Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние рентгеновского облучения на экспрессию клеточных генов в гепатоцитах регенерирующей печени крыс

ВАК РФ 03.00.01, Радиобиология

Автореферат диссертации по теме "Влияние рентгеновского облучения на экспрессию клеточных генов в гепатоцитах регенерирующей печени крыс"

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ СССР

ЦЕНТРАЛЬНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ РЕНТГЕНО-РАДИОЛОГИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ

На правах рукописи УДК 591.2:610.36.001.28

БАРАБИЦКАЯ

Оксана Владимировна

ВЛИЯНИЕ РЕНТГЕНОВСКОГО ОБЛУЧЕНИЯ НА ЭКСПРЕССИЮ КЛЕТОЧНЫХ ГЕНОВ В ГЕПАТОЦИТАХ РЕГЕНЕРИРУЮЩЕЙ ПЕЧЕНИ КРЫС

Специальность: 03.00.01 — Радиобиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ЛЕН И Н ГРАД 1990

Работа выполнена в Центральном научно-исследовательском рептге-ио-радиологическом институте Минздрава СССР (г. Ленинград).

Научный руководитель — член-корреспондент АМН СССР, доктор медицинских наук, профессор Хансон К. П.

Научный консультант — кандидат биологических наук Евтушенко В. И.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук Гайцхоки В. С.; доктор медицинских наук Полищук А. М.

Ведущее научное учреждение — Киевский Государственный Университет им. Т. Г. Шевченко. ^ -

Защита диссертации состоится '^^^/^Мээо г. в"^"^"»Тасов на

заседании Специализированного совета Д 07433.01 при Центральном научно-исследовательском рентгено-радиологическом институте Минздрава СССР (г. Ленинград, Песочный-2, ул. Ленинградская, д. 70/4).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

А д,

Автореферат разослан^ » 1990 г.

(

Ученый секретарь Специализированного совета, доктор медицинских наук Л. И. Корытова

■ - 3 -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актугу ьность_темы.Решение фундаментальных проблем биологии, таких как нормальный и злокачественный рост, связано с изучением стимулированной пролиферации клеток. В настоящее время установлено, что у взрослых животных в некоторых тканях и органах большинство дифференцированных клеток находится в состоянии покоя, переход к активной пролиферации наблюдается при неоплазии или компенсаторном росте органов (Епифанова, 1983). Типичным примером являются клетки печени половозрелых особей, которые характеризуются .крайне низкой величиной митотического индекса ; одновременно в митозе находится один ге-патоцит из 10-20 тыс. клеток (Bûcher, 1971).При вирусном гепатите, циррозах, гепатотоксических реакциях и обширных некрозах печени гибель клеток и уменьшение массы органа стимулирует пролиферацию гепэ-тоцитов. Переход части клеток паренхимы из состояния покоя в митоти-ческий цикл также может быть адаптивным ответом на присутствие в составе пищи гексахлорбензена и хлорорганических инсектицидов, которые вызывают минимальную гибель гепатоцитов (Short, 1972; Fausto, 1989).

Известно, что длительная и/или интенсивная физиологическая или репаративная регенерация органов увеличивает риск образования опухолей (Акоев,1988). Исследования In vitro и In vivo показали,что ионизирующее излучение обладает канцерогенным эффектом (Coglle, 1985). Сопоставление с данными по химическому гепатоканцерогенезу, который изучен лучше радиационного, позволяет, предположить, что при сочетаний стимулированной пролиферации и воздействия радиации вероятность реализации опухолевой трансформации клеток паренхимы печени возрастает.

Исследования проблемы регуляции пролиферации облученных и/или трансформированных клеток,по-видимому, целесообразно проводить в два этапа. Во-первых,необходимо выяснить молекулярные механизмы, лежащие в основе пострадиационных нарушений пролиферации гепатоцитов. В свя-

зи с этим особый интерес вызывает изучение влияния радиации на экспрессию "клеточный цикл-зависимых" генов, т.е. генов, которые активируются после воздействия пролиферативпого стимула на покоящиеся• клетки (Baserga, 1985).

Удобной моделью для исследования клеточных и молекулярных процессов In vivo является регенерирующая печень крыс. В ответ на удаление 2/3 печени значительная часть покоящихся гепатоцитов синхронно переходит к пролиферации (Grlsham, 1962; Fabricant, 1969; Терских., 1973).Воздействие радиации Приводит к изменению стимулированной пролиферации клеток паренхимы. Основной эффект заключается в пострадиационном удлинении всех стадий клеточного цикла.Продолжительность задержки перехода гепатоцитов из одного периода цикла в другой зависит от дозы излучения и момента воздействия; После снятия блока ' клетки относительно синхронно возобновляют прерванную пролиферацию (Сидорова, I9G6; Окада, 1974; Полищук, 1986).

Результаты экспериментов по определению радиочувствительности . биосинтеза разных типов РНК в клетках регенерирующей печени показали, что ионизирующее излучение преимущественно воздействует на экспрессию генов, активирующихся после операции (Магсоу, 1975; Комар, 1980). Проблема избирательного действия радиации на гены до сих пор остается.нерешенной. Возникает вопрос"- в какой стегани пострадиационная регуляция экспрессии индивидуальных генов зависит от их функций в клетке и от состояния генома в момент облучения. Для изучения этого вопроса необходимо исследовать влияние радиации на экспрессию различных в функциональном отношении rpymi генов:протоонкогенов; генов, кодирующих ферменты, белки цитоскелета, белки-регуляторы пролибрации, секреторные белки и т.д.. Согласно данным литературы, в печени после частичной гепатэктрмии активация экспрессии генов связана со стимулированной пролиферацией клеток или с реакцией "острой фазы" . (Sobczak, 1986; Schreiber,. 1987). По-видимому , индукция экспрессии

этих генов происходит в разных популяцих клеток: пролиферирукхцих и покоящихся (Епифанова, 1983). При планировании наших исследований мы остановили свой выбор на следующих гонах, связанных с пролиферацией клеток: протоонкогаш c-fos и с-На-газ, т.к. экспрессия этих генов является "клеточный цикл-зависимой", а их белковые продукты, по-видимому, принимают участие в регуляции пролиферации (Ferainlsco, 1984; Wilson, 1988); гены, кодирующие'Gs~ и G^-белки, которые регулируют активность эденилат циклазн, передавая сигнал от рецепторов плазматической мембраны (Gilmañ, 1987); пируват киназу Ь-тшта - основной фермент гликолиза в клетках печени взрослых животных, катализирует реакцию превращения фосфоеиолпируватз в пируват с образованием АТФ .(Cognet, 1987);- №а!К+-АТФазу - ассоциированный с плазматической мембраной фермент, ответственный за активный транспорт ионов На+и К+ (Herrera, 1987). В группу генов, белковые продукты которых сокрети-руются клетками паренхимы печени, вошли: с^-макроглобулин - типичный белок "острой фазы" (Schreiber,1987); сывороточный альбумин - основной белок плазмы крови взрослых животных и <х-<5етапротеин - его аналог у эмбрионов (Selem, 1984)..

• Исходя из представлений о радикальном изменении метаболизма клеток при переходе из состояния покоя к пролиферации (Епифанова, 1983), можно предположить, что пострадиационные изменения экспрессии генов будут существенно различаться при облучении в фазе Gq или в одном иа периодов митотического цикла.

. Целью работы явилось изучение влияния рентгеновского облучения (в дозе 5 Гр) на экспрессию "клеточный цикл-зависимых" и "клеточный цикл-независимых" генов в регенерирующей печени крыс при воздействии радиацией на гепатоциты, находящиеся в состоянии покоя (Gq) или в середине пререпликативного периода (Gj).

Исходя из этого были поставлены следуюцив задачи: I. Исследовать вступление в S-период клеток печени на ранних сроках

после удаления 2/3 органа в норме и после Облучения на с'гадиях С0 и С,. Выявить пострадиационные нарушения пролиферации гепатоцитов в используемой экспериментально!» модели.

2, Изучить динамику изменения экспрессии генов, связанных с пролиферацией гепатсцитои: протоонкогонов с-Юэ и с-На-гаа и генов, кодирующих Ыа|к+-АТФязу, нируват кияазу, С-белки, на ранней стадии регенерации. печени в норме и после облучения на стадиях вд и С^ ююточ-г ного цикла. Исследовать возможную взаимосвязь между пострадиационными изменениями экспрессии "клеточный цикл-зависимых" генов и нарушениям! пролиферации клеток паренхимы печени.

3. Изучить экспрессию генов, белковые продукты которых секретируют-ся гелатоцитами: сывороточный альбумин, а-фбтопротецн и а^-макрогло-булин, на ранней стадии регенерации печени в норме и при двух выб-рашшх схемах облучения. Определить общие закономерности и индивидуальные особенности регуляции экспрессии клеточных генов в гепатоци-тах регенерирующей печени крыс после облучения. '.

И§Хчная_ндвизна• Впервые проведен анализ влияния рентгеновского облученкя на экспрессию лрогоонкогешов с-Хоа, с-На-гаэ и генов, кодирующих а-субъединицу №^К+-АТФазы, нируват киназу 1-типа,. «-субъ-ед1шицу И Соболков, сывороточный альбумин и а^-макроглобулин, в клетках регенерирумцей печени. Установлено, что после.облучения уровень экспрессии изученных генов в гепатоцитах регенерирующей печени снижен по .сравнению:с контролем. Ингибирующее действие радиации .на экспрессию генов проявляется сильнее при облучении на стадии Ср чем на стадии Исключением из этого общего правила'являются три гена, для которых обнаружено превышение уровня экспрессии над контролем при'облучении б'С0-нериод8 клеточного цикла гелатоцитов (с~-Гоа,с-На~ гае) и при облучении в С^-гюриоде (ген нируват киназы Ь-тшю).Усиление экспрессии этих генов совпадает но ьремон.1 с задержкой перехода. С0/01 для с-Гоа И Сц/й для с-На-гая, нируват киназы. По-видимому,

активация экспрессии этих генов необходима для снятия пострадиационного блока пролиферации гепатоцитов. Полученные данные об изменениях экспрессии изученных генов в гепатоцитах регенерирующей печени крыс после облучения свидетельствуют об отсутствии общего пострадиационного механизма регуляции уровня транскриптов. Регуляция экспрессии каждого гена осуществляется индивидуальным образом. *

Научно-драктическая__значимость. Исследование относится к разряду теоретических работ.Полученные даннае об экспрессии генов в гепатоцитах регенерирующей печени, облученных на стадиях и наряду с данными о.нарушениях пролиферации расширяют и углубляют представления о молекулярных событиях, связанных с пострадиационной регуляцией клеточного цикла. Сведения об активации экспрессии с-Гоз и с-На-газ в облученных гепатоцитах представляют интерес для последующих исследований радиационного гепатокэнцерогбнеза.

Ф°рма_внедреиия. Работа проведена в рамках1 плановых заданий ЦНИРРК МЗ СССР по программе 0.74.05 "Молекулярная биология и молекулярная генетика медицине" (постановление ГКНТ СССР, Госплана СССР и президиума АН СССР № 492/245/146 от 8.12.81). Номер государственной регистрации темы 01860049367.

АОКбация_работы. Материалы диссертации доложены на Всесоюзной школе-семинаре "Современные проблемы радиационной медицины" (Киев-Канев* 1983), на научном заседании Ленинградского обо'ества рентгенологов и радиологов (Ленинград, 1989), нз I Всесоюзном радиобиологическом съезде (Москва, 1989).

О2блгаации. По материалам диссертации опубликовано 4 работы.

?1ЕККТ1Е9_и_дбьем_дйссертац™. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, собственных экспериментальных данных, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Работа изложена на /¿^страницах машинописного текста, иллюстрированна 17 рисунками и-фотографиями. Указатель лите-

ратуры содержит/i'-i'ссылок на публикации отечественных и'зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В экспериментах использовали самцов белых беспородных, крыс весом 120-140 г. Ольрацию частичной гепатэктомии осуществляли в 8.0010.00 ч по методу Хиггинса и Андерсона (Hlggins,1931). Общее рентгеновское облучение крыс в дозе 5 Гр проводили на аппарате РУМ-17 (мощность дозы 0,019 Гр/с). Применяли две схемы облучения: за 0,5 ч до операции ("Обл.С0") и через 6 ч после операции (условно "Обл.С^"). Долю пролиферирующих клеток в S-периоде на ранней стадии реге-

Q

нерации печени оценивали по включению Н-тишдина в ДНК. Меченный предшественник (10 МЕк на крысу) вводили внутрибрюшинно. ДНК выделяли модифицированным методом (Donehower, 1979). Количество ДНК определяли по Burton (1956), радиактивность измеряли в сцинтилляционном счетчике (Rack Beta/LKB-WALLAC, Швеция).

РНК из печени крыс выделяли центрифугированием гомогенатов в градиенте гуанидинизотиоцианат/CsCl (Chlrgwln,1979). Глиоксилирован-ную РНК фракционировали в 1-1,356 агарозном геле, переноси ли на капроновые фильтры (Маниатис,1984),Транскрипты иммобилизовали на фильтрах с помощью УФ (№andjian,1936). ■ .

В качестве зондов для гибридизации использовали плазмида, содержащие фрагменты соответствующих генов, меченные а- р-дНТФ в реа-

о '

кции ник-трансляции до удельной активности 0,7-1,5X10 имп/шн.мкг ДНК. Плазмиды накапливали в бактериях E.coli (штаммы НВ101, JM109),

I

выделяли по методу Blrribolm-Boly (1979), обрабатывали рестриктазами и фракционировали в 0,8-1%■агарозном геле (Маниагис, 1984).

• Гибридизацию связанной с фильтрами РНК проводили в растворе,-содержащем 0,5М NaCl - 20шМ трис.НМ рН7,5 - 0,556 ДСН - 5мМ ЭДТА-10% I'lcoll 400, в течете 24-48 ч при 60-64°C. Отмытые от несвязав-шейся метки фильтры экспонировали с рентгеновской пленкой GRW0 (ГДР)

в кассетах с усиливающим экраном при -70°С в течение 1-7 суток. Интенсивность гибридизации определяли по степени почернения рентгеновской пленки (лазерный денситометр SLR-.1D/2D, США).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И Ж ОБСУЖДЕНИЕ Кинетика пролиферации необлученных гепатоцитов на ранней

стадии регенерации печени : Динамика изменения удельной радиактивности 3Н-ДНК в печени в различные сроки после удаления 2/3 органа (рисЛ) свидетельствует о продолжающемся длительное время переходе части покоящихся клеток к пролиферации. В период от 12 до 44 ч после операции (п.о.) крыс наблюдается формирование двух волн синтеза ДНК с максимумами на 20 и 35-40 ч п.о. Эти результаты согласуются с данными. литературы (Bucher, 1964; Полищук, 1969). Анализ, популяции клеток, пролиферирующих в период до 48 ч после частичной гепатэктомии показал , что первая волна синтеза ДНК обусловлена практически только гепатоцитами (более 84% клеток), в то время как во второй волне их доля снижена до 30% (Grisham,1962; Kaufman,1981 ). Однородность первой.волны синтеза ДНК по клеточному составу позволяет использовать ее для анализа пострадиационных нарушений пролиферации гепатоцитов.

ВЛИЯНИЕ ОБЛУЧЕНИЯ В "Gg" И "Gj" ФАЗАХ КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛА .

• НА КИНЕТИКУ ПРОЛИФЕРАЦИИ ГЕПАТОЦИТОВ

о

Данные о включении °Н-тимидина в ДНК облученных клеток регенерирующей- печени в исследуемый период (рисЛ) свидетельствуют о сходных- изменениях пролиферации: облучение в "Gü" и ^"приводит к появлению только одной волны синтеза ДНК с максимумами на 40 и 36 ч п.о., соответственно. При этом увеличивается продолжительность пре-решгокативного периода митотического цикла. В ряде работ (Полищук, 1969; Kauiman, 1981) была выявлена следующая закономерность после снятия блока пролиферации, вызванного радиационным (Gj-период) или гормональным (Gq~ и Gj-периоды) твдчдействием, первая волна синтеза

ДНК обусловлена исключительно гепатоцитами.

Рис.1 Динамика включения 3Н-тимидина в клетки регенерирующей печени крыс. {г—г)- контроль; облучение в состоянии покоя; (•—»)- облучение в фазе С^ миготического цикла. Ордината - удельная активность ДНК/ абсцисса - время после операции.

В наших экспериментах пострадиационная задержка начала синтеза ДНК в клетках паренхимы печени по сравнению с контролем составляет 8 ч при "Обл.С0" и 4 4 при "Обл.С^". По-видимому, более длительная задержка вступления гепатоцитов в Э-период при' облучении в состоянии покоя' связана с дополнительным блокированием прогрессии клеточного цикла - задержкой перехода Р0/'С1'. При обеих схемах облучения блок, перехода в^/Б является общим следствием радиационного воздействия. Полученные данные согласуются с представлениями' о пострадиационных нарушениях стимулированной пролиферации гепатоцитов, облученных на разных стадиях клеточного цикла.

■ "КЛЕТОЧНЫЙ ЩЕЛ-ЗАВИСИМАЯ1' ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ Б ■ ГЕПАТОЦИТАХ НЕОБЛУЧЕННОЙ РЕГЕНЕРИРУЮЩЕЙ ПЕЧЕНИ • Стимулированная пролиферация гепатоцитов сопровождается усилением экспрессии протоонкогенов с-Гоз и с-На-гаэ; генов, кодирующих пируват- киназу., Ь-типа, . а-субъеданицу С.-¡-белка, а+-субъединицу На+;К+-АТФазы. Транскрипты гена а-субъеданицы вд-бвлка не детектировались в условиях' нашего эксперимента. Экспрессию генов определяли по уровню транскриптов з различные сроки после частичной гепатэкто-. мии. Уровень экспрессии в интактной печени был принят за ЮОЖ.'

Динамика изменения уровня мРВД с-1оз и с-На-гзз протоонкогенов в исследуемый период регенерации печени от 0,6 до 44 ч п.о. свидетельствует о сходном характере активации экспрессии этих генов (рис.* 2 А,Б). Основной пик увеличения экспрессии обоих генов охватывает период от момента перехода гепатоцитов к синтезу ДНК и до окончания митоза. Кроме того, возрастание уровня транскриптов с-?оэ происходит в середине пререпликативного периода. Напротив, уровень экспрессии цротоонкогена с-На-газ на протяжении почти всего пререпликативного периода снижен по сравнению с уровнем в интактной печени.

Рис.2. Динамика изменения экспрессии протоонкогенов c-fos (А) и c-HA-ras (Б), в клетках регенерирующей печени крысЛ»"-^ )- контроль; (о--о)- облучение в состоянии покоя; (•—•)- облучение в фазе Gj митотического цикла. Ордината- уровень транскриптов генов в. процентах от интактной печени; абсцисса - время после операции.

Полученные результаты об изменении экспрессии c-HA-ras на исследуемой стадии регенерации печени крыс согласуются с данными других авторов (Goyette,1983; Krui3er,1986). В работах (Thompson,1986; Corral,1985; Blesiada,1988) описана сходная картина активации экспрессии c-íos при прохождении гепатоцитами цикла деления.

Анализ данных об изменении уровня-транскриптов генов, кодирую-

1 J й Ik Й Н 28 32 3« 4» 44"

1 5 ¡2 16 20 24 28 35 31 «5

щих пируват киназу L-тша и а-субьединицу G-j-белка,'на ранней стадии регенерации печени приводит к выводу о сходном характере активации экспрессии этих генов (рис.3 А,Б). Первый пик повышения уровня экспрессии обоих генов совпадает по времени с переходом Gq/Gj гепатоци-. тов первой волны пролиферации. Второй сложный пик активации экспрессии генов охватывает практически весь исследуемый интервал времени, причем периоды резкого возрастания уровня транскриптов соответствуют-середине лререлликативного периода, переходу Gj/S, S/Gg и митозу. В литературе отсутствуют данные об изменении экспрессии генов пируват киназы L-типа и а-субъединицы С^-белка в лечени после частичной ге-патэктомии. Однако, сведения о функциях белковых продуктов этих генов в клетках позволяют предположить, ■ что. увеличение уровня транскриптов необходимо для прогрессии митотического цикла гепатоцитов.

В исследуемый период регенерации печени уровень экспрессии гена, кодирующего а+-субъедщшцу Na|к+-АТФазы, мало отличается от уровня в интактном органе. Возрастание уровня транскриптов гена Сне более, чем в 1,4 раза) наблюдается в период между 28 и 32 ч п.о. (рис. 3 В). В .то время как активность фермента NatK+-AT®a3u увеличивается в печени крыс, начиная с 12 ч после частичной гёпат&ктомии (Schenk, ' 1984). Имеются данные о том, что в регенерирующей печени происходит активация рредсуществующих молекул.энзима, вследствие фосфорилирова-ния а-субъединицы (Yehj1983).Полученные, нами данные также свидетельствуют об отсутствии прямой корреляции между уровнем транскриптрв гена и активностью фермента Иа^К+-АТФазы, Такой же вывод был сделан Bramel (1987) при изучении этого фермента в мозге крысы- 1 '

Обобщая эксперименталыше данные об экспрессии генов, связанных с пролиферацией гепатоцитов, можно сделать вывод:о том, 2то резкое возрастание уровня транскриптов' всех изученных генов происходит при переходе гепатоцитов из одного периода клеточного цикла в другой. Для всех генов, кроме. а+-субъединицы Na't.K+--AT$a3Hf характерна акти-

ващш экспрессии при переходе С-^/Б. Усиление экспрессии протоонкоге-на с-Гоз и генов, кодирующих пируват киназу Ь-типа и а-субъединицу О^-белка, в середине пререпликативного периода показывает, что этот этап митотического цикла, по-видимому, также является одним из критических моментов дли пролиферации гепатоцитов.

Ряб.З Динамика изменения экспрессии.генов, кодирующих пируват киназу Ь-типа ХА), а-субъеданицу .Гц-белка (Б) и а+-субъеданицу Ка|К+-. АТФазы (В) в клетках регенерирующей печени крыс. контроль;

(о—о)_ облучение в состоянии покоя; (»-.-*)- облучение в ^азе С^ митотического цикла* Ордината - уровень транскриптов в. процентах от интактной иечени, абсцисса - время после операции. .

ВЛИЯНИЕ ОБЛУЧЕНИЯ НА "КЛЕТОЧНЫЙ ЦИКЛ-ЗАВИСИМУЮ" ЭКСПРЕСС.™

ГЕНОВ В ГЕ1ХЛТ0ЦИТАХ РЕШГЕГИРУЩЕЙ ПЕЧЕ1Ш После воздейстгия радиацией ка стадиях'0о и С1 клеточного никла

усиление экспрессии во время стимулированной пролиферации гепатоцитов сохраняемся только для щютоонкогенов-с-Гоэ и с-На-таз,. а также для генов, кодирующих пируват киназу 1,-типа и а-субъединицу С^-бел-ка. Данные о пострадиационном изменении уровня транскриптов гена а+-субъединицы Ма|к+-АТФазы свидетельствуют о подавлении экспрессии этого гена в облученной печени по сравнению с интактной и регенерирующей в контроле (рис.3 В). Причем облучение на стадии приводит к более резкому снижению уровня транскриптов ^К+-АТФазы па «райю-нию с воздействием на стадии С0.

Анализ данных об уровне.транскриптов с-Гоз и с-На-газ в исследуемый период регенерации облученной печени (рис.3 А,Б) показал, что влияние радиации в основном связано с количественными изменениями ■ экспрессии генов. При обеих схемах облучения активация экспрессии с-1оз и с-На-газ соответствовала тем же периодам митогического цикла гепатоцитов, что и в контроле, но уровень транскриптов как'правило . был ниже. Снижение уровня транскриптов протоонкогенов при облучении в фазе было более значительным, чем при. облучении в фазе вд. Обращает внимание тот факт, что при облучении гепатоцитов в состоянии покоя в интервалы времени, соответствующие задержке перехода '.\Сд/Сг для с-1оз и С^/Б для с-На-газ, уровень экспрессии генов выше, чем в контроле. Следует отметить,что в контроле в отличии от облучения в состоянии покоя, переход гепатоцитов из фазы 00 в клеточного цикла не сопровождается активацией экспрессии с-Лэ протоонкоге-. на.

Пострадиационные изменения уровня транскриптов генов, кодирующих пируват. киназу Ь-типа и а-субъединицу в^-белка, в значительной ■степени зависят от схемы облучения: характер изменения экспрессии обоих генов при облучении.в фазе С0 одинаков, а при облучении в фазе - резко различается (рис.3 А,Б). В отличии от контроля переход .гепчтощтш, облученных в-состоянии покоя, из фазы в не сопро-

воздается активацией экспрессии генов пируват киназы и С^-белка. В дальнейшем при прогрессии митотического цикла гепатоцитов, облученных в фазе С0, уровень транскриптов этих генов увеличивается по сравнению с интактной печенью, хотя на протяжении всего исследуемого периода остается низкб, чем в контроле. Возрастание уровня мРНК обоих генов происходит в позднем пререпликативном периоде и, по-видимому, связано с задержкой перехода гепатоцитов в Б-период. Активация экспрессии гена пируват киназы также наблюдается в/середине 0]--периода.. Облучение клеток паренхимы в фазе митотического цикла приводит к »снижению уровня транскриптов гена -белка по сравнению с контролем и облучением в фазе С0< На протяжении почти всего исследуемого интервала времени уровень экспрессии этого гена близок к уровню в интактной печени и увеличение экспрессии (не более, чем в 1,5 раза) наблюдается только в середине лререгошкативного¡ периода. На экспрессию'гена пируват киназы Ъ-типа облучение гепатоцитов на стадии в} оказывает противоположный эффект: с середины пререпликатявного периода до перехода клеток в Б-фазу уровень транскриптов этого гена .значительно превышает контрольный уровень.. Очевидно, что активация экспрессии гена пируват киназы.после облучения в фазе С^ связана с пострадиационными нарушениями' пролиферации гепатодатов и в первую очередь с задержкой перехода

;" При рассмотрении данных о пострадиационных, изменениях экспрессии генов с-Гоз, с-На-гаэ и пируват киназы обращает внимание интервал времени между 36-44 ч п.О., в течение которого уровень транскриптов - указанных ге.нов выше, чем в контроле. По-видимому, в данном случае уровень экспрессии генов отражает количество гепатоцитов, находящихся на стадии репликации ДНК. В этот период при регенерации печени в контроле гепатоциты составляют не более 1/3. пролифврируыцих клеток, в то время как после облучения волна пролиферации' представлена исключительно гепатоцитами. . • •

Приведенные результаты свидетельствуют о том, что при регенера-щга печени облученных крыс "клеточный цикл-зависимая" экспрессия сохраняется только для протоонкогенов с-1оз и с-На-газ и генов, кодирующих пируват киназу Ь-типа и а-оубъединицу в^-белка. Пострадиационное инрибкровяние экспрессии гена а+-субъединицы НаТк+-АТФазы указывает на то, что стимулированная пролиферация гелатоцитов может осуществляться при пониженном уровне транскриптов этого гена. Таким образом, экспрессия гена Ш,К+-АТФазы не является строго "клеточный цикл-зависимой". Напротив, для с-1оз, с-На-газ, .генов пируват киназы и 01а-бежа обнаружена связь между активацией их экспрессии в облученных гепатоцитах и проховдэнием клетками определенных стадий цикла (переход 00Л5р середина пререпликативного периода и переход С-^/Б.). В контроле эти стадии митотического цикла гепатоцитов также характеризуются увеличением уровня транскриптов указанных генов. Влияние радиации на экспрессию "клеточный цикл-зависимых" генов проявляется в основном в количественных изменениях уровня их.транскриптов. Общей закономерностью является пострадиационное подавление. экспрессии генов по сравнению с контролем. Для большинства генов справедливо заключение о том, что после облучения гепатоцитов в фазе уровень транскриптов снижен в большей степени, чем после облучения в фазе С0. Пострадиационное превышение уровня транскриптов некоторых генов над контролем и интервалы времени, соответствующие задержке перехода С0/С1 (с-Гов) и в^/Б (с-На-гае, пируват киназа).по-видимому, связано с участием этих генов в регуляции пролиферации облученных клеток.

ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ, КОДИРУЩЧХ СЕКРЕТОРНЫЕ БЕЛКИ, В ГЕПАТОЦИТАХ НЕОоЛУЧЕННОЙ РИдардашЦЕЙ ПЕЧЕНИ В условиях нашего эксперимента в печени крыс после удаления 2/3 органа определяются транскрйптн двух генов: а?-макроглобулина (о^-МГ) и сиьсцютчиопо альОумияа (альбумин), мРНН «--феточратеина не доте.Ч'Пфунп'ся.

В клетках регенерирующей печени в исследуемый период после частичной гепатэктомии обнаружено увеличение уровня транскриптов гена og-МГ по сравнению с интактннм органом (рис.4 А). Уровень мРНК в интактной печени чрезвычайно низок, но резко увеличивается уже в первые часы после операции. Усиление экспрессия «g-MT происходит между 0,5-4 ч, 6-10 ч п.о., но основной ник ее активации охватывает интервал времени с 16 до 36 ч п.о. Максимальное превышение уровня транскриптов а2-МГ в регенерирующей печени над уровнем в интактной достигает 15-20 раз. Аналогичную картину активации экспрессии гана '^-макроглобулина в печени крыс наблюдали (Schreiber, 1986) при остром восспалении в эксперименте, вызванном инъекцией скипидара. Полученные данные согласуются с представлением о а^-макроглобулине как белке "острой фазц". При регенерации печени увеличение уровня транскриптов гена о^-МТ обусловлено реакцией клеток паренхимы на операционную травму, которая в.основном связана с гепатоцитами, находящимися в состоянии покоя.

Операция по удалению 2/3 печени вызывает также изменение экспрессии гена сывороточного альбумина (рис.4 Б). В исследуемый интервал времени в регенерирующей печени наблюдается чередование периодов увеличения и снижения уровня транскриптов данного гена. Незначительное возрастание экспрессии по сравнению с уровнем в интактом органе (не'более, чем в 1,5 раза) происходит между 0,5-3 ч и 16-36 ч п.о. В целом количества транскриптов гена альбумина в клетках регенерирующей печени близко к их содержанию в интактной, что согласуется с данными, полученными в работах (Thompson, 1987; Friedman, 1984).

.Таким образом, при регенерации печени крыс происходит активация экспрессии гена а^-макроглобулина, участвующего в. реакции "острой фазы", в то время как уровень экспрессии гена.сыьороточното альбумина - основного секреторного белка гематоцитов.у взрослых животных практически не изменяется. • . * .

Рис.4 Динамика изменения экспрессии генов, кодирующих. а0-макроглобулин (А) и сывороточный альбумин (Б) в печени крыс после частичной . гепатэктомии. (▼—«")- контроль; \о~-о)~ облучение за -0,5 ч до операции; (•—облучение через 6 ч после операции. Ордината - уровень транскриптов генов.в процентах от интактной печени; абсцисса - время после операции.

В.ШШЕ ОБЛУЧЕНИЯ НА ЭКСПРЕССИЮ ГЕНОВ, КОДИРИОЩ СЕКРЕТОРНЫЕ БЕЛКИ, В ГЕПАТОЦИТАХ РЕГЕНЕРИРУЮЩЕЙ ПЕЧЕНИ При обеих схемах облучения (за 0,5 ч до операции и через 6 ч после операции) экспрессия генов, кодирующих а^-макроглобулин и сы-Еороточный альбумин, подавляется по сравнению с контролем (рис.4 А, ■Б),Тем не менее, уровень транскриптов гена с^-МГ на протяжении почти всего исследуемого периода регенерации облученной печени превышает таковой в интактном. органе. Следует отметить, что при облучении за 0,5 ч до операции возрастание уровня экспрессии гена происходит через 4 ч п.о.,т.е. активация экспрессии с^-макроглобулина задерживается по сравнению с контролем. Существенных различий е уровне экспрессии этого гена при обеих схемах облучения не наблюдается. Воз-дейсгаил радиацией приводиг к ингибировакию экспрессии гена альбумина в рчрлюрипумщей печени по сравненью с интактной. Уровень экспре-

ссии данного гена при обеих схемах облучения приблизительно одинаков. Отсутствие в литературе сведений о пострадиационном изменении экспрессии генов а2-макроглобулина и альбумина в регенерирующей печени не позволяет сравнить результаты наших экспериментов о данными других авторов. '

Полученные данные об уровне транскриптов о^-макроглобулина и сывороточного альбумина в регенерирующей печени крыс свидетельствует о том, что пострадиационные изменения экспрессии этих генов не зависят от того, когда производилось облучение (до или после операции). »Активация экспрессии гена с^-макроглобулина в облученной регенерирующей печени сохраняется, в то время как экспрессия гена альбумина оказалась подавленной.

вывода

1. Облучение гаштоцитов в состоянии покоя (фаза С0) приводит к более 'длительной задержке начала синтеза ДНК по сравнению с радиационным воздействием в середине ггрврешшкативного периода ммтотического цикла (фаза ).

• 2. Характер пострадиационных изменений экспрессии генов в гепатоци-тах регенерирующей печени зависит от фавн клеточного цикла, в которой произведено облучение. Воздействие радиацией в фазе'подавляет экспрессию большинства изученных генов в большей степени,- чем облучение в фазе что может свидетельствовать о повышенной радиочувствительности транскршщионно активированных генов.

3. Воздействие радиацией вызывает дополнительную активацию экс1фег,-сии некоторых "клеточный цикл-зависимых" генов: с-Гиз и с-На-га» протоонкогенов лри облучении в фазе С0 и г«на пируват киназн Ь-типа 1 при облучении в фазе Превыиение уровня экспрессии этих генов над контролем наблюдается ■ в периода, соответствующие пострадиационной задержке перехода'00/й1 и О-^/З.

4. Экспрессия-генов, транскрипции которых не уеил1тне*ся при рога-

нерации печени, падает после облучения ниже уровня в интактном органе (а+-субъедашицы На|"К+-АГФазы, альбумина). Активация экспрессии генов, связанных с пролиферацией гепатоцитов .(c-fos, c-Ha-ras, пиру-ват киназы, а-субъединицы G^-белка) или реакцией "острой фазы" (ag-макроглобулина) после воздействия радиацией сохраняется, т.е. обнаруживается связь между функцией генов и пострадиационными изменениями их экспрессии.

5. Изменения экспрессии-генов в облученных гепатоцитах регенерирующей печени крыс определяются индивидуальными механизмами их регуляции, участием в клеточных программах (пролиферация, дифференцировка) и состоянием генома в момент радиационного воздействия. п

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

I. Влияние ионизирующего излучения на экспрессию клеточных генов и протоонкогенов в различных органах крысы.//Тез.докл.науч.конф."Актуальные вопросы экспериментальной и клинической рентгено-радиологии". Л.-1988-С.248/Соавторы: Евтушенко в.И..Боровицкая А.Э.Дербин Е.А., Хансон К.П.

Z. Экспрессия клеточных генов и протоонкогенов в органах облученных крыс.//Тез.докл.Всесоюзн.симп."Объем и метода генотоксической оценки и побочных эффектов биологически активных веществ.Л.-I989-C.37-38 /Соавторы: Евтушенко В.И., Боровицкая А.Э., Хансон К.П.

3. Влияние облучения в GQ и Gj стадиях митотического цикла на экспрессию клеточных генов и протоонкогенов в клетках регенерирующей печени крыс,//Тез.докл. I Всесоюзн-радиобиологич.съезда.Пущино.-1989-T.I. -О Л32-133/Соавторы: Евтушенко В.И., Хансон К.П. .

4. Определение верхнего предела величины экспрессии генома крысы. //Молекулярная биология-I989-Т.23,Вып.3.-С.663-675/Соавторы: Евтушенко В.П.,Хансон К.П..Емельянов A.B..Решетников В.Л..Козлов А.П.