magistris, L., Lazzaro, D., Gestner, J., Monaci, P., Nicosia, A., Cortese, R. (1991a). LFB3, a heterodimer forming homeoprotein of the LFB1 family, is expressed in specialized• epithelia. EMBO J., 5: 1435-1443.

94. De Souza, А.Т., Hankins, G.R., Washington, M.K., Orton, T.C., Jirtle, R.L. (1995). M6P/IGF2R gene is mutated in human hepatocellular carcinomas with loss of heterozygosity. Nat. Genet., 11: 447-449.

95. Dell, H. and Hadzopoulou-Cladaras, M. (1999). CREB-binding protein is a transcriptional coactivator for hepatocyte nuclear factor-4 and enhances apolipoprotein gene expression. J. Biol. Chem., 274: 9013-9021.

96. Deschartrette, J., Fouger-Deschartrette, C., Corcos, L., Schimke, R.T. (1985). Expression of mouse serum albumin geneintroduced into differentiated and dedifferentiated rat hepatoma cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 765-769.

97. Descombes, P. and Schibler, U. (1991). A liver inriched- transcriptional activator protein, LAP, and Ф transcriptional inhibitoiy protein, LIP, are translated from the same mRNA. Cell, 67: 569-579.

98. Deutsch, H.F. (1991). Chemistry and biology of alpha-fetoprotein. Adv. Cancer Res., 56:253-312.

99. Devereux, T.R., Anna, C.H., Foley, J.F., White, C.M., Sills, R.C., Barrett, J.C. (1999). Mutation of beta-catenin is an early event in chemically induced mouse hepatocellular carcinogenesis. Oncogene, 18: 4726-4733.

100. Dikstein, R., Factor, O., Shaul, Y. (1990). Hierarchic and cooperative binding of the rat liver nuclear protein C/EBP at the hepatitis В virus enhancer. Mol. Cell. Biol., 10: 4427-4430.

101. DiPersio, C.M., Jackson, D.A., Zaret, K.S. (1991). The extracellular matrix coordinately modulates liver transcription factors and hepatocyte morphology. Mol. Cell. Biol., 11: 4405-4414.

102. Dong, J.-M., Nordloh, P.W., Chiu, J.-F. (1989). The mechanism of the bidirectional regulation of the rat a-fetoprotein gene by glucocorticoid hormone. Mol. Cell. Endocrinol., 66: 109-114.

103. Drewes, Т., Senkel, S., Holewa, В., Ryffel G.U. (1996). Human hepatocyte nuclear factor 4 isoforms are encoded by distinct and differentially expressed genes. Mol. Cell. Biol. 16: 925-931.

104. Dufort, D., Schwartz, L., Harpal, K., Rossant, J. (1998). The transcription factor HNF3beta is required in visceral endoderm for normal primitive streak morphogenesis. Development, 125: 3015• 3025.

105. Dugaiczyk, A., Ruffner, D. E., Minghetti, P. P., Gibbs, P. E. M. (1985). Structure and evolution of the serum albumin gene family. In: Protides Biol. Fluids, Proc. 33 Collog., Oxford, 27-30.

106. Duncan, S.A, Nagy, A., Chan, W. (1997). Murine gastrulation requires HNF-4 regulated gene expression in the visceral endoderm: tetraploid rescue of Hnf-4(-/-) embryos. Development, 124:279-287.

107. Duncan, S.A, Navas, M.A., Dufort, D., Rossant, J., StofFel M. (1998). Regulation of a transcription factor network required for differentiation and metabolism. Science, 281(5377): 692-695.

108. Duncan, S. A. (2000). Transcriptional regulation of liver development. Developmental Dynamics, 219: 131-142.

109. Duncan, S.A. (2003). Mechanisms controlling early development of the liver. Mech Dev., 120: 1933.

110. Dziadek, M. (1978). Modulation of alpha-fetoprotein synthesis in the early post-implantation embrio. J. Embryol. Exp. Morph., 46: 135-146.

111. Edlund, M., Wikstrom, K., Toomik, R., Ek, P., Obrink, B. (1998). Characterization of protein kinase C-mediated phosphorylation of the short cytoplasmic domain isoform of C-CAM. FEBS, 425: 166170.

112. Emerson, J. A., Vacher, J., Cirillo, L. A., Tilghman, S. M., Tyner, A. L. (1992). The zonal expression of alpha-fetoprotein transgenes in the livers of adult mice. Dev. Dyn., 195,55-66.

113. Eraiser, T.L., Khamzina, L.S. (1988). Phenotypic variability of cultured rat hepatoma cell population in respect to alpha-fetoprotein synthesis. Int. J. Cancer, 42: 633-637.

114. Eraiser, T.L., Yazova, A.K., Poltoranina, V.S., Kuprina, N.I., Karamova, E.R., Shipova, L.Ya., Lazarevich, N.L., Abelev, G.I. (1998). Inducible protein in rat hepatomas with expression alternative to alpha-fetoprotein. Int. J. Cancer, 75: 371-378.

115. Evans, R.M (1988). The steroid and thyroid hormon receptor superfamily. Science, 240: 889-895.

116. Faber, E. (1980). The sequential analysis of liver cancer induction. BBA, 605: 149-166.

117. Faust, D.M., Boshart, M., Imaizumi, S.T., Schutz, G., Weiss, M.C. (1994). Constancy of expression of the protein kinase A regulatory subunit R1 a in hepatoma cell lines of different phenotypes. Cell Growth Differ., 5:47-53.

118. Fausto, N. and Webber, E.M. (1993). Control of liver growth. Critical Reviews in Eukaiyotic Gene Expression, 3:117-135.

119. Fausto, N. (2000). Liver regeneration. J. Hepatol., 32: 19-31.

120. Feitelson, M., Sun, В., Tufan, N.L.S., Liu, J., Pan, J., Lian, Z. (2002). Genetic mechanisms of hepatocarcinogenesis. Oncogene, 21: 2593-2604.

121. Feuerman, M.H., Godbout, R., Ingram, R.S., Tilghman S. M. (1989). Tissue-specific transcription of the mouse a-fetoprotein gene promoter is depend on HNF-1. Mol. Cell. Biol., 9: 4204-4212.

122. Flodby, P., Barlow, C., Kylefjord, H., Ahrlund-Richter, L., Xanthopoulos, K.G. (1996). Increased hepatic cell proliferation and lung abnormalities in mice deficient in CCAAT/enhancer binding protein alpha. J. Biol. Chem., 271: 24753-24760.

123. Friend, S.H., Bernards, R., Rogelij, S., Weinberg, R.A., Rapaport, J.M., Albert, D.M., Dryja, T.P. (1986). A human DNA segment with properties of the gene that predisposes to retinoblastoma and osteosarcoma. Nature, 323:643-646.

124. Fujimori, M., Tokino, Т., Hino, O., Kitagawa, Т., Imamura, Т., Okamoto, E., Mitsunobu, M., Ishikawa, Т., Nakagama, H., Harada, H. et al. (1991). Allelotype study of primary hepatocellular carcinoma. Cancer Res., 51: 89-93.

125. Fujimoto, Y., Hampton, L.L., Wirth, P.J., Wang, N.J., Xie, J.P., Thorgeirsson, S.S. (1994). Alterations of tumor suppressor genes and allelic losses in human hepatocellular carcinomas in China. Cancer Res., 54: 281-285.

126. Fukuda-Taira, S. (1981). Hepatic induction in the avian embryo: specificity of reactive endoderm and inductive mesoderm. J. Embiyol. Exp. Morphol., 63: 111-125.

127. Galarneau, L., Pare, J.-F., Allard, D., Hamel, D., Levesque, L., Tugwood, J.D., Green, S., Belanger, L. (1996). The a-fetoprotein locus is activated by a nuclear receptor of the Drosophila Ftz-Fl family. Mol. Cell. Biol., 16: 3853-3865.

128. Gale, M. Jr., Kwieciszewski, В., Dossett, M., Nakao, H., Katze, M.G. (1999). Antiapoptotic and oncogenic potentials of hepatitis С virus are linked to interferon resistance by viral repression of the PKR protein kinase. J. Virol., 73: 6506-6516.

129. Garcia, A.D., Ostapchuk, P., Hearing, P. (1993). Functional interaction of nuclear factors EF-C, HNF-4, and RXR alpha with hepatitis В virus enhancer I. J. Virol., 67: 3940-3950.

130. Ghosh, A.K., Steele, R., Meyer, K., Ray, R., Ray, R.B. (1999). Hepatitis С virus NS5A protein modulates cell cycle regulatory genes and promotes cell growth. J. Gen. Virol., 80: 1179-1183.

131. Giannelli G, Fransvea E, Marinosci F, Bergamini C, Colucci S, Schiraldi O, Antonaci S. (2002). Transforming growth factor-betal triggers hepatocellular carcinoma invasiveness via alpha3betal integrin. Am J Pathol., 161:183-193.

132. Gibbs, P. E., Witke, W. F., Dugaiczyk, A. (1998). The molecular clock runs at different rates among closely related members of a gene family. J. Mol. Evol., 46: 552-561.

133. Giroldi, L.A., Bringuier, P.P., de Weijert, M., Jansen, C., van Bokhoven, A., Schalken, J.A. (1997). Role of E boxes in the repression of E-cadherin expression. Biochem. Biophys. Res. Commun., 241: 453-458.

134. Gleiberman A.S., Sharovskaya, Yu.Yu., Chailakhjan, L.M. (1989). "Contact inhibition" of a-fetoprotein synthesis and junctional communication in adult mouse hepatocyte culture. Exp. Cell Res., 184: 228-234.

135. Godbout, R., Ingram, R., Tilghman, S. M. (1988). Fine-structure mapping of the three mouse a-fetoprotein gene enhancers. Mol. Cell. Biol., 8: 1169-1178.

136. Golubovskaya, V.M., Presnell, S.C., Hooth, M.J., Smith, G.J., Kaufmann W.K. (1997). Expression of telomerase in normal and malignant rat hepatic epithelia. Oncogene, 15:1233-1240.

137. Gorin, M.B., Cooper, D.L., Eiferman, F., Van de Rijn, P., Tilghman, S.M. (1981). The evolution of alpha-fetoprotein and albumin. I. The structures of the alpha-fetoprotein and albumin mRNA in the mouse. J. Biol. Chem., 256:1954-1959.

138. Gotoh, M., Sakamoto, M., Kanetaka, K., Chuuma, M., Hirohashi, S. (2002). Overexpression of osteopontin in hepatocellular carcinoma. Pathol Int 52: 19-24.

139. Greenbaum, L.E., Li, W., Cressman, D.E., Peng, Y., Ciliberto, G., Poli, V., Taub R. (1998). CCAAT enhancer- binding protein beta is required for normal hepatocyte proliferation in mice after partial hepatectomy. J. Clin. Invest., 102: 996-1007.

140. Gregory, P., Horz, W. (1998). Life with nucleosomes: chromatin remodeling in gene regulation. Curr. Opin. Cell Biol., 10: 339-345.

141. Groupp, E.R., Crawford, N., Locker, J. (1994). Characterization of the distal alpha-fetoprotein enhancer, a strong, long distance, liver-specific activator. J. Biol. Chem., 269: 22178-22187.

142. Guan, X. J., Arhin, G., Leung, J., Tilghman, S. M. (1996). Linkage between vitamin D-binding protein and alpha-fetoprotein in the mouse. Mamrn. Genome, 7: 103-106.

143. Guazzarotti, L., Bartolotta, E., Chiarelli, F. (1999). Maturity-onset diabetes of the young (MODY): a new challenge for pediatric diabetologists. J. Pediatr. Endocrinol. Metab., 12:487-497.

144. Gumbiner, B.M. (1995). Signal transduction of beta-catenin. Curr. Opin. Cell Biol., 7: 634-640.

145. Guo, W., Chen, M., Yen, T.S., Ou, J.H. (1993). Hepatocyte-specific expression of the hepatitis В virus core promoter depends on both positive and negative regulation. Mol. Cell. Biol., 13:443-448.

146. Hadzopoulou-Cladaras, M., Kistanova, E., Evagelopoulou, C., Zeng, S., Cladaras, C., Ladias, J.A. (1997). Functional domains of the nuclear receptor hepatocyte nuclear factor 4. J. Biol. Chem., 272: 539-550.

147. Hadzopoulou-Cladaras, M., Kistanova, E., Evagelopoulou, С., Zeng, S., Cladaras, C., Ladias, J.A. (1996). Functional domain of the HNF4. J. Biol. Chem., 272: 539-550.

148. Hahn, W.C. and Weinberg, R.A. (2002). Rules for making human tumor cells. N. Engl. J. Med., 347: 1593-1603.

149. Hall, A.J., Chuansumrit, A., Peake, I.R., Winship, P.R. (1994). A single base pair deletion in the promoter region of the factor IX gene is associated with haemophilia B. Thromb. Haemost., 72:799-803.

150. Hall, R.K., Sladek, F.M., Granner D.K. (1995). The orphan receptors COUP-TF and HNF-4 serve as accessory factors required for induction of phosphoenolpyruvate carboxykinase gene transcription by glucocorticoids. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 412-416.

151. Hamilton, S.R., Aaltonen, L.A. (eds). Pathology and genetics of tumours of the digestive system. Lyon, IARC Press, 2000.

152. Hammer, R.E., Krumlauf, R., Camper, S.A., Brinster, R.L., Tilghman, S.M. (1987). Diversity of alphafetoprotein gene expression in mice is generated by a combination of separate enhancer elements. Science, 235:53-58.

153. Hanahan, D. and Weinberg, R.A. (2000). The hallmarks of cancer. Cell, 100: 57-70.

154. Hahn W.C., and Weinberg, R. A. (2002). Modelling the molecular circuitry of cancer. Nat. Rev. Cancer, 2: 331-341.

155. Hansen, L.P. and Crabtree, G.R. (1993). Regulation of the HNF- 1 homeodomain proteins by DCoH. Curr. Opin. Genet. Dev., 3:246-253.

156. Hard, Т., Kellenbach, E., Boelens, R., Maler, B.A., Dalhman, K., Freedman, L.P., Carlstedt-Duke, J., Yamamoto, K.R., Gustafsson, J.-A., Kaptein, R. (1990). Solution structure of the glucocorticoid receptor DNA-binding domain. Science, 249: 157-160.

157. Harnish, D.C., Malik, S., Kilbourne, E., Costa, R., Karathanasis S.K. (1996). Control of apolipoprotein Al gene expression through synergistic interactions between hepatocyte nuclear factors 3 and 4. J. Biol. Chem., 271: 13621-13628.

158. Hata, K. (1995). On the right track. The integrated IEC campaign succeeds in recruiting many acceptors in a fishing commune. Integration, 45: 14-16.

159. Hatzis, P., Talianidis, I. (2001). Regulatory mechanisms controlling human hepatocyte nuclear factor 4alpha gene expression. Mol Cell Biol, 21: 7320-7330.

160. Hayashi, Y., Chan, J., Nakabayashi, H., Hashimoto, Т., Tamaoki, T. (1992). Identification and characterization of two enhancers of the human albumin gene. J. Biol. Chem., 267: 14580-14585.

161. Hayhurst, G.P., Lee, Y.H., Lambert, G., Ward, J.M., Gonzalez F.J. (2001). Hepatocyte nuclear factor 4alpha (nuclear receptor 2A1) is essential for maintenance of hepatic gene expression and lipid homeostasis. Mol. Cell. Biol., 21:1393-1403.

162. Hiemisch, H., Schutz, G., Kaestner, K.H. (1997). Transcriptional regulation in endoderm development: characterization of an enhancer controlling Hnf3g expression by transgenesis and targeted mutagenesis. EMBO J., 16:3995-4006.

163. Hemavathy, K., Ashraf, S.I., Ip, Y.T. (2000). Snail/slug family of repressors: slowly going into the fast lane of development and cancer. Gene, 257: 1-12.

164. Henderson, A.J., Calame, K.L. (1997). CCAAT/enhancer binding protein (C/EBP) sites are required for HIV-1 replication in primary macrophages but not CD4(+) T cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 8714-8719.

165. Henriette, M.-F., Gabant, P., Dreze, P.-L., Szpirer, C., Szpirer, J. (1997). Negative regulation of the a-foetoprotein genein fibroblasts: identification and characterization of cis and trans elements. Folia Biologica, 43: 5-13.

166. Hermann-LeDenmat, S., Werher, M., Sentenae,A., Thuriaux, P. (1994). Suppression of yeast RNA polymerase III Mutations by FHL1, a gene coding for a fork head protein involved in rRNA• processing. Mol. Cell. Biol., 14: 2905-2913.

167. Hertz, R., Magenheim, J., Berman, I., Bar-Tana, J. (1998). Fatty acyl-CoA thioesters are ligands of hepatic nuclear factor-4alpha. Nature, 392: 512-516.

168. Hildt, E., Hofschneider, P.H., Urban, S. (1996). The role of hepatitis В virus (HBV) in the development of hepatocellular carcinoma. Sem. Virology, 7: 333-347.

169. Hogan, B.L., Taylor, A., Adamson, E. (1981). Cell interactions modulate embrional carcinoma cell differentiation into visceral endoderm. Nature, 291: 235-237.

170. Holewa, В., Zapp, D., Derves, Т., Senkel, S., Ruffel, G.U. (1997). HNF4beta, a new gene of HNF4family with distinct activation and expression profiles in oogenesis and embryogenesis of Xenopus laevis. Mol. Cell. Biol., 17:687-694.

171. Hsu, I.C., Metcalf, R.A., Sun, Т., Welsh, J.A., Wang,N.J., Harris, C.C. (1991). Mutational hotspot in the p53 gene in human hepatocellular carcinomas. Nature, 350: 427-428.

172. Huang, H., Fujii, H., Sankila, A., Mahler-Araujo, B.M., Matsuda, M., Cathomas, G., Ohgaki, H. (1999). Beta-catenin mutations are frequent in human hepatocellular carcinomas associated with hepatitis С virus infection. Am. J. Pathol., 155: 1795-1801.

173. Huang, J., Kwong, J., Sun, E.C., Liang, T.J. (1996). Proteasome complex as a potential cellular ш target of hepatitis В virus X protein. J. Virol., 70: 5582-5591.

174. Jackson, D.A., Rowader, K.E., Stevens, K., Jiang, C., Milos, P. and Zaret, K.S. (1993). Modulation of liver-specific transcription by interactions between HNF3 and NF1/CTF proteins binding in close apposition. Mol. Cell. Biol., 13: 2401-2410.

175. Jagodzinski, L.L., Sargent, T.D., Yang, M., Glackin, C., and Bonner, J. (1981). Sequence homology between RNAs encoding rat alpha-fetoprotein and rat serum albumin. Prot. Natl. Acad. Sci. USA. 78: 3521-3525.

176. Jensen, M.R., Factor, V.M., Fantozzi, A., Helin, K., Huh, C.G., Thorgeirsson, S.S. (2003). Reduced hepatic tumor incidence in cyclin Gl-deficient mice. Hepatology, 37: 862-70.

177. Jiang, G. and F.M. Sladek (1997). The DNA binding domain of hepatocyte nuclear factor 4 mediates cooperative, specific binding to DNA and heterodimerization with the retinoid X receptor alpha. J. Biol. Chem., 272: 1218-1225.

178. Jin, D.K., Vacher, J., Feuerman, M.H. (1998). a-Fetoprotein gene sequences mediating Afr2regulation during liver regeneratio. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 8767-8772.

179. Jin, J.R., Wen, P., Locker, J. (1995). Enhancer sharing in a plasmid model containing the alpha-fetoprotein and albumin promoters. DNA Cell Biol., 14: 267-272.

180. Johnson, P.F., Landschulz, W.H., Graves, B.J., McKnight, S.L. (1987). Identifacation of a rat liver nuclear protein that binds to the enhancer core element of three animal viruses. Genes Dev., 1: 133146.

181. Jung, J., Zheng, M., Goldfarb, M., Zaret, K.S. (1999). Initiation of mammalian liver development from endoderm by fibroblast growth factors. Science, 284:1998-2003.

182. Kaestner, K.H., Hiemisch, H., Schutz G. (1998). Targeted disruption of the gene encoding hepatocyte nuclear factor 3gamma results in reduced transcription of hepatocyte-specific genes. Mol. Cell. Biol., 18: 4245-4251.

183. Kaestner, K.H., Katz, J., Liu, Y., Drucker, D.J., Schutz G. (1999). Inactivation of the winged helix transcription factor HNF3alpha affects glucose homeostasis and islet glucagon gene expression in vivo. Genes Dev., 13:495-504.

184. Kaestner, K.H. (2000). The hepatocyte nuclear factor 3 (HNF3 or FOXA) family in metabolism. Trends. Endocrinol. Metab., 11:281-285.

185. Kajiyama, Y., Tian, J., and Locker J (2002). Regulation of alpha-fetoprotein expression by Nkx2.8. Mol. Cell. Biol., 22: 6122-6130.

186. Kalkuhl, A., Kaestner, K., Buchmann, A., and Schwarz, M. (1996). Expression of hepatocyte-enriched nuclear transcription factors in mouse liver tumours. Carcinogenesis, 17: 609-612.

187. Katagiri, Т., Nakamura, Y., Miki, Y. (1996). Mutations in the BRCA2 gene in hepatocellular carcinomas. Cancer Res. 56: 4575-4577.

188. Keller, G.M. (1995). In vitro differentiation of embryonic stem cells. Curr. Opin. Cell Biol., 7: 862869.

189. Khramkova, N.I., Postnikova, Z.A., Abelev, G.I. (1963). Antigenic structure of mouse hepatomas Ш. A study of organospecific liver antigens in the hepatomas with the aid of specific antibodies. Neoplasma, 10: 127-131.

190. Kim, C.M., Koike, К., Saito, I., Miyamura, Т., Jay, G. (1991). HBx gene of hepatitis В virus induces liver cancer in transgenic mice. Nature, 351: 317-320.

191. Kliever, S.A., Umesono, K., Mangelsdorf, D.J., and Evans, R.M. (1992). Retinoid X receptor interacts with nuclear receptors in retinoic acid, thyroid hormone and vitamin D3 signalling. Nature, 355: 446-449.

192. Knowles, B.B., Howe, C.C., and Aden,D.P. (1980). Human hepatocellular carcinoma cell lines • secrete the major plasma proteins and hepatitis В surface antigen. Science, 209: 497-499.

193. Koike, K., Moriya, K., lino, S., Yotsuyanagi, H., Endo, Y., Miyamura, Т., Kurokawa, K. (1994). High-level expression of hepatitis В virus HBx gene and hepatocarcinogenesis in transgenic mice. Hepatology, 19: 810-819.

194. Kojiro M. (1997). Pathology of hepatocellular carcinoma; In: Okuda K, Tabor E (eds): Liver Cancer. New York, Churchill Livingstone, 1997, pp 165-187.

195. Koutsourakis, M., Langeveld, A., Patient, R., Beddington, R., Grosveld, F. 1999. The transcription factor GATA6 is essential for early extraembryonic development. Development, 126: 723-732.

196. Kritis, A.A., Argyrokastritis, A., Moschonas, N.K., Power, S., Katrakili, N., Zannis, V.I., Cereghini, S., Talianidis, I. (1996). Isolation and characterization of a third isoform of human hepatocyte nuclear factor 4. Gene, 173:275-280.

197. Kritis, A.A., Ktistaki, E., Barda, D., Zannis, V.I., and Talianidis, I. (1993). An indirect negative autoregulatory mechanism involved in hepatocyte nuclear factor-1 gene expression. Nucleic Acids Res., 21: 5882-5889.

198. Krutovskikh, V.A., Oyamada, M., Yamasaki, H. (1991). Sequential changes of gap-junctional щ intercellular communications during multistage rat liver carcinogenesis: direct measurement of communication in vivo. Carcinogenesis 12: 1701-1706.

199. Ktistaki, E. (1995). Recruitment of hepatosyte nuclear factor 4 into specific intranuclear compartmens depends on tyrosin phosphorylation that affects its DNA-binding and transactivation potencial. Proc. Natl. Acad. Sci., 92: 9876-9880.

200. Ktistaki, E. and Talianidis, I. (1997). Chicken ovalbumin upstream promoter transcription factors act as auxiliary cofactors for hepatocyte nuclear factor 4 and hepatic gene expression. Mol. Cell. Biol., 17:2790-2797.

201. Kuo, C.J., Conley, P.B., Chen, L., Sladek, F.M., Darnell, J.E., Jr., and Crabtree, G.R. (1992). A transcriptional hierarchy involved in mammalian cell-type specification. Nature, 355: 457-461.

202. Kuo, C.T., Morrisey, E.E., Anandappa, R., Sigrist, K., Lu, M.M., Parmacek, M.S., Soudais, C., Leiden, J.M. (1997). GATA4 transcription factor is required for ventral morphogenesis and heart tube formation. Genes Dev., 11: 1048-1060.

203. Maeda, Y., Seidel, S.D., Wei, G., Liu, X., Sladek, F.M. (2002). Repression of hepatocyte nuclear factor 4alpha tumor suppressor p53: involvement of the ligand-binding domain and histone deacetylase activity. Mol. Endocrinol., 16: 402-410.

204. Majumder, M, Ghosh, A.K., Steele, R., Zhou, X.Y., Phillips, N.J., Ray, R., Ray, R.B. (2002). Hepatitis С virus NS5A protein impairs TNF-mediated hepatic apoptosis, but not by an anti-FAS antibody, in transgenic mice. Virology, 294: 94-105.

205. Mao, T.L., Chu, J.S., Jeng, Y.M., Lai, P.L., Hsu, H.C. (2001). Expression of mutant nuclear beta-catenin correlates with non-invasive hepatocellular carcinoma, absence of portal vein spread, and good prognosis. J. Pathol., 193: 95-101.

206. Massague, J., and Chen, Y.G. (2000). Controlling TGF-b signaling. Genes Dev., 14: 627-644.

207. Mathew, J.K., Knoll, B.J., Pilla, A., Durham, D., Sell, S. (1994). Discrete cell-type specific enhancer region 5' of the rat alpha-fetoprotein gene: identification of a highly active distal enhancer. J. of Tumor Marker Oncology, 9:21-28.

208. Matsuda, Y., Ichida, Т., Matsuzawa, J., Sugimura, K., Asakura, H. (1999). pl6 (INK4) is inactivatedby extensive CpG methylation in human hepatocellular carcinoma. Gastroenterology, 116: 394-400.

209. McPherson, C.E., Shim, E.-Y., Friedman, D.S., and Zaret, K.S. (1993). An active tissue-specific enhancer and bound transcription factors existing in a precisely positioned nucleosomal array. Cell, 75:387-398.

210. Mendel, D.B., Hansen, L.P., Graves, M.K., Conley, P.B., and Crabtree, G.R. (1991). HNF-1 and HNF-1 share dimerizatoin and homeo domains, but not activation domains, and form heterodimers in vitro. Genes Dev., 5: 1042-1056.

211. Mendel, D.B., Khavari, P.A., Conley, P.B., Graves, M.K., Hansen, L.P., Admon, A., and Crabtree, G.R. (1992). Characterization of a cofactor that regulates dimerization of a mammalian homeodomain protein. Science, 254: 1762-1767.

212. Michalopoulos, G.K, DeFrances, M.C. (1997). Liver regeneration. Science, 276: 60-66.

213. Millonig, J.H., Emerson, J.A., Levorse, J.M., and Tilghman, S.M. (1995). Molecular analysis of the distal enhancer of the mouse a-fetoprotein gene. Mol. Cell. Biol., 15: 3848-3856.

214. Miquerol, L., Lopez, S., Carrier, N., Tulliez, M., Raymondjean, M., Kahn, A. (1994). Expression of the L-type pyruvate kinase gene and the hepatocyte nuclear factor 4 transcription factor in exocrine and endocrine pancreas. J Biol Chem, 269: 8944-8951.

215. Molkentin, J., Lin, Q., Duncan, S., Olson, E. (1997). Requirement of the transcription factor GATA4 for heart tube formation and ventral morphogenesis. Genes Dev., 11: 1061-72.

216. Molkentin, J.D. (2000). The zinc finger-containing transcription factors GATA-4, -5, and -6. Ubiquitously expressed regulators of tissue-specific gene expression. J. Biol. Chem., 275:38949-38952.

217. Morinaga, Т., Yasuda, H., Hashimoto, Т., Higashido, K., and Tamaoki, T. (1991). A human a-fetoprotein enhancer-binding protein, ATBF-1, contains four homeodomeins and seventeen zinc fingers. Mol. Cell. Biol., 11: 6041- 6049.

218. Morrisey, E.E., Ip, H.S., Lu, M.M., Parmacek, M.S. (1996). GATA-6: a zinc finger transcription factor that is expressed in multiple cell lineages derived from lateral mesoderm. Dev. Biol., 177: • 309-322.

219. Morrisey, E.E., Tang, Z., Sigrist, K., Lu, M.M., Jiang, F., Ip, H.S., Parmacek, M.S. (1998). GATA6 regulates HNF4 and is required for differentiation of visceral endoderm in the mouse embryo. Genes Dev., 12: 3579-3590.

220. Mueller, C.R. (1992). The down-regulation of albumin transcription during regeneration is due to the loss of HNF-1 and the D-site transcription factors. DNA. Cell. Biol., 11: 559-566.

221. Mueller, C.R., Maire, P., and Schibler, U. (1990). DBP, a liver inriched-transcriptional activator, is expressed late in ontogeny and its tissue specificity is determined posttranscriptionally. Cell, 61: 279-291.

222. Murakami, Y., Hayashi, K., Hirohashi, S., Sekiya, T. (1991). Aberrations of the tumor suppressor p53 and retinoblastoma genes in human hepatocellular carcinomas. Cancer Res., 51: 5520-5525.

223. Mutoh, K., Wakuri, H., Liu, В., Seno, M., Taniguchi, K. (1998). Electron microscopic study of intercalated duct cells in the chicken pancreatic islet and effects of tolbutamide administration. Okajimas Folia Anat. Jpn., 75:231-237.

224. Nahon, J. L. (1987). The regulation of albumin and a-fetoprotein gene expression in mammals. Biochemie, 69: 445-459.

225. Nakabayashi, H., Hashimoto, Т., Miyao, Y., Tjong, К. K., Chan, J., and Tamaoki, T. (1991). A position-depend silencer plays a major role in repressing alpha-fetoprotein expressoin in human hepatoma. Mol. Cell. Biol., 11: 5885-5893.

226. Nakhei, H., Lingott, A., Lemm, I., Ryffel, G.U. (1998). An alternative splice variant of the tissue specific transcription factor HNF4alpha predominates in undifferentiated murine cell types. Nucleic Acids Res., 26: 497-504.

227. Nawata, H., Yanase, Т., Oba, К., Ichino, I., Saito, M., Goto, K., Ikuyama, S., Sakai, H., Takayanagi, R. 1999 Human Ad4BP/SF-l and its related nuclear receptor. J. Steroid. Biochem. Mol. Biol., 69: 323-328.

228. Nemer, G., Nemer, M. (2003). Transcriptional activation of BMP-4 and regulation of mammalian organogenesis by GATA-4 and -6. Dev. Biol., 254: 131-148.

229. Nieto, M.A. (2002). The snail superfamily of zinc-finger transcription factors. Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 3: 155-166.

230. Nitta, M., Ku, S., Brown, C., Okamoto, A.Y., Shan, B. (1999). CPF: an офЬап nuclear receptor that regulates liver-specific expression of the human cholesterol 7alpha-hydroxylase gene. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96: 6660-6665.

231. Nuclear Receptors Nomenclature Committee (1999). A unified nomenclature systems for the nuclear receptor superfamily. Cell, 97: 161-163.

232. Okada, C.Y., Rechsteiner, M. (1982). Introduction of macromolecules into cultured mammalian cells by osmotic lysis of pinocytic vesicles. Cell, 29:33-41.

233. Ochoa, A., Bovard-Houppermans, S., and Zakin, M.M. (1993). Human apolipoprotein A-IV gene expression is modulated by members of the nuclear hormone receptor superfamily. Biochim. Biophys. Acta., 1210: 41-47.

234. Oda, Т., Tsuda, H., Sakamoto, M., Hirohashi, S. (1992). Different mutations of the p53 gene in nodule-in-nodule hepatocellular carcinoma as a evidence for multistage progression. Cancer Lett., 83: 197-200.

235. Ogden, S.K., Lee, K.C., Barton, M.C. (2000). Hepatitis В viral transactivator HBx alleviates p53-mediated repression of alpha-fetoprotein gene expression. J. Biol. Chem., 275: 27806-27814.

236. Ogden, S.K., Lee, K.C., Wernke-Dollries, K., Stratton, S.A., Aronow, В., Barton, M.C. (2001). p53 targets chromatin structure alteration to repress alpha-fetoprotein gene expression. J. Biol. Chem., 276: 42057-42062.

237. Omori, Y., Mesnil, M., Yamasaki, H. (1996). Connexin 32 mutations from X-linked Charcot-Marie-Tooth disease patients: functional defects and dominant negative effects. Mol. Biol. Cell. 7: 907-916

238. Opdecamp, K., Rivire, M., Molne, M., Szpirer, J., and Szpirer, C. (1992). Methylation of an alpfa-fetoprotein gene intragenic site modulates gene activity. Nucl. Acids Res., 20: 171-178.

239. Osada, Т., Sakamoto, M., Ino, Y., Iwamatsu, A., Matsuno, Y., Muto, Т., Hirohashi, S. (1996). E-cadherin is involved in the intrahepatic metastasis of hepatocellular carcinoma. Hepatology, 24: 1460-1467.

240. Ott, M.-0., Rey-Campos, J., Cereghini, S., and Yaniv, M. (1991). vHNF-1 is expressed in epithelial cells of distinct embrionic origin during development and preceeds HNF-1 expression. Mech. Devel., 36: 47-58.

241. Ozaki, I., Mizuta, Т., Zhao, G., Yotsumoto, H., Нага, Т., Kajihara, S., Hisatomi, A., Sakai, Т., Yamamoto, K. (2000). Involvement of the Ets-1 gene in overexpression of matrilysin in human hepatocellular carcinoma. Cancer Res., 60: 6519-6525.

242. Ozturk, M. (1994). Chromosomal rearrangements and tumor suppressor genes in primary liver cancer, In Primary Liver Cancer: Etiological and Progression Factors (Brechot C, ed.) pp. 269-281. CRC Press, Boca Raton.

243. Pachnis, V., Belayew, A., and Tilghman, S.M. (1984). Locus unlinked to a-fetoprotein under the control of the murine raf and 7?//genes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 5523-5527.

244. Pani, L., Quian, X.B., Clevidence, D., and Costa, R.H. (1992a). The restricted promoter activity of the liver transcription factor hepatocyte nuclear factor 3|3 involves a cell-specific factor and positive autoactivation. Mol. Cell. Biol., 12: 552-562.

245. Patient, R.K., McGhee, J.D. (2002). The GATA family (vertebrates and invertebrates). Curr. Opin. Genet. Dev., 12:416-422.

246. Paulweber, В., Sandhofer, F., and Levy-Wilson, B. (1993). The mechanism by which the human apolipoprotein В gene reducer operates involves blocking of transcriptional activation by hepatocyte nuclear factor 3. Mol. Cell. Biol., 13: 1534-1546.

247. Pereira, F.A., Qiu, Y., Zhou, G„ Tsai, M.J., Tsai, S.Y. 1999. The orphan nuclear receptor COUP-TFII is required for angiogenesis and heart development. Genes Dev., 13:1037-1049.

248. Petropoulos, С. Т., Yaswen, P., Panzica, M., and Fausto, N. (1985). Methylation of the alpha-fetoprotein gene in cell populations isolated from rat livers during carcinogenesis. Nucl. Acids Res.,13:8105-8118.

249. Peyton, D.K., Huang, M.-C., Giglia, M.A., Hugnes, N.K., and Spear, B.T. (2000). The alpha-fetoprotein promoter is the target of Afr-1- mediated postnatal repression. Genomics, 63: 173-180.

250. Philippe, J., Morel, C., Prezioso V.R. (1994). Glucagon gene expression is negatively regulated by hepatocyte nuclear factor 3 beta. Mol. Cell. Biol., 14: 3514-3523.

251. Piao, Z., Park, C., Kim, JJ., Kim, H. (1999). Deletion mapping of chromosome 16q in hepatocellular carcinoma. Br. J. Cancer, 80: 850-854.

252. Pitot, H., Dragan, Y. (1991). Facts and theories concerning the mechanisms of carcinogenesis. FASEB J., 5:2280-2286.

253. Pitot, H., Sirica, A. (1980). The stages of initiation and promotion in hepatocarcinogenesis. BBA, 605: 191-215.

254. Poli, V., Mancini, F.P., and Cortese, R. (1990). IL-6DBP a nuclear protein involved in interleukin-6 signal transduction, defines a new family of leucine zipper protein a related to C/EBP. Cell, 63: 643653.

255. Pontoglio, M., Barra, J., Hadchouel, M., Doyen, A., Babinet, C., and Yaniv, M. (1996). Hepatocyte nuclear factor 1 inactivation results in hepatic dysfunction, phenilketonuria and renal Fanconi syndrome. Cell, 84: 575-585.

256. Pontoglio, M., Faust, D.M., Doyen, A., Yaniv, M., Weiss M.C. (1997). Hepatocyte nuclear factor 1 alpha gene inactivation impairs chromatin remodeling and demethylation of the phenylalanine hydroxylase gene. Mol. Cell. Biol., 17:4948-4956.

257. Poussin, K., Kienes, H., Sirma, H., Urban, S., Beaugrand, M., Franco, D., Schirmacher, P., Brechot, C., Brechot, P.P. (1999). Expression of mutated hepatitis В virus X genes in human hepatocellular carcinomas. Int. J. Cancer, 80: 497-505.

258. Powell, D.J., Friedman, J.M., Oulette, A.J., Krauter, K.S., and Darnell, J.E., Jr. (1984). Transcriptional and post-transcriptional control of specific messenger RNAs in adult and embryonic• liver. J. Mol. Biol., 179:21-35.

259. Power, S.C., Cereghini, S. (1996). Positive regulation of the vHNFl promoter by the orphan receptors COUP-TFl/ЕагЗ and COUP-TFII/Arpl. Mol. Cell. Biol., 16: 778-791.

260. Prieto-Alamo, MJ, Laval F (1998). Deficient DNA-ligase activity in the metabolic disease tyrosinemia type I. Proc. Nat. Acad. Sci. 95: 12614-12618,1998.m

261. Qian, X., Costa R.H. (1995). Analysis of hepatocyte nuclear factor-3 beta protein domains required for transcriptional activation and nuclear targeting. Nucleic Acids Res., 23: 1184-1191.

262. Qiu, Y., Krishnan, V., Pereira, F.A., Tsai, S.Y., Tsai, M.J. (1996). Chicken ovalbumin upstream promoter-transcription factors and their regulation. J. Steroid. Biochem. Mol. Biol., 56: 81-85.

263. Rabe, C., Cheng, В., Caselmann, W.H. (2001). Molecular Mechanisms of Hepatitis В Virus-Associated Liver Cancer. Dig. Dis., 19: 279-287.

264. Ramesh, T.M., Ellis, A.W., and Spear, B.T. (1995). Individual mouse a-fetoprotein enhancer elements exhibit different patterns of tissue-specific and hepatic position-dependent activities. Mol. Cell. Biol., 15: 4947-4955.

265. Rana, В., Xie, Y., Mischoulon, D., Bucher, N.L., Farmer, S.R. (1995). The DNA binding activity of C/EBP transcription factor is regulated in the G1 phase of the hepatocyte cell cycle. J. Biol. Chem., 270:18123-18132.

266. Rashid, A., Wang, J.S., Qian, G.S., Lu, B.X., Hamilton, S.R., Groopman, J.D. (1999). Genetic alterations in hepatocellular carcinomas: association between loss of chromosome 4q and p53 gene mutations. Br. J. Cancer, 80: 59-66.

267. Rastegar, M., Rousseau, G.G., Lemaigre, F.P. (2000). CCAAT/enhancer-binding protein-alpha is a component of the growth hormone-regulated network of liver transcription factors. Endocrinology, 141:1686-1692.

268. Ray, R.B., Lagging, L.M., Meyer, K., Steele, R., Ray, R. (1995). Transcriptional regulation of cellular and viral promoters by the hepatitis С virus core protein. Virus Res., 37:209-220.

269. Ray, R.B., Meyer, K., Ray, R. (1996). Suppression of apoptotic cell death by hepatitis С virus core protein. Virology, 226:176-182.

270. Ray, R.B., Ray, R. (2001). Hepatitis С virus core protein: Intriguing properties and functional relevance. FEMS Microbiol. Lett., 202:149-156.

271. Ray, R.B., Steele, R., Meyer, K., Ray, R. (1997). Transcriptional repression of p53 promoter by hepatitis С virus core protein. J. Biol. Chem., 272: 10983-10986.m

272. Rey-Campos, J., Chouard, Т., Yaniv, M., and Crerghini, S. (1991). vHNFl is a homeodomain that activates transcription and forms heterodimers with HNF1. EMBO J., 10: 1445-1457.

273. Ringeisen, F., Rey-Campos, J., and Yaniv, M. (1993). The transactivation potential of variant hepatocyte nuclear factor 1 is modified by alternative splicing. J. Biol. Chem., 268: 25706-25711.

274. Rocken С, Carl-McGrath S (2001). Pathology and Pathogenesis of Hepatocellular Carcinoma. Dig Dis 19: 269-278.

275. Rollini, P., Xu, L., Fournier, R.E. (1999). Partial activation of gene activity and chromatin remodeling of the human 14q32.1 serpin gene cluster by HNF-1 alpha and HNF-4 in fibroblast microcell hybrids. Somat. Cell. Mol. Genet., 25: 207-221.

276. Rossi, J.M., Dunn, N.R., Hogan, B.L., Zaret, K.S. (2001). Distinct mesodermal signals, including BMPs from the septum transversum mesenchyme, are required in combination for hepatogenesis from the endoderm. Genes Dev., 15: 1998-2009.

277. Rossner, M.T. (1992). Hepatitis В virus X-gene product: a promiscuous transcriptional activator. J. Med. Virol., 36: 101-117.

278. Rubinfeld, В., Souza, В., Albert, I., Muller, O., Chamberlain, S.H., Masiarz, F.R., Munemitsu, S., Polakis, P. (1993). Association of the APC gene product with b-catenin. Science, 262: 1731-1734.

279. Rudolph, D., Yeh, W.C., Wakeham, A., Rudolph, В., Nallainathan, D., Potter, J., Elia, A.J., Мак, TW. (2000). Severe liver degeneration and lack of NF-kappaB activation in NEMO/DCKgamma-deficient mice. Genes Dev., 14: 854-862.

280. Ruse, M.D., Jr., Privalsky, M.L., Sladek, F.M. (2002). Competitive cofactor recruitment by orphan receptor hepatocyte nuclear factor 4alphal: modulation by the F domain. Mol. Cell. Biol., 22: 16261638.

281. Ryan, S.C., Zielinski, R., and Dugaiczyk, A. (1991). Structure of the gorilla a-fetoprotein gene and divergence of primates. Genomics, 9: 60-72.

282. Saegusa, M., Ido, A., Nakabayashi, H., Sakai, M., and Tamaoki, T. (1994). Down regulation of human a-fetoprotein by c-jun and c-fos. J. Tumor Marker Oncol., 9: 29-34.

283. Sala-Trepat, J.M., Sargent, T. D., Sell, S., Bonner, J. (1979). a-fetoprotein and albumin genes of rats: no evidence for amplification-deletion or rearrangement in rat liver carcinogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 695-699.

284. Samadani, U. and Costa, R.H. (1996). The transcriptional activator hepatocyte nuclear factor 6 regulates liver gene expression. Mol. Cell. Biol., 6: 6273-6284.

285. Sargent, T. D., Wu, J.R., Sala-Trepat, J.M., Wallace, R.B., Reyes, A.A., and Bonner, J. (1979). The rat serum albumin gene: analysis of cloned sequences. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 3256-3260.

286. Sargent, T. D., Jagodzinski, L., Yang, M., Bonner, J. (1981). Fine structure and evolution of the rat serum albumin gene. Mol. Cell. Biol., 1: 871-883.

287. Schaeffer, E., Guillou, F., Part, D., Zakin, M.M. (1993). A different combination of transcription factors modulates the expression of the human transferrin promoter in liver and Sertoli cells. J. Biol. Chem., 268: 23399-23408.

288. SchlQter, V., Meyer, M., Hofschneider, P.H., Koshy, R., Caselmann, W.H. (1994). Integrated hepatitis В virus X and 3) truncated preS/S sequences derived from human hepatomas encode functionally active transactivators. Oncogene, 9: 3335-3344.

289. Schmidt, P. and Schulz, W.A. (1990). Coexpression of the c-myc protooncogene with a-fetoprotein in fetal mouse liver. Differentiation, 45: 96-102.

290. Schrem, H., Klempnauer, J., Borlak, J. (2002). Liver enriched transcription factors in liver function and development. Part 1: The hepatocyte nuclear factor network and liver-specific gene expression. Pharmocol. Rev., 54: 129-158.

291. Shen, C.N., Slack, J.M., Tosh, D. (2000). Molecular basis of transdifferentiation of pancreas to liver. Nat. Cell. Biol., 2: 879-887.

292. Sherr, C.J. (1996). Cancer cell cycles. Science, 274: 1672-1677.

293. Shimotohno, K. (2000). Hepatitis С virus and its pathogenesis. Semin. Cancer Biol., 10:233-240.

294. Shiota, G., Okano, J., Kawasaki, H., Kawamoto, Т., Nakamura, T. (1995). Serum hepatocyte growth factor levels in liver diseases: clinical implications. Hepatology, 21: 106-112.

295. Shirota Y, Keneko S, Honda M, Kawai HF, Kobayashi К (2001). Identification of differentially expressed genes in hepatocellular carcinoma with cDNA microarrays. Hepatology, 33: 832-840.

296. Sirma, H., Giannini, C., Poussin, K., Paterlini, P., Kremsdorf, D., Brechot, C. (1999). Normal and Malignant Liver Cell Growth: FALK Workshop Fleig WE (ed). Norwell, MA: Kluwer Academic Publishers, pp. 171-186.

297. Sladek, F.M., Zhong, W., Lai, E., and Darnell, J.E., Jr. (1990). Liver-enriched transcription factor HNF4 is a novel member of the steroid hormon receptor superfamily. Genes Dev., 4: 2353-2364.

298. Song, C.S., Jung, M.H., Kim, S.C., Hassan, Т., Roy, A.K., Chatteijee, B. (1998). Tissue-specific and androgen-repressible regulation of the rat dehydroepiandrosterone sulfotransferase gene promoter. J. Biol. Chem., 273:21856-21866.

299. Song, Y.H., Ray, К., Liebhaber, S.A., and Cooke, N.E. (1998). Vitamin D-binding protein gene transcription is regulated by the relative abundance of hepatocyte nuclear factors la and 1(3. J. Biol. Chem., 273:28408-28418.

300. Soutoglou, E., Papafotiou, G., Kartakili, N., and Talianidis, I. (2000). Transcriptional activation by hepatocyte nuclear factor-1 requires synergism multiple coactivator proteins. J. Biol. Chem., 275: 12515-12520.

301. Soutoglou, E., Katrakili, N., and Talianidis, L. (2000a). Acetylation regulates transcription factor activity at multiple levels. Mol. Cell, 5: 745-751.

302. Spagnoli, F.M., Cicchini, C., Tripodi, M., Weiss, M.C. (2000). Inhibition of MMH (Met murine hepatocyte) cell differentiation by TGF-beta is abrogated by pre-treatment with the heritable differentiation effector FGF1. J. Cell. Sci., 113: 3639-3647.

303. Spath, G.F., Weiss, M.C. (1997). Hepatocyte nuclear factor 4 expression overcomes repression of the hepatic phenotype in dedifferentiated hepatoma cells. Mol. Cell. Biol., 17: 1913-1922.

304. Spath, G.F., Weiss, M.C. (1998). Hepatocyte nuclear factor 4 provokes expression of epithelial marker genes, acting as a morphogen in dedifferentiated hepatoma cells. J. Cell. Biol., 140:935-946.

305. Spear, B.T. (1994). Mouse a-fetoprotein gene 5' regulatory elements are regured for postnatal regulation by raf and Rif. Mol. Cell. Biol., 14: 6497-6505.

306. Spear, B.T. (1999). Alpha-fetoprotein gene regulation: lessons from transgenic mice. Semin. Cancer Biol., 9: 109-116.

307. Stamatoglou, S.C., Enrich, C., Manson, M.M, Hughes, R.C. (1992). Temporal changes in the expression and distribution of adhesion molecules during liver development and regeneration. J. Cell Biol., 116: 1507-1515.

308. Stamatoglou, S.C., Hughes, R.C. (1994). Cell adhesion molecules in liver function and pattern formation. FASEB J., 8: 420-427.

309. Stambolic, V., Suzuki, A., de la Pompa, J.L., Brothers, G.M., Mirtsos, C., Sasaki, Т., Ruland, J., Penninger, J.M., Siderovski, D.P., Мак, T.W. (1998). Negative regulation of PKB/Akt-dependent cell survival by the tumor suppressor PTEN. Cell, 95: 29-39.

310. Stewart, M.J., Shean, M.L., Duester, G. (1990). Trans activation of human alcohol dehydrogenase gene expression in hepatoma cells by C/EBP molecules bound in a novel arrangement just 5' and 3' to the TATA box. Mol. Cell. Biol., 10: 5005-5010.

311. St-Louis, M., Tanguay, R.M. (1997). Mutations in the fumaiylacetoacetate hydrolase gene causing hereditary tyrosinemia type I: overview. Hum. Mutat., 9: 291-299.

312. Stoffel, M., Duncan, S.A. (1997). The maturity-onset diabetes of the young (MODY1) transcription factor HNF4alpha regulates expression of genes required for glucose transport and metabolism. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 13209-13214.

313. Sund, N.J., Ang, S.L., Sackett, S.D., Shen, W., Daigle, N., Magnuson, M.A., Kaestner, K.H. (2000). Hepatocyte nuclear factor 3beta (Foxa2) is dispensable for maintaining the differentiated state of the adult hepatocyte. Mol. Cell. Biol., 20: 5175-5183.

314. Suzuki, E., Evans, Т., Lowiy, J., Truong, L., Bell, D.W., Testa, J.R., Walsh, K.B. (1996). The human GATA-6 gene: structure, chromosomal location, and regulation of expression by tissue-specific and mitogen-responsive signals. Genomics, 38:283-290.

315. Tahara, H., Kuniyasu, H., Yokozaki, H., Yasui, W., Shay, J.W., Ide, Т., Tahara, E. (1995). Telomerase activity in preneoplastic and neoplastic gastric and colorectal lesions. Clin. Cancer Res, P 1:1245-1251.

316. Taipale, J., Keski-Oja, J. (1997). Growth factors in the extracellular matrix. FASEB J., 11: 51-59.

317. Takeichi, M. (1996). Morphogenic roles of classic cadherins. Curr. Opin. Cell. Biol., 7: 619-627.

318. Takiguchi, M (1998). The C/EBP family of transcription factors in the liver and other organs. Int. L. Exp. Pathol., 79: 369-391.

319. Tanaka, S., Toh, Y., Adachi, E., Matsumata, Т., Mori, R., Sugimachi, K. (1993). Tumor progression in hepatocellular carcinoma may be mediated by p53 mutation. Cancer Res., 53: 2884-2887.

320. Tang, R, McLachlan, A (2001). Transcriptional regulation of hepatitis В virus by nuclear hormone receptors is a critical determinant of viral tropism Proc. Natl. Acad Sci. USA, 98:1841-1846.

321. Taraviras, S., Monaghan, A.P., Schutz, G., Kelsey, G. (1994). Characterization of mouse HNF-4 gene and its expression during mouse embiyogenesis. Mech. Devel., 48: 67-79.

322. Teramoto T, Satonaka K, Kitazawa S, Fujimori T, Hayashi K, Maeda S (1994). p53 gene abnormalities are closely related to hepatoviral infections and occur at a late stage of hepatocarcinogenesis. Cancer Res., 54: 231-235.

323. Thomas, P., Brown, A., Beddington, R. (1998). Hex: a homeobox gene revealing peri-implantation assymetiy in mouse embryo and an early transient marker of edothelial cell precursors. Development, 125: 85-94.

324. Thorgeirsson SS, Grisham JW (2002). Molecular pathogenesis of human hepatocellular carcinoma. Nature Genetics, 31: 339-346.

325. Tian, J.M., and Schibler, U. (1991). Tissue-specific expression of the gene encoding hepatocyte nuclear factor 1 may involve hepatocyte nuclear factor 4. Genes Dev., 5:2225-2234.

326. Tilghman, S.M. and Belayew, A. (1982). Transcriptional control of the murine albumin/a -fetoprotein locus during development. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79: 5254-5257.

327. Timchenko, N.A., Harris, Т.Е., Wilde, M (1997). CCAAT/enhancer binding protein a regulates p21 protein and hepatocyte proliferation in newborn mice. Mol. Cell. Biol., 17: 7252-7261.

328. Timchenko, N.A., M Wilde, G.J. Darlington (1999). C/EBPa regulates formation of S-phase-specific E2F-pl07 complexes in livers of newborn mice. Mol. Cell. Biol., 19: 2936-2945.

329. Tomei, L., Cortese, R., De Francesco, R. (1992). A POU-A related region dictates DNA binding specificity of LFB1/HNF1 by orienting the two XL-homeodomains in the dimer. EMBO J., 11: 41194129.

330. Torchia, J., Rose, D.W., Inostroza, J., Kamei, Y., Westin, S., Glass, C.K., Rosenfeld, M.G. (1997). The transcriptional co-activator p/CIP binds СВР and mediates nuclear-receptor function. Nature, 387: 677-84.

331. Torres-Padilla, M.E., Fougere-Deschatrette, C., Weiss, M.C. (2001). Expression of HNF4alpha •i isoforms in mouse liver development is regulated by sequential promoter usage and constitutive 3' end splicing. Mech. Dev., 109: 183-93.

332. Tournier-Thurneyssen, I., Feldman, G., and Bernuau, D. (1993). Nuclear oncogenes and gene expression in hepatoma cell lines. Tumor Biol., 14: 201-212.

333. Tranche, F., and Yaniv,. M. (1992). HNF-1, a homeoprotein member of the hepatic transcription regulatory network. BioEssays, 14: 579-587.

334. Tranche, F., Ringeisen, F., Blumenfeld, M., Yaniv, M., and Pontoglio, M. (1997). Analysis of the distribution of binding sites for a tissue-specific transcription factor in the vertebrate genome. J. Mol. Biol., 266,231-245.

335. Tsai, S.Y. and Tsai, M.J. (1997). Chicken ovalbumin upstream promoter-trancnption factors (COUP-TFs): coming of age. Endocr. Rev., 18: 229-240.

336. Tsuchiya, Т., Kominato, Y., Ueda, M. (2002). Human hypoxic signal transduction through a signature motif in hepatocyte nuclear factor 4. J. Biochem. (Tokyo), 132: 37-44.

337. Tsujiuchi, Т., Tsutsumi, M., Kido, A., Takahama, M., Sakitani, H., Iki, K., Sasaki, Y., Denda, A., Konishi, Y. (1998). Induction of telomerase activity during regeneration after partial hepatectomy in the rat. Cancer Letters, 122: 115-120.

338. Turcotte, В., Guertin, M., Chevrette, M., and Belanger, L. (1985). Rat a-fetoprotein messenger RNA: 5'-end sequence and glucocorticoid supressed liver transcription in an improved nuclear run-off assay. Nucl. Acids Res., 13: 2387-2398.

339. Tyner, A., Goudbout, R., Compton, R., and Tilghman, S. M. (1990). The ontogene of alpha-fetoprotein gene expression in the gastrointestinal tract. J. Cell Biol., 110: 915-927.

340. Ueda, H., Ullrich, S.J., Gangemi, J.D., Kappel, C.A., Ngo, L., Feitelson, M.A., Jay, G. (1995). Functional inactivation but not structural mutation of p53 causes liver cancer. Nat. Genet., 9:41-47.

341. Ueno, Y., Moriyama, M., Uchida, Т., Arakawa, Y. (2001). Irregular regeneration of hepatocytes is an important factor in the hepatocarcinogenesis of liver disease. Hepatology, 33: 357-362.

342. Unsal, H., Yakicier, C., Marcais, C., Kew, M., Volkmann, M., Zentgraf, H., Isselbacher, K.J., Ozturk, M. (1994). Genetic heterogeneity of hepatocellular carcinoma. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:822-826.

343. Vacher, J. and Tilghman, S.M. (1990). Dominant negative regulation of the mouse a-fetoprotein gene in adult liver. Science, 250: 1732-1735.

344. Vacher, J., Camper, S. A., Krumlauf, R., Compton, R., and Tilghman, S. M. (1992). га/regulates the postnatal repression of the mouse a-fetoprotein gene at the posttranscriptional level. Mol. Cell. Biol., 12: 856-864.

345. Vanhorenbeeck, V., Jacquemin, P., Lemaigre, F.P., Rousseau, G.G. (2002). OC-3, a novel mammalian member of the ONECUT class of transcription factors. Biochem. Biophys. Res. Commun., 292: 848-854.

346. Vassy, J., Kraemer, M., Chalumeau, M.T., Foucrier, J. (1988). Development of the fetal rat liver: ultrastructural and stereological study of hepatocytes. Cell Differ., 24: 9-24.

347. Vautier, G., Bomford, A.B., Portmann, B.C., Metivier, E., Williams, R., Ryder, S.D. (1999). p53 mutations in british patients with hepatocellular carcinoma: clustering in genetic hemochromatosis. Gastroenterology, 117:154-160.

348. Vedel, M., Gomez-Garcia, M., Sala, M., and Sala-Trepat, J. M. (1983). Changes in methylation pattern of albumin and a-fetoprotein genes in developmental rat liver and neoplasia. Nucl. Acids Res., 11:4335-4354.

349. Vergnes, L., Taniguchi, Т., Omori, K., Zakin, M.M., Ochoa, A. 1997. The apolipoprotein A-I/C-Ш/A-IV gene cluster: ApoC-HI and ApoA-IV expression is regulated by two common enhancers. Biochim. Biophys. Acta., 1348: 299-310.

350. Viollet, В., Kahn, A. and Raymondejean, M. (1997). Protein kinase A-dependent phosphorylation modulates DNA-binding activity of HNF4. Mol. Cell. Biol., 17: 4208-4219.

351. Vogt, Т.Е., Solter, D., and Tilghnan, S.M., 1987. Raf a trans-acting locus, regulates the a-fetoprotein gene in adult liver. Science, 236: 301-307.

352. Volpes, R., van den Oord, J.J., Desmet, V.J. (1993). Integrins as differential cell lineage markers of primary liver tumors. Am. J. Pathol., 142: 1483-1492.

353. Wade, D.P., Lindahl, G.E., Lawn, R.M. (1994). Apolipoprotein(a) gene transcription is regulated by liver-nriched trans-acting factor hepatocyte nuclear factor 1 alpha. J. Biol. Chem., 269: 1975719765.

354. Wan, Y.J., and Chou, J.Y. (1989). Expression of the a-fetoprotein gene in adult rat liver. Arch. Biochem. Biophys., 270: 267-276.

355. Wan, Y. J. and Wu, T.C. (1992). The effects of retinoic acid on the expression of a-fetoprotein and albumin genes in rat hepatoma cell lines. Differentiation, 50: 107-111.

356. Wang, J., Xie, L.Y., Allan, S., Beach, D., Hannon, G.J. (1998). Мус activates telomerase. Genes Dev., 12: 1769-1774.

357. Wang, S.K., Wang, Z.Z., Lu, XL., Wang, Y., Jiang, J.D. (1999). The presence of HBV genomic DNA in tumor tissue correlates with P53 aberrations in human hepatocellular carcinoma in Qidong, China. Cancer Genet. Cytogenet., 113: 191-192.

358. Wang, J.C., Stafford, J.M., Granner, D.K. (1998). SRC-1 and GRIP1 coactivate transcription with hepatocyte nuclear factor 4. J. Biol. Chem., 273: 30847-30850.

359. Wang, L.-H., Tsai, S.Y., Cook, R.G., Beattie, W.G., Tsai, M.-J., and O'Malley, B.W. (1989). COUP transcription factor is a member of the steroid receptor superfamily. Nature, 340: 163-166.

360. Wang, N.D., Finegold, M.J., Bradley, A., Ou, C.N., Abdelsayed, S.V., Wilde, M.D., Taylor, L.R., Wilson, D.R., Darlington, G.J. (1995). Impaired energy homeostasis in C/EBP alpha knockout mice. Science, 269:1108-1112.

361. Wang, W., Hayashi, Y., Ninomiya, Т., Ohta, K., Nakabayashi, H., Tamaoki, Т., Itoh, H. (1998). Expression of HNF-1 alpha and HNF-1 beta in various histological differentiations of hepatocellular carcinoma. J. Pathol., 184:272-278.

362. Watanabe, Т., Jimenez-Molina, J. L., and Chou, J. Y. (1992). Characterization of a rat variant alpha-fetoprotein. Biochem. Biophys. Res. Commun., 185: 648-656.

363. Watkins, P.J., Condreay, J.P., Huber, B.E., Jacobs, S.J., Adams, D.J. (1996). Impaired proliferation and tumorigenicity induced by CCAAT/enhancer-binding protein. Cancer Res., 56:1063-1067.

364. Wegner, M., Cao, Z., and Rosenfeld, M.G. (1992). Calcium-regulated phosphorylation within the leucine zipper of C/EBP-beta. Science, 256: 370-373.

365. Weigel, D. and Jackie, H. (1990). The fork head domain: a novel DNA binding motif of eukariotic transcription factors? Cell, 63: 455-456.

366. Weigel, D., Jurgens, G., Kuttner, F., Seifert, E., and Jackie, H. (1989). The homeotic gene fork head encodes a nuclear protein and is expressed in the terminal regions of the drosophila embrio. Cell, 57: 645-658.

367. Weil R, Sirma H, Giannini C, Kremsdorf D, Dargemont C, Brechot C, Israel A (1999). Direct association and nuclear import of the hepatitis В virus X protein with the NF-xB inhibitor fyBa. Mol. Cell. Biol., 19: 6345-6354.

368. Weinstein, D.C., Ruiz i Altaba, A., Chen, W.S., Hoodless, P., Prezioso, V.R., Jessell, T.M,. Jr. Darnell JE. (1994). The winged-helix transcription factor HNF-3 beta is required for notochord development in the mouse embryo. Cell, 78: 575-588.

369. Welm, A.L., Timchenko, N.A., Darlington, G.J. (1999). C/EBPa regulates generation of C/EBPp isoforms through activation of specific proteolytic cleavage. Mol. Cell. Biol., 19: 1695-1704.

370. Wen, P., Crawford, N., and Locker, J. (1993). A promoter-linked coupling region required for stimulation of a-fetoprotein transcription by distant enhancers. Nucleic Acids Res., 21: 1911-1918.

371. Wen, P., Group, E.R., Bruzard, G.,Crawford, N., Locker, J. (1991). Enhancer, repressor and promoter specificities combine to regulate the rat alpha-fetoprotein gene. DNA Cell. Biol., 10: 525-536.

372. Wen, P., Locker, J. (1994). A novel hepatocyte transcription factor that binds the a-fetoprotein promoter-linked coupling element. Mol. Cell. Biol., 14: 6616-6626.

373. Widen, S.G., Papaconstantinou, J. (1986). Liver-specific expression of the mouse alpha-fetoprotein gene is mediated by cis-acting DNA elements. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 83: 8196-8200.

374. Wogan, G.N. (2000). Impacts of chemicals on liver cancer risk. Sem. Cancer Biol., 10:201-210.

375. Wooster, R, Bignell, G., Lancaster, J., Swift, S., Seal, S., Mangion, J., Collins, N., Gregory, S., Gumbs, C., Micklem, G. (1995). Identification of the breast cancer susceptibility gene BRCA2. Nature, 378: 789-792.

376. Workman, J.L., Kingston, RE. (1998). Alteration of nucleosome structure as a mechanism of transcriptional regulation. Annu. Rev. Biochem., 67: 545-579.

377. Wright, C.V.E. (1991). Vertebrate homeobox genes. Curr. Opin. Cell Biol., 3: 976-982.

378. Wu, K.L., Gannon, M., Peshavaria, M. (1997). HNF3P is involved in pancreatic P-cell-specific transcription of the pdx-1 gene. Mol. Cell. Biol. 17: 6002-6013.

379. Xanthopoulos, K.G. and Mirkovitch, J. (1993). Gene regulation in rodent hepatocytes during development, differentiation and disease. Eur. J. Biochem., 216: 353-360.

380. Xu, L„ Hui, L„ Wang, S., Gong, J., Jin, Y., Wang, Y„ Ji, Y„ Wu, X., Han, Z., Hu, G. (2001). Expression profiling suggested a regulatory role of liver-enriched transcription factors in human hepatocellular carcinoma. Cancer Res., 61: 3176-3181.

381. Yakicier, M.C., Irmak, M.B., Romano, A., Kew, M., Ozturk, M. (1999). Smad2 and Smad4 gene mutations in hepatocellular carcinoma. Oncogene, 18: 4879-4883.

382. Yamaguchi, Y., Nozawa, K., Savoysky, E., Hayakawa, N., Nimura, Y., Yoshida, S. (1998). Change in telomerase activity of rat organs during growth and aging. Experimental Cell Research, 242: 120-127.

383. Yang, F., Luna, V. J., McAnelly, R. D., Naberhaus К. H., Cupples, R. L., Bowman, В. H. (1985). Evolutionary and structural relationships among the group-specific component, albumin and alpha-fetoprotein. Nucl. Acids Res., 13: 8007-8017.

384. Yao, Y.J., Ping, X.L., Zhang, H., Chen, F.F., Lee, P.K., Ahsan, H., Chen, C.J., Lee, P.H., Peacocke, M., Santella, R.M., Tsou, H.C. (1999). PTEN/MMAC1 mutations in hepatocellular carcinomas. Oncogene, 18:3181-3185.

385. Yasuda, H., Mizuno, A., Tamaoki, Т., and Morinaga, T. (1994). ATBF1, a multiple-homeodomain zinc finger protein, selectively down-regulates AT-rich elements of the human a-fetoprotein gene. Mol. Cell. Biol., 14: 1395-1401.

386. Yoo, Y.D., Ueda, H., Park, K„ Flanders, K.C., Lee, Y.I., Jay, G., Kim, S.J. (1996). Regulation of transforming growth factor-beta 1 expression by the hepatitis В virus (HBV) X transactivator. J. Clin. Invest., 97:388-395.

387. Yu, X., Mertz, J.E. (2001). Differential regulation of the pre-C and pregenomic promoters of human hepatitis В virus by members of the nuclear receptor superfamily. J. Virol., 71:9366-9374.

388. Zaret, K. (1999). Developmental competence of the gut endoderm: genetic potentiation by GATA and HNF3/fork head proteins. Dev. Biol., 209: 1-10.

389. Zaret, K.S. (1994). Genetic control of hepatocyte differentiation. In: The Liver: Biology and Pathobiology. Third Edition. (Arias, I.M., Boyer, J.L., Fausto, N., Jakoby, W.B., Schachter, D.A., Shafritz, D.A., eds.), Raven Press, Ltd, New York.

390. Zhang, P., Bennoun, M., Gogard, C., Bossard, P., Leclerc, I., Kahn, A., Vasseur-Cognet, M. (2002). Expression of COUP-TFII in metabolic tissues during development. Mech. Dev., 119:109.

391. Zhang, D.E., Ge, X., Rabek, J.P., and Papaconstantinou, J. (1991). Functional analysis of the transacting factor binding sites of the mouse alpha-fetoprotein proximal promoter by site-directed mutagenesis. J. Biol. Chem., 266:21179-21185.

392. Zhao, L., Samuels, Т., Winckler, S., Korgaonkar, C., Tompkins, V., Home, M.C., Quelle, D.E. (2003). Cyclin G1 Has Growth Inhibitory Activity Linked to the ARF-Mdm2-p53 and pRb Tumor Suppressor Pathways. Mol Cancer Res. 1: 195-206.

393. Zhong, W., Mirkovitch, J., and Darnell, J.E., Jr. (1994). Tissue-specific regulation of mouse hepatocyte nuclear factor 4 expression. Mol. Cell. Biol., 14: 7276-7284.

394. Zhong, W., Sladek, F.M., and Darnell, J.E., Jr. (1992). The expression pattern of a Drosophila homolog to the mouse transcription factor HNF4 suggests a determinative role in gut formation. * EMBO J., 12: 537-544.

395. Zhou, C., Tsai, S.Y., Tsai, M.-J. (2000). From apoptosis to angiogenesis: new insights into the roles of nuclear orphan receptors, chicken ovalbumin upstream promoter-transcription factors, during development. Biochim. Bioph. Acta, 1470: M63-M68.