Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Количественные закономерности модификаций терморадиационной чувствительности клеток инкубационными средами различной тоничности

ВАК РФ 03.00.01, Радиобиология

Автореферат диссертации по теме "Количественные закономерности модификаций терморадиационной чувствительности клеток инкубационными средами различной тоничности"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК МЕДИЦИНСКИЙ РАДИОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР

7^01 . я ЦЕ* 1,54

0 На правах рукописи

УДК 57А.92:57.029.1 +57.041.2

АНСИМОВА Наталья Семеновна

КОЛИЧЕСТВЕННЫЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ МОДИФИКАЦИЙ ТЕРМОРАДИАЦИОННОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ КЛЕТОК ИНКУБАЦИОННЫМИ СРЕДАМИ РАЗЛИЧНОЙ ТОНИЧНОСТИ

03.00.01 — радиобиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ОБНИНСК — 1998

Работа выполнена в МЕДИЦИНСКОМ РАДИОЛОГИЧЕСКОМ НАУЧНОМ ЦЕНТРЕ АКАДЕМИИ МЕДИЦИНСКИХ НАУК.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор В. Г. Петин.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Б. И.Сынзыныс; доктор медицинских наук О. К. Курпешев.

Ведущая организация: Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной радиологии и агроэкологии РАСН.

Защита состоится » 1999г. в часов

на заседании диссертационного совета 001.11.01 при Медицинском радиологическом научном центре РАМН. Отзывы на автореферат просим отправлять по адресу: 249020, Калужская обл., г. Обнинск, ул. Королева, 4, МРНЦ РАМН, диссертационный совет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Медицинского радиологического научного центра РАМН.

Автореферат разослан « 1998г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук, профессор В.Л.КУЛИКОВ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. Хорошо известно, что живые организмы постоянно подвергаются комбинированным многофакторным воздействиям. Особую актуальность эта проблема приобрела в связи с насыщением среды обитания человека и животных различными физическими и химическими агентами, синергически взаимодействующими при их одновременном или последовательном применении. К таким наиболее широкораспространенным агентам можно отнести ионизирующие излучения, термический фактор и различные химические агенты, усугубляющие комбинированное действие этих факторов.

Многообразие факторов внешней среды обуславливает необходимость изучения общих закономерностей комбинированных воздействий с целью прогностической оценки ожидаемых последствий. К настоящему времени в отечественной и зарубежной литературе накопилось достаточно много экспериментальных данных подобного рода. В то же время имеется недостаточно систематических работ, касающихся модификаций терморадиационной чувствительности клеток инкубационными средами различной тоничности.

Актуальность этой проблемы заключается в том, что гало- и гипертонические среды модифицируют в значительной степени термо- и радиочувствительность клеток при раздельном или сочетанном применении этих факторов. Важность этого направления исследования возрастает в связи с необходимостью оценки неблагоприятных последствий загрязнения окружающей среды тепловым и радиационным факторами.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Для более углубленного понимания механизма термических повреждений клеток, их репарации и защиты необходимо детально исследовать количественные закономерности модификаций тепловой и терморадиационной чувствительности клеток средами с различной тоничностью. Однако подобного рода исследования носят эпизодический характер выполнены на различных объектах и поэтому их достаточно трудно систематизировать для понимания и выявления общих закономерностей.

Целью • данной работы является установление закономерностей модификаций терморадиочувствительности клеток инкубационными, средами различной тоничности и количественное описание этих эффектов. Для выполнения этой цели необходимо было решить следующие задачи:

-установление значимости тоничности инкубационных сред в тепловой гибели и восстановлении бактериальных клеток;

- изучение влияния некоторых химических соединений на эффективность инактивации и защиты бактериальных клеток при действии гипертермии и ионизирующего излучения;

- оценка влияния повреждающего действия гипертермии в различных режимах термического воздействия, скорости прогрева и перепада температур на термоустойчивость клеток;

- исследование участия осмотического гомеостаза в тепловой радиосенсибилизации бактериальных клеток;

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Впервые показана зависимость термоинактивации бактериальных клеток и ее модификации солевыми средами от интенсивности теплового воздействия.

Показано, что в зависимости от условий инкубации, влияющих на осмотический гомеостаз бактериальных клеток, их можно как защищать, так и допоражать при тепловом воздействии. Гипертонические концентрации некоторых химических веществ, присутствовавших в момент воздействия, защищали клетки как от термо- , так и от радиационных повреждений.

Приведены оригинальные данные, демонстрирующие важность осмотического давления в проявлении влияния режима термического воздействия на чувствительность бактериальных клеток.

Получены систематические экспериментальные данные, показывающие значимость тоничности инкубационных сред в биологических последствиях отдельного и комбинированного действия радиационного и термического факторов.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. Полученные экспериментальные данные могут иметь практическую значимость для прикладной радиобиологии, медицинской и сельскохозяйственной радиологии при разработке оптимальных режимов промышленной и сельскохозяйственной терморадиостерилизации, а также для разработки эффективных режимов лучевой терапии злокачественных новообразований.

Результаты работы имеют и фундаментальное значение, поскольку дополняют современный уровень представлений о синергических взаимодействиях.

Полученные в данной диссертации новые результаты используются при чтении лекционных курсов "Экологическая биофизика" и "Сочетанные воздействия факторов окружающей сре^ы" в Обнинском институте атомной энергетики.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЬГ. Основные положения диссертации доложены на: Всесоюзном рабочем совещании по проблемам радиочувствительности хромосом (Обнинск, 1984); II Всесоюзной конференции по прикладной радиобиологии (Киев, 1985); Всесоюзной конференции "Синергизм действия ионизирующей радиации и других физических и химических факторов на биологические системы" (Пущино, 1988); I Всесоюзном радиобиологическом съезде (Пущино, 1989); научной конференции "Новое в гигиеническом нормировании неионизирующих излучений" (Ленинград, 1989); II Всесоюзном симпозиуме с

международным участием "Гипертермия в онкологии" (Минск, 1990); Всесоюзной конференции "Проблема синергизма в радиобиологии" (Пущино, 1990). По теме диссертации опубликовано 12 научных работ. Диссертация апробирована 25 мая 1998 года на научной конференции отдела исследований комбинированных воздействий МРНЦ РАМН.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Работа изложена на 160 страницах и состоит из введения; обзора литературы; описания материалов и методов исследования; главы, содержащей экспериментальные результаты; заключения и обсуждения результатов исследований; выводов и списка литературы, содержащего 211 источников, из которых 72 опубликованы на русском языке и 139 - на иностранных. Результаты работы иллюстрированы 5 таблицами и 34 рисунками.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. Закономерности термической инактивации и восстановления бактериальных клеток в зависимости от разных действующих температур и тоничности инкубационных сред.

2. Защита бактериальных клеток от термо- и радиационных повреждений гиперосмотическими растворами некоторых веществ различной природы.

3. Влияние скорости нагрева на термочувствительность клеток и ее модификация солевыми средами.

4. Значимость осмотического гомеостаза в тепловой сенсибилизации бактериальных клеток к действию ионизирующего излучения.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Основным объектом исследований в данной работе являются бактериальные клетки кишечной палочки (колибактерии) Escherichia coli термоустойчивого "дикого" штамма B/r(WP2).

Для культивирования бактерий использовали питательный бульон или косячки со стандартной плотной питательной средой (YEP). В экспериментах также использовали агаризованную среду РКА, голодный агар, жидкую среду М-9, плотную среду М-9А, растворы NaCl различной концентрации, приготовленные на 0,01 М трис-HCl или фосфатном буфере с pH 7.0. Все среды роста бактерий, растворы и буферы готовились на дистиллированной воде.

Для получения культуры в стационарной фазе роста бактерии выращивали на среде РКА в течение 18 часов при 37 "С. При переводе культуры в логарифмическую фазу роста находящиеся в стационарной фазе бактерии пересевали снова на РКА и подращивали в течение 1,5-2 часов при 37 °С.

Для теплового или радиационного воздействия клетки смывали и суспендировали в 0,01 М трис-HCl или фосфатном буфере рН7.0 с 0,9 % содержанием NaCl в концентрации 108-109 кл/мл.

Для инкубации бактерий использовали обычный лабораторный суховоздушный термостат "ТВЗ-25". Для изучения теплового воздействия суспензии клеток прогревали в стеклянных или пластиковых пробирках диаметром 10-12 мм, которые помещали в водный ультратермостат "ТА-150". Для измерения температуры образцов клеточных суспензий применяли специальный быстродействующий • 5-диапазонный электронный термометр с резистивным микротермодатчиком малой массы и теплоемкости, точность измерения которого составляла ± 0,1. °С. Для даучения действия радиации на клетки суспензии бактерий облучали, у-квантами ^Со на установке "Гаммацелл-220". Для озвучивания суспензий клеток использовали звукорой дисмембратор, модель-300, фирмы Fisher США. Оптическую плотность клеточных суспензий' определяли на фотоэлектроколориметре "ФЭК-М". Проницаемость клеток определяли путем измерения оптической плотности супернатантов клеточных суспензий на спектрофотометре) "СФ-4а", призводства ЛОМО. Супернатанты получали путем осаждения клеток из клеточных суспензий в лабораторной центрифуге "ОПн-8УХЛ4.2" с частотой вращения ротора 7000 об/мин (F,=3420g). Подсчет сформировавшихся на плотной среде макроколоний осуществляли с помощью приспособления фотоувеличителя в установке "Микрофот 5ПО-1".

При изучении особенностей тепловых повреждений и восстановления от них клеточных объектов в качестве термического воздействия был выбран нагрев клеточных суспензий при температурах 50, 52 , 54 и 60 °С.

Прогретые или облученные клеточные суспензии либо сразу разводили с учетом выживаемости и высевали на питательный агар, либо инкубировали в режиме восстановления в изотоническом 0,01 М трис-HCl или фосфатном буфере, а также в жидкой среде М-9 или питательном бульоне (в зависимости от схемы и задач эксперимента) при температуре 37 °С в течение 2-3 часов с последующим разведением суспензии изотоническим раствором NaCl (физиологический раствор) и посевом экономическим капельным методом (Морозов И.Й., 1983) в виде капель объемом 0,02 мл на Поверхность предварительно подсушенного участка плотного питательного агара (YEP) в чашки Петри, каждая из которых вмешала по 8-10 проб одновременно.

С целью изучения модифицирующего влияния растворов NaCl различной тоничности на осмоустойчивость бактерий при термическом воздействии и облучении клеточные суспензии на короткое время (15-30 с) переносили в 0,01 М трис-HCl или фосфатный буфер pH 7.0 с различной концентрацией NaCl (1-10%) или просто в дистиллированную воду с последующим разведением суспензии с учетом выживаемости при защите или допоражении

клеток, а затем высевали на питательный агар. О выживаемости клеток судили по числу сформировавшихся макроколоний после 18 часов инкубации посевов при 37 "С.

При изучении защитных свойств растворов хлористого натрия, хлористого аммония, глицерина и Сахаров от действия различных температур клеточные суспензии нагревали путем закапывания образцов клеточных суспензий в предварительно прогретые пробирки с растворами этих веществ.

Изменение транспортных свойств (проницаемость) мембран определяли по выходу из клеток во внешнюю среду (супернатант) оптически активного (поглощающего свет) при 265 нм материала.

При изучении режимов термического воздействия, повышающих эффективность повреждающего действия гипертермии на клетки бактерий (при одной и той же экспозиционной дозе) и приводящих . к снижению клеточной жизнеспособности, применялись простые и оригинальные методические приемы: резкий перепад температуры и различные скорости нагрева клеточных суспензий.

Сущность первого методического приема заключалась в следующем: специальным микрошприцем, предварительно нагретым, либо охлажденным до температуры клеточной суспензии, переносили 0,1 или 1,0 мл этой суспензии в нагретый до 60 "С физраствор объемом соответственно 9,9 или 9,0 мл. При этом исходные температуры отдельных образцов клеточной суспензии имели разные значения 0, 20, 37 и 47 "С. Тем самым создавались условия перепада температур в системе клетки - суспензионная среда при соотношении смешиваемых образцов клеточных суспензий и физраствора 1/99 и 1/9, соответственно. После термического воздействия образцы охлаждали, помещая их в воду комнатной температуры. Для снижения влияния процессов метаболизма на термоустойчивость смешанных культур клеток (делящиеся клетки термочувствительнее покоящихся) все образцы клеточной руспензии предварительно выдерживали в течение 15 мин на холоде при 0°С. С этой же целью, а также для предотвращения индукции т^рмотолерантности период прогрева клеток до промежуточных температур, т.е. до 20, 37 и 47 °С был сокращен до минимума и не превышал 5-10 с.

Особенность второго методического приема состояла в разной скорости прогрева клеточных суспензий от 2 °С до 52 °С в средах различной тоничности с последующим термическим воздействием при этой конечной температуре в течение одних и тех же промежутков времени. Нагрев и дальнейшее термическое воздействие осуществляли в ультратермостате. Время нагрева до 52 "С составляло 1 час (пробирку с клеточной суспензией ставили в водный ультратермостат и включали его нагрев), 3,5 мин (пробирку с клеточной суспензией ставили в предварительно нагретый ультратермостат) ц 35 с (клеточную суспензию закапывали в пробирку с уже прогретым физраствором), а

рассчитанные скорости нагрева составляли соответственно 0,014; 0,24 и 1,43 "С/с. После завершения термического воздействия клеточные суспензии охлаждали путем переноса пробирок в воду комнатной температуры. Повреждающее действие гипертермии, ионизирующего излучения и терморадиационного воздействия оценивали по тестам выживаемости, т.е. способности клеток образовывать видимые невооруженным глазом макроколонии и/или проницаемости клеток.

Построение кривой выживаемости, т.е. нахождение ее точек и параметров, а также их ошибок проводили с помощью общепринятых методов вариационной статистики (Бейли Н., 1964; Лакин Г.Ф., 1990). Усредняя результаты разных опытов, мы объединяли данные только тех опытов, в которых значения выживаемости были одного порядка, при этом определяли взвешенное среднее и его квадратичную ошибку по известным формулам (Урбах В.Ю., 1963; Стрелков Р.Б., 1986). Чтобы качественно обсудить сравнительные оценки параметров кривых по разности между средними сравниваемых выборок, т.е. достоверность различий сравниваемых средних величин в опыте и контроле, применялся параметрический критерий достоверности - t-критерий Стьюдента (Спиридонов В.П., Лопаткин A.A., 1970; Лакин Г.Ф., 1990). Уровень значимости, или вероятность ошибки, допускаемой при сравнительной оценке в биологических исследованиях часто считают достаточным в размере 5 % или меньше (р< 0,05).

РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Термоинактивация, восстановление клеток и их модификации солевыми средами

В этой серии экспериментов тепловое воздействие на клеточные суспензии проводили при 50, 54 и 60 "С в ультратермостате. Несинхронизированную смешанную культуру бактерий Е. coli В/г прогревали в изотоническом 0,01 М фосфатном буфере pH 7.0 и высевали на питательную среду сразу после воздействия и после 2-х часового выдерживания в режиме восстановления.

Интересная особенность, вытекающая из представленных в диссертации данных, заключается в том, что объем восстановления клеток от термоповреждений в существенной степени зависит от интенсивности нагрева, то есть от температуры. Фактор изменения дозы (ФИД), обусловленный восстановлением клеток после их выдерживания в изотоническом 0,01 М фосфатном буфере при 37 °С в течение 2-х часов и расчитанный для 10% выживаемости, составлял 1,00 для 50 "С, 2,48 для 54 °С и 1,54 для 60 °С. Это означает, что после термического воздействия при высоколетальных температурах клетки восстанавливаются более эффективно, чем после нагрева при 50 "С.

Исследование динамики восстановления от термоповреждений клеток, инактивированных при различных температурах до изоэффективного уровня (выживаемость ~ 1 %), показало, что процесс восстановления после прогрева при 54 и 60 °С продолжается, как минимум, до 2-х часов, в то время как после термического воздействия при 50 °С время восстановления ограничено 30 минутами, после чего имеет место даже некоторое снижение выживаемости клеток.

Поскольку клеточные плазматические мембраны действительно являются одними из основных мишеней, претерпевающих изменения под действием тепла, то помещение прогретых клеток в условия осмотического шока, модифицирующего мембраны, должно сопровождаться явлениями сенсибилизации выживаемости, увеличением клеточной проницаемости или вытекания биологически активных веществ из клеток.

С целью проверки этого предположения клетки после прогрева при разных температурах немедленно помещали на короткие промежутки времени (10 мин) в гипотонические (без NaCl) и гипертонические (10%-ный раствор NaCl) условия с последующим разведением суспензии с учетом ожидаемой выживаемости и посевом на изотонический питательный агар.

Необходимо отметить, что осмотические взаимоотношения между двумя растворами, разделенными полупроницаемой мембраной, которой является клеточная плазматическая мембрана, выражаются в виде тоничности или осмолярности, однако чаще для простоты пользуются термином "тоничность", называя раствор вне клетки либо изотоническим одинаковой с клеткой осмолярности), либо гипотоническим (меньшей осмолярности), либо -ипертоническим (большей осмолярности) по отношению к раствору внутри клетки, а утияние двух последних растворов на клетку - гипотоническим или гипертоническим шоком, -.оответственно.

Установлено, что в отличие от клеток, прогретых при 50 "С, выживаемость которых не менялась под действием гипо- и гипертонических шоков, выживаемость клето^, прогретых три 52 "С и 60 "С, заметно снижалась, особенно в случае помещения их в гипертонический >аствор NaCl.

Параллельно были показаны зависимости оптической плотности образцов клеточной ;успензии и супернатантов образцов суспензии клеток бактерий Е. coli В/г, подвергнутых -ермическому воздействию при 52 °С, от продолжительности термического воздействия, фичем величины этих эффектов, как и выживаемость, зависели от тоничности среды, в юторую переносили клетки после гипертермического воздействия (рис. 1).

Изменение величины клеточного осмотического набухания зависело от осмолярности реды, в которую переносили клетки после воздействия гипертермии. Так, перенос в ипотонические (кривая 2) и особенно в гипертонические (кривая 3) условия прогретых

бактерий приводил к заметно большему снижению оптической плотности клеточных суспензий (увеличению набухания и, возможно, агрегации клеток в гипертонии), чем подобный перенос в изотонические условия (кривая 1) (рис. 1, А).

100

0.5

- 0.4

.0.3

0.2

- 0.1

о Рнс. 1. Влияние продолжила тельности термического воз-5 действия на оптическую £ плотность суспензий (А) и g "супернатантов суспензий (Б)

к клеток бактерий Е. coli В/г <ч

g после воздействия гипертер-

% мии при 52 "С в изотоничес-

X

g ких условиях и последующе° го кратковременного на 1530 с переноса клеток в

0 5 10 15 20 25 30 О 5 10 15 20 25 Продолжительность термического воздействия, мин УСЛОВИЯ.

изотонические (0,9 %-ный раствор ЫаС1) (1), гипотонические (без ЫаС1) (2) и гипертонические (10 %-ный раствор №С1) (3)

В другой серии экспериментов, результы которых представлены на рис. 1 (Б), получено увеличение оптической плотности супернатантов клеточных суспензий с ростом тепловой "дозы", особенно в условиях гипотонии, в результате вытекания из прогретых клеток оптически активных при 265 нм веществ. Как видно из рис. 1 (Б), выход на плате кривой оптической плотности происходил поел; 20-ти минутной экспозиции термическогс воздействия при 52 °С. Отметим, что подобный эффект происходил уже через 4 минуть после прогрева клеток при 60 "С, а при 50 "С - имел, место только после 60-ти минутноЕ экспозиции. Вероятно, при этом происходит выравнивание осмотического давления ] системе клетка - суспензионная среда, сопровождающееся увеличением транспорта чере: плазматическую мембрану клетки в результате действия механизмов осморегуляции.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что объем и динамик; восстановления бактериальных клеток от термоповреждений зависят от интенсивност] термического воздействия: инактивация клегок при более низкой воздействующее температуре (50 °С) носила более необратимый характер, в то время как клетки инактивированные при 54 и 60 "С, в значительной степени восстанавливались о термоповреждений.

Эффективность действия кратковременного осмотического шока н термоинактивацию бактерий зависит от интенсивности термического воздействия выживаемость клеток, инактивированных при 50 "С, не модифицировалась гипо- ]

гипертоническими шоками, в то время как выживаемость клеток после действия более высоких температур (52, 60 "С) снижалась в условиях осмотического шока. Эти данные не противоречат предыдущему выводу, демонстрируя большую необратимость термоповреждений, формируемых при длительных воздействиях относительно низких температур.

Модификации клеточного восстановления после термического воздействия Представляло интерес исследовать влияние агрегатного состояния, тоничности й питательности сред, в которых выдерживались клетки после теплового воздействия, на жизнеспособность и осмоустойчивость прогретых бактериальных клеток.

На рис. 2 показана зависимость выживаемости прогретых при 52 "С в физиологическом растворе бактерий Е. со Ii Б/'г от времени их выдерживания в средах различной питательности, тоничности и агрегатного состояния..

Рис. 2. Динамика изменения выживаемости при 37 °С прогретой в изотонических условиях от 19 до 52 "С в течение 30 минут несинхронизированной смешанной культуры бактерий Е. coli В/г

(1)- в изотоническом растворе NaCl,

(2)- в жидкой среде М-9,

(3)- в бульоне,

(4)- на плотной среде М-9,

(5)- на питательном агаре,

(6)- на голодном агаре,

(7)- в дистиллированной воде,

(8)- в 10 %-ном растворе NaCl.

Все среды имеют pH 7.0

Как видно, факторы роста (пластический материал, источник энергии и микроэлементы) слабо влияли на величину клеточного восстановления. Восстановление имело место независимо от того, присутствовали ли в среде такие соединения как пептон, глюкоза, а также ионы К\ Mg2\ РОд2\ 304Н и др. Вместе с тем, восстановление проявлялось только в жидких средах: изотонический раствор ЫаС1 (1), жидкая среда М-9 (2), питательный бульон (3). На плотных агаризованных средах любого состава восстановление отсутствовало: плотная среда М-9 (4), питательный агар (5) и голодный агар (6) (рис. 2).

Продолжительность иихубацни, мин

Кроме того, другим важным условием восстановления клеток являлась тоничность среды. Восстановление происходило в изотонических средах: изотонический раствор NaCl (I), жидкая среда М-9 (2), питательный бульон (3). В гипотонической (Н20) (7) и гипертонической (10%-ный раствор NaCI) (8) средах восстановление полностью подавлялось. При этом имело место допоражение клеток, особенно выраженное в случае выдерживания их в гипертонической среде (рис. 2).

Следовательно, бактерии /:'. coli В/г в процессе восстановления от тепловых повреждений не нуждаются в поступлении извне ни источников энергии, ни пластического материала и микроэлементов, что согласуется с данными работы (Hurst А., 1984). В то же время совершенно необходимым условием для восстановления бактерий от термоповреждений является жидкий нормотонический характер сред, в которых происходит восстановление.

Зашита клеток от термо- и радиационных повреждений средами с различной осмолярностью

Описанные выше экспериментальные данные о зависимости термочувствительности и способности к восстановлению клеток микроорганизмов от воздействующей температуры свидетельствуют о большей обратимости повреждений после более интенсивного термического воздействия. С учетом этих данных можно ожидать, что после воздействия гипертермии при более высокой температуре защита клеток от термических повреждений будет эффективней.

С целью проверки этого предположения были проведены опыты, где в качестве фактора защиты жизнеспособности клеток бактерий от термических повреждений, индуцированных теплом при низколетальной и высоколетальной температурах, были использованы различные концентрации хлористого натрия. На рис. 3 представлена зависимость выживаемости бактерий Е. coli В/т, подвергнутых термическому воздействию при 50 и 60 °С, от количества хлористого натрия, добавленного к клеточной суспензии перед прогревом.

Как видно из рис. 3 (А), в обоих вариантах используемых температур, также как и в случае с экспериментами по восстановлению бактерий, эффективность защиты клеток зависела от интенсивности термического воздействия, при этом величина защитного действия NaCl была большей в процессе нагрева при 60 "С, чем при 50 "С. Так, выживаемость после действия 60 °С увеличивалась в 200 раз, в то время как после 50 °С выживаемость клеток возрастала лишь в 5 раз. Максимум защитного действия NaCl при воздействии температурой 50 °С соответствует ~ 4-6 %-ной концентрации, в то время как для температуры 60 °С - лежит в области концентраций - 6-8 %. Стоит также отметить, что при

Золее высокой концентрации КаС1 (> 6 %) эффективность защитного действия поваренной :оли прогрессивно снижалась.

Рис. 3. Защитное влияние различных концентраций хлористого натрия в процентах (%) (А) или в единицах осмолярнос-ти (мосмоль/л) (Б) на жизнеспособность бактерий Е. coli В/г, подвергнутых термическому воздействию в присутствии NaCl

(1) при 50 °С в течение 3-х часов, о 4 8 12 16 20 о 5 ю 15 20 25 зо 35xioJ (2) при 60 °С в течение 60 с

Концентрация Осиолирность

хлористого натрия, % хлористого натрия, космоль/л

В работе исследовали влияние растворов NaCl (от 0 до 10%) на чувствительность бактерий Е. coli В/г к у-квантам ь0Со и гипертермии (52 °С). Выживаемость облученных клеток изменялась в 3,8 раза, а выживаемость прогретых при 52 °С - в 380 раз. Установлено, что в отличие от интактных бактерий, жизнеспособность облученных или подвергнутых термическому воздействию клеток зависела^ не только от концентрации NaCl в суспензионной среде, но "также от времени добавления этого соединения к суспензиям клеток. При переносе клеток в неизотонические растворы хлористого натрия после термического воздействия (52 °С) защиты клеток практически не наблюдалось.

Следовательно, эффективность защиты поваренной солью бактериальных клеток от термоповреждений была более выраженной при действии 52 "С, чем при 50 °С, 60 °С и наименее эффективна при облучении ионизирующей радиацией, причем эффект защиты проявлялся в присутствовие NaCl в момент воздействия.

Представляло интерес исследовать, является ли поваренная соль NaCl уникальным соединением, изменяющим терморезистентность клеток бактерий. В этой связи, по аналогии с хлористым натрием, в работе исследовали осмотически активное вещество - многоатомный спирт глицерин. Так защитное действие растворов глицерина во время термического воздействия при 60 °С проявляется в области более высоких концентраций (50 %), чем при 50 °С (10-30 %), причем концентрации глицерина, проявляющие защитное действие, заметно превышали концентрации хлористого натрия. Величина защитного эффекта глицерина оставалась примерно одинаковой при гипертермическом воздействии 50 и 60 "С. Необходимо отметить, что глицерин в малых концентрациях (до 2 %), а также при высоких

концентрациях глицерина > 50 % (при 60 °С) и > 30 % (при 50 °С) проявлял не защитное, а допоражающее действие на клетки.

В диссертации исследовано влияние растворов осмотически активных соединений, а именно хлористого аммония, глицерина, сахарозы и глюкозы, на чувствительность бактерий Е. coli В/г к гипертермии (52 °С). Как следует из полученных данных, все перечисленные выше вещества: соли, многоатомный спирт ц сахара в определенных концентрациях повышали выживаемость клеток бактерий после термического воздействия (52 °С), добавленные к клеточным суспензиям перед термическим воздействием.

Итак, все используемые нами соединения с различным осмотическим давлением растворов, несмотря на их химическое различие, в определенных концентрациях защищали клетки бактерий от термических и радиационных (NaCl) повреждений или допоражали (NaCI) в зависимости от времени добавления веществ к клеточным суспензиям. Общим для всех этих соединений было то, что защитный эффект проявлялся только при гипертонических концентрациях их растворов по отношению к изоосмотичности клетки. Этот факт свидетельствует о том, что в основе термозащитного действия солей, углеводов, глицерина лежит, по-видимому, единый механизм, связанный с поддержанием системы клеточного осмотического гомеостаза.

Термическое воздействие с разными скоростями и осмотический гомеостаз клеток

Осмотический гомеостаз любой биологической системы, в том числе и живой клетки, поддерживается действующими механизмами осморегуляции. Регуляция ионного состава и содержания воды; поддержание осмотического давления, зависящего от количественного соотношения между растворенными веществами и растворителем - водой, а также объема жидкостей организма на стабильном'уровне называется осморегуляцией.

Осморегуляция - это гомеостатический механизм, присущий клеткам животных и микроорганизмов, обеспечивающий постоянство концентрации растворенных осмотически активных веществ или ионов в жидкостях внутренней среды, т.е. в цитоплазме клетки при изменении концентрации растворенных веществ в жидкостях внешней среды. Термин "осморегуляция" означает не просто регуляцию, водного баланса в организме, а регуляцию состава внутренних жидких сред организма, которые представляют собой растворы различной сложности.

Понятие осморегуляции неразрывно связано с понятием клеточной проницаемости, которое вмещает в себя реальное перемещение определенных молекул или ионов растворенных веществ через мембрану живой клетки, проявляющую в этом отношении избирательность, зависящую от природы и физиологии клеток про- и эукариотов, в частности от строения их мембран. Все Мембраны организма, включая плазмалемму

(клеточную, или плазматическую, мембрану), слои цитоплазмы способны действовать как полупроницаемые мембраны, через которые мог>т проходить вода и растворенные вещества.

Из вышесказанного логически вытекает предположение, что в клетке под влиянием повышенных (нефизиологических) температур происходит нарушение клеточной проницаемости, которое является одним из показателей дестабилизации ее осмотического гомеостаза. Как считают, в основе этого влияния лежит тепловое повреждение липидных и/или белковых компонентов клеточных мембран (Волков Е.И., Полежаев A.A., 1983).

Тогда целью нашей следующей серии экспериментов является установление значения осмотического гомеостаза в тепловой гибели клеток, что и продемонстрировано в диссертационной работе. Было показано, что термоустойчивость клеток бактерий в значительной степени зависела от режима термического воздействия, в частности от величины перепада температуры при термическом воздействии в системе клетка - нагретый физраствор. Причем, чем резче был перепад температуры (0-60) °С, по сравнению с менеее резкими перепадами (20-60) "С, (37-60) "С и (47-60) "С, тем более чувствительными были клетки к нагреву при соотношении смешивания клеточной суспензии и физраствора 1/99.

Интересные данные были получены при изучении влияния скорости прогрева на выживаемость бактерий. На рис. 4 нанесены кривые выживаемости бактерий Е. coli В/г после термического воздействия (52 °С) при прогреве с разными скоростями от 2 "С до 52 "С в 0,01 М трис-буфере pH 7.0 без NaGl -, кривые 1, 2,3 и с добавлением NaCl (6 %-й раствор) -кривые 4, 5,6.

Продолжительность термического воздействия, мин 0 Ю 20 'ЪО 40 50 60

Рис. 4. Влияние продолжительности термического воздействия при 52 "С в 0,01 М трис-буфере, pH 7.0 на выживаемость бактерий Е. coli В/г, прогретых от 2 до 52 °С с разными скоростями:

(2, 5) - средняя скорость прогрева

(1,4)- средняя скорость прогрева

в течение 35 с; 3,5 мин и 1 часа,

(3, 6) - средняя скорость прогрева

соответственно

0,24 °С/с;

0,014 "С/с

1,43 "С/с;

0,01

Важно отметить, что перед основным термическим воздействием при 52 "С клетки прогревались от 2 до 52 "С в течение разных промежутков времени и рассчитанные средние скорости составляли при этом разные значения (рис. 4). В течение прогрева до 52 "С выживаемость клеток контролировалась и не отличалась от выживаемости интактных клеток.

Как видно, гибель клеток в 0,01 М трис-буфере зависела от скорости прогрева. При этом, чем выше была скорость прогрева, тем сильнее проявлялось повреждающее действие гипертермии, хотя интегральная экспозиционная "доза" была ниже. Необходимо отметить, что термическое воздействие в этих опытах специально проводили в гипотонических условиях (кривые 1,2,3), чтобы подчеркнуть большее различие в термочувствительности клеток, нагреваемых до анализируемой температуры воздействия с разными скоростями прогрева. Использование же гипертонических условий при воздействии (6 %-ный раствор NaCl) нивелировало все эти различия (кривые 4, 5, 6), причем имело место явление солевой защиты выживаемости (рис. 4). В этом случае гипертонические условия внешней по отношению к клеткам среды создавали повышенное осмотическое давление на клетку, препятствовавшее проявлению инактивирующего действия избыточного внутриклеточного давления, которое усиливалось с увеличением скорости прогрева при термическом воздействии. Благодаря этому, термический гипотонический шок, усиленный нами бессолевой средой (кривые 1,2,3) предотвращался, выживаемость клеток увеличивалась (кривые 4, 5,6) и уже не зависела от скорости прогрева (рис. 4).

Таким образом, можно сделать вывод, что термочувствителыюсть клеток Е. coli В/г зависит от режима термического воздействия. Увеличение скорости прогрева, а также резкие перепады температуры термического воздействия увеличивают поражаемость клеток по тестам жизнеспособности клеток и вытекания биологически значимых для клетки веществ, причем эти эффекты подвергаются модификациям при изменении тоничности суспензионных сред.

Осмотический гомеостаз клеток при терморадиационном воздействии

Как принято считать, одной из ведущих причин синергизма при терморадиационном воздействии является нарушение процессов восстановления ДНК вследствие прямого влияния температуры и/или радиации либо на генетический аппарат клеток, либо на мембраны и мембраносвязанные ферменты репарации. Нарушение функций мембран и мембраносвязанных ферментов может быть также обусловлено и термической дестабилизацией осмотического гомеостаза клеток.

Высказанное допущение базируется на том факте, что состав содержимого клеток и окружающей их суспензионной среды (физиологические, рингеровские и др. растворы), как

правило, является различным. В состав суспензионных сред входят сильные электролиты с константой электролитической диссоциации, близкой к единице независимо от температурных условий. Клетки же содержат наряду с сильными электролитами и такие слабые полиэлектролиты, как белки, аминокислоты, нуклеокислоты и др. полимерные соединения, константа электролитической диссоциации которых возрастает с увеличением температуры раствора. Отсюда следует, что с ростом температуры клеточной суспензии осмотическое давление внутри клеток будет увеличиваться быстрее, нежели давление суспензионной среды. В итоге клетки подвергнутся действию гипотонического стресса, величина которого будет тем существеннее, чем с большей скоростью будет осуществляться прогрев и чем выше будет перепад температуры при термическом воздействии.

В результате этого нормальная клеточная физиология будет нарушена со всеми вытекающими отсюда последствиями, в том числе и деформацией структурно-функционального статуса мембран и мембраносвязанных ферментов репарации ДНК, а также потерей клетками во внешнюю среду этих ферментов.

Если это предположение верно, то следует ожидать, что при сочетанном воздействии на клетки гипертермии и ионизирующего излучения в условиях, при которых мембраны испытывают напряжение, будет изменяться терморадиоустойчивость клеток, а также величина эффекта синергизма.

Целью данного эксперимента явилась оценка значимости влияния состояния системы осмотического гомеостаза (в условиях гипотонического или гипертонического шоков) на терморадиоустойчивость и величину синергизма терморадиационного воздействия на делящиеся клетки бактерий F.. coli В г, облученные у-квантами б0Со в дозе 40 Гр и подвергнутые термическому воздействию при 50 "С в растворах NaCl различной концентрации при одновременном действии этих повреждающих факторов (рис. 5).

Из рисунка видно, что гипертонические растворы NaCl (от 2 до 6 %) защищали клетки от одновременного действия гипертермии и ионизирующего излучения по сравнению с эффективностью действия этих агентов в изотонических условиях. В то же время гипотонический раствор (0,1 %-ый -раствор NaCl) сенсибилизировал клетки к одновременному применению этих факторов. Показано также заметное снижение величины синергизма с ростом концентрации NaCl в клеточной суспензии в процессе одновременного комбинированного воздействия ионизирующего излучения и гипертермии»примерно от 2,8 (0,1 % NaCl) до 1,1 (6% NaCl) (рис.-5). При этом коэффициент синергизма рассчитывали отношением изоэффективных доз (доз, вызывающих одинаковый биологический эффект) при аддитивном сложении эффектов от каждого агента к дозе после комбинированного воздействия используемых повреждающих факторов.

0,1

0,01

Доза облучения, Гр. 40 0 _ _ 40 0

\ ч \ \ \ ч \ 1 \ Ч \ \ 4 О. \ ч \ ч \ ч" 0,9% \ 4% \

\ 0,1%

\ юо • 1 \ О 2 \ ®3 \ 10 ч

6%

Рис. 5. Выживаемость делящихся клеток Е. coli В/г, облученных у-квантами 60Со в дозе 40 Гр (1), прогретых при 50 °С в течение 10 минут (2), подвергнутых комбинированному одновременному действию ионизирующего излучения и гипертермии (3) в суспензионной среде с различной концентрацией NaCl (0,1; 0,9; 2; 4 и 6 %).

Пунктирные линии - теоретически ожидаемые кривые выживаемости при аддитивном сложении эффектов от действия указанных повреждающих факторов

10 О 10 О 10

Продолжительность терморалиационпого воздействия, мин

Были также проведены эксперименты с целью изучения комбинированного послеповательного терморадиационного воздействия (гипертермия - 5 мин при 52 °С, затем у-кванты 60Со, мощность дозы 4 Гр/мин) на жизнеспособность делящихся клеток бактерий Е. coli В/г в условиях изотонии (0,9 %-й раствор NaCl) и гипертонии (6 %-й раствор NaCl) (рис. 6).

Доза облучения, Гр

20 40 60 80 100

! 10

\ ^ FttrM

i \ 1 : \ : 1 1

Б i i i i i ...

Рис. 6. Влияние последовательного комбинированного терморадиационного воздействия (гипертермия при 52 "С в течение 5 минут, затем ионизирующее излучение у-квантами 60Со) (1,2)

на выживаемость бактерий Е. coli В/г:

делящихся

"А" - в условиях изотонии (0,9 %-

ный раствор NaCl), "Б" - в условиях гипертонии (6 %-ный раствор NaCl)

Из рисунка видно, что хлористый натрий в концентрации 6 % подавлял тепловую радиосенсибилизацию делящихся бактерий Е. coli В/г. Сравнивая кривые 1 и 3 с кривыми 2 и

I на тгом рисунке, отчетливо видно ослабление синергического влияния последовательной тепловой радиосенсибилизации делящихся клеток Ii. coli Ii г в условиях гипертонического лока. Кривые 3 и 4 (рис. 6) - кривые выживаемости делящихся бактерий /:'. coli В г после облучения только у-квантами ''"Со в изотонических (кривая 3) и гипертонических (кривая 4) »словиях приведены для подсчета коэффициента синергизма, который снижается :оответственно с 5,1 до 2,3.

Итак, величина тепловой радиосенсибилизации бактерий /:'. coli В г зависела от гоним ности среды, в которой происходило воздействие гипертермии и ионизирующего излучения на клетки: гипотоническая солевая среда увеличивала эффект синергизма, изо- и гипертонические - снижали величину тепловой радиосенсибилизации вплоть до защиты клеток от комбинированного терморадиационного воздействия.

Полученные данные и предложенная на их основе концепция о роли осмотического гомеостаза в проявлении синергизма при одновременном или последовательном действии гипертермии и ионизирующего излучения дополняют и расширяют существующие в настоящее время представления о природе терморадиационного синергизма. Кроме того, они подтверждают предположение о существенном вкладе повреждений мембран в радиационные и тепловые биоэффекты, что позволяет их более целенаправленно усиливать или ослаблять, а также свидетельствуют о необходимости учета фактора тоничности среды в оценке ожидаемых результатов и. возможности их прогноза при комбинированных воздействиях.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Совокупность представленных в диссертации данных показывает, что гипертермия и радиация вызывают в клетках прокариотов повреждения, последствия которых удается как усилить, так и ослабить путем восстановления или защиты. Показано, что величина "модификации термических повреждений бактерий зависит от интенсивности термического воздействия и условий их культивирования, а также от осмотических условий, в которых клетки подвергаются воздействию гипертермии и/или ионизирующего излучения.

Рассматривая представленную работу в целом, можно отметить ряд впервые полученных неординарных данных,'. а именно: обратимость клеточных повреждений существенно выше после более интенсивного термического воздействия на клетки и определяется, в значительной степени, тоничностью инкубационной среды воздействия и/или восстановления.

Совокупность полученных новых экспериментальных данных и сравнительный их анализ с данными литературы свидетельствует о том, что одной из причин термической гибели клеток, а также комбинированного терморадиационного воздействия является

повреждение плазматических мембран. Эти повреждения могут быть обусловлены как прямым действием гипертермии на компоненты мембран, так и косвенным влиянием на них посредством осмотического стресса, вследствие непропорционального изменения соотношения внутри- и внеклеточного содержимого, а следовательно осмотического давления в нарушенных температурных условиях. В результате происходит дестабилизация осмотического гомеостаза клеток, приводящая к изменению структуры и/или функций плазматических мембран и в конечном результате к снижению клеточной жизнеспособности. Поскольку клеточные мембраны являются ключевым звеном в цепи метаболизма, их повреждение может вызвать и ряд других, несовместимых с нормальной жизнедеятельностью клетки последствий. Это не исключает вероятность участия в наблюдаемой феноменологии повреждения и других структур, например, цитоскелета клетки, или функций клеток, в том числе синтеза стрессовых тепловых белков.

Полученные данные и их интерпретация могут быть полезны в области радиобиотехнологии, промышленной стерилизации, а также при разработке эффективных режимов термического воздействия на злокачественные новообразования.

ВЫВОДЫ

1. Объем и динамика' восстановления бактерий Е. coli В/г от термоповреждений зависят от интенсивности термического воздействия: инактивация клеток при более низкой воздействующей температуре (50 °С) носила более необратимый характер, в то время как клетки, инактивированные при 54 и 60 °С, в значительной степени восстанавливались от термоповреждений.

2. Эффективность инакгивирующего действия кратковременного осмотического шока, воздействующего после термической обработки бактерий Е. coli В/т, зависит от интенсивности термического воздействия: выживаемость клеток, инактивированных при 50 °С, не модифицировалась гипо- и гипертоническими шоками, в то время как выживаемость клеток после действия более высоких температур (52, 60 °С) снижалась в условиях осмотических шоков.

3. Условия выдерживания батерий Е. coli В/т в период сразу после теплового воздействия приводят как к восстановлению клеток от термоповреждений, так и к их допоражению. Восстановление происходило в изотонических жидких средах и отсутствовало на агаризованных, а также в гипо- и гипертонической средах.

4. Защита бактериальных клеток Е. coli В/т гипертоническими растворами NaCl, присутствовавшими в момент гипертермического воздействия, была более эффективна при 60 °С, чем при 50 °С. Гипертонические растворы NaCl, присутствовавшие в момент облучения, защищали бактериальные клетки также и от действия ионизирующего излучения.

'акт, что некоторые соединения (NaCl, NH4CI, сахароза, глюкоза и глицерин) защищают актерии от термических и радиационных повреждений в гипертонических концентрациях аидетельствует о том, что в основе радио- и термозащигного действия этих соединений ожет лежать механизм, связанный с поддержанием клеточного осмотического гомеостаза.

5. Термочувствительность клеток бактерий Е. coli В/г зависит от режима термического »действия: увеличение скорости прогрева, а также резкие перепады температуры ;рмического воздействия увеличивают поражаемость клеток по -тестам жизнеспособности и ;иления проницаемости (транспортных свойств). Гипертонические условия при ;рмовоздействии с разными скоростями прогрева защищали клетки от термоповреждений и «елировали влияние скорости прогрева на термоинактивацию клеток.

6. Величина тепловой радиосенсибилизации клеток Е. coli В/г зависела от тоничности >еды, в которой происходило воздействйе' гипертермии и ионизирующего излучения на 1етки: гипотоническая солевая среда увеличивала эффект синергизма, изо- и шертонические - снижали величину тепловой радиосенсибилизации вплоть до защиты 1еток от комбинированного воздействия тепла и радиации. Следовательно, осмотический меостаз клеток может иметь значение в проявлении эффекта синергизма при мбинированных терморадиационных воздействиях.

РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Морозов И.И., Ансимова Н.С., Дергачева И.П. О роли мембран в тепловой диосенсибилизации клеток // Радиация и организм. Комбинированное действие низирующих излучений и других физических факторов среды: Матер. Всесоюз. раб. вещ. - Обнинск, 1984. - С. 54-56

2. Морозов И.И., Дергачева,|И.П., Ансимова Н.С. Влияние некоторых химических гдинений на эффективность радио- и тепловой стерилизации сред / И Всесоюз. конфер. по икладной радиобиологии: Тез. докл. - Киев, 1985. - Т. 111. - С. 30-31

3. Морозов И.И., Дергачева И.П., Ансимова Н.С. Влияние осмотического шока на □неспособность, оптическую плотность И проницаемость прогретых клеток Е. coli SI жробиология. - 1986. - Т. 55, № 2. - С. 278-281

4. Морозов И.И., Дергачева И.П., Ансимова Н.С. Роль мембран в чувствительности шх и мутантных штаммов Е. coli к повреждающему действию излучений и других кторов // Инф. бюлл. Науч. Совета по пробл. радиобиол. АН СССР. - 1986. - № 32. - С. 121

5. Морозов И.И., Дергачева И.П., Ансимова Н.С. Влияние у-квантов 60Со и других кторов на жизнеспособность и мутагенез делящихся и покоящихся бактерий // Инф. бюлл. уч. Совета по пробл. радиобиол. АН СССР. - 1986. - № 32. - С. 122

6. Морозов И.И., Ансимова Н.С. Осмотический гомеостаз ] терморадиоустойчивость клеток // Синергизм действия ионизирующей радиации и друга: физических и химических факторов на биологические системы: Тез. докл. Всесоюз. конфер

- Пущино, 1988. - С. 35

7. Морозов И.И., Дергачева И.П., Ансимова Н.С. О роли тоничности среды в теплово! радиосенсибилизации клеток // Синергизм действия ионизирующей радиации и другиз физических и химических факторов на биологические системы: Тез. докл. Всесоюз. конфер -Пущино, 1988.-С. 35-36'

8. Морозов И.И., Ансимова Н.С., Дергачева И.П. Осмотический гомеостаз пр! терморадиационных воздействиях /1 Всесоюз. радиобиол. съезд: Тез. докл. - Пущино, 1989. Т. II. - С. 363-364 .

9. Морозов И.И., Дергачева И.П., Ансимова Н.С. Осмотический гомеостаз I модификация устойчивости клеток к микроволнам тепловой интенсивности // Новое 1 гигиеническом нормировании неионизирующих излучений: Тез. докл. научно! конференции. - Л., 1989. - С. 48

10. Морозов И.И., Дергачева И.П., Ансимова Н.С. Особенности бйологическогс действия микроволн тепловой интенсивности // Новое в гигиеническом нормированш неионизирующих излучений: Тез. докл. научной конференции. - Д., 1989. - С. 46-47

П.Морозов И.И., Дергачева И.П., Ансимова Н.С. Влияние режима нагрева н; термоустойчивость клеток // Гипертермия в онкологии: Тез. докл. II Всесоюз. симпоз. < международ, участ., Минск. - Обнинск,'1990. - Т. II, - С. 27-28

12. Морозов И.И., Ансимова Н.С., Дергачева И.П., Петин В.Г. Осмотический гомеоста: и терморадиоустойчивость клеток при комбинированных воздействиях // Проблем! синергизма в радиобиологии: Материалы Всес. конфер. - Пущино, 1990. - С. 102-112

РАБОТЫ, НАХОДЯЩИЕСЯ В ПЕЧАТИ:

1. Морозов И.И., Дергачева И.П., Ансимова Н.С., Морозова Г.В., Петин В.Г Особенности осмотической модификации клеточных последствий нагрева при разны? температурах // Цитология. - 1998. - в печати.

2. Ансимова Н.С., Морозов И.И., Петин В.Г. Тепловая радиосенсибилизацш бактериальных клеток и тоничность среды // Радиационная биология. Радиоэкология. - 1998

- в печати.

Заказ 1977 Формат 60x84 1/16 Бумага картографическая Печать офсетная Объём 1 п. л. Тираж 100.

Отпечатано в Обнинской городской типографии 249020, г. Обнинск, ул. Комарова, 6.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ансимова, Наталья Семеновна, Обнинск

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК МЕДИЦИНСКИЙ РАДИОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР

На правах рукописи

АНСИМОВА НАТАЛЬЯ СЕМЕНОВНА

КОЛИЧЕСТВЕННЫЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ МОДИФИКАЦИЙ ТЕРМОРАДИАЦИОННОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ КЛЕТОК ИНКУБАЦИОННЫМИ СРЕДАМИ РАЗЛИЧНОЙ ТОНИЧНОСТИ

кс^

03.00.01 - радиобиология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук,

В.Г. Петин

ОБНИНСК - 1998 г.

СОДЕРЖАНИЕ

Стр.

ВЕДЕНИЕ......................................................4

Глава 1. СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О МЕХАНИЗМАХ МОДИФИКАЦИИ ТЕПЛОВОЙ И РАДИАЦИОННОЙ ИНАКТИВАЦИИ КЛЕТОК..................................8

1.1. Особенности инактивации клеток при комбинированных воздействиях......................8

1.2. Молекулярно-клеточные аспекты термо- и радиочувствительности клеток..........................15

1.3. Нарушение проницаемости клеточных мембран под действием гипертермии............................21

1.4. Влияние сред с различным осмотическим давлением на термочувствительность клеток........2 6

1.5. Постановка целей и задач данной работы...........33

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.................................36

2.1. Объекты исследования.............................36

2.2. Источники воздействия и используемая аппаратура.......................................39

2.3. Методы исследования..............................3 9

2.4. Кривые выживаемости..............................43

2.5. Статистическая обработка полученных результатов......................'................45

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ..........47

3.1. Зависимость от интенсивности термического воздействия инактивации и восстановления клеток и их модификации солевыми средами.........47

3.2. Устойчивость и способность к восстановлению

делящихся и покоящихся клеток после воздействия гипертермии, ионизирующего излучения, ультразвука и осмотических шоков......65

3.3. Модификации клеточного восстановления после термического воздействия на бактерии Е. coli средами разной тоничности и агрегатного состояния........................................7 9

3.4. Защита клеток от повреждений, вызванных гипертермией и ионизирующим излучением, средами с различной осмолярностью................84

3.5. Термическое воздействие с разными скоростями прогрева и осмотический гомеостаз клеток.........95

3.6. Значение осмотического гомеостаза для клеток

при терморадиационном воздействии...............110

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ И ЗАКЛЮЧЕНИЕ...........119

ВЫВОДЫ.....................................................132

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ..........................................134

ВВЕДЕНИЕ

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. Хорошо известно, что живые организмы постоянно подвергаются комбинированным

многофакторным воздействиям. Особую актуальность эта проблема приобрела в связи с насыщением среды обитания человека и животных различными физическими и химическими агентами, синергически взаимодействующими при их одновременном или последовательном применении. К таким наиболее

широкораспространенным агентам можно отнести ионизирующие излучения, термический фактор и различные химические агенты, усугубляющие комбинированное действие этих факторов. Многообразие факторов внешней среды обуславливает необходимость изучения общих закономерностей комбинированных воздействий с целью прогностической оценки ожидаемых последствий. К настоящему времени в отечественной и зарубежной литературе накопилось достаточно много экспериментальных данных подобного рода. В то же время имеется недостаточно систематических работ, касающихся модификаций

терморадиационной чувствительности клеток инкубационными средами различной тоничности. Актуальность этой проблемы заключается в том, что гипо- и гипертонические среды модифицируют в значительной степени термо- и

радиочувствительность клеток при раздельном или сочетанном применении этих факторов. Важность этого направления исследования возрастает в связи с необходимостью оценки неблагоприятных последствий загрязнения окружающей среды этими факторами.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Целью данной работы являлось установление закономерностей модификаций терморадиационной чувствительности клеток инкубационными средами различной тоничности.

В связи с поставленной целью следует решить следующие задачи:

- изучить влияние некоторых химических соединений на эффективность инактивации и защиты бактериальных клеток при действии гипертермии и ионизирующего излучения;

- оценить влияние повреждающего действия гипертермии в различных режимах термического воздействия, скорости прогрева и перепада температур на термоустойчивость клеток;

- установить значимость тоничности инкубационных сред в тепловой гибели и защите от нее бактериальных клеток;

- исследовать участие осмотического гомеостаза в тепловой радиосенсибилизации бактериальных клеток;, ¡у

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Впервые показана зависимость термоинактивации бактериальных клеток и ее модификации N солевыми средами от/интенсивности теплового воздействия. /

Показано, что в зависимости от условий инкубации, влияющих на осмотический гомеостаз бактериальных клеток, их можно как защищать, так и допоражать при тепловом воздействии. Гипертонические концентрации некоторых химических веществ, присутствовавших в момент воздействия, защищали клетки как от термо- , так и от радиационных повреждений.

Приведены оригинальные данные, демонстрирующие важность ; осмотического давления в проявлении влияния режима термического воздействия на чувствительность бактериальных клеток.

Получены систематические экспериментальные данные, показывающие значимость тоничности инкубационных сред в биологических последствиях отдельного и комбинированного действия радиационного и термического факторов.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. Полученные

экспериментальные данные могут иметь практическую значимость для прикладной радиобиологии, медицинской и

сельскохозяйственной радиологии при разработке оптимальных режимов промышленной и сельскохозяйственной

терморадиостерилизации, а также для разработки эффективных режимов лучевой терапии злокачественных новообразований. Результаты работы имеют и фундаментальное значение, поскольку дополняют современный уровень представлений о синергических взаимодействиях.

Полученные в данной диссертации новые результаты используются при чтении лекционных курсов "Экологическая биофизика" и "Сочетанные воздействия факторов окружающей среды" в Обнинском институте атомной энергетики.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Основные положения диссертации доложены на: Всесоюзном рабочем совещании по проблемам радиочувствительности хромосом (Обнинск, 1984); II Всесоюзной конференции по прикладной радиобиологии (Киев, 1985); Всесоюзной конференции "Синергизм действия ионизирующей радиации и других физических и химических факторов на биологические системы" (Пущино, 1988); I Всесоюзном радиобиологическом съезде (Пущино, 1989); научной конференции "Новое в гигиеническом нормировании неионизируюпщх излучений" (Ленинград, 1989); II Всесоюзном симпозиуме с международным участием "Гипертермия в онкологии" (Минск, 1990); Всесоюзной

конференции "Проблема синергизма в радиобиологии" (Пущино, 1990) . Основные результаты диссертации опубликованы также в статьях: Морозов И.И., Ансимова Н.С., Дергачева И.П., 1984; Морозов И.И., Дергачева И.П., Ансимова Н.С., 1986;

Морозов И.И., Ансимова Н.С., Дергачева И.П., Петин В.Г., 1990.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Работа изложена на 160 страницах и состоит из введения; обзора литературы; описания материалов и методов исследования; главы, содержащей экспериментальные результаты; заключения и обсуждения результатов исследований; выводов- и списка литературы, содержащего 211 источников, из которых 72 опубликованы на русском языке и 139 - на иностранных. Результаты работы

иллюстрированы 5 таблицами и 34 рисунками.

Г 9

И], ^ _ р

Глава 1. СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О МЕХАНИЗМАХ МОДИФИКАЦИЙ ТЕПЛОВОЙ И РАДИАЦИОННОЙ ИНАКТИВАЦИИ КЛЕТОК

В этой главе будут проанализированы описанные в литературе данные об особенностях проявления биологических эффектов, их значимости при комбинированных воздействиях и влиянии сред с различным осмотическим давлением на термо- и

радиочувствительность клеток при комбинированных воздействиях. Будут рассмотрены также молекулярно-клеточные аспекты термо- и радиоустойчивости клеток и механизмы их модификации. В результате анализа будут сформулированы основные направления исследований данной работы.

1.1. Особенности инактивации клеток при комбинированных

воздействиях

Жйвые организмы в окружающей среде постоянно подвергаются воздействию целого комплекса факторов. Развитие атомной промышленности, использование ядерной энергии, истощение озонового слоя планеты, приводящее к увеличению потока ультрафиолетового света, внедрение разнообразных химических веществ в виде лекарственных препаратов, пищевых добавок, пестицидов, промышленных соединений насыщают среду обитания человека и животных различными физическими и химическими агентами, оказывающими на них биологическое действие. Все эти факторы могут встречаться в комбинации или действовать одновременно на биосферу и тем самым вызывать усиление летального, мутационного эффектов, а также увеличение числа онкологических заболеваний.

Особенности проявления инактивации клеток при комбинированных воздействиях удобно проанализировать на комбинированном действии ионизирующего излучения и гипертермии, закономерности проявления которых достаточно хорошо и тщательно изучены в эксперименте и клинике (Ярмоненко С.П. и др., 1976, 1992; Петин В.Г., 1977; Streffer С. et al., 1978, 1990; Курпешев O.K., Коноплянников А.Г., 1981; Комаров В.П., 1983;

Коноплянников А.Г., Деденков А.Н., 1984).

Гипертермическое воздействие является одним из наиболее известных физических факторов, повышающих

радиочувствительность клеток. Хотя первые попытки

использования нагревания для лечения опухолей относится к концу 19-го - началу 20-го века (Dietzel F., 1975), систематическое изучение и значительное внимание к этому факту возникло недавно, благодаря, с одной стороны, обнаружению синергического взаимодействия повреждений, индуцированных гипертермией и ионизирующим излучением в различных клеточных системах и опухолях животных, а, с другой стороны, благодаря разработке способов формирования контролируемого локального нагревания опухолей (Streffer С. et al., 197 8; Dethlefsen L.A., Dewey W.С., 1982).

Повышенное внимание и интерес к исследованию гипертермии на различных уровнях организации, начиная от молекулярного и кончая организменным, обусловлен большим числом наблюдений, наиболее важные из которых можно суммировать следующим образом:

1. Тепловое воздействие может приводить к инактивации клеток, причем опухолевые клетки более чувствительны к теплу,

чем нормальные (Гаузе Г.Ф. и др., 1968; Robinson J.E. et al., 1974; Hofer K.G., 1978; Overgaard J., 1978; Hahn G.M., 1982). Отметим, что результаты более поздних исследований показывают, что это свойство не является универсальным для всех опухолей (Hill S.A., Denekamp J., 1979; Streffer С. et al., 1990).

2. Имеется потенциирующее действие тепла на инактивацию клеток при их облучении ионизирующим излучением, причем это действие выражено в большей степени для опухолевых клеток (Overgaard К., Overgaard J., 1972; Kim S.H. et al., 1974; Suit H.D., Shwayder M., 1974; Sapareto S.A. et al., 1978). Благодаря этому, фактор терапевтического выигрыша (ФТВ) при комбинированном действии ионизирующего излучения и гипертермии составляет около 1.5-2.0, что значительно превышает значения этого фактора при использовании в лучевой терапии электронно-акцепторных соединений и плотноионизирующих излучений (ФТВ = 1.3-1.6) (Bewley D.K. et al., 1980; Ярмоненко С.П. и др., 1992) .

3. Наиболее резистентные гипоксические клетки являются более чувствительными к теплу, чем оксигенированные, поэтому радиосенсибилизация гипертермией более выражена для гипоксических клеток (Gerweck L.E. et al., 1974; Dewey W.C. et al., 1977).

4. Наиболее радиорезистентная S-фаза клеток является наиболее чувствительной к температуре и поэтому радиосенсибилизация гипертермией более выражена для клеток, находящихся в этой стадии роста; наоборот, наиболее радиочувствительный G2-nepnofl и митоз являются наиболее устойчивыми к термическому воздействию (Dewey W.C. et al., 1971; Kim S.H., 1976). Таким образом, при комбинированном

действии гипертермии и ионизирующего излучения сглаживаются различия в зависимости чувствительности клеток от фазы клеточного цикла.

5. Наблюдается потенциирующее действие тепла на клеточную гибель, вызванную некоторыми цитотоксическими препаратами, в том числе гипоксическими сенсибилизаторами (Ben-Hur Е. et al., 1974; Ben-Hur Е., Elkind М.М., 1975; Li G.C. et al., 1976; Hofer K.G., 1978; Overgaard J., 1979; Teicher В.A. et al., 1981; Кузин A.M., 1983; Urano M. et al., 1985).

6. Значения межклеточной pH ниже величины 7.0-7.2, характерных для резистентных участков опухолей, увеличивают чувствительность клеток к тепловой гибели и, следовательно, увеличивают радиосенсибилизацию опухолевых клеток гипертермией (Gerweck L.E., 1977; Lunec J., Parker R., 1980).

7. Тепловая обработка ингибирует восстановление клеток от сублетальных и потенциально, летальных повреждений, индуцированных ионизирующим излучением (Harris J.R. et al., 1977) . Поскольку, как уже отмечалось выше, пострадиационная репарация выражена в меньшей степени при действии плотноионизирующих излучений, при этом синергический эффект гипертермии и ионизирующих излучений отсутствовал или был менее выражен (Gerner E.W., Leith J.Т., 1977).

8. Одновременное применение двух инактивирующих агентов, в том числе и одновременное терморадиационное воздействие, в большинстве случаев оказывается более эффективным, чем их последовательное применение. Совокупность этих данных позволяет с позиций радиационной биологии очень высоко оценить потенциальные возможности использования гипертермического воздействия при лечении злокачественных опухолей, при

терморадиационной стерилизации пищевых продуктов, медицинского инструментария и т.д. Первые клинические испытания использования одной гипертермии или в комбинации с ионизирующим излучением и химиотерапией оказались успешными (Dietzel F., 1975; Hill S.A., Denekamp J., 1979;

Александров H.H. и др., 1980; Dethlefsen L.A., Dewey W.C., 1982), как и практическое использование терморадиационных воздействий при стерилизации объектов (Кузин A.M., Каушанский Д.А., 1981).

Фундаментальные закономерности синергического

взаимодействия тепла и ионизирующего излучения были получены в экспериментах на некоторых микроорганизмах (споры, бактерии, дрожжи) (Самойленко И.И., Першина З.Г., 1970; Петин В.Г., Бердникова И.П., 1979 а, б; Prescott D.M. et al., 1990) и культивируемых клетках млекопитающих (Bridges В.А. et al., 1969 a,b; Hume S.P., Marigold J.C.L., 1981; Djordjevic В. et al., 1992) .

В многочисленных работах (Ben-Hur Е. et al., 1974; BenHur E., Elkind M.M., 1975; Li G.C. et al., 1976; Коноплянников A.H., Штейн JI.В., 1977; Petin V.G.,

Berdnikova I.P., 1979; 1981) отмечалось участие процессов пострадиационного восстановления в механизме проявления синергического взаимодействия при терморадиационном

воздействии. Было показано, что модификация

радиочувствительности и реакция клеток на комбинированное воздействие во многом зависит от работы репарационных систем (Haynes R.H., 1975; Harris J.R. et al., 1977; Пелевина И.И., 1977; Жестянников В.Д., 1968, 1979; Жураковская Г.П.,

Петин В.Г., 1984; Дягилев С.А., Шубин В.Н., 1989; Sanches-Reyes А., 1992) .

Предполагается, что термическое воздействие подавляет способность клеток восстанавливаться от повреждений, индуцированных ионизирущим излучением. Наиболее убедительным доказательством справедливости данной точки зрения на механизм синергического взаимодействия являются данные, демонстрирующие значительный синергический эффект при комбинированном действии различных агентов на клеточные системы различного происхождения, способные к пострадиационному восстановлению, и отсутствие синергизма для радиочувствительных мутантов, утративших такую способность (Haynes R.H., 1975; Petin V.G., Berdnikova I.P., 1981). Существует и ряд других аргументов, подтверждающих эту точку зрения: величина и скорость восстановления при выдерживании облученных клеток в непитательной среде уменьшались с увеличением температуры, при которой происходило облучение (Petin V.G., Berdnikova I.P., 197 9); в условиях синергического взаимодействия гипертермии и ионизирующего излучения дрожжевые клетки характеризуются более

.у

"тяжелыми" формами инактивации (Петин В.Г., 1977); значения активационных энергий при комбинированном действии гипертермии и ионизирующего излучения (в отличие от действия только повышенных температур) приближались к величинам, характерным для различных процессов в ДНК (Petin V.G., Berdnikova I.P., 1981) .

Другой распространенной точкой зрения на механизм синергического взаимодействия при комбинированных воздействиях является представление о наличии некоторых нелетальных субповреждений, формируемых при действии каждого из

применяемых агентов в отдельности, взаимодействие которых обусловливает образование дополнительных летальных повреждений (Ьее�