Изменения радиочувствительности в поколениях облученных клеток млекопитающих

Лизунова, Екатерина Юрьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изменения радиочувствительности в поколениях облученных клеток млекопитающих
ВАК РФ 03.00.01, Радиобиология

Автореферат диссертации по теме "Изменения радиочувствительности в поколениях облученных клеток млекопитающих"

На правах^рукописи

/У

ии

ЛИЗУНОВА Екатерина Юрьевна

ИЗМЕНЕНИЯ РАДИОЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ В ПОКОЛЕНИЯХ ОБЛУЧЕННЫХ КЛЕТОК МЛЕКОПИТАЮЩИХ

03.00.01- радиобиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

о Г V:' ^

Москва-2009

003465587

Работа выполнена в лаборатории радиационной биофизики и экологии Учреждения Российской Академии Наук Института химической физики им.Н.Н. Семенова РАН

Научный руководитель: доктор биологических наук

Осипов Андреян Николаевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Мазурик Виктор Константинович

доктор биологических наук, профессор Сынзыныс Борис Иванович

Ведущая организация: ФГУ Российский Научный центр

рентгенорадиологии Росмедтехнологий

/Г зе

Защита состоится «9» апреля 2009 г. в «' » часов на заседании диссертационного совета Д.501.001.65. в Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119899, г. Москва, ГСП, Ленинские горы, МГУ, биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ по адресу: 119899, г. Москва, ГСП, Ленинские горы, МГУ, биологический факультет.

Автореферат разослан « ^ » < ЬЛСЛ^у^С^ 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

Т.В.Веселова

Актуальность проблемы. Открытие таких эффектов воздействия ионизирующего излучения как снижение чувствительности к последующему облучению (адаптивный ответ) или повышение радиочувствительности (гиперчувствительность к облучению) заставило пересмотреть патофизиологические механизмы формирования отдалённых эффектов радиационного воздействия (Mothersill, Seymour, 2000; Пелевина и др., 2003). Предполагается, что облучение изменяет состояние клеточных защитных механизмов: систем антиоксидантной защиты, репарации ДНК, регуляции клеточного цикла и апоптоза (Пелевина и др., 2000; Серебряный и др., 2004). Многие исследователи считают, что механизмы изменения клеточной радиочувствительности тесно взаимосвязаны с механизмами индукции и реализации другого эффекта облучения - радиационно-индуцированной нестабильности генома (Пелевина и др., 2003; Okada et al., 2007; Schwartz et al., 2007: Seoane et al., 2007). Этот радиобиологический феномен проявляется в том, что часть клеток, выживших после облучения, может давать функционально измененное потомство, в котором с высокой частотой на протяжении многих поколений возникают de novo аберрации хромосом и генные мутации, в ряде случаев приводящие к повышенной клеточной смертности путем апоптоза (Мазурик и Михайлов 2001, 2004). Как и всякое биологическое явление, нестабильность генома может иметь как негативное (амплификация генов, мутации, дестабилизация хромосом, неопластическая трансформация и др.), так и позитивное значение для биологической системы (формирование гипервариабельных участков паратопа антител, появление альтернативных путей адаптации к меняющимся условиям среды благодаря изменениям в геноме и т.д.). Известно, что физико-химические изменения молекул после действия ионизирующей радиации осуществляются в течение короткого промежутка времени, тогда как индуцируемые ими вышеописанные изменения могут быть обнаружены спустя длительное время после воздействия (дни, месяцы и, возможно, годы). Исследование молекулярных и клеточных механизмов, лежащих в основе отдаленных эффектов облучения, является одной из ключевых и наиболее актуальных задач радиационной биологии.

В формировании эффектов облучения участвуют различные сигнальные пути, в которые вовлечены целый ряд белков, в частности, поли (АДФ-рибозо) полиме-раза, р53, протеинкиназа С (РКС), р38 митоген активирующая протеинкиназа (р38МАРК), фосфолипаза 51, кластерин и др. (Matsumoto et al., 2007). Однако, до сих пор нет единого мнения о том, в ответ на какие клеточные повреждения активируются системы клеточного отклика на облучение. Среди повреждений ДНК, вызываемых ионизирующим излучением, особое внимание исследователей привлекают двунитевые разрывы (ДР) ДНК. ДР, не устраненные в ходе репарации

ДНК, приводят к цитогенетическим нарушениям и гибели клеток. Возможно, что именно ДР ДНК являются основным триггером, запускающим процессы клеточного отклика на воздействие ионизирующего излучения. Однако, исследования роли ДР ДНК в формировании отдаленных последствий облучения сравнительно немногочисленны. Неясно, за счет каких основных механизмов изменяется чувствительность потомков облученных клеток к тестирующему облучению: предотвращение образования ДР ДНК или активизация процессов репарации ДНК от них? В течение скольких поколений облученных клеток сохраняется чувствительно-сить/резистентность к индукции ДР ДНК ионизирующим излучением и как она меняется?

Исходя из вышеизложенного, представлялось весьма актуальным изучить изменения степени поврежденное™ ДНК за счет ДР и чувствительности клеток к образованию ДР ДНК при дополнительном, тестирующем облучении в различных поколениях облученных клеток млекопитающих.

Цель и задачи исследования.

Цель работы состояла в изучении изменений клеточной радиочувствительности, оцененной по образованию ДР ДНК, индуцированных тестирующим (проявляющим) облучением, в поколениях остро и хронически облученных клеток млекопитающих. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

- Исследовать изменения выхода и эффективности репарации ДНК от ДР, индуцированных тестирующим облучением в проявляющей дозе в адаптированных облучением в малой дозе и контрольных делящихся лимфоцитах в различное время после стимуляции клеток к делению.

- Оценить изменения степени поврежденности генома и радиочувствительности, оцененной по выходу ДР ДНК при тестирующем облучении, в 30-40 поколениях остро облученных клеток яичника китайского хомячка линии СНО.

- Изучить изменения выхода двунитевых разрывов ДНК, индуцированных облучением в проявляющей дозе, в клетках селезенки и крови мышей, подвергавшихся хроническому облучению, в зависимости от времени облучения и дозы.

гипотезы о том, что нестабильность генома может создавать условия для активизации селективного механизма, приводящего к формированию радиорезистентных клеточных клонов. Впервые изучено влияние хронического радиационного воздействия на фрагментацию ДНК клеток крови и селезенки мышей, подвергавшихся в течение 40, 80 и 120 суток облучению с мощностью дозы 0.36 сГр/сутки. Впервые показано, что при хроническом воздействии у-излучения на клетки млекопитающих, в зависимости от времени облучения и от накопленной дозы, реализуются различные системы защиты клеток от облучения, не связанные и связанные с изменением степени фрагментации ДНК в клеточной популяции.

Научно-практическая ценность работы. Результаты работы могут быть использованы в радиационной биологии при изучении механизмов возникновения и поддержания нестабильности генома, изменения радиочувствительности клеточных популяций в пострадиационном периоде, эффектов формирования отдаленных последствий облучения на клеточном уровне. Результаты исследований хронически облученных мышей будут весьма полезны при проведении радиоэкологического мониторинга окружающей среды, а в космической биологии и в медицине для оценки эффектов хронического облучения в малых дозах.

Апробация работы. Основные положения диссертации докладывались и обсуждались на V съезде по радиационным исследованиям (Москва, 2006), Российской научной конференции «Медико-биологические проблемы токсикологии и радиологии» (Санкт-Петербург, 2008) и 36-м ежегодном съезде Европейского общества по радиационным исследованиям (Tours, France, 2008).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ, в том числе 3 статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, использованных в работе, 3-х глав результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на_страницах машинописного текста и содержит_

таблиц и_рисунков. Список литературы включает_источников, из них_

на иностранном языке.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Лимфоциты крови человека: выделение, условия культивирования и облучения. Выделение лимфоцитов из гепаринизированной крови человека проводили путем центрифугирования в градиенте плотности фикол-верографин («Histopaque», Sigma). После выделения лимфоциты отмывали и ресуспензировали в среде для культивирования клеток RPMI-1640 (фирма «Панэко», Россия) до конечной концентрации 1-2 х 106 клеток/мл.

Стимулированные к пролиферации фитогемоагглютинином (ФГА, 7 мкг/мл) лимфоциты культивировали в течение 24 - 96 ч в термостате при 37 °С в полной культуралыюй среде RPMI 1640 содержащей 20 % сыворотки крупного рогатого скота и антибиотики (все реактивы фирмы «Панэко», Россия).

Облучение клеток проводили на установке «Алтай» (Россия, источник у-излучения 60Со) при мощности дозы 1 Гр/мин и температуре 4 'С. Для определения непосредственной поврежденности ДНК в результате образования ДР, индуцированных проявляющим облучением в дозе 10 Гр, облучали агарозные слайды с иммобилизированными в них клетками. Этот методический подход позволяет сократить время между окончанием облучения и лизисом клеток до 30-60 сек.

Культура клеток: условия культивирования и облучения. В работе использовали культуру эпителиальных клеток яичников китайского хомячка (линия СНО). Время удвоения клеточной популяции - 16-18 ч.

Для культивирования клеток применяли стандартную полную среду DMEM, содержащую 10 % фетальной сыворотки крупного рогатого скота (FBS), 1 % L-глютамина и антибиотики (пенициллин со стрептомицином). Выращивание клеток проводили в стандартном С02-инкубаторе при 37 °С в атмосфере с 5 % содержанием С02. Пересев клеток проводили каждые 2-3 суток в фазе экспоненциального роста.

Клетки подвергали воздействию у-излучения 60Со в дозах 1 Гр и 10 Гр (в зависимости от условий эксперимента) при мощности поглощенной дозы 1 Гр/мин (об-лучательная установка«Алтай», Россия).

Экспериментальные животные: облучение, отбор биоматериала. Эксперименты проводили на мышах-самцах линии CBA/lac исходной массой 14—16 г, полученных из питомника «Столбовая» РАМН (Московская обл.) В течение эксперимента мышей содержали на стандартном рационе вивария (сухой гранулированный корм и вода ad libitum). Состав рациона не менялся. Распределение животных на группы проводили путем случайной выборки.

Мыши подвергались воздействию у-излучения 137Cs круглосуточно в течение

40, 80 и 120 суток при мощности поглощенной дозы 0,36 сГр/сут. Суммарная поглощенная доза, полученная животными, составила 14,4, 28,8 и 43,2 сГр соответственно.

Животных умерщвляли путем цервикальной дислокации. Периферическую кровь отбирали в пробирки с гепарином (20 ME на 1 мл крови). Селезенку гомогенизировали в охлажденном до 4 "С фосфатно-солевым буфере (137 ммоль/л NaCl, 2.7 ммоль/л КС1, 10 ммоль/л Na2HP04, 2 ммоль/л К2НР04, рН 7.4) (1 мл буфера на 10 мг ткани лимфоидного органа). Суспензию клеток фильтровали через нейлоновую сетку. Концентрацию клеток определяли в камере Горяева с помощью микроскопа типа SK-14 фирмы "PZO" (Польша). Суспензию лимфоцитов (20 мкл) смешивали со 100 мкл 0.5 % раствора легкоплавкой агарозы (тип IV) в фосфатно-солевом буфере (рН 7,4) при температуре 37 °С и наносили на предварительно покрытые слоем 1 % нормоплавкой агарозы предметные стекла, накрывали покровными стеклами и выдерживали 5 мин при 4 "С на предварительно охлажденной металлической пластине. После солидификации агарозы удаляли покровные стекла и полученные сайды помещали в охлажденный (4 °С) боратный буфер.

Облучение иммобилизированных в агарозу клеток проводили в боратном буфере при 4 °С на у-установке 60Со «Луч» («Изотоп», Россия) в дозе 4 Гр при мощности дозы 0.35 сГр/мин. Контрольные препараты выдерживали в течение времени облучения в боратном буфере при 4°С.

Оценка фрагментированности ДНК, обусловленной образованием ДР. Фрагментированность ДНК под влиянием ДР в клетках непосредственно (через 3060 с, 4 °С) и через 1 ч после облучения (1-часовая инкубация клеток при 37 °С в полной культуральной среде RPMI 1640) определяли модифицированным методом электрофореза ДНК единичных клеток (метод ДНК-комет) при нейтральном значении рН (основные условия электрофореза: 1 В/см, 4 °С, 20 мин) (Воробьева и др. 2007). Степень фрагментированности ДНК, определяемая этим методом, оценивается после проведения электрофореза ДНК единичных клеток, иммобилизованных в агарозу, по количеству двунитевой ДНК, мигрировавшей из ядерной области, и расстоянию ее миграции из «ядра» ДНК-кометы» в «хвост».

Для окраски ДНК использовали акридиновый оранжевый («Sigma», США) (2 мкг/мл в фосфатно-солевом буфере, рН 7.4). Визуализацию ДНК-комет проводили с помощью микроскопа «Люмам Р-8» («ЛОМО», Россия) с использованием системы визуализации микрофотоизображений «Микмед-1600-Зф» («ОМО», Россия). ДНК-кометы клеток в каждой пробе подвергали анализу, используя программу CometScore v. 1.5 (TriTek Corp. http://tritekcorp.com). Программа оценивает момент хвоста ДНК-комет в усл. ед. (момент хвоста по Оливе) равный произведению

расстояния от центра «ядра» до центра плотности ДНК «хвоста» ДНК-кометы в пикселях на % ДНК в «хвосте». Вычисляли среднее арифметическое момента хвоста 100 ДНК-комет для пробы и варианты значений показателя по каждой пробе включали в сводную выборку по всем пробам для последующей статистической обработки.

Статистический анализ полученных данных. Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы 81а11в1юа 6.0. Результаты исследований представлены как среднее арифметическое ± стандартная ошибка. Для оценки различий использовали ^критерий Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Индукция двуннтевых разрывов ДНК и репарация ДНК от них в делящихся лимфоцитах крови человека, облученных в адаптирующей дозе

В настоящей главе представлены результаты исследований изменений чувствительности делящихся лимфоцитов крови человека, облученных в адаптирующей дозе, к образованию ДР ДНК тестирующим облучением в различное время после индукции адаптивного ответа. Было поставлено две основных задачи: а) изучить, приводит ли облучение делящихся лимфоцитов в адаптирующей дозе к активизации механизмов, снижающих количество индуцированных радиацией ДР ДНК или механизмов репарации ДНК от них; б) оценить, в течение какого времени после его индукции сохраняется АО. Для оценки изменений относительного количества ДР ДНК использовали метод ДНК-комет. Считается, что именно ДР ДНК отвечают за фрагментацию ДНК, определяемую методом ДНК-комет при проведении электрофореза при нейтральном рН (СаНт е1 а1., 2002). В наших предварительных исследованиях было показано, что значения момента хвоста ДНК-комет статистически достоверно (г>0.9, р<0.01) коррелируют с количеством фосфолирированного гис-тона Н2АХ (у-Н2АХ), то есть с количеством распознанных ДР ДНК.

Полагают, что АО не является универсальным клеточным ответом на облучение в малых дозах, так как его проявление зависит от индивидуальных генетических особенностей организма, возраста и может быть модифицировано воздействиями, связанными с образом жизни, профессией, окружающей средой (Пелевина и др., 2007). Поэтому, для того, чтобы избежать неопределенности, связанной с индивидуальной вариабельностью проявления АО, в наших исследованиях использовалась кровь только от тех здоровых доноров, для лимфоцитов которых было ранее, с помощью стандартных цитогенетических тестов, показано наличие досто-

верного АО. Крайне важно было также выбрать оптимальную адаптирующую дозу и стадию клеточного цикла, на которой будет проведено облучение в этой дозе. Анализ данных литературы и результатов собственных исследований показал, что хотя диапазон адаптирующих доз довольно широк (от 1 до 50 сГр), наиболее часто для индукции АО в лимфоцитах используют дозы 2-5 сГр (Пелевина и др., 2007; БшПоу е1 а1., 2007). С другой стороны, наиболее выраженный АО наблюдается, как правило, при облучении лимфоцитов через 20-24 ч после их стимуляции к делению, то есть в стадии клеточного цикла (Пелевина и др., 2007; 51оПоу е1 а1., 2007). Основываясь на этих данных, для индукции АО мы выбрали адаптирующую дозу 5 сГр с облучением клеток через 24 ч после их стимуляции к делению ФГА.

Результаты наших исследований, представленные на рис. 1, свидетельствуют о том, что облучение культивируемых лимфоцитов в дозе 5 сГр через 24 ч после добавления ФГА приводит к статистически достоверному (р<0.05) снижению выхода ДР ДНК, индуцированных тестирующим облучением в дозе 10 Гр, через 24, 48 и 72 ч после адаптирующего облучения (48, 72 и 96 ч после стимуляции клеток к делению ФГА соответственно). Через 24 ч после адаптирующего облучения в облученных в малой дозе клетках относительное количество индуцированных тестирующим облучением ДР ДНК было меньше на ~ 24 % по сравнению с контролем. Через 48 ч после адаптирующего облучения этот показатель увеличивается до ~ 35 %, а через 72 ч опять снижается до ~ 29 %.

Проведенный в параллельных экспериментах анализ распределения делящихся лимфоцитов в 1-ом - 4-ом митозах через разное время после стимуляции ФГА показал, что пики 1-х митозов наблюдаются через 48 ч, 2-х - через 72 ч, 3-х - через 96 ч (Пелевина и др., 2008). По времени вступления в цикл и скорости движения по циклу популяция лимфоцитов неоднородна, что уже отмечалось и другими авторами (\Vojcik е1 а1., 1996).

Таким образом, полученные нами данные свидетельствует о том, что АО, связанный с уменьшением чувствительности ДНК клеток к образованию ДР, при последующем тестирующем облучении сохраняется в дочерних клетках, возникающих, по крайней мере, в течение 72 ч после его индукции (время ~ трех митозов). В пользу этого свидетельствует тот факт, что выраженность АО в наших экспериментах не уменьшается с увеличением времени после его инициации вплоть до 72 ч после облучения в адаптирующей дозе (96 ч после добавления ФГА).

1-10

120

100

5 80

60 -10

г'

дай?

и контроль и 5 сГр на 24 ч и 10 Гр

н 5 сГр на 24 ч+ ЮГр

: Р

Время после добавления ФГА, ч Рис. 1. Показатель поврежденности ДНК, обусловленной ДР ее молекул (момент хвоста ДНК-комет, усл. ед.) в лимфоцитах крови человека (контрольных и подвергнутых адаптирующему воздействию у-излучения в дозе 5 сГр через 24 ч после стимуляции к делению) непосредственно после тестирующего облучения в дозе 10 Гр, проводимого в различное время от момента стимуляции клеток к делению ФГА. * - различие эффекта тестирующего облучения в дозе 10 Гр в клетках, подвергавшихся адаптирующему облучению, от наблюдавшегося в контрольных клетках достоверно, р < 0.05.

Для изучения эффективности репарации ДНК от ДР в поколениях адаптированных и контрольных клеток, лимфоциты после тестирующего облучения в дозе 10 Гр инкубировали в течение одного часа. Согласно данным литературы, полученным с помощью метода ДНК-комет, за это время в лимфоцитах происходит репарация ДНК от ДР путем негомологичного воссоединения концов ее нитей в местах ДР (\Vojewodzka е! а!., 2004). Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что развитие АО в делящихся лимфоцитах в течение 24-72 ч после облучения в адаптирующей дозе (48-96 ч после добавления ФГА) не сопровождается статистически достоверным увеличением эффективности репарации ДНК от ДР путем негомологичного воссоединения концов ее нитей по местам ДР. Возможно, что инициация АО приводит в основном к активизации более медленной, но корректной репарации ДР ДНК путем гомологичной рекомбинации. Однако, проверить эту гипотезу в этих опытах на лимфоцитах крови пока не представляется возможным, так как через 4-6 ч после облучения в дозах, индуцирующих достаточное для анализа количество ДР ДНК, начинается апоптотическая межнуклеосомная деграда-

ция ДНК, то есть процесс глубокой фрагментации ДНК, мешающий анализу репарации ДНК от ДР.

Исследований изменений чувствительности по показателям индукции ДР ДНК и эффективности репарации ДНК от них к последующему облучению лимфоцитов крови, подвергнутых радиационному воздействию в адаптирующей дозе и стимулированных к делению ФГА, до настоящего времени никем не проводились. Cramers et al. (2005), исследовавшие АО с помощью метода ДНК-комет, иммуноф-луоресцентного анализа гистона у-Н2АХ (специфичный маркер ДР ДНК) и метода принудительной конденсации хромосом в неделящихся лимфоцитах (стадия GO), применяя облучение по схеме 5(10) сГр + 2-8 Гр через 4 ч, показали, что в лимфоцитах, подвергнутых адаптирующему облучению, выход разрывов ДНК, индуцированных тестирующим облучением, достоверно ниже, чем в контроле. Причем эффективность репарации ДНК от разрывов достоверно не менялась. По всей видимости, основную роль в формировании АО по этому показателю в лимфоцитах играют процессы, предотвращающие образование радиоиндуцированных ДР ДНК (активизация систем антиоксидантной защиты, изменения конформации хроматина и т.д.), но не систем негомологичного воссоединения концов нитей ДНК по местам

ДР.

Резюмируя вышеизложенное, мы можем сделать следующее заключение. Облучение в малой дозе делящихся лимфоцитов в стадии G1 индуцирует АО, проявляющийся в снижении чувствительности клеток к образованию ДР ДНК при тестирующем облучении. Индуцированный АО сохраняется, по крайней мере, в течение 72 ч (время ~ трех митозов). В формировании АО главную роль играет активизация клеточных систем, предотвращающих образование ДР в ДНК, но не активизация ее репарации от указанных разрывов путем негомологичного воссоединения концов нитей ДНК по местам разрывов.

2. Изменения поврежденности генома и чувствительности к образованию

ДР ДНК при тестирующем облучении в поколениях облученных клеток

линии СНО

В главе представлены результаты исследования изменений поврежденности генома и чувствительности к образованию ДР ДНК при тестирующем облучении в поколениях культуры клеток яичника китайского хомяка линии СНО, облученных в дозе 1 Гр. Задача этих исследований состояла в том, чтобы выяснить закономерности изменений вышеупомянутых показателей в отдаленных потомках облученных клеток. Для оценки степени поврежденности генома, обусловленной ДР ДНК,

использовали метод ДНК-комет при нейтральном рН.

Усредненные результаты исследования степени фрагментации ДНК клеток линии СНО в различное время после облучения в условиях нейтрального рН, позволяющих оценивать наблюдаемые изменения как результат возникновения ДР ДНК, представлены на рис.2. Как и ожидалось, непосредственно после облучения клеток в дозе 1 Гр отмечается увеличение фрагментированности ДНК, вызванной ДР ДНК, в 1.5-2.0 раза. Известно, что клетки линии СНО характеризуются периодом удвоения клеточной популяции 16-18 ч, поэтому уже через 2-е суток после облучения мы исследуем потомков облученных ранее клеток (ориентировочно второго поколения) и т.д. Результаты наших экспериментов показали, что через 4 суток (5-6 поколение) после облучения степень фрагментации ДНК потомков облученных клеток не отличалась от соответствующих контрольных значений (рис. 2).

И контроль

0(0) 4(5-6) 7(9-10) 11(14-16) 18(24-27) 23(30-34) 28(37-42) Время после облучения, сутки (Число клеточных поколений после облучения)

Рис. 2. Изменения степени фрагментации ДНК, обусловленной образованием в ней ДР, наблюдавшиеся в клетках линии СНО в различное время после облучения в дозе 1 Гр. * - отличие от контроля достоверно, р <0.05; ** - отличие от контроля достоверно, р <0.01.

Однако, начиная с 7-х суток после облучения (9-10 поколение), регистрировалось статистически достоверное увеличение степени фрагментации ДНК de novo, что, по всей видимости, является проявлением радиационно-индуцированной нестабильности генома. Понятие «радиационно-индуцированная нестабильность генома» определяется как увеличение в потомстве облученных клеток частоты обра-

зующихся de novo генетических нарушений (мутации, хромосомные аберрации, дестабилизация хромосом, онкотрансформация и апоптоз) спонтанно, в отсутствие дополнительных радиационных воздействий (Seoane et al., 2007; Morgan et al., 2007). Основной особенностью генетической нестабильности такого рода является ее проявление на протяжении многих клеточных поколений после воздействия ионизирующего излучения без образования клеточных клонов с указанными выше нарушениями в геноме. В наших экспериментах повышение степени фрагментации ДНК регистрировалось вплоть до 21-х суток после облучения, с максимумом на 11 и 18-е сутки (рис. 2). Обращает на себя внимание тот факт, что на 23-и и 28-е сутки после облучения степень фрагментации ДНК потомков облученных клеток снижалась и не отличалась от контроля (рис. 2).

По всей видимости, увеличение степени фрагментации ДНК, регистрируемое с помощью метода ДНК-комет, в этих опытах обусловлено преимущественно вкладом апоптотических клеток с высоко фрагментированной ДНК. Однако, не стоит забывать и о том факте, что в потомках облученных клеток при нестабильности генома наблюдается повышенный уровень активных форм кислорода (Kim et al., 2006), которые также вызывают различные повреждения ДНК, в том числе и дву-нитевые разрывы.

Наиболее интересные результаты были получены при исследовании изменений радиоповреждаемости ДНК потомков облученных клеток (рис. 3). Было показано, что на 7, 11, и 18-е сутки после облучения отмечается статистически достоверное увеличение чувствительности ДНК клеток к дополнительному (тестирующему) облучению в дозе 10 Гр, что, по всей видимости, обусловлено тем, что облучение накладывалось на эндогенную гиперпродукцию свободных радикалов и, возможно, на ситуацию истощения системы антиоксидантной защиты клеток от повреждений. Но на 23-е и 28-е сутки экспериментов наблюдался обратный эффект: устойчивость к дополнительному облучению возрастала.

В целом же, описанные здесь результаты исследования показали, что облучение клеток линии СНО в дозе 1 Гр проявляется в потомстве следующими эффектами: на 7-21-е сутки (9-31-е поколения) - увеличением поврежденности генома и чувствительности клеток к дополнительному облучению; на 23-28-е сутки (30-42 поколения) - возвращением поврежденности генома к контрольным значениям; причем, в этих поколениях потомки облученных клеток становятся более устойчивыми к дополнительному облучению.

На основании анализа результатов исследования степени фрагментации ДНК, наблюдавшейся в клетках линии СНО в различное время после облучения в дозе 1 Гр и обусловленной образованием в ней ДР, можно высказать два предположения

о причинах снижения ее выраженности в 30-34-м и 37-42-м пострадиационных поколениях клеток. Это может быть переход нестабильности генома в скрытое (латентное) состояние, либо это - завершение селекционного процесса элиминации клеток с нестабильным геномом, чувствительных к оксидативному стрессу.

Результаты изучения изменений чувствительности потомства облученных клеток к тестирующему облучения по тому же критерию указывают на вероятную реальность второго предположения.

0(0) 4(5-6) 7(9-10) 11(14-16) 18(24-27) 23(30-34) 28(37-42) Время после облучения, сутки (Число клеточных поколений после облучения)

Рис. 3. Изменения повреждаемости ДНК клеток линии СНО при повторном (тестирующем) облучении в дозе 10 Гр в различное время после облучения в дозе 1 Гр. Данные представлены как разница значений (инкремент) момента хвоста ДНК-комет после дополнительного облучения в дозе 10 Гр и значений момента хвоста ДНК-комет без дополнительного облучения. * - различия по отношению к контролю достоверны, р <0.05.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют в пользу гипотезы о том, что нестабильность генома может создавать условия для функционирования селективного механизма, обеспечивающего формирование радиорезистентных клеточных клонов путем элиминации клеток с нестабильным геномом, чувствительных к оксидативному стрессу.

3. Изменения радиочувствительности ДНК лейкоцитов крови и клеток селезенки мышей в течение хронического облучения

Задача этого раздела наших исследований состояла в том, чтобы выяснить закономерности изменени чувствительности ДНК к образованию ДР, индуцированных тестирующим облучением, в клеточных популяциях, подвергаемых длительному (в течение нескольких месяцев) постоянному низкоинтенсивному воздействию ионизирующего излучения in vivo. Для ее решения были поставлены опыты на мышах линии СВА/lac. Изменения поврежденности ДНК и ее чувствительности к индукции ДР тестирующим облучением в клетках системы крови хронически облучаемых и контрольных животных оценивали с помощью метода ДНК-комет при нейтральном рН.

Результаты исследования изменений поврежденности ДНК, обусловленной образованием ДР ДНК (фрагментации ДНК) в клетках системы крови мышей, подвергающихся хроническому облучению, показали, что на 40-е сутки от его начала (доза 14,4 сГр) происходит некоторое ее увеличение в лейкоцитах крови (рис. 4) и в клетках селезенки (рис. 5) по сравнению с контролем. Однако, уже к 80-м суткам облучения (28,8 сГр) отмечается статистически достоверное (р<0.01) уменьшение поврежденности ДНК, обусловленной образованием ДР, как в лейкоцитах, так и в клетках селезенки (рис. 4 и рис. 5, соответственно). К 120-м суткам облучения (43,2 сГр) выраженность поврежденности ДНК исследуемого рода в названных выше клетках мышей остается практически такой же, что и на 80-е сутки.

Исследования изменений уровня поврежденности ДНК, обусловленной образованием ДР у мышей при хроническом облучении, ранее никем не проводились. Однако, в опытах на мышах линии С57В1/6, подвергавшихся воздействию низкоинтенсивного у-излучения, показано, что у животных отмечается достоверное уменьшение количества однонитевых разрывов ДНК в клетках селезенки, регистрируемое методом контролируемой щелочной денатурации ДНК (Осипов и др., 2000). Одновременно в тех же клетках у тех же животных отмечалось увеличение количества ДНК-белковых сшивок. Предполагалось, что увеличение количества прочных связей ДНК-белок препятствует щелочной денатурации ДНК и тем самым уменьшает регистрируемое количество однонитевых разрывов ДНК (Осипов и др., 2000). Однако, природа увеличения количества прочных связей ДНК-белок при воздействии ионизирующих излучений в малых дозах до сих пор не ясна. Не исключено, что увеличение количества прочных связей ДНК-белок одновременно с уменьшением количества разрывов ДНК является отражением компактизации хроматина

исследуемых клеток. Известно, что степень компактизации хроматина является одним из основных факторов, определяющих клеточную радиочувствительность (Кооэ й а1., 2002). Белки хроматина лимитируют доступ свободных радикалов к ДНК, уменьшая тем самым количество индуцируемых свободными радикалами повреждений ДНК. В работе Алипова и др. (2004) было показано, что радиорезистентные потомки облученных фибробластов джунгарского хомячка линии ОН-ТК характеризуются более компактной структурой хроматина по сравнению с материнскими клетками.

И контроль

ыхроническое облучение

25 Т 1

20 ' X : т 1

15 ■ • • ьт I , !

10 ■ I ■1 1

5 0 Штат ш 1

40 суток (0,144 Гр)

80 суток (0,288 Гр)

120 суток (0,432 Гр)

Рис. 4. Изменения степени фрагментации ДНК лейкоцитов крови мышей в разные сроки от начала хронического облучения с мощностью дозы 0,36 сГр/сут. ** - различия по отношению к контролю достоверны, р <0.01.

Uконтроль

Ы хроническое облучение

С 20

<а

|- 15 г

о 10

40 суток (0,144 Гр)

80 суток (0,288 Гр) 120 суток (0,432 Гр)

Рис.5. Изменения степени фрагментации ДНК клеток селезенки мышей в разные сроки от начала хронического облучения с мощностью дозы 0,36 сГр/сут. Различия по отношению к контролю достоверны: * - р <0.05, ** - р <0.01.

В качестве альтернативной гипотезы можно предположить, что хроническое облучение приводит к изменению качественного соотношения клеток в исследуемых клеточных системах в сторону увеличения доли клеток с меньшим количеством ДР ДНК. Возможно, что именно изменения структуры клеточной популяции являются основой изменения радиочувствительности тканей и органов.

Результаты исследования изменений выхода индуцированных острым облучением в дозе 4 Гр in vitro ДР ДНК (инкремент момента хвоста, усл. ед.) в лейкоцитах крови (рис. 6) и клетках селезенки (рис. 7) контрольных мышей и мышей, подвергавшихся хроническому облучению, показали, что у хронически облученных мышей наблюдается статистически достоверное снижение радиоповреждаемости ДНК клеток системы крови. Поскольку мы исследовали этот процесс по показателю, отражающему количество ДР ДНК в условиях ингибирования систем их репарации (боратный буфер и 4 °С), то снижение значений этого показателя при облучении in vitro, по всей видимости, обусловлено механизмами, предотвращающими образование ДР ДНК. Причем, если на 40-е сутки (доза облучения 14,4 сГр) клеточная защита не обеспечивает снижение количества ДР ДНК в клетках системы крови хронически облучаемых мышей, то начиная с 80-х суток (28,8 сГр) увеличению клеточной резистентности к острому облучению сопутствует снижение уровня ДР ДНК в этих клетках.

| 15 о

н 10

40 суток (0,144 Гр)

■ ,>

'ii'ift'i

80 суток (0,288 Гр)

в контроль

и хроническое облучение

120 суток (0,432 Гр)

Рис. 6. Изменения инкремента хвоста ДНК-комет (усл. ед.), отражающего выход индуцированных острым облучением в дозе 4 Гр in vitro двунитсвых разрывов ДНК в лейкоцитах крови контрольных мышей и мышей, подвергавшихся хроническому облучению в дозе 0,36 сГр/сут. * - отличие от контроля достоверно, р <0.05.

Ы контроль

J 20 Ыхроническое облучение

о >

га 25

40 суток (0,144 Гр) 80 суток (0,288 Гр) 120 суток (0,432 Гр)

Рис. 7. Изменения инкремента хвоста ДНК-комет (усл. ед.), отражающего выход индуцированных острым облучением в дозе 4 Гр in vitro двунитевых разрывов ДНК в клетках селезенки контрольных мышей и мышей, подвергавшихся хроническому облучению в дозе 0,36 сГр/сут. * - отличие от контроля достоверно, р <0.05.

Таким образом, результаты изучения радиочувствительности ДНК клеток системы крови мышей свидетельствуют о том, что при хроническом низкоинтенсивном воздействии у-излучения в зависимости от длительности облучения и от накопленной дозы реализуются разные механизмы благоприобретенной радиорезистентности (адаптивного ответа). Можно предположить, что в начальный период хронического облучения, когда дозы относительно невелики, в клетках активируется первой система детоксикации свободных радикалов (система антиоксидантной защиты). С накоплением дозы и усилением воздействия включаются новые защитные механизмы. При помощи механизмов апоптоза обеспечивается элиминация неспособных к восстановлению от повреждений радиочувствительных клеток, в результате чего, оставшаяся часть клеток становится относительно резистентной к воздействию излучения в повреждающей острой дозе.

ВЫВОДЫ

1. Облучение культивируемых лимфоцитов в дозе 5 сГр через 24 ч после стимуляции их к делению ФГА приводит к статистически достоверному понижению поврежденное™ ДНК, регистрируемой методом ДНК-комет и отражающей образование ДР в ее структуре при последующем облучении в дозе 10 Гр через 24, 48 и 72 ч после облучения в указанной выше малой дозе.

2. Адаптивный ответ, выраженный в уменьшении чувствительности клеток к образованию ДР ДНК тестирующим облучением, сохраняется, по крайней мере, в течение 72 ч (время ~ трех митозов) после его индукции.

3. Основную роль в формировании адаптивного ответа в лимфоцитах крови по показателю поврежденности двунитевой структуры ДНК играют процессы, предотвращающие образование радиационно-индуцированных ДР ДНК (активизация систем антиоксидантной защиты, изменение конформации хроматина), но не активизация процессов их быстрой (в течение 1 ч) репарации.

4. Облучение клеток линии СНО в дозе 1 Гр индуцирует у потомков облученных клеток нестабильность генома, проявляющуюся в увеличении на 7-21-е сутки поврежденности генома и чувствительности ДНК к дополнительному облучению.

5. Увеличение радиорезистентности потомков клеток СНО на 23-28-е сутки после облучения в дозе I Гр свидетельствует о том, что нестабильность генома создает условия для активации селективного механизма, приводящего к формированию радиорезистентных клеточных популяций.

6. Хроническое облучение мышей (мощность дозы 0,36 сГр/сут) ведет к сни-

жению степени фрагментации ДНК (лейкоцитов крови и клеток селезенки) на 80-е и 120-е сутки от начала облучения.

7. Благоприобретенная клеточная резистентность (адаптивный ответ) клеток системы крови хронически облучаемых мышей к тестирующему облучению по показателю поврсжденности ДНК, обусловленной ДР, в ранние (40-е сутки, доза 14,4 сГр) и более поздние (80-е и 120-е сутки, дозы 28,8 и 43,2 сГр соответственно) сроки облучения реализуется с помощью разных механизмов, не связанных и связанных со снижением степени фрагментации ДНК в клеточных популяциях.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Е.Ю. Лизунова. Н.Ю. Воробьева, А.Н. Осипов Влияние хронического воздействия у-излучения и 90Sr в малых дозах на уровень разрывов ДНК и чувствительность клеток селезенки мышей к перекиси водорода. // Известия РАН. Серия биологическая. -2008. -Т.35. - № 4. С. 409-413.

2. А.Н. Осипов, Е.Ю. Лизунова. Н.Ю. Воробьева, И.И. Пелевина Индукция и репарация двунитевых разрывов ДНК в лимфоцитах крови человека, облученных в адаптирующей дозе. // Радиац. биология. Радиоэкология. 2009. Т. 49. № 1. С. 42-45.

3. Пелевина И.И., Алещенко A.B., Антощина М.М., Боева О.В., Готлиб В.Я., Куд-ряшова О.В., Лизунова Е.Ю.. Осипов А.Н., Рябченко Н.И., Семенова Л.П., Серебряный A.M. Адаптивный ответ в разных митотических циклах после облучения. // Цитология. 2009. Т. 51. № 1. С. 78-83.

4. Воробьева Н.Ю., Лизунова Е.Ю.. Осипов А.Н., Сыпин В.Д. Изменения радиоповреждаемости ДНК лейкоцитов периферической крови мышей, подвергавшихся длительному воздействию низкоинтенсивного гамма-излучения. // V съезд по радиационным исследованиям (10-14 апреля 2006, Москва): Тез. докл. - Изд. «Фотон-век», Пущино. - 2006. - Т. I. - С. 22.

5. Д.В. Гурьев, А.Н. Осипов, Е.Ю. Лизунова. Н.Ю. Воробьева, О.В. Боева Отдаленные молекулярно-клеточные эффекты в поколениях облученных клеток линии СНО. И Вестник Российской военно-медицинской академии. 2008 №3 (23). Приложение 1. С. 124.

6. N. Vorobyeva, Е. Lizunova, D. Guryev and A. Osipov Molecular and Cellular Late Radiation Effects in Generations of CHO Line Cells // Radioprotection. -2008. - V. 43 (5).-P. 114.

Бумага для множительных аппаратов. Печать офсетная. Формат 60x84/16. Тираж 100 экз. Заказ 7567

Типография ООО "ФЭД+", Москва, ул. Кедрова, д. 15, тел. 774-26-96

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Лизунова, Екатерина Юрьевна

Введение.

1. Обзор литературы.

1.1. Факторы, определяющие чувствительность клеток к воздействию ионизирующего излучения.

1.2. Изменения клеточной радиочувствительности после облучения в малых дозах.

2.Материалы и методы.

Лимфоциты крови: выделение, условия культивирования и облучения.

Культура клеток: условия культивирования и облучения.

Экспериментальные животные: облучение, отбор биоматериала.

Метод электрофореза ДНК единичных клеток.

Анализ доли клеток с высоким содержанием фосфорилированного гистона

Н2АХ.

Оценка доли погибших клеток.

Статистический анализ полученных данных.

3. Результаты исследований и их обсуждение.

3.1.Индукция двунитевых разрывов ДНК и репарация ДНК от них в делящихся лимфоцитах крови человека, облученных в адаптирующей дозе.

3.2.Изменения поврежденности генома и чувствительности к образованию ДР ДНК при тестирующем облучении в поколениях облученных клеток линии СНО.

3.3.Изменения радиочувствительности ДНК лейкоцитов крови и клеток селезенки мышей в течение хронического облучения.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изменения радиочувствительности в поколениях облученных клеток млекопитающих"

Актуальность проблемы. Открытие таких эффектов воздействия ионизирующего излучения как снижение чувствительности к последующему облучению (адаптивный ответ) или повышение радиочувствительности (гиперчувствительность к облучению) заставило пересмотреть патофизиологические механизмы формирования отдалённых эффектов радиационного воздействия (Mothersill, Seymour, 2000; Пелевина и др., 2003). Предполагается, что облучение изменяет состояние клеточных защитных механизмов: систем аптиоксидантной защиты, репарации ДНК, регуляции клеточного цикла и апоптоза (Пелевина и др., 2000; Серебряный и др., 2004). Многие исследователи считают, что механизмы изменения клеточной радиочувствительности тесно взаимосвязаны с механизмами индукции и реализации другого эффекта облучения - радиационно-индуцированной нестабильности генома (Пелевина и др., 2003; Okada et al., 2007; Seoane et al., 2007). Этот радиобиологический феномен проявляется в том, что часть клеток, выживших после облучения, может давать функционально измененное потомство, в котором с высокой частотой па протяжении многих поколений возникают de novo аберрации хромосом и генные мутации, в ряде случаев приводящие к повышенной клеточной смертности путем апоптоза (Мазурик и Михайлов 2001, 2004). Как и всякое биологическое явление, нестабильность генома может иметь как негативное (амплификация генов, мутации, дестабилизация хромосом, неопластическая трансформация и др.), так и позитивное значение для биологической системы (формирование гипервариабельных участков парагопа антител, появление альтернативных путей адаптации к меняющимся условиям среды благодаря изменениям в геноме и т.д.). Известно, что физико-химические изменения молекул после действия ионизирующей радиации осуществляются в течение короткого промежутка времени, тогда как индуцируемые ими вышеописанные изменения могут быть обнаружены спустя длительное время после воздействия (дни, месяцы и, возможно, годы). Исследование молекулярных и клеточных механизмов, лежащих в основе отдаленных эффектов облучения, является одной из ключевых и наиболее актуальных задач радиационной биологии.

В формировании эффектов облучения участвуют различные сигнальные' пути, в которые вовлечены целый ряд белков, в частности, поли (АДФ-рибозо) полимераза, р53, протеипкиназа С (РКС), р38 митоген-активируемая протеинкиназа (р38МАРК), фосфолипаза 81, кластерин и др. (Matsumoto et al., 2007). Однако, до сих пор нет единого мнения о том, в ответ па какие клеточные повреждения активируются системы клеточного отклика па облучение. Среди повреждений ДНК, вызываемых ионизирующим излучением, особое внимание исследователей привлекают двунитевые разрывы (ДР) ДНК. ДР, не устраненные в ходе репарации, приводят к цитогенетическим нарушениям и гибели клеток. Возможно, что именно ДР ДНК являются основным триггером, запускающим процессы клеточного отклика на воздействие ионизирующего излучения. Однако, исследования роли ДР ДНК в формировании отдаленных последствий облучения сравнительно немногочисленны. Неясно, за счет каких основных механизмов изменяется чувствительность потомков облученных клеток к тестирующему облучению: предотвращения образования ДР ДНК или активизации процессов репарации ДНК от них? В течение скольких поколений облученных клеток сохраняется чувствительность/резистентность к индукции ДР ДНК ионизирующим излучением и как она меняется?

Исходя из вышеизложенного, представлялось весьма актуальным изучить изменения степени поврежденности ДНК за счет ДР и чувствительности клеток к образованию ДР ДНК при дополнительном, тестирующем облучении в различных поколениях облученных клеток млекопитающих.

В работе использовали лимфоциты крови человека, эпителиальные клетки яичника китайского хомячка линии СНО, а также лейкоциты крови и клетки селезенки мышей линии СВА/lac. Выбор столь разных экспериментальных обьектов обусловлен их уникальными возможностями. В отличие от лимфоцитов грызунов, свсжевыделенные лимфоциты периферической крови человека легко стимулируются к делению фитогемоагглютинином. Высокая чувствительность к облучению, известный кариотип и возможность их культивирования in vitro в течение 5-6 суток (без усложнения методики) сделали лимфоциты крови человека одним из наиболее распространенных объектов для изучения механизмов адаптивного ответа (АО) (Пелевина и др., 2000, 2003, 2007, 2009). Недостатком этого объекта является относительно короткий срок культивирования и довольно высокая вариабельность показателей в зависимости от конкретного донора. Для оценки эффектов облучения в отдаленных потомках облученных клеток нами была использована культура клеток яичника китайского хомячка линии СНО. Ранее именно на этой культуре клеток была показана индукция нестабильности генома в потомках облученных клеток (Антощина и др. 2005). Для изучения биологических эффектов хронического облучения клеток млекопитающих in vivo нами были выбраны линейные мыши CBA/lac, характеризующиеся высокой чувствительностью к хроническому облучению и низким уровнем спонтанных хромосомных нарушений (Blandova, 1983). Использование общего методического подхода для оценки изменений радиочувствительности ДНК делает возможным включение экспериментальных результатов, полученных на вышеупомянутых биообъектах, в диссертационную работу.

Цель и задачи исследования Цель работы состояла в изучении изменений клеточной радиочувствительности, оцененной по образованию ДР Д11К, индуцированных тестирующим (проявляющим) облучением, в поколениях остро и хронически облученных клеток млекопитающих. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

Оценить изменения степени поврежденности генома и радиочувствительности, оцененной по выходу ДР ДНК при тестирующем облучении, в 30-40 поколениях остро облученных клеток эпителия яичника китайского хомячка линии СНО.

- Изучить изменения выхода ДР ДНК, индуцированных облучением в проявляющей дозе, в клетках селезенки и крови мышей, подвергавшихся хроническому облучению, в зависимости от времени облучения и дозы.

Положения, выносимые на защиту:

1. Адаптивный ответ, вызванный в стимулированных к делению лимфоцитах крови облучением в малой дозе (5 сГр), сохраняется в их кратковременной культуре, по крайней мере, в течение 72 ч (~ 3 митоза) после его индукции, переходя от материнских клеток в поколения дочерних

2. Поврежденность ДНК, обусловленная двунитевыми разрывами ее молекул в клетках СНО в результате облучения в сублетальной дозе, проявляется в потомстве этих клеток длительное время, на протяжении многих поколений, такими же разрывами, свидетельствуя о возникновении и поддержании, по крайней мере, в части их, радиационно-индуцированной нестабильности генома и создавая условия для селекции из них клеток-родоначальников радиорезистентных клонов

3. При хроническом воздействии у-излучения на клетки млекопитающих в зависимости от времени облучения и ог накопленной дозы реализуются различные системы защиты клеток от облучения, не связанные и связанные со снижением степени фрагментации ДНК в клеточных популяциях.

Научная новизна. Впервые с помощью метода ДНК-комет были проведены исследования изменений чувствительности адаптированных облучением в малой дозе лимфоцитов периферической крови человека к индукции ДР ДНК облучением в тестирующей дозе, а также эффективности их репарации в течение 72 ч (время ~ трех митозов) после индукции АО. Впервые исследованы изменения степени поврежденности генома и чувствительности к дополнительному облучению в 37-42-х поколениях, облученных в дозе 1 Гр. эпителиальных клеток яичника китайского хомячка линии СНО. Получены новые результаты, свидетельствующие в пользу гипотезы о том, что нестабильность генома может создавать условия для активизации селективного механизма, приводящего к формированию радиорезистентных клеточных клонов. Впервые изучено влияние хронического радиационного воздействия на фрагментацию ДНК клеток крови и селезенки мышей, подвергавшихся в течение 40, 80 и 120 суток облучению с мощностью дозы 0.36 сГр/сутки. Впервые показано, что при хроническом "воздействии у-излучения на клетки млекопитающих, в зависимости от времени облучения и от накопленной дозы, реализуются различные системы защиты клеток от облучения, не связанные и связанные с изменением степени фрагментации-ДНК в клеточной популяции.

Личный вклад диссертанта. Представленная работа является частью исследований, проведенных лабораторией радиационной биофизики и экологии ИХФ РАН. Автор самостоятельно осуществляла постановку и проведение исследований, первичную обработку и анализ полученных данных, формулировала положения и выводы работы.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Радиобиология", Лизунова, Екатерина Юрьевна

выводы

1. Облучение культивируемых лимфоцитов в дозе 5 сГр через 24 ч после стимуляции их к делению ФГА приводит к статистически достоверному понижению поврежденности ДНК, регистрируемой методом ДНК-комет и отражающей образование ДР в ее структуре, при последующем облучении в дозе 10 Гр через 24, 48 и 72 ч после облучения в указанной выше малой дозе.

2. АО, выраженный в уменьшении чувствительности клеток к образованию ДР ДНК тестирующим облучением, сохраняется, по крайней мере, в течение 72 ч (время ~ трех митозов) после его индукции.

3. Основную роль в формировании АО в лимфоцитах крови по показателю поврежденности двунитевой структуры ДНК играют процессы, предотвращающие образование радиационно-индуцированных ДР ДНК (активизация систем антиоксидантной защиты, изменение конформации хроматина), но не активизация процессов их быстрой (в течение 1 ч) репарации.

5. Увеличение радиорезистентности потомков клеток СНО на 23-28-е сутки после облучения в дозе 1 Гр свидетельствует о том, что нестабильность генома создает условия для активации селективного механизма, приводящего к формированию радиорезистентных клеточных популяций.

6. Хроническое облучение мышей (мощность дозы 0,36 сГр/сут) ведет к снижению степени фрагментации ДНК (лейкоцитов крови и клеток селезенки) на 80-е и 120-е сутки от начала облучения.

7. Благоприобретенная клеточная резистентность (АО) клеток системы крови хронически облучаемых мышей к тестирующему облучению по показателю поврежденности ДНК, обусловленной ДР, в ранние (40-е сутки, доза 14,4 сГр) и более поздние (80-е и 120-е сутки, дозы 28,8 и 43,2 сГр соответственно) сроки облучения реализуется с помощью разных механизмов, не связанных и связанных со снижением степени фрагментации ДНК в клеточных популяциях.

заключение

Результаты проведенных исследований свидетельствуют о тесной связи изменений радиочувствительности ДНК в потомках облученных клеток с такими важными радиобиологическими феноменами как АО и нестабильность генома.

Было продемонстрировано, что индуцированное облучением в адаптирующей дозе снижение чувствительности ДНК лимфоцитов крови человека к повреждающему действию ионизирующей радиации сохраняется, по крайней мере, в течение ~ 3 клеточных генераций после индукции. Полученные данные свидетельствуют в пользу гипотезы о том, что ведущую роль в формировании АО играет активизация защитных антиоксидантных механизмов клеток, предотвращающих образование ДР ДНК, вызываемых образующимися при радиолизе воды свободными радикалами, но не элиминация чувствительных к облучению клеток и активизация системы • быстрой репарации путем негомологичного воссоединения нитей ДНК по местам ДР.

Проявление нестабильности генома в потомках облученных клеток сопровождается повышением чувствительности ДНК клеток к провоцирующему облучению. Возможно, что это связано с тем, что облучение происходит на фоне характерной для нестабильности генома повышенной генерации свободных радикалов митохондриями. Наличие максимума проявлений нестабильности генома, наблюдаемого на протяжении 14-27 клеточных генерации после облучения, подтверждает тот факт, что радиационно-ппдуцированная нестабильность генома не наследуется и не приводит к образованию генетически нестабильных клеточных клонов. Более того, полученные в работе данные позволяют предположить, что гиперпродукция активных форм кислорода и азота, сопровождающая явление нестабильности генома приводит к элиминации клеток чувствительных к оксидативному стрессу, то есть фактически служит механизмом клеточной селекции. В результате клеточная популяция становится более устойчивой к воздействию различных прооксидантов и физических факторов, вызывающих оксидативный стресс.

Результаты изучения изменений радиочувствительности ДНК клеток системы крови мышей в течение хронического низкоинтенсивного воздействии у-излучения показали, что в ранний период облучения, когда суммарная накопленная доза относительно невелика, активируются сначала базовые защитные механизмы клеток (предположительно системы антиоксидантной защиты), а при увеличении продолжительности воздействия и накопленной дозы включаются системы защиты клеточных популяций (элиминация поврежденных и чувствительных к облучению клеток).

В целом проведенные исследования свидетельствуют о том, что механизмы изменений радиочувствительности ДНК в поколениях остро и хронически облученных клеток млекопитающих реализуются в зависимости от дозы облучения, времени после облучения или продолжительности воздействия и направлены на обеспечение устойчивости клеточных популяций к радиационному воздействию.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Лизунова, Екатерина Юрьевна, Москва

1. Алипов Е.Д., Тырсина Е.Г., Саримов P.M. и др. // Радиац. биология. Радиоэкология. 2004. Т. 44. № 2. С. 188-197.

2. Баутин Н.И., Леонтович Е.А. Методы и приемы качественного исследования динамических систем на плоскости. М.: Наука, 1990.488 с.

3. Велегжанинов И.О., Москалев А.А., Осипов А.Н. Феномен уменьшения уровня однонитевых разрывов ДНК клеток системы крови в первом поколении хронически облучаемых мышей. // Радиационная биология. Радиоэкология. 2007. - Т. 47. - № 5. - С. 567-570.

4. Гераськин С.А., Зяблицкая Е.Я., Удалова А.А. Статистический анализ мутагенной эффективности хронического облучения в малых дозах на фоне техногенного загрязнения среды // Генетика. 1993. Т. 29. №11. С. 1901-1913.

5. Зайнулин В.Г., Шапочников М.В., Москалев А.А., Таскасв А.И. Современные аспекты радиобиологии Drosophila Melanogaster. Екатеринбург, 2001. 101 с.

6. Засухина Г.Д. Радиоадаптивный ответ в клетках человека, различающихся по репарации ДНК // Радиационная биология. Радиоэкология. . 1999. Т.39. №1. С.58-63.

7. Ю.Куликов Н.В., Алыпиц Л.К., Позолотин А.А. и Ташевская С.В. 1971. Изменения радиочувствительности растений как результат предварительного облучения. Радиобиология. 11 (4): 630-632.

8. Лыоин Б. Гены. М.: Мир, 1987. 544 с.

9. Мазурик В.К., Михайлов В.Ф. Радиационно-индуцируемая нестабильность генома: феномен, молекулярные механизмы, патогенетическое значение // Радиац. биология. Радиоэкология. 2001. Т. 41. № 3. С.272-289.

10. Мазурик В.К., Михайлов В.Ф. В книге: «Радиационная биофизика (ионизирующие излучения), Кудряшов Ю.Б. М.:Физматлит, 2004. 450 с.

11. Пелевина И.И., Акифьев Г.Г. Алещенко А.В. и др., Радиационно-индуцированный адаптивный ответ у детей и эффект внешних и внутренних факторов. // Радиац. Биология. Радиоэкол., 1999. Т. 39. Вып. 1. С. 106-112.

12. Пелевина И. И. Алещенко А. В., Антощина М. М., Готлиб В. Я., Кудряшова О. В., Семенова Л. П., Серебряный А. М. Реакция популяции клеток на облучение в малых дозах // Радиационная биология. Радиоэкология. 2003. Т. 43. N 2. С. 161-166

13. Рябченко Н.И., Антощина М.М., Насонова В.А., Фесенко Э.В., Готлиб В.Я. 2004. Аберрации хромосом в лимфоцитах человека при различной продолжительности культивирования после облучения. Радиац. биология. Радиоэкология. 44 (2): 146—150.

14. Серебряный A.M., Алещенко А.В., Готлиб В.Я., Кудряшова О.В., Семенова Л.П., Пелевина И.И. Клеточный состав популяции лимфоцитов и радиационный адаптивный ответ. // Цитология. 2003. Т. 45. №1. С. 81-85.

15. А.М. Серебряный, А.В. Алещенко, В.Я. Готлиб, О.В. Кудряшова, Л.П. Семенова, И.И. Пелевина «О новом механизме формирования адаптивного ответа». Радиац. биология. Радиоэкология. 2004. Т. 44. №6.С.653-656.

16. Серебряный A.M., Зоз H.II.,. Морозова И.С. К механизму антимутагенеза у растений. Генетика. 2005. Т. 41, №5, с. 676-679.

17. Серебряный A.M., Антощина М.М., Алещенко А.В., Рябченко Н.И., Пелевина И.И. 2008. О механизме адаптивного ответа. Оценка способности лимфоцитов крови человека к радиационному адаптивному ответу с помощью разных критериев. Цитология. 50 (5): 461-65.

18. Спитковский Д.М., Ермаков А.В., Горин А.И. и др. Зависимость репарации ДНК, индуцированной генетически опасными воздействиями, от ионной силы среды, в которой находятся клетки // Цитология, 1992. Т. 37, №7. - С.76-85

19. Талызина Т.А. Особенности изменений ядер лимфоцитов человека под действием ионизирующего излучения в малых дозах: Автореф. Дис. Канд. Биол. Наук. Киев, 1991. 24 с.

20. Талызина Т.А., Спитковский Д.М., Структурные изменения ядер лимфоцитов человека при действии ионизирующих излучений в диапазоне доз, вызывающих адаптивный ответ // Радиобиология. 1991. Т. 31, вып. 4. С. 606-611.

21. Филиппович И.В. Феномен адаптивного ответа клеток в радиобиологии // Радиобиология 1991. Т. 31, вып. 6. С. 803-813.

22. Ahmcd K.M., Li J.J. 2008. NF-kappa B-mediated adaptive resistance to ionizing radiation. Free Radic. Biol. Med. 44: 1—13.

23. Azzam, E. I., de Toledo, S. M., Gooding, T. and Little, J. В. Intercellular communication is involved in the bystander regulation of gene expression in human cells exposed to very low fluences of alpha particles. // Radiat Res, 1998. 150:5,497-504.

24. Barquinero J.F., Barrios L., Caballin M.R., Miro R., Ribas M., Subias A. and Egozcue J. Occupational exposure to radiation induces an adaptive response in human lymphocytes // Int. J. Radiat. Biol. 1995. 67:187-191

25. Belyakov OV, Folkard M, Mothersill C, Prise KM, Michael BD. Bystander-induced apoptosis and premature differentiation in primary urothelial explants after charged particle microbeam irradiation//Radiat Prot Dosimetry. 2002;99(l-4):249-51.

26. Biedermann KA, Sun JR, Giaccia AJ, Tosto LM, Brown JM. Scid mutation in mice confers hypersensitivity to ionizing radiation and adeficiency in DNA double-strand break repair//Proc Natl Acad Sci USA. 1991; 15;88(4): 1394-7.

27. Billen D. Spontaneous DNA Damage and Its Significance for the "Negligible Dose" Controversy in Radiation Protection // Radiat. Res. 1990. V. 124. P. 242-245.

28. Blandova ZK. Congeneic-resistant mice strains from the Soviet collection stock // Vestn Akad Med Nauk SSSR. 1983;(9):10-4. Russian.

29. Bohr VA. Preferential DNA repair in active genes // Dan Med Bull. 1987;34(6):309-20. Review.

30. Bosi A., and Olivieri G. Variability of the adaptive response to ionizingradiation in humans. // Mutat. Res., 1989. 211, 13-17,

31. Bravard A., Petridis F., Luccioni C. 1999. Modulation of antioxidant enzymes p21WAFl and p53 expression during proliferation and differentiation of human melanoma cell lines. Free Radic. Biol. Med. 26: 1027-1033.

32. Cai L.and.Liu S.Z. Induction of cytogenetic adaptive response of somatic and germ cells in vivo and in vitro by low dose X-irradiation // Int. J. Radiat. Biol., 1990. 58, 187-194.

33. Calini V, Urani C, Camatini M. Comet assay evaluation of DNA single-and double-strand breaks induction and repair in C3H10T1/2 cells //Cell Biol Toxicol. 2002; 18(6):369-79.

34. Coates P.J., Lorimore S.A., Wright E.G. 2004. Damaging and protective cell signalling in the untargeted effects of ionizing radiation. Mutat. Res. 568:5-20.

35. Cortes F, Dominguez I, Mateos S, Pinero J, Mateos JC. Evidence for an adaptive response to radiation damage in plant cells conditioned with X-rays or incorporated tritium. // Int J Radiat Biol, 1990;57(3):537-41

36. Cramers P., Atanasova P., Vrolijk H., Darroudi F., van Zeeland A.A., Huiskamp R., Mullenders L.H. F. and Kleinjans C.S. 2005. Pre-exposure to low doses: modulation of X-ray-induced DNA damage and repair. Radiat. Res. 164: 383-390.

37. Cummins, R. J., Mothersill, C., Seymour, С. В., Johns, H. and Joiner, M. C. The effect of microcolony size, at time of irradiation, on colony forming ability. // Int J Radiat Biol. 1999. 75:2, 225-32

38. Durovic B, Spasic-Jokic V, Durovic B. Influence of occupational exposure to low-dose ionizing radiation on the plasma activity of superoxide dismutase and glutathione level.// Vojnosanit Pregl. 2008 Aug;65(8):613-618Л

39. Emerit I, Quastel M, Goldsmith J, Merkin L, Levy A, Cernjavski L, Alaoui-Youssefi A, Pogossian A, Riklis E. Clastogenic factors in the plasma of children exposed at Chernobyl. Mutat Res. 1997 Jan 3;373(l):47-54.

40. Farooqi, Z., Kesavan, , PC. Low-dose radiation-induced adaptive response in bone marrow cells of mice // Mutat. Res., 1993. 302, 83-89.

41. Flores M.J. Pinero J., Ortiz Т., Pastor N., Mateos J.C. and Cortes F. Both bovine and rabbit lymphocytes conditioned with hydrogen peroxide showan adaptive response to radiation damage // Mutat. Res., 1996. 372, 9-15.

42. Goldberg Z. and Lehnert B.E. Radiation-induced effects in unirradiated cells: A review and implications in cancer // International journal of oncology. 2002. 21: 337-349.

43. Goodhead DT. Initial events in the cellular effects of ionizing radiation: clustered damage in DNA. // Int J Rad Biol. 1994. V. 65 P.7-17.

44. Gourabi H., and Mozdarani H. A cytokinesis-blocked micronucleus study of the radioadaptive response of lymphocytes of individuals occupationally exposed to chronic doses of radiation // Mutagenesis. 1998. 13. 475-480

45. Hain J. Jaussi R., Burcart W. Adaptive respons of human peripheral blood lymphocytes (PBL's) to low dosws of ionizing radiation //Experientia, 1991. Vol.47. Abstr.-P.56

46. Hain J., Jaussi R., and Burkart W. Lack of adaptive response to low doses of ionizing radiation in human lymphocytes from five different donors. // Mutat. Res. 1992. 283. 137-144.

47. Hall J.L. Cellular mechanisms for heavy metal detoxification and tolerance //Journal of Experimental Botany. 2003. Vol.53. №366.P.1-11

48. Jeggo PA, Taccioli GE, Jackson SP. Menage a trois: double strand break repair, V(D)J recombination and DNA-PK // Bioessays. 1995;17(11):949-57. Review.

49. Jiang H., Li W„ Li X., Cai L., Wang G. 2008. Low-Dose Radiation Induces Adaptive Response in Normal Cells, but not in Tumor Cells: In vitro and in vivo Studies. J. Radiat. Res. (Tokyo). 2008.

50. Jorgensen TJ, Shiloh Y. The ATM gene and the radiobiology of ataxia-telangiectasia // Int J Radiat Biol. 1996 May;69(5):527-37. Review.

51. Kadhim MA, Moore SR, Goodwin EH. Interrelationships amongst radiation-induced genomic instability, bystander effects, and the adaptive response. // Mutat Res. 2004 Dec 2;568(l):21-32.

52. Kalina I., Nemethova G. 1997. Variability of the adaptive response to low dose radiation in peripheral blood lymphocytes of twins and unrelated donors. Folia Biol. (Praha). 43: 91-95.

53. Kastan M. On the TRAIL from p53 to apoptosis // Nat Genet. 1997;17(2):130-1.

54. Kesley K.J., Memisoglu A., Frenkel D., Liber H.L. Human lymphocytes exprosed to low doses of X-rays are less susceptible to radiation-induced mutagenesis // Mutat.res. Left., 1991. Vol. 263, №4. P. 197-201

55. Kim GJ, Chandrasekaran K, Morgan WF. Mitochondrial dysfunction, persistently elevated levels of reactive oxygen species and radiationinduced genomic instability: a review. // Mutagenesis. 2006 Nov;21(6):361-7.

56. Kolodner RD, Putnam CD, Myung K. Maintenance of genome stability in Saccharomyces cerevisiae. // Science. 2002. 297:552-57.

57. Leach JK, Van Tuyle G, Lin PS. Schmidt-Ullrich R, Mikkelsen RB. Ionizing radiation-induced, mitochondria-dependent generation of reactive oxygen/nitrogen// Cancer Res. 2001; 15:61(10):3894-901

58. Lehnert BE, Iyer R. Exposure to low-level chemicals and ionizing radiation: reactive oxygen species and cellular pathways. // Hum Exp Toxicol. 2002. V. 21(2) P.65-69.

59. Leonard S, Gannett PM, Rojanasakul Y, Schwegler-Berry D, Castranova V, Vallyathan V, Shi X. Cobalt-mediated generation of reactive oxygen species and its possible mechanism. J Inorg Biochem. 1998;70(3-4):239-44.

60. Limoli CL, Kaplan MI, Giedzinski E, Morgan WF. Attenuation of radiation-induced genomic instability by free radical scavengers and cellular proliferation // Free Radic Biol Med. 2001a;31(l):10-9.

61. Limoli CL, Corcoran JJ, Jordan R, Morgan WF, Schwartz JL. A role for chromosomal instability in the development of and selection for radioresistant cell variants // Br J Cancer. 2001b:84(4):489-92.

62. Little, J.B., H. Nagasawa, T. Pfenning, and H. Vetrovs. Radiation-induced genomic instability: delayed mutagenic and cytogenetic effects of X-rays and alpha particles. // Radiation Research 1997.148:299-307.

63. Little JB, Azzam EI, de Toledo SM, Nagasawa H. Bystander effects: intercellular transmission of radiation damage signals. // Radiat Prot Dosimetry. 2002. V. 99(1-4) P.159-162.

64. Liu S.Z., Cai L., Sun S.Q. Induction of a cytogenetic adaptive response by exposure of rabbits to very low dose-rate gamma-radiation // Int. J. Radiat. Biol., 1992. 62,187-90.

65. Matsumoto H.,Ohnishi T. 2004. Contribution of radiation-induced, nitric oxide-mediated bystander effect to radiation-induced adaptive response. Biol. Sci. Space. 18: 108-109.

66. Matsumoto H, Hamada N, Takahashi A, Kobayashi Y. Ohnishi T. Vanguards of paradigm shift in radiation biology: radiation-induced adaptive and bystander responses // J Radiat Res (Tokyo). 2007;48(2):97-106.

67. Meyn MS. Ataxia-telangiectasia and cellular responses to DNA damage // Cancer Res. 1995;55(24):5991-6001. Review.

68. Mitchell SA, Marino SA, Brenner DJ, Hall EJ. Bystander effect and adaptive response in C3H 10T(l/2) cells. // Int J Radiat Biol. 2004. Jul;80(7):465-72.

69. Miyashita T, Krajewski S, К raj cw ska M, Wang HG, Lin HK, Liebermann DA, Hoffman B, Reed JC. Tumor suppressor p53 is a regulator of bcl-2 and bax gene expression in vitro and in vivo // Oncogene. 1994;9(6):1799-805.

70. Miyashita T, Reed JC. Tumor suppressor p53 is a direct transcriptional activator of the human bax gene // Cell. 1995; 27;80(2):293-9.

71. Morgan WF. Is there a common mechanism underlying genomic instability, bystander effccts and other nontargeted effects of exposure to ionizing radiation? // Oncogene. 2003a Oct 13;22(45):7094-9. Review.

72. Morgan WF. Non-targeted and delayed effects of exposure to ionizing radiation: II. Radiation-induced genomic instability and bystander effects in vivo, clastogenic factors and transgenerational effects // Radiat Res. 2003b; 159(5):581-96. Review.

73. Morgan WF. Non-targeted and delayed effects of exposure to ionizing radiation: I. Radiation-induced genomic instability and bystander effects in vitro // Radiat Res. 2003c; 159(5):567-80. Review.

74. Morgan WF, Sowa MB. Non-targeted bystander effects induced by ionizing radiation. Mutat Res. 2007 Mar l;616(l-2):159-64. Epub 2006 Nov 28. Review.

75. Moslen, M.T. Free Radicals in Diagnostic Medicine // D. Armstrong, ed., Plenum Press, New York. 1994.

76. Mothersill C, Seymour C. Genomic instability, bystander effects and radiation risks: implications for development of protection strategies for man and the environment // Radiats Biol Radioecol. 2000; 40(5):615-20. Review.

77. Mothersill С, O'Malley К, Seymour СВ. Characterisation of a bystander effect induced in human tissue explant cultures by low let radiation. // Radiat Prot Dosimetry. 2002. V. 99(1-4). P.163-167.

78. Mothersill C., Seymour C.B. 2004. Radiation-induced bystander effects -implications for cancer. Nat. Rev. Cancer. 4:158—64.

79. Murnane JP. Role of induced genetic instability in the mutagenic effects of chemicals and radiation. // Mutat Res. 1996 Jan;367(l): 11-23. Review.

80. Nagasawa H, Little JB. Unexpected sensitivity to the induction of mutations by very low doses of alpha-particle radiation: evidence for a bystander effect. // Radiat Res. 1999. Nov;152(5):552-7.

81. Narayanan PK, Goodwin EH, Lehnert BE. Alpha particles initiate biological production of superoxide anions and hydrogen peroxide in human cells // Cancer Res. 1997;57(18):3963-71

82. Nojima H. Cell cycle checkpoints, chromosome stability and the progression of cancer // Hum Cell. 1997; 10(4):221-30. Review.

83. Okada M, Okabe A, Uchihori Y, Kitamura H, Sekine E, Ebisawa S, Suzuki M, Okayasu R. Single extreme low dose/low dose rate irradiation causes alteration in lifespan and genome instability in primary human cells // Br J Cancer. 2007;96( 11): 1707-10.

84. Oleinick NL, Chiu SM, Friedman LR. Gamma radiation as a probe of chromatin structure: damage to and repair of active chromatin in the metaphasc chromosome // Radiat Res. 1984;98(3):629-41.

85. Olive PL. Detection of DNA damage in individual cells by analysis of histonc H2AX phosphorylation // Methods Cell Biol. 2004;75:355-73.

86. Olivieri, G., J. Bodycote, and S. Wolff. 1984. Adaptive response of human lymphocytes to low concentrations of radioactive thymidine. Science 223:594-597.

87. Olivieri G., and Bosi A. Possible causes of variability of the adaptive response in human lymphocytes. // In Chromosomal Aberrations Basic and Applied Aspects, 1990.

88. Osterreicher J, Prise KM, Michael BD, Vogt J, Butz T, Tanner JM. Radiation-induced bystander effects. Mechanisms, biological implications, and current investigations at the Leipzig LIPSION facility. Strahlenther Onkol. 2003;179(2):69-77. Review.

89. Paull TT, Gellert M. The 3' to 5' exonuclease activity of Mre 11 facilitates repair of DNA double-strand breaks. // Mol Cell. 1998. Jun;l(7):969-79.

90. Prise KM, Belyakov OV, Newman HC, Patel S, Schettino G, Folkard M, Michael BD. Non-targeted effects of radiation: bystander responses in cell and tissue models. // Radiat Prot Dosimetry. 2002;99(1-4):223-6

91. Prise KM, Folkard M, Michael BD. A review of the bystander effect and its implications for low-dose exposure. // Radiat Prot Dosimetry. 2003. 104 (4):347-55.

92. Raaphorst GP, Boyden S. Adaptive response and its variation in human normal and tumour cells. // Int J Radiat Biol. 1999;75(7):865-73.

93. Riley PA. Free radicals in biology: oxidative stress and the effects of ionizing radiation. // Int J Radiat Biol. 1994. Jan;65(l):27-33. Review.

94. Roos WP, Binder A, Bohm L. The influence of chromatin structure on initial DNA damage and radiosensitivity in CHO-K1 and xrsl cells at low doses of irradiation 1-10 Gy. // Radiat Environ Biophys. 2002. Sep:41(3): 199-206. Epub 2002 Sep 07.

95. Salone В., Pretazzoli V., Bosi A., Olivieri G. 1996. Interaction of low-dose irradiation with subsequent mutagenic treatment: role of mitotic delay. Mutat. Res. 358: 155-60.

96. Samson L., Cairns J. 1977. A new pathway for DNA repair in Escherichia coli. Nature. 267: 281-283.

97. Sancar A., Lindsey-Boltz L.A., Unsal-Kacmaz K., and Linn S. Molecular mechanisms of mammalian DNA repair and the DNA damage checkpoints // Annu. Rev. Biochem. 2004/ 73:39-85

98. Sankaranarayanan K., Von Duyn A., Loos M., and Natarjan, A.T. Adaptive response of human lymphocytes to low level radiation from radioisotopes or X-rays. // Mutat. Res. 1989. 211 , 7-12.

99. Sasaki MS, Ejima Y, Tachibana A, Yamada T, Ishizaki K, Shimizu T, Nomura T. DNA damage response pathway in radioadaptive response. // Mutat Res. 2001. Jul 25;504(1-2):101-18.

100. Sasaki MS, Ejima Y, Tachibana A, Yamada T, Ishizaki K, Shimizu T, Nomura T. DNA damage response pathway in radioadaptive response. // Mutat Res. 2002. Jul 25; 504(1-2):101-18.

101. Scaffidi С, Fulda S, Srinivasan A, Friesen C, Li F, Tomaselli KJ, Debatin KM, Krammer PH, Peter ME. Two CD95 (APO-l/Fas) signaling pathways (1998). EMBO J., 17: 1675-1687:

102. Seoane A, Gtierci A, Dulout F Genetic instability induced by low doses of x-rays in hamster cells. // Int J Radiat Biol. 2007 Feb;83(2):81-7.

103. Shadley J.D., WolffS. Very low doses of X-rays can cause human lymphocytes to become less susceptible to ionizing radiation, // Int. J. Radiat. Biol., 1987. 2. 95-96.

104. Shadley J.D.and Wiencke J.K. Induction of the adaptive response by X-rays is dependent on radiation intensity // Int. J. Radiat. Biol., 1989. 56. 107-118.

105. Smith LE, Nagar S, Kim GJ, Morgan WF. Radiation-induced genomic instability: radiation quality and dose response. // Health Phys. 2003. Jul;85(l):23-9.

106. Stecca C, Gerber GB. Adaptive response to DNA-damaging agents: a review of potential mechanisms. // Biochem Pharmacol. 1998 Apr 1;55(7):941-51. Review

107. Stoilov LM, Mullenders LH, Darroudi F, Natarajan AT. Adaptive response to DNA and chromosomal damage induced by X-rays in human blood lymphocytes. // Mutagenesis. 2007 Mar;22(2):l 17-22. Epub 2007 Jan 17.

108. Sung P. Catalysis of ATP-dcpendent homologous DNA pairing and strand exchange by yeast RAD51 protein. // Science. 1994. Aug 26; 265(5176):1241-3.

109. Thompson, L.H. Evidence that mammalian cells possess homologous recombinational repair pathways. // Mutation Research. 1996. 363:77-88.

110. Trujillo KM, Yuan SS, Lee EY, Sung P. Nuclease activities in a complex of human recombination and DNA repair factors Rad50, Mrell, and p95. //J Biol Chem. 1998. Aug 21;273(34):21447-50.

111. Tsujimoto Y. Role of Bcl-2 family proteins in apoptosis: apoptosomes or mitochondria? // Genes Cells. 1998 Nov;3(l l):697-707

112. Tyrsina EG, Slanina SV, Alipov ED. Contribution of inducible and constitutive mechanisms to radioresistance acquisition by hamster malignant fibroblasts. // Dokl Biochem Biophys. 2007 May-Jun;414:l 169. No abstract available.

113. Ullrich, R. L. and Ponnaiya, B. Radiation-induced instability and its relation to radiation carcinogenesis. // Int J Radiat Biol. 1998. 74:6, 74754.

114. Ward, J.F. DNA damage produced by ionizing radiation in mammalian cells: Identities, mechanism of formation, and repairability. // Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology 1988.35:95125.

115. Wicncke J.K., Afzal V., Olivieri G. and Wolff S. Evidence that the 3H. thymidine induced adaptive response of human lymphocytes tosubsequent doses of X-rays involves the induction of chromosomal repair mechanism//Mutagenesis. 1986. 1.375-380

116. Wojcik A. and Tuschl H. Indications of an adaptive response in C57BL mice pre-exposed in vivo to low doses of ionizing radiation. // Mutat. Res., 1990. 243:67-73.

117. Wojcik A., Streffer C., Adaptive response to ionizing radiation in mammalian cells: a review.// Biol. Zent. Bl. 1994. 113:417-434.

118. Wojcik A, Sauer C. Zolzer F, Bauch T, Muller WU. Analysis of DNA damage recovery processes in the adaptive response to ionizing radiation in human lymphocytes. // Mutagenesis. 1996 May;l l(3):291-7.

119. Wojewodzka M, Buraczewska I, Kruszewski M. A modified neutral comet assay: elimination of lysis at high temperature and validation of the assay with anti-single-stranded DNA antibody. // Mutat Res. 2002 Jun 27;518(l):9-20.

120. Wojewodzka M, Kruszewski M, Sochanowicz B, Szumiel I. Differential DNA double strand break fixation dependence on poly(ADP-ribosylation) in L5178Y and CHO cells. // Int J Radiat Biol. 2004 Jul;80(7):473-82.

121. Wright E.G. Radiation-induced genomic instability in haemopoietic cells // Int. J. Radiat. Biol., 1998. Vol. 74. № 6. P. 681-687

122. Yan N, Shi Y. Histone HI.2 as a trigger for apoptosis. Nat Struct Biol. 2003 Dec;10(12):983-5

123. Zhang L. 1995. Cytogenetic adaptive response induced by preexposure in human lymphocytes and marrow cells of mice. Mutat. Res. 334: 33--7.

124. Zong WX, Ditsworth D, Bauer DE, Wang ZQ, Thompson CB. Alkylating DNA damage stimulates a regulated form of necrotic cell death.Genes Dev. 2004 Jun 1; 18(11): 1272-82. Epub 2004 May 14.

125. Zhou BB, Elledge SJ. The DNA damage response: puttingcheckpoints in perspective. // Nature 2000. 408:433^39.

Информация о работе

Лизунова, Екатерина Юрьевна
кандидата биологических наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.01

Диссертация

Изменения радиочувствительности в поколениях облученных клеток млекопитающих - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы