Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Фотоиндуцибельные защитные эффекты при действии длинноволнового оптического излучения на УФ-поврежденные культивируемые клетки млекопитающих

ВАК РФ 03.00.01, Радиобиология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Хан Енсу, Москва

и-

л

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

ИМ. М. В. ЛОМОНОСОВА

ФОТОИНДУЦИБЕЛЬНЫЕ ЗАЩИТНЫЕ ЭФФЕКТЫ ПРИ ДЕЙСТВИИ ДЛИННОВОЛНОВОГО ОПТИЧЕСКОГО

ИЗЛУЧЕНИЯ НА УФ-ПОВРЕЖДЕННЫЕ КУЛЬТИВИРУЕМЫЕ КЛЕТКИ МЛЕКОПИТАЮЩИХ

03.00.01 - Радиобиология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители:

кандидат биологических наук

И. М. Пархоменко кандидат биологических наук М. Г. Страховская

Биологический факультет Кафедра биофизики

На правах рукописи УДК 577.2.017.3:535-31

ХАН ЕНСУ

Москва 1999

ОГЛАВЛЕНИЕ

1. ВВЕДЕНИЕ 1

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. 6

2.1. Основные закономерности биологического действия УФ-

из лучения. 6

2.1.1. Фотодеструктивные реакции в ДНК при действии УФ-излучения. 7

2.1.2. Вклад фотоповреждений ДНК в летальное действие кУФ, сУФ и дУФ. 14

2.1.3. Действие УФ-излучения на белки. 15

2.1.4. Действие УФ-излучения на биологические мембраны и цитоплазматические мишени. 16

2.2. Фотобиологические процессы при комбинированном действии

оптического излучения различных длин волн. 24

2.2.1. Фотореактивация. 26

2.2.2. Фотозащита. 34

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. 40

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ. 44

4.1. Зависимость доза-эффект для действия УФ излучения на культивируемые клетки млекопитающих. 46

4.2. Кривые доза-эффект для фотодинамического повреждения культивируемых клеток млекопитающих видимым

светом. 51

4.3. Репарация УФ-индуцированных повреждений. 55

4.4. Индуцированный красным светом фотозащитный эффект от УФ-индуцированных повреждений. 62

4.5. Влияние УФ-излучения и красного света (680 нм) на вобождение гистамина из тучных клеток. 66

4.6. Спектрофлуориметрический анализ клеточных экстрактов. 72

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ. 80

6. СНОВНЫЕ ВЫВОДЫ. 84

7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ. 86

1. ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы. В последнее время остро встает вопрос о разрушении озонового слоя стратосферы и увеличении повреждающего действия солнечного ультрафиолетового излучения (290-3 80нм), достигающего поверхности Земли. В результате интенсивных исследований его биологического действия был достигнут существенный прогресс в оценке биологически эффективных доз и спектров действия УФ-излучения для его основных медико-биологических эффектов и созданы основы для количественной оценки естественной УФ-радиации как фактора риска для человека.

Однако, помимо эпидемиологических исследований на человеке и экспериментальных исследованиях на животных необходимо понимание механизмов биологического действия длинноволнового (дУФ, 320-380нм) и средневолнового ультрафиолетового излучений (сУФ, 290-320нм) на клеточном уровне. К настоящему времени во многом выяснены основные механизмы действия УФ-излучения, особенно коротковолнового, на вирусы, прокариотические клетки и дрожжи. Фотобиология клеток млекопитающих менее изучена. Выяснение механизмов действия УФ-излучения на эти клетки представляет значительный интерес как для фундаментальной фотобиологии и биологии клетки, так и для прикладной фотобиологии в связи с быстрым развитием современной фотомедицины. Оптимальной системой для

исследования механизмов действия УФ-излучения на клетки млекопитающих являются культивируемые клетки перевиваемых штаммов.

Важно отметить, что наблюдаемые биологические эффекты УФ-излучения определяются соотношением процессов начальной фотодеструкции и процессов репарации, как темновой, так и фотоиндуцированной. Из многих известных защитных механизмов наиболее полно изучена ферментативная фотореактивация с участием фермента фотолиазы, которая в возбужденном состоянии расщепляет УФ-индуцированные пиримидиновые димеры. Известны также эффекты фотозащиты у клеток бактерий и дрожжей - уменьшение повреждений, вызванных коротковолновым УФ-излучением, при предварительном облучении УФ-излучением с большей длиной волны. В последние годы обнаружена новая фотоиндуцибельная зашитная система в клетках дрожжей Candida guillermondii, которая принципиально отличается и по длине волны реактивирующего света, и по форме кривой доза реактивирующего света -эффект, и по зависимости эффекта от времени и температуры от ранее исследованных систем фоторепарации и фотозащиты. Возникает вопрос о ее существовании у биологических объектов, относящихся к другим таксономическим группам. Особенно важно знать, существует ли эта система у клеток млекопитающих. Это имеет значение не только для суждения об универсальности этой системы и общности механизмов, определяющих процессы восстановления УФ-индуцированных повреждений у широкого

круга биологических объектов, но и может иметь практическое значение при защите от повреждений, индуцированных средневолновым («экологическим») УФ-излучением, а также в условиях медицинского использования УФ- излучения и видимого света.

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось выявление и изучение на клетках млекопитающих фотобиологических эффектов при комбинированном действии УФ-излучения различных длин волн и красного света (А,=680 нм).

В соответствии с этим были поставлены следующие задачи:

- получить зависимости доза-эффект по тесту репродуктивной гибели для двух штаммов культивируемых клеток млекопитающих для УФ-излучения различных диапазонов (кУФ, сУФ и дУФ);

- выяснить, возможна ли модификация этих повреждений с помощью длинноволнового оптического излучения;

- на клеточной модели, позволяющей судить о состоянии мембран, -мастоцитах крыс - получить данные об изменениях мембран, индуцированных УФ-излучением и возможности модификации этих эффектов длинноволновым оптическим излучением;

- получить зависимости доза-эффект для повреждающего действия видимого света и определить роль эндогенных фотосенсибилизаторов в этом процессе.

Научная новизна работы. Впервые получены данные,

свидетельствующие о существовании в культивируемых клетках млекопитающих защитной системы, индуцируемой длинноволновым оптическим излучением. Показано, что зависимость фотовосстановления и фотозащиты от дозы фотореактивирующего света имеет колоколообразный характер. При сравнении действия длинноволнового оптического излучения на УФ-индуцированную репродуктивную гибель культивируемых клеток млекопитающих и на процессы модификации биомембран УФ-облучением показано, что процесс восстановления повреждений наблюдается только при репродуктивной гибели клеток, т.е. функционирование этой фотоиндуцибельной защитной системы направлено на репарацию повреждений ДНК. При изучении фотодинамического повреждения клеток млекопитающих показано, что оно зависит от содержания в клетке эндогенных фотосенсибилизаторов порфириновой природы.

Научная и практическая значимость работы. Обнаружение в клетках млекопитающих системы фотозащиты и фоторепарации, индуцируемой красным светом и направленной на уменьшение повреждающего действия УФ-излучения, имеет большое значение для понимания механизмов устойчивости клеток млекопитающих к действию оптического излучения. Сходство с соответствующей системой дрожжевых клеток указывает на универсальный характер этой системы и общность механизмов, определяющих процессы восстановления УФ-индуцированных повреждений у широкого круга биологических объектов. Полученные данные могут иметь

практическое значение при разработке способов защиты от фотоповреждений, индуцированных средневолновым («экологическим») УФ-излучением, а также при медицинском использовании УФ-излучения и видимого света. Полученные данные о возможности усиления фотодинамического повреждения клеток с помощью модификации процессов биосинтеза эндогенных сенсибилизаторов порфириновой природы также могут иметь не только теоретическое, но и практическое значение при фотодинамической терапии опухолей, а культивируемые клетки млекопитающих могут быть использованы в качестве адекватной модели для отработки деталей процедуры сенсибилизации клеток к действию видимого света.

Апробация работы. Основные результаты работы доложены на III Съезде по радиационным исследованиям (Москва, 1997), на II Международной конференции по биофизике (Каир, 1998), на II Съезде биофизиков России (Москва, 1999).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 тезисов, 3 статьи приняты в печать.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, заключения и основных выводов.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Основные закономерности биологического действия УФ-излучения

Оптическое излучение ультрафиолетового диапазона может вызывать разные биологические эффекты, как фотодеструктивные, так и фоторегуляторные. К последним относятся, например, фотоиндуцированный биосинтез витамина D. Фотодеструктивные реакции оказывают не только отрицательное воздействие на живые организмы (УФ-облучение кожи приводит к изменению иммунного статуса и к возникновению злокачественных опухолей кожи), но и используются при фототерапии ряда заболеваний: УФ-терапии кожных болезней в присутствии экзогенных сенсибилизаторов псораленов [Averbeck, 1989; Potapenko, 1991] и фотодинамической терапии опухолей - облучении опухолей видимым светом в присутствии сенсибилизаторов [Dougherty, 1987; Zhou, 1989].

Ключевыми параметрами, характеризующими действующий свет и определяющими эффективность и молекулярный механизм фотодеструктивных процессов, являются длина волны и интенсивность излучения. Солнечное оптическое излучение можно подразделить на несколько диапазонов: коротковолновый УФ, обычно не доходящий до поверхности Земли (кУФ, 100-290 нм); средневолновый УФ (сУФ, 290-320 нм), длинноволновый УФ (дУФ, 320-380 нм) и видимый свет (380-780 нм).

2.1.1. Фотодеструктивные реакции в ДНК при действии УФ-излучения

Фоточувствительность биологических объектов сильно различается в зависимости от диапазона длин волн действующего света [Peak et al., 1984; Black et al., 1997]. Наиболее эффективно фото деструктивные реакции индуцируются в клетках различного происхождения кУФ-излучением [Swenson, 1976; Rothman & Setlow, 1979; Zolzer & Kiefer, 1983], получаемым от искусственных источников света. Основная внутриклеточная молекулярная мишень при летальном и мутагеном действии кУФ-излучения -ДНК.

Основными хромофорами в ДНК являются азотистые основания нуклеотидов, причем фотохимически наиболее лабильны пиримидиновые основания, значительно более стабильны пуриновые основания и углеводные остатки нуклеиновых кислот.

Многочисленными исследованиями установлено, что УФ-излучение в клетках и в тканях вызывает следующие фотохимические реакции:

1) образование циклобутилпиримидиновых димеров,

2) пиримидин-6,4-пиримидон фотоадцуков,

3) одноцепочечные разрывы в ДНК,

4) сшивки ДНК-белок,

5) образование диоксидигидротимина.

1) Реакция фотодимеризации с образованием циклобутил-пиримидиновых димеров (ЦПД).

Димеризация пиримидиновых оснований заключается в ковалентном фотоприсоединении двух соседних молекул с участием двойных связей у 5-го и 6-го атомов углерода. Между основаниями образуется цикдобутановое кольцо.

Считают, что димеры пиримидиновых оснований, образующиеся в одной цепи ДНК, оставляют 70-80% от всех летальных повреждений, индуцируемых коротковолновым УФ-светом. Характерная черта реакции димеризации - её фотообратимость. Пиримидиновые основания поглощают свет в области 200-300 нм с максимумом при 260 нм, их димеры - примерно в том же диапазоне УФ-спектра (200-285 нм). Поэтому при УФ-облучении оснований или ДНК для каждой длины волны возбуждающего света между димерами и основаниями устанавливается динамическое равновесие, определяемое соотношением поперечных сечений реакций димеризации оснований и мономеризации димеров [ЮШег е1 а1., 1977]. Еще 1928 году было выяснено, что спектр действия гибели бактерий соответствует спектр поглощения нуклеиновых кислот. Для клеток млекопитающих эти спектры несколько отличаются, но наблюдаемые различие могут быть объясны эффектами самоэкранировки, которые для коротковолнового излучения более значительны у клеток эукариот, чем у бактериальных клеток [Сахаров, 1988].

Среди экологических диапазонов оптического излучения солнца

наибольшую активность в фотодеструкции проявляет сУФ, на долю которого приходится 5% суммарного УФ-излучения, достигающий поверхности Земли после поглощения более коротковолновых компонент озоновым слоем атмосферы. Значение этого экологического фактора особенно возросло в последнее время в связи с частичным разрушением озонового слоя, сопровождающимся повышением интенсивности сУФ в биосфере [Kerr, 1993; Van der Leun, 1998].

В многочисленных исследованиях установлено, что сУФ также вызывает образование пиримидиновых димеров [Doniger et al., 1981], и с их образованием коррелирует инактивация бактерий и вирусов, гибель различных линий культивируемых клеток [Rothman & Setlow, 1979; Doniger et al., 1981]. При облучении УФ с длинами волн больше 300 нм димеры ДНК (как и разрывы) образуются косвенным путем с участием определенных сенсибилизаторов, поскольку длинноволновая граница поглощения ДНК лежит в области 300-310 нм [Фрайкин, 1988].

В летальном действии дУФ пиримидиновые димеры практически не участвуют. В частности, имеются данные, что эффективность кУФ-излучения

2 5

в 10 раз выше эффективности сУФ, в 10 раз выше эффективности дУФ в отношении образования ЦПД [Kuluncsics et al., 1999]. Одним из важнейших доказательств того, что ЦПД не участвуют в инактивации клеток дУФ, является полное отсутствие фотореактивации у большинства штаммов бактерий, облученных при нормальных условиях.

2) Образование пиримидин-6,4-пиримидон фотоаддуктов (6,4-ФА).

Реакция образования этих фотопродуктов в ДНК имеет аналогичный спектр действия, что и предыдущая. Они впервые обнаружены в 1965 г. [Pearson, 1965] и образуются преимущественно в ТЦ и ЦЦ последовательностях в отличие от ЦПД, которые преобладают в TT последовательностях [Brash et al., 1982]. Их выход составляет 10% - 50% выхода поримидиновых димеров [Patrick & Rahn, 1976; Patrick, 1977].

Образование (6,4)-ФА из двух пиримидинов вызывает сдвиг спектра поглощения в красную область. (6,4)-ФА имеет максимум поглощения в области около 310 нм, причем спектр действия его фотолиза идентичен его собственному спектру поглощения [Mitchell, 1987].

В последнее время высказывалось мнение, что большинство биологических эффектов солнечного УФ-света, включая гибель клеток, сестринские хроматидные обмены, мутагенез, ингибирование и репарация синтеза ДНК и РНК, происходят главным образом из-за образования (6,4)-фотоаддуктов, а не циклобутилпиримидиновых димеров [Cleaver, 1988]. Оно основано на экспериментах, проведенных на клетках, способных восстанавливать только (6,4)-ФА [Mitchell, 1988].

3) Одноцепочечные разрывы (ОР) в ДНК

При очень больших дозах УФ-облучения имеют место разрывы цепей

ДНК. В области кУФ выход разрывов на 2-3 порядка ниже, чем выход ЦПД, и им принадлежит меньшая биологическая роль [Peak, 1988]. Как отмечалось выше, при действии сУФ и кУФ пиримидиновые димеры вносят основной вклад в летальные повреждения ДНК. В то же время дУФ индуцирует образование в ДНК повреждений, более характерных для ионизирующей радиации, чем для кУФ и сУФ, - одиночных и двойных разрывов цепи ДНК. С ростом длины волны отношение ОР : ЦПД возрастает и при 365 нм выходы этих продуктов примерно равны [Tyrrell, 1979]. При действии дУФ и света видимой области ОР очевидно, представляют основной класс повреждений ДНК. Так, Bradley et al [1978] и Erickson et al [1980] сообщили, что дУФ значительно увеличивает суммарное количество одноцепочечных разрывов ДНК в человеческих клетках. Спектр действия для ОР в человеческих клетках имеет плечо или пик при длинах волн 340 - 500 нм [Rosenstein. 1983; Peak et al., 1987], предположительно, оно определяется такими внутриклеточными хромофорами, как например, рибофлавин, никотинамидные коферменты, порфирины или билирубин. Так, было показано, что in vitro НАДН обладает способностью к фотосенсибилизации образования ОР в двухцепочечной плазмидной ДНК под действием сУФ и дУФ (320-400 нм) [Бурчуладзе и др., 1990].

4) Сшивки ДНК - белок.

Под действием УФ, главным образом кУФ, образуются сшивки ДНК с

белками. Спектр действия этой реакции имеет максимум при 265 нм [Rosenstein & Ducore, 1983; Moan & Peak, 1989]. Акцепторами УФ-света являются оба компонента, поскольку облучение как белка, так и ДНК, перед смешиванием сопровождается образованием сшивок [Kornhauser, 1976]. Однако этот вид повреждений вносит вклад в биологические эффекты либо при больших дозах и мощностях дозы, либо в условиях, когда затруднено образование пиримидиновых димеров, например, при низких температурах. В спектре действия этой реакции имеются также максимумы около 320 нм и при 400 нм [Peak et al., 1985], т. е. этот вид повреждений ДНК может вносить определенный вклад в биологические эффекты сУФ и дУФ. Предполагается что сшивки ДНК - белок участвуют в ряде эффектов, индуцируемых ближ