Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование радиобиологических реакций эмбрионов тутового шелкопряда Bombyx mori L. на разных стадиях их развития

ВАК РФ 03.00.01, Радиобиология

Автореферат диссертации по теме "Исследование радиобиологических реакций эмбрионов тутового шелкопряда Bombyx mori L. на разных стадиях их развития"

6 оч зг .

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕЗОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В.ЛОМОНОСОВА

Биологический факультет

На правах рукописи УДК 577.391.632.732

АГАЕВ ФУАД АР® оглы

ИССЛЕДОВАНИЕ РАДИОБИОЛОГИЧЕСКИХ РЕАКЦИЯ ЭМБРИОНОВ ТУТОВОГО ШЕЛКОПРЯДА ВопЪух тог! ь. НА РАЗНЫХ СТАДИЯХ ИХ РАЗВИТИЯ

03.00.01 -. Радиобиология

АВТОРЕЗЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА - 1992

Работа выполнена в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН.

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор А.И.Газиев,

кандидат биологических наук Н.И.Юсифов.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Г.Д.Засухина,

доктор биологических наук, профессор Н.И.Рябченко.

Ведущая организация - Институт биофизики клетки РАН.

Защита диссертации состоится гз,-в /5~ — часов на заседании Специализированного совета Д 053.05.74 при Московском Государственном Университете им. Ы.В.Ломоносова по адресу: 119899, г.Москва, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета Ы1У.

Автореферат разослан " " 1992 г.

Ученый секретарь Специализированного совета

доктор биологических наук 0. Р. Колье

I ОБЦАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

"Актуальность проблемы. Среди живых организмов, насекомым принадлежит первое место как по разнообразию видов, числу занимаемых ими экологических ниш, так и по их огромной численности. Хорошо известно, что они способны адаптироваться к резко изменяющимся условиям среды обитания, к воздействию физических и химических факторов.

В настоящее время в литературе имеются сведения о реакции нескольких десятков видов насекомых, относящихся более чем к семи отрядам, на воздействие ионизирующей радиации (Калмыков, 1970;

ДюоГГ,1972). Однако большая часть имеющихся в литературе сведений по радиобиологическим реакциям многих насекомых или их клеток разрозненны и противоречивы, ибо исследования проводились фрагментарно и на различных объектах: изучали или выживаемость облученных насекомых или только восстановление радиационных повреждений, не рассматривая результаты этих исследований в комплексе на одном и том же объекте.. Большое количество данных по радиобиологии плодовой мушки ИгозорЬИа недостаточно для оценки радиобиологических реакций'других видов насекомых на разных стадиях их развития. Дальнейшее изучение реакций различных насекомых на воздействие ионизирующей радиации и других физических факторов представляется чрезвычайно важным для решения задач радиобиологии, радиационной биотехнологии и экологии.

Среди насекомых, имеющих народно-хозяйственное значение,важное место занимает тутовый шелкопряд ВотЪух тог1 ь, , которого человек использует в течение столетий для получения шелка, и изучение радиобиологических реакций этих организмов представляется чрезвычайно интересным.

Как известно, важнейшим критерием оценки реакции организмов на воздействие ионизирующей радиации может быть шределение проявления как летальных, так и стимулирующих эффектов радиации на данном виде организма. В свою очередь, радиочувствительность организмов зависит от ряда факторов и, в частности от функционирования систем репарации ДНК в их клетках. Хотя большое количество исследований по изучению репарации ДНК выполнены на клетках дрозофилы, совершенно не изучены процессы репарации ДОК у тутового шелкопряда, после их облучения. Более того надо полагать, что на уровне целого организма и особенно у развивающихся эмбрионов тутового шелкопряда в зависимости от стадии их развития процессы репарации ДНК могут иметь специфические особенности. Как

известно, наиболее радиочувствительной стадией у развивающихся насекомых является эмбриогенез. Поэтому в рамках настоящего иссле дования мы в основном изучали реакции эмбрионов тутового шелкопря да на разных стадиях-их развития на воздействие гамма-радиации. При этом были использованы как пролонгированное воздействие радиации при низких мощностях дозы, так и острое облучение в летачь-них дозах.

Цель и задачи исследования. Исходя из изложенного, основной целью настоящей работы являлось исследование реакций развивающихся эмбрионов тутового шелкопряда на воздействие различных доз ионизирующей радиации и изучение функционирования систем репарации повреждений ДИК в клетках этих эмбрионов.

Для реализации указанной_цели необходимо было решать следующие конкретные задачи:

- исследовать влияние хронического действия малых доз лучения на развитие эмбрионов тутового шелкопряда;

- выяснить полную характеристику радиочувствительности эмбрионов в течение всего периода эмбриогенеза;

- исследовать реакции эмбрионов на комбинированное воздействие теплового шока (ТШ) и ^-радиации;

- изучить ингибирование и восстановление синтеза ДНК в облученных развивающихся эмбрионах;

- анализировать образование однонитевых разрывов (ОР) и any-ринозых/апиримидинових (АП) участков и их репарации в ДНК облученных эмбрионов.

Научная новизна и практическая ценность работы. В результат! проведенных исследований впервые получены следующие новые факты, которые ькносятся на защиту:

- выявлены эффекты стимуляции развития тутового шелкопряда при ^"-облучении грены в малых дозах и при низких мощностях доз;

- характеризована радиочувствительность эмбриогенеза тутово го шелкопряда. Эморионц до 4 суток развития в 10-12 раз болео чувствительны к действию т"-лучей, чем эмбрионы на 6-10-е сутки развития;

- показано, что ТШ модифицирует радиочувствительность эмбри онов, повышая, либо снижая ее в зависимости от последовательности его воздействия (до или после ^-облучения);

- установлено, что количество АП-участков, ОР, регистрируемое в ДНК эмбрионов, после их ^"-облучения находится в зависимое ти от стадии развития эмбрионов. В ДНК 3-сут эмбрионов этих пов-

реждений регистрируется больше, чем в ДНК 7-сут. Кинетика пострадиационного восстановления АП-участков и ОР а ДНК 3- и 7-сут эмбрионов гетерогенна и существенно различается;

- установлено, что синтез ДНЯ в 3-сут эмбрионах более чувствителен к действию ^"-радиации, чем в 7-сут эмбрионах. Степень пострадиационного подавления и восстановления синтеза ДНК в эмбрионах тутового шелкопряда коррелирует с их радиочувствительностью.

Данные, полученные при выполнении диссертационной работы, имеют важное значение для фундаментальной и прикладной радиобиологии, радиационной биотехнологии. Они могут быть использованы при дальнейшей разработке вопросов радиационной биологии насекомых и, в частности тутового шелкопряда. Отдельные результаты работы могут быть рекомендованы для использования при разработке мер по повышению продуктивности в шелководстве.

Публикации. По теме диссертации опубликованы 6 статей и 3 находятся в печати.

Апробация работы. Основные положения диссертации догладывались на II Всесоюзном координационном совещании "Эколого-генети-ческие последствия воздействия на окружающую среду антропогенных факторов" (Сыктывкар, 1989); I Всесоюзном радиобиологическом съезде (Москва, 1989); I Всесоюзном симпозиуме "Молекулярно-кле-точные механизмы хронического (гнеинего и внутреннего) действия ионизирующих излучений на биологические системы" (Пуцино, 1990). Работа в целом апробирована на меотабораторном семинаре в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН 26 декабря 1991 года.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, трех глав, включающих обзор литературы, описание материалов и методов, изложение результатов исследований и их обсуждение, а также заключения, выводов и списка цитированной литературы (173 наименования, из них 135 зарубежных публикаций). Работа изложена на 121 стр., содержит 5 таблиц и 18 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ. В работе использовали грену и эмбрионы моновольтинной расы тутового шелкопряда Bombyx nori L., породы Шеки-I, Шеки-2 и их гибридов: Шеки-1х2 и Шеки-2х1. Инкубация постдиапаузных эмбрионов осуществлялась при температуре 25+1°С и относительной влажности 65-70$. Выход гусениц из грены укладывался в течение 10—II сут.

Условия облучения. Опыты с хроническим У^-облучением проводи-

ли в термостатированной камере (¡¿3+1°С), в которой был установле: свинцовый контейнер-коллиматор, содержащий источник ^-излучения на основе изотопа ^Cs, имеющий активность 2,5x10® Бк. Контроль ные образцы помещались вне поля пучка ¿Г-лучей, в этой же камере за дополнительной свинцовой стенкой. Острое облучение эмбрионов проводили на установках ГУБЭ и РХ-^-30, с источником ^-излучения при мощности дозы 18,55 и 100 Гр/мин, соответственно.

Определение влияния малых доз хронического и острого ¡¡^-облучения на развитие и выживаемость эмбрионов, гусениц и на техно логические показатели коконов. Грену через сутки после инкубации при 25°С помещали в условия хронического ^-облучения. Спустя 9 сут развития в этих условиях, грену переносили в лабораторию и проводили учет вылупившихся гусениц. Определяли вес развивающих ся гусениц. В опытах с острым облучением, грену облучали в начал эмбриогенеза. Исследовали те же показатели развития, что и в пре дцдущих опытах.

Массу коконов, их оболочек и шелконосность определяли по оС щепринятым методам.

Изменение радиочувствительности в течение эмбриогенеза опре деляли облучением эмбрионов всех возрастов (I—10 сут) в широком диапазоне доз (2-650 Гр) и последующим вычислением ЛДвд из кривь доза-выживаемость.

Воздействие Т1Д (40°С, 60 ыин) на эмбрионы проводили непоср« дственно перед их облучением или сразу после него.

Синтез ДНК в тканях эмбрионов определяли по включению /V -тимидина в их кислотонерастворимые фракции.

0Р в ДНК определяли методом щелочного "раскручивания" с по< ледующей фиксацией одно-двунитевых фрагментов ДНК на гидроксиаш тите (Газиев и др., 1979).

Количественное определение АП-участков в ДНК проводили по реакции связывания /14С/-ыетоксиамина с АП-участками ДНК in vit] (Talpaert-Borle, liuzzi, 1983).

Ввделение ДНК из эмбрионов проводили по методу r.larnur (IS6! с некоторыми модификациями.

Синтез белков оценивали по включению /^^/-метионина в кис-лотонерастворимую фракцию тканей эмбрионов. Индукцию синтеза бе. ков теплового шока (БТШ) определяли методом электрофореза (Ъаеи mLi , 1970). Фракции радиоактивно-меченых белков регистрировали радиоавтографией.

Количественное содержание белка определяли по методу Lowry

et al (1951).

Количественное содержание ДНК определяли флуорометрическим методом по реакции с 3,5-диаминобензойной кислотой (Thomas, Far-quna4I978).

I. ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ МАЛЫХ ДОЗ ХРОНИЧЕСКОГО И ОСТРОГО ^-ОБЛУЧЕНИЯ НА РАЗВИТИЕ ТУТОВОГО ШЕЛКОПРЯДА

В литературе мало сведений, касающихся влияния малых доз хронического ^"-облучения на насекомых. Тем не менее как в исследованиях на других объектах, здесь можно было ожидать проявление эффекта стимуляции, индукцию адаптивного ответа или усиление неблагоприятных последствий (Ъискеу, I980;Sagan, 1989) в зависимости от дозы и мощности дозы ^-облучения, а также от радиочувствительности насекомых. В наших исследованиях мы изучали влияние малых доз ^-радиации на развитие эмбрионов тутового шелкопряда. ■

Средние значения продолжительности эмбриогенеза тутового шелкопрядах подвергнутых хроническому ^-облучению, полученных в части экспериментов, представлены на рис.1. Как видно из полученных данных, стимуляция развития эмбрионов при хроническом облучении обнаруживается при столь малой суммарной дозе, как 3,24x10"^ Гр, накопленной в течение 9 суток. Анализ большой выборки данных показал, что на всех исследованных породах и гибридах ^-облучение приводит к ускорению эмбрионального развития на 3-7 часов. В то же время острое облучение эмбрионов в такой ж дозе никак не сказывается на их развитии. Дальнейшее наблюдение за развитием гусениц, полученных из породы Шеки-2, облученной в течение эмбриогенеза, показало значительное увеличение их веса на 33-е сут развития, по сравнению с контролем.

Исходя из полученных эффектов при хроническом ^"-облучении, представлялось интересным установить возможность выявления этих же реакций при других величинах доз острого облучения (0,5-13 Гр).Исследования, проведенные на породе Шеки-2, показали, что наибольший эффект стимуляции развития обнаруживается при ^-облучении этих эмбрионов в дозе 2 Гр. При этом ускоренное развитие гусениц сказывается и на весе коконов и оболочек, т.е. ведет к статистически достоверному повышению выхода шелка-сырца.

Как следует из полученных нами данных, хроническое ^-облучение грены в период эмбриогенеза в суммарной дозе 1,3 Гр^при мощности 6x10"^ Гр/час снижает также гибель гусениц в неблагоприятных условиях летне-осеннего периода, и при этом масса живого кокона

увеличивается на 24%, а масса шелковой оболочки - на 38%. Получен ные данные свидетельствуют о повышении сопротивляемости к неблаго приятным условиям среды тутового шелкопряда под влиянием ^"-облучения в малых дозах.

Согласно литературным данным, большинство исследований'по стимулирующему действию малых доз ^"-радиации выполнены на растительных организмах (Кузин, Вагабова, 1984). Результаты, полученные нами на эмбрионах тутового шелкопряда, указывают на общность этого феномена и для мира насекомых.

зоо

/

У

Рис.1. Продолжительность эмбриогенеза при ¡¡"-облучении с различной мощностью дозы. По оси абсцисс - продолжительность эмбриогенеза, час; по оси ординат — доля вылупившихся гусениц, %. I - контроль; £ - <К-облучение с мощностью дозы 1,5x1с)"4

3 - 6,0x10 Гр/час

Гр/час;

Рис.2. Изменение радиочувствительности эмбрионов тутового шелкопряда в различные периоды их развития. По оси абсцисс - периоды эмбрионального развития, сут; по оси ординат - ЛДзд, Гр

2. РАДИОЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ ЭМБРИОНОВ ТУТОВОГО ШЕЛКОПРЯДА И ЕЕ ИЗМЕНЕНИЕ ПРИ ТЕПЛОВОМ ШОКЕ

Как уже отмечалось, для насекомых характерно резкое различие радиочувствительности на разных стадиях их развития и наиболее радиочувствительной является эмбриональная стадия. Изучение изменения радиочувствительности эмбрионов в течение всего периода их развития представляет важный интерес,так как в процессе эмбриогенеза могут включаться или выключаться различные регуляторные системы, способные влиять на биологические процессы и на реакцию этих организмов к воздействию экстремальных факторов среды.

Нами были исследованы радиочувствительность эмбрионов тутового шелкопряда, ^ также влияние налетального ТШ на радиочувстви-

тельность этих эмбрионов на разных стадиях их развития.

На рис.2 представлены обобщенные данные из большого количества кривых выживаемости эмбрионов тутового шелкопряда в зависимости от времени их развития. Видно, что экбрионы на начальном периоде развития - до 4 суток - более чувствительны к ^-радиации. Начиная с 4-х сут развития у эмбрионов радиорезистентность непрерывно по-вьппается до конца эмбрионального развития. Д^о Для эмбрионов на

3-4-е сут развития составляет 30-35 Гр, в то время как на 7-9-е сут развития она повышается до 310-430 Гр. Таким образом обнаруживается 10-кратное понижение радиочувствительности к 7-9-м сут эмбриогенеза. Повышенная радиочувствительность на ранних этапах развития, возможно, связана с тем, что на этом этапе происходит более интенсивное деление и дифференцировка клеток. Как показали наши эксперименты, эмбрионы,завершающие морфогенез личинок на 7-9-е сут, являются резистентными к воздействию ионизирующей радиации. Возможно, появление у эмбрионов высокой радиорезистентности на этой стадии развития способствуют и гуморальные факторы," так как усиление радиорезистентности хорошо коррелирует с повышенной индукцией гормона выхода (Ризо et а1, 1985). Таким образом, процесс эмбриогенеза тутового шелкопряда условно можно разделить на две стадии, резко различающиеся по радиочувствительности. Первая стадия - до

4-х сут эмбриогенеза - в 10-12 раз более чувствительна к ^-радиации по сравнению со второй стадией, которая начинается в основном с 5-х сут эмбриогенеза.

Исходя из полученных данных о резком различии р~.д:ю',у )о?2и-тельности первой и второй стадий эмбриогенеза тутового шелкопряда, в дальнейших исследованиях мы использовали эмбрионы на 3- и 7-е сут развития. ,

Как известно, ГШ может вызывать в клетках различные структурно-функциональные изменения, в том числе изменение радиочувствительности. Многочисленные данные показывают, что воздействие ТШ на клетки животных до или после их облучения, в большинстве случаев усиливает летальное действие ^-радиации ( Вептап а1, 1982; Каприза et а1, 1989). Результаты наших исследований по изучению влияния ТШ на радиочувствительносзъзлбрионов тутового шелкопряда показали, что предрадиационная термообработка (40°С, 60 мин) 3-сут эмбрионов приводит к.повышению их радиорезистентности (ФИД=1,6). В то же время ТШ, применяемый сразу после облучения, приводит к усилению лучевого поражения (ФИД=1,5). ДД50 для эмбрионов, получивших ТШ до или после облучения, составляет 46,7 и 19,0 Гр соответ-

ственно. Для контрольного варианта, в котором эмбрионы облучались без термообработки, равна 29,5 Гр. Аналогичные эффекты, хотя и менее выраженные, обнаруживаются на 7-сут эмбрионах. На этой стадии развития ДЦзд для эмбрионов, подвергнутых предрадиационной термообработке, равна 357,0 Гр (ФИД=1,1), а для контрольных эмбрионов и эмбрионов, получивших ТШ после облучения, ЛД50 равна 316,7 и 280,6 Гр, соответственно, (£ИД=>1,1). Исходя из этих даннь можно заключить, что эффект радиомодифицируюцего действия ТШ однс ■значен и на радиорезистентной, и на радиочувствительной стадиях эмбрионального развития тутового шелкопряда, однако на радиочувс! вительной стадии он выражен более резко. Таким образом, результаты наших наблюдений показывают, что ТШ может вызвать изменение ра диочувствительности не только клеток in vitro , но и на уровне целого организма.

Усиление радиорезистентности ТШ, по-видимому, является ответом клеток эмбрионов тутового шелкопряда к стрессовому фактору, i это может быть обусловлено различными биохимическими сдвигами, в частности индукцией синтеза белков ТШ (БТШ) ( iiitchei, norriccon, 1982; Вербенко и др., 1986). Учитывая то, что культивируемые клет ки тканей тутового шелкопряда характеризуются способностью синтезировать БТШ при исключительно высоких температурах (до 48°С) (Евгеньев и др., 1987), можно предположить, что БТШ могут участв< вать в регуляции радиочувствительности на уровне целого организм; Что же касается наблюдаемого нами усиления гибели эмбрионов при применении ТШ после облучения, можно предположить, что ТШ ингиби-рует репарацию потенциально летальных повреждений и,возможно, в данных условиях радиационные повреждения подавляют процесс индукции синтеза БТШ. Для проверки последнего предположения мы анализировали возможность синтеза БТШ в клетках эмбрионов тутового ше. копряда, подвергнутых комбинированному воздействию ТШ и ^-облучения.

Согласно полученным результатам, воздействие ТШ (40°С, 60 м: приводит к индукции или усиливанию синтеза БТШ в этих эмбрионах. При,этом, белок с мол.массой 70 кДа (БТШ-70 кДа) синтезируется de novo . А синтез двух БТШ (83 и 68 кДа) значительно усиливаете, в результате действия высокой температуры. Следует отметить, что на долю БТШ-70 кДа приходится 55-60% всей включившейся радиоакти вной метки. Аналогичная индукция этих белков происходит и в опытах, в которых эмбрионы подвергаются комбинированному воздействи: ТШ и ¡^-облучения. Особо стоит отметить, что при пострадиационно

термообработке, которая значительно снижает выживаемость эмбрионов, также индуцируется синтез БТШ, причем на том же уровне, что и при предрадиационной термообработке. Очевидно, что повреждения, вызываемые ^-облучением, не могут служить "препятствием" для индукции БТШ. Сравнение результатов анализа показывает, что в 3-сут эмбрионах, в отличие от 7-сут, БТШ намного интенсивнее синтезируются, что коррелирует с выраженным в них эффектом радиомодифици-рующего действия ТШ. Вместе с тем, полученные данные указывают, что индуцируемые БТШ в клетках ^-облученных эмбрионов (пострадиационный ТШ) не способствуют повышению радиорезистентности этих эмбрионов.

3. СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ СТРУКТУРНЫХ ПОВРЕЖДЕНИЙ И СИНТЕЗА ДНК В ЭМБРИОНАХ ТУТОВОГО ШЕЛКОПРЯДА, ОБЛУЧЕННЫХ НА РАЗНЫХ СТАДИЯХ РАЗВИТИЯ

Как было отмечено, радиочувствительность организмов существенно зависит от функционирования систем репарации ДНК в их клетках.

Обнаруженное нами резкое различие в радиочувствительности эмбрионов тутового шелкопряда на разных стадиях их развития позволяет предполагать, что в клетках 3- и 7-сут эмбрионов системы репарации ДНК, возможно, функционируют с различной эффективностью.Как известно,- об эффективности функционирования систем репарации ДНК в клетках можно судить по данным анализа кинетики'элиминации структурных повреждений из ДНК, по восстановлению функциональной активности ДЖ-матрицы (например, восстановление синтеза ДНК), по дан-ныл анализа частоты мутаций и т.п.

В настоящем исследовании, мы анализировали восстановление АП--участков, ОР ДНК и репликативного синтеза ДНК в 3- и 7-сут эмбрионах тутового шелкопряда, облученных ^-лучами.

3.1. Образование и репарация АЛ-участков в ДНК

Исследование зависимости образования АП-участков в ДНК клеток 3- и 7-сут эмбрионов от дозы ^"-облучения показало, что с увеличением дозы гамма-облучения увеличивается количество АП-участков в ДНК эмбрионов. Вместе с тем, результаты анализа показали, что в ДНК 3-сут эмбрионов количество регистрируемых АП-участков в 1,2-1,4 раза выше, чем в ДНК 7-сут эмбрионов, сразу после их ^"-облучения в одних и тех же дозах.

Из полученных данных видно также, что чем больше доза облучения, тем выше разница в количестве регистрируемых АП-участков в

ДНК 3- и 7-сут эмбрионов.

При пострадиационной инкубации 3- и 7тсут эмбрионов было обнаружено снижение количества АП-участков в ДНК, что свидетельствует о функционировании в клетках эмбрионов тутового шелкопряда системы репарации таких повреждений, как апуринизация и апиримиди-низация ДНК. Вместе с тем, репарация АП-участков при пострадиационной инкубации этих эмбрионов протекает с разной скоростью. Так, в ДНК 7-сут эмбрионов остаточное количество АП-участков к 45 минутам пострадиационного периода составляет около 30$ от величин, регистрируемых сразу после облучения эмбрионов, тогда как в Д1К 3-сут эмбрионов остаточное количество АП-участков к этому времени снижается только на 50%. Причем.такое различие в скорости репарации АП-участков у 3- и 7-сут эмбрионов сохраняется независимо от дозы их ¡¡¡"-облучения.

На рис.3,А показано изменение содержания количества АП-участков в ДНК эмбрионов 3- и 7-сут развития, после их ^"-облучения в дозе 100 Гр. Здесь же для сравнения представлены данные об изменении содержания количества АП-участков в ДИ гамма-облученных клеток Escherichia coli К 12. Можно видеть, что все три кривые зависимости содержания АП-участков в ДНК от времени после облучения^, демонстрируют различные скорости восстановления АП-участков в ДНК облученных бактерий и 3-, 7-сут эмбрионов тутового шелкопряда. Так, время репарации 50% АП-участков у бактерий составляет 15 мин, у 3-сут эмбрионоз 45 мин и у 7-сут эмбрионов 30 мин, относительно регистрируемых величин сразу после их облучения. Вместе с тем,эти

Рис.3. Изменение содержания АП--участков в ДНК 3-сут (I) и 7--сут (2) эмбрионов тутового шелкопряда и клеток E.coli (3) после их ¡T-облучения в дозе 100 Гр. По Ъси абсцисс - время после облучения, мин; по оси ординат: (А) - количество связываемого с ДНК /^С/-метоксиамина,

о

имп/мин х 10 /мг ДНК; (Б) - изменение количества связанного с

ДНК /^С/-меток сиамина. за 100% принято количество / £/-мето-ксиамина, связываемой с ДНК, выделенной из эмбрионов сразу после их облучения

О 10 15 го 30 4 5

же данные указывают, что хотя начальная скорость восстановления АП-участков в ДНК 7-сут эмбрионов выше, чем у 3-сут, к 90 минутам пострадиационного периода скорость репарации АП-участков в ДНК 7--сут эмбрионов снижается. К этому сроку пострадиационной инкубации эмбрионов, доля остаточных АП-участков, относительно данных, регистрируемых сразу после облучения у 7-сут эмбрионов составляет 25%, тогда как у 3-сут эта величина равна 10% (рис.3,Б).

Кап известно, з ДНК ^"-облученных клеток АП-участки могут возникнуть как в результате радиациснно-химического отщепления оснований от ДНК, так и в процессе элиминации поврежденных оснований или продуктов их деструкции от Д1К различными ДНК-гликозилаэами (Сага-й оппа, СЬепс, 1982). Регистрируемое нами количество АП-участков в ДНК эмбрионов тутового шелкопряда сразу после их ^-облучения можно рассматривать в основном как результат первичного посревде-ния ДНК. Однако, не исключено, что за короткий промежуток времени после облучения эмбрионов до лизиса их клеток, для получения препаратов- ДНК, начинают функционировать инцизиснние ферменты, и в регистрируемые нами данные о количестве АП-участков в ДНК сразу после облучения эмбрионов, вносит вклад и действие ДНК-гликозилаз. В целом полученные данные свидетельствуют о том, что в клетках эмбрионов тутового шелкопряда процесс репарации АП-участков ДНК протекает достаточно гетерогенно.

Полученные данные, хотя указывают на существенное различие в образовании АП-участков в ДНК сразу после облучения и в кинетике их репарации в пострадиационный период у 3- и 7-сут эмбрионов, очевидно, эти различия не могут отражать 10-кратную разницу в чувствительности этих эмбрионов к ^-радиации, определяемой по гибели.

3.2. Образование и репарация ОР ДНК

ОР Д!К, хотя принято рассматривать как легкорепарируемые повреждения в клетках большинства организмов, торможение или снижение эффективности их репарации может приводить к формированию летальных повреждений в Д1К облученных клеток. Более того, ферментативные системы репарации различных повреядений ДНК взаимосвязаны, поэтому результаты анализа образования ОР ДНК и их репарация в 3-и 7-сут эмбрионах, резко различающихся по радиочувствительности, в определенной мере могут осарактеризовать эффективность функционирования процессов репарации ДНК в клетках этих эмбрионов. Результаты анализа ОР ДНК в наших экспериментах характеризуют уровень истинных разрывов полинуклеотидных цепей Д1К, так как в условиях проведения этих аначизов АП-участки ДНК не разрушались.

Рис.4. Изменение количества одно-нитевой ДНК в лизатах Т-облучен-ных 3-сут (I) и 7-сут (2) эмбрионов, %.

По' оси абсцисс - время после облучения, мин; по оси ординат -доля однонитевой ДНК, %

На рис.4, представлено количество однонитевой ДНК в процен- • тах от общей ДНК, которое соответствует количеству ОР в ДНК эмбрионов тутового шелкопряда, облученных в дозе 100 Гр. Как видно из этих данных, у эмбрионов разного возраста сразу после облучения регистрируется различная степень деградации ДНК, а к 90 минутам пострадиационного периода почти одинаковое их снижение, что указывает на активное функционирование системы репарации ОР ДНК в клетках эмбрионов обоего возраста. Так, количество однонитевой ДНК, регистрируемое в лизатах клеток 3- и 7-сут эмбрионов, полученных сразу после их облучения, составляет 46 и 12% от общего количества ДНК в каждом образце, с вычетом величин контрольного уровня. Изменение количества ОР в ДНК 3- и 7-сут эмбрионов в пострадиационный период имеет двухфазный характер. Большая часть разрывов восстанавливается в течение 15-30 мин. Особенно это наглядно ввдно на данных, полученных на 3-сут эмбрионах. Вместе с тем, полученные результаты позволяют полагать, что формирование ОР в ДНК и процессы их репарации в 3- и 7-сут эмбрионах существенно различны. Резко различающиеся данные о количестве разрывов ДНК, регистрируемых сразу после облучения 3- и 7-сут эмбрионов в одной и той же дозе и последующие кривые снижения количества этих разрывов, в зависимости от времени после облучения, свидетельствуют о гетерогенности кинетики процессов репарации разрывов ДНК в клетках этих эмбрионов. Различную степень деградации ДНК на начальном этапе после облучения эмбрионов можно рассматривать как различие в скорости функционирования быстрой репарации ОР ДНК в клеткахсмбрио-нов тутового шелкопряда на разных стадиях их развития.

3.3. Подавление и восстановление синтеза ДНК в ^-облученных эмбрионах

Важнейшим критерием проявления воздействия ионизирующей радиации и других генотоксиков на организмы является ингибирование репликативного синтеза ДНК в их клетках за счет повреждения ДНК-матрицы или надмолекулярных систем репликации. Эмбриогенез тутового шелкопряда характеризуется постепенным повышением уровня синтеза ДНК, который достигает своего максимума в середине эмбриогенеза, и дальнейшим спадом этого уровня к концу эмбрионального развития (Севастьянова, Родина, 1987). Результаты наших исследований показывают, что для стадии эмбриогенеза с высокой радиочувствительностью характерен высокий уровень репликативного синтеза ДНК. В эмбрионах на 3-й сут развития уровень синтеза ДНК, регистрируемый по включению /^/-тимидина в 7-8 раз выше по сравнению с синтезом ДНК на 7-е сут развития. Облучение 3-сут эмбрионов в дозе 100 Гр почти на 50% угнетает в них региикативный синтез ДНК, а в 7-сут эмбрионах облучение в такой же дозе подавляет уровень синтеза ДНК только на 15%.

Через 4 часа после облучения в дозе 100 Гр способность синтезировать ДНК у эмбрионов тутового шелкопряда существенно восстанавливается. Однако и здесь можно увидеть разницу мевду эмбрионами 3- и 7-сут развития. При этом ДНК-синтезирующая активность 7-сут эмбрионов восстанавливается на 100$, а 3-сут эмбрионов только на 70%, через 4 часа после их ¡р-облучения.

Результаты исследований ДНК-синтезирующей активности, определяемой сразу и через 4 часа после облучения 3- и 7-сут эмбрионов различными дозами радиации, представлены на рис.5. Видно, что облучение 3-сут эмбрионов' в дозе 25 Гр приводит к подавлению синтеза ДНК на 40%. При дальнейшем увеличении дозы ^-облучения до 50-100 Гр синтез ДНК подавляется незначительно. Подавление синтеза ДНК сразу после облучения сменяется восстановлением его уровня к 4 часам пострадиационного периода. Однако при этом не наблюдается полного восстановления синтеза ДНК у 3-сут эмбрионов, облученных в дозе 25 Гр. В то же время синтез ДНК в 7-сут эмбрионах оказывается весьма резистентным к действию ^-облучения. При облучении этих эмбрионов в дозе' 25-75 Гр не обнаруживается значительного подавления синтеза ДНК. Существенное угнетение синтеза ДНК

на 1Ъ%) в 7-сут эмбрионах наблюдается при их ^-облучении, начиная с дозы 100 Гр. Дальнейшее угнетение синтеза ДНК в 7-сут эмбрионах носит дозово-зависимый характер. И при этом к 4 часам пос-

lio

70

Рис

К 25 50 100 25 . 50 . 100 Гр К 100 150 200 100 150 2 00 Гр

5. Ингибирование и восстановление синтеза ДНК в ^»облученных 3-сут (А) и 7-сут (Б) эмбрионах. По оси ординат - синтез ДНК в клетках облученных эмбрионов в ю от контроля

ле облучения наблюдается полное восстановление ДОК-синтезирующей способности в эмбрионах облученных в дозе 100 и 150 Гр. В то же время в эмбрионах облученных при более высоких дозах (200 Гр и выше) не наблюдается восстановление синтеза ДНК. Полученные нами результаты свидетельствуют о более высокой радиорезистентности процесса синтеза ДНК в пролиферирующихся клетках 7-сут эмбрионов тутового шелкопряда, по сравнению с таковой у 3-сут эмбрионов.

Таким образом, результаты серий экспериментов, выполненных с использованием эмбрионов тутового шелкопряда, резко различающихся по радиочувствительности, показывают, что количество АЛ-участков и ОР в ДНК 3-сут (радиочувствительных) эмбрионов, регистрируемое сразу после их У1-облучения гораздо больше, чем в ДНК 7-сут (радиорезистентных) эмбрионов. Кинетика пострадиационного восстановления этих повреждений ДОК в 3- и 7-сут эмбрионах различается и довольно гетерогенна. Синтез ДНК в 3-сут эмбрионах более чувствителен к действию (f1-радиации, чем в 7-сут. Степень подавления и пострадиационного восстановления синтеза ДЩ в облученных 3- и 7--сут эмбрионах больше коррелирует с радиочувствительностью этих эмбрионов. Различие в количественном образовании и разнохарактерность репарации ОР и АП-участков в ДНК V-облученных 3- и 7-сут эмбрионов явно не являются факторами, определяющими разную радио-

чувствительность этих эмбрионов. Однако можно отметить, что репарация ОР и АП-участков в ДНК этих эмбрионов является необходимым, но недостаточным условием для восстановления синтеза ДНК и жизнеспособности клеток ^"-облученных эмбрионов тутового шелкопряда.

Можно полагать, что наблюдаемое различие в образовании и кинетике репарации поврелдений ДНК и восстановление ее синтеза в ^--облученных эмбрионах связана сменой генетической активности в клетках эмбрионов насекомых на поздних стадиях эмбриогенеза, вовлечением новых ферментов-белков и других факторов (возможно, гормональных) в регуляцию матричных процессов в клетках развивающегося организма.

Полученные данные несомненно указывают также на возможность усложнений регуляций репарации ДНК в клетках высших организмов в процессе их развития ОШсНе!!., "Наг-Шап, 1990).

ВЫВОДИ

1. Выявлены эффекты стимуляции развития змбриснов__тутового шелкопряда при хроническом или разовом облучении грены в малых дозах ^-радиации. При этом ускорение развития личинок, вылупившихся из облученной грены, впоследствии способствует увеличению веса кокснов и их оболочек, а также снижению гибели гусениц в неблагоприятных условиях среды их обитания.

2. Получена полная характеристика радиочувствительности эмбриогенеза тутового шелкопряда. Обнаружено, что эмбрионы до 4-х сут развития в 10-12 раз более чувствительны к действию ¡^-лучей, чем эмбрионы на 6-10-е сутки развития.

3. Показано, что тепловой шок модифицирует радиочувствительность эмбрионов тутозого шелкопряда, повышая, либо снижая ее в зависда.ости от последовательности его воздействия (до или после ^-облучения), ^"-облучение не подавляет индукцию синтеза белков теплового шока у эмбрионов тутового шелкопряда.

4. Установлено, что количество АП-участков, ОР, регистрируемое в ДНК эмбрионов, после их ¿^-облучения находится в зависимости от стадии развития эмбрионов. В ДНК 3-сут эмбрионов этих повреждений регистрируется больше, чем в ДНК 7-сут эмбрионов. Кинетика пострадиационного восстановления АП-участков и ОР в ДНК 3- и 7--сут эмбрионов гетерогенна и существенно различается.

5. Установлено, что синтез ДНК в 3-сут эмбрионах в 3-4 раза более чувствительнее к действию ^-радиации, чем в 7-сут эмбрионах. Степень пострадиационного подавления и восстановления синте-

за ДНК в 3- и 7-сут эмбрионах тутового шелкопряда коррелирует с

их радиационной гибелью.

Основное содержание диссертации изложено в следующих работах:

1. Сейфов Н.И., Кузин A.M., Агаев Ф.А., Мозговой Е.Г. Влияние -облучения грены в малых дозах на развитие тутового шелкопряда Bombyx mori //Радиобиология, 1988. Т.28. Вш.1. С.95-99.

2. Юсифов Н.И., Кузин A.M., Агаев Ф.А. Влияние хронического ^-облучения малой мощности на эмбриогенез тутового шелкопряда Bombyx raori //Радиобиология.1989. Т.29. Вып.2. С.282-284.

3. Агаев Ф.А., Юсифов Н.И. Влияние малых доз радиации на развитие тутового шелкопряда Bombyx mori //Тезисы докл. II Всесоюзного совещания "Эколого-генетические последствия воздействия на окружающую среду антропогенных факторов".Сыктывкар,1989.С.33-34.

4. Агаев Ф.А., Закржевская Д.Т., Юсифов Н.И. Радиочувствительность тутового шелкопряда Bombyx mori на разных стадиях эмбрионального развития.//Тезисы докл. I Всесоюзного радиобиологического

, съезда. Москва, 1989. T.I. С.177-178.

5. Юсифов Н.И., Агаев Ф.А. Задержка эмбриогенеза тутового шелкопряда Bombyx mori после ^"-облучения.//Там же. Т.5. С.1230.

6. Yusifov 1.1., Kuzin A.M., Agaev F.A., Alieva С.G.

The effect of low level ionizing radiation on embryogenesis of silkworm Bombyx mori. // Radiât. Environ. Biophys. 1990. V.29, H 4. P.323-327.

7. Юсифов Н.И., Кузин A.M., Агаев Ф.А. Влияние хронического облучения эмбрионов тутового шелкопряда Bombyx mori на его развитие в онтогенезе. //Тезисы докл. I Всесоюзного симпозиума "Молекулярно-клеточные механизмы хронического (внешнего и внутреннего) действия ионизирующих излучений на биологические системы". Пущино, 1990. C.I40-I4I.

8. Агаев Ф.А., Закржевская Д.Т., Юсифов Н.И., Газиев А.И. Радиочувствительность эмбрионов тутового шелкопряда Bombyx mori L. и ее изменение при тепловом шоке. //Радиобиология. 1991. Т.31. Вш.1. С.33-37.

9. Юсифов Н.И., Агаев Ф.А., Кузин A.M. Повышение сопротивляемости к неблагоприятным условиям среды тутового шелкопряда (Bombyx mori L. ) под влиянием ^"-облучения в малых дозах.//Радиобиология. 1991. Т.31. Вып.2. С.265-268.

10. Юсифов Н.И., Агаев Ф.А., Алиева С.Г., Гулуева В.А. 0 влиянии естественного фона радиации на развитие тутового шелкопряда

( Bombyx mori ъ. ). //Актуальные проблемы радиационных исследо-

ваний. Труды Сектора РИ АН Азербайджана. Баку, Элм. 1991. С. 120-123.

[I. Агаев в.А. Индукция белков теплового шока и изменение радиочувствительности при тепловой обработке эмбрионов тутового шелкопряда Bombyx morí L. //Радиобиология.. (в печати).

[2. Агаев S.A., Газиев А.И., Закржевская Д.Т., Малахова Л.В., Сейфов Н.И. Сравнительное исследование структурных повреядений и синтеза ДНК а эмбрионах тутового шелкопряда ВошЪух mori облученных ^-лучами на разных стадиях развития, //Журнал эволи-ционой биохимии и физиологии, (в печати).

13. Агаев S.A., Васильев С.П., Газиев А.И. Исследование апуриниза-ции и апиримидиниэации ДНК ^"-облученных эмбрионов тутового шелкопряда ВошЪузс mori на разных стадиях развития.//Радиобиология. (в печати).

12.03.52 г. Зак.5915Р Т"р.125 экз. Уч.-«зд.л. 1.0 Отпечатано на ротапр"нте в ОКТК ПНЦ РАК