Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Летальное и цитогенетическое действие ускоренных тяжелых ионов на клетки млекопитающих в условиях влияния ингибиторов синтеза ДНК

ВАК РФ 03.00.01, Радиобиология

Автореферат диссертации по теме "Летальное и цитогенетическое действие ускоренных тяжелых ионов на клетки млекопитающих в условиях влияния ингибиторов синтеза ДНК"



П 9"]''

ГОСУДАРСТВЕННАЯ КОМИССИЯ СССР ПО ПРОДОВОЛЬСТВИЮ И ЗАКУПКАМ :ЕСОЮЗНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ РАДИОЛОГИИ

19-91-135

НАСОНОВА Елена Анатольевна ,

т

ЛЕТАЛЬНОЕ И ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ УСКОРЕННЫХ ТЯЖЕЛЫХ ИОНОВ НА КЛЕТКИ МЛЕКОПИТАЮЩИХ УСЛОВИЯХ ВЛИЯНИЯ ИНГИБИТОРОВ СИНТЕЗА ДНК

Специальность: 03.00.01 - радиобиология

втореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Обнинск 1991

Работа выполнена в Объединенной институте ядерных исследований, Дубна.

Научные руководители: доктор биологических наук профессор Е.А.Красавин

кандидат биологических наук Р.Д.Говорун

Официальные оппоненты: доктор биологических наун А.В.Севанькаев

кандидат биологических наук С.А.Гераськин

Ведущая организация - Институт ботаники им. Н.Г.Холодного

АН УССР

Защита диссертации состоится "М" ОИГМАЛ 199_/г. на заседании специализированного Совета по радиобиологии Д IZO.81.01 при Всесоюзном научно-исследовательском институте сельскохозяйственной радиологии Госномиссии СССР по продовольствию и закупкам (Москва, Волков переулок, дЛ).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИ сельскохозяйственной радиологии. Отзывы на автореферат просьба направлять по адресу: 249020, Калужская область, г.Обнинск, ВНИИСХР, специализированный Совет.

Автореферат разослан

Ученый секретарь специализированного Совета кандидат биологических наук

Н.И.Санжарова

тлел

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Проблема биологического действия ионизирующих злучений разных физических характеристик является одной из ключевых в адиобиологии. Это обусловлено широким использованием ядерноэнергети-есних установок, созданием мощных ускорителей заряиенных частиц, при-енением различных радиоактивных изотопов в медицине, науке и технике, своением космического пространства. В последние годы в связи с Черно-ыльской катастрофой остро встал вопрос о влиянии малых доз излучений азного качества на организм человека. Вследствие этого вопросы норми-звания лучевых нагрузок, определения предельных уровней лучевых воз-зйствий излучений с разными физичесними характеристиками с учетом раз-лчий в их биологической эффективности являются нрайне важными.

Выяснению природы относительной биологической эффективности (обэ), зучению механизмов, определяющих специфику биологического действия чектромагнитных и корпускулярных видов излучений, посвящена обширная аература. Общей отличительной чертой в подходах к расшифровне пробле-I ОБЭ до недавнего времени являлись попытки ее объяснения лишь на ос-)ве учета специфини энерговыделения тяжелых заряженных частиц в "чув-•вительных структурах" живых клеток. На этой основе были построены югочисленные математические модели. В последние годы в экспериментах I клетках про- и низиих эукариот было показано, что важная роль в бионической эффективности излучений с разной линейной передачей энергии !ПЭ) принадлежит биологическому фактору - свойству клеток восстанав-ваться от лучевых повреждений ' . Исследований, насающихся роли ре-рации повреждений ДНК в биологической эффективности излучений с раз-й ЛПЭ на клетках млекопитающих, проведено не было. Одним из способов, зволяющих выяснить роль восстановительных процессов в лучевой инакти-ции клеток, является использование ингибиторов синтеза ДНК, подавляю-х репликативный и репаративный синтез, в частности таких как арабино-дцитозин (АраЦ) и оксимочевина (ОМ). В присутствии этих агентов наб-дается повышение чувствительности клетон к /-облучению, что связано повышением выхода двунитевых разрывов ДНК энзиматической природы ^. учетом изложенного представляется важным изучить закономерности ле-льного и цитогенетичесного действия излучений широного диапазона ЛПЭ условиях влияния указанных агентов, поскольку характер молекулярных рушений, индуцируемых при ¿-облучении и действии тяжелых ионов, раз-чен ^^. Исследованию этой проблемы и была посвящена настоящая диссер-ционная работа.

Цель и золами исследования.

Целью диссертационного исследования являлось изучение закономерностей летального и цитогенетического действия ионизирующих излучений широкого диапозона ЛПЭ в условиях влияния ингибиторов синтеза ДНК. Для решения уназанной цели были поставлены следующие основные задачи:

1. Изучить закономерности летального действия излучений широкого диапазона ЛПЭ на клетки китайского хомячка в стандартных условиях и в условиях влияния ингибиторов синтеза ДНИ - арабинозидцитозина (АраЦ) и оксимочевины (ОМ).

2. Оценить время задержки деления клеток при /-облучении и действии тяжелых ионов в стандартных условиях и в присутствии АраЦ и ОМ и обосновать подходы к учету частоты образования структурных нарушений хромосом при действии излучений с разной ЛПЭ.

3. Провести количественный анализ частоты образования клеток с хромосомными аберрациями в первом и втором пострадиационных митозах в зависимости от дозы ¿-излучения и ускоренных тяжелых ионов в широком диапазоне ЛПЭ.

4. Провести количественный анализ частоты образования разных видов хромосомных аберраций в клетках в первом и втором пострадиационных митозах при действии излучений, различающихся по ЛПЭ.

5. Исследовать закономерности модифицирующего влияния АраЦ и ОМ

на индукцию цитогенетических нарушений в клетках китайского хомячка при ¿-облучении и действии тяжелых ионов.

Научная новизна и практическая ценность работы. В результате проведенных исследований впервые получены следующие новые факты, которые выносятся на защиту:

- изучены закономерности летального действия ускоренных тяжелых ионов с ЛПЭ от 5 до 690 кэВ/мкм на клетки млекопитающих в условиях влияния ингибиторов синтеза ДНК. Показано, что их модифицирующее действие уменьшается с увеличением ЛПЭ тяжелых заряженных частиц и отсутствует при значениях ЛПЭ 90 кэВ/мкм;

- установлено уменьшение коэффициентов ОБЭ тякелых ионов в условиях влияния ингибиторов синтеза ДНК по сравнению с обычными условиями облучения;

- показано, что частота образования клеток с хромосомными аберрациями и разных видов хромосомных аберраций при облучении клеток тяжелыми ионами в условиях влияния ингибиторов синтеза ДНК увеличивается с ростом их ЛПЭ до максимума в области 90 кэВ/мкм. Сенсибилизирующее действие АраЦ и ОМ наблюдается во всем исследованном диапазоне ЛПЭ тяжелых ионов, но уменьшается при значениях ЛПЭ, соответствующих области максимума радиочувствительности хромосом;

- на основе цитогенетических исследований установлена средняя простительность задержки деления клеток и выявлено длительное пролонги-ювание митотического цикла у клеток со множественными повреждениями :роиосом в зависимости от дозы и ЛПЭ излучений;

- показано, что отноиение числа интерстициальных делеций к числу юрных ацентрических фрагментов увеличивается с ростом дозы и ЛПЭ излу-1ений. Выявлено, что использованные ингибиторы синтеза ДНК не влияют на оотношения обменных (как внутри-, так и межхромосомных) аберраций и рагментов.

Полученные результаты имеют важное значение для выяснения механиз-ов летального и мутагенного действия ионизирующих излучений с разными изическими характеристиками на клетки млекопитающих и человека. Они огут быть использованы для разработки вопросов санитарно-гигиеничесно-

0 нормирования лучевых нагрузок у персонала, работающего с норпуску-ярными излучениями, вопросов, связанных с обеспечением радиационной езопасности длительных космических полетов, при оценке экологической пасности оС-излучаюцих радионуклидов.

Струнтуро роботы.

Диссертационная работа состоит из введения, 4-х глав и выводов, абота изложена на 145 страницах мааинописного текста (включая список итературы), иллвстрирована 18 рисунками и 16 таблицами. Список литера-уры, использованной в донной работе, содержит 151 наименование, из ко-эрых 41 работа отечественных авторов и ПО работ зарубежных авторов э английском и немецком языках.

Апробация.

Материалы диссертации докладывались на 111 Международном рабочем )вещании по использованию тяжелых частиц в биологии и медицине (ФРГ, ]рмштадт, 1987), Международном рабочем совещании по генетическому дей-гвию корпускулярных излучений (Дубна, 1988), Международном рабочем совании по исследованию механизма радиационно-индуцированного мутагене-

1 и репарации ДНК (Дубна, I99Q), I Всесоюзном радиобиологическом съез-! (Москва, 1989), Всесоюзной научной конференции "Актуальные проблемы |Диационной биологии и радиационной генетики" (Обнинск, 1990).

Диссертационная работа апробирована на Биофизическом семинаре Уединенного института ядерных исследований (8 января 1991 г.) и на ¡минаре ВНИИ сельскохозяйственной радиологии Госкомиссии СССР по про-!8ольствию и закупкам (24 января 1991 г.).

МАТЕРИАЛУ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Источники ионизирующих излучений.

Для решения поставленных задач были использованы моноэнергетичес-кие пучки ускоренных тяжелых ионов, получаемые на ускорителе многозарядных ионов У-200 Объединенного института ядерных исследований. В экспериментах использовали дейтоны, ионы гелия, углерода и неона. В каче-

т от

стве "стандартного" излучения применяли ^-излучение Св . Физические характеристики излучений приведены в таблице I. Эксперименты с ускоренными тяжелыми ионами проводили на специально созданной установке с комплексом электронно-физической аппаратуры.

Таблица I. Физические характеристики излучений.

Вид излучения Энергия, МэВ/нуклон лпэ, кэВ/ыкм Мощность дозы, Гр/мин. Интервал доз излучения,Гр

Выживаемость Цитогенети-ческие исследования

J-излучение I3?cs 0,667 МэВ 0,3 4,6 I-I3 1-5

2d 8,8+0,3 5,0+0,2 15 - 1-5

4Не 7,9+0,2 22,0+0,2 20 0,5-6 -

8,3+0,2 21,0+0,4 10 - 0,5-5

2,2+0,3 60,0+5,0 20 1-4,5 -

1,2+0,2 90+15 10 1-6 -

12С 1,2+0,3 6,6+0,2 90+20 231+4 3 12 0,5-4,5 0,5-4

20 Ие 7,0+0,5 5,8+0,2 214+12 690+20 10 63 1-7 0,5-4

Культивирование и облучение клеток.

Работа проведена на перевиваемой культуре клеток китайского хомячка Ч79-Ь, которые культивировали при 37°С в среде Игла ("Serva", ФРГ) с добавлением 7-8% эмбриональной сыворотки теленка ("Serva") или 20% сыворотки крупного рогатого скота. В этих условиях время удвоения клеток составляло примерно 12 ч. Клетки облучали в стационарной фазе роста выращивая в среде с добавлением антибиотиков (пенициллин и стрептомицин в концентрации 100 ед./мл и 100 мг/мл соответственно). Облучение монослоя клеток J-квантами проводили во флаконах Карреля на установке "Свет" с мощностью дозы 4,6 Гр/мин при комнатной температуре.

В связи с ограниченным размером пучков ускоренных тяжелых ионов и ( малыми пробегами моиослой клеток выращивали в течение 2-2,5 суток в 1ециально изготовленных стеклянных цилиндрах высотой 30 мм и диамет-)м 13 мм, дном которых служила пленка из поликарбоната толщиной 8 мкм. жослой клеток облучали через поликарбонатную пленку, на которой рос] культура при комнатной температуре.

В качестве ингибиторов синтеза ДНК применяли арабинозид цитозин

!, 2-anhydro-i-d-araMnof uranosylcytosine- НС1) И оксимочввину (АраЦ и i) ("Serva", ФРГ) в конечных концентрациях 0,1 и 4 мМ/мл соответствен) I . Ингибиторы, растворенные в питательной среде, вводили за 20-30 ж. до облучения, после чего клетки выдерживали в среде с АраЦ и ОМ в ¡чение 2 ч. при 37°С. Затем моиослой клеток отиыволи свежей средой, ¡рабатывали трипсином и ресуспендировали клетки в свежей среде.

Выживаемость клеток определяли методом макроколоний. Клетки высели в чашки Петри, содержащие 10 мл питательной среды с добавлением IJ¡ сыворотки крупного рогатого скота или 123! Детальной сыворотки те-¡нка и антибиотиков. Число колоний подсчитывали через 8-9 суток нуль-жирования при 37°С. Статистическую обработку результатов проводили i ЭВМ с помощью стандартной программы fumili. Радиочувствительность i"1) клеток и значение экстраполяционного числа (и) кривых выживаемос-I определяли путем вычисления и минимизации суммы квадратов. Ошибки носительных величин определяли из наибольией ошибки любой из двух со-ютавляеыых величин, полученных в пароллельных опытах.

Для цитогенетических исследований клетки V79-4 после облучения и шубации с ингибиторами синтеза ДНК высевали во флаконы со свежей пи-1тельной средой, содержащей 10 мкг/мл 5-бромдезоксиуридина (5-БДУ) 'Fiuka АВ", Швейцария), приготовленного на растворе Хзнкса. Клетки 'льтивировали 28-32 ч. За 2-2,5 ч. до фиксации вводили колхицин в кон-¡нтрации 2,5 мкг/мл ("Merck", ФРГ). Фиксацию, приготовление и окраску lenapaTOB проводили в соответствии с методикой С помощью метода |фференциальной окраски в метафазных хромосомах второго пострадиационно митоза наблюдали дифференциальную окраску сестринских хроматид. ¡тафазные хромосома первого митоза при этом опрашивались обычным обра-im, кан при стандартной процедуре окрашивания. При работе избегали по-¡дания света на культуру, растущую на среде с 5-БДУ.

При цитогенетическом анализе проводили оценку числа аберрантных еток, общего числа и частоты разных видов хромосомных аберраций, итывали все виды хромосомных аберраций, идентифицируемые без кариоти-рования. Каждой точке опыта соответствует примерно 100-400 просчитан-х клеток. Полученные дозовые зависимости обработаны по стандартной ограмме fumili. Зависимость числа клеток без хромосомных аберраций

от дозы излучений представлена кривыми, аналогичными кривым выживаемости. В этом случае рсссчитывали радиочувствительность (D"1) и экстрапо-ляционное число. ОБЭ и фактор изменения дозы (ФИД) определяли как отношение о"1 исследуемого излучения н D"1 стандартного излучения. Зависимость от дозы общего числа и отдельных видов хромосомных аберраций описывались линейно-степенной зависимостью у = B"Dn или линейной в случае, если п = I. В этих случаях ОБЭ и ФИД определяли как отношение равноэф-фективных доз стандартного и исследуемого излучений.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние ингибиторов синтеза ДНК на выживаемость клеток

при действии излучений с разной ЛПЭ.

В первом разделе главы Ш диссертации представлены результаты исследования модифицирующего влияния ингибиторов синтеза ДНК АраЦ и ОМ на выживаемость клеток китайского хомячка при действии излучений широкого диапазона ЛПЭ. Механизм действия АраЦ и ОМ заключается в подавлении репарации ДНК путем блокирования стадии ресинтеза и заполнения коротких однонитевых брешей, образующихся в процессе репарации повреждений ДНК. Это приводит к формированию энзимотических двунитевых разрывов (ДР) ДНК за счет перекрытия однонитевых брешей в оппоэитных нитях либо за счет увеличивающейся со временем вероятности атаки однонитевой ДНК бреви эн-донуклеазами, специфичными к однонитевой ДНК ' '.

Поскольку сенсибилизирующее влияние этих агентов при J-облучении заключается в повышении выхода ДР ДНК энзиматической природы, мы предполагали, что при действии тяжелых ионов их модифицирующее влияние на радиочувствительность клеток будет снижаться, так как при этом в ДНК клеток индуцируются главным образом прямые ДР ДНК ^^.

На рис.1 приведены кривые выживаемости (s) клеток от дозы (D) облучения ускоренными тяжелыми ионами и J-лучами в стандартных условиях и при действии АраЦ и ОМ. Зависимости s(D) при J-облучении и действии ионов Не с ДПЭ = 22 кзВ/мкм являются сигмоидными. При облучении тяжелыми ионами с более высониии значениями Ш наблюдается экспоненциальный характер зависимости S(D). С ростом ДПЭ уменьшается величина экс-траполяционного числа кривой выживания и увеличивается угол ее наклона. Характер изменения наклона кривых с ростом ЛПЭ отчетливо виден на рис.2, где показана зависимость d^Cl). Радиочувствительность клеток возрастает с увеличением ЛПЭ до ~ 150 кзВ/ики, а затем снижается при дальнейшем росте ЛПЭ.

с.1. Влияние арабинозидцитозина и оксимочевины на выживаемость клеток китайского хомячка при ¿-облучении (а) и действии ускоренных тяжелых ионов: ионы гелия (22 кэВ/мкм) (б), ионы гелия (60 кэВ/икм) (в), ионы гелия (91 кэВ/мкм) (г), ионы углерода (д) и неона (е). I - без ингибиторов синтеза ДНК; 2 - в присутствии АраЦ ♦ ОМ. Го оси ординат - выживаемость, ?; по оси абсцисс - доза облучения, Гр.

Рис.2. Зависимость радиочувствительности клеток китайского хомячка от /ПЭ излучений: I - без ингибиторов синтеза ДНН; 2-е присутствии АраЦ + ОМ. По оси ординат -радиочувствительность, Гр~*; по оси абсцисс - ЛПЭ, кзВ/мнм.

Инкубация клеток в среде, содержащей АраЦ и ОМ, во время и после облучения оказывает сенсибилизирующее влияние на их выживаемость после /-облучения. При этом <Щ составил 1,67+0,05. Модифицирующее влияние агентов наблюдается и при действии ионов гелия с ЛПЗ, равной 22 и 60 кзВ/мнм, однако значения ФИД существенно меньве (1,3+0,1 и 1,2+0,1 соответственно). При облучении клеток ионами гелия с ЛПЗ 90 кэВ/мкм, ионами углерода и неоно модифицирующее влияние ингибиторов отсутствует. Зависимость радиочувствительности клеток от ЛПЭ излучений при действии АраЦ и ОМ также описывается кривой с максимумом (рис.2), однако величина его относительно радиочувствительности клеток к ¿-облучению в присутствии ингибиторов меньше, чем в стандартных условиях. На основании полученных данных были рассчитаны коэффициенты ОБЭ тяжелых ионов. Они являются максимальными в диапазоне ЛПЭ от 60 до 230 кэВ/мкм, достигая значений 3,0-3,1 при облучении в стандартных условиях. В условиях влияния ингибиторов синтеза ДНК величина ОБЭ уменьшается и в максимуме составляет 1,8-1,9. Это обусловлено тем, что при J-облучении в условиях влияния АраЦ и ОМ радиочувствительность нлеток повышается, а при облучении тяжелыми ионами с высокими ЛПЭ сенсибилизирущее влияние этих агентов отсутствует. В свете изложенного становятся понятными причины снижения коэффициентов ОБЭ излучений с высокими ЛПЭ, полученных при исследовании выживаемости клеток млекопитающих и человека с дефектами в системе репарации ДНК (Walicka, Korner, 1982; Сох, 1982; И ДР.).

Цитогенетические нарушения в клетках китайского хомячка

при действии излучений с разной ЛПЭ.

С учетом тесной связи между репродуктивной гибелью клеток и нарушениями их хромосомного аппарата нами было проведено исследование закономерностей индукции хромосомных аберраций излучениями широкого диапазона ЛПЭ в условиях влияния ингибиторов синтеза ДНК. Исследования были проведены с целью проверки справедливости основных выводов о роли репарационных процессов у клеток млекопитающих в биологической эффективности тяжелых ионов, сделанных на основе анализа их летального действия.

Сравнительная оценка биологической эффективности тяжелых ионов на основе цитогенетических критериев является весьма сложной проблемой. В большой степени это обусловлено тем, что возникновение нарушений хромосомного аппарата клеток сопряжено со значительной задержкой клеточного деления. Известно также, что длительность клеточного цикла неодинакова у клеток с разным числом аберраций хромосом ^ и облучение (особенно частицами с высоной ЛПЭ) быстро десинхронизирует нлеточную популяцию . В связи с этим для оценки биологической эффективности тяжелых ионов по цитогенетичесним критериям важно изучить вопрос о влиянии

адержки деления клеток на регистрируемый выход хромосомных аберраций ри действии излучений с разной ЛПЭ.

. I. Определение задержки митоза.

Используя метод дифференциальной окраски сестринских хроматид, мы ровели анализ хромосомных аберраций в популяции через 30-32 ч. после -облучения и действия тяжелых ионов. Этот метод позволяет идентифици-овать клетки, проходяцив первый и второй постродиационные митозы,и аздельно провести в них учет хромосомных аберраций.

Использованный метод позволил нам выявить в популяции через 302 ч. после /-облучения и действия тяжелых ионов клетки, проходящие ервый, второй и третий пострадиационные митозы. Как видно из таблицы 2, оличество клеток первого митоза с ростом дозы и ЛПЭ излучений увеличи-ается. В этот срок финсации при стандартном способе просчета (без диф-еренциации клеток по митозам) приходится иметь дело с разнородными по-уляциями клеток: при ¿-облучении, в основном, учитываются клетки, на-одящиеся во втором митозе, а при действии тяжелых ионов с высокой ЛПЭ в основном, в первом митозе.

Таблица 2. Количество клеток, проходящих первый пострадиационный митоз, через 32 ч. после облучения.

Вид излучения Доза облучения, Количество клеток митозе, X в первом

Гр без ингибиторов синтеза ДНК АраЦ ♦ ОМ

/ - '"с 0 5,7 16,0

I 5,5 16,9

3 9,1 33,9

5 12,3 69,6

12С 7 90,4

0 6,6 27,0

0,5 14,8 99,0

I 28,2 100,0

2 47,2 100,0

3 80,2 100,0

4 87,7 100,0

Величина задержки митозов оцененная нами по соотношению пер-■IX и вторых митозов в популяции, составила 0,12 и 0,34 ч./Гр при }-5лучении и действии ионов гелия с ЛПЭ 21 кэВ/мкм соответственно, увеличением ЛПЭ тяжелых ионов до 91 кэВ/мкм задержка митозов достига-

ла максимального значения, равного 3,23 ч./Гр, а затем уменьшалась с дальнейшим ростом ЛПЭ. Введение ингибиторов синтеза ДНК значительно повышало эффективность действия излучений по индукции задержки деления клеток: после 1-облучения она составила 1,5 ч./Гр. Нам не удалось оценить задержку митоза, вызываемую действием тяжелых ионов в присутствии АраЦ и ОМ, тан как через 30-32 ч. после начала культивирования все делящиеся клетки находились еще в первом пострадиационном митозе.

2. Образование клеток с хромосомными аберрациями.

Оценку эффективности действия излучений с розной ЛПЗ и влияния АраЦ и ОМ проводили, анализируя дозовые зависимости доли клеток без хромосомных аберраций по аналогии с кривыми выживаемости облученных клеток (рис.3). Эти зависимости имеют экспоненциальный характер, наклон их увеличивается с ростом ЛПЭ до 91 кэВ/мкм и несколько уменьшается при облучении ионами углерода. Полученные зависимости позволили оценить радиочувствительность хромосом (и"1) (рисД), а такие коэффициенты ОБЭ тяжелых ионов и <Щ излучений при действии ингибиторов синтеза ДНК.

Рис.3. Зависимость числа клеток без хромосомных аберраций от дозы )-излучения и тяжелых ионов: а) для клеток первого митоза; б) для нлеток второго митоза, в) при стандартном способе учета. 1-5 -без ингибиторов синтеза ДНК; 6-10 - в присутствии АраЦ + ОН. 1.6 - /-излучение; 2,7 - дейтоны; 3,8 - *Не (21 кэВ/мкм); 4,9 -С; 5-10 - {91 кэВ/мки). По оси ординат - число клеток без хромосомных аберраций, отношение к контролю; по оси абсцисс -доза облучения, Гр.

Радиочувствительность хромосом увеличивается с ростом ЛПЭ излучений до максимума при 90 кэВ/мкм и снижается при дальнейшем росте ЛПЭ. В максимуме радиочувствительности коэффициент ОБЭ ионов гелия с ЛПЭ 91 кэВ/мкм в первом митозе составлял 4,8.

Во втором пострадиационном митозе (рис.36) доля клеток без хромосомных аберраций значительно возрастает,и наклоны кривых уменьшаются вследствие элиминации из популяции тяжело пораженных клеток. Обращает на себя внимание большая доля клеток с аберрациями при облучении ионами гелия с ЛПЭ 91 кэВ/мкм.

Рис.4. Зависимость радиочувствительности хромосом, определяемой по числу нлеток без хромосомных аберраций, от ЛПЭ излучений: I - без ингибиторов синтеза ДНК; 2 - в присутствии АраЦ + ОМ. По оси ординат -радиочувствительность, по

оси абсцисс - ЛПЭ, кэВ/мкм.

Ингибиторы синтеза ДНК сенсибилизируют клетки к действию излучений. Наибольшее сенсибилизирующее влияние ингибиторов выявлено при облучении клеток ионами гелия с ЛПЭ 22 кэВ/мнм (ФИД равен 3,1+0,3 для клеток первого митоза). При облучении ¿-квантами и дейтонами модифицирующее влияние агентов несколько меньше (ФИД равен 1,7+0,1 и 1,3+0,1 соответственно). При облучении клеток тяжелыми ионами с ЛПЭ> 21 кэВ/мкм сенсибилизирующий эффект ингибиторов уменьшался и был наименьшим при действии ионов гелия с ЛПЭ 91 кэВ/мкм, величина ФИД для которого была близка к I.

При анализе клеток второго митоза сенсибилизирующее влияние АраЦ и ОМ мы могли наблюдать только при облучении клеток /-квантами и дейтонами (ФИД равен 1,8+0,1 и 1,3+0,2 соответственно). Таким образом, сенсибилизирующее влияние ингибиторов сохраняется, по крайней мере, в течение двух клеточных цинлов. Провести такую оценку при облучении тяжелыми ионами не представилось возможным, поскольку вследствие значительного пролонгирования клеточного деления в таких условиях все делящиеся клетки в популяции в указанный срок исследования находились в первом митозе. При стандартном способе учета можно наглядно видеть влияние разного вклада первых и вторых митозов после облучения отдельными тяжелыми ионами на оценку их эффективности (рис.Зв). Хотя учет хромосомных повреждений проводится в одинаковые сроки, из-за различий в пролонгировании клеточных циклов при действии разных видов излучений приходится

анализировать, по сути дела, различающиеся по составу клеточные популяции. Вследствие этого соответствующие величины ОБЭ в ряде случаев оказываются особенно высокими.

Полученные данные свидетельствуют о том, что характер зависимости радиочувствительности хромосом от ЛПЭ излучений, оцененной по числу нлеток без хромосомных аберраций (рис.4), описывается кривой с максимумом в области 90 кэВ/мкм. Аналогичный характер зависимости выявлен и в условиях влияния АраЦ и ОМ. В этом случае отмечается их сенсибилизирующее влияние в области низких ЛПЭ, уменьшающееся с ростом ЛПЗ тяжелых ионов. Однако небольшой эффект сохраняется и для ионов с высокими значениями ЛПЭ.

3. Частота разных видов хромосомных аберраций.

После облучения клеточной популяции ¿-квантами и тяжелыми ионами увеличивается количество хромосомных аберраций и отдельных их видов в клетках. В работе представлены данные по индукции общего числа хромосомных аберраций и отдельных видов аберраций хромосомного типа: дицент-риков и колец центрических, интерстициальных делеций и парных ацентрических фрагментов. Как видно из рис.5, индукция общего числа аберраций

Рис.5. Изменение общего числа хромосомных аберраций в зависимости от дозы /-излучения и тяжелых ионов: а) для клеток первого митоза; б) для клеток второго митоза, в) при стандартном способе учета. 1-5 - без ингибиторов синтеза ДНК; 6-10 - в присутствии АраЦ + ОМ. 1,6 - )-излучение; 2,7 - дейтоны; 3,8 - *Не (21 кэВ/мкм); 4,9 - 5-10 - *Не (91 кзВ/мкм). По оси ординат - число хро» сомных аберраций на клетку (данные приведены за вычетом контроля); по оси абсцисс - доза облучения, Гр.

хромосом, а танже число обменных аберраций (дицентрини и кольца центрические и интерстициальные делении) описывается линейно-степенной зависимостью от дозы /-квантов и дейтонов. При облучении тяжелыми ионами с возрастающей ЛПЭ этот тип зависимости трансформируется в линейный. Выход парных ацентрических фрагментов описывается линейной зависимостью от дозы всех видов излучений. Значения ОБЭ и ФИД излучений по этому показателю рассчитывали по отношению равноэффективных доз соответствующих видов излучений. Видно, что общее число аберраций увеличивается с ростом ЛПЭ излучений до максимального уровня при облучении ионами гелия с ЛПЭ 91 кэВ/мкм и несколько снижается при дальнейшем увеличении ЛПЭ.

Присутствие ингибиторов синтеза ДНК резко увеличивает эффективность действия излучений по индукции аберраций хромосом. Однако характер дозовых зависимостей при этом, как правило, не меняется. При анализе клеток первого митоза наибольшее сенсибилизирующее влияние ингибиторов отмечено для ионов гелия с ЛПЭ 21 кэВ/мкм (ФИД равен 2,2^0,1). Значения ФИД для тяжелых ионов с более высокими ЛПЭ уменьшаются до 1,21,3.

4. Соотношения между отдельными видами хромосомных аберраций.

Отношение числа дицентринов и колец центричесиих к парным ацентрическим фрагментам. Поскольку ингибиторы синтеза ДНК АраЦ и ОМ нарушают эепарацию радиационно-индуцируемых повреждений ДНК, что приводит к увеличению выхода ЭДР ДНК, представлялось важным выяснить, приведет ли обработка облученных клеток ингибиторами к увеличению фрагментоза хромовом и снижению выхода обменных аберраций и повлияет ли она на соотно-пение указанных типов аберраций при облучении тяжелыми ионами широкого «иапазона ЛПЭ. Такого рода данные в литература отсутствуют. Нами выявлено увеличение образования в присутствии ингибиторов и тех, и других 5идов хромосомных аберраций.

Анализ отношения общего числа обменных аберраций хромосом (дицент-)ики, полицентрики, кольца центрические) к числу парных ацентрических фрагментов показал, что оно не зависело от дозы облучения и слабо зависло от ЛПЭ излучений (рис.6). Можно отметить тенденцию к снижению отмщения при действии ионов гелия с ЛПЭ 91 кэВ/мкм. Обработка нлеток ингибиторами несколько уменьшала величину отношения при 1-облучении и не пменяла ее при действии всех остальных видов излучений. Видимо, ис-юльзованные нами ингибиторы синтеза ДНК в соответствии с описанным механизмом действия увеличивают образование разрывов хромосом, но мало 1лияют на их дальнейшую судьбу.

Рис.6. Отношение числа дицентриков и колец центрических к числу парных ацентрических фрагментов в клетках первого митоза в зависимости от дозы облучения: а) без ингибиторов синтеза ДНК; б) в присутствии АраЦ ♦ ОН. I - ¿-излучение; 2 - дейтоны; 3 - ионы гелия (21 кэВ/икм); 5 - ионы гелия (91 нэВ/мкм); 4 - ионы углерода. По оси ординат - величина отношения; по оси абсцисс - доза облучения, Гр.

Отношение числа интерстициольных делеций к числу парных ацентри-чесних фрагментов. Приведенные в работе данные свидетельствуют о том, что тяхелые ионы весьма эффективны по индукции интерстициольных деле-ций, которые относятся к классу двухударных аберраций, и представляют собой, как показали специально проведенные исследования, тип мелких парных ацентрических колец (Peacock et al., 1973), то есть, по сути, внутрихроиосомные обмены. Резкое повышение их числа при облучении тяжелыми частицами, вероятно, можно объяснить увеличением частоты разрывов на единицу длины отдельных хромосом, связанную с неравномерностью распределения энергии ионизации по чувствительным объемам клетки, когда создаются благоприятные условия для формирования этого типа аберраций. Об этом свидетельствуют и данные о соотношении интерстициольных делеций и парных ацентрических фрагментов (рис.7): оно увеличивается с ростом дозы и ЛПЗ излучений. В то же время присутствие АраЦ и ОМ не оказывает влияния на величину отношения при действии всех видов излучений.

5. ОБЭ тяжелых ионов по цитогенетическим показателям.

На основании совокупности данных, полученных при проведении цито-генетичэсних исследований на клетках млекопитающих, облученных тяжелыми ионами в разных условиях, были рассчитаны ОБЭ излучений и величины ФИД в условиях влияния ингибиторов синтеза ДНК (рис.8). Зависимость ОБЭ от ЛПЗ описывается характерной кривой с локальным максимумом, весьма

25 20 15 Ю СБ

012345 012345

ис.7. Отношение числа интерстициальных делеций к числу парных ацентрических фрагментов в клетках первого митоза в зависимости от дозы облучения: а) без ингибиторов синтеза ДНК; б) в присутствии АраЦ + ОМ. I - /-излучение; 2 - дейтоны; 3 - ионы гелия (21 кэВ/мкм); 4 - ионы гелия (91 кэВ/мкм); 5 - ионы углерода. По оси ординат - величина отношения; по оси абсцисс - доза облучения, Гр.

ходной с таковой по выживаемости. Наибольшей эффективностью по всем итогенетическим показателям обладают ионы гелия с ЛПЭ 91 кэВ/мкм. злучения с большей и меньшей ЛПЭ менее эффективны. Аналогичный харак-ер зависимости ОБЭ от ЛПЭ по цитогенетическим показателям получен и ругими авторами (Skarsgard et al., 1967; Tolkendorf, Eichhorn, 1983).

Видно, однако, что эффективность тяжелых ионов по индукции разных идов хромосомных нарушений не одинакова: нами отмечен быстро растущий увеличением ЛПЭ выход парных ацентрических фрагментов и интерстици-льных делеций (максимальные значения ОБЭ 6,2-6,6), наименьшая эффектность отмечена по индукции хромосомных обиенов (рис.8а).

Как было поназано в работе ингибиторы синтеза ДНК - АраЦ и и, угнетающие репаративный синтез ДНК, оказывают сенсибилизирующее пияние на выживаемость клеток млекопитающих при /-облучении вследствие зеличения выхода ЭДР ДНК. В опытах с тяжелыми ионами нами отмечено г<ижение их влияния на выживаемость клеток с ростом ЛПЭ частиц, когда ^дуцируются преимущественно прямые ДР ДНК, вследствие чего коэффициен-i 053 тяжелых ионов снижаются. Анализ цитогенетических нарушений в летках китайского хомячка выявил сенсибилизирующее влияние ингибиторов теза ДНК при действии тяжелых ионов во всем исследованном диапазоне

Рис.8. Зависимость ОБЭ тяжелых ионов от их ЛПЭ по цитогенетическим показателям: а) без ингибиторов синтеза ДНК; б) в присутствии АраЦ + ОМ. I - число дицентриков и колец центрических; 2 -общее число аберраций; 3 - число клеток без хромосомных аберраций; 4 - число интерстициольных делеций; 5 - число парных ацентрических фрагментов (пунктиром нанесены данные по выживаемости). По оси ординат - ОБЭ; по оси абсцисс - ЛПЭ, кэВ/мкм.

ЛПЭ, которое снижается только в области максимума радиочувствительност! хромосом. Вероятно, он определяется вкладом редкоионизирующего компонента треков тяжелых ионов за счет «^-электронов, образующихся при пр< хождении зоряженных частиц через клетки. В связи с этим снижение коэффициентов ОБЭ тяжелых ионов по цитогенетическим показателям в условиях

ияния ингибиторов синтеза ДНК АраЦ и ОМ вырожено не столь отчетливо, к по выживаемости клетон (рис.86).

Таким образом, проведенные нами исследования летального и цитоге-¡тического действия ускоренных тяжелых ионов на клетки млекопитающих идетельствугет о том, что эффективность излучений с разной ЛПЭ опре-¡ляется, с одной стороны, физическим фактором, связанным с особенности микрораспределения энергии излучений в генетических структурах и тягащим на выход нерепарируемых или трудно репарируемых повреждений, биологическим - эффективностью работы репарационных систем. Влияние юлогического фактора на величину ОБЭ излучений в свою очередь зави-|т от их ЛПЭ.

ВЫВОДЫ

1. Ингибиторы синтеза ДНК арабинозидцитозин и оксимочевина оказы-пот сенсибилизирующее влияние на выживаемость клеток китойскаго хомяч-| при /-облучении {ФИД равен 1,67+0,05).

2. При действии ускоренных ионов гелия разных энергий, углерода и ¡она с ЛПЭ в диапазоне 20-690 кэВ/мкм сенсибилизирующее влияние инги-аоров синтеза ДНК на выживаемость клеток млекопитающих уменьшается

>и повышении ЛПЭ частиц и полностью исчезает при значениях ЛПЭ> 90 >В/мкм.

3. Величина ОБЭ ускоренных тяжелых ионов зависит от способности теток млекопитающих репарировать повреждения ДНК. Показано уменьшение пффициентов ОБЭ тяжелых ионов е условиях влияния ингибиторов синтеза 1К по сравнению с облучением в обычных условиях.

4. Величина средней задержки деления клеток при облучении возрастет с увеличением ЛПЭ ускоренных частиц, достигая максимума (3,2 ч^/Гр) >и ЛПЭ, равной 90 кэВ/мкм. Ингибиторы синтеза ДНК пролонгируют клеточ-«й цикл.

5. Ингибиторы синтеза ДНК АраЦ и ОМ оказывают сенсибилизирующее тияние на частоту образования хромосомных аберраций в клетках как при -облучении, так и при действии тяжелых ионов во всем исследованном юпазоне ЛПЭ (5-210 кэВ/мкм). С повышением ЛПЭ частиц модифицирующее тияние этих агентов снижается.

6. Соотношение различных типов хромосомных аберраций зависит от

13 излучений. С повышением ЛПЭ тяжелых ионов отношение числа интерсти-юльных делений к числу парных ацентрических фрагментов увеличивается, условиях влияния ингибиторов синтеза ДНК соотноиение обменных (внутри-межхромосомных) аберраций и фрагментов не меняется по сравнению с обучением в обычных условиях.

По теме диссертации опубликованы следующие работы:

1. Говорун Р.Д., Красавин Е.А., Насоново Е.А., Череватенко А.П. Влияние ингибиторов синтеза ДНК на чувствительность клеток млекопитающих к действию излучений с разной линейной передачей энергии. Радиобиология, 1986, Т.26, в.З, с.377-380.

2. Говорун Р.Д., Насонова Е.А., Красавин Е.А., Козубен С., Череватенко А.П. Детальное действие ускоренных тяжелых ионов на клетки млекопитающих в условиях влияния ингибиторов синтеза ДНК. Результаты экспериментальных исследований. Радиобиология, 1987, т.¿7, в.2, C.I7/-I8I; GSI-tr-86-24, Darmstadt, 1986, p.I-I4.

3. Козубек С., Красавин Е.А., Говорун Р.Д., Насонова Е.А. Детальное действие ускоренных тяжелых ионов на клетки млекопитающих в условия) влияния ингибиторов синтеза ДНК. Теоретический анализ. Радиобиологи! 1987, Т.27, В.2, С.212-217; GSI-tr-86-25, Darmstadt, 1986, p.I-I2.

4. Krasavin E.A., Kozubek S., Amirtaev К.G., Bonev M., Tokarova В., Govorun R.D., Naaonova E.A., tobatchevskij P.M., Tcherevatenko A.P. The investigation of lethal and mutagenic effects of Jf-rays and high-LET particles in Dubna. GSX-87-II, Darmstadt, 13-15 July 1987, Dil.

5. Насонова E.A., Говорун P.Д., Красавин Е.А. Индунция структурных хромосомных мутаций в клетках млекопитающих ускоренными тяжелыми ионами. Труды рабочего совещания по генетическому действию корпускулярных излучений (Дубна, 4-6 октября 1988). Дубна, ОИЯИ, Д19-89-143,

1989, с.169-182.

6. Говорун Р.Д., Красавин Е.А., Лобачевский П.Н., Насонова Е.А., Пер-цева Т.Е. Летальные и цитогенетические эффекты клеток млекопитающих при облучении тяжелыми ионами в условиях влияния ингибиторов синтеза ДНК. I Всесоюзный радиобиологический съезд, Москва, 21-27 августа 1989. Тезисы докладов, т.4, Пущино, 1989, с.997-998.

7. Govorun B.D., Krasavin E.À., LobachevskiJ Р.П., Nasonova E.A., Pertseva T.B. Modifying influence of DMA synthesis inhibitors on the effect of irradiation of Chinese hamster cells. Труды рабочего совещания no исследованию механизма радиационно-индуцированного мутагенеза и репарации ДНК, 12-14 июня 1990. Дубна, ОИЯИ, Д19-90-457,

1990, с.106-117.

8. Насонова Е.А., Говорун Р.Д., Красавин Е.А., Лобачевский П.Н. Действие ускоренных тяжелых ионов на клетки млекопитающих в условиях влияния ингибиторов синтеза ДНК. В сб.: Актуальные проблемы радиационной биологии и радиационной генетики. Материалы Всесоюзной конференции. НИИ медрадиологии АМН СССР, Обнинск, 1990, с.95-97.

Литература

1. Красавин Е.А. Знергоатомиздат, М., 1989.

2. Филатов И.В. и др. В кн.: Проблемы природной и модифицированной радиочувствительности. М., Наука, 1983, с.213-220.

3. Лазутка Е.С., Лекявичус Р.К. Изд-во Вильнюсск. ун-та, Вильнюс, 1984.

4. Пяткин Е.К. и др. Радиобиология, 1984, т.24, в.З, с.310-314.

5. Scholz М. et al. GSI-88-53, Darmstadt, 1988, p.1-6.

Рукопись поступила 22 марта

в издательсний отдел 1991 года.