Исследование структурно-функциональных механизмов клеточной радиочувствительности

Гильяно, Надежда Яковлевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Исследование структурно-функциональных механизмов клеточной радиочувствительности
ВАК РФ 03.00.01, Радиобиология

Автореферат диссертации по теме "Исследование структурно-функциональных механизмов клеточной радиочувствительности"

РГ6 ОА

- 5 Ш 1995

На правах рукописи

Г И Л ь Я н О

Надежда Яковлевна

ИССЛЕДОВАНИЕ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ МЕХАНИЗМОВ КЛЕТОЧНОЙ РАДИОЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ.

(03.00.01 - радиобиология)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Санкт-Петербург 1995

Работа выполнена в Отделе Молекулярной и Радиационной Биофизики ( ОМРБ) Петербургского Института Ядерной Физики (ПИЯФ) им.Б. П. Константинова Российской Академии Наук.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук.профессор И.И. Пелевина, доктор биологических наук А.С.Ягунов. доктор биологических наук М.В.Архипов.

Ведущая организация - Институт цитологии РАН

Защита диссертации состоится "_"_____ 1995г. в 12 часов на

заседании Диссертационного Совета Д 074.23.01 в Центральном научно-исследовательском рентгено-радиологическом институте МЗ России по адресу: 188646, С.-Петербург, Песочный-2. ул.Ленингг радская, д. 70/4. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан"_"апреля 1995 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета

Л.И.Корытова

- 3 -ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность темы: Исследование механизмов, регулирующих воздействие ионизирующей радиации на нормальный жизненный цикл, является одной из приоритетных областей радиационной биологии. Для понимания механизмов клеточной радиочувствительности существенна идентификация первичных повреждений и определение их значения в клеточной летальности.

Известно, что первичные повреждения, индуцированные ионизирующим излучением разного качества, реализуются в летальное для клетки событие с разной вероятностью. Спектр радиационных повреждений, индуцируемых ионизирующим излучением с разной ЛПЭ, варьирует от простых разрывов ДНК до локально поврежденных сайтов, возникающих в результате кластерированного выделения энергии. Предполагается, что закономерности изменения радиочувствительности являются результатом различной эффективности пострадиационной репарации при одинаковой первичной поражаемое™ структур клетки, ответственных за радиационный эффект. Клетка, прогрессирующая по генерационному циклу, является естественной моделью для изучения эффективности работы "репарационных систем. В клеточном цикле эукариот фундаментальная роль митоза заключается в точности разделения дуплицированного генетического материала между дочерними клетками. Как сам процесс клеточного деления, так'и точность разделения генетического материала очень чувствительны к действию ионизирующего излучения.Способность клеток задерживать прогрессию по клеточному .циклу защищает их от генетических изменений.Митотическая активность приводит к фиксации повреждений ДНК, индуцированных ДНК-тропными агентами. Радиациокно -индуцированная задержка клеточного деления коррелирует со способностью клеток репарировать первичные радиационные повреждения и , тем самым, определяет клеточную радиочувствительность. Практически все биологические процессы (пролиферация,транс-Формация, регенерация. дифференциация, онтогенез) сопровождаются изменением структуры хроматина в клетке. Кроме того, выход отдельных радиационно - химических повреждений и характер превращений нуклеиновых кислот, возникающих в результате этих повреждений, также во многом зависят о г компактности упаковки ДНК в хроматине. Данных о клеточной радиочувствительности при облучении целого организма излучением с различной ЛИЛ по различным критериям, таким как кинетика клеточной пролнФорпции. шшукчнн и репарация хромосомных и геномных мутаций, конфирмационные изменения xprnin•

тина,практически отсутствуют. Этот пробел могут восполнить исследования! выполненные на естественно синхронизированной клеточной популяции гепатоцитов крыс. Наличие Со-периода в клеточном цикле гепатоцитов позволяет сравнить радиочувствительность покоящихся и пролиферирующих клеток. Исследование закономерностей образования хромосомных аберраций при облучении покоящихся и пролиферирующих клеток, поможет лучше понять механизмы, определяющие различия в реакции на облучение клеток, находящихся в различных физиологических состояниях.Предполагается, что неэффективность фракционирования дозы при облучении покоящихся клеток печени обусловлена отсутствием репарации повреждений хромосом на этапе,предшествующем формированию хромосомных перестроек. Молекулярные механизмы этой репарации пока не изучены. Возможно, что активные процессы (репарации и фиксации) протекают только при и / или после перехода покоящихся клеток к пролиферации. Если это так, то и модификация эффекта ионизирующего излучения существенна только в момент перехода клеток из Со в С1 - период генерационного цикла. Из изложенного видна важность определения момента перехода клеток из состояния покоя к пролиферации'. Подобного рода данные в литературе отсутствуют.

Таким образом, комплексное исследование изменения структуры хроматина и индукции и элиминации радиационно-индуцировакных нарушений наследственных структур клетки позволит лучше понять молекулярные механизмы, ответственные за эти нарушения. На основе зтих исследований возможна выработка новых представлений о роли кон-формации хроматина в реализации первичных повреждений ДНК в фикск-^ рованные мутации,с последующей модификацией радиационных эффектоз. Кроме того, возможно создание высокоселективных подходов в биологической дозиметрии.

Цели исследования: Идентификация радиационных повреждений и определение их значения в различных клеточных эффектах; исследование взаимосвязи первичных повреждений и регистрируемых клеточных реакций на облучение с цель» выяснения механизмов реализации их в летальное для клетки событие; изучения возможности модификации действия ионизирующего излучения как.при облучении целого организма, так и клеточной популяции.

Задачи исследования: 1.Исследование кинетики клеточной пролиферации с целью определения параметров клеточного цикла и идентификации периода митотического покоя в клеточном цикле гепатоцитов крыс.

2. Исследование влияния ионизирующего излучения на кинетику клеточной пролиферации с целью выяснения роли торможения синтеза ДНК и задержки митоза в конечном эффекте задержки клеточного деления.

3.Изучение задержки митоза , индуцированной ионизирующим излучением с различной ЛПЭ, с целью выяснения механизмов данной реакции клеток на облучение.

4.. Сравнительное исследование изменения клеточной радиочувствительности на протяжении различных периодов клеточного цикла по индукции хромосомных и геномных мутаций.

5. Изучение конформационных изменений хроматика в гепатоцитах в процессе клеточной пролиферации и после облучения крыс ионизирующим излучением с различной ЛПЭ.

6. Исследование корреляции между состоянием хроматина и процессом репарации хромосомных повреждений при фракционировании дозы облучения.

'/.Оценка роли топологических изменений структуры ДНК и белков хроматина на модификацию репарационных процессов радиационнз-инду-цированных повреждений хромосом.

8". Изучение возможности изменения радиочувствительности клеток с помощью химических радиопротекторов, и оценка их влияния на конфор-мационные изменения хроматина.

9. Оценка влияния возрастного фактора на ряд клеточных реакций на облучение с целью выяснения возможных механизмов аккумуляции повреждений в наследственных структурах с возрастом животного.

Научно-практическое значение: Исследования радиочувствительности клеток являются той основой, которая в конечном счете позволяет оценить степень радиационной опасности ионизирующего излучения для живых организмов. Оценка степени опасности ионизирующего излучения для живых организмов развилась в целое направление в радиобиологии, именуемое биологической дозиметрией ионизирующего излучения. Использование различных клеточных реакций на облучение , а также использование различных методов оценки этих реакций : от традиционного трудоемкого микроскопирования до автоматизированного проточ-но-цитометрического позволило нам выделить наиболее чувствительные клеточные реакции для индикации дозы и качества излучения.Полученные данные позволили:

1) открыть принципиально новые закономерности полнплоидизации непролиферирующих и пролиферирующих клоток;

2)сформулировать гипотезу о роля радиационного повреждения

мембран в реализации эффекта полиплоидизации гепатоцитов;

3)выявит? существенную зависимость эффекта полиплоидизации от качества излучения,что позволило предложить использование данной кле точной реакции для ЛПЭ-метрии излучения ( Авторское свидетельство N1539619)

Благодаря разработанному нами цитометрическому методу оценки конформации хроматина в клетках была получена возможность:

1) регистрации спонтанных повреждений наследственных структур на клеточном уровне;

2) индикации малых доз ионизирующего излучения;

3) идентификации покоящихся и пролиферирующих клеток по степени конденсированности хроматина,что позволяет нам предложить этот метод для анализа популяции опухолей, для более успешного применения как химической, так и лучевой терапии.

Зарегистрированная нами-зависимость процесса репарации хромосомных повреждений от степени конденсированности хроматина в клетках позволила нам предположить; что процесс репарации хромосомных повреждений детерминирован доступностью поврежденных участков действию ферментов репарации. Усиление или ослабление радиационного эффекта теми или иными модификаторами радиационного .поражения, позволит лучше понять не только природу первичных повреждений, но также проследить их трансформацию в фиксированные повреждения, приводящие в конечном счете к инактивации клетки,и определить оп-' тимальные условия протекания репарационных процессов. Модификация эффективности ионизирующего излучения представляет интерес как для направленного повышения резистентности организмов к радиационным воздействиям, так и для избирательного повышения чувствительности опухолей в радиотерапии.

Научная новизна. Впервые целым рядом независимых методов исследована кинетика клеточной пролиферации гепатоцитов крыс в процессе регенерации органа. Определен момент перехода покоящихся гепатоцитов в пререпликагивный период митотического цикла. Впервые проведено сравнительное исследование клеточной радиочувствительности по целому ряду клеточных реакций на облучение. Впервые зарегистрирован эффект слияния непролиферирующих гепатоцитов после облучения крыс нейтронами в малых дозах. Впервые установлены два различных механизма индуцир занной полиплоидизации гепатоцитов при действии редко- и плотноионизирующего излучения. . Обнаружена качественная разница в эффекте на цитологическом уровне для излучений с разной

ЛПЭ. Впервые показана зависимость эффективности индуцированного слияния клеток от возраста облучаемого животного. Впервые с помощью метода проточной цитометрии показана дозо-зависимая декон-денсация хроматина гепатоцитов при облучении крыс рентгеновыми лучами и нейтронами деления в малых дозах. Обнаружена зависимость данной реакции клеток на облучение от стадии клеточного цикла, ЛПЭ излучения и возраста облучаемого животного. Впервые показана зависимость процесса репарации хромосомных повреждений от состояния хроматина в клетках в момент облучения. Продемонстрирована возможность модификации репарационного процесса с помощью изменения степени конденсированности хроматина. Впервые на гепатоцитах крыс продемонстрирован пострадиационный радиозащитный эффект цистеами-''на. Показана зависимость модифицирующего действия химического радиопротектора от степени конденсированности хроматина в "летках. Показана его способность уменьшать связывание флуоресцентных красителей с ДНК. Продемонстрирована корреляция степени конденсиро-.ванности хроматина в клетках с уровнем спонтанных повреждений наследственных структур клетки.

' Апробация работы: Материалы диссертации были доложены на Ш • симпозиуме по радиационной генетике, Мозжинка. 1972; на -1-ой Радиобиологической конференции Социалистических стран. Брно,1974; на Всесоюзном совещании :"Кинетика клеточных процессов и ее роль в лучевой терапии опухолей",Обнинск,1977;на Всесоюзной конференции "Восстановительные и компенсаторные процессы при опухолевых поражениях", Ленинград, 1986; На 1 Всесоюзном совещании по биофизике рака, Черноголовка,1987; на Ш Республиканском совещании по автоматизации цитологических исследований, Киев, 1988; на 1-м Всесоюзном биофизическом сьезде,1982; на 1-м и 2-м Всесоюзных радиобиологических сьездах, Москва, 1989, Киев, 1993; на 5-м и 6-м Всесоюзных совещаниях по микродозиметрии, Усть-Нарва ,1986; Канев,1989;на Всесоюзном совещании "Генетические последствия загрязнения окружающей среды мутагенными факторами", Самарканд, 1990; на 9-м Интернациональном Конгрессе Радиобиологов, Торонто,1991; на 24-м и 25-м Ежегодных совещаниях Европейского общества радиационных биологов. Эрфурт,1992; Стокгольм,1993; Амстердам, 1994.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 38 работ.

Структура и обьем диссертации. Работа изложена на 311 страницах машинописного текста, состоит из введения, 4 глав и выполни, содержит 21 таблицу, 59 рисунков. Список .питеротури пк.пю'нсг и<3

названия,из которых 72 на русском языке и ill на английском языке.

Глава 2. Материал и методы исследс ,ания.

Работа выполнена на самцах белых крыс питомника "Рапполово". материалом исследования служила печень крыс. Экспериментальный материал получен при исследовании нескольких тысяч животных. Эксперименты проводилить также и на клетках млекопитающих в культуре. В работе использованы две клеточные линии : человеческой карциномы линия Hela и фибробласты Китайского хомячка линия V-79. Р качестве питательной среды использовали среду Игла с 15%-м содержанием сыворотки крупного рогатого скота. Синхронизацию клеток проводили с помощью механической селекции.

Клеточную суспензию гепатоцитов получали с помощью перфузии печени раствором цитрата Na, которую фильтровали и затем центрифугировали в течение 5 мин. при 1000 об./мин. Осадок фиксировали этанолом. начиная с 50%,70%,96% .

Для цитогенетического анализа суспензия гепатоцитов наносилась на предметные стекла. После высыхания мазки фиксировали этанолом и затем окрашивали либо ацетсорсеином, либо метиленовым зеленым, либо тем и другим одновременно. Для подсчета хромосомных повреждений мы использовали анафазный метод,поскольку он не требует дополнительных воздействий на клетки (будь то колхицин или винбластин), к которым клетки проявляют дифференциальную чувствительность.

Для оценки митотического индекса просчитывали % митотическиХ клеток. ДНК - синтетическая активность в клетах оценивалась с помощью ряда методов,среди которых радиоавтография, метод меченых митозов к измерение удельной радиоактивности. Общим для всех этих методов является включение в ДНК гепатоцитов меченого тимидина. За час до декапитации животным вводили вт'трибрюшинно меченый тритием тимидин в дозе 0,3мк кюри на 1 г веса и через каждые 2 часа, начиная с 14 до 30 часов после частичной гепатэктомии, фиксировали материал. Мазки из клеточной суспензии гепатоцитов фиксировали этанолом. окрашивали ацетоорцеином и затем покрывали эмульсией типа "Р"НИйХИМФ0Т0ПР0ЕКТ. Препараты экспонировали в течение 2-х недель при температуре -4°С. После чего их проявляли и считали либо число меченых клеток . либо число меченых митозов из ста случайно выбранных на стекле. Перед подсчетом числа меченых клеток е каждом препарате определяли "фон" радиоавтографов. Мечеными считались ядра, число, зерен серебра над которыми превышало максимальный для данного препарата фон.

Для учета изменения удельной радиоактивности клеток, клеточную суспензию гепатоцитов центрифугировали и титровали до концентрации 10 ООО клеток в 1 мл. Во всех Пробах равное количество клеток осаж дали на мембранных фильтрах "Сынпор" с диаметром 0, бмкм и затем промывали фильтры 3% раствором ТХУ и 95% этиловым спиртом, после чего фильтры высушивали. На сцинтилляционном счетчике "МагК 2" анализировали фильтры во флаконах со сцинтилляционной жидкостью ' (0.4% РРО;0.01%РОРОР в толуоле).

Для определения временной взаимосвязи между синтезом ДНК и митозом мы метили клетки не импульсно. а интегрально. Изотоп вво дился через каждые 2 часа, начиная с 14 до 32 часов после частичной гепатэктомии, а фиксация материала производилась одномоментно во время 1-го и 2-го максимумов митотической активности.

Анализ клеточной суспензии гепатоцитов и клеток млекопитающих в культуре проводили на проточных цитоф уориметрах, созданных в Отделе молеку..::рной и радиационной биофизики Ленинградского института ядерной физики АН СССР. Прибор создан по аналогии с зарубежными приборами с использованием лазерного луча для возбуждения флуоресценции клеток.окрашенных флуоресцентными красителями. Анапиз гепатоцитов проводили также и на однопараметровом проточном цитофлуо-риметре с . автоматической системой регистрации и' накопления данных, выполненных из модулей в стандарте "КАМАК". Источником возбуждающего флуоресценцию света служит ртутная лампа ДРШ-250.

Для анализа конформационного состояния хроматина в клетках они окрашивались.бромитсым этидием в низких, ненасыщающих концентрацг-ях. Фиксированные этанолом клетки отмывали от фиксатора буферным раствором 2 SSC. Для удаления РНК клетки инкубировали в течение 60 мин. . при 37сС в растворе РНК-азы (0,1млг/мл), затем отмывали от РНК-азы раствором 2 SSC_и окрашивали раствором бромистого этидия в конечной концентрации_10®М. Для анализа клеточной популяции на установке. где источником возбуждения флуоресценции является УФ -лампа, клетки окрашивали DAPI (4.6 - DlamMino-2-piienylindole 2 HCl). Клетки отмывали от фиксатора раствором 2 SSC и затем помещали в раствор красителя в конц.О,1 мкг/мл на 15-30 мин. при температуре 37 С и анализировали на установке.

Результаты цитометрического анализа подвергали компьютерной обработке. Компьютерная обработка позволяет вычислять: - o'/iuee число зарегистрированных клеток; - количество клеток, принадлежащих разным зонам ( что и соотпстствует плоидности ¡¡леток ), а за-

тем вычисляется их процент к общему числу клеток; - положение мод для клеток каждого уровня плоидности; - коэффициенты вариации для каждой группы клеток.

Об лучение животных и клеток проводили на рентгеновском аппарате РУМ-11 при напряжении 250 кУ, силе тока 15мА, фокусном расстоянии 40см, фильтрах 0,5мм Си +1мм А1 и мощности дозы 1,94Гр/мин. Источником гамма-лучей являлся Со 60. Мощность дозы на установке "Исследователь" была 48 Гр/мин. и 1.5Гр/мин. на установке "МИДИ". Облучение животных и клеток нейтронами проводили в специально оборудованном для радиобиологических экспериментов вертикальном канале реактора ВВР-М ПИЯФ АН Р. Дозиметрия в рабочем обь-еме биокамеры осуществляется с помощью двух ионизационных камер -полиэтиленовой и графитовой. Погрешность измерения мощности : дозы приблизительтно 15%. Неравномерность нейтронного и гамма-поля в рабочем обьеме биокамеры не больше 10%. Облучение биообьектов проводилось при тепловой мощности реактора 16-18 Мвт. Мощность дозы нейтронов при этом равна 0,3-0,33 Гр/мин, а гамма - излучения 0,11 - 0.12 Гр/мин. Источником моноэнергетических нейтронов служил генератор с выходом 10*?-1,созданный в ПИЯФ РАН. Нейтроны, полученные в реакции Т3( д2,п)4 Не. В работе использованы тритиево-тита-новые мишени. Выход нейтронов был пропорционален току на . мишени. Абсолютное значение выхода определялось по активации медных фольг и при токе 15мА и ускоряющем напряжении160кВ составляло 10с -1 с точностью 5%.

При статистической обработке результатов экспериментов за пов-торность принимались данные каждого отдельного эксперимента , выполненного на клетках млекопитающих в культуре и для каждого отдельного животного в экспериментах на крысах. На каждую экспериментальную точку приходилось от 6 до 12 животных. В каждом случае вычислялось среднее х = х /п и ошибка среднего по формуле:

где X - выборочное среднее значение, X;- экспериментальное значение отдельного (1 -того) измерения, п - количество повторов. ■

1. Кинетика клеточной пролиферации гепатоцитов крыс после частичной гепатэктомии.

Результаты наших исследований по кинетике клеточной пролиферации позволяют нам предложить некоторую схему развития событий в

Результаты и обсуждение.

клетках печени крыс в процессе регенерации органа (рис.1). В течение первых 40 часов после частичной гепатэктомии в клетках отмечается два максимума ДНК синтетической и митотической активности. Это указывает на существование двух субпопуляций клеток в течение этого периода. При сопоставлении положения пиков синтеза ДНК и митотической активности клеток этих двух субпопуляций видно, что продолжительность 01 периода у них различна. Этот факт позволяет предположить в первом генерационном цикле особого периода в течение которого происходит перестройка физиологического состояния клетки,после чего она вступает в истинный пререпликативный период митотического цикла. Для повторного деления наличие этого периода "трансформации" необязательно, и поэтому у повторно делящихся клеток предсинтетический период короче. Проведенная нами количествен ная оценка состава клеточной популяции регенерирующей печени пока зала, что в первом митотическом цикле из 95% воспринявших проли феративный стимул вступает в митоз только часть, а 20% задерживаются в й2 или,точнее,выходят из митотического цикла и делятся только во время второго митоза. Такая сложная кинетика клеточной пролиферации в процессе регенерации органа должна учитываться при оценке клеточной чувствительности к.тем или иным воздействиям. Определение временных параметров первого и второго генерационных циклов гепатоцитов доказывает как сам факт их повторного деления, так и наличие так называемой "С2"-популяции , относительно наличия и местоположения которой в клеточном цикле до сих пор ведутся дискуссии. Следует также подчеркнуть, что стимуляция клеточной пролиферации зависит от возраста животного, число клеток воспринимающих стимул уменьшается с увеличением возраста животного. Это может быть результатом двух причин: либо с возрастом уменьшается число рецепторов, воспринимающих стимул, либо уменьшается чувствитель ность рецепторов.

Количественная оценка параметров первого генерационного цикла, проведенная с помощью графического метода Квастлера-Шермана показала, ЧТО Тд = 23 4. ,ТС1 - 13 Ч., ТБ = 6,5 ч. , Т 02+М = 3,5 ч. Продолжительность С1-периода определялась с момента стимуляции клеток к пролиферации. Определение момента перехода клеток из Со в (И-период митотического цикла позволит решить ряд вопросов, ь частности: наличие и продолжительность периода трансформации покоящейся клетки в пролиферирующую.

Известно, что в периоде гл. как и п других периодах ммтотичес

кого цикла, наблюдается снижение радиационного эффекта при фракционировании дозы во времени, чего нет в состоянии С-о.Мы использовали эту радиобиологическую характеристику покоящихся клеток для опреде лекия момента перехода клеток из митотического покоя к пролиферации после частичной гепатэктомии крыс.: Из соотношения кривых, представленных на рис.1 .видно, что клетки в течение первых 3 -х часов .цосле частичной гепатэктомии также,как и в интактной печени. не способны к восстановлению радиационных.повреждений.Через 4 часа после операции и позже наблюдается уменьшение доли аберрантных клеток при фракционированном облучении. При этом достигается уровень аддитивности эффектов двух облучений, т.е. уровень теоретически полного восстановления,

Полученные результаты однозначно свидетельствуют о существовании перехода клеток печени после частичной гепатэктомии из фазы митотического покоя в истинный предсинтетический период митотического цикла. Этот факт может служить одним из прямых экспериментальных доказательств альтернативности состояний Со и 01. До сих пор в литературе,посвященной этому вопросу» существуют разночтения при оценке чувствительности клеток задержанных в;С1- периоде в.течение продолжительного периода и ¿¡стинным йо. 2. Влияние рентгеновского облучения на кинетику клеточной пролиферации регенерирующей печени крыс.

Влияние рентгеновского излучения на кинетику клеточной пролиферации оценивали по продолжительности блоков - М и - Б. Изменение ДНК-синтетической активности позволяет оценить вклад блока С1-Б в общую задержку деления. Из результатов экспериментов (рис.2) видно,что у необлученных животных максимум ДНК-синтетической активности' (47% меченых клеток) приходится на 22 час после частичной гепатэктомиил. В клетках печени животных, облученных до гепатэктомии. максимум синтеза ДНК наступает к 24 часу после стимуляции (44% меченых" клеток). При сопоставлении положения максимумов ДНК-синтетической"- активности и числа меченых клеток печени необлученных и облученных до гепатэктомии животных видно, что облучение в дозе'6,3 Гр задерживает начало синтеза ДНК примерно на 2 часа, но после восстановления' от облучения, число клеток, синтезирующих ДНК, достигает контрольного уровня. В клетках печени животных, облученных в том же йо периоде, но только после гепатэктомии. продолжительность блока 01-3 составляла уже не 2. а 4 часа, причем число клеток, синтезирующих ДНК,вдвое меньше, чем у необ-

Со

§ Ю 60

2,6 Гр

■ /;2,6Гр +1час +2,6ГР

ЬЧГ 1/ \

Митотическая Лк ¡1 активность

часы после частичной гепатэктомии Рис.1.Кинетика клеточной пролиферации гепатоцитов

частичной гепатэктомии.

крыс

после

облучение

§1 I-

■ х ТЛ 3 Ж 0) ф гс ж !

о 4 к о " Ег

после гэпатэктомии 6 часов . , I 2.5 и

до гепатэктомии

у/. *

время после частичной гепатэктомии (часи ) Рис.2.Влияние рентгеновского облучения на кинетику клеточной пролиферации регенерирующей печени крыс.

митотическая активность у необлученных (3) облученных жизотных(4) .синтеза ДНК - (1)/ - (2)

лученных и облученных до гепатэктомии животных. Облучение животных через 6 часов после стимуляции (С1 -период) также индуцирует блок 01-3 продолжительностью 4 часа. Число клеток,синтезирующих ДНК,вдвое меньше, чем у необлученных и облученных до гепатэктомии животных. Таким образом, облучение животных рентгеновыми лучами приводит к задержке начала синтеза ДНК в клетках регенерирующей печени .. крыс независимо от момента- облучения, а продолжительность задержки синтеза ДНК зависит от момента облучения. Облучение гепа-тэктомированных животных индуцирует не только более продолжительный блок - Б, но и существенно снижает число клеток,синтезирующих ДНК после снятия блока по сравнению с необлученными животными. Зависимость продолжительности блока С1-Э от момента облучения зарегистрирована впервые. По-видимому, в медленно пролиферирующей клеточной популяции облучение нарушает механизм стимуляции клеточного деления и в облученной печени меньшая доля клеток осуществляет переход из Со в С1-период, чем в необлученной.

Одновременные исследования влияния облучения на синтез ДНК и митотическую активность позволили нам количественно-оценить вклад блоков С1-Б и С2-М в общую задержку деления (рис.2). При сравнении положения пиков митотическэй активности гепатоцитов необлученных и облученных после гзпатэктомии крыс видно, что максимум митотичес-кой активности у облученных животных наступает к 31 часу после стимуляции, а число клеток в митозе примерно одинаково у необлученных и облученных до -гепатэктомии животных. У гепатэктомирован-ных крыс за 2,5 и 6 часов до облучения максимум митотической активности в гепатоцитах наступает к 33 часу, а число митотических фигур почти вдвое меньше, чем у необлученных крыс. Из изложенного следует, что продолжительность блока С2-М составляла 2 часа, вне зависимости от того облучались ли негепатэктомирсванные или гепа-тэктомированные крысы. Задержка митозов от дозы рентгеновского облучения носила линейный характер. Ионизирующее излучение индуцирует также и необратимую задержку деления, которая приводит к полип-лоидизации гепатоцитов.

3. Индукция полиплоидизации гепатоцитов крыс рентгеновыми лучами в различных периодах клеточного цикла.

Индукция полиплоидизации ионизирующим излучением - явление недостаточно изученное. Механизмы, лежащие в основе образования полиплоидных клеток, не ясны. Из результатов экспериментов (рис.3) вилно. -П'о раяиационно-индуцированная полиплоидкзация пролиферирую

содержание ДНК на клетку

Рис. 3. Индукция полипЛоидизашш гепатоцитов крыс рентгеновыми лучами в различных периодах клеточного цикла.

часы после частичной гепатзктомии Рис. 4. Сравнительное исследование радиочувствительности гепатоцитов крыс по выходу хромосомных и геномных мутации в течение генерационного никла.

щих гепатоцитов носит дозоз^висимый характер. При сопоставлении же действия одной и той же дозы в различные периоды клеточного цикла наибольшая эффективность рентгеновых лучей в индукции полиплоиди зации гепатоцитов наблюдается при облучении животных в Б- периоде клеточного цикла. Процент октаплоидных клеток у животных, облученных через 20 часов после частичной гепатэктомии. увеличивается в 10 раз по сравнению с негепатэктомированным контролем. Облучение негепатэктомированных крыс (Со-период) рентгеновыми лучами в различных дозах вплоть до ЗОГр не приводило к заметному перераспределению клеток по уровням плоидности. Облучение негепатэктомированных крыс в различных дозах рентгеновыми лучами с последующей их стимуляцией к пролиферации с помощью частичной гепатэктомии также, как и в гепатэктомированных до облучения животных, приводило к заметному изменению перераспределения клеток по уровням плоидности. Чувствительность гепатоцитов крыс , облученных рентгеновыми лучами и гепатэктомированных через 4 часа после облучения, оказалась равной таковой для клеток.

Сравнительное исследование увеличения плоидности клеток в процессе естественного-старения и после воздействия различных доз рентгеновского излучения показало, что увеличение средней плоидности в первом и во втором случаях носит линейный характер.

4.Сравнительное исследование радиочувствительности гепатоцитов крыс по выходу хромосомных и геномных мутаций в течение первого генерационного цикла.

Кинетика выхода клеток с хромосомными аберрациями в регенериру ющей печени крыс при облучении в различных периодах клеточного цикла сходна в общих чертах с кинетическими кривыми клеточной выживаемости, полученными для клеток млекопитающих в культуре (рис.4). Два радиоустойчипых участка в начале периода и в средине Б, и статистически значимое повышение чувствительности между ними. Наибольшая радиочувствительность наблюдается в средине 01 периода, а не в момент перехода клеток из в Б, как это отмечалось для клеток млекопитающих в культуре. Сдвиг критического момента к средине С1 - периода указывает на то, что фиксация деталей не связана ни с накоплением насинтезированной ДНК, ни, непосредственно, с началом синтеза ДНК- моментом реализации первичных повреждений. Наличие Со - периода в клеточном цикле гепатоцитов поз-йоляет нам. провести сравнительное исследование радиочувствительности покоящихся и пролиферирующих клеток. Как было показано выше.

продолжительность блока С1-Б пои облучении негепатэктомированных крыс меньше, чем при облучении гепатэктомированных крыс. Радиаци-онно-индуцированный рыход хромосомных аберраций не зависил от состояния клеточной пролиферации. Кроме того, прослеживается повышение чувствительности клеток в момент перехода их из бо в - период. По индукции геномных мутаций существенных различий в радиочувствительности между йо и С1- периодами не обнаружено. Наиболее высокий выход полиплоидных клеток зарегистрирован при облучении животных на протяжении Б- периода. Эта фаза клеточного цикла оказалась наиболее вариабельной и по своей радиочувствительности. При облучении в в2- периоде (26 часов) выход полиплоидных клеток ниже, чем при облучении в ДНК-синтетическом периоде, но выше , чем при облучении в фазе (31.

Таким образом, оценка радиочувствительности клеток на протяжении клеточного цикла существенно зависит от выбора критерий оценки, что, по-видимому, обусловлено различными молекулярными механизмами, лежащими в основе изучаемых реакций клетки на облучение. Для понимания механизмов , лежащих в основе тех или иных клеточных реакций на облучение,необходима идентификация первичных радиационных повреждений и исследование реализации их в регистрируемые повреждения.

Поскольку спектр первичных повреждений, индуцируемый ионизирующим излучением с различной линейной передачей энергии различен, то радиация была использована нами в качестве инструмента при исследовании механизмов клеточной чувствительности.

5. Полиплоидизация гепатоцитов крыс, индуцированная нейтронами в различных периодах клеточного цикла.

При исследовании влияния нейтронного облучения на процесс по-липлоидизации гепатоцитов крыс в различных дозах как до, так и в различные моменты после частичной гепатзктомии наиболее интересным и неожиданным оказался эффект полиплоидизации непролиферирующих гепатоцитов (Со) (рис.5). Наблюдаемый эффект может быть обусловлен рядом причин: - индуцированным синтезом; - преимущественной гибелью диплоидных клеток; - индуцированным слиянием клеток: диплоидных с диплоидными, тетраплоидных с тетраплоидными. Однако, мы но зарегистрировали включения зН-тимидина в ДНК гепатоцитов негеип-тэктомйрованных крыс после облучения их быстрыми нейтронами в дозе 1 Гр в течение 19 часов после облучения. Дополнительным доказл-

■ч и ьо

с»

« о 7С

X 40

а го

ч о Л

а»

ч 10

о 0

нейтроны

МН5 1

рентгеновы лучи ______$_

доза нейтронов (ГР)

0.250 5

доаа

500

облучения (Гр) Рис. 5.Полиплоидизация гепатоцитов крыс, индуцированная нейтронами в Со периоде клеточного цикла.

0.85 МзЙ

оз о.5 о.? 1 . .. г .

доза облучения ( Гр )

Рис.С. Зависимость эффекта полиплоидизации непроли-ферируювдх гепатоцитов от энергии нейтронов.

тельством отсутствия индуцибельного нейтронами синтеза ДНК в неде-лящихся гепатоцитах было четкое разделение клеточной популяции при цитометрическом анализе на группы 2с. 4с. 8с без промежуточных значений, свойственных популяциям . реплицирующим ДНК. Все вышеизложенное позволяет исключить йкдукцию синтеза ДНК нейтронами как одну из причин, вызывающих полиплоидизацию непролиферирующих гепа-тоцитов. Морфологический анализ .гепатоцитов облученных крыс, проведенный нами . исключает какие-либо преимущественные нарушения морфологии диплоидных клеток по сравнению с клетками другой пло-идности. Анализ популяции гепатоцитов после одновременной окраски клеток ядерным и цитоплазматическим красителями позволил зарегистрировать 'существенное увеличение доли двуядерных клеток у крыс, облученных быстрыми нейтронами в дозе 1Гр по отношению к необлу-ченному контролю. К 2 часам после облучения достигается максимальное значение доли двуядерных клеток с последующим уменьшением к 4 часам, что. по-видимому, связано с. последующим слиянием ядер, которое отчетливо прослеживается на исследуемых препаратах. Таким образом. плотноионизирующие нейтроны вызывают качественно иную реакцию, чем редкоионизирующие рентгеновы лучи, несмотря на формально одинаковый конечный эффект - повышение уровня плоидности клеток.

Дозовая зависимость слияния клеток не имеет порога (рис.5-) и, по-видимому, описывается реакцией первого порядка. При значимых дозах каждую клетку пересекают сотни частиц, но, по всей вероятности, только небольшая часть пересечений является эффективной как по выделенной энергии, так и по благоприятным условиям межклеточных контактов. В среднем на протяжении 70 - 80 ангстрем двум соседним мембранам передается около 100 эВ энергии. Учитывая флуктуации энерговыделения в мишени столь малой протяженности, можно предположить, что эффективное энерговыделение может иметь большое значение, по крайней мере, в несколько раз. Мы предположили, что слияние возможно и при редкоионизируюшем излучении, но только при очень высоких дозах. И действительно, при' облучении негепатэктоми-рованных крыс гамма-лучами в дозах 72 и 120 Гр мы наблюдали слияние непролиферирующих гепатоцитов. Но эти дозы на три порядка превышают дозы нейтронного облучения индуцирующие аналогичную клеточную реакцию.

Однако, если слияние непролиферирующих гепатоцитов определяется величиной локально выделенной энергии ( по аналогии с электроразрядом), тогда эффективность слияния должна зависеть от онер-

гии нейтронов. Сравнительное исследование эффективности нейтронов деления со средней энергей 0,85 МэВ и нейтронов с энергией 14 МоВ. в индукции слияния непролиферирующих гепатоцитов (рис. 6 ) показала большую эффективность первых, что и следовало ожидать,исходя из того, что плотность ионизации обратнопропсрциональна энергии частиц. '

Таким образом, сделанное нами ранее предположение о зависимости слияния гепатоцитов от локально выделенной энергии в чувствительном обьеме полностью подтвердилось.

Как было показано вышз, пролиферирующие гепатоциты увеличивают свою плоидность- за счет необратимой задержки в С2-периоде клеточного цикла. По-видимому, разброс в дозах рентгеновского и нейтронного облучения, индуцирующих полиплоидизацию по данному механизму, не должен быть столь велик как по слиянию, поскольку суммарный эффект полиплоидизации пролиферирующшс гепатоцитов под действием нейтронного облучения должен определяться, по крайней мере, тремя факторами: 1 - полиплоидизация за счет слиянием клеток; 2 - полип-лоидизацией за счет регенерации; 3 - полиплоидизацией за счет индуцированного облучением С2-блок.а. При сравнении эффективности полиплоидизации (рис.7) при облучении негепатэктомированных крыс с таковой при облучении крыс в Б-периоде видно, что в первом случае полиплоидизация достигает уровня полиплоидизации, обусловленного регенерационным процессом , а во втором случае - эффективность полиплоидизации примерно.равна сумме эффектов облученных негепатэктомированных животных (слияние в "чистом виде") и гепатэктомиро-ванных необлученных животных (полиплоидизация за счет регенерации). Эффекта же индуцированной полиплоидизации, аналогичной той, которая наблюдается после нейтронов, после рентгеновского облучения нет. Возможно, этот эффект полностью маскируется более чувствительной реакцией клеток в ответ на нейтронное облучение - слиянием клеток. Не исключается также возможность того, что эти две реакции клеток, носят конкурирующий или же взаимоисключающий характер. Важным Фактом, подтверждающим большую радиочувствительность реакции слияния клеток по сравнению с необратимой задержкой деления. является то. что плато на дозовой кривой по слиянию достигается при. дозах всего 1 Гр, а по необратимой задержке деления оно не регистрируется при дозах,в 7 раз превышающих означенную .'

Таким образом, при облучении нейтронами крыс был обнаружен иной механизм образования полиплоидных гепатоцитов нежели при облучении

индуцированной нейтронами в различные периоды клеточного

цикла. д

Е-

Рис.8. Дозоиая записимооть слияния непролифорирующих гепотоиитпи крыс разного возроотя, облучении^ п различных доз л* нейтронами .гюлонин со ороднсМ оноргией 0,85 МэВ.

рентгеновыми и гамма-лучами. Индукции яолиплоидизации гепатоцитов за счет необратимого блока клеточного деления после облучения нейтронами в гепатоцитах не обнаружено. Слияние гепатоцитов. обуславливающее полиплоидизацию гепатоцитов после облучения нейтронами, довольно чувствительная .реакция клеток. ОБЭ нейтронов по данной реакции клеток на облучение на три порядка выше, чем при редкоионизирующем излучении.

6. Индукция ионизирующим излучением с разной ЛПЭ полиплоидиза-ции гепатоцитов крыс разного возраста.

В серии экспериментов, выполненных на крысах разного возраста, облучение в различных дозах нейтронами деления со средней энергией 0.85 МэВ выявлена существенная зависимость слияния непролиферирую-щих гепатоцитов от возраста облучаемого животного. Слияние гепатоцитов индуцируется небольшими дозами нейтронов и в диапозоне 1-2 Гр этот эффект достигает плато (рис. 8),. При облучении половозрелых животных ( 40, 60, 70, 90,, 100 дневных и 4-х и 6-ти месячных ) наблюдали значительные различия в реакции клеток на облучение. При сравнении процента клеток, увеличивших свою плоидность, после облучения непролиферирующих гепатоцитов в дозе 1 Гр, видно, что у 40-дневных крыс сливается до 50% клеток , а у 100-дневных крыс при облучении в дой же дозе сливается всего 5% клеток. Таким образом, разница в возрасте в 60 дней изменяет эффективность нейтронного облучения на порядок. На крысах более молодой возрастной группы (20-ти и 50-ти дневных) . эффективность слияния гепатоцитов также существенно различалась. Следовательно, независимо от ЛПЭ нейтронов наблюдается зависимость эффективности слияния гепатоцитов от возраста животного. Уменьшение эффективности слияния клеток после облучения нейтронами с увеличением возраста крыс, возможно, обусловлено изменением "состояния мембран и , как следствие этого, уменьшением числа клеток, способных к слиянию. Это доказывают эксперименты. в которых увеличение дозы нейтронного облучения на порядок не приводило к повышению уровня плоидности гепатоцитов. Кроме того, отсутствие различий у крыс 100-120 дневного и 6-ти месячного возраста говорит о том, что с возрастом число клеток, способных к слиянию, уменьшается, достигая плато в 3,5 - 4-х-месячном возрасте. Гепатоциты крыс разного возраста при равных дозах достигают плато. В эффекте индvциpoвaннoй нейтронами полиплоидизации про.пиферирующих гепатоцитов суммируются, по крайней мере, две величины:

_ 23- полиплоидизация. возникающая в процессе регенерации органа после частичной гепатэктомии.

- полиплоидизация, обусловленная слиянием клеток. Третья возможная причина - полиплоидизация за счет необратимой задержки в С2-периоде, которая при облучении нейтронами либо незначительна ( в случае облучения нейтронами деления), либо отсутствует (в случае облучения моноэнергетичнкми нейтронами). При облучении рентгеновыми лучами необратимая задержка в й2 - периоде-основной путь полиплоидизации гепатоцитов. При оценке возрастной динамики полиплои-дизации гепатоцитов, индуцированной регенерационным процессом, мы отчетливо наблюдали снижение пролиферативной способности гепатоцитов с увеличением возраста животного. Аналогичный возраст-зависимый эффект на стимулированных к пролиферации лимфоцитах периферической крови человека объясняется задержкой передачи активирующего сигнала с рецепторов на клеточной поверхности внутрь клетки, что не исключено и для гепатоцитов.

Для пролиферирующих гепатоцитов сравнение зависимой от возраста полиплоидизации, индуцированной нейтронами и рентгеновыми лучами , проводили в наиболее радиочувствительном по этой реакции Б-периоде клеточного цикла. Зарегистрировали, большую эффективность индукции полиплоидизации гепатоцитов нейтронами у молодых крыс, чем у старых. Индуцированная же рентгеновыми лучами полиплоидизация гепатоцитов не зависела от возраста облучаемого животного. Это еще раз подчеркивает различные пути полиплоидизации гепатоцитов после действия плотно- и редкоионизирующего излучения. По-видимому, это обусловлено повреждениями различных мишеней, ответственных в первом случае за слияние клеток, во-втором - за необратимую задержку пролиферирующих гепатоцитов в С2-периоде клеточного цикла.

Дополнительным аргументом в пользу этого предположения может служить модификация эффекта радиационно-индуцированного слияния гепатоцитов уранил-ацетатом, модификатором биологических мембран. Введение крысам уранил-ацетата в концентрации 0.02млг/на г веса за 30 минут до облучения почти полностью снимало эффект нейтронного облучения в дозе 1 Гр в слиянии гепатоцитов.

Таким образом, показана существенная зависимость эффекта индуцированного слияния клеток от возраста животного при облучении нейтронами и отсутствие влияния возраста животного на эффект индуцированной необратимой задержки в й2-периоде при действии рентгене вых лучей. Эти факты вместе с данными о модификации реакции »ушч-

ния клеток уранил-ацетатом и различием эффективности нейтронов разных энергий свидетельствует в пользу гипотезы о мембранной природе мишени индуцированного ионизируюцим излучением слияния клеток.

7. Оценка конформационных изменений хроматина в гепатоцитах облученных крыс.

Такие клеточные процессы как пролиферация, дифференциация, трансформация, старение сопровождаются и изменением конформации хроматина в клетках . Экспериментальные данные, полученные при оценке конформационных изменений хроматина в течение этих биологических процессов, как правило, являются результатом биохимических исследований, которые включают разрушение ядер, вследствие чего теряется информация об индивидуальных клетках, межклеточных взаимодействиях и особенностях клеточной популяции. Кроме того, при изучении действия ионизирующего излучения на структуру хроматина эффекты регистрируются только после действия высоких доз, порядка десятков Гр , вследствие чего сравнительние изменения структуры хроматина и индукции и элиминации радиационно-индуцировакных нарушений наследственных структур не вполне корректно. Конформационные изменения хроматина в клетке в процессе прогрессии ее по клеточному циклу, после облучения в различных дозах излучением разного качества, после воздействия ингибиторов клеточного метаболизма , а также в процессе естественного старения были оценены с помощью разработаного нами цитохимического метода, который позволил нам проследить за изменениями в хроматите не разрушая клетки. Конфор-мационное состояние хроматина в клетках оценивали на проточном ци-тометре по изменению флуоресценции комплекса ДНК-бромистый этидий. На рис. 9 представлены гистограммы положения мод флуоресценции диплоидных гепатоцитов, изолированных из печени до и в различные сроки после стимуляции пролиферации. Из гистограммы отчетливо видны различия в связывании красителя неиролиферирующи.ми(Со) и проли-ферирующими гепатоцитами (С1. Б, 62). Наибольшая интеркаляция красителя зарегистрирована для клеток в ДНК-синтетическом периоде. С увеличением дозы облучения интенсивность Флуоресценции комплекса ДНК-бромистый этидий увеличивается (рис.9 ). Однако, это увеличение достигает некоторого плато, после которого дальнейшее увеличение дозы не приводит к увеличению связывания красителя с ДНК. Известно. что радиация вызывает дезагрегацию ядерного хроматина в ингерфазных ядрах. Несмотря на то, что ионизирующая радиация инду-

интенсивность флуоресценции. ;

номер канала флуоресценции. \

го

сл

цирует также и повреждения собственно молекулы ДНК. на всегда эти два типа повреждений кооперативно связаны между собой. Например, на интенсивность вторичной флуоресценции эти повреждения действуют в противоположных . направлениях: нарушения в хроматине облегчают доступность молекул флуоресцентного интеркалятора к плоскостям биспирали ДНК и, таким образом, увеличивают количество связанного красителя, а нарушения в первичной структуре ДНК уменьшают возможности связывания интеркалятора. По-видимому, в этом диапазоне доз (4-6 Гр) в большей степени начинают проявляться повреждения молекулы ДНК, а не хроматина, и процессы доступности красителя и повреждения ДНК работают в противоположных направлениях: доступность увеличивается, количественность связывания уменьшается.

При облучении гепатэктомированных животных в различные, периоды клеточного цикла существенной разницы в индуцированной излучением деконденсации хроматина в 01 клетках по сравнению с Со-клетками не наблюдается . Положение плато примерно в одном и том же диапазоне доз 4-6 Гр. Однако,для клеток, находящихся'в момент облучения в 5- и в С2-периодах, индуцированной излучением деконденсации хроматина зарегистрировано не было. По-видимому, уровень деконденсации хроматина, индуцируемый пролиферативнкм процессом в клетках к 20-24 часам после стимуляции гепатоцитов к делению, достаточно высок, и на его фоне вклад деконденсации, индуцированной излучением,не регистрируется.

Исследование эффективности нейтронного излучения на процесс деконденсации хроматина проводили на негепатэктомированных животных. чтобы исключить вклад деконденсации, индуцированный пролифера-тйвным процессом. При нейтронном облучении животных так же,как и при облучении рентгеновыми лучами, наблюдается дозозависимая де-конденсация хроматина, только плато деконденсации хроматина дости-' гается при больших дозах ( 10 Г'р). В отличие от других

клеточных реакций,таких как выживаемость и хромосомные аберрации, данная реакция клетки проявляла обратную зависимость от ЛПЭ излучения. По-видимому, в эффекте радиационноиндуцированной деконденсации хроматина определяющим моментом является число событий иони-заций. а не величина локально выделенной энергии, столь важная для индукции хромосомных аберраций, полиплоидизэции и клеточной выживаемости. Показано, что с увеличением временного интервала от момента облучения до момента Фиксаций образцов, декондэнсация существенно уменьшалась и через 60 минут после облучения не отлича-

лась от необлученного контроля. Очевидно, что повреждения, лежащие в основе радиационно-индуцированной деконденсации хроматина относятся к разряду короткоживущих репарабельных повреждений.

Спектр спонтанных повреждений ДНК во многом сходен с нарушениями структуры ДНК, индуцированными ионизирующей радиацией. В процессе старения происходит изменение ДНК-гистонного взаимодействия, что влечет за собой изменение структуры хроматина. С увеличением возраста животного увеличивается степень деконденсации хроматина (рис. 100. Уровень же индуцированной излучением деконденсации хроматина уменьшается с увеличением возраста облучаемого животного. Эффект радиационно-индуцированной деконденсации хроматина регистрировался только для относительно молодых крыс (20 - 90 дневных).. Скорее всего гормональный дисбаланс, возникающий в процессе естественного старения, приводит к конформационным изменениям хроматина в клетках старых крыс.

Старение организма сопровождается нарушением стабильности генетических структур клетки. На молекулярном уровне - это накопление повреждений ДНК, а на клеточном-повышение спонтанного уровня, хромосомных повреждений. Оценка уровня спонтанных хромосомных повреждений, проведенная нами для двух возрастных групп крыс, показала, что у месячных крыс 10% анафаз, а у 4-х месячных крыс-26% анафаз были аберрантными. Корреляция степени деконденсиррванности хроматина с уровнем хромосомных повреждений при условии отсутствия зависимости от возраста как активности репарационных ферментов,так и самого процесса репарации повреждений ДНК'(Turner et.al.,1982; Gazlev and Malakhova,1982) позволяет предположить, что конформация хроматина играет существенную роль в аккумуляции повреждений наследственных структур клетки б процессе естественного старения. Необходимо также отметить, что зависимые от возраста животного кон-формационные изменения в хроматине показали возможности разработанного нами метода оценивать низкий спонтанный уровень повреждений з неделящихся клетках. Сама возможность оценки каких-либо повреждений в популяции неделящихся клеток очень ценна, поскольку позволяет целенаправленно изменить судьбу этих повреждений в процессе индуцированной пролиферации.

8. Влияние рентгеновского и нейтронного излучения на конформа-ционные изменения хроматина при облучении клеток млекопитающих в культуре.

Эксперименты на клетках млекопитающих в культуре представляют

100

а> я

о & »

о >>

с;

§ 0

рентгеновы лучи

. I

нейтроны, деления

доза облучения.(Гр ) Рис. 11. Изменение моды флуоресценции комплекса ДНК-бромистый этидий в клетках НеЬа .облученных в различных дозах.

до

а >

о ■

в*

а а

а>

УФ

спермидин

Х-лучи

>л

» » 4 * >'. !> ' П ГГ1 ; (

!" УФ 3 V х-лучи \ ч. \

новобиоцин

г;..... -1-т- 1

, "нейтрона \ '

1Х !Рис. 12.Влияние спермидина 4• | и новобиоцина на выход не-\ | аберрантные анафаз в клет-4 |ках НеЬа ,облученных нейтронами Х-лучами и УФ.

\ нейтроны \

\ л

Я ' г Г "Г ! (Дж/М ) дозы облучения (Гп )

более корректную информацию о влиянии ионизирующего излучения на конформацию хроматина, поскольку исключают разброс между индивиду-мами. При облучении клеток НеЬа так же,как и при облучении крыс, было зарегистрировано зависимое от дозы увеличение декондексации хроматина. Яри облучении рентгеновыми лучами был зарегистрирован порог при облучении клеток в диапазоне 4-6 Гр. Совпадение диапазона доз,при котором эффект деконденсации достигает "насыщения" для гепатоцитоз и для клеток Н-зЬа. проинициировал нас проверить еще один тип клеток, а именно лимфоциты периферической крови человека. Со-лимфоциты оказались очень чувствительной системой, они также продемонстрировали зависимую от дозы облучения деконденсацию хроматина. однако порог в этой клеточной реакции у них наступал при. облучении в дозе 1 Гр .

Таким образом, можно констатировать, что деконденсация хроматина индуцируется дозозависимым образом не только при облучении животных, но и при облучении клеток. И в том,и в другом случаях регистрируется порог данного эффекта радиации. Дозы, при которых регистрируется порог, зависят от исходной радиочувствительности клеток. Нейтронное излучение индуцировало также зависимое от дозы увеличение интеркаляции•бромистого этндия в ДКК клеток НеЬа. Эффект достигал плато в диапазоне - 10 Гр, что в два раза выше дозы рентгеновского излучения для тех же клеток (рис. 11). Следовательно, индукция деконденсации хроматина проявляет обратную зависимость от ЛПЭ излучения не только при облучении организма, но и клеточной популяции.

Таким образом, клеточные эффекты радиационного воздействия и качественно и количественно достаточно аналогичны как при облучении всего организма, так и при облучении клеточной популяции. Следовательно, факторы организменной регуляции заметно не модифицируют первичные пострадиационные клеточные реакции.

Регистрация даннной реакции клеток и ее зависимость от дозы облучения. качества излучения , стадии клеточного-цикла.типа клеток, возраста облучаемого животного представляет несомненно большой практический интерес в процессе индикации малых доз ионизирующего излучения. Исследование ке взаимосвязи этих повреждений с индукцией и репараций хромосомных повреждений имеет большое научно-теоретическое значение, поскольку позволяет лучше понять структурно-функциональные механизмы клеточной чувствительности.

9. Оценка индукции и репарации хромосомных аберраций в зависи-

- 30 -

мости от степени конденсированное™ хроматина в клетках.

Значительных различий б индукции первичных повреждений в клетках с исходно различной степень» конденскрозанкости хроматина нами не зарегистрировано. Тем не менее, не исключено, что реализация первичных радкационно-индуцирсванных повреждений в регистрируемые повреждения координируется на уровне хроматина и определяется радиусом взаимодействия поврежденных сайтов. Индукция повреждений ионизирующим излучением разного качества так же,как и степень конденсации хроматина, позволяют проследить за ролью фактора пространственного распределения первичных повреждений. На одной и той же клеточной системе, клетках HeLa, синхронизированных в G1 и митозе - периодах клеточного цикла с различной степенью конденсированное™ хроматина, оценивали зависимость выхода хромосомных аберраций от дозы рентгеновского излучения . Значительных различий в радиочувствительности клеток, находящихся в этих периодах, как и для Go- и G1 - гепатоцитов, также различающихся по степени конденсированное™ хроматина,мы не зарегистрировали.

Временной фактор является вторым определяющим моментом в эффекте реализации первичных повреждений в хромосомные аберрации. Для клеток синхронизированных в митозе и затем облученных однократно или фракционирование, существенных различий в выходе хромосомных аберраций не зарегистрировано. В течение 60 минут куль-

тивирования клеток в нормальной питательной среде при температуре 37°С, одни и те же клетки Hela, облученные в стационарной фазе роста (Gl-периоде) и в митозе, по-разному репарировали повреждения от одной и той же дозы рентгеновского излучения. Аналогичные дан -ные были получены нами при облучении негепатэктомированных (Go) и через 6 часов после гепатэктомии (G1), также различающихся по степени конденсированности хроматина. Отсутствие репарации первичных' повреждений, индуцированных первой фракцией дозы в течение оптимального временного интервала, зарегистрированного для этих клеток, позволяет предположить, что вероятность взаимодействия первичных повреждений в конденсированном хроматине выше, чем в дисперсном. Очевидно, что увеличение степени конденсированности хроматина изменяет условия протекания репарационного процесса. Модифицируя конформационное состояние хроматина в клетках,мы попытались понять механизм.регуляции'репарационного процесса.

Известно, что спермидин индуцирует конформационные изменения в хроматине. Если клетки HeLa, находящиеся в стационарной фазе рос-

та. на которой мы наблюдали эффективность фракционирования, обработать перед облучением спермидином, то эффективность фракционированного облучения сушественно уменьшается (рис.12). Используемая концентрация спермидина (0,01 млг/мл) не ингибировала реет клеток. незначительно увеличивала выход хромосомных аберраций;- но изменяла степень конденсированности хроматина в клетках и этим, видимо. определялся выход хромосомных аберраций при фракционировании дозы облучения. Спермидин практически не модифицировал повреждения, индуцированные нейтронами и Х-лучами. но статистически значимо увеличивает выход хромосомных аберраций в УФ облученных клетках Hela. Известно, что пиримидиновые димеры - это топологически зависимые первичные повреждения, поскольку для репарации им необходимо, быть узнанными ферментами репарации. Увеличивая степень конденсированности хроматина, спермидин не только уменьшает вероятность димеров быть узнанными ферментами репарации, но и увеличивает вероятность неотрепарированных повреждений провзаимодействозать между собой. Меньшая эффективность спермидина в клетках, облученных Х-лучами и нейтронами деления, обьясняется, по-видимому, меньшей топологической зависимостью индуцированных ими повреждений. К тому же, первичные- повреждения, индуцированные плотноиокизирующим излучением, в данном случае нейтронами деления, являются к тому же слабо модифицируемыми повреждениями (Красавин,1989).

В ряде работ показана способность топоизомераз изменять топологию ДНК в эукариотических клетках. Увеличение хромосомных аберраций. после обработки клеток ингибиторами топоиземеразы II предполагает ее участие в процессах репарации тех форм повреждений ДНК, которые призодят к образованию хромосомных аберраций. Мы использовали два ингибитора топо II - новобиоцин и адриамицин. При сравнении кривые дозовой зависимости для клеток HeLa, обработанных ново,-биоцином и затем облученных либо УФ, либо Х-лучами. либо нейтронами деления видно, что большая модифицируемость повреждений наблюдается з УФ облученных клетках (рис.12). Это еще раз подтверждает большую топологическую зависимость репарации пиримидиновых димеров, по сравнению с повреждениями, индуцированными ионизирующим излучением. Наблюдается также усиление повреждающего действия Х-лучей новобиоцином,что,возможно. является результатом не только ингибироЕания активности топо II. но и результатом частичного ин-гибировачия полимерозной активности (Collins, 1990).

Для адркамицина е предварительных экспериментах была заре-

гистрирована зависимость выхода хромосомных аберраций от времени инкубации клеток в среде с адриамицином. Обработка клеток перед облучением адриамицином не увеличивала чувствительности клеток к действию рентгеновского излучения, а при одчочасовой инкубации даже наблюдалось некоторое уменьшение радиочувствительности. Известно, что адриамицин, подобно налидиксовой кислоте, стабилизирует комплекс ДНК-геразы за счет сшивок разорванных фссфодизфирных связей с белками, чем, по-видимому, затрудняет реализацию разрывов ДНК в хромосомные разрывы за счет того, что связывает на некоторое время разрывы ДНК, предотвращая их взаимодействие друг с другом.

Поскольку эффект адриамицина на топоизомеразы обратим , мы проследили зависимость этого эффекта от времени после обработки и влияние обработки на процесс репарации хромосомных повреждений при фракционировании дозы облучения ( рис 13 ). Для клеток обработанных адриамицином в течение 1 и 4 часов перед облучением показано, что в обоих случаях адриамицин уменьшал эффект фракционирования дозы облучения. Оценка влияния адриамицина на конформацию хроматина в клетках выявила четко регистрируемую конденсацию хроматина (рис.14).

Таким образом, использованные нами модификаторы конформации хроматина с различным механизмом действия ( спермидин - прямо не. влияющий ни на репарационный процесс, ни на ферменты, меняющие топологию ДНК; новобиоцин - влияющий и на репарационные ферменты и на ферменты, меняющие топологию ДНК; адриамицин - влияющий на ферменты, меняющие топологию ДНК ) подавляли репарацию хромосомных повреждений при фракционировании дозы облучения и увеличивали кон-денсированность хроматина в клетках. Все это позволяет предположить, что механизм реализации первичных повреждений связан с кон-формационными изменениями хроматина вне зависимости от того, каким агентом это изменение индуцировано. Возможно также, что конденси-рованность хроматина зависит не только от структурной целостности нуклеотидной цепи, но и от функциональной целостности белковых компонент нуклеопротеина.

10. Исследование зависимости радиочувствительности, репарационной способности клеток НеЬа от степени посттрансляционной модификации гистонов в момент облучения.

Показано,, что аиетилирование гистонов, более чем другие гисто-.-новые модификации, связано с транскрипционной активностью и степень» конденсированное™ хроматина (МаскегсЧеп еС.а!.. 1989).

^£00 К 1б0 &70

с0 60

50 ¿О"

30-

о20 *о .

¿«¡Я 1а ч со

Н § &&

г: со е- Я

к сО со к

<3 Е-К СГ СО со СО I

облучение СЗ- фракционированное

однократное

Рис.13. Влияние модификаторов конформации хроматина

на процесс репарации хромосомных повреждений при фракционировании дозы облучения клеток НеЬа.

без

обработки

спермидин.

адриамицин __, ■

без;

обработки

бутират' N8,

5-азацитидин

О Й 10" 150 200

новобиоцин

1С 1и.: йет

Рис. 14. Изменение интеркаляции бромистого этидия в ДНК клеток НеЬа

В предварительных экспериментах была подобрана концентрация бутирата натрия (ингибитора деацетилаз) и время обработки, в течение которого не наблюдается увеличения радиочувствительности клеток . Модифицирующий эффект бутирата натрия проявлялся при.УФ-об-лучении клеток и почти полностью отсутствовал при облучении клеток нейтронами деления. Предобработка клеток бутиратом натрия не изменяла репарацию хромосомных повреждений при фракционировании дозы рентгеновского облучения, в отличие от воздействия агентов увеличивающих степень конденсированное™ хроматина в клетках (рис. 13)

Использованная концентрация бутирата натрия и время обработки от 90 мин. до 300 мин., увеличивали связывание бромистого этидия с ДНК. что регистрировалось нами по интенсивности флуоресценции комплекса ДНК-бромистый этидий (рис.14). Таким образом, факт деконден-сации хроматина при измененном уровне ацетилирования белков зарегистрирован в прямом эксперименте. Однако, деконденсация хроматина, обусловленная гиперацетилированностыо гистонов, существенно не влияла на пострадиационные репарационные процессы в клетках.

Известно,что поли-АДФ-рибозилирование изменяет функции хроматина в клетках высших эукариот. Используя ингибитор поли (АДФ-рибо зилирования) 3 аминобензамид, мы попытались оценить роль этой мо-= дификации гистонов в индукции и репарации хромосомных аберраций рентгеновыми лучами. 3 аминобензамид в концентрации,не ингибирую-щей рост клеток.увеличивал выход клеток с хромосомными аберраци ями. Однако, он не влиял на кинетику репарации повреждений хромосом при фракционировании дозы облучения (рис.13). Механизм действия бензамидов не выяснен, по данным разных авторов они или задерживают стадию лигации в процессе репарации ДНК, или. наоборот, ускоряют лигацию и уменьшают выход разрывов ДНК. Несмотря на противоречивость интерпретаций в механизмах действия бензамидов,по воп-" росу о влиянии их на конформационные изменений хроматина существует единое мление: обработка клеток бензамидами приводит к декон-денсации хроматина.

5-азацитидин был использован нами в качестве ингибитора процесса метилирования. Предобработка клеток в концентрации, не инги-Сирующей клеточный рост, приводила к- дозо-зависимому увеличению индукции хромосомных аберраций ионизирующим излучением. Инкубирование клеток с 5- азацитидином приводит к увеличению их чувстви-. тельнооти к последующему УФ и Х-облучению и не изменяет радиочувствительности клеток'к облучению нейтронами деления. При исследова-

нки влияния 5-азацитидина на кинетику репарации хромосомных аберраций при фракционировании дозы облучения мы не зарегистрировали существенного различия между обработанными клетками и контрольными (рис.13 ). Однако, инкубация клеток HeLa c, 5-азацитидином приводила к изменению степени конденсации хроматина (рис.14).

Таким образом, ДНК-гистонные взаимодействия, меняющиеся в процессе посттрансляционной модификации белков,приводили к увеличению степени дисперсности хроматина, что подтверждает предположение о том, что увеличение интеркаляции бромистого этидия в ДНК обусловлено ослаблением ДНК-гистонного взаимодействия. В пользу этого говорят также наши данные об уменьшении интеркаляции красителя в ДНК клеток, после обработки их агентами, индуцирующими конденсацию хроматина ( адриамицин, спермидин. новобиоцин ). Исследование взаимосвязи процессов репарации хромосомных повреждений с состоянием хроматина в клетках в момент облучения доказали важность конформации хроматина в процессе реализации первичных повреждений ДНК в регистрируемые хромосомные аберрации. Возможность определяющей роли конформации хроматина в реализации первичных повреждений предполагалась рядом исследователей, но нами впервые было проведено комплексное исследование процессов репарации хромосомных повреждений и конформационных изменений хроматина. Из вышеизложенного можно сделать также предположение о том, что модификация ДНК-гистонного взаимодействия,обусловленная модификацией белковой компоненты, в меньшей степени влияет на процессы репарации хромосомных повреждений, в отличие от модификации ДНК-ой компоненты.

11. Модификация цистеамином радиационно-индуцированных хромосомных повреждений в гепатоцитах негепатэктомированных и гепа-тэктомированных крыс и клетках млекопитающих в культуре.

На уровне установленной феноменологии принципиально важным было исследовать другие модификации ДНК в хроматине, которые приводят к радиозащитным эффектам. На роль таких радиомодификаторов могут претендовать соединения типа цистеамина. В" настоящее время в пользу репарационного механизма радиозащитного эффекта цистеамина.имеется много серьезных аргументов. Достаточно строго такой механизм был доказан на клетках прокариот и низших эукариот с использованием мутантов, дефектных по системам репарации, менее строго - на

тэктомированных. животных.так же.как и в нерегенерирующей печени, замедлены процессы реализации потенциальных повреждений в нерепа-рируемые повреждения, что, в свою очередь, обеспечивает большую эффективность репарирующим системам. Величины эффекта при пред- и пострадиационном введении протектора для этих периодов различались незначительно.что исключает существенный вклад быстро репарируемых повреждений в радиозащитный эффект цистеамина. Обнаруженная эффективность радиопротектора при пострадиационном введении протектора для клеток с большей степенью конденсированности хроматина предполагает, что процессы репарации определяются степенью конденсированности хроматина в клетках в момент облучения, не исключено также.что в конденсированном хроматине затруднена также . й фиксация первичных повреждений в нерепарабельное состояние. Выявленный пострадиационный эффект цистеамина хотя и предполагает реализацию репарационного механизма радиозащиты, но не указывает на роль в этом процессе взаимодействия протектора с поврежденной мишенью. Поэтому мы провели серию экспериментов, демонстрирующих модифицируемость защитного действия цистеамина при декомпактизации нуклеопротеина.

Таблица.2.

Влияние бутирата натрия на радиозащитный эффект цистеамина при облучении клеток млекопитающих в культуре гамма-лучами в дозе 4,ЗГр

ЛИНИ! клеток н: выход аберрантных анафаз ( в процентах )

необлученный: облученный:цистеамин: бутират Ыа: бутиратЯа контроль : контроль : +облучение: +цистеамин+: +облучение -: об л- чение

СНЕЬ V-79 НеЬа 26, 0+2. 3 59.3+3.1 38,0+..0 53,3+1,8 55.0+4.0 12.4+1.6 54,0+1.6 1,3+2.8 57,3+3.5 55.1+1,9 12,0+0,8 55.5+1,4 40,6+2.8 58,6+1,3 50,7+4,4

. Обработка клеток бутиратом натрия приводит, к. увеличению ацетили-рования гистонов , увеличению чувствительности хроматина к действию нуклеаз, модификации степени конденсированности хроматина в клетках. На клетках Китайского Хомячка линий СНЕЬ и У-79. а также на опухолевых человеческих клетках НеЬа - Ж63 показали,что цисте-амин. добавленный в питательную среду после того, как там в течение 16 часов присутствовал бутират натрия, оказывался незффектив-

ным в защите клеток от радиационного поражения. В то же время 16-часовое присутствие бутирата натрия в питательной среде не усиливало поражающего действия гамма-облучения на клетки. Полное снятие радиозащитного эффекта цистеамина бутиратом натрия указывает на то. что в данном случае защита обусловлена уменьшением доступности поврежденных участков ДНК действию нуклеаз. Возможно модификация радиочувствительности осуществляется за счет адсорбции протектора на ДНК: протектор просто увеличивает конденсированность хроматина, что сопровождается ослаблением пострадиационной нуклеазной деградации ДНК вследствие малой доступности поврежденных участков ДНК действию репарационных ферментов. Доказательство прямого взаимодействия цистеамина с нуклеопротеином было получено нами при измерении интенсивности флуоресценции комплекса ДНК-бромистый этидий в клетках НеЬа,инкубированных в течение 30 мин. с цистеамином и без . него. 30-микутное инкубирование клеток в среде с цистеамином как с последующим облучением, так и без него приводит к уменьшению интенсивности флуоресценции комплекса ДНК-бромистый этидий. Протектор, по-видимому, вступая в комплекс с ДНК, уменьшает интеркаляцию красителя в ДНК, причем это не зависит от наличия повреждений в структуре ДНК. Модификация хроматина клеток используемыми агентами, оцененная по интенсивности флуоресценции комплекса ДНК-бромистый этидий, показала, что гамма-облучение в дозе 4,3 Гр приводит к смещению пиков флуоресценции в сторону увеличения интенсивности флуоресценции. а 30-ти-минутное инкубирование клеток в среде с цистеа мином приводит к уменьшению интенсивности флуоресценции. Обработка клеток ■ бутиратом Ыа ( 0,55 мг/мл) лишь незначительно увеличивала деконденсацию хроматина в облученных клетках, но делала неэффективной обработку клеток цистеамином. Обработка клеток цистеамином после того как их в течение 16 часов инкубировали в питательной' среде с бутиратом натрия, не приводила к уменьшению интенсивности флюоресценции по сравнению с облученным контролем.

Таким образом, полное снятие радиозащитного эффекта цистеамина агентом, увеличивающим''доступность хроматина действию нуклеаз. а также уменьшение связывания интеркалирующего красителя с ДНК после обработки клеток протектором позволяет нам заключить, что в основе механизма действия цистеамина лежит его способность при взаимодействии с ДНК усиливать компактизацию структуры хроматина.,

Сиолстрием чего, по-видимому, является уменьшение иострадиацион-Н"11 нуклеазной деградации и уменьшение вероятности образования

ферментативных двойных разрывов. Ингнбирование ферментативной активности происходит в результате связывания цистеамина с ДНК.

ВЫВОДЫ:

1. Исследование кинетики клеточной пролиферации гепатоцитов в процессе регенерации органа выявило два максимума ДНК-синтетической и митотической активности в течение первых 40 часов после частичной гепатэктомии. Показана временная задержка части пролифе-рирующих клеток в £2 -периоде первого цикла, дёлящю-оя во время второго митоза без предварительного синтеза ДНК. Доказана возмож ность повторного деления части гепатоцитов, и наличие "С2-"попу ляции. Количественно оценены параметры и состав клеточной популяции 1-го и 2-го генерационных циклов.

2. По репарационной способности клеток идентифицирована популяция покоящихся гепатоцитов и определен момент перехода их в пред-синтетический период первого генерационного цикла. Тем самым доказано само существование особого физиологического С-о состояния в составе пререпликативного периода клеточного цикла гепатоцитов.

3. Облучение животных рентгеновыми лучами индуцирует обратимую задержку клеточного деления гепатоцитов, которая линейно зависит от дозы облучения.

4. Обратимая задержка деления складывается из двух блоков : вА-Э и 02-М. Показано, что при облучении покоящихся и пролифериру-ющих гепатоцитов вклад этих двух блоков в общую задержку деления разный. При облучении до стимуляции продолжительность задержки начала синтеза ДНК меньше, чем при облучении после стимуляции, причем в последнем случае и число клеток, вступающих в синтез, вдвое меньше, чем у контрольных и негепатэктомированных крыс. Предполагается, что при облучении гепатэктомированных животных нарушается механизм последующей стимуляции клеточного деления.

5. Облучение животных как ре"тгеновыми лучами, так и нейтронами индуцирует необратимую задержку деления, приводящую к полиплоиди-зации гепатоцитов. Необратимая задержка деления/так .же как и обратимая, проявляет линейную зависимость от доз"-' облучения и носит цикл-зависимый характер. Наибольшая эффективность полишшдизации тре-гистрирована для клеток, находящихся в момент облучения в Б- .черно де клеточного цикла, наименьшая-в С1-периоде.

6. Зарегистрирована полиплоидизация непролиферирующих гепатоцитов при облучении крыс нейтронами, которая зависела от энергии нейтронов: чем меньше энергия нейтронов ( больше ЛПЭ). тем эффективнее

они индуцировали полиплоидизацию. Нейтроны деления со средней энер гией 0,85 МэВ эффективнее нейтронов с энергией 14 МэВ приблизительно в два раза. ФИД при воздействии излучением разного качества по тесту полиплоидизации изменяется в 1000 раз и более, что может быть использовано для создания высокочувствительной ЛПЭ-дозиметрии.

7. Индуцированная нейтронами полиплоидизация непролиферирующих гепатоцитов, так же,как полиплоидизация при регенерации органа, зависит от возраста облучаемого животного: чем старее животное, тем меньшее число гепатоцитов полиплоидизуется.

8. Отсутствие индуцибельного синтеза ДНК в непролиферирующих ге-патоцитах и визуально зарегистрированная кинетика слияния непролиферирующих гепатоцитов в течение первых 2-х часов после облучения животных позволили предположить, что радиационно-индуцирован-ная полиплоидизация непролиферирующих гепатоцитов обусловлена слиянием клеток.

Таким образом, выявлены два различных механизма индуцированной ионизирующим излучением полиплоидизации для пролиферирующих и не -пролиферирующих гепатоцитов.

10.Для клеток интактной печени показана квадратичная зависимость выхода аберрантных клеток от дозы облучения, что подтверждает гипотезу об образовании хромосомных аберраций за счет индукции двунитевых разрывов ДНК. Кинетика восстановления радиационных повреждений хромосом при фракционировании дозы облучения выявила зависимость эффективности их репарации с увеличением временного интервала между фракциями и последующим уменьшением эффективности, что указывает на ограниченность временного интервала в течение которого возможна модификация радиационного повреждения.

11.Определена зависимость выхода аберрантных клеток от момента облучения в течение первого генерационного цикла. Обнаружено два' критических момента повышенной радиочувствителоности клеток ; момент перехода из Со-С1 и средина в1-периода.

12. С помощью метода проточной цитометрии продемонстрировано изменение конформации хроматина в клетках в процессе клеточной пролиферации и в процессе естественного старения организма.Продемонстрирована корреляция между увеличением степени деконденсиро-ванности хроматина с возрастом животного и уровнем спонтанных хромосомных аберраций..Оценка степени деконденсации хроматина предлагается в качестве теста для идентификации популяции покоящихся клеток и пролиферирующих клеток, а также для оценки уровня спон-

тайных, повреждений как в покоящихся, так и в пролиферирующих клеточных популяциях.

13; Показана индукция ионизирующим излучением деконденсации хроматина, которая носит дозозависимый характер, с выходом на пла- . то. Положение плато на кривой дозовой зависимости определяется рядом факторов, в том числе : тип клеток, возраст животного, ЛПЭ излучения.

14. Предрадиационная обработка клеток веществами, модифицирующими белки хроматина или изменяющими компактизацию нуклеиновых кислот приводит к различным пострадиационным эффектам. На уровне четко зарегистрированной деконденсации хроматина модификаторы белковой компоненты хроматина не влияли на процесс репарации хромосомных, повреждений при фракционировании дозы облучения. Модификаторы молекулы ДНК увеличивали конденсацию хроматина и ингибировали репарацию хромосомных повреждений. Предполагается, что эффективность репарационных систем клетки в большей степени связана с модификацией структурных повреждений ДНК в составе хроматина.

15. Пострадиационная модификация действия ионизирующего излу-, чения химическим радиопротектором зависела от состояния хроматина в клетках в момент облучения. В клетгах с наиболее конденсированным хроматином (Со, митоз) модификация повреждений,индуцированных ионизирующим излучения, возможна и при введении протектора после облучения, чего не наблюдается в клетах с меньшей степенью конденсации хроматина (С1). Увеличение степени конденсированности хроматина в клетках, инкубированных с цистеамином^и снятие радиозащитного эффекта цистеамина агентом,увеличивающим степень деконденсации хроматина в клетках (бутиратом натрия), доказывает участие протектора в модификации радиационных повреждений, предполагаемой репарационным механизмом радиозащиты.

Список работ,опубликованных по теме диссертации:

1. Малиновский 0.В.,Михайлова Н.Я., Сигалева (Гильяно)Н.Я..Шейкина Т.Д. Экспериментальное обнаружение границы между периодами Со и С1 в митотическом цикле регенерирующей печени крыс. Цитология, 1973, Т. 15, N 8.1048-1050.

2.Шейкина Т.Д., Малиновский 0.В., Сигалева (Гильяно) Н.Я. Радиочувствительность клеток регенерирующей печени крыс в фазах Со и 01 и восстановление хромосом, поврежденных радиацией. Сборник

материалов 1 радиобиологической конференции соц. стран.Брно. ЧССР. 1974. с. 384.

3.£ильяно Н.Я.. Малиновский О.В. Синтез ДНК и митотическая активность в клетках регенерирующей печени крыс после облучения в Go и Gl стадиях клеточного цикла. Цитология, 1976, т. 18, N10, с.1284-1288. .

4.Гильяно Н.Я., Малиновский О.В. Выход хромосомных аберраций индуцированных Х-облучением в клетках регенерирующей печени крыс в различные периоды генерационного цикла. Цитология, 1977, т.19. . N3,с. 367-372.

б.Гильяно Н.Я., Малиновский O.E. Go- фаза в клеточном цикле. В кн. "Надежность клеток и тканей".1980, Наукова думка, Киев, с.99-105.

6.Гильяно Н.Я.Генерационный цикл и радиационные эффекты клеток регенерирующей печени крыс. Автореферат канд. диссертация, 1977

7.Гильяно Н.Я., Малиновский О.И. о пострадиационном эффекте цисте-амина в клетках печени крыс. ДАН СССР, 1979, т. 248, N 4, с. 988--9$Ю.

8. Малиновский 0. В., Соловьев В. А, Третьяков А. Н.. Бело'стоцкая Г. Б., Гильяно Ц.Я. Лазерный проточный цитофлуориметр-сортировщик "ЛАСКАН" . Препринт ЛИЯФ; N 76Ô, 1982, 1-22.

9.Гильяно Н.Я., Малиновский О.В. Исследование спонтанной и индуцированной полиплоидизации гепатоцитов печени крыс методом проточной цитометрии. В сб."Восстановительные и компенсаторные процессы при лучевых поражениях". Л., 1982.50.

10.Гильяно Н.Я.. Малиновский О.В. Использование метода проточной цитометрии для исследования спонтанной и индуцированной полиплоидизации клеток печени крыс. Тезисы докл. на 1 Всесоюз. биофизическом съезде, М., 1982,226-227.

11. Гильяно Н.Я., Малиновский 0.В., Ланда Е.И. Зависимость эффекта радиопротектора на выход хромосомных аберраций от стадии кле-' точного цикла. Инф. бюл. "Радиобиология"1983 , т. 27.с,53.

12.Гильяно Н.Я., Малиновский О.В. Кинетика клеточной пролиферации в регенерирующей печени крыс по данным проточной цитометрии. Цитология и генетика/ 1984, N 3/4, с.256г259.

13.Гильяно Н.Я. . Малиновский О.В. Выход геномных мутаций в клетках интактной и регенерирующей печени крыс в норме и после гамма-облучения. Радиобиология, 1984, T.24.N1. с. 35-38.

14. Гильяно Н.Я.. Малиновский О.В., Ланда Е. И. Пострадиационный эф-, фект радиопротектора в зависимости от степени конденсации хроматина в клетках. Радиобиология, 1985. т. 25. НЗ .с. 389-391.

15. Гильяно Н. Я. .Малиновский О.В., Степанов С.И. В вопросу о механизме радиозащитного действия цистеамина. Радиобиология, 1985, Г. 25, N2, С. 238-241.

16.Гильяно Н.Я., Малиновский О.В. Способ оценки качества ионизирующего излучения. Авторское свидетельство.N1539619 от 11Л1-85Г.

17.Гильяно Н.Я..Малиновский О.В., Хаир М.Б. Выход эуплоидных мутаций, индуцированных Х-лучами и нейтронами в гепатоцитах при облучении крыс в различных периодах клеточного 'цикла. В сб. "Восстановительные и компенсаторные процессы при лучевых поражениях". Л., 1986 . с.22-23.

18.Гильяно Н.Я., Малиновский О.В. Влияние радиации на функциональное состояние хроматина в клетках. В сб. "Механизмы действия ионизирующего излучения на структуру и функцию белков". Пущино. 1986 .с.40.

19.Малиновский 0.В., Гильяно Н.Я. Состояние хроматина в клетках и модификация радиационного поражения. В сб. "Прикладные аспекты радиационной Физики.".Л..1986, с.143-162.

20.Гильяно Н.Я.,Малиновский О.В. Репарация хромосом клеток млеко- . питающих в зависимости от состояния хроматина. Инф.Бюл."Радиобиология" 1986. т. 26, с.30.

21.Гильяно Н.Я.,Малиновский О.В., Хаир М.Б. Полиплоидизация гепа-тоштов,индуцированная рентгеновским излучением в различных периодах клеточного цикла. Радиобиология, 1987, т. 27,N3 , С.375-377

22.Гильяно Н.Я.. Малиновский О.В., Хаир М.Б. Два механизма полип-лоидизации клеток in vivo..Тезисы 1-го Всесоюзного совещания "Биофизика рака" М.. 1987, с. 42.

23.Гильяно Н.Я., Малиновский О.В.. Хаир М.Б. .Смолин В. А.,Балдычев A.C. Полиплоидизация гепатоцитов крыс.обусловленная слиянием клзток при действии излучений с разной ЛПЭ. Радиобиология, 1938, Т. 28, N1. С. 68-73. ' v

24.Гильяно Н.Я., Малиновский О.В., Хаир М.Б. Слияние клеток In vivo. индуцированное действием быстрых нейтронов и гамма-лучей. ДАМ СССР. 1988 .т. 301. в. 6, с. 1484-1487.

25.гильяно Н.Я., Малиновский О.В.,Хаир М.Б. Полиплоидизация клеток индуцированная радиацией. Тезисы доклада на 1-ом радиобиол.

5ъе:?де. м.. 1989, с. 583-584.

;'6.Гильяно Н.Я., Малиновский О.В.. Хаир М.Б. .Ихтиар А^М. Действие 1злучений с разной ЛПЭ на состояние хроматина в клетках млекопитающих In vivo и In vitro. Тезисы доклада на 1-ом радиобиоло-

гическом съезде,М., 1989, с. 137.

27.Гильяно Н.Я., Малиновский О.В., Хаир М.Б. .Индукция полиплоиди-зации гепатоцитов крыс разного возраста ионизирующим излучением с разной ЛПЭ. Радиобиология, 1990, т.30, в. 2 , с. 194-198.

28.Гильяно Н.Я..МАлиновский О.В.,Хаир М.Б. О механизмах индуцированной полиплсидизации клеток. Биологич.журнал Армении,1989 , В. 9/10, с. 852-858.

30. Гильяно Н.Я., Малиновский 0.В., Ихтиар A.M. Влияние ионизирующих излучений с разной ЛПЭ на наследственные структуры клетки. В сб. "Генетические последствия окружающей среды.", Самарканд, 1990, с. 61-62.

31.Гильяно Н.Я., Малиновский О.В., Ихтиар A.M. Действие излучений с разной ЛПЭ на состояние хроматина в гепатоцитах облученных крыс. В сб. "Микродозиметрия"; Канев. 1989. с. 72.

32.Giliano N. J., Malinovsky O.V. Radiation-Induced yield genome mutation in the rat hepatocytes.Rad. Res. Internatlon.Congress Abstracts. Toronto. 1991 , v. 1,p. 170

33.Giliano N. J.. Mallnovsky 0. V., IKhtiar A.M. The DNA content and chromatin conformation measured by flow 'cytometry In mammalian cells after different LET radiation. Abstracts Europ. meeting Radloblol. Erfurt,, 1992, p. 242.

34.Гильяно Н.Я., Малиновский О.В.Ихтиар A.M. Влияние ингибиторов ДНКтопоизомеразы 2 на радиочувствительность, репарацию и кон-формационные изменения хроматина в клетках млекопитающих. Радиобиология, 1993 .Т. 33. В. 2.: С. 197-205.

35. Гильяно Н. Я., Малиновский О.В., Ихтиар A.M. Изменение конформа-ции хроматина,индуцированное ионизирующим излучением с разной ЛПЭ в покоящихся и пролиферирующих гепатоцитах крыс разного возраста. Радиобиология. 1993, т. 33, в. 2 ,с. 189-196.

37.Glliano N.J.Potential role conformation of chromatin in the cell radiosensitivity. Abstracts Europ.Meeting Radloblol., Stockholm, 1993.

38.Giliano N.J., Ikhtidr A.M., Pantina R.A, Alteration In the radiosensitivity of'Hela cells by hypertonic treatment: Correlations between chromatin conformation and repair chromosome aberrations. Abstracts Europ. Meeting Radloblol. Amsterdam., 1994, p.

Отпечатано на ротапринте ПИЯФ Зак.280, тир.ЮО, уч.-изд.л.^; 26/1У-1995г. Бесплатно

Информация о работе

Гильяно, Надежда Яковлевна
доктора биологич. наук
Санкт-Петербург, 1995
ВАК 03.00.01

Автореферат

Похожие работы