Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Синтез ДНК и реализация радиационных повреждений в клетках млекопитающих

ВАК РФ 03.00.01, Радиобиология

Автореферат диссертации по теме "Синтез ДНК и реализация радиационных повреждений в клетках млекопитающих"

А Я 0 2 ^ ^

АКАДЕМИЯ МЦДИЦИНОШХ НАУК СССР НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ МЕДИЦИНСКОЙ РАДИОЛОГИИ

На правах рукописи

СЩЗЫНЫС Борис Иванович

УДК: 576.3+616-001.28/29+612.57

СИНТЕЗ ДОК И РЕАЛИЗАЦИЯ РАДИАЦИОННЫХ ПОВРЕЖДЕНИЙ В КЛЕТКАХ МЛЕКОПИТАЮЩИХ

Специальность - 03.00.01 '(радиобиология)

Автореферат Диссертации

на соискание ученой степени доктора биологических наук

Обнинск - 1930

'•у

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте медицинской радиологии АМН СССР;

Научный консультант - доктор биологических наук,

старший научный сотрудник А.С.САЕНКО

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук,

профессор Н.Г.ДАРЕНСКАЯ

доктор биологических наук, профессор А.И.ГАЗИЕВ

доктор химических наук, профессор А.А.КРАЕВСКИЙ

Ведущая организация: Институт цитологии АН СССР.

Защита диссертации состоится " 3 " 1990 г.

на заседании специализированного совета Д001.Н.01 при Научно-исследовательском институте медицинской радиологии АМН СССР (249020, г.Обнинск Калужской области, ул.Королева, 4),

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке. Научно-исследовательского института медицинской радиологии АМН СССР

Автореферат разослан ■ У ■ <аг£бсьси 19^ Г.

Ученый секретарь специализированного совета, доктор медицинских наук

В.А.КУЛИКОВ

fjnr&ttrr&aar.

' •••«» -1

^^^ЖЩи^льность проблемы. В настоящее время общепринято, что

гибель облученных клеток в значительной степени обусловлена нарушениями в структуре ДНК. Однако попытки найти строгие корреляции между количеством возникающих в ДНК повревдений, способностью к репарации ДЖ и параметрами, характеризующими выживаемость облученных клеток, успеха не принесли. Для клеток

животных и человека установлено, что ликвидация однонитевых тпттЛйРктически

и двунитевых разрывов ДОГ'полностью завершается в клетках, из которых 99% являются репродуктивно погибшими. В то же время экспериментальные данные последних лет (см. Пелевина и со-авт., 1985) дают основания полагать, что степень реализации радиационных повреждений в клетках млекопитающих зависит не только от самого наличия процессов репарации ДШ, но и от их эффективности, которая регулируется специальным механизмом.

Имеющиеся в литературе данные свидетельствуют, что у многих клеток, обладающих повышенной радиочувствительностью, характер процессов репликации ДНК отличается от такового для "нормально" реагирующих на облучение клеток, хотя процессы репарации ДДК у тех и других могут протекать равноэффективно. Такие результаты получены при изучении радиочувствительных линий клеток от больных атаксией телеангиэктазией (Painter, 1981), синдромом Кокейна (cleaver, 1983), некоторыми другими наследственными заболеваниями, характеризующимися нестабильностью хромосом (Баренфельд и соавт., 1985). Эти данные позволяют полагать, что в клетках существует механизм, контролирующий уровень реализации повреждений ДШ, и одним из способов контроля является регуляция репликации ДШ в облученных (поврежденных) клетках. Следовательно, изучение процессов репликации ДНК в облученных клетках и установление их роли в реализации радиационных повреждений является одной из самых актуальных задач современной молекулярной и клеточной радиобиологии.

Цель работы. Целью настоящего исследования явилось установление закономерностей репликации ДНК в облученных клетках, изучение роли ингибирования репликации ДНК в реализации радиационных повреждений.

Задачи исследования:

- изучение влияния различных типов повреждений ДНК и скорости их репарации на подавление и восстановление синтеза ДНК в облученных клетках;

- определение корреляций между ингибированием инициации и элонгации цепей ДШ при репликации в облученных клетках и радиочувствительностью клеток разных линий;

- исследование радиорезистентного синтеза ДШ в облученных клетках млекопитающих;

- определение повреждений структуры ДНК и механизмов ин-гибирования репликации ДНК в клетках млекопитающих после действия гипертермии;

- исследование закономерностей репликации ДНК в первичных суспензионных культурах клеток опухолей и нормальных тканей животных после действия облучения и гипертермии.

Научная новизна. Следующие новые факты и закономерности впервые получены в настоящей работе:

- репарация однонитевых и двунитевых разрывов ДНК, восстановление структуры нуклеоида и ДНК-мембранного комплекса является, вероятно, необходимым, но недостаточным условием для восстановления в облученной клетке способности синтезировать ДНК;

- установлена корреляция между величиной Д0 (радиочувствительностью клеток), определяемой по кривой выживаемости облученных редкоионизирующей радиацией клеток млекопитающих, и величиной Д 1 - характеристической дозой ингибирования инициации синтеза ДНК на 37%;

- установлена зависимость процесса восстановления синтеза ДНК в облученных клетках от синтеза белка и РНК и независимость от активности ДНК-топоизомеразы II, что предполагает участие в процессе восстановления индуцибельной ветви репликации ДНК, отличающейся по ряду свойств от нормальной полуконсервативной репликации ДНК;

- действие 5-фтордезоксиуридина и других ингибиторов синтеза ДНК стимулирует в клетках УФ-, гамма- и терморезистентный синтез ДНК;

- репликатквный комплекс в клетках, демонстрирующих фенотип Зупг- радиорезистенгный синтез ДНК - осуществляет "беспробельный" синтез ДНК на матрице, содержащей УФ-псвреядения;

- действие гипертермии при температуре 43°С и выше приводит к образованию разрывов ДНК, ингибирования репарации радиационных разрывов ДНК, а также подавлению процессов инициации и элонгации ДНК.

Совокупность полученных в диссертации результатов и теоретических обобщений можно рассматривать как новое направление в радиобиологии, изучающее свойства и роль неканонической репликации ДНК в облученных клетках млекопитающих.

Практическая значимость работы. Разработаны оптимальные условия культивирования первичных краткосрочных культур клеток из опухолей и нормальных тканей для изучения синтеза и репарации ДНК. Предложены графический и аналитический способы определения радиочувствительности и термочувствительности клеток млекопитающих' по степени подавления в них синтеза ДНК.

Полученные результаты вошли в монографию "Выживаемость облученных клеток млекопитающих и репарация ДНК" (авторы И.И. Пелевина, А.С.Саенко, В.Я.Готлиб, Б.И.Сынзыныс), опубликованной в издательстве "Энергоатомиздат" в 1985 г., а также использованы при написании монографии "Прогнозирование реакции опухоли на лучевую и лекарственную терапию" (авторы А.Н.Деденков, И.И.Пелевина, А.С.Саенко), опубликованной в издательстве "Медицина" в 1987 г.

В клинику НИИМР, Московский научно-исследовательский онкологический .институт им. П.А.Герцена, а также Харьковский НИИ медицинской радиологии МЗ УССР внедрены радиометрический и им-мунофлуоресцентный методы определения ДНК-синтезирующих клеток и оценки радиочувствительности клеток.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. При действии на клетки ингибиторов синтеза ДНК в них индуцируется УФ-, радио-и терморезистентный синтез ДНК; репликация ДНК в клетках с фенотипом Зупг имеет отличительные чёрты

от нормальной реакции ДЯК в клетках млекопитающих.

2. Степень подавления инициации репликации в клетках млекопитающих коррелирует с их радиочувствительностью.

Апробация диссертации. Основные положения диссертации доложены на итоговых научных конференциях молодых ученых КИИМР Й.'Н СССР в 1974, 1978 и 1982 гг., материалы которых опубликованы в сборниках "Радиация и организм"; на Ш и У1 Всесоюзных симпозиумах "Молекулярные механизмы генетических процессов", Москва, 1976, 1967; на Всесоюзном совещании "Механизмы повышения радиочувствительности опухолевых клеток", Ленинград, 1976; на УП и УШ Всесоюзных симпозиумах "Структура и функции клеточного ядра", Харьков, 1980, Пущино, 1984; на Всесоюзном симпозиуме "Механизмы радиационного поражения и восстановления нуклеиновых кислот", Пущино, 1980; на II Всесоюзном симпозиуме "Радиобиологические основы лучевой терапии", Ленинград, 1980; на I Всесоюзном биофизическом съезде, Москва, 1982; на УШ и IX Всесоюзных конференциях "Восстановительные и компенсаторные процессы при лучевых поражениях", Ленинград, 1982 и 1986; на рабочем- совещании "Радиомодификаторы в лучевой терапии опухолей", Обнинск, 1982; на координационном совещании программы "Модификатор", Обнинск, 1983; на Всесоюзном совещании "Структурно-функциональные аспекты репликации и репарации ДНК в норме и при облучении", Пущино, 1983; на XI Всесоюзном съезде рентгенологов и радиологов, Ереван, 1984; на II Всесоюзном совещании "Надежность биологических систем", Чернигов, 1983; на Всесоюзной конференции "Механизмы-действия ультрафиолетового света", Ялта, 1985; на 19 ежегодной конференции ассоциации европейских радиобиологических обществ, Прага, 1985; на I рабочем совещании "Прогнозирование в лучевой терапии опухолей", Обнинск, 1986; на Всесоюзном симпозиуме "Механизмы действия ионизирующих излучений на структуру и функцию белков", Львов, 1986; на I и 1П рабочих совещаниях "Энзимология матричного синтеза нуклеиновых кислот", Гатчина, 1984, Тбилиси, 1988; на международном симпозиуме "Репарация Д1К, повревдения хромосом и структура хроматина в связи с загрязнением окружающей среды", Москва, 1988; на И рабочем совещании "Проблема'синергизма а радиобиологии", Пущино, 1988.

Публикации. Основные результаты исследований изложены в 59 публикациях: 32 статьях в отечественных, зарубежных журналах' и сборниках, I монографии и 25 тезисах докладов.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из 6 глав, которым предшествует введение и которые завершаются заключением с общим обсуждением результатов исследований, выводами и практическими рекомендациями. Первая глава посвящена обзору литературы об известных закономерностях репликации ДЖ в норме и энзимологии синтеза ДЦК в облученных клетках про- и эукариот; вторая глава - описанию объектов и методов исследования. В остальных Ч главах излагаются результаты собственных экспериментальных исследований. Каждой главе предшествует небольшое введение с постановкой конкретной задачи исследования и каждая глава завершается заключительными замечаниями с обсуждением основных результатов, впервые полученных в данной работе. Диссертация изложена на 381 странице текста, включая рисунки, таблицы и список 'литературы. Работа иллюстрирована 88 рисунками, 15 таблицами. Список литературы включает 324 работы, из них 63 работы на русском языке и 261 - на иностранных языка.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В работе использовали следующие культивируемые в культуре клетки млекопитающих: лейкозные лимфобласты мыши, линия LL ; клетки человека HeLa , монослойная и суспензионная культуры; клетки китайского хомячка, линия FAF-28; фибробласты мыши, линия L929 ; клетки лимфомы мышей, суспензионная культура, радиорезистентная Ъ5178Г-й и L5178Y-S радиочувствительная сублинии. Штаммы опухолевых клеток, перевиваемые мышам: асцит-ная карцинома Эрлиха, карцинома легких Льюис, меланома BI6, саркома 37, тимома, а также нормальные клетки костного мозга и тимуса мышей.

Культивируемые клетки выращивали по стандартной методике в чашках Петри, мультивеллах, в атмосфере 5$ С0«> или во флаконах Kappeля, сцинтилляционных или пенициллиновых флаконах в обычных термостатах при 37°С в средах: 199, Игла, КЕМ (Serva , ФРГ), Фишера (Flow , Швеция) в зависимости от задач опыта с 10-20%-ной сывороткой крупного рогатого скота или 10^-ной фе-тальной сывороткой и антибиотиками отечественного производства. Перевиваемые опухоли пассировали на беспородных мышах или мышах гибридах ^.(СЗАхС^ВЮ.

- б -

Суспензию клеток получали по стандартным методикам, модифицированным к нашим условиям, применяя ферменты: коллагеназу • и ДЦК-азу (Serva, ФРГ). Для определения скорости синтеза ДНК клетки инкубировали вначале с С-тимвдином (2КБк/мл) для промечивания родительской ДНК, а затем с ^Н-тимидином (18,5 КБк/мл, фирма "Изотоп") в течение 10, 30 или 60 мин при 37°С. При работе с биопсийным материалом скорость синтеза ДНК определяли по вкЗгЛЩЙйкг'в" ДНК в пересчете^ на клетку. Для промечивания белков или клеточной мембраны клетки инкубировали с ^С-холинхлоридом (14 КБк/мл,, Amersh em »Англия) или %-лейцином (37,5 КБк/мл, "Изотоп").

Для выбора оптимальных условий культивирования клеток первичных суспензионных культур было проведено специальное исследование для приближения к условиям in vivo .

Клетки облучали гамма-лучами на установках Garama-Cell-220 (Канада), мощность дозы 2,4 Гр/мин и ГУТ-60, мощность дозы 0,8 Гр/мин при 23°С; УФ-облучение (254 нм) - с помощью лампы Phillips TÜV15 w с мощностью дозы 0,25 Дж/м^ сек в чашках Петри с заменой питательной среды на теплый фосфатный буфер. Для гипертермической обработки клеток флаконы с культурами помещали в водяной термостат на I ч при температурах(41-43) +0,5 °С. В разных экспериментах клетки обрабатывали формальдегидом (Merk, ФРГ), оксимочевиной и циклогексимидом (все: Serva, ФРГ), актиномицином Д (Reanal, Венгрия), 5-фтордезокси-уридином (Calbiochem, США). После промечивания родительской ДНК С-тимидином клетки в среде Ш>! или Игла обрабатывали различное время фДУ (Ю-6!/.), далее каждую из партий делили еще на 2 части, одну из которых облучали УФ- или гамма-лучами или подвергали действию гипертермии, затем меняли среду, добавляли %-тимидин и определяли скорость синтеза ДНК по отношению ^Н/^С в ТХУ-нерастворкмой фракции ДНК.

Молекулярную массу однонитевой Д1К и количество CP ДНК определяли с помощью метода седиментации в щелочных градиентах сахероаы (Сеечто и соавт., 1971, 1980). Седиментационные свойства ДШ-мембранного комплекса исследовали по модифицированной методике (Eikind, IS7I), при кратковременном лизисе клеток. Изменения в суперспирализованности ДНК определяли по скорости седиментации нуклеоида в присутствии бромистого зткдия (Cook, ВГ87.С11. IÍT75).

Методы исследования репликации ДНК: синтез ДНК в новых репликонах определяли седиментационным методом (Painter, Young, 1975; Walters, Hildebrand, 1975; Саенко и соавт., 1981), промечивая клетки через I ч после облучения в течение 10 мин с %-тимидином и определяя долго радиоактивности меньшую вную среднему размеру репликона для денного вида клеток.

нсервативной репликации ДЖ определяли с помощью равновесного центрифугирования в градиенте нейтрального CsCl (Smith et al., 1981; Brozmanova, 1982). Элонгацию ДНК - с помощью измерения размеров ДНК через различные промежутки времени после непрерывного промечивания %-тимидином с помощью центрифугирования в градиентах щелочной сахарозы (Брозманова, Сьтн-зыныс, 1983). Размер ДЖ, синтезированной в УФ-облученных клетках определяли с помощью импульсного промечивания и определения мол.массы ДШ в градиентах щелочной сахарозы (Brozmanova, 1985). Двумерный электрофорез белков клеток проводили по методу Ofcarrel (1978) совместно с С.Н.Нарыжным в лаборатории биосинтеза ДНК Института ядерной физики им. Б.П.Константинова АН СССР. Распределение клеток по фазам цикла определяли совместно с Н.П. Матылевич и В.Н.Афанасьевым в лаборатории методов исследования организации биоструктур Института биофизики АН СОСР.

Долю клеток в стадии синтеза ДЖ определяли с помощью авторадиографии (Епифанова, Терских, 1981) или с помощью разработанного в отделе радиационной биохимии НЮМР АМН СССР иммунофлуо-ресцентного метода с использованием антисывороток или антител к тимидину или однонитевой ДНК.

Каждый опыт повторяли 3-7 раз. При вычислении необходимых зависимостей использовали регрессионный анализ. Большую часть результатов обрабатывали с помощью стандартных методов статистической обработки с определением среднего арифметического и среднеквадратичной ошибки. Для аппроксимации полугенных данных аналитическими зависимостями использовали ЭВМ EC-I033.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

I. Подавление и восстановление синтеза ДНК в клетках после облучения

Одной из характерных реакций клеток на облучение является ингибирование синтеза ДНК. Количественные закономерности ингл-иирования изучают путем аналаза криво* доза-зцфект и кинетической кривой, показывающей степень подавления и скорость восстановления синтеза в разное время после облучения. На рис. I (кривая I) представлена дозная кривая ингибирования синтеза ДНК в клетках Hela после облучения.

Рис. I. Ингибирование синтеза ДНК в клетках НеЬа после гамма-облучения в разных дозах. По оси абсцисс - доза облучения, Гр; по оси ординат -скорость синтеза ДНК в клетках, определенная по отношению ^Н/* С радиоактивностей тимидина и выраженная в % к таковой для необ-лученных клеток.

1 - гамма-облучение;

2 - То же, но с предварительным облучением клеток в дозе 5 Гр за 4 ч до опыта.

Кривая состоит из 2 компонентов: первый резко изменяется с дозой облучения в интервале доз т 0 до 10 Грги,^ гибирование инициации синтеза репликонов; второй - изменяется постепенно при увеличении дозы и характеризует подавление более резистентного процесса - элонгации цепей ДНК. С помощью простых математических подходов, используя программу нелинейной регрессии из пакега программ СОМИ (НИИМР АМН СССР) на ЭВМ ЕС-ЮЗЗ осуществили аппроксимацию экспериментальных данных согласно формуле I, учитывающей ингибирование инициации и элонгации цепей ДНК при синтезе.

доза, ГС>

Буи (0) - а.,е-Ь1в + адв-1^ (I)

1'Дв: вуп (в) - скорость синтеза ДНК как функция дозы облучения; а^, Ъ^ - константы процесса инициации синтеза репликонов; а2» ь2 ~ к°нстанты процесса элонгации цепей ДНК.

Для контрольных необлученных клеток Буп (О) = а^ +■ а2 = 100$. Численные значения параметров для дозных кривых ингиби-рования синтеза ДЦК, полученных в собственных опытах или заимствованных из опубликованных работ, представлены в таблице I.

Таблица I

Параметры уравнения(I), описывающего ингибирование синтеза ДНК в клетках разных линий

Я» Тип клеток Параметры уравнения : Источник

а1 Ь1 : а2 : ъ2 : данных

I. Тимус мышей 14,5 0,64 65,5 0,01 Данная работа

2. Тимома мышей Е1-4 51,0 0,16 49,0 0,01 н

3. Костный мозг мышей 29,8 0,39 70,2 0,01 и

4. Гепатома Н22А 38,8 0,11 61,2 0,01

5. Ш 27.1 0,20 72,9 0,01 и

6. Ь517ОТ-Н 24,6 0,31 75,4 0,01

7. Ь?1787-3 42,0 0,43 58,0 0,01 н

8. НеЬа 52,3 0,15 47,7 0,01 п

Э. НеЬа ( У + У ) 35,3 0,21 64,7 0,01

10. НеЬа (ФДУ) 15,0 0,17 85,0 0,15 II

II. 1"5178? 38,7 0,29 6Т,3 0,01 Hama-Inaba,

12. МЮ 45,9 0,33 54,1 0,0001 1983 tf

13. 1X830 51,0 0,34 49,0 0,0001

14. 15. 16. СНО К1 Л хгб-1 НБ-27 36,3 57,0 38,2 о,те 0,18 0,28 63.7 43,0 61.8 0,01 0,01 0,01 Jeggo,1985 « Fainter, 1981

Представленные в таблице I параметры уравнения (I) для разных линий клеток можно интерпретировать следующим образом. Параметр. а характеризует потенциал ингибирования инициации репликации, т.е. л процентном отношении ко всему синтезу ДНК

выражает максимально возможную степень ингибирования инициации репликации, которая достигается при облучении клеток данной линии. Значение параметра ъ^, указывающего на степень изменения инициации с дозой облучения, для разных линий клеток различается и, вероятно, коррелирует с радиочувствительностью клеток. Параметр а^ характеризует потенциал ингибирования элонгации цепей ДНК; параметр ъ2, характеризующий изменение элонгации с дозой облучения, за некоторым исключением для мугантных линий клеток, практически одинаков для всех линий клеток и равен 0,01 Гр~*. Одинаковое значение параметра ъ2 для линий клеток, различающихся по радиочувствительности, позволяет считать, что ин-гибирование элонгации цепей ДЖ является событием, безразличным для судьбы облученных редкоионизирующей радиацией клеток.

Как следует из результатов, представленных в таблице Г, клетки разных линий и тканей значительно различаются между собой по величине ингибирования инициации синтеза ДНК при облучении в одной и той же дозе. На основании этих данных было проверено, существует ли корреляция между радиочувствительностью на клеточном уровне и степенью ингибирования инициации синтеза ДОС. Построив дозовые кривые ингибирования синтеза и вычленив из них графически участок ингибирования инициации синтеза ДНК для 4-х линий клеток (суспензионная культура Hela, АКЭ, костный мозг и тимус мышей), было установлено, что дозе Д0 соответствует подавление инициации синтеза на ^37% или в I/е раз. Этот факт позволил, исходя из одноударной кривой, описывающей инги-бирование синтеза ДНК в облученных клетках, по дозной зависимости ингибирования инициации оценивать радиочувствительность клеток

Представим ингибирование инициации в виде зависимости (ряс. 2):

Syn (Б)1 >

С помощью предложенной зависимости и основываясь на экспериментальных данных были определены значения Д ^ (дозы ингибирования инициации репликации) для восьми линий клеток и проведено сравнение со значениями Д0 для этих же клеток. Корреляционный график изображен на рис. 3.

о л ¿-Do

Рис. 2. Дознал зависимость ингибиро-вания инициации синтеза ДШ и схема ■ расчета Д ± - дозы инициации. По оси абсцисс - доза облучения, Гр; по оси ординат - подавление инициации синтеза ДНК, рассчитанная из дозной кривой ингибирования синтеза ДЖ, согласно уравнению (I); весь потенциал ингибирования принят за 100%. При дозе облучения, равной 0, скорость инициации Буа (0) 1 равна скорости инициации в контрольных клетках. При уменьшении инициации на 37$ значение Д1 будет соответствовать уравнению:

0,0-5)

откуда:

0,46 Ъ1

Рис. 3. Корреляционный график между значениями Д0 и Д^ для различных клеточных линий. По оси ординат - ; по оси абсцисс - соответствующие значения Д0. Коэффициент корреляции 0,99. Вертикальные и горизонтальные отрезки - 95^-ные доверительные интервалы средних значений. Приведены данные для клеток: первичных культур костного мозга (I) и тимуса мышей (2); суспензионных культур НеЬа (3), 15178T-R (5) и L5178Y-S (6), АКЭ (7); моно-слойных культур:фибробластов человека линии HS27 С4), китайского хомячка линии СНО KI (8).

Как видно из графика на рис. 3, существует хорошая корреляция между значениями Д ^ и До; коэффициент корреляции г = 0,99.

Отличительной особенностью синтеза ДНК в облученных клетках является способность к восстановлению после действия облучения в умеренных дозах (до 10 Гр). На рис. 4 представлены кривые подавления и восстановления синтеза ДНК в клетках Hela после гамма-облучения в дозе 10 Гр.

Рис. 4. Ингибирование и восстановление синтеза ДНК в клетках Hela после гамма-облучения. По оси абсцисс - время инкубации после облучения, ч; по оси ординат - скорость синтеза Д1К, отношение С радиоактивностей ДНК, выраженное в % к контролю.

1 - облучение, 10 Гр;

2 - ЦГ+облучение;(1мкг/мл)

3 - АД, 0,05мкг/мл+облучение;

4 - НБ, ЮОмкг/мл+облучение.

120.

100.

Как видно из графика (кривая I), изменение скорости синтеза ДНК после облучения отражает протекание в клетках двух процессов: с одной стороны - это подавление инициации синтеза репликонов, а с другой - восстановление способности к инициации в облученных клетках. Наименьшая скорость синтеза ДНК наблюдается через 2 ч после облучения, затем начинает преобладать процесс восстановления: к 4 ч инкубации после облучения скорость синтеза ДНК достигает контрольного значения, а затем и несколько превосходит его. Вполне логично, описывая кинетическую зависимость подавления и восстановления синтеза ДНК в облученных клетках, предполагать, что причиной ингибирования синтеза ДНК является образование повреждений в хроматине клеток.,- препятствующих нормальному функционированию репликативных комплексов, а восстановление синтеза ДНК происходит по мере ликвидации этих повреждений. И если первая часть этого утверждения по-прежнему осталась незыблемой, то опыты с облученными клетками мышей линии ЬЬ, ас-

цитной карциномы Эрлиха;ЯеЬа показали, что заметное восстановление скорости синтеза ДОК начинается спустя некоторое время после завершения репарации основной части повреждений ДНК. Например,-с помощью седиментации в щелочных градиентах сахарозы установлено, что среднечисленная молекулярная масса ДНК клеток линии Ы/ после облучения в дозе 30 Гр снижается: (1,07 + 0,15)10® Дальтон в контроле и (0,65 + 0,09)10® Д после облучения. Инкубация облученных клеток при 37°С приводит к увеличению мол.массы ДНК практически до контрольного значения: (1,06 + 0,08)108Д. За 30 мин после облучения в дозе 10 Гр происходит восстановление суперспиральной структуры ДНК клеток HeLa, LL и АКЭ, за это же время восстанавливаются седиментационные свойства ДНК-мембранного комплекса этих клеток, а за 60 мин происходит ликвидация ДР ДНК. Однако поскольку восстановление синтеза ДНК в облученных клетках начинается значительно позднее завершения процессов восстановления основной части повреждений, то совокупность данных о репарации ДНК и её надмолекулярных комплексов и восстановлении синтеза ДНК дает основание для заключения, что завершение репарации основной части повреждений ДНК и её надмолекулярных комплексов является, может быть, необходимым, но недостаточным условием для восстановления синтеза ДНК в облученных клетках.

Начало восстановления синтеза ДНК в облученных клетках НеЬа, наблюдаемое через 2 ч инкубации после облучения (рис. 4, кривая I) может быть объяснено истинным восстановлением синтеза ДНК в клетках, находящихся в момент облучения в s-фазе цикла и перераспределением клеток по фазам цикла, вызванным облучением. Г окно также предположить, что восстановление синтеза ДНК в облученных клетках имеет индуцибельную природу и, следовательно, зависит от догпнителького синтеза белков de novo . Косвенно ото предположение можно проверить, ингибируя синтез белка циклогексимидом (ЦТ), а синтез FHK - актиномицином Д. Как следует из данных, представленных на рис. 4, присутствие в среде инкубации ЦТ в концентрации I мкг/мл подавляет процесс восстановления синтеза ДНК в облученных клетках (ЦТ в данных концентрациях подавляет синтез белка, судя по включению меченого лейцина, на 50%). АД подавляет процесс восстановления синтеза ДНК в облученных клетках полностью. Следует отметить, что как ЦТ, так и АД не являются nnfinvrtuv---......- "«гибитотми синтеза

белка и РНК, но ингибируют также и синтез ДЖ.:

Поэтому результаты на рис. 4 приведены с учетом ингибирования этими агентами нормальной репликации ДНК.

Зависящая от синтеза новых белков или увеличения юс количества ветвь репликации ДНК, которая принимает участие в восстановлении синтеза ДОК в облученных клетках, может по своей природе отличаться от нормальной конститутивной (канонической) репликации ДНК. Как известно, нормальная репликация ДЖ ингибиру-ется новобиоцином и тенипозидом ( VM 26) - ингибиторами фермента топоизомеразы П. Если облученные клетки НеЬа инкубировать с НБ (100 мкг/мл, 37°С), скорость синтеза ДЖ в контрольных необлучен-ных клетках подавляется на 44 +8$, но НБ не влияет на восстановление синтеза ДЖ в облученных клетках (рис. 4, кривая 4). Аналогичные данные получены при инкубации облученных клеток L929 с новобиоцином (200 мкг/мл) и тенипозидом (12,5 Л). Однако на процесс увеличения скорости синтеза ДНК в облученных клетках оказывает влияние не только восстановление синтеза ДНК в клетках, находящихся в момент облучения в s -фазе. В эффект увеличения скорости синтеза ДЖ должны вносить свой вклад и клетки, "приходящие" в S -фазу из фазы g-j при отсутствии длительного блока на границе G^/S. В работе была исследована с помощью метода проточной флуорометрии структура клеточной популяции НеЬа в разные сроки после облучения. Как известно, клетки в логарифмической стадии роста находятся в равновесном состоянии в отношении количества клеток в разных фазах цикла за счет постоянного движения клеток по ииклу. Облучение нарушает это "равновесное состояние", вызывая временное перераспределение клеток по фазам цикла (рис. 5). В то время, как структура клеточной популяции контрольных клеток в течение 24 ч не претерпевает сколь-нибудь значительных изменений (прямые на рис. 6а, б, в), после облуче-® ния наблюдается убыль клеток из G-, и накопление их в S , а зз-Této, и в Gg- ^ первый ч после облучения распределение клеток по «азам цикла не обличается от такового для контрольной популяции югеток, тогда как скорость синтеза ДНК б этоЗвремя минимальная (см. рис. 4 и рис. 5. Начиная со 2-го ч после облучения зафик- ■ сирована убыль клеток из фазы G,, на фоне постоянного количества клеток в G2+ V. Следовательно, увеличение скорости синтеза.

£ а) с, (а.)

7Э J

в, Gt+M

4 I « и я

врм.Ч

Рис. 5. Изменение структуры популяции клеток Hela после облучения. По оси абсцисс - время после облучения, ч; по оси ординат - доля клеток в определенной фазе клеточного цикла, %.

1 - контроль;

2 - после гамма-облучения в дозе

10 Гр;

а - клетки в фазе G^CGq); б - клетки в фазе S; 4

в - клетки в фазах G2 + М.

ДНК, наблюдаемое к 3 ч после облучения, является следствием восстановления синтеза ДНК в клетках, находящихся в момент облучения в фазе синтеза ДЖ, а также перераспределением клеток по фазам цикла, вызванным облучением, в частности стимулированным облучением переходом, части клеток из фазы G^ в s. Восстановленный в облученных-клетках синтез ДНК, кроме нечувствительности к действию ингибиторов нормальной репликации ДШ новобиоцину и тени-позиду, а также афидиколину - ингибитору ДЖ-полимеразы оL С Ventura et al.,I987), характеризуется также большей устойчивостью к'действию повторного гамма-облучения (рис. I, кривая 2). В совокупности эти данные позволяют предполагать функционирование . в облученных клетках индуцибельной ветви репликации ДНК, отличающейся по некоторым своим характеристикам от нормальной репликации ДНК, функционирующей в "обычных" необлучеиных клетках. Вероятно, роль этой ветви репликации ДНК состоит в том, что с её

помощью клеткам удается своевременно синтезировать полный набор ДНК, необходимый им для последующего деления.

Меньшей чувствительностью к действию облучения характеризуется не только восстановленный после действия гамма-облучения

синтез ДНК, но также и синтез ДНК после обиаботки. клеток 5-

/жт,„, д основном..

фтордезоксиуридином (ФДУ), действие которого^сЬяЭано с ингибиро-

ванием фермента биосинтеза Д1К тимидилатсинтетазы. Используя в качестве показателя скорости синтеза ДНК включение ^Р, утилизируемого по основному пути биосинтеза предшественников, установлено, что синтез ДОК ингибируется на 30$ после 6-часовой инкубации с ФДУ и на 70-80$ после длительной 24-часовой обработки с агентом. При этом 6-часовая инкубация клеток с ФДУ мало влияет на их жизнеспособность: выживаемость 85 + тогда как 24-часовая обработка уменьшает выживаемость до 51 + 6%.

Из данных, представленных на рис. 6, видно, что предварительная 6- и 24-часовая инкубеция клеток с аду цо-%) стимулирует у них УФ-резистентный синтез ДНК.

2. Радиорезистентный синтез ДНК

100

^___6 2 Рис. 6. Влияние предваритель-

ной инкубации клеток с ЗДУ на синтез ДНК в УФ-£блученных

клетках.

По оси абсцисс - время после облучения, ч; по оси ординат -

Ф 1 степень подавления синтеза ДНК в % к необлученному контролю.

„ -----------------„ -

I - Уф-облучение, 10 Дж/м ;

12 3 4 5 6 6Рвмя, у

2 - ОДУ, 6 ч+18 ч свежая сре-да+УФ-облучение (то же при инкубации с адУ в течение 24 ч перед облучением).

Предварительная инкубация клеток с ФДУ приводит также к стимуляции резистентного к действию гамма-облучения синтеза ДНК.

Поскольку включение ^Н-тимидина в ТХУ-нерастворимую ДНК является лишь косвенным показателем репликации ДНК, в специальных опытах с помощью равновесного центрифугирования в градиенте {¡¡£¡1 определяли, обусловлен ли УФ-резистентный синтез ДЦК именно полуконсервативной репликацией. Из седиментограмм равновесного центрифугирования, представленных на рис. 7, следует, что УФ-об-лучение ингибирует репликацию: это видно по уменьшению ^С-радио-активности ДЖ в пике промежуточной плотности. "Объем" репликации Д1К после УФ-облучения в дозе 10 Дж/м^ составляет 42% от контроля, а для клеток, инкубированных перед облучением с ФДУ (6 ч + 18 ч M0í) - 82%. В пределах ошибки опыта (до 10%) эти значения совпадают с таковыми, определенными с помощью включения ^Н-тимидина в ДНК (рис. 6). Эти результаты позволили сделать заключение, что УФ-резистентный синтез ДНК является полуконсерва-

Рис. 7. Седиментограммы ДДК клеток Hela после равновесного центрифугирования в нейтральных градиентах CeCi. По оси абсцисс - номер фракции градиента, считая от дна центрифужной пробирки; по оси ординат - ^Н или С радиоактивность ДНК, кмп/мин; на одной из осей ординат - плотность раствора CsCl , г/см^. В качестве плот-ностной метки использован бром-дез оксиурвдин. а - контроль;

б - УФ-облучение, Ю Дж/м2; в - инкубация с ФДУ, 6ч+18ч tíSá; г - то же, что к в, + УФ.

1 - 14С родительская ДНК;

2 - % - дочерняя ДНК;

3 - плотность раствора CsCl > г/е.м^.

тивным репликативным процессом.

Резистентный к УФ-облучению синтез ДНК в клетках НеЬа является, по всей вероятности, следствием остановки синтеза ДНК под действием ОДУ. Подтверждением этому заключению являются следующие данные: добавление в среду инкубации с ОДУ тимидина (10 !.!) полностью снимает эффект возникновения УФ-резистентного синтеза ДНК, а добавление уридина в той же концентрации не влияет на проявление этого феномена.

Известно (Kurek, Taylor, 1977), что длительная инкубация клеток китайского хомячка с ОДУ приводит к остановке и накоплению клеток в s-фазе. В работе-определено с помощью метода проточной цитометрии распределение клеток по фазам цикла в различных вариантах инкубации клеток с ОДУ.

Таблица 2

Число клеток в разных фазах клеточного цикла после инкубации с ОДУ (по данным проточной цитофлуорометрии)

Воздействие

Доля клеток в фазах цикла, %

G-l(G0> : s : G2 + М

62,0 ' 22,5 15,5

62,5 27,5 10,0

36,4 52,0 11,6

Контроль

ОДУ, 6ч + 18ч МЕЫ ОДУ, 24ч

Действительно, как видно из таблицы 2, длительная 24-часовая инкубация клеток с ФДУ приводит к накоплению клеток в Б -фазе цикла. Кратковременная (6 ч) инкубация клеток с ОДУ практически не меняет структуру клеточной популяции исследуемых клеток через 24 ч от начала обработки, а как было показано, резистентный синтез ДНК в этих клетках наблюдается в равной степени, что и после 6-часовой обработки. Т.е. изменениями структуры клеточной популяции (накоплением клеток в в-фазе цикла) нельзя объяснить приобретения клетками устойчивости к облучению.

Синтез ДНК, стимулированный в клетках НеЬа действием ФДУ, оказался резистентным не только к действию УФ-облучения, но и гамма-лучей. В экспериментах также установлено, что и другие ингибиторы синтеза ДНК: оксимочевина и само гамма-облучение -своим действием индуцируют в клетках УФ- и гамма-резистентный синтез ДНК (рис. I, кривая 2).

/

В работах Herrlich et al. (1Э82, 1986) показано, что обработка клеток китайского хомячка ингибиторами синтеза ДШ (окскмочевина, форболовый эфир, ^-облучение) вызывает в них повышенный синтез некоторых белков. Можно предположить, что повышение синтеза отдельных белков, необходимых для реализации радиорезистентного синтеза ДЖ, будет происходит и после обработки клеток ФДУ. Это предположение было проверено с помощью двумерного электрофореза белков клеток Hela в полиакриламидном геле и установлено, что после действия на клетки ФДУ, в частности, происходит существенное увеличение белка с мол. массой около 34 кД и изоэлектрической точкей, соответствующей pH 7,5-7,8.

Зависимость проявления рэдиорезистентного синтеза ДНК в клетках, обработанных ФДУ, можно также определить на основании косвенных данных, ингибируя белковый синтез ЦТ. В табл. 3 представлены данные о влиянии ЦТ на радиорезистентный синтез ДНК.

Таблица 3

Влияние циклогексимида (ЦТ) на радиационное ингибирование синтеза ДНК в клетках, инкубированных перед облучением с ФДУ

Воздействие 1 Включение -тимидина в ДНК

% к интактному i % к соответствующему

контролю ; контролю

Контроль 100 . 100.

10 Гр - 45,5 г 4,3

ЦТ 74,0 t 12,5 100

ЦТ + Ю Гр - 68,0 +. 6,5

аду 94,3 +14,0 100

аду + ю Гр - 86,7 + 10,8

ФДУ + цг 114,5 + 23,4 100

аду + цг + ю Гр - 54,5 + 5,6

■Как видно из этой таблицы, в клетках, обработанных ФДУ, синтез ДНК ингибирован в меньшей степени, чем в контрольных: 86,7% против 45,6?. Если же в промежутке мелщу воздействием ФДУ и гамма-облучением клетки инкубировали с ЦТ в концентрации I мкг/мл (степень подавления синтеза белка, определенная по вклю-

чению %-лейцина составляет около 50%), то радиорезистентный синтез не стимулируется. Аналогичные данные получены для клеток НеЬа, облученных УФ-светом. В этих опытах клетки обрабатывали ФДУ (6 ч) и ЦТ в концентрации 10 мкг/мл (степень подавления синтеза белка - 90%) причем время и "точка приложения" действия ЦТ в схеме опыта варьировали. Установлено, что ЦТ не влияет на степень кнгибирования синтеза ДНК в УФ-облученных клетках; обработка клеток ФДУ стимулирует у них УФ-резистентный синтез ДНК, а добавление ЦТ полностью устраняет эффект стимуляции УФ-резистентного синтеза ДЖ после действия ФДУ.

Вероятно, радиорезистентный синтез ДНК, стимулированный в клетках действием ФДУ, имея индуцибельную природу, является следствием: I) изменений в структуре реплицирующегося хроматина и 2) возможных изменений в функционировании репликативной "машины". Для определения изменений в структуре реплицирующегося хроматина исследовали суперспиральную организацию ДЖ в ядре клеток НеЬа, обработанных ФДУ, с помощью определения скорости седиментации нуклеоида в нейтральных градиентах сахарозы, содержащих бромистый этидий ( EtBr ) в различных концентрациях. На рис. 8. представлены данные о седиментации нуклеоида клеток НеЬа в зависимости от концентрации EtBr , вычисленные в % от скорости седиментации нуклеоида интактных клеток при нулевой концентрации EtBr Как видно из этого рисунка (кривая I), при увеличении концентрации EtBr от 0 до 5 мкг/мл происходит уменьшение скорости седиментации нуклеоида за счет релаксации суперспиральной ДЖ, вызванной интеркаляцией EtBr в ДЖ. При концентрации EtBr 5 мкг/мл степень релаксации нуклеоида максимальна, а при дальнейшем увеличении концентрации EtBr снова начинает убывать, а скорость седиментации возрастать, что свидетельствует об образовании положительной суперспирали ДЖ с образованием супервитков противоположного знака (Cook, Brazell, 1975). Если клетки обрабатывали ФДУ в течение 24 ч (кривая 2) или 6 ч (кривая 3), то наблюдается увеличение скорости седиментации нуклеоида при всех концентрациях EtBr . В наибольшей степени это выражено для нуклеоида клеток, инкубированных 6 ч с ФДУ и 18 ч в свежей среде. Различие с другим вариантом обработки ФДУ, вероятно, связано с тем, что при'более длительной инкубации (24 ч) с ФДУ в ДЖ возникают также 0Р ДНК за счет инцизии включенного в ДЖ ФДУ

Рис. 8. Седиментация нуклеоида клеток НеЬа, обработанных ФДУ, в зависимости от концентрации EtBr в центрифужной пробирке.

По оси абсцисс - концентрация EtBг , мкг/мл; по оси ординат - скорость седиментации нуклеоида в % от таковой для нуклеоида интактных клеток (а) или в % от собственного контроля при нулевой концентрации EtBr (б).

1 - без обработки ФДУ;

2 - ФДУ, 24 ч;

3 - ФДУ, 6 ч + 18 ч свежая среда МЕМ.

(Количество ОР ДНК, определенное с по-

на фрагмент ДНК, равный 10® Д, равно 0,1 + 0,03 после 24-часовой обработки клеток ФДУ и 0,04 + 0,03 после 6-часовой инкубации с ФДУ. Полученные результаты по увеличению скорости седиментации нуклеоида можно трактовать, сделав выбор из следующих возможных механизмов, в результате действия которых происходит увеличение скорости седиментации нуклеоида: I. увеличение суперспирализованности ДНК в ядре; 2. реорганизация доменной структуры хроматина, делающей его более компактным. Что&л подтвердить (или опровергнуть) предположение, что увеличение ^¡корости седиментации нуклеоида после воздействия ФДУ связано с увеличением суперспирализованности ДНК в ядре, кривые "титрования" нуклеоида бромистым этидием были просто перестроены в % к скорости седиментации нуклеоида, но не интактных клеток, а собственного контроля с обработкой ФДУ при нулевой концентрации EtBг (рис. 86). Как видно из этого рисунка, после инкубации с ФДУ (в любой модификации) нуклеоид релаксирует в значительно меньшей степени при концентрации , равной 5 мкг/мл, чего нельзя было ожидать, если бы действие ФДУ

приводило к увеличению суперспирализованности ДНК в ядре. Следовательно, увеличение скорости седиментации нуклеовда после действия ЗДУ обусловлено не увеличением степени суперспирализации ДОС, а изменением доменной структуры хроматина. Об изменениях в структуре реплицирующегося хроматина свидетельствуют также наши данные об увеличении прочности связи ДЩ с белками, а также результаты работы Б'Anna, ТоЪеу (1984) о частичной перестройке ДНК-гистоновых взаимодействий, а также работы Kurek, Taylor (1977) о возможном появлении дополнительных сайтов инициации репликации ДНК после обработки клеток HeLa и китайского хомячка ФДУ. Имеющиеся в распоряжении данные позволяют представить гипотетическую реорганизацию структуры хроматина под действием ФД7 в виде следующей схемы, представленной на рис. 9.

Рис. 9. Предполагаемая схема реорганизации доменной структуры хроматина после воздействия ФДУ. А - домен хроматина, включающий кластер репликонов. Б - релаксация суперспиральной структуры домена под действием облучения или EtBr .

В - реорганизация - превращение домена в отдельные субдомены с автономной регуляцией репликации. Г - релаксация субдоменов под действием облучения или EtBr . '

Согласно современным представлениям, каждый домен в хроматине интактных клеток включает в себя кластер репликонов, репликация в которых индуцируется синхронно (Hand, 1988; Hartwig, 1983). Увеличение скорости седиментации нуклеоида после действия ФДУ, обнаруженное в опыте, можно предположительно рассматривать как перестройку доменов, содержащих кластеры репликонов, в субдомены, содержащие отдельные репликоны. Как видно из схемы на

А В

ФДУ sfi^Mi^

ЯДЕРНЫЙ М/ГЛШС -► ЯДЕРНЫЙ МЛТРИКС

Et бг у Etßrj у

Б /Л Г

м

ядерный мтрж ядерный м/ггрикс

рис. 9, при воздействии ФДУ должен уменьшаться эффективный размер мишени при действии квантов УФ-света или ионизирующей радиации. Поэтому инициация репликации ДНК в таких клетках ингиби-руется в меньшей степени и потенциально летальные повреждения ДШ в процессе репликации с большей вероятностью, чем в обычных клетках фиксируются в летальные. Подобная реорганизация реплицирующегося хроматина может, в частности обеспечиваться за счет дополнительного синтеза "якорных" белков, с помощью которых происходит "фиксация" ДОК на ядерном матриксе. При этом, вероятно, происходит изменение регуляции с кластерного типа репликации на монорепликонный с использованием дополнительных сайтов инициации репликации и, как следствие, уменьшение среднего размера репликонов. Это, однако, существенно не сказывается на жизнеспособности клеток.

УФ-резистентному синтезу ДНК свойственен иной, нежели в интактных клетках тип репликации ДНК. Как известно, размер фрагментов ДОК, синтезированной на матрице, содержащей УФ-поврежде-ния, например, пиримидиновые димеры, ниже такового для контрольных, необлученных клеток (Eupp, Howard-Flanders, 1968; Lehman, 1983). Это свидетельствует, что репликативный комплекс, осуществляющий репликацию, останавливается на УФ-повреждениях, в результате чего в дочерней ДНК образуются пробелы или гэпы. Как видно из данных,.представленных на рис. 10а, седиментационное распределение внов^синтезированной ДНК в щелочном градиенте сахарозы смещено в сторону более низких значений мол. масс. По-иному, вероятно, происходит репликация ДИК в УФ-облученных клетках НеЬа, обработанных предварительно ФДУ. Как видно из результатов, представленных на рис. 106, седиментационное распределение ДНК, синтезированных в УФ-облученных клетках, демонстрирующих УФ-резистентный синтез ДНК, практически не отличается от распределения ДНК, синтезированной в соответствующих контрольных клетках. Эти результаты позволяют сделать вывод о том, что' после обработки клеток ФДУ репликативнй комплекс ведет "беспробельный" синтез ДНК на матрице, содержащей УФ-повреждения. Это не связано с более эффективной эксцизией пиримидиновых димеров из ДНК, т.к. кинетика эксцизии пиримидиновых димеров в контрольных и ФДУ-обработанных клетках одинакова.

Рис. 10. Седиментограммы вновьсинтези-рованной ДНК в клетках HeLa после инкубации с ФДУ и/или УФ-облучения. По оси абсцисс - номер фракции; по оси ординат - процент радиоактивности в каждой фракции ДНК по отношению ко всей радиоактивности на градиенте, а - интактные клетки Hela без обработки ВДУ;

б - после действия ФДУ, 6 ч + 18 ч МЕМ; I - контроль; 2 - УФ, 10 Дж/м*\ Импульсная метка %-тимидина 10 мин через 50 мин после УФ-облучения.

Исходя из гипотезы, что временное подавление синтеза ДНК в гамма-облученных клетках является своеобразной защитной реакцией клеток, направленной на более эффективное осуществление ре-паративных процессов, при радиорезистентном синтезе ДНК следует ожидать значительного увеличения гибели облученных клеток после предварительной инкубации с ФДУ. Результаты по определению скорости синтеза ДНК и выживаемости клеток НеЬа после комбинированного воздействия ФДУ и гамма-облучения представлены в табл. 4.

Таблица 4

Скорость синтеза ДНК и выживаемость клеток НеЬа после действия ФДУ, гамма-облучения и их комбинированного

воздействия

; Условия обработки клеток

I ■ бТр :фду,6ч+18ч мил:еду,бч -+8ч+бГр

Скорость синтеза Д60 + 5 100 92 +2

Выживаемость, % 20 +3 91 + 4 5 + 0,05

Как следует-из этой таблицы, ФДУ в используемой концентрации незначительно влияет на жизнеспособность клеток, облучение вызывает гибель 80% клеток. Если же после обработки ФДУ клетки выдерживали в свежей питательной среде 18 ч при 37°С и далее облучали, гибель клеток в значительной мере увеличивалась: выжи- .

НОМЕР ФРАКЦИИ

ваемость составляет Ъ%. Этот результат свидетельствует о синер-гическом действии на клетки двух агентов и подтверждает предположение, что при радиоустойчивом синтезе ДНК повышается гибель облученных клеток.

3. Повреждения и репликация ДНК в культивируемое клетках млекопитающих после действия гипертермии

В качестве модификатора при лучевом лечении опухолей, как известно, все шире используется гипертермия (Курпешев, Коноплян-ников, 1981; Цыб и соавт., 1988).

К действию гипертермии преимущественно чувствительны клетки, находящиеся в клеточном цикле в стадии синтеза ДНК ( Westra, Dewey, 1971). Поскольку гипертермия вызывает в хроматине клеток млекопитающих иной, нежели УФ- или гамма-облучение, тип повреждений ДНК и хроматина (Roti Roti, Winward, 1978), изучение корреляций между подавлением репликации и выживаемостью клеток при таком воздействии может иметь особое значение для выяснения биологической роли подавления синтеза ДНК. Клетки АКЭ, китайского хомячка или Hela нагревали I ч при температуре 43°С и определяли мол.массу родительской и вновь синтезированной ДНК седиментационным методом. В этих экспериментах было установлено, что действие гипертермии приводит к образованию 0,8 + 0,1 0Р ДНК в клетках АКЭ и I + 0,2 ОР ДНК в клетках китайского хомячка или Hela в расчете на молекулу ДНК с мол.массой 10^ Д, т.е. соизмеримой с размером кластера репликонов. Кроме образования разрывов в хроматине клеток возникает другой тип повревдений, свойственный гипертермическому воздействию - увеличение содержания белков теплового шока, а также других белков хроматина (Roti Roti, Winward, 1978). Эти повреждения, вероятно, и нарушают процесс репликации ДНК в клетках. На рис. II представлены седиментограммы ДНК, синтезированной за 10 мин в клетках Hela после действия гипертермии.

Как видно из представленных данных, после действия гипертермии нарушаются как процессы ингибирования инициации синтеза репликонов, так и элонгации цепей ДНК. О нарушении процесса инициации синтеза свидетельствует уменьшение доли ДШ не седи-ментограмме между фракциями 10 и 15; отметим, что средний размер

10 J

г

u

I §

«^A-AV

5 10 15 houep фрдкции

20

Рис. II. Седиментограммы им-пульсно меченной однонитевой ДПС, синтезированной в клетках Hela после действия гипертермии.

По оси абсцисс - номер фракции сахарозного градиента; по оси ординат - процент радиоактивности ДНК во фракциях по отношению ко всей радиоактивности на градиенте. Седиментация справа-налево.

1 - контроль;

2 - гипертермия, I ч, 43°С.

7 p*t al..

репликона для клеток НеЬа равен 2-10 ( Oleaver Г1983) и соответствует 12-фракции на градиенте для данных условий центрифугирования. На ингибирование элонгации ДНК в пределах репликона указывает появление, пика радиоактивности ДНК в районе 18-22 фракций, что значительно меньше размера репликона. Вероятно, ингибирование процесса инициации синтеза ДНК обусловлено появлением разрывов ДНК, а подавление элонгации связано, в основном, с присоединением к реплицирующему хроматину белков теплового шока, а также частичной инактивацией ферментов репликативного комплекса. Кроме ферментов репликации, действие гипертермии в большей степени инактивирует репаративный фермент ДНК-полимеразу J , чем, в частности, обусловлено ингибирование гипертермией репарации ДНК в клетках АКЭ, впервые установленное в настоящей работе.

Если предполагать, что ингибирование синтеза ДНК в клетках, обработанных гипертермией, также, как и в случае облучения, является защитной реакцией клеток, налравленной на более эффективную ликвидацию гипертермических повреждений в хроматине клеток, то "отмена" этого ингибирования должна приводить к увеличению гибели клеток.

Как видно из рисунка 12, в прогретых клетках скорость синтеза ДНК составляет 30% от контрольного значения (кривая I). Если клетки инкубировать перед облучением с ВДУ (6 ч + 18 ч СС), то скорость синтеза ДНК равна 65-80$ от соответствующего контро-

Рис. 12. Синтез ДНК в клетках НеЬа после инкубации с ФДУ и действия гипертермии. По оси абсцисс - время инкубации с %-тимидином, ч; по оси ординат - скорость синтеза ДНК в % от таковой в контроле (с ФДУ или без ВДУ).

1 - гипертермия, I ч, 43°С;

2 - ФДУ, 6 ч плюс 18 ч свежая

среда,плюс гипертермия.

ля. Более резистентный к нагреванию синтез ДНК наблюдали также после 2-часовой инкубации с ФДУ с последующей 22-часовой инкубацией в свежей среде.(50-60$ от соответствующего контроля). В этих же условиях обработки клеток ФДУ и гипертермией была определена выживаемость клеток НеЬа (эксперименты проведены совместно с В.С.Пятенко). В этих экспериментах было установлено (см. табл. 5), что инкубация клеток в течение 2 или 6 ч с ЩЦУ практи--чески не оказывает цитотоксического действия на клетки Hela; используемый режим гипертермической обработки (43°С, I ч) приводит к гибели около половины клеток. При комбинированном воздействии ВДУ и гипертермии происходит синергическое увеличение гибели клеток. Таким образом, предварительная инкубация клеток с адУ индуцирует в них резистентный к нагреванию синтез ДНК и сенсибилизирует клетки к последующему нагреванию.

Таблица 5

Выживаемость клеток НеЬа после инкубации с ФДУ и/или действия гипертермии (Г) и их комбинированного воздействия

Вариаии опыта

Доля выживших клеток, выраженная в единицах контроля при разной продолжительности инкубации клеток с ЗДУ и в свежей среде

0+24

2 + 22

6+18

9

аду аду + г

I + 0,06 0,55 + 0,03

0,97 + 0,04 0,33 ± 0,01

0,82 + 0,04 0,34 + 0,01

Согласно существующим представлениям, в основе действия гипертермии на репликацию и репарацию ДОК лежат изменения в структуре хроматина. В работе показано, что действие гипертермии приводит к образованию разрывов ДНК; из литературы известно ( Wheeler, Wärters, 1983), что белки теплового шока связываются с хроматином в местах, где происходит инициация репликации ДНК. Ингибирование синтеза ДНК при гипертермии, следовательно, можно объяснить как образованием разрывов ДНК, так и тем, что белки теплового шока препятствуют функционированию ДНК полимераз при инициации и злонгации цепей ДОК. В таком случае резистентный к нагреванию синтез ДНК, вероятно, обусловлен увеличением числа точек инициации за счет действия ФДУ, а также их нечувствительностью к белкам теплового шока. В результате изменения в репликации ДНК реализуются в виде сенсибилизации клеток под влиянием ФДУ к действию гипертермии. Причиной повышенной чувствительности к нагреванию в обработанных ФДУ клетках является реализация повреждений во время синтеза ДНК, стимулированного действием ФДУ.

В последние года первичные суспензионные культуры клеток опухолей и нормальных тканей используют для оценки и прогнозирования терапевтической эффективности различных химиопрепара-тов. Поэтому актуальной является задача разработки и выбора тест-системы, на основании которой можно было принимать решение о пригодности или перспективности того или иного способа лучевого или гипертермического лечения. В настоящей работе исследованы осоёенности синтеза ДНК в клетках опухолей и нормальных тканей с целью их использования в качестве критерия эффективности действия облучения или гипертермии.

При исследовании на клетках карциномы Льюис, АКЭ, саркомы 37 и костного мозга мышей определены оптимальные условия культивирования первичных суспензионных культур клеток для определения синтеза и репарации ДНК. Показано, что в первые 3-4 ч инкубации' in vitro в питательной среде с HEPES-буфером (20 iffl) клетки в значительной степени сохраняют особенности синтеза ДНК in vivo. После выбора оптимальных условий культивирования было исследовано влияние гипертермии на синтез ДНК в клетках различных опухолей. Было исследовано влияние гипертермии на ингибирование и восстановление синтеза ДНК в клетках опухолей

мышей: АКЭ, карциномы Льюис, саркомы 37 и мелэномы BI6. Показано, что различные типы опухолей по-разному реагируют на гипертермию по критерии подавления и восстановления синтеза ДНК. Гипертермия, как было показано в предыдущем разделе, эффективно инги-бирует как инициацию, так и элонгацию цепей ДНК. Поэтому можно полагать, что степень ингибирования общего включения радиоактивного тимидина в ДНК будет коррелировать с термочувствительностью клеток, определенной по их клоногенной способности. Такие опыты были выполнены на клетках АКЭ, отличающихся высокой эффективностью клонирования (Колесникова А.И., 1988). В данных экспериментах биологическим критерием чувствительности клеток к гипертермическому воздействию служила клоногенная способность клеток, определенная по эффективности роста колоний в диффузионных камерах (Штейн и соавт., 1986). Величины Д ауп ("доза" гипертермии, подавляющая включение %-тимидина до 37%) и Д0 выражали в минутах инкубации при определенных температурах как для синтеза ДНК, так и выживаемости клеток. При инкубации клеток АКЭ при 41°С величина Д вуп определенная по подавлению синтеза ДШ, равна 57,1 мин: для этих же клеток (результат получен в том же эксперименте) значение Д , определенное по клоногенной способности, равно 60,6 мин. Соответствующие значения Д syn и Д0 для гкпертермичес-кого воздействия при 43°С равны 17,6 и 18,5 мин.

Теким образом, можно сделать заключение, что по степени подавления инициации синтеза ДНК можно оценивать радиочувствительность клеток; для оценки термочувствительности клеток, вероятно, достаточно определения подавления общего синтеза ДНК по степени подавления включения меченного предшественника ДНК.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенных исследований показано, что после действия ингибиторов синтеза ДШ, в также облучения в клетках млекопитающих начинает функционировать механизм репликгции ДНК с необычными свойстврчи. Его возникновение:

- подавляется ингибиторами синтезг белтся ЦТ и ингибитором синтеза FHK - ЛД;

- не подо р. пяется уцгибкторями нормальной репликации ДШ новобиоцкном г ТП1ИПОПИДОМ (VM26 ), дгйг.твуктцим;/ н» фермент топоизомарсзу П.

По-видимому, эту ветвь полуконсервативной репликации ДОС характеризуют и другие, возможно, более отличительные свойства. Роль этой ветви репликации ДИК состоит в синтезе полного, хотя, возможно, и неполноценного в функциональном отношении, набора ДНК в клетках, который позволил бы ей поделиться с образованием дочерних клеток.

Важным также следует считать выявление корреляций между степенью ингибирования инициации репликации ДЙ и радиочувствительностью клеток, а также степенью ингибирования включения радиоактивного предшественника ДЖ и термочувствительностыо клеток при гипертермической обработке. Эти данные могут быть основой при разработке метода оценки к прогнозирования эффективности лучевого и гипертермического лечения опухолей человека. Проявление радиорезистентного способа синтеза ДЖ также сопровождается :

- реорганизацией структуры хроматина, вероятно, с заменой кластерной организации реплициругащег^хроматина на монорепликон-ную;

- "нечувствительностью" ДШ-реплицирующего комплекса к УФ-поврездениям в ДНК - способностью осуществлять "беспробельный" синтез ДНК на поврежденной матрице.

Логически обоснованным является дальнейшее развитие этих направлений исследований и, в честности, решение следующих задач:

- исследование природы и функции белков, синтез которых "обеспечивает" радкорезистентную репликацию ДНК и восстановление синтеза ДЖ в облученных клетках;

- идентификация генов, кодирующих белки, которые ответственны за радиорезистентную репликацию;

- изучение репликации ДМ в клетках млекопитающих после Действия плотноионизирутощих излучений и установление функциональной зависимости ОБЭ от степени ингибирования инициации и элонгации ДНК;

- использование предложенной схемы расчета Д ^ на основании зависимости подавления синтеза ДЖ от дозы облучения для определения Д0 для клеток опухолей и нормальных тканей человека.

выводы

1. Репарация ОР и ДР ДНК, восстановление структуры ДНК-мембранного комплекса и нуклеоида клеток различных линий практически завершаются через 30-60 мин после облучения гамма-лучами в дозах до 10 Гр, тогда как восстановление синтеза ДНК начинается лишь через 2-3 часа инкубации после облучения. Следовательно, ликвидация основной части повреждений ДНК, завершение репарации надмолекулярных комплексов является недостаточным условием для восстановления ингибированного облучением синтеза ДНК.

2. Определены численные значения параметров ингибирования инициации и элонгации цепей ДНК в облученных клетках. Показано, что степень подавления инициации синтеза репликонов после облучения коррелирует с радиочувствительностью клеток, а зависимость торможения элонгации от дозы гамма-облучения одинакова для различающихся по радиочувствительности клеток. Установлено численное равенство между величиной Д0, рассчитанной по кривой выживаемости клеток, и величиной Д1 - характеристической дозой ингибирования инициации синтеза ДШ на 37$.

3. В клетках млекопитающих в первые 2 часа после облучения гамма-лучами в дозе 10 Гр синтез ДШ прогрессивно ингибируется на 35-50$, а затем к 4-5 ч восстанавливается. Восстановление синтеза ДНК в облученных клетках подавляется ингибиторами синтеза белка и ШК, но практически не подавляется ингибиторами "обычной" репликации ДНК. Восстановленный синтез ДНК становится более устойчивым к действию повторного гамма-облучения в умеренных дозах. Эти данные предполагают функционирование в облученных клетках индуцибельной ветви репликации ДШ, отличающейся по некоторым свойствам от канонической репликации ДНК в клетках эукариот.

4. Предварительная инкубация клеток с ингибиторами синтеза ДШ: 5-фтордезоксиуридином (в нетоксической концентрации), окси-мочевиной или гамма-облучением клеток стимулирует в них синтез ДНК, резистентный к действию УФ-света, гамма-облучения

и гипертермии. Радиорезистентный синтез ДНК не является следствием перераспределения клеток по фазам цикла под действием ФДУ.

5. Радиорезистентный синтез ДНК - полуконсервативный репликатив-ный процесс, его становление подавляется ингибитором синтеза белка циклогексимидом и сопровождается повышенные синтезом некоторых белков, т.е., по-видимому, радиоустойчивый синтез ДНК является индуцибельным процессом.

6. ДНК-реплициручгцая система в клетках, демонстрирующих радиорезистентный синтез ДНК, ведет "беспробельный" синтез ДЖ на матрице, содержащей УФ-повреждения.

7. Стимуляция радиорезистентного и терморезистентного синтеза ДНК приводит к повышению чувствительности клеток к действию гамма-облучения и гипертермии. Это подтверждает представление о том, что временное ингибирование синтеза ДНК под действием повреждающих агентов является защитной реакцией клеток, способствующей, вероятно, более эффективному восстановлению клеток от повреждений.

8. Инкубация клеток асцитной карциномы Эрлиха и китайского хомячка при температуре 43°С и выше, усиливающая летальный эффект ионизирующей радиации, приводит к образованию ОР в ДЖ

и ингибированито репарации радиационных разрывов ДНК. Действие гипертермии ингибирует в клетках процессы инициации синтеза репликонов и элонгации цепей ДНК в пределах реплккона.

9. Клетки первичных суспензионных культур АКЭ, карциномы Льюис, саркомы 37 и меланомы В16 по-разному реагируют на гипертермию по критерию подавления и восстановления синтеза ДНК. Величина Д0 гипертермического воздействия, определенная по степени ингибирования суммарного синтеза ДЖ, инициации и элонгации в клетках АКЭ, совпадает по величине с Д0, определенной с помощью клонирования клеток в диффузионных камерах.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Коноплянников А.Г., Сынзыныс Б.И., Саенко A.C. Динамика репарации однотяжевых разрывов ДНК и сублетальных радиационных поврелздений в облученных клетках асцитного рака Эрлиха и влияние на эти процессы актиномицина Д // Радиобиология. -1974. - Т. 14. - С. 475-479.

2. Сынзыныс Б.И., Склобовская И.Э., Аненко Г.И. Участие ферментов репарации ДНК в её нормальной репликации // Тезисы докладов научной конференции молодых ученых и специалистов, г. Обнинск, 1974. - С. 183.

3. Саенко A.C., Сынзыныс Б.И., Смирнов Г.Б. Нарушение образования высокополимерной ДНК в клетках двойного мутанта//Докл. АН СССР, 1974. - Т. 214. - № 2. - С. 451-455.

4. Саенко A.C., Сынзыныс Б.И., Смирнов Г.Б. Образование двутя-жевых разрывов в процессе репликации ДНК // Радиоцитология-75. Ленинград, 1976. - С. 34.

5. Рябченко H.H., Саенко A.C., Иванник Б.П., Склобовская М.В., Сынзыныс Б.И., Малкин В.Н., Проскуряков С.Я. Об определении молекулярного веса однотяжевой- ДНК в клетках эукариот // Тез. докл. Ш Всесоюзного симпозиума "Молекулярные механизмы генетических процессов". Москва.-1976. - С. 58.

6. Коноплянников А.Г., Сынзыныс Б.И., Свиногеева Г.П., Штейн Л.В., Склобовская М.В., Саенко A.C. Влияние гипертермии на репарацию повревдений ДНК и на выживаемость клеток асцитного рака Эрлиха // Тезисы докл. совещания "Механизмы повышения радиочувствительности опухолевых клеток". - Ленинград.-1976. -

7. Сынзыныс Б.И., Саенко A.C., Коноплянников А.Г. Репарация ДНК в облученных клетках асцитной карциномы Эрлиха в условиях гипертермии // Радиобиология. - 1979. - Т. 19. - № 4. -

С. 600-603.

8. Сынзыныс Б.И., Трофимова С.Ф., Саенко A.C., Поверенный A.M. Особенности повреждения структуры ДНК-мембранного комплекса

и репликации ДНК в клетках млекопитающих, обработанных формаль дегидом // Тезисы УП Всесоюзного симпозиума по структуре и функциям клеточного ядра.1980, Харьков. - С. 164.

9. Саенко A.C., Сынзыныс Б.И., Трофимова С.Ф., Готлиб В.Я., Пелевина И.И. Репарация ДНК, Д1К-структурного комплекса и восстановление от сублетальных повреждений в клетках млеко-

питающих после облучения // Радиобиология. - 1980. - Т. 20. -№ 3. - С. 329.

10. Сынзыныс Б.И., Готлиб В.Я., Трофимова С.Ф., Саенко A.C., Пелевина И.И. Способность облученных клеток инициировать синтез репликона и восстановление от сублетальных повреждений //• Тезисы докл. Всесоюзного симпозиума "Механизмы радиационного повреждения и восстановления нуклеиновых кислот". - 1980. - Пущино. - С. 21-22.

11. Параносенкова В.И., Сынзыныс Б.И., Саенко A.C. Изучение модифицирующего действия карминомицина на радиопоражаемость и пострадиационную репарацию ДНК и Д1К-мембранного комплекса клеток асцитной карциномы Эрлиха // Тезисы докл. II Всесоюзного симпозиума "Радиобиологические основы лучевой терапии". -Ленинград. - 1980. - С. 75-76.

12. Саенко A.C., Сынзыныс Б.И., Готлиб В.Я., Трофимова С.Ф., Пелевина И.И. О природе и репарации сублетальных повреждений // Радиобиология. - 1981. - Т. 21; - № I. - С. 26-37.

13. Саенко A.C., Киселева В.И., Сынзыныс Б.И. Повреждения ДНК-мембранного комплекса клеток млекопитающих после действия гамма-облучения или химических агентов. Роль ДНК-мембранного комплекса в репликации //studia Biophys. - 1982. -Vol. 89. - No 1. - Р. 45-53.

14. Сынзыныс Б.И., Склобовская М.В., Саенко A.C. Инициация репликации ДЖ и образование высокомолекулярной ДЖ в клетках китайского хомячка после действия гипертермии // Тезисы докл. I Всесоюзного биофиз. съезда. - Москва. - 1982. -

Т. II. - С. 331.

15. Сынзыныс Б.И., Саенко A.C. Молекулярный механизм репликации ДЖ в клетках млекопитающих после гамма- или УФ-облучения // Тезисы докл. I Всесоюзного биофиз. съезда. - Москва. - 1982.Т. II. - С. 200.

16. Сынзыныс Б.И., Склобовская М.В., Саенко A.C. Репликация ДНК в клетках млекопитающих после действия гипертермии // В сб.: Радиация и организм, г. Обнинск, 1982. - С. 49-50.

17. Сынзыныс Б.И., Киселева В.И. Восстановление ДНК-комплекса и нуклеоида и репликация Д1К в облученных клетках млекопитающих/ Тезисы докл. УШ Всесоюзной конф. "Восстановление и компенсаторные процессы при лучевых поражениях". - Ленинград. -ноябрь, 1982.

18. Склобовская M.B., Сынзыныс Б.И., Саенко A.C. Влияние гипертермии на синтез ДНК в клетках китайского хомячка в логарифмической и стационарной фазах роста // В сб.: "Радиомодификаторы в лучевой терапии опухолей". - Обнинск. - 1982. -С. 68-70.

19. Сынзыныс Б.И. Возможный механизм радиосенсибилкзирующего действия гипертермии // В сб.: "Радиомодификаторы в'лучевой терапии опухолей". - Обнинск. - 1982. - С. 72.

20. Saenko A.S., Synzynys B.I., Gotlib V.J., Trofimova S.í1., Pelevina I.I. Sublethal damage: their nature and repair // Studia Biophys. - 1983. - Vol. 95. - P.

21. Сынзыныс Б.И., ПиршелМ., СедляковаМ., Трофимова С. Ф., Саенко A.C., Поверенный A.M. Репликация ДЖ в клетках млекопитающих при действии факторов физической, химической или биологической природы.1.Повреждения и репарация ДЖ в клетках линии IL, обработанных формальдегидом // Цитология. - 1983. -Т. 25. - С. 793-798.

22. Трофимова С.Ф., Сынзыныс Б.И., Готлиб В.Я., Саенко A.C., Пелевина И.И., Поверенный A.M. Механизм цитотоксического действия формальдегида на культивируемые клетки млекопитающих // Цитология. - 1983. - Т. 25. - С. II66-II72.

23. Склобовская М.В., Сынзыныс Б.И., Саенко A.C. Особенности синтеза ДНК в клетках китайского хомячка на логарифмической

и стационарной стадиях роста культуры после действия на клетки повышенной температуры // Цитология. - 1983. - Т. 25. -С. 1289.

24. Готлиб В.Я;, Пелевина И.И., Сынзыныс Б.И., Поверенный A.M., Саенко A.C. Повреждения ДЖ, их репарация и выживаемость клеток // В кн.: "Проблемы природной и модифицированной радиочувствительности". - Москва, Наука. - 1983. - С. 57-66.

25. Сынзыныс Б.И., Склобовская М.В., Саенко A.C., Брозманова Е. Синтез ДНК в клетках млекопитающих после действия гипертермии и его модификация фтордезоксиуридином//В кн.: "Применение гипертермии в лечении злокачественных новообразований". Материалы совещ. коорд. совета программы "Модификатор". -1983. - С. 164-165.

26. Брозманова Е., Сынзыныс Б.И. Репликация и репарация ДНК в УФ-облученных клетках Hela после предварительной инкубации

с 5-фтордезоксиуридином // В кн.: "Структурно-функциональные аспекты репликации и репарации ДНК". - Пущино. - 1983. -С. 122-132. Под рсдакц. Л.И.Газиева.

27. Брозыанова Е., Сынзыныс Б.И. Репликация и репарация ДНК в УФ-облученных клетках НеЬа послэ обработки 5-фтордсзокси-уридином. Информ. бюлл. // Радиобиология. - 1983. - № 28. -С. 55.

28. Сынзыныс Б.И., Трофимова С.Ф. Инициация репликации ДНК в клетках линии LL, обработанных формальдегидом или облученных гамма-лучами. Информ. бюлл. // Радиобиология. - 1983. - № 28. -С. 55-56.

29. Сынзыныс Б.И. Экспериментальное обоснование использования краткосрочных культур клеток млекопитающих для прогнозирования реакции опухолей и нормальных тканей на облучение и гипертермию // Тезисы докл. XI Всесоюзного съезда рентгенологов и радиологов. - Москва-Обнинск. - 1984. - С. 63-64.

30. Сынзыныс Б.И., Киселева В.И., Трофимова С.Ф. Репликация ДНК в клетках млекопитающих при действии факторов физической, или биологической природы. II. Восстановление ДНК-комплекса, нуклеоида и репликация ДНК после гамма-облучения // Цитология. - 1984. - Т. 26. - № II. - С. 1323-1326.

31. Сынзыныс Б.И., Трофимова С.Ф. Репарация нуклеоида саркомы 37 in vitro и in vivo . Влияние HEEES -буфера // Радиология. -1984. - Т. 24. - № 5. - С. 641-642.

32. Сынзыныс Б.И., Брозманова Е., Склобовская М.В., Саенко A.C. Изменение в структуре и репликации ДНК клеток млекопитающих после действия 5-фтордезоксиуридина // Материалы УШ Всесоюзного симпозиума "Структура и функции клеточного ядра". -Пущино. - 1984. - С. 277.

33. Сынзыныс Б.И., Брозманова Е., Склобовская М.В., Саенко A.C. Репликация ДНК в клетках млекопитающих после действия факторов физической, химической или биологической природы. 111. 5-фтор-дезоксиуридин индуцирует в клетках синтез ДНК, не подавляемый гамма-облучением // Цитология. - 1985. - Т. 27. - № 2. -

С. 236-239.

34. Сынзыныс Б.И. Инициация репликации ДНК и надежность эукарио-тической клетки // В сб.: "Надежность биологических систем". -Киев. - 1985. - С. 115.

35. Сынзыныс Б.И., Колесникова А.И., Коноплянников А.Г. Исследование синтеза ДНК в краткосрочных культурах клеток млекопитающих для оценки реакции клеток опухолей и нормальных тканей на облучение и гипертермию // Радиобиология. - 1985. -

№ 2. - С. 179-184.

36. Пелевина И.И., Саенко A.C., Готлиб В.Я., Сынзыныс Б.И. Выживаемость облученных клеток млекопитающих и репарация ДНК // М., Энергоатомиздат. - 1985. - 125 С.

37. Сынзыныс Б.И., Брозманова Е., Пятенко Е.С. , Готлиб В.Я., Абрамова М.Р. Влияние предварительной инкубации с 5-фтордезокси-уридином на синтез ДЖ и выживаемость облученных или подвергнутых действию гипертермии клеток // Информ. бюлл. Радиобиология. - 1985. - № 31. - С. 102-103.

38. Brozmanováf Е., Synzynys B.I. Effect of 5-fluorodeoxyuridine on DNA replication and survival in ultra-violet-irradiated HeLa cells // In: "Abstracts European Society for Radiation Biology."19th Annual Meeting. - Prague. - 1985. - P. ?6.

39. Сынзыныс Б.И., Брозманова E., Пятенко B.C., Склобовская M.B., Коноплянников А.Г., Саенко A.C. Репликация ДШ в клетках млекопитающих после действия факторов физической, химической или биологической природы. 1У. 5-фтордезоксиуридин модифицирует влияние гипертермии на синтез ДШ и выживаемость клеток HeLa // Цитология, - 1985. - Т. 27. - С. 911-920.

40. Сынзыныс Б.И., Брозманова Е., Готлиб В.Я., Саенко A.C. 5-фтор-дезоксиуридин индуцирует радиорезистентный синтез ДШ и сенсибилизирует клетки Hela к ^-облучению // Радиобиология. -

1985. - Т. 25. - С. 593-597.

41. Brozraanováf Е., Synzynys B.I., Hasek 2.. SaenXo A.S. Effect of 5-fluoredeoryuridine on DNA replication in ultraviolet irradiated HeLa cell // Studia Biophys. - 1985. - V. 10Я—P.97.

42. Соловьева Л.П., Сынзыныс Б.И., Подгородническо B.K., Андреев В.Г. Определение количества клеток, синтезирующих Д1К, с помощью иммунофлуоресцентного метода // Цитология. - 1986. -Т. 28. - С. 373-377.

43. Сынзыныс Б.И., Брозманова Е., Саенко A.C. 0 возможной инду-цибельной природе радиорезистентного синтеза ДНК, стимулированного в клетках действием 5-фтордезоксиуридина // Радиобиология.

1986. - Т. 26. - С. 221-223.

44. Штейн JI.B., Колесникова А.И., Олнзыныс Б.И., Коноплянников А.Г. Термочувствительность клеток асцитного рака Эрлиха, формирующих колонии в агаровых культурах в диффузионных камерах // Экспер. онкология. - 1986. - Т. 8. - С. 37-47.

45. Brozmanová J., Synzynys B.I. Effect of 5-fluorodeoxyuridine on DNA replication and survival in ultraviolet irradiated Hela cells // Int. J. Radiat. Biol. - 1966. - Vol. £9. -

P. 696.

46. Сынзыныс Б.И., Саенко A.C. Радиорезистентный синтез ДНК в культивируемых клетках млекопитающих // Тезисы докл. IX Всесоюзной конф. "Восстановительные и компенсаторные процессы, при лучевых поражениях". - Ленинград. - 1986. - С. 88.

47. Сынзыныс Б.И., Брозманова Е., Саенко A.C., Афанасьев В.Н. Репликация ДНК в клетках млекопитающих после действия факторов физической, химической или биологической природы. IÍ. Реорганизация структуры реплицирующей Д1К в клетках HeLa после инкубации с 5-фтордезоксиуридином // Цитология. - 1986. -

Т. 28. - № 9. - С. I0I2-I0I6.

48. Колесникова А.И., Коноплянников А.Г., Бизер В.А., Семичастнова Л.М., Лепехина Л.А., Сынзыныс Б.И. Клоногенная способность и пролиферативная активность клеток злокачественных опухолей костей // Мед. радиология. - 1986. - № 12. - С. 36-40.

49. Сынзыныс Б.И. Синтез ДНК как показатель реакции клеток на облучение и другие повреждающие воздействия // Мед. радиология.-1986. - № 12. - С. 60-62.

50. Сынзыныс Б.И., Саенко A.C. Синтез ДНК в стационарной культуре клеток НеЬа после y-облучения // Радиобиология. - 1986. -

Т. 26. - С. 800-803.

51. Сынзыныс Б.И., Готлиб В.Я., Брозманова Е. Инициация репликации ДНК, повревдения хромосом и гибель облученных клетск // Информ. бюлл. Радиобиология. - 1986. - № 32. - С. 91-94.

52. Сынзыныс Б.И., Саенко A.C. Репликация и пострепликативная репарация ДНК в облученных клетках млекопитающих после действия ингибиторов синтеза ДНК // Тезисы докл. УП Всесоюзн. симп. "Молекулярные механизмы генетических процессов". -Москва. - 1987. - С. 50.

53. .Саенко A.C., Сынзыныс Б.И. Радиорезистентный синтез и пострепликативная репарация ДНК в клетках млекопитающих как след-

сгвие синтеза белков de novo //В сб. Всесоозн. симпоз. "Механизмы действия ионизирующих излучений на структуру и функцию белков". - Львов. - 1986. - С. 10.

54. Сынзыныс Б.И., Аминев А.Г., Саенко А.С., Пелевина И.И. Подавление инициации синтеза ДНК как показатель радиочувствительности клеток // Радиобиология. - 1987. - Т. 27. - С. 224-227.

55. Svnzynys B.I., Brozraanovâ Е., Saenko A.S. Effect of fluoro-deoxyuridine on the sédimentation of nucleoiae from HeLa cells in sucrose gradients // Néoplasme. - 1987. - V. 34. -P. 55-59.

56. Сынзыныс Б;И., Аминев А.Г., Константинова С.А., Саенко А.С. Гамма-облучение индуцирует в клетках Helja радиорезистентный синтез ДНК // Радиобиология. - 1987. - Т. 27. - С. 459-462.

57. Замулаева И.А., Крикунова Л.И., Фурсова Т.И., Подгородни-ченко В.К., Сынзыныс Б.И. Иммунофлуоресцентное исследование пролиферативной активности опухолевых клеток для прогнозирования эффективности лучевой терапии рака тела и шейки матки/ В сб.: "Современные методы оценки эффективности лучевой терапии". Под редакцией А.Ф.Цыба. - Обнинск. - 1988, - С. 96-102.

58. Saenko A.S., Synzynys B.I., Brozmanovâ J., Pelevina I.I. Inducible processes in DNA replication and repair after gamma-? ÙV-irradiation and action of some chemicals in mammalian cells // Acta biologica Acad. Sci. Hung. - | 1989. - V. 40. - No 3-4. - P. 47-59.

59. Сынзыныс Б.И., Шаповалова Е.В. Математическое моделирование процесса синтеза ДНК в облученных клетках и клеточных популяциях. Моделирование инициации и элонгации цепей ДНК в облученных клетках млекопитающих // Радиобиология. - 1988. - Т.

.28. - С. 597-600.

/