Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Синергизм и восстановление клеток после комбинированного действия химических агентов с ионизирующим излучением или гипертермией

ВАК РФ 03.01.01, Радиобиология

Автореферат диссертации по теме "Синергизм и восстановление клеток после комбинированного действия химических агентов с ионизирующим излучением или гипертермией"

ЕВСТРАТОВА Екатерина Сергеевна

СИНЕРГИЗМ И ВОССТАНОВЛЕНИЕ КЛЕТОК ПОСЛЕ КОМБИНИРОВАННОГО ДЕЙСТВИЯ ХИМИЧЕСКИХ АГЕНТОВ С ИОНИЗИРУЮЩИМ ИЗЛУЧЕНИЕМ ИЛИ ГИПЕРТЕРМИЕЙ

Специальность 03.01.01 — Радиобиология

ППДП 2015

АВТОРЕФЕРАТ

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

005569265

Обнинск - 2015

005569265

Диссертация выполнена в Медицинском Радиологическом Научном Центре им. А.Ф. Цыба - филиале Федерального Государственного Бюджетного Учреждения «Федеральный Медицинский Исследовательский Центр Им. П.А. Герцена» Министерства Здравоохранения России

Научный руководитель: Петин Владислав Георгиевич, доктор биологических

наук, профессор, заведующий биофизической лабораторией Медицинского Радиологического Научного Центра им. А.Ф. Цыба - филиала Федерального Государственного Бюджетного Учреждения «Федеральный Медицинский Исследовательский Центр им. П.А. Герцена» Министерства Здравоохранения России

Официальные оппоненты: Сынзыныс Борис Иванович,

доктор биологических наук, профессор, ИАТЭ НИЯУ МИФИ (г. Обнинск), профессор кафедры экологии

Осипов Андреян Николаевич,

доктор биологических наук,

Федеральный медицинский биофизический центр им. А.И. Бурназяна (г. Москва),

заведующий лабораторией радиационной биофизики

Ведущая организация: Объединенный институт ядерных исследований

(г. Дубна)

Защита состоится «18» июня 2015 г. в «10» часов на заседании диссертационного совета Д 006.068.01 при ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной радиологии и агроэкологии по адресу: 249032, Калужская обл., г. Обнинск, Киевское шоссе, 109 км, ГНУ ВНИИСХРАЭ, здание 1, к. 510.

Факс: (48439) 680 66.

Электронная почта: rirae70@grnail.corn

Сайт: http://www.riarae-raas.ru/

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте ГНУ ВНИИСХРАЭ, http://www.riarae-raas.ru/

Автореферат разослан « 12. » _ 2015 г.

Учёный секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Шубина Ольга Андреевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИРА РАБОТЫ

Актуальность темы. При использовании ионизирующих излучений для лечения онкологических заболеваний дозу, требуемую для поражения всех злокачественных клеток, по многим причинам нельзя подвести однократно (Линденбратен и Королюк, 2000; Цыб и Гулидов, 2010). В связи с этим в онкологии используют комбинированное действие ионизирующего излучения с различными химическими агентами для повышения радиочувствительности опухолевых клеток при лучевой терапии. Существует болыцое количество работ по изучению влияния одновременного и последовательного комбинированного действия ионизирующего излучения с химическими агентами на выживаемость и пострадиационное восстановление клеток различного происхождения (Streffer et al., 1990; Ng et al., 1994; Snyder, 1994; Choy, 2003; Hall and Giaccia, 2006; Fischbach, 2011). В этих и во многих других работах авторы наблюдали уменьшение скорости и объема восстановления клеток с увеличением концентрации химических агентов, повышающих радиочувствительность клеток. На этом основании сделан вывод, что механизм радиосенсибилизации химическими агентами обусловлен поражением или нарушением процессов восстановления. Однако, как было показано ранее для комбинированного действия гипертермии с ионизирующим излучением и УФ светом на диплоидные дрожжевые клетки (Комарова и Петин, 2007; Петин и др., 2012; Petin and Kim, 2004;), ингибирование процессов восстановления реализуется, главным образом, благодаря увеличению доли необратимых повреждений, от которых клетки неспособны восстанавливаться, а не повреждением или нарушением самого процесса восстановления. Однако подобные исследования для комбинированного действия химических агентов с ионизирующим излучением немногочисленны. Поэтому представляется актуальным более детально исследовать комбинированное действие химических соединений с ионизирующим излучением или гипертермией. Были выявлены универсальные закономерности проявления синергических эффектов, не зависящие от биологического теста и объекта, а также от физических агентов, используемых при комбинированных воздействиях**^)

(Петин и др., 2012; Petin and Kim, 2014). Также представляется актуальным провести подобные исследования для клеток различного происхождения, подвергавшихся воздействию ионизирующего излучения или гипертермии в комбинации с химическими сенсибилизаторами, используемыми в настоящее время в клинической практике. Поскольку в лучевой терапии используется фракционированной облучение, актуальной является задача изучить восстановление клеток от потенциально летальных повреждений после многократных воздействий редко- и плот-ноионизирующих излучений.

Ингибирование процессов восстановления может реализовываться различными механизмами — за счет повреждения или нарушения самого процесса восстановления, а так же благодаря увеличению доли необратимых повреждений, от которых клетки неспособны восстанавливаться, или оба эти процесса могут происходить одновременно. Для выявления общности этих закономерностей представляло интерес на примере клеток млекопитающих различного происхождения, подвергавшихся воздействию ионизирующего излучения в комбинации с тяжелыми металлами и другими химическими агентами, проанализировать возможные механизмы ингибирования способности клеток восстанавливаться от радиационных повреждений.

Представляло интерес проверить, будут ли ранее выявленные универсальные закономерности проявления синергизма после комбинированного действия гипертермии с ионизирующим излучением, УФ светом или ультразвуком (Петин и др., 2012) реализовываться при комбинированном действии химических агентов с гипертермией и ионизирующим излучением.

Цель работы: выявление новых закономерностей проявления синергизма и восстановления клеток после комбинированного действия химических агентов с ионизирующим излучением или гипертермией.

Задачи исследования: 1. Определить влияние цисплатина, блеоцина, сульфата меди и доксорубицина на повышение радиочувствительности дрожжевых клеток и их способности к восстановлению от потенциально летальных повреждений.

2. Оценить, происходит ли подавление способности диплоидных дрожжевых клеток к восстановлению от потенциально летальных повреждений после комбинированных действий химических агентов с ионизирующим излучением за счет увеличения доли необратимо поврежденных клеток или благодаря нарушению самого процесса восстановления.

3. Исследовать влияние повторного облучения диплоидных дрожжевых клеток ионизирующим излучением с низкой и высокой ЛПЭ на константу восстановления, характеризующую вероятность восстановления клеток в единицу времени, и формирование необратимых повреждений, от которых клетки не способны восстанавливаться.

4. Выяснить, связан ли механизма повышения радиочувствительности культивируемых клеток млекопитающих при применении химических радиосенсибилизаторов с нарушением самого процесса восстановления или только с формированием необратимых радиационных повреждений, от которых клетки не способны восстанавливаться.

5. Получить новые данные для дрожжевых клеток и культивируемых клеток млекопитающих, подтверждающие универсальные закономерности проявления синергизма: существование максимального синергического эффекта при определенном соотношении «доз» воздействующих агентов и его зависимость от интенсивности применяемых факторов.

Научная новизна

В ходе выполнения работы впервые были получены следующие новые результаты.

1. Механизм повышения радиочувствительности культивируемых клеток млекопитающих химическими радиосенсибилизаторами может быть обусловлен как дополнительным формированием необратимых радиационных повреждений, так и уменьшением константы восстановления, характеризующей вероятность восстановления клеток в единицу времени.

2. Блеоцин, сульфат меди и доксорубицин в нетоксических концентрациях повышали радиочувствительность дрожжевых клеток за счет подавления способ-

ности клеток к восстановлению и синергического взаимодействия повреждений, индуцированных этими препаратами и ионизирующим излучением.

3. При повторных облучениях диплоидных дрожжевых клеток плотноионизи-рующим излучением резко уменьшается способность клеток восстанавливаться от потенциально летальных повреждений за счет формирования необратимых повреждений.

4. Для комбинированного действия химических агентов с гипертермией получены новые данные, подтверждающие универсальные закономерности проявления синергизма, выявленные ранее для комбинированных действий гипертермии с ионизирующим излучением и другими физическими агентами: наличие оптимальной температуры для проявления максимального синергизма, а также его зависимость от концентрации препаратов.

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные в работе новые результаты о подавлении способности клеток к восстановлению после комбинированного действии ионизирующего излучения с химическими агентами имеет теоретическое и практическое значение для понимания механизма радиосенсибилизации клеток химическими агентами и практического использования комбинированных воздействий. Большое значение имеют новые данные о снижении способности клеток восстанавливаться от потенциально летальных повреждений после повторных облучений ионизирующим излучением различного качества. Результаты диссертации имеют фундаментальную и практическую значимость для оптимизации комбинированных воздействий и обеспечения максимального синергического взаимодействия, а также для понимания и теоретической интерпретации биологических эффектов комбинированных воздействий.

Методология и методы исследования. Методологической основой для выполнения данных исследований и интерпретации получаемых результатов является разработанная в биофизической лаборатории математическая модель синергизма, позволяющая прогнозировать максимальный синергический эффект, условия его достижения, а также зависимость синергизма от интенсивности применяемых факторов (Петин и Комаров, 1989; Петин др., 2012; Petin and Komarov,

1997). Оценка параметров восстановления была выполнена с использованием уравнения, описывающего процесс пострадиационного восстановления в терминах уменьшения эффективной дозы (Корогодин, 1966; Капульцевич, 1978).

Экспериментальная часть работы была выполнена на диплоидных дрожжевых клетках Басскаготусси сеге\ч51ае. Результаты, полученные на дрожжевых клетках, сравнивались с данными для клеток млекопитающих, опубликованные другими авторами, в которых сами авторы не оценивали параметры восстановления. В качестве ионизирующих излучений в настоящей работе были использованы у-кванты б0Со (ЛПЭ = 0,2 кэВ/мкм) и а-частицы 239Ри (ЛПЭ = 130 кэВ/мкм). Для гипертермической обработки использовали ультратермостат, автоматически поддерживающий заданную температуру. В качестве химических агентов применяли цисплатин, циклофосамид, доксорубицин, блеоцин, камптотецин, новобиоцин, пируват натрия, камптотецин (КПТ), дифтормитилорнитин (ДФМО), метилглиок-саль-бис-гуанилгидразон (МГБГ), цис-дихлордиаминерплатина(П) (цис-ДДП), 5'-йоддеоксиуридин, пируват натрия, новобиоцин, лактат натрия, налидиксовая кислота, 3-аминобензамид, ара-А, гидроксимочевина и соли тяжелых металлов ^пСЬ, МСЬ и Си804). Основным биологическим тестом была выживаемость, оцениваемая по способности клеток образовывать видимые глазом колонии на питательной среде.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Механизм повышения радиочувствительности культивируемых клеток млекопитающих химическими радиосенсибилизаторами может быть обусловлен как дополнительным формированием необратимых радиационных повреждений, так и уменьшением константы восстановления, характеризующей вероятность восстановления клеток в единицу времени.

2. Выявлены препараты, влияющие на восстановление клеток от сублетальных радиационных повреждений, что проявляется превращением сигмоидной формы кривой выживаемости в экспененциальную.

3. Обнаружены соединения, не влияющие на параметры пострадиационного восстановления, но повышающие радиочувствительность клеток.

4. Показано, что при повторных облучениях клеток плотноионозирующим излучением уменьшается их способность восстанавливаться не только от сублетальных, но и от потенциально летальных повреждений за счет формирования необратимых повреждений.

5. Установлено, что ранее выявленные универсальные закономерности проявления синергизма после терморадиационных воздействий подтверждены для комбинированных действий химических агентов с гипертермией: наличие оптимальной температуры для проявления максимального синергизма, а также его зависимость от концентрации препаратов.

Достоверность результатов. Достоверность полученных результатов определяется использованием адекватных и объективных методов исследования и достаточным уровнем статистической нагруженности получаемых результатов. Для обработки экспериментальных данных использован стандартный набор статистических методов, принятых в современных биологических исследованиях. В работе принят 95% уровень значимости различий, что соответствует принятому стандарту и обеспечивает необходимую степень достоверности полученных результатов.

Апробация работы. Основные результаты диссертации были представлены на следующих научных форумах: Научная сессия НИЯУ МИФИ-2012. Инновационные ядерные технологии. Высокие технологии в медицине. М.: НИЯУ МИФИ. 2012; БИОЛОГИЯ - НАУКА XXI ВЕКА: 16-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых (Пущино, 16-21 апреля 2012 года); Ольвшский форум-2012: стратегш Украпни в геополгтичному простор!»: тезисы Миколапв: Вид-во ЧДУ 1м. Петра Могили. 2012; Техногенная система и экологический риск: Материалы докладов IX Региональной научной конференции / Под общ. ред. академика РЭА Г.К. Игнатенко. Обнинск: ИАТЭ. 2012; Экспериментальная и теоретическая биофизика '12 (Пущино, 22-24 октября 2012 года). Пущино. 2012; Техногенные системы и экологический риск: Тезисы докладов X Региональной научной конференции / Под общ. ред. А.А. Удаловой - Обнинск: ИАТЭ. 2013; 17-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых "БИОЛОГИЯ -

НАУКА XXI ВЕКА", 21-26 апреля 2013 г, Пущино; Невский радиологический форум 2013 / Под ред. H.A. Карловой. СПб.: ЭЛБИ-СПб, 2013; Экспериментальная и теоретическая биофизика '13. Сборник тезисов. Пущино: типография Fix Print, 2013; XXVI зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». Москва, полиграфический участок ИБХ РАН. 2014; Техногенная система и экологический риск: Тезисы докладов XI Региональной научной конференции / Под общ. ред. A.A. Удаловой. Обнинск: ИАТЭ, 2014; 18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых "БИОЛОГИЯ - НАУКА XXI ВЕКА". Пущино, 21-25 апреля 2014 г.

Апробация диссертации состоялась на научной конференции экспериментального радиологического сектора Медицинского радиологического научного центра им. А.Ф. Цыба - филиала ФГБУ «ФМИЦ им. П.А. Герцена» Минздрава России 19 декабря 2014 года.

Основные результаты диссертации опубликованы в 7 статьях в журналах, входящих в список ВАК, и в 8 статьях, опубликованных в других журналах и сборниках.

Личное участие автора в получении научных результатов. Автор диссертационной работы Е.С. Евстратова принимала непосредственное участие в планировании данной работы, осуществляла ее организацию, самостоятельно проводила экспериментальные исследования, выполняла обработку полученных результатов, в том числе статистическую, а также анализ и сопоставление с данными, имеющимися в литературе.

Объем и структура диссертационной работы. Диссертация изложена на 123 страницах машинописного текста и содержит введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, результаты экспериментов, их обсуждение, заключение, выводы, а также список литературы, содержащий 210 источников, 153 из которых являются зарубежными. Диссертационная работа содержит 39 рисунков и 4 таблицы, а также 6 рисунков в приложении.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Во введении обоснована актуальность темы диссертации, сформулированы основные цели и задачи исследования, научная новизна, теоретическая и практическая значимость работы. Глава 1. Аналитический обзор литературы

При одновременном или последовательном применении ионизирующего излучения и другого агента физической или химической природы на биологические объекты возможны три типа взаимодействия повреждений, индуцированных ионизирующим излучением и агентом, используемым в комбинации с ним (Доклад 30, МКРЕ, 1984): синергическое, независимое (аддитивное) и антагонистическое.

Для количественной оценки синергического эффекта используется коэффициент синергического усиления к (Петин, 1977; Petin and Berdnikova, 1979, 1981), определяемый отношением продолжительностей воздействия на теоретической кривой выживаемости, ожидаемой при независимом сложении эффектов от обоих агентов, к соответствующей продолжительности воздействия, оцененной по экспериментальной кривой выживаемости, полученной после комбинированного воздействия

Ккт.=* \lh. (1)

Фактически этот коэффициент показывает, во сколько раз биологический эффект усилился по сравнению с аддитивным сложением эффектов от каждого агента.

Наиболее подробно изучены закономерности проявления биологических эффектов после комбинированных воздействий ионизирующего излучения с гипертермией (Александров и др., 1980; Петин и др., 2012; van der Zee et al, 2000; Vasanthan et al., 2005; Hall and Giaccia, 2006; Mitsumori et al., 2007). В этих монографиях (Петин и др., 2012; Petin and Kim, 2014) описаны универсальные закономерности синергического взаимодействия различных факторов окружающей среды, проявление которых не зависит от применяемых в комбинации агентов, анализируемого эффекта и используемых объектов. Главные из них можно резюмировать следующим образом: существует оптимальное соотношение воздействующих агентов, для которых синергизм максимален. Во-вторых: синергизм зависит

от интенсивности применяемых агентов — при меньшей интенсивности одного из агентов необходимо использовать меньшую интенсивность другого агента для обеспечения максимального синергического эффекта.

Для описания кинетики пострадиационного восстановления дрожжевых клеток было использовано (Корогодин, 1966; Капульцевич, 1978) следующее уравнение:

= + (2) где О, - первоначальная доза, в которой были облучены клетки, t - продолжительность восстановления, Ц,Д0 — эффективная доза в зависимости от продолжительности пострадиационного восстановления, К - необратимый компонент лучевого поражения, Р — константа восстановления, характеризующая вероятность восстановления от радиационных повреждений в единицу времени. Из этого уравнения следует, что

= (3)

к = -J_

A

Параметр К, который не зависит от времени, называют необратимым компонентом радиационного поражения клеток. Из этих уравнений следует, что

Р=--f1, (5)

где

- D^i плато)

D.-D^mamo) w

Пример нахождения эффективной дозы D^it), D^(wiamo) и первичной дозы

Dx, в которой были облучены клетки, указан на рисунке 1 стрелками.

Для описания одновременного комбинированного действия агентов была предложена математическая модель, описанная в работах (Петин и Комаров, 1989; Petin and Komarov, 1997). В соответствии с этой моделью, синергическое взаимодействие двух факторов внешней среды обусловлено формированием до-

полнительных эффективных повреждений за счет взаимодействия субповреждений, образовавшихся после действия каждого из факторов и неэффективных при действии каждого фактора в отдельности.

Рисунок 1 - Кривая зависимости выживаемости дрожжевых клеток от дозы ионизирующего излучения (А) и продолжительности пострадиационного восстановления клеток (Б).

В опытах использовали диплоидные дрожжевые клетки БассЬаготусез штамм ХБ800 в стационарной стадии роста. Выживаемость диплоидных дрожжевых клеток оценивали методом макроколоний. Помимо результатов собственных экспериментальных исследований, в работе для оценки необратимого компонента и константы восстановления использованы данные, опубликованные другими авторами для клеток млекопитающих различного происхождения Отметим, что сами авторы этих исследований таких расчетов не проводили.

В качестве химических термо- и радиосенсибилизаторов использовали циспла-тин, циклофосфамид, блеоцин и доксорубицин. Препараты в различных концентрациях присутствовали во время облучения и в процессе пострадиационного восстановления клеток. В работах других авторов, данные которых мы использовали для расчетов, использовали препараты: камптотецин (КПТ), дифтормити-лорнитин (ДФМО), метилглиоксаль-бис-гуанилгидразон (МГБГ), цис-ДДП, 5'-йоддеоксиуридин, пируват натрия, новобиоцин, лактат натрия, налидиксовая кислота, 3-аминобензамид, ара-А, гидроксимочевина и соли тяжелых металлов (гпСЬМСЬ и Си804).

Доза, Гр Время восстановления, ч

2 4 6 8 10 12 0 2 4 6 8 10 12

Глава 2. Материалы и методы исследования

Источником у-квантов служил радионуклид 60Со, установка «Исследователь», мощность дозы 25 Гр/мин, ЛПЭ = 0,2 кэВ/мкм. Источником а-частиц служила стационарная установка с радионуклидом 239Ри, средняя энергия а-частиц 3,5 МэВ, мощность дозы 20 Гр/мин, ЛПЭ = 130 кэВ/мкм. Дозиметрию источников проводили сотрудники лаборатории дозиметрии.

При определении выживаемости клеток в опытах использовали по 3-5 чашек Петри на каждую экспериментальную точку, а соответствующие разведения делали с таким расчетом, чтобы в каждой чашке вырастало 100-200 колоний. Каждый опыт повторяли 2—3 раза.

Глава 3. Восстановление дрожжевых клеток после воздействия факторов различной природы и их комбинаций

На рисунке 2 изображены полученные в эксперименте кривые зависимости выживаемости диплоидных дрожжевых клеток от дозы ионизирующего излучения (рисунок 2, А). Клетки, выдерживаемые в растворе цисплатина различной концентрации, показали заметное повышение радиочувствительности по сравнению с контролем. Изменение концентрации препарата в диапазоне от 0,002 до 0,02 г/мл не влияло на выживаемость. Видно (рисунок 2, Б), что цисплатин инги-бировал процесс восстановления клеток, причем эффект ингибирования был выражен в большей степени для более высоких концентраций цисплатина.

Рисунок 2 - Кривые зависимости выживаемости диплоидных дрожжевых клеток Saccharomyces cerevisiae дикого типа (штамм XS800) от дозы ионизирующего излучения (А) и продолжительности пострадиационного восстановления облученных клеток в непитательной среде (Б) при дозе 1200 Гр: 1 - действие только ионизирующего излучения, 2, 3, 4 - ионизирующее излучение + цисплатин (0,002; 0,01 и 0,02 мг/мл соответственно)

На основании данных, приведенных на рисунке 2, рассчитаны функции K(t) и A(t) (рисунок 3). Из этого рисунка следует, что необратимый компонент радиационного поражения К возрастает с 0,26 при действии одного ионизирующего из-

Доза, Гр

Продолжительность

лучения до 0,5; 0,68 и 0,83 после облучения ионизирующим излучением и восстановления клеток в присутствии цисплатина, в то время как константа восстановления р = 0,05 ч"1 не зависела от условий облучения и восстановления. Эти данные означают, что цисплатин ингибировал процесс восстановления через формирование необратимых радиационных повреждений, а не благодаря нарушению способности клеток к восстановлению от потенциально летальных повреждений.

Рисунок 3 - Зависимость доли невосстановленных (А) и восстанавливаемых (Б) радиационных повреждений K{t) диплоидных дрожжевых клеток Saccharomyces cerevisiae дикого типа (штамм XS800) от продолжительности восстановления клеток в непитательной среде.

В диссертации приводятся аналогичные данные о дозовой зависимости выживаемости и кинетике пострадиационного восстановления дрожжевых клеток, облученных в присутствии блеоцина, доксорубицина и сульфата меди. Пострадиационное восстановление клеток после применения данных препаратов практически полностью было подавлено. Показано, что коэффициент синергического усиления после комбинированного действия блеоцина, сульфата меди и доксорубицина с ионизирующим излучением равняется 1,9, 2,6 и 3,7 соответственно.

Получены экспериментальные результаты о радиочувствительности диплоидных дрожжевых клеток Saccharomyces cerevisiae (штамм XS800) и их способности к восстановлению после повторных воздействий ионизирующих излучений разного качества (рисунки 4 и 5 после действия у- и а-облучений).

Из представленных данных видно, что повторные воздействия обоими видами излучений не вносили существенных изменений в радиочувствительность клеток, но значительно влияли на восстановление клеток после облучения. Продемонстрировано, что возрастание доли необратимо поврежденных клеток с ростом ЛПЭ

излучения в меньшей степени связано с нарушением систем репарации, а в большей степени - с формированием необратимых радиационных повреждений.

Доза, Гр

О 400 800 1200 1600 0 400 800 1200 1600 0 400 800 1200 1600

100 чв Ю

I 0.1

Л

м

0.01 0,001

Рисунок 4 - Кривые выживаемости диплоидных дрожжевых клеток БассИаготусез сеге\чз1ас штамма Х5800, полученные сразу после облучения (1200 Гр) (темные кружки) и после полного восстановления в непитательной среде (светлые кружки), а также кривая восстановления в динамике (светлые квадраты). А — первое облучение, Б - второе облучение, В - третье облучение

Продолжительность восстановлення, ч

Доза, Гр

Продолжительность восстановления, ч

Рисунок 5 - Кривые выживаемости диплоидных дрожжевых клеток БассИаготусея сегеу1з1ае штамма Х5800, полученные сразу после а-облучения (400 Гр) (темные кружки) и после полного восстановления (светлые кружки), а также кривая восстановления в динамике (светлые квадраты). А - первое облучение, Б - второе облучение, В - третье облучение

Глава 4. Особенности взаимодействия химических препаратов и гипертермии

Результаты определения выживаемости диплоидных дрожжевых клеток Бас-сЪаготусеБ сеге\ч.ч1ае (штамм ХБ800) после одновременного применения циспла-

тина с гипертермией (52,5 °С), после воздействия отдельно цисплатина и этой температуры, а также теоретические кривые, рассчитанные при условии независимого сложения эффектов используемых факторов, представлены на рисунке 6. Стрелками указан пример нахождения коэффициента синергического усиления. Аналогичные данные получены для других действующих температур.

1 2 3

Продолжительность воздействия, ч

Рисунок 6 - Кривые выживаемости диплоидных дрожжевых клеток Saccharomyces cerevisiae дикого типа (штамм XS800) после действия отдельно цисплатина и гипертермии (кривые / и 2 соответственно), теоретическая кривая, рассчитанная при условии независимого сложения эффектов, индуцированных используемыми факторами (кривая 3), и экспериментальная кривая после одновременного применения цисплатина и гипертермии (52,5°С) (кривая 4)

Рисунок 7 - Зависимость коэффициента синергического усиления от действующей температуры при одновременном действии цисплатина (0,25 мг/мл) и гипертермии на диплоидные дрожжевые клетки 5асскаготусе$ сегеу1з1ае (штамм Х8800)

Температура, "С

На основании совокупности всех результатов, представленных в диссертации, мы рассчитали зависимость коэффициента синергического усиления от действующей температуры (рисунок 7). Аналогичные данные были получены для цик-лофосфамида, используемого в комбинации с гипертермией. Результаты изучения влияния концентрации циклофосфамида на его синергическое взаимодействие с гипертермией приведены на рисунке 8. Представленные данные показывают, что для каждой исследованной концентрации препарата имеется определенный диапазон действующих температур, в пределах которого регистрируется синергическое взаимодействие.

2,5

Рнсунок 8 - Зависимость коэффициента синергического усиления от температуры при одновременном действии циклофо-фамида различной концентрации с гипертермией на диплоидные дрожжевые клетки БассИаго-тусе.ч сегег1$1ае дикого типа (штамм ХБ800): кривая 1-2 мг/мл, кривая 2 — 6 мг/мл

48 52 56 60 64 68

Температура, °С

Кроме того, для каждой концентрации имеется специфическая температура, при которой отмечается максимальная эффективность синергического взаимодействия. При уменьшении концентрации препарата диапазон действующих температур синергически взаимодействующий с химическими агентами, смещается в область более низких значений. Точно такие же закономерности выявлены для комбинированного действия гипертермии с различными концентрациями циспла-тина. Совокупность этих данных подтверждает справедливость ранее продемонстрированных (Петин и др., 2012; Petin and Kim, 2014) универсальных закономерностей проявления синергизма для комбинированного действия ионизирующего излучения с различными физическими факторами окружающей среды.

Глава 5. Восстановление клеток млекопитающих после комбинированных воздействий ионизирующих излучений и химических агентов

Используя экспериментальные данные, опубликованных другими авторами (Kumar et al., 1985), мы рассчитали параметры восстановления культивируемых клеток китайского хомячка (V79) после действия ионизирующего излучения одного и в комбинации с указанными ингибиторами восстановления (пирувата натрия, новобиоцина, лактата натрия, налидиксовой кислоты). Сами авторы этих исследований таких расчетов не проводили. На основании этих расчетов мы пришли к следующим выводам: (1) необратимый компонент радиационного повреждения увеличивался с увеличением концентрации химических ингибиторов восстановления; (2) при высоких концентрациях химических соединений практически все радиационные повреждения носили необратимый характер; (3) константа восстановления (Р=0,15 ± 0,01 ч"1) не зависела от того, происходил ли процесс восста-

новления в присутствии или отсутствии химических сенсибилизаторов радиационного эффекта.

Однако некоторые химические вещества, испытанные в концентрациях, достаточных для подавления восстановления от потенциально летальных повреждений, приводили как к уменьшению константы восстановления, так и к увеличению числа повреждений, от которых клетка не способна восстанавливаться, т.е. за счет увеличения доли необратимых повреждений. Этот вывод сделан на основании результатов, опубликованных в работе (Snyder, 1989), и наших расчетов. Аналогичные результаты, приведенные в диссертации, были получены для некоторых других препаратов.

В диссертации приводятся результаты модификации радиочувствительности клеток млекопитающих различного происхождения, когда не наблюдается повышенный выход необратимых радиационных повреждений или нарушение константы восстановления.

Эти данные означают, что изученные препараты (цисплатин, дифтормети-лорнитин, соли никеля и камптотецин) повышали радиочувствительность клеток не за счет влияния на формирование необратимых повреждений или на процесс пострадиационного восстановления, а благодаря повышенной вероятности формирования первичных радиационных повреждений.

ВЫВОДЫ

1. Повышение радиочувствительности дрожжевых клеток при комбинированном действии ионизирующего излучения и цисплатина (фактор изменения дозы для 10% выживаемости равнялся 1,6) не зависело от концентрации препарата, использованного в нетоксических дозах. При этом цисплатин приводил к значительному уменьшению скорости и объема восстановления от потенциально летальных повреждений. Подавление способности клеток к восстановлению происходило за счет увеличения доли необратимо поврежденных клеток, а не вследствие нарушения самого процесса восстановления.

2. Комбинированное действие ионизирующего излучения с блеоцином, сульфатом меди и доксорубицином повышало радиочувствительность клеток в 2, 4,5 и 5

раз соответственно. Повышение радиочувствительности обусловлено синергиче-ским взаимодействием препаратов с ионизирующим излучением. Коэффициент синергического усиления составлял 1,8, 4,8 и 5,5 соответственно. Эти препараты в значительной степени подавляли способность клеток к восстановлению от радиационных повреждений.

3. При повторных облучениях диплоидных дрожжевых клеток ионизирующим излучением с низкими и высокими ЛПЭ константа восстановления, характеризующая вероятность восстановления клеток в единицу времени, не зависит от числа последующих облучений. При повторных воздействиях плотноионозирую-щим излучением резко уменьшается способность клеток восстанавливаться от потенциально летальных повреждений за счет формирования необратимых повреждений, от которых клетки не способны восстанавливаться.

4. Используя данные, опубликованные другими авторами, показано, что механизм повышения радиочувствительности культивируемых клеток млекопитающих химическими радиосенсибилизаторами, повышающими радиочувствительность клеток различного происхождения в 2-5 раз, не связан с нарушением самого процесса восстановления, а обусловлен, главным образом, формированием необратимых радиационных повреждений, от которых клетки не способны восстанавливаться.

5. Используя данные, опубликованные другими авторами, показано, что изменение скорости восстановления однонитевых разрывов ДНК в присутствии ингибиторов восстановления (соли цинка, дифторметилорнитин, метилглиоксаль-бис-гуанилгидразон) обусловлено как образованием большей доли необратимых повреждений, так и нарушением самих процессов репарации, выразившееся в уменьшении константы восстановления.

6. В случае использования цисплатина, дифторметилорнитина, солей никеля и камптотецина радиочувсвительность культивируемых клеток млекопитающих различного происхождения повышалась, однако при этом константа восстановления и необратимый компонент не отличались от контроля. Это означает, что по-

вышение радиочувствительности при применении этих агентов обусловлено большей вероятностью формирования первичных радиационных повреждений. 7. Подтверждены универсальные закономерности проявления синергизма при комбинированных действиях химических агентов с гипертермией - наличие оптимальной температуры для проявления максимального синергизма, а также его зависимость от концентрации препаратов - чем меньше их концентрация, тем при меньшей температуре регистрируется максимальный синергический эффект. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в изданиях, рекомендованных ВАК РФ:

1. Евстратова, Е.С. Количественное описание восстановления клеток млекопитающих после комбинированных воздействий ионизирующих излучений и химических агентов / Е.С. Евстратова // Радиационная биология. Радиоэкология. - 2012. - Т. 52. - № 3. - С. 268-275.

2. Омельченко, А.О. Проявление синергизма при одновременном воздействии гипертермии и противоопухолевых препаратов на дрожжевые клетки / А.О. Омельченко [Е.С. Евстратова, Л.Н. Комарова, Е.Н. Рыжикова] // Цитология. — 2013.-Т. 56-№2.-С. 165-169.

3. Евстратова, Е. С. Восстановление клеток от потенциально летальных повреждений после повторных воздействий ионизирующим излучением / Е. С. Евстратова, Н. М. Кабакова, В.Г. Петин // Медицинская радиология и радиационная безопасность.-2013.-Т. 58.-№5.-С. 5-10.

4. Petin, V.G. Quantitative estimation of recovery parameters after combined action of ionizing radiation and chemical agents / V.G. Petin [J.K. Kim, E.S. Evstratova, L.N. Komarova]//Int. J. Radiat. Res. -2013. - V. 11.-№1.-P. 17-27.

5. Евстратова, Е.С. Влияние цисплатина на радиочувствительность и восстановление дрожжевых клеток / Е.С. Евстратова, В.Г. Петин // Радиационная биология. Радиоэкология. - 2013. - Т. 53. - №6. - С. 598-603.

6. Omelchenko, А.О. Manifestation of synergism under simultaneous action of hyperthermia and antitumor drugs on yeast cells / A.O. Omelchenko [E.S. Evstratova, L.N. Komarova, E.N. Ryzhikova] // Cell and Tissue Biology. - 2014. - V. 8. - № 3. -P. 253-257.

7. Petin, V.G. Radiosensitivity, liquid-holding recovery and relative biologicaleffectiveness of densely-ionizing radiation after repeated irradiationof yeast cells / V.G. Petin, E.S. Evstratova, J.K. Kim // Mutation Research. - 2014. - V. 771.-P. 37-42.

Статьи в других журналах и сборниках:

1. Комарова, Л.Н. Параметры восстановления разрывов ДНК опухолевых клеток линии HeLa/ Л.Н. Комарова, Е.С. Евстратова // Сборник научных работ лауреатов конкурса имени Е.Р. Дашковой. Калуга: КГУ им. К.Э. Циолковского. -2011.-Вып. 5.-С. 36-44.

2. Евстратова, Е.С. Исследование генома различных видов микроорганизмов семейства Enterobacteriacea для одновременной их идентификации / Е.С. Евстратова // Техногенные системы и экологические риски: Материалы докладов VIII Региональной научной конференции / Под общ. ред. Г.К. Игнатенко - Обнинск: ИАТЭ. - 2011. - 4.2. - С. 15-18.

3. Омельченко, А.О., Евстратова Е.С. Оценка параметров восстановления клеток после комбинированного действия ионизирующего излучения и тяжелых металлов / А.О. Омельченко, Е.С. Евстратова // Труды 54-й научной конференции МФТИ «Проблемы фундаментальных и прикладных естественных и технических наук в современном информационном обществе». Молекулярная и биологическая физика. - 2011. - С. 127-128.

4. Евстратова, Е.С. Влияние интенсивностей факторов окружающей среды на их взаимодействие в биосфере / Е.С. Евстратова, Г.П. Жураковская, В.Г. Петин // HayKOBi npaui., Сер1я «Техногенна безпека». - 2012. - Т. 185. - Випуск 173. -С. 17-21.

5. Евстратова, Е.С. Биофизические аспекты комбинированного действия гипертермии с цисплатином / Е.С. Евстратова // Актуальные проблемы гуманитарных и естественных наук. - 2013. - Т.12. - №59. - Ч. III. - С. 30-32.

6. Пронкевич, М.Д. Радиофибия и проблема беспорогового вредного действия ионизирующего излучения / М.Д. Пронкевич, В.Г. Петин, Е.С. Евстратова // Труды регионального конкурса научных проектов в области гуманитарных наук. - 2013. - Выпуск 14. - С. 118-125.

7. Евстратова, Е.С. Закономерности одновременного действия химических препаратов и гипертермии на диплоидные дрожжевые клетки / Е.С. Евстратова, А.О. Омельченко // Актуальные проблемы гуманитарных и естественных наук. -2014,-№6-1. -С. 52-55.

8. Бабина, Д.Д. Некоторые закономерности влияния радиосенсибилизаторов на радиочувствительность клеток / Д.Д. Бабина, Е.С. Евстратова, В.Г. Петин // Международное Научное Объединение "Inter-Medical", Ежемесячный научный медицинский журнал Интер-медикал. - 2014. - №1. - С. 131-136.

Тезисы докладов:

1. Комарова, JI.H. Влияние предрадиационных условий культивирования на выживаемость и восстановление клеток / J1.H. Комарова, Е.С. Евстратова // Научная сессия НИЯУ МИФИ-2012. Аннотации докладов. В 3 томах. Т.1. Инновационные ядерные технологии. Высокие технологии в медицине. М.: НИЯУ МИФИ, 2012.-С. 268.

2. Евстратова, Е.С. Оптимизация синергического взаимодействия цисплатина и гипертермии / Е.С. Евстратова, А.О. Омельченко // БИОЛОГИЯ - НАУКА XXI ВЕКА: 16-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых (Пущино, 16-21 апреля 2012 года). - С. 310.

3. Евстратова, Е.С. Влияние интенсивностей факторов окружающей среды на их взаимодействие в биосфере / Е.С. Евстратова, Г.П. Жураковская, В.Г. Петин // Ольвшский форум - 2012: стратегш Украпни в геополггичному npocropi» : те-зи. Миколапв: Вид-во ЧДУ ím. Петра Могили, 2012. - Т. 3. - С. 23.

4. Пронкевич, М.Д. Данные о радиационном гормезисе могут служить базой для снижения радиофобии населения / М.Д. Пронкевич, Е.С. Евстратова, В.Г. Пе-тин // Техногенная система и экологический риск: Материалы докладов IX Региональной научной конференции / Под общ. ред. академика РЭА Г.К. Игна-тенко. Обнинск: ИАТЭ, 2012. - 4.1. - С. 108.

5. Евстратова, Е.С. Биофизические аспекты комбинированного действия ионизирующего излучения с радиосенсибилизаторами / Е.С. Евстратова, А.О. Омель-ченко // Экспериментальная и теоретическая биофизика '12 (Пущино, 22-24 октября 2012 года). Пущино, 2012. - С. 106-107.

6. Евстратова, Е.С. Радиочувствительность и восстановление дрожжевых клеток в присутствии цисплатина / Е.С. Евстратова // Техногенные системы и экологический риск: Тезисы докладов X Региональной научной конференции / Под общ. ред. A.A. Удаловой - Обнинск: ИАТЭ, 2013. - С. 107-109.

7. Евстратова, Е.С. Исследование радиочувствительности и восстановления дрожжевых клеток при повторных облучениях / Е.С. Евстратова, A.A. Каргина // 17-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых "БИОЛОГИЯ - НАУКА XXI ВЕКА", 21-26 апреля 2013 г, Пущино. - С. 210211.

8. Евстратова, Е.С. Синергическое взаимодействие цисплатина и ионизирующего излучения / Е.С. Евстратова // Невский радиологический форум 2013 / Под ред. H.A. Карловой. СПб.: ЭЛБИ-СПб, 2013. - С. 169.

9. Евстратова, Е.С. Биофизические аспекты комбинированного действия гипертермии совместно с цисплатином / Е.С. Евстратова // Экспериментальная и теоретическая биофизика '13. Сборник тезисов. Пущино: типография Fix Print, 2013.-С. 11-12.

10. Евстратова, Е.С. Проявление синергизма при одновременном действии гипертермии и противоопухолевого препарата цисплатина на дрожжевые клетки / Е.С. Евстратова // XXVI зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». Сборник тезисов. Москва, полиграфический участок ИБХ РАН, 2014. - С. 75.

11. Евстратова, Е.С. Исследование радиочувствительности дрожжевых клеток при комбинированном воздействии доксорубицина и ионизирующего излучения / Е.С. Евстратова, Д.Д. Бабина // Техногенная система и экологический риск: Тезисы докладов XI Региональной научной конференции / Под общ. ред. A.A. Удаловой. Обнинск: ИАТЭ, 2014. - С. 158-160.

12. Евстратова, Е.С. Закономерности взаимодействия химических препаратов с ионизирующим излучением и гипертермией / Е.С. Евстратова, А.О. Омельчен-ко // 18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых "БИОЛОГИЯ - НАУКА XXI ВЕКА". Пущино, 2014. - С. 91-92.

Заказ № 760 от 30.04.2015. Тираж 100 экз. Объём 1 п.л. Формат 60x84 'Лб. Печать офсетная.

Отпечатано в МП «Обнинская типография» 249035 Калужская обл., г. Обнинск, ул. Комарова,