Молекулярные механизмы деструктивного и защитного действия оптического излучения на микроорганизма

Фрайкин, Григорий Яковлевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярные механизмы деструктивного и защитного действия оптического излучения на микроорганизма
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Молекулярные механизмы деструктивного и защитного действия оптического излучения на микроорганизма"

л и .

Московский ордена Ленина, ордена Октябрьской революции и ордена Трудового Красного Знамени государственный .университет им.М.В.Ломоносова

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи УДК 576.8.095.14:577.37.123.344

ФРАЙСИН Григорий Яковлевич

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ДЕСТРУКТИВНОГО И ЗАЩИТНОГО ДЕЙСТВИЯ ОПТИЧЕСКОГО ИЗЛУЧЕНИЯ НА МИКРООРГАНИЗМЫ'

03.00.02 - биофизика

Автореферат диссертации на соискание учёной степени доктора биологических наук

Москва - 1988

Работа выполнена в.проблемной лаборатории космической биологии кафедры биофизики биологического факультета МГУ.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Н.П.Воскресенская, доктор биологических наук Г.Б.Завильгельский, доктор биологических наук, профессор Ф.Ф.Литвин.

Ведущее учреждение: Институт биохимии ил.А.Н.Баха АН СССР.

Защита состоится

■ль.

ОЦи Я Н1^ 1388 г.

в ч на заседании специализированного совета

Д 053.05.53 при Московском государственном университете. Адрес: 119899, Москва, Ленинские горы, МГУ, биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан "

1988 г.

Учёный секретарь специализированного совета

доктор биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Оптическое излучение длинноволновой ультрафиолетовой ( УФ ) и видимой областей спектра ( 300 - 700 нм является фактором окружающей среды, постоянно оказывающим воздействие на организмы. Поэтому познание молекулярных механизмов фотобиологических процессов, происходящих в биологических системах

при поглощении квантов этих видов излучения, имеет большое обще-\

биологическое значение.

Хорошо известны достижения в области изучения природы таких фундаментальных процессов, как фотосинтез, зрительная фоторецепция, фотобиоэнергетика, опосредованная бактериородопсином, и фотоморфогенез, контролируемый фитохромной системой. В этой области полностью подтвердился принцип единства молекулярных механизмов их начальных фотофизических стадий, которые основаны на эле-ктронно-конформационных взаимодействиях в фотоактивном хромофорном комплексе.

Значительные успехи достигнуты также в расшифровке молекулярных механизмов повреждающего действия на биоструктуры коротковолнового УФ-излучения ( < 300 нм ), которое вследствие прямого поглощения нуклеиновыми кислотами и белками, эффективно индуцирует протекание в них деструктивных фотохимических реакций. Что касается света более длинноволновых участков оптического спектра, то полученные данные о его повреждающем действии на биологические системы ( в отсутствие экзогенных сенсибилизаторов ) носят в основном феноменологический характер.

Вместе с тем происходящие в последнее время изменения в экологической обстановке, затрагивающие и облученность организмов, требуют детального изучения общих закономерностей и молеку-

лярных механизмов биологаческого действия длинноволнового УФ-излучения ( 300 - 400 нм ) и видимого света ( 400 - 700 нм ), являющихся экологическими компонентами солнечной радиации^ К такого рода изменениям можно отнести повышение уровня загрязнённости окружающей среды, увеличивающее вероятность протекания фо-- тосенсибшшзированных деструктивных реакций в клетках, и рост интенсивности биологически наиболее активных УФ-лучей солнца ( 300 - 320 нм ) в биосфере в результате частичного разрушения озонового слоя атмосферы. Среди многих экологических последствий разрушения озона особое значение придаётся тому, что даже слабое повышение интенсивности УФ-свзта проведёт к резкому увеличению образования рака кожи у лвдей под действием солнечной радиации.

Для успешного решения вопросов, связанных с выяснением механизмов и особенностей взаимодействия "экологических" видов оптического излучения с живой клеткой, принципиально важно изучать ве только действие света отдельных областей спектра, но а эффекты комбинированного действия света различных длин волн. Это вызвано тем, что меаду различными фотоиадуцярованннми реакциями могут происходить определённые взаимодействия ( как сияергические, так и антагонистические ), которые отразятся на конечном фотобиолога-ческом эффекте в целом.

Актуальность-проблемы комбинированного действия света определяется, с одной стороны, условиями реальной экологической ситу-

^Коротководновое УФ-излучение солнца поглощается озоном атмосферы и поверхности Земли не достигает.

едки, когда имеет место одновременное облучение живых систем различными видами излучений, а, с другой - необходимостью создания новых способов защиты биологических объектов от повреждающего действия излучений, в том числе лазерных источников УФ-диапазона. Последние находят всё более широкое применение в биологии и медицине, и это остро ставит вопрос как о защите биологических систем от интенсивного лазерного УФ-изяучения, так и выяснении специфики его повредиапцего действия на клетки.

Несмотря на значительный интерес к указанным проблемам биологического действия оптического излучения и несомненную важность исследования перечисленных выше фотобиологических процессов, их молекулярные механизмы, особенно у эукариотных клеток, изучены мало, а о некоторых эффектах сведения вообще отсутствуют. В значительной мере это обусловлено сложным характером взаимодействия света с живой клеткой. Есть основания полагать, что конечное проявление фотобиологического эффекта будет определяться не только параметрами облучения и природой фотоактивных хромофоров в клетке, но также конкретным местом их локализации, особенностями клеточных структур, где протекают начальные стадии фотопроцессов, и возможностью их взаимодействия.

Цель и задачи исследования. Основная цель работы состояла в выявлении и изучении природы деструктивных и защитных фотобиологических реакций при комбинированном действии оптического излучения различных длин волн на эукаряотные клетки. В соответствии с этим были поставлены следующие основные задачи :

-провести сравнительный анализ повреждающего действия на плетки УФ-излучения лазерного и обычного источников и выяснить природу и особенности образования лазер-индуцированных продуктов в ДНК;

-изучить механизмы деструктивного действия на клетки оптического излучения длинноволновой УФ и видимой областей спектра, в том числе найти фотоактивные хромофоры и сенсибилизаторы в клетках, а также определить первичные фотопродукты, ответственные за развитие конечных повреждающих эффектов;

-исследовать фотобиологические эффекты при комбинированном действии на клетки света различных длин волн, выявить фотозащитные системы в клетках и изучить молекулярные основы их функционирования.

Научная новизна. Работа представляет собой первое систематическое исследование молекулярных механизмов деструктивных и защитных фотобиологических реакций при комбинированном действии оптического излучения разных длин волн на клеточные системы. В( ней получены новые данные об основных закономерностях и особенностях повреждающего действия на клетки дрожжей "экологических" видов оптического излучения и высокоинтенсивного лазерного УФ-излучения, а также о природе фотобиологических эффектов, выявленных при комбинированном действии света разных длин волн на клетки, - фотозащиты и фотосинергизма. Наиболее важными результатами исследования представля-г ются следующие:

выявление специфики повреждающего действия высокоинтенсивного лазерного УФ-излучения по сравнению с действием низкоинтенсивного УФ-света обычных источников, которая выражается в увеличении степени фотоинактивации клеток с ростом интенсивности лазерного излучения и обусловлена протеканием в ДНК двухквантовых фотохимических реакций, приводящих к образованию ряда новых повреждений, не наблюдающихся в условиях низкоинтенсивного УФ-облучения;

установление связи летального действия длинноволнового УФ-света

/320-400 нм/ с протеканием деструктивных фотодинамических процессов в ДНК, основным инициатором которых является супероксидный анион, радикал кислорода /б^/, генерируемый локализованным в ядерных структурах клеток НАШ;

выяснение механизма фотодинамической инактивации клеток видимым светом /400-600 нм/ в отсутствие экзогенных сенсибилизаторов, включавшего следующие последовательные реакции: поглощение света эндогенным сенсибилизатором /идентифицирован как протопорфирин/, фотогенерация протопорфирином синглетного кислорода /^Ог/, инициация деструктивных процессов в плазматической мембране /основная мишень фотодеструкции/, нарушение ее проницаемости и других функциональных свойств, гибель клетки;

обнаружение у ряда представителей дрожжевых организмов новых эффектов фотозащиты от летального действия УФ-лучей /254, 313 нм/ и ионизирующего /рентгеновского/ излучения и доказательство связи этих эффектов с фотоактивированным ферментативным синтезом серотонина; выяснение молекулярного механизма защитного действия серото-нина в качестве протектора ДНК от УФ-индуцированных повреждений;

обнаружение эффекта взаимодействия двух фотобиологических процессов у дрожжей - фотоиндуцированного биосинтеза серотонина и ферментативной фотореактивации, проявляющегося в ингибировании фотореактивации и изменении структуры ее- спектра действия; расосфровка механизма этого эффекта, в основе которого лежит связывание серотонина с УФ-облученной ДНК и ингибирование работы" фермента фотореактивации по фоторасцеплению пиримидиновых дшеров;

обнаружение фотосннергического летального эффекта при комбинированном /или совместном/ действии на клетки длинноволновых УФ-лучей /337, 365 нм/ и видимого света /400-ЧЮО нм/; объяснение явлений фотосинергизма с позиций взаимоусиления фотодеструктивных реакций, которые протекают в разных внутриклеточных структурах и индуцируются

различными эндогенными сенсибилизаторами.

Л- Ш9 с

Ь ,

Научно-практичеекая значимость.Работа выполнена в плане одной из ключевых проблем современной биофизики, связанной с изучением фундаментальных механизмов взаимодействия света с живой клеткой и устойчивости биологических систем к повреждающему действию оптического излучения. Полученные экспериментальные данные и теоретические обобщения создай; основу для понимания этих механизмов, а также открывают перспективы разработки новых подходов к решению вопросов практического применения оптического излучения в микробиологической промышленности, медицине и сельском хозяйстве. Установленный в работе фак^' фотоактивированного ферментативного синтеза серотонина ( процесс фотозащиты ) имеет непосредственное практическое значение как в связи с проблемой защиты биологических объектов от поврежца-пцего действия различных излучений, так и в аспекте поиска новых путей направленной регуляции клеточного метаболизма с целью получения физиологически активных веществ в биотехнологических процессах.

Материалы диссертации положены в основу курса лекций, читаемого автором студентам каф. биофизики биологического факультета ШУ, я нашш отражение в учебнике А.Б.Рубина "Биофизика", 1987, И. : Ейсшая школа. Результаты работы и разработанные мдщцщ используются при проведении научных исследований в институте ЕНИИсинтезбелок, на каф. биофизики Т1У, в НИИФ ЛГУ и др. институтах.

Апробация работа. Основные результаты диссертации бшш доложены и обсуждены: на 7-й и 11-й Всесоюз, конференциях по когерентной и нелинейной оптике /Тбилиси,1976г. и Ереван,1982г./,1-м Все-союз. симпозиуме "Фотобиология животной клетки "/Ленинград, 1977г./, II-м-Всесоюз. совещании "Биологическое действие УФ излучения"/Киев, 1979г./, Все союз, семинаре-совещании "Применение лазеров в биоло-

гии" /Тбилиси,1980г./, 1-м Всесоюз. биофизическом съезде /Москва, 1982г./, Всесоюз. научном совещании "Применение лазеров в биологии" /Москва,1983г./, Всесоюз. конференции "Молекулярные механизмы биологического действия оптического излучения" /Ялта,1984г./, 5-й Всесоюз. конференции по спектроскопии биополимеров /Харьков,1984г./; на 12-м Междунар. ботан. конгрессе /Ленинград,1975г./, Междунар. симпозиуме ФЕМО "Регуляция микробного метаболизма факторами внешней среды" /Пущино,1983г./, 1-м болгаро-советском симпозиуме "Свободные радикалы и биостабилизаторы" /София,1987г./; на выездной сессии межфакультетского координационного совета МГУ по биофотони-ке "Проблемы биофотохимии" /Пущино,1974г./, рабочем совещании научного совета по радиобиологии АН СССР "Комбинированное действие ионизирующей радиации, физических и химических факторов на биологические объекты" /Москва,1980г./, школе-семинаре "Современные проблемы биофизики" /Пущино,1981г./, круглом столе научного совета по фотосинтезу и фотобиологии растений АН СССР "Некоторые аспекты не-фотосинтетического действия света на растения" /Пущино,1986г./, научно-практической конференции "Экстремальные условия существования микромицетов и охрана окружающей среды" /Киев,1986г./, симпозиуме "Эволюция фотобиологических процессов" /Пущино,1986г./; на специализированных научных семинарах в институте биохимии им.А.Н. Баха АН СССР, НИИЯФ МГУ, на каф. квантовой радиофизики физического факультета и каф. биофизики биологического факультета в псковском университете.

Результаты исследований были также представлены в материалах 7-го ежегодного съезда американского общества фотобиологов /дсило-мар,Калифорния,США,1979г./, Междунар. симпозиума "Действие ультрафиолетовой радиации на растения" /Дели,Индия,1982г./, 1-го Европейского фотобиологического конгресса /Гренобль,Фцанция,1986г./ и Междунар. симпозиума "Активированные формы кислорода в биологических системах" /Варна,НРБ,1986г./

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 65 печатных работ в отечественных и зарубежных изданиях, в том числе 6 статей обзорного характера. Список основных работ приведен в конце автореферата.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, двух частей, включающих пять глав, с изложением и обсуждением экспериментального и литературного материала, заключения, основных выводов, приложения и списка цитированной литературы. Содержание работы представлено на 240 с. машинописного текста, иллюстрировано 80 рисунками и 12 таблицами; цитировано 280 литературных источников.

Методические аспекты работы. При выборе экспериментальных методов мы исходили из необходимости осуществления комплексного подхода к изучению поставленной проблемы, включающего проведение исследований на биологических системах разного уровня организации -от целых клеток до субклеточных структур и макромолекул. Это потребовало применения и разработки разнообразных методов исследования и методических приемов, в том числе оригинальных. В ходе выполнения работы были использованы методы абсорбционной и люминесцентной спектрофотометрии, электронного парамагнитного резонанса /ЭПР/, полярографии, микрофлуориметряи, препаратжвао! Аотгпгн, хроматографии, радиоизотопного анализа и др.. а тшк ришне облучатель-ные установки, включая лазерные, подробная характеристика которых в сочетании с дозиметрией, условиями облучения и проведения экспериментов дается в соответствующем разделе диссертации /приложение/.

Основнши объектами исследования служили три вида дрожжей р. Candida , включая промышленные штаммы, и несколько штатов Saccha-romyces cerevisiae , различающихся по системам темновой репарации ДНК и способности к фотореактивации. В модельных экспериментах использовали бесклеточнме системы, а также интактные митохондрии, ядра к препараты нативной ДНК. выделенные наш кз ыеток. Хярахтрркс-

тпа объектов, методы выделения ■ биохимического тфиводятся

8 ,

в приложении.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ЧАСТЬ ПЕРВАЯ

ДЕСТРУКТИВНОЕ ДЕЙСТВИЕ ОПТИЧЕСКОГО ИЗЛУЧЕНИЯ РАЗНЫХ ДЛИН ВОЛН

Основные сведения о механизмах фотодестрултивнюс реакций в биологических системах были получены в многочисленных экспериментах с коротковолновым УФ-излучением /254 нм/ газоразрядных ламп. Повреждающее действие этого излучения на клетки связано в первую очередь с фотохимическими превращениями ДНК, а также молекулярных компонентов мембран, что приводит к гибели клеток, образованию мутаций, нарушению макромолекулярных синтезов и некоторых других процессов ме-■ таболизма /Конев, Волотовский,1971; Смит, Хэнеуолт,1972; Зи/епвоп, 1976/.

Главной внутриклеточной мишенью при летальном и мутагенном действии коротковолнового УФ-излучения служит молекула ДНК, в которой роль основных хромофоров выполняют азотистые основания. Поглощение основаниями УФ-света /максимум поглощения при 260 нм/ приводит к одноквантовому возбуждению их низколежащих электронных уровней /Б^ и Т^/. При этом в ДНК протекает несколько фотохимических

реакций, из которых биологически наиболее важной является фотодиме-

_р

ризация пиримидиновых оснований с квантовым выходом ~2х10 .

Помимо одноквантовых реакций основания ДНК могут вступать в фотохимические реакции и при поглощении двух квантов УФ-света. Однако такие двухквантовне реакции в условиях низкоинтенсивного УФ-облучения удается наблюдать только в "жестких" средах /замороженные органические растворители/, где вследствие ограниченности движения молекул их время жизни в Т^-состоянпи достигает теоретических величин /"1-10 с/, и это увеличивает вероятность поглощения второго кванта даже при низких интенсивностях УФ-излучения от обычных источников /Багдасарьян,1976/3 дидких средах при комнатной темпера-

туре двухквантовые фотопроцессы в ДНК и ее компонентах стало возможным изучать недавно после создания импульсных лазерных установок, генерирующих высокоинтенсивное УФ-излучение /1>10® Вт/м^ /.

Второй критической мишенью при действии УФ-излучения являются мембранные структуры клеток. Основные эффекты воздействия УФ-света на мембраны - увеличение их проницаемости для ионов и подавление активности мембраносвязанных ферментов. С точки зрения жизнеспособности клетки наиболее важным следует считать нарушение барьерной функции мембран, которое связано главным образом с фотолизом липи-дов. Основной путь фотолиза липидов заключается в перекисном фотоокислении цепей ненасыщенных жирных кислот с образованием гидроперекисей и перекисных радикалов, способных инициировать цепь окисления исходных жирных кислот /Рощупкин,1979/. Что касается мембранных белков и ферментов, то первостепенное значение в их УФ-инактивации имеет фотолиз триптофана /Murphy ,1983/.

Итак, коротковолновое УФ-излучение вследствие прямого поглощения основаниями ДНК и молекулярными компонентами мембранных структур эффективно индуцирует протекание в них деструктивных фотохимических реакций, что приводит к серьезным биологическим последствиям. Именно это обстоятельство определило повышенное внимание к изучению молекулярных механизмов деструктивного дейстнхж коротковолнового УФ-излучения на биологические системы. Вместе с тем свет более длинноволновых участков оптического спектра также способен /хотя и с меньшей эффективностью/ оказывать повреждающее действие на биополимеры, мембраны и целые клетки /Krinsky ,1976;Webb ,1977/. Однако систематические работы в этом направлении начали проводиться только в 70-х годах. Тогда же были созданы лазерные источники высокоинтенсивного УФ-излучения, что потребовало выяснения механизмов и особенностей его деструктивного действия.

Анализ результатов исследования деструктивных фотопроцессов,

индуцируемых длинноволновым уф и видимым светом, дается в главах 2 и 3. 3 следующей же главе 1 приводятся данные, полученные при изучении особенностей повреждающего действия высокоинтенсивного лазерного УФ-излучения.

ГЛАВА 1. СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ДЕСТРУКТИВНОГО ДЕЙСТВИЯ КОРОТКОВОЛНОВОГО УФ-ИЗЛУЧЕНИЯ ЛАЗЕРНОГО И ОБЫЧНОГО ИСТОЧНИКОВ

В недавно проведенных экспериментах с растворами компонентов нуклеиновых кислот было установлено, что пикосекундные и наносекунд-ные импульсы лазерного УФ-излучения /266 нм/ при интенсивностях У/ 1010 Вт/м^ индуцируют в молекулах двухквантовые фотохимические реакции, не наблюдающиеся в условиях низкоинтенсивного УФ-облучения и приводящие к образованию продуктов их фоторазрушения, сходных с продуктами радиолиза /Ангелов с соавт.,1980; Будовский с соавт.,1981; Rubin et3.1 .,1981/. Это позволило предположить, что такого рода лазер-индуцированные процессы будут реализовываться и в ДНК, и в конечном счете обусловят специфику лазерной УФ-инактивации клеток.

В соответствии с поставленной задачей следовало выяснить, как изменение параметров УФ-излучения отразится на характере его повреждающего действия на клетки и каковы возможные отличия в природе и механизмах образования лазер-индуцированных фотопродуктов ДНК по сравнению с заранее известными, возникающими при низкоинтенсивноы УФ-облучении.

§1. Действие лазерного УФ-излучения на ДНК

Проведенный нами хроматографический анализ продуктов, образующихся при облучении водного раствора ДНК наносекунднкми /Т=1С не' импульсами лазерного УФ-излучения /266 нм/, позволил, помимо дилеров тимина, выявить еще два типа повреждений: разрывы N-гликозад-ной связи, определяемые по появлению свободного тимина в растворе, и деградированные основания, ряд конечных продуктов которых оказался аналогичным таковым в случае облучения ДНК ионизирующим /рентге-

новским/ излучением. Следует подчеркнуть, что при низкоинтенсивном УФ-облучении /254 нм/ такие повреждения в ДНК вообще не образуются.

Рис.1. Зависимость степени разрыва N-гликозидной связи за вспышку от ин-

тенсивности лазерного УФ-излучения /266 нм/.

4 8 12

16 Х109

Интенсивность, Вт/м^

Установленная квадратичная зависимость выхода разрывов от ин-

рис.1/ свидетельствует, что расщепление N -гликозидной Связи в ДНК происходит в результате двухквантовой реакции. При использованных нами интенсивностях и длительности импульса лазерного УФ-излучения второй квант поглощается преимущественно Т^-состоянием основания. Вследствие поглощения двух квантов по триплетному каналу может происходить ионизация молекул оснований. Это подтверждается проведенной оценкой величины энергии, которую приобретает надела основания в результате ступенчатого поглощения двух квантов излучения с длиной волны 266 нм. Несложные расчеты показывают, что она превышает потенциал ионизации молекулы /например, тимина/ в водной среде наэВ. Поэтому поглощение второго кванта действительно может привести к ионизации молекулы и, как следствие, вызвать расщепление М -гликозидной связи или деградацию основания в цепи ДНК.

В отличие от продуктов двуххвантовых реакций количество тими-новых димеров, образующихся в ДНК под действием лазерного УФ-излучения, не зависит от интенсивности излучения в диапазоне 4x10^ -

л л

тенсивности лазерного УФ-излучения в диапазоне 2-10x10 Вт/м /см.

2x10^ Вт/м2, и их квантовый выход практически не отличается от такового /^«0,03/ в случае облучения ДНК низкоинтенсивным УФ-светом.

Таким образом, при равных дозах УФ-облучения как высокими, так и низкими интенсивностями в ДНК образуется примерно одинаковое число продуктов одноквантовых реакций /пиримидиновые димеры/, однако при высоких интенсивностях в ней дополнительно возникают новые типы повреждений /деградированные основания, разрывы N -гликозидной связи/, которые являются результатом протекания двухквантовкх фотохимических реакций с участием ионизированных состояний молекул оснований. Иными словами, при переходе от низкоинтенсивного к высокоинтенсивному лазерному УФ-облучению происходит увеличение выхода суммарного фотопродукта в ДНК. Можно было ожидать, что это приведет к более высокой эффективности инактивирующего действия высокоинтенсивного УФ-излучения на клетки.

§2. Особенности лазерной УФ-инактивации клеток

При исследовании действия наносекундного УФ-излучения /266 нм/ на клетки дрожжей было установлено, что существует зависимость летального эффекта от интенсивности: с увеличением интенсивности от 10® до 5х109Вт/м2 поперечное сечение инактивации клеток возрастает. При этом чувствительность клеток к высоким интенсивностям лазерного УФ-излучения /266 нм/ значительно выше, чем к низкоинтенсивному УФ-свету /254 нм/.В соответствии с результатами, изложенными в §1,данный эффект можно объяснить тем, что при высоких интенсивностях УФ-излучения общий выход повреждений в ДНК превышает таковой в случае облучения клеток низкоинтенсивным УФ-светом.

Для определения относительного вклада в летальный эффект фотопродуктов одноквантовых и двухквантовых реакций были проведены опыты с использованием мутантного, УФ-чувствительного штамма дрожжей. Оказалось, что отношение поперечных сечений инактивации клеток мутантного и дикого штаммов при лазерном УФ-об лучении меньше, чем при

облучении низкоинтенсивным УФ-светом. Поскольку мутантный штамм де,-фицитен по эксцизионной системе репарации ДНК, способной ликвидировать пиримидиновые димеры, то полученные данные позволили заключить, что при действии лазерного УФ-излучения вклад димеров в инактивацию , клеток уменьшается. Такой же вывод следовал и из результатов эспе-риментов по изучению фотореактивации УФ-облученных клеток - процесса, в основе которого лежит фотоферментативное расщепление только пиримидиновых димеров ДНК. Эти эксперименты показали, что с ростом интенсивности лазерного УФ-излучения степень фотореактивации клеток заметно уменьшается. Аналогичные данные были получены на фагах и плазмидах/2ауНде1эку а1 .,1985/.

Итак, при переходе от низкоинтенсивного к высокоинтенсивному лазерному УФ-облучению относительный вклад пиримидиновых димеров ДНК в инактивацию клеток уменьшается за счет увеличения вклада продуктов двухквантовых фотохимических реакций, таких, как разрывы N1-гликозидной связи и деградированные основания. Кроме того, было показано, что при использованных нами интенсивносТях наносекундное лазерное УФ-излучение индуцирует одноцепочечные разрывы в ДНК /Бур-чуладзе,1982/, которые, как известно, имеют важное значение в инактивации клеток. Увеличение общей эффективности фотоповреадения ДНК при действии лазерного УФ-излучения по сравнению с тспгшггенсившди УФ-светом обычных источников и обусловливает, очевидно, установленные различия в летальных эффектах, вызываемых этими видами УФ-света.

Полученные данные об особенностях, повреждающего действия выбс?-коинтенсивного лазерного УФ-излучения кратко суммированы в таблице.

ГЛАВА 2. ПОВРЕЖДАЮЩЕЕ ДЕЙСТВИЕ ДЛИННОВОЛНОВОГО УФ-СВЕТА /300-400 нм/

О том, что длинноволновый УФ-свет способен оказывать повреждающее действие на биологические системы, известно достаточно давно. Уже в ранних работах было показано, что длинноволновое УФ-юблрение

' \ И

Таблица

Сравнительная характеристика деструктивного действия высокоинтенсивного лазерного УФ-излучения и низкоинтенсивного УФ-света на клетки и ДНК •

Вид УФ-излучения

Зависимость фотоинактивации клеток от интенсивности излучения

Основной тип фотовозбуждения оснований ДНК

Основные летальные фотопродукты ДНК

Непрерывное низкоинтенсивное /Л=254 нм, Г <10 Вт/м2 /

Импульсное наносе кундное /JU 266 нм.Т^п =

10 не, Г^ 108 Вт/м2 /

Отсутствует

Нелинейное увеличение поперечного сечения инактивации при I 7/ Ю8 Вт/м2

Одноквантовое

возбуждение

низколежащих

электронных

уровней

Двухквантовое• возбуждение высрколежащих уровней с последующей ионизацией молекул

Пиримидино-вые димеры

Продукты двухкванто-вых реакций /разрывы N -гликозидной связи, деградированные основания, одноце-почечные разрызы/

вызывает торможение роста и1инактивацию клеток, ингибирует их дыхание и другие метаболические процессы /Kashket, Brodie ,1962; Ei -senstark ,1971; Jagger ,1972; Samoi lova, Kr\j lenkoY,1973/. Однако механизмы отмеченных эффектов, особенно у эукариотных клеток, до недавнего времени оставались практически не изученными. В значительной мере это связано с тем, что до сих пор не удавалось идентифицировать природу первичных хромофоров и сенсибилизаторов в.клетках. Поэтому, приступая к исследованиям в данном направлении, мы сосредоточили основное внимание на экспериментальном решении именно этих вопросов.

Ниже приводятся результаты, полученные нами при выяснении механизмов двух индуцируемых длинноволновым УФ-светом повреждающих эффектов у дрожжей - фотоинактивации и фотоингибирования дыхания.

§1. Летальные эффекты

При изучении действия на дрожжи длинноволнового УФ-света области 300-400 нм найдены режимы облучения, при которых наблюдается гибель клеток. Показано также, что летальные эффекты, индуцируемые УФ-светом длин волн >320 нм, строго зависят от кислорода, тогда как инактивация, вызываемая светом с длиной волны 313 нм из области 300320 нм, от кислорода не зависит. Установленный факт свидетельствовал о существенных различиях в природе и механизмах образования летальных повреждений, индуцируемых УФ-светом 313 нм и длин волн в области 320-400 нм. Действительно, как показали опыты по изучению фотореактивации, основными фотопродуктами, ответственными за летальное действие УФ-света 313 нм, являются пиримидиновые димеры ДНК; в инактивацию же, вызываемую УФ-светом области 320-400 нм, димеры практически не вносят вклада.

Для того чтобы выяснить, является ли вообще ДНК мишенью при летальном действии света этой области Уф-спектра, мы использовали му-тантные 'лтаммы дрожжей, дефицитные по эксцизионной и пострепликатив-ной репарации ДНК. Оказалось, что они проявляют более высокую чувствительность к облучению УФ-светом области 320-400 нм по сравнению с их диким штаммом, и, следовательно, повреждение ДНК имеет важное значение в инактивации клеток, вызываемой светом данной области УФ-спектра. Отметим, что роль ДНК в качестве основной мишени при летальном действии длинноволновых УФ-лучей показана и в отношении бактериальных клеток /Самойлова, 1979; Webb, 1977; Peak, Peak,1983/.

Вместе с тем, поскольку граница поглощения молекулы ДНК лежит при 300-310 нм, она, очевидно, не может служить первичным хромофором ггтзи длинноволновом УФ-облучении клеток. Поэтому образование фото-

повреждений должно происходить не за счет прямого поглощения квантов основаниями ДНК, а косвенным путем с участием каких-то эндогенных сенсибилизаторов. В соответствии с приведенными выше данными о принципиальных различиях в проявлении эффектов инактивации, вызываемых УФ-светом 313 нм и длин волн в области 320-400 нм, можно считать, что разными должны быть как сами сенсибилизаторы в этих случаях,так и механизмы индуцируемых ими фотохимических реакций, приводящих к образованию повреждений в ДНК.

Сильная зависимость от кислорода летального эффекта, вызываемого УФ-облучением в области 320-400 нм,'свидетельствует, что в повреждении ДНК светом этих длин волн участвуют фотодинамические процессы. Поскольку при фотодинамическом действии эффективнее повреждаются те внутриклеточные компоненты, с которыми сенсибилизаторы находятся в непосредственной близости, наиболее вероятно, что в дрожжевых клетках сенсибилизатор локализован в ядерных структурах. Спектрофлуоршетрический анализ изолированных дрожжевых ядер позволил выявить наличие в них флуоресцирующего вещества с максимумами в спектрах возбуждения А350 нм/ и флуоресценции /~450 нм/, характерными для НАДН. Было установлено также, что спектр действия фотоинактивации клеток в области 320-400 нм характеризуется максимумом при 340-350 нм и обнаруживает близкое сходство со спектром поглощения НАДН. Эти данные позволили заключить, что именно локализованный в ядре НАДН служит основным сенсибилизатором при фотодинамическом действии на клетки дрожжей УФ-света области 320 - 400 нм.

При исследовании вопроса о механизме фотосенсибилизации нами была обнаружена способность НАДН фотогенерировать супероксидный анион-радикал кислорода. Для детектирования образования 0^ использовали его акцепторы: феррицитохром с , способный восстанавливаться супероксидом кислорода с увеличением поглощения при 550 нм, и тайрон, который при взаимодействии с 0^ окисляется до семзхинона, обнаруживаемого по характерному спектру ЭПР.

/S*3

Результаты, полученные в экспериментах с использованием ферри-цитохрома с , показали, что при длинноволновом УФ-облучении как раствора НАДН, так и суспензии ядер происходит его восстановление. Значительное уменьшение эффекта в присутствии супероксиддисмутазы /СОД/, ингибирующей реакцию образования б^ . свидетельствовало о том, что в восстановлении феррицитохрома С принимает участие б^ , фотогенерируемый НАДН. На основании этих данных было рассчитано молярное количество 0^ ,^образующегося при облучении раствора НАДН или суспензии ядер длинноволновым УФ-светом /см.рис.2/. Кроме того, была проведена оценка величины квантового выхода фотогенерации б^ в условиях облучения раствора НАДН вгнзхракатическим УФ-светом лазерного источника /337 нм/ : V « ЗхЮ-6.

■«с о

а:

I о* „

•О 2

1 -

Рис.2. Фотогенерация б^ в 2 к" растворе НАДН /1/ и в суспензии ядер -/2/ в зависимости от дозы облучения длинноволновым УФ-светом /320-400 юл/; концентрация белка в ядрах 200 мкг/мл.

О 39 78 117

Доза, кДж/м

Применение спинового индикатора б^ - тайрона позволило нам зарегистрировать в растворе НАДН и в суспензии ядер фотоиндуцированный сигнал ЭПР, который совпадал по структуре со спектром ЗПР окисленного тайрона. Доказательством участия б^ в реакциях окисления тайрона служило уменьшение величины сигнала в присутствии СОД/см.рис.3/.

Рис.3, ^отоиндуцированнкй сигнал ЗПР тайрона в суспензии ядер без /1/ и с добавлением /2/ СОД. Доза облучения УФ-светом /320-400 нм/-1,2>104 Дж/м2. Условия записи: амплитуда ЗЧ-моиуляции 10 Тл, мощность СВЧ-2 мВт, скорость развертки 4Х10-4 Тл/мин. Аналогичные спектры получены для юаствора HAIH.

Проведенные с та/роном эксперименты подтвердили способность КАЛН фотогенерировать Óg как in vitro , так и in vivo . Необходимо было выяснить роль 0g в индуцируемой УФ-светом 320-400 нм инактивации клеток. При релении этого вопроса мы исходили из того, что если 0р участвует в деструктивных реакциях, то тайрон будет уменьшать летальный эффект. Было установлено, что тайрон весьма эффективно защищает клетки от летального действия УФ-света области 320-400 юл, и, следовательно, Og играет важную роль в инициации деструктивных реакпий в ДНК при облучении клеток данной областью УФ-спектра.

Отсутствие зависимости от кислорода выхода пиримидиновых диме-ров - основных летальных фотопродуктов при действии УФ-света 313нм-показывает, что их образование осуществляется не по фотодинамическому механизму, а путем молекулярной фотосенсибилизации. Моделью такого механизма может служить фотосенсибилизированное некоторыми производными кетонов образование пиримидиновых димеров в ДНК, которое включает перенос энергии возбуждения с тришгетного уровня сенсиби-

лизатора, поглотившего квант света />310 нм/, на триплетный уровень основания с последующей его димеризацией /Завильгельский,1987/. Наличие кетонов в клетках в качестве естественных продуктов метаболизма делает предположение об их роли как сенсибилизаторов при образовании димеров в ДОК in vivo наиболее вероятным.

Итак, в основе летальных эффектов, вызываемых светом двух участков длинноволновой УФ-области спектра /300-320нм и 320-400нм/, лежат различные молекулярные механизмы. Летальное действие УФ-света 313 нм, как и коротковолновая УФ-инактивация клеток, не зависит от кислорода »обусловлено главным образом пиримидиновыми димерами ДНК. Однако, в отличие от коротковолнового 5$-жадучения, при действии которого димеры образуются в результате прямого возбуждения оснований ДНК, УФ-свет 313 нм индуцирует образование этих фотопродуктов преимущественно путем фотосенсибшшзации с участием, вероятно, соединений, подобных кетонам. Что касается света длин волн области 320 -400 нм, то в их летальное действие пиримвдиновые димеры практически не вносят вклада, хотя основной мишенью фотодеструкции и в данном случае является молекула ДНК. При этом деструктивные реакции в ДНК протекают по фото динамическому механизму и инициируются в основном Óg, генерируемым НАДН. Шесте с тем не исключено, что в процессах повреждения ДНК участвует и другой высокореакцконносаээайнЛ рахж-кал - ОН. Основанием для такого предположения кнут служить данные об индуцированном длинноволновым УФ-светом образовании в клетках

• одним цз продуктов взаимодействия которой с 0^ , как известно, является гидроксильный радикал. Учитывая это, сенсибилизированные НАГО реакции образования кислородных радикалов, приводящие к повреждению ДНК, можно представить в виде следующей схемы:

ЬО *+0о . НАДН—Х-НАДН ПАИ* + Оо

«-НоОо

ОН

где НАД1" - окисленная форма НАШ, образующаяся в результате одно-электронного переноса от фоторозбужденного сенсибнлизгтгрз /

на кислород. Кислородные радикалы способны вызывать в ДНК одноцепо-чечные разрывы, окислять азотистые основания, расщеплять И-глико-зидные связи. Очевидно, эти повреждения ДНК и вносят основной вклад в инактивации клеток дрожжей при действии длинноволнового УФ-света области 320 - 400 нм.

§2. Эффект фотоингибирования дыхания

Длинноволновый УФ-свет /300-400 нм/ наряду с инактивацией клеток вызывает ингибирование их дыхания. Однако в данном случае фотоактивным оказался только УФ-свет области 300-320 юл /313 нм/. Свет длин волн в области 320-400 нм при использованных нами интенскзнос-тях и дозах облучения не влиял на интенсивность дыхания клеток. Природа эффекта фотоингибирования дыхания была исследована в опытах с интактными дрожжевыми митохондриями. На приведенной схеме /рис.4/ показаны места вхождения электронов от субстратов /сукцинат и аскор-бат/, которые мы применяли при определении участка, на уровне которого могло происходить индуцированное УФ-облучением /313 нм/ блокирование электронно-транспортной цепи:

НАДН-— Фп1 Ух — Ь — сх —- с — а+аз —— 0?

сукцинат аскорбат

Рис.4. Упрощенная схема дыхательной цепи дрожжевых митохондрий. Фп - флавопротеиды, Ух - убихинон, Ь , с^, с, а,а3 - цитохромы.

Измерение скорости поглощения кислорода при окислении митохондриями сукцината показало, что УФ-свет 313 нм вызывает подавление сукцинатоксидазной активности, причем между кривой, характеризующей зависимость подавления этой активности от дозы облучения, и соответствующей кривой фотоингибирования дыхания целых клеток существует близкая корреляция. Установленный факт свидетельствовал о том, 6 - /&9

что эффект фотоингибирования дыхания связан главным образом с подавлением активности сукцинатоксидазной системы. При исследовании спектра действия подавления сукцинатоксидазной активности было установлено, что свет длин волн в области 320-400 нм, как и в случае облучения целых клеток, не эффективен, а максимум в этом спектре расположен при 280 нм. Кроме того, было выявлено совпадение спектра действия со спектром поглощения убихинона, на основании чего мы предположили, что данный компонент электронно-транспортной цепи выполняет роль первичного хромофора и мишени. Однако, обращаясь к схеме, видно, что подавление сукцинатоксидазной активности в принципе может быть связано с блокированием дыхательной цепи не только на уровне убихинона, но и на уровне флавопротеидов /Фп^ и цитохро-мов. Для выяснения роли цитохромов быха измерена цитохромоксидазная активность в УФ-облученных митохондриях. Оказалось, что при дозе облучения, ингибирующей сукцинатоксидазную активность на 9Сцитохромоксидазная активность не изменяется, и, следовательно, цито-хромы можно исключить из числа возможных кандидатов на роль хромофоров. Также маловероятно, что флавопротеиды выполняют такую роль. Действительно, как уже отмечалось, свет длин волн в области 320 -400 нм, где расположен максимум в спектре поглощения флавопротеидов, абсолютно не эффективен в подавлении сукцинатоксидазной активности.

В соответствии с вышеизложенным можно считать, что УФ-индуциро-ванное блокирование электронно-транспортной цепи происходит на уровне убихинона. Дополнительным подтверждением этого служат результаты проведенного нами спектрофлуориметрического анализа, показавшего, что после УФ-облучения митохондрий компоненты дыхательной цепи, расположенные с ее восстанавливающего конца /НАДН и флавопротеиды/, обнаруживают изменения во флуоресцентных характеристиках, соответствующие их переходу в более восстановленное состояние в результате образования "убихинонового блока".

Совокупность полученных данных позволяет сделать вывод о том, что при повреждающем действии УФ-света на дыхательную систему дрожжей первичным хромофором и мишенью служит убихинон.

ГЛАВА 3. ФОТОДИНАМИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ ВИДИМОГО СВЕТА /400-600 нм/ В ОТСУТСТВИЕ ЭКЗОГЕННЫХ СЕНСИБИЛИЗАТОРОВ

Известно, что видимый свет в комбинации с экзогенными сенсибилизаторами /красители, пигменты/ и кислородом оказывает сильное повреждающее действие на биологические системы. Исследованию таких фотодинамических эффектов посвящены многочисленные работы, и к настоящему времени в изучении их механизмов достигнуты определенные успехи /Ио ,1983/. Значительно менее подробно исследованы летальные эффекты видимого света .без добавленных к клеткам сенсибилизаторов. До последнего времени практически отсутствуют данные о спектрах действия фотоинактивации клеток, остаются слабо изученными вопросы о природе внутриклеточных сенсибилизаторов и мишеней, не выяснена роль различных форм активированного кислорода в реализации фотодеструктивных процессов.

В данной главе приводятся экспериментальные результаты, полученные наш при исследовании этих вопросов.

§1. Роль активированных форм кислорода в фотоинактивации клеток

Согласно современным представлениям, важными интермедиатами в фотодинамических деструктивных процессах, индуцируемых экзогенными сенсибилизаторами, являются активированные формы кислорода, которые образуются в результате взаимодействия фотовозбужденных сенсибилизаторов с кислородом и могут эффективно окислять биологически важные молекулы, вызывая потерю их функциональных свойств. Наличие в клетках ряда соединений, имеющих поглощение в видимой области спектра и обладающих сродством к кислороду, позволяет считать, что видимый свет может индуцировать образование активированных форм кислорода и в отсутствие экзогенных сенсибилизаторов, и тем самым вызывать

фотоповреждение клеток. Фотоиндуцированные деструктивные процессы такого рода должны с наибольшей вероятностью протекать в клетках, не содержащих каротиноиды и другие пигменты, способные эффективно тушить активированные формы кислорода. Использованные в наших опытах клетки дрожжей являются именно такими объектами.

В результате проведенных исследований были найдены режимы облучения, при которых видимый свет /400-600 нм/ вызывает инактивацию клеток. Строгая зависимость обнаруженного летального эффекта от кислорода свидетельствовала о том, что процесс фотоинактивации осуществляется по фотодинамическому механизму с участием активированных форм кислорода. Мы исследовали относительный вклад в фотоповреждение клеток двух таких форм - супероксидного анион-радикала и синг-летного кислорода. Применение тайрона, служащего акцептором /см. главу 2/, позволило нам зарегистрировать непосредственно в клетках фотоиндуцированный сигнал ЭПР, совпадавший по структуре со спектром ЬГР окисленного тайрона. Исчезновение сигнала при облучении клеток видимым светом в бескислородных условиях подтверждало тот факт, что в процессе окисления тайрона участвует • Однако, как было установлено в опытах по определению выживаемости клеток, добавление тай- . рона вызывает очень слабую их защиту от фотоинактивации. Следовательно, ¿2« хотя и образуется в клетках под дейетзгЕа видимого света, вклад в летальный эффект в данном случае практически'не вносит / ср. с результатами, приведенными в главе 2 /.

В отличие от 0^, фотосенсибилизированное образование синглет-ного кислорода обнаруживается физическим метолом /по люминесценции с максимумом при 1272 нм/ только в растворах. Непосредственно в живых клетках такую люминесценцию пока зарегистрировать не удается /Красновский,1987/. Поэтому для выяснения вопроса об участии в фотодеструктивных процессах в клетках применяются его тушители, полученные нами данные о влиянии одного из эффективных тушителей

2.А

- азвда натрия - на степень фотоинактивации дрожжей показали,

что он сильно защищает клетки от летального действия видимого света.

> 1

Этот факт указывает на существенный вклад О2 , генерируемого эндогенным сенсибилизатором, в фотоповреждение клеток видимым светом.

§2. Природа сенсибилизатора и мишени в клетках дрожжей при летальном действии видимого света

Для выяснения природы сенсибилизатора был исследован спектр действия фотоинактивации, представленный на рис.5. Там же приведен спектр поглощения раствора пигмента, экстрагированного нами из мембранной фракции клеток дрожжей. Близкое сходство двух спектров позволяет считать, что этот пигмент выполняет роль эндогенного сенсибилизатора. Помимо спектра поглощения выделенного пигмента мы зарегистрировали также его спектр флуоресценции с максимумом при 640 юл. Сопоставление полученных данных о структуре спектров поглощения и флуоресценции пигмента с имеющимися в литературе сведениями о спектральных свойствах порфириновых соединений /Юденфренл,1965; Красновс-кий.1984/ позволило идентифицировать пигмент-сенсибилизатор из дрожжей как протопорфирин.

Выше отмечалось, что при фотодинамическом действии наиболее эффективно повреждаются те биоструктуры, с которыми сенсибилизатор находится в непосредственной близости. Поскольку протопорфирин связан с мембранным комплексом дрожжевых клеток, можно было предположить, что фотодеструкции подвергаются преимущественно их мембранные структуры. Для выяснения этого вопроса мы провели опыты по определения степени фотоиндуцированного изменения проницаемости плазматических мембран дрожжей к флуорохрому примулину, используя люминесцентно-микроскопический метод. Была установлена корреляция в дозовых зависимостях увеличения проницаемости плазматической мембраны и степени фотоинактивации клеток. Эти результаты четко продемонстрировали, что основная причина гибели дрожжей под действием видимого света заключается в фотоповреждении их плазматических мембран.

25"

"350 400 450 500 550 600 650 700 Длина волны, им

.Рис.5. Спектр действия фотоинактивации дрожжевых клеток / и спектр поглощения протопорфирина, выделенного из мембранной фракции дрожжей /2/. Эффективность фотоинактивации определяли как величину, обратную дозе монохроматического света, при которой выживаемость клеток составляла 37? /F^^/.

Согласно полученным в последние годы данным, фотодеструктивные

процессы в мембранах, индуцируемые экзогенными сенсибилизаторами и

протекающие с участием 0g, обусловлены повреждением молекул белков и липидов /Черницкий,Воробей,1986/. При этом липиды повреждаются в основном за счет перекисного фотоокисления ненасыщенных жирных кислот /см. выше/, а белки - в результате окисления аминокислотных остатков с последующим образованием сшивок между полипептидными цепями. Очевидно, что такие же фотодеструктивные процессы с участием • протекают и в мембранах исследованных нами дрожжей. Следствием этих цроцессов является изменение важнейших функциональных свойств мембран и в первую очередь нарушение их проницаемости, что в итоге приводит к гибели клеток.

Таким образом, механизм фотоинактивации дрожжей видимым светом включает следующие последовательные реакции: поглощение света прото-порфирином —фотогенерация —инициация деструктивных процессов в плазматической мембране —нарушение ее'проницаемости и других биологических функций —— гибель клеток.

ЧАСТЬ ВТОРАЯ

ФОТОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ ПРИ КОМБИНИРОВАННОМ ДЕЙСТВИИ СВЕТА РАЗНЫХ ДЛИН ВОЛН

При комбинированном действии на биологические системы различных видов излучений может происходить либо взаимоусиление деструктивных процессов /синергизм/, либо их ослабление /антагонизм/. Показано, например, что длинноволновые УФ-лучи /320-400 нм/ резко усиливают образование эритемы и рака кожи, вызываемое УФ-облучением в области 290-320 нм / Parr ish et al .,1978/. Синергические повреждающие эффекты выявлены также при комбинированном действии света разных длин волн УФ-спектра на клетки бактерий /Tyrrell ,1978/. Однако механизмы, лежащие в основе этих эффектов изучены мало. Кроме того, до последнего времени не исследованы фотосинергические процессы при взаимодействии таких важных компонентов солнечной радиации, как видимый свет и длинноволновый УФ-свет. Практически отсутствуют данные и об антагонистических фотобиологических реакциях. Исключение, составляет известный процесс ферментативной фотореактивации.

Учитывая это, мы поставили перед собой задачу провести подробное исследование фотобиологических эффектов при комбинированном действии света разных длин волн на дрожжевые клетки.

ГЛАВА 4. ФОТОЗАЩИТА И ФОТОРЕАКТИВАЦИЯ

§1. Обнаружение и изучение механизма эффекта фотозащиты у дрожжей Исследование комбинированного действия на дрожжи света-разных

длин волн позволило установить, что длинноволновые УФ-лучи /313,

334, 365 нм/ в дозах, не влияющих на скорость размножения и выживаемость клеток, при предварительном облучении вызывают уменьшение летального действия коротковолнового УФ-излучения /254 нм/. Были выявлены следующие основные закономерности обнаруженного эффекта фотозащиты: 1/ для максимального проявления эффекта необходим интервал времени /2 ч/ между последовательными воздействиями на клетки длинноволнового и коротковолнового УФ-света; 2/ величина фотозащиты обнаруживает зависимость от температуры в этот интервал, характерную для ферментативных процессов. В дальнейшем било установлено, что эффект фотозащиты наблюдается и при облучении клеток УФ-светом 313 нм, однако он отсутствует в случае летального действия длинноволновых УФ-лучей /320-400 нм/ и видимого света /400-600 нм/, а также резко уменьшается при высоких интенсивностях />108 Вт/м2 / лазерного УФ-излучения /266 нм/. Как показано выше, летальное действие этих видов оптического излучения отличается от инактивации, вызываемой УФ-лучами 254 и 313 нм, полным отсутствием или значительным уменьшением /в случае лазерного УФ-излучения/ вклада в летальные эффекты пиримидиновых димеров ДНК. Поэтому можно считать, что защитное действие длинноволнового УФ-света реализуется в том случае, если основной вклад в фотоинактивацию клеток вносят пиримидиновые димеры. Установление этого факта наряду с данными о наличии температурно-зави-симой стадии в процессе фотозащиты позволило выдвинуть предположение о том, что в основе механизма фотозащиты лежит индуцируемый длинноволновым УФ-светом ферментативный синтез какого-то соединения, способного выполнять функцию протектора ДНК, то есть уменьшать в ней выход пирнмилиновых димеров.

В специальных исследованиях было обнаружено, что длинноволновый УФ-свет может вызывать защиту дрожжевых клеток не только от УФ-инактивации, но и от летального действия ионизирующего /рентгеновского/ излучения. Поскольку основные закономерности проявления двух фотозащитных эффектов оказались аналогичными, мы предположили, что

¿8

фотозащита от рентгеновского излучения тоже связана с фотоиндуцированным синтезом в клетках какого-то вещества. Согласно гипотезе Б.Н. Гончаренко и Ю.Б.Кудряшова /1980/, важную роль в радиорезистентности биологических объектов играют биогенные амины, такие, в частности, как серотонин и гистамин. Учитывая это, мы сочли целесообразным в первую очередь исследовать влияние длинноволнового УФ-света на синтез именно этих веществ. Проведенные опыты показали, что после облучения клеток по "фотозащитному режиму" в них увеличивается уровень как гистамина, так и серотонина. В рамках упомянутой гипотезы эндогенного фона радиорезистентности установленный факт позволял объяснить фотозащиту дрожжей от ионизирующего излучения. Он также согласовывался с нашим предположением о роли фотоиндуцированного синтеза какого-то соединения в фотозащитном эффекте. Однако для доказательства участия гистамина или серотонина в проявлении фотозащиты в случае УФ-инактивации требовались дополнительные данные. Иными словами,

. предстояло выяснить, действительно ли фотозащита*от УФ-инактивации связана с фотоиндуцированным образованием в клетках серотонина и/или гистамина либо эти процессы протекают независимо и отношения к фотозащите не имеют.

Для экспериментального решения этого вопроса фотозащитный эффект исследовали в условиях дефицита в клетках предшественников синтеза серотонина и гистакяиа соответственно триптофана и гистидина. Оказалось, что у таких клеток эффект фото защиты исчезает. Однако при добавлении к ней триптофана эффект вновь проявляется, причем его зависимость от интервала времени между воздействиями длинноволновым и коротковолновым УФ-светом совпадала с таковой в случае фотозащиты у недефнцитных по триптофану клеток. В то же время добавление гистидина не приводило к "восстановлению'' эффекта фотозащиты. Полученные данные показали, что эффект фото защиты связан в основном с фотоиндуцированнвми реакциями превращения триптофана.

п- ХФА

Триптофан ТШтмВДГСЙМЦЗ*. 5^,к0и1рип104м ДЕКДГСТСМДЗа . —5-окситриптамин / серотонин /.

На приведенной схеме пути синтеза серотонина из триптофана отмечен ингибитор п-хлорфенилаланин /п-ХФА/, блокирующий цепь на уровне фермента триптофангидроксилазы. Мы установили, что в присутствии этого ингибитора эффект фотозащиты не наблюдается, однако полностью восстанавливается при добавлении 5-окситриптофана, включающегося в цепь синтеза после заингибированного фермента. Следовательно, эффект фотозащиты связан с фотоиндуцированными реакциями превращения триптофана именно по пути синтеза серотонина. Дополнительное подтверждение участия серотонина в процессе фотозащиты было получено в опытах, которые показали, что экзогенный серотонин вызывает эффект защиты клеток от УФ-инактивации, аналогичный фотозащите, то есть серотонин обладает фотомиметическим действием.

Согласно данным литературы /Воскресенская, 1975; Крицкий',1986; Zucker,1972; Hug ,1978/, фотоиндуцированный ферментативный синтез каких-либо соединений может осуществляться по двум механизмам: либо за счет фотоицдукции синтеза ферментов de novo, либо в результате их фотоактивации. Основной подход, позволяющий решить вопрос, какой i из двух механизмов участвует в такого рода процессах, заключается в использовании ингибиторов белкового синтеза. Как показали налш эксперименты по изучению влияния пуромицина и циклогексиыида на проявление эффекта фотозащиты, эти антибиотики в концентрациях, блокирующих синтез белка в клетках в течение темновой стадии процесса, не изменяют величины фотозащиты. Поэтому можно считать, что образование в клетках серотонина не связано с фотоиндуцированным.синтезом ферментов серотонинового пути de novo, а происходит в результате фотоактивации гидроксилазы и/или декарбоксилазы / см. схему /.

В специально проведенных опытах по определению скоростей реакций гидроксилирования триптофана и декарбоксилирования 5-окситрип-тофана в бесклеточных системах дрожжей нами было установлено, что длинноволновый УФ-свет вызывает фотоактивацию как триптофангидрокси-лазы, так и декарбоксилазы.

Итак, в оенове эффекта фотозащиты лежит фотоактивированный ферментативный синтез в клетках серотонина. В соответствии с нашим предположением о роли серотонина как протектора ДНК, вопрос о механизме его защитного действия исследовали в модельных экспериментах с растворами ДНК и серотонина. Предварительно изучали природу связывания серотонина с ДНК. Спектрофлуориметрический анализ показал, что при взаимодействии серотонина с ДНК происходит тушение его флуоресценции. Такое тушение флуоресценции могло быть обусловлено встраиванием молекул серотонина в цепь ДНК. Для подтверждения образования интеркалированного комплекса между серотонином и ДНК мы исследовали взаимодействие с ДНК серотонина и известного интеркалято-ра ДНК - красителя акридинового оранжевого /АО/. В том случае, если серотонин также обладает способностью интеркалировать в цепь ДНК, можно было ожидать, что эти два соединения будут конкурировать за места связывания. Установлено, что добавление АО к комплексу серото-нин-ДНК приводит к уменьшению степени тушения флуоресценции серотонина молекулой ДНК. Этот факт свидетельствует о высвобождении части молекул серотонина из комплекса в результате встраивания в цепь ДНК молекул АО. Данные по влиянию серотонина на комплекс АО с ДНК приведены на рис.6. Увеличение интенсивности флуоресценции АО в присутствии ДНК отражает образование интеркалированного комплекса. Как видно, при добавлении серотонина флуоресценция АО увеличивается в меньшей степени. Следует отметить, что экранирующий эффект серотони- ' на при длине волны возбуждения флуоресценции АО /305 км/ не наблюдался. Поэтому уменьшение интенсивности флуоресценции АО в комплексе с ЛЗС ирг лггйЕзлении серотонина является следствием вытеснения

молекул красителя из интеркалированного комплекса за счет встраивания молекул серотонина в цепь ДНК.

100 г

яг к о

8,25

Рис.6. Изменение интенсивности флуоресценции акридинового оранжевого / Ю-5 М / в зависимости от концентрации ДНК без серотонина / 1 / и с добавлением 10М / 2 / и Ю-4 М / 3 / серотонина : -*в036 = 305 ни. .Афл = 530 ни.

Итак, серотонин и АО конкурируют за места связывания, вытесняя друг друга из комплекса с ДНК, и, следовательно, серотонин, как и АО, действительно способен встраиваться в цепь ДНК. Была проведена оценка величины константы интеркалированного связывания серотонина с ДНК /1^/, которую рассчитывали по формуле

кс = Сь/С, (N-0*), /1/

где Сь И С^- концентрации связанных и свободных молекул серотонина соответственно, N - концентрация мест связывания. Значения Сь и

с+ мы определяли на основании данных, приведенных на рис.7, по ормулам

Сь= (1-1»А) С4/1фА , /2/

с^. = 1<рд Сь / 1фЛ , /3/

где Сь+ С^. - обшая концентрация молекул серотонина, -

интенсивность флуоресценции серотонина без ДНК, а X ^ - в присутствии ДНК. Уравнение /1/ может быть записано в виде

СЬ/С#Р = К;СП -КССЬ/Р, /4/

где Р - концентрация ДНК, выраженная в молях фосфата на литр, а П = . Построение зависимости С^/С^Р от Сь/Р позволило нам гра-

?з?с.7. Зависимость интенсивности флуоресценции серотонина от его концентрации в отсутствие /1/ и пни'добавлении 0,33 кМ ДНК /2Л

-Авозб = ?05 -*фл = 345

Рис.8. Уменьшение выхода УФ-индуцированных тиминовых дилеров з ДНК /0,33 уЗ/ в зависимости от количества молекул сеготонина. тгсихоля-шихся на одну пару оснований ДНК / К /.

Выяснение вопроса о влиянии серотонина на формирование УФ-инду-цированных димеров в ДНК проводили в условиях, когда практически все молекулы серотонина связаны с ДНК. Было установлено, что в присутствии серотонина выход тиминовых димеров уменьшается. На рис.8 приведена зависимость уменьшения количества димеров от концентрации связанного с ДНК серотонина, позволившая оценить значение эффективного . расстояния в парах оснований /£/, на котором реализуется защитное действие каждой интеркалированной молекулы, с помощью выражения

N = N0 (1 ~ , '

где Мо- процент димеров тимина в отсутствие серотонина, N - в присутствии серотонина, К - количество молекул лиганда, приходящихся на одну пару оснований ДНК. Расчеты показали, что для серотонина

4. Иными словами, одна интеркалированная молекула серотонина может уменьшать выход тиминовых димеров в ДНК на участке цепи в ~ 4 пары оснований. Предложенный на основании этих данных механизм запиты ДНК серотонином подробно обсуждается в диссертации.

В целом механизм процесса фотозащиты клеток от УФ-инактивации можно представить в виде следующей схемы, где Ф - ферменты цепи синтеза серотонина /С/, Ф*- ферменты в фотоактивированном состоянии,

Т - тимин, Т Т - димер тимина :

УФ-излучение /254, 313 ни/

Фотоиндуциро-ванный синтез серотонина

-т т

Комплекс /ДНК-серотонин/

ФОТОЗАЩИТА

I .]

ДНК 1

1. * .1 "V Инакти-

■V - вация

- клеток.

Необходимо било выяснить, может ли связанный серотонин выполнять роль протектора ДНК от повреждений, индуцируемых рентгеновским излучением. Для решения этого вопроса мы провели опыты по влиянию серотонина на образование в ДНК разрывов М -гликозидной связи, которые являются одними из характерных повреждений при действии ионизирующего излучения. Установлено, что связанный с ДНК серотонин не изменяет количества разрывов, и, следовательно, в условиях фотозащиты дрожжей от инактивации, вызываемой рентгеновским излучением, серотонин не может выполнять функцию протектора ДНК. Вместе с тем было показано, что фотоиндуцированное образование в дрожжевых клетках серотонина /процесс фотозащиты/ приводит к уменьшению содержания в них продуктов перекисного окисления липидов. Основываясь на представлении о вкладе продуктов липопероксидации в развитие лучевого поражения клеток, а также учитывая данные о способности серотонина взаимо-. действовать с ними /Гончаренко, Кудряшов,1980/, можно считать, что в основе механизма защитного действия серотонина в процессе фотозащиты дрожжей от летального действия рентгеновского излучения лежит его инактивирующее влияние на уровень этих веществ.

Итак, защитное действие серотонина в процессах фотозащиты может реализовываться по принципиально различным путям: в случае действия рентгеновского излучения серотонин выполняет функцию антиокси-панта, а в случае УФ-облучения - функцию протектора ДНК от пиримиди-новых димеров.

Рассмотренные механизмы фотозащиты обнаружены пока только у некоторых видов дрожжей. Однако есть все основания предполагать, что такие /или аналогичные/ механизмы имеют более широкое биологическое распространение.

§2. Некоторые особенности ферментативной фотореактивации у дрожжей

В отличие от фотозащиты ферментативная фотореактивация / ФР / .шляется широко распространенным фотобиологическим процессом. Он

осуществляется с участием специального светочувствительного фермента фотолиазы, субстратом которого служат УФ-индуцированные повременил ДНК только одного типа - пиримидиновые димеры. Максимумы в спектрах действия ФР у различных биологических объектов варьируют от 350 до 440 нм, что связывают главным образом с различиями в спектрах поглощения хромофорных групп фотолиазы, которые у ряда ферментов идентифицированы как производные соединений флавиновой природы /Sanear, Sanear, 1984 /. Шесте с тем наряду с такой причиной различий в спектрах действия ФР возможна и другая. В случае дрожжевых клеток она может быть связана, например, с фотоиндуцированным синтезом серотонина. Действительно, поскольку серотонин способен связываться с ДКК, можно было ожидать, что при облучении светом длин волн в области 320-380 нм, который активирует фотолиазу и одновременно индуцирует синтез серотонина, эффективность ФР клеток будет уменьшаться вследствие конкуренции между ферментом и серотонином за субстрат.

Данные, полученные нами при исследовании спектра действия ФР, подтвердили это предположение. Установлено, что при ингибировании фотоиндуцированного синтеза серотонина эффективность ФР в области 320-380 нм становится выше, чем в условиях протекания этого синтеза. Важно отметить, что "восстановленная" структура данного спектра обнаружила сходство с таковой для спектра действия Ф? тех клеток дрожжей, которые не обладают способностью к синтезу серотонина.

Для выяснения механизма взаимодействия процессов ФР и фотоиндуцированного синтеза серотонина мы исследовали влияние серотонина на фотоферментативное расщепление тиминовых димеров в ДНК in vi 1ro. Оказалось, что серотонин очень сильно ингибирует этот процесс. Поскольку в условиях нашего эксперимента практически весь серотонин связан с ДНК, его ингибируюшее действие не может быть обусловлено непосредственным взаимодействием с ферментом ФР в растворе. Следовательно, серотонин ингибирует работу фотореактивирующего фермента в связанном с ДНК состоянии. По-видимому, при этом серотонин связы-

вается и с участками, содержащими ииримвдиновые димеры, препятствуя тем самым.ферменту образовывать с ними комплекс и осуществлять их фоторасщепление /см. схему на рис.9/.

Фотоиндуциро-ванный синтез серотонина

Рис.9. Схема, отражающая ингибирующее действие серотонина на процесс ферментативного фоторасщепления тиминовых димеров в ДНК: $ - ферменты цепи синтеза серотонина, Ф*- ферменты в фотоактивированном состоянии, С - серото-нин, Т Т - димер тимина в УФ-облучен-ной ДНК, Т - тимин, Р - фотбреактиви-рующий фермент /фотолиаза/, Р*- фотолиаза в фотовозбужденном состоянии.

©Р

4: р*

Полученные в модельных опытах результаты позволяют считать, что и in vivo ингибирующее влияние фотоиндуцированного синтеза серотонина на процесс ФР обусловлено связыванием серотонина с УФ-облучен-ной ДНК. Это и приводит к установленному изменению структуры спектра действия ФР. Вероятно, такого рода конкурентные взаимодействия могут происходить я между другими фотобиологическими процессами, и их необходило учитывать при анализе соответствующих спектров действия.

ГЛАВА 5. ФОТОСПШТИЧЕСКИЕ ПРОПЕССЫ

Установление факта фотоиндуцированного синтеза серотонина, его способности связываться с ДНК и ингибировать процесс ферментативного

фоторасщепления пиримидиновых димеров позволило предположить, что у не способных к фотореактивации клеток пострадиационное действие длинноволнового УФ-света может привести к усилению коротковолновой УФ-инактивации за счет ингибирующего влияния серотонина на эффективность работы репарационных систем ДНК по ликвидации летальных фотопродуктов. Эксперименты, проведенные с не способными к фотореактивации клетками дрожжей, подтвердили это предположение. Было показано, что пострадиационное облучение клеток длинноволновым УФ-светом /313, 334, 365 нм/ в дозах, не влияющих на их выживаемость и темпы размножения, вызывает усиление легального действия коротковолнового УФ-из-лучения /254 нм/, т.е. эффект, противоположный фотозащите. Такой же эффект фотоусиления наблюдался- и в отношении летального действия УФ-света 313 нм. Для проверки роли серотонина в проявлении этих эффектов был использован тот же подход, что и при выяснении его участия в процессе фотозащиты. Оказалось, что эффект фотоусиления, как и фотозащита, отсутствует у клеток, дефицитных по предшественникам синтеза серотонина, однако вновь проявляется при добавлении к клеткам триптофана или 5-окситриптофана. Ингибитор синтеза серотонина п-ХФА полностью снимает эффект фотоусиления. Пострадиационная инкубация УФ-облученных клеток с серотонином вызывает снижение уровня их выживаемости, причем с увеличением концентрации серотонина эффект увеличения гибели клеток возрастает. Полученные данные четко продемонстрировали, что в основе эффекта фотоусиления, как и фотозащиты, лежит индуцированное длинноволновым УФ-светом "образование в клетках серотонина. При исследовании вопроса о механизме действия серотонина в эффекте фотоусиления использовали мутантный штамм дрожжей, дефицитный по эксцизионной репарации ДНК. Установлено, что пострадиационное добавление серотонина в этом случае не приводит к усилению УФ-инактивации клеток. Следовательно, для проявления эффекта фотоусиления необходимо наличие в клетках ферментов эксцизионной репарации. Этот факт подтверждает наше предположение о том, что серотонин

вызывает усиление гибели клеток, препятствуя работе ферментов темно-вой /экспизионной/ репарации по ликвидации в ДНК пиримидиновых диме-voв, которые являются основными летальными фотпродуктами при дейст-

Рис.10. Схема сенсибилизированных НАДН и протопорфирином / П / реакций, приводящих к фотосинергическому эффекту при облучении клеток дрожяей длинноволновыми УФ-лучами /337, 365 нм/ и видимым светом /400-600 нм/.

Помимо эффекта фотоусиления нами был обнаружен фотосинергичес-кий летальный эффект при комбинированном /или совместном/ действии на клетки длинноволновых УФ-лучей /337, 365 нм/ и видимого света /400-600 нм/. Этот эффект выражался в неаддитивном суммировании повреждающего действия двух видов оптического излучения. С учетом приведенных выше данных о различных механизмах действия длинноволнового УФ и видимого света наиболее вероятное объяснение эффекта фотосинергизма заключается во взаимоусилении деструктивных процессов, вызывающих повреждение разных молекулярных компонентов и внутриклеточных структур /см. "схему на рис.10/. Установленный факт представляется важным в экологическом аспекте, поскольку он показывает, что такие .малоэффективные/в отношении деструктивного действия/ компоненты сол-нетиг!' радиации, как видимый свет и длинноволновый УФ-свет, при со-

вместном действии могут вызывать достаточно сильные повреждающие эффекты.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Совокупность полученных в работе данных свидетельствует о сложном и разнообразном характере действия оптического излучения на клеточные системы, который зависит от длины волны и интенсивности света, дозы облучения и последовательности /комбинации/ воздействий. Однако, несмотря на многообразие ответных фотобиологических реакций клеток, молекулярные механизмы их начальных стадий основаны на общих принципах. Во всех случаях энергия кванта- света используется для преодоления активационного барьера в первичном акте и образования первичных фотохимических продуктов. Что касается конечных продуктов и фотобиологического эффекта в целом, то они определяются не только параметрами облучения и природой фотоактивных хромофоров в клетке, но также конкретным местом их локализации и особенностями клеточных структур, где протекают начальные стадии фотопроцесса.

С этим положением хорошо согласуются, в частности, результаты исследования фотодинамических летальных эффектов у дрожжей. Действительно, в дрожжевой клетке /главным образом, в митохондриях и цитоплазме/ содержится достаточно много различных соединений, поглощающих в длинноволновой УФ и видимой областях спектра и способных' вступать в фотохимические реакции. Однако, как показано нами, роль основных фотоактивных хромофоров в случае летального действия видимого и длинноволнового УФ-света выполняют только два из них: протопорфирин и НАДН, локализованные в тех структурах клеток, которые являются критическими при фотодинамическом действии оптического излучения.

В случае облучения клеток только длинноволновыми УФ-лучами или только видимым светом в фотохимическую реакцию, вызывающую летальные повреждения в клетках, преимущественно вступает либо НАДН, либо протопорфирин. Вместе с тем при действии света широкой области спектра,

включающей длинноволновый УФ и видимый свет, фотохимические реак-

ЦО

ции индуцируются одновременно обоими сенсибилизаторами, и это приводит к взаимоусилению деструктивных процессов,, протекающих в различных внутриклеточных структурах /ДНК, плазматическая мембрана/, й соответственно к проявлению фотосинергическогсг летального эффекта.

Помимо спектрального состава света важное значение в реализации биологического действия оптического излучения имеет и другой его параметр - интенсивность. Особенно ярко это проявляется при сравнительном анализе деструктивных процессов, индуцируемых в ДНК низкоинтенсивным УФ-светом /254 нм/ обычных источников и высокоинтенсивным УФ-излучением лазерного источника /266 нм/. Низкоинтенсивное УФ-об-лучение ДНК приводит к возбуждению низколежащих электронных уровней оснований /в^ и Т^/, которые вступают в однокваитовые фотохимические реакции. При высокоинтенсивном импульсном У5-облучении ДНК происходит двухквантовое возбуждение высоколежащих электронных уровней оснований / БцИ Тп / через промежуточные уровни и Т^. При поглощении двух квантов молекула приобретает энергию, превышающую порог ее ионизации, и в фотойонизированном состоянии эффективно вступает в химические реакции, не наблюдающиеся в условиях низкоинтенсивного УФ-облучения и приводящие к образованию новых типов повреждений ДНК. Это, в свою очередь, обусловливает специфику летального действия лазерного УФ-излучения на метки, что выражается в значительном увеличении их инактивации с ростом интенсивности излучения.

Зависимость от интенсивности света выявляется также при исследовании фотобиологических процессов, индуцируемых, длинноволновыми УФ—лучами. Так, использование ивтенсивностей вкзэ 20 Вт/м2 приводит к фотосенсибилизированному повреждению ДНК и гибели клеток. При ин-тенсивностях же до 10 Вт/м2, при которых деструктивное действие длинноволновых УФ-лучей еще не реализуется, наблюдается фотозащита клеток от летального действия коротковолнового УФ и рентгеновского излучений - процесс, связанный с фотоактивированным ферментативным синтезом серотонина. В качестве фотоактивных хромофоров ферментов

цепи синтеза серотонина могут выступать их кофакторы /соответственно тетрагидробиоптерин у триптофангидроксилазы и пиридоксальфосгат у декарбоксилазы/, имеющие максимумы поглощения в-длинноволновой УФ-области спектра.- Вследствие протекания'фотохимических реакций с участием этих кофакторов может измениться характер их связи с белковой частью ферментов, что и приведет к повышению их каталитической активности.

Обнаружение эффекта фотозащиты и выяснение его механизма, основанного на фотоактивированном ферментативном синтезе серотонина, имеет большое значение не только в связи с проблемой защиты биологических объектов от поражающего действия различных видов излучений, но и в аспекте поиска новых путей направленной регуляции клеточного метаболизма с целью получения в качестве метаболитов различных физиологически активных веществ.

Полученные нами данные о природе деструктивно-модифицирующих и защитных фотобиологических реакций важны для понимания общих фундаментальных механизмов взаимодействия света с живой клеткой и выяснения молекулярных основ устойчивости биологических систем к повреждающему действию оптического излучения.

ОСНОВНЫЕ ВЫВОЛЫ

Впервые исследованы молекулярные механизмы деструктивного действия на клетки дрожжей "экологических" видов оптического излучения-длинноволнового УФ и видимого света, а также импульсного наносекунл-ного лазерного УФ-излучения высокой интенсивности

1. При сравнительном анализе эффектов фотоинактивации, вызываемых коротковолновым УФ-светом лазерного и обычного источников, выявлена специфика повреждающего действия вксокоинтенсивного УФ-излуче-ния. Эта специфика выражается:

- в нелинейной зависимости увеличения поперечного сечения инакти-

вации клеток от интенсивности лазерного УФ-излучения;

- в образовании в ДНК наряду с продуктами одноквантовых реакций /пиримидиновые димеры/ новых типов повреждений /разрывы N-гликозид-ной связи, деградированные основания/, не наблюдающихся в условиях низкоинтенсивного УФ-облучения и возникающих вследствие протекания двухквантовых фотохимических реакций с. участием ионизированных состояний молекул оснований;

- в уменьшении относительного вклада в лазерную УФ-инактивацию пиримидиновых димеров за счет увеличения вклада продуктов ДНК двухквантовых реакций.

2. В результате исследования основных закономерностей инактиви-рующего действия длинноволнового УФ-света установлено:

- летальные эффекты, вызываемые длинноволновыми УФ-лучами в области 320-400 нм, в отличие от коротковолновой УФ-инактивации клеток, сильно зависят от кислорода и обусловлены повреждениями ДНК, отлич- . ными от пиримидиновых димеров;

- деструктивные процессы в ДНК реализуются по фотодинамическому механизму и инициируются главным образом супероксидным анион-радикалом кислорода / ¿2 /;

- ¿2 генерируется эндогенньм фотосенсибилизатором, функцию которого выполняет локализованный в ядерных структурах клеток НАДН.

3. Изучена природа УФ-индуцированного эффекта ингибирования ды-уания клеток. На интактных дрожжевых митохондриях показано:

- эффект фотоингибирования дыхания связан с УФ-повреждением сук-цинатоксидазной системы дыхательной цепи;

- спектр действия УФ-инактивации сукцинатоксидазной активности совпадает со спектром поглощения убихинона /максимумы при 280 нм/;

- компоненты электронно-транспортной цепи /НАДН и флавопротеиды/ перех~одят в более восстановленное состояние в результате образования "убихинонового. блока".

Сйплзно заключение, что первичным хромофором и мишенью при по-ЧЪ

вреждаюшем действии УФ-света на дыхательную систему дрожжей является убихинон.

4. Исследован механизм фотодинамической инактивации клеток видимым светом /400-600 нм/ в отсутствие экзогенных сенсибилизаторов:

- на основании изучения спектра действия фотоинактивации и спектральных свойств пютвента, выделенного из мембранной фракции дрожжей, показано, что функцию основного фотосенсибилизатора выполняет про-топорфирин;

- установлено, что критической мишенью в клетке служит плазматическая мембрана, деструктивные процессы в которой инициируются преимущественно синглетным кислородом Ло^, генерируемым порфирином.

Выявлены и изучены основные механизмы фотобиологических процессов при комбинированном действии оптического излучения разных длин волн на дрожжевые клетки

5. Обнаружены новые эффекты фотозащиты клеток от летального действия УФ-лучей /254, 313 нм/ и ионизирующего /рентгеновского/ излучения:

- доказано, что в основе фотозащитных эффектов лежит фотоактивированный ферментативный синтез серотонина;

- установлена способность серотонина связываться интеркаляционным путем с ДНК и выполнять функцию ее протектора от УФ-индуцированных повреждении / пиримидиновые димеры /; :

- определена константа интеркалированного связывания серотонина с ДНК / Кс = 4,2хЮ4 IГ1 /;

- рассчитано эффективное расстояние участка цепи ДНК, равное ~4 парам оснований, на котором каждая молекула серотонина предотвращает формирование дамеров, и предложен молекулярный механизм его защитного действия.

нн

6. Обнаружено взаимодействие двух фотобиологических процессов -фотоиндуцированного синтеза серотонина и ферментативной фотореактивации, что проявляется в ингибировании фотореактивации и изменении ее спектра действия. Изученный в модельных экспериментах механизм этого эффекта заключается в том, что серотонин, связываясь с УФ-об-лученной ДНК, препятствует ферменту фотореактивации расщеплять пири-мидиновые димеры, ингибируя тем самым его активность.

Взаимодействия такого рода необходимо учитывать при анализе спектров действия различных фотобиологических процессов.

7. Обнаружен фотосинергический летальный эффект при комбинированном /или совместном/ действии на клетки длинноволновых УФ-лучей /337, 365 нм/ и видимого света /400-600 нм/. Выдвинуто представление о том, что явления фотосинергизма обусловлены взаимодействием фотодеструктивных реакций, которые протекают в разных внутриклеточных структурах и индуцируются различными эндогенными сенсибилизаторами.

Основные работы, опубликованные по материалам диссертации

1.Фрайкин Г.Я. .Поспелов М.Е.,Рубин JI.Б.Эффекты фотозащиты и обратимой инактивации дрожжей Candida guilliermondii .индуцируемые светом 313нм.-Докл.АН СССР,1976,т.227,№5.с.1241-1243.

2.Фрайкин Г.Я..Поспелов М.Е.,Рубин Л.Б.Репарация повреждений, индуцируемых светом 313нм,и фотозащита.у дрожжей Candida guilliermondii .-Микробиология,1977,т.46,М,с.96-100.

3.Гаврилов А.Г..Меньшонкова Т.Н..Пискункова Н.Ф..Поспелов М.Е., Фрайкин Г.Я..Рубин Л.Б.О специфике действия лазерного УФ излучения

• на выживаемость микроорганизмов.-Докл.АН СССР,1978,т.239,№5,с. 1238-1240.

4.Поспелов М.Е..Иванова Э.В..Фрайкин Г.Я..Хитров Ю.А..Рубин Л.Б. Влияние длинноволнового ультрафиолетового света 313нм на выживаемость и дыхание дрожжей Candida utilis.-Микробиология, 1979,т.48. №2,с.256-259.

5.Фрайкин Г.Я..Бурчуладзе Т.Г..Иванова Э.В..Поспелов М.Е..Рубин Л.Б. Изучение механизма летального эффекта, индуцируемого длинноволновым ультрафиолетовым светом, у дрожжей Candida uiilis.-Биол. науки,1979,J52,с. 15-17.

6.Фрайкин Г.Я. .Поспелов М.Е.,Рубин Л.Б.О биологических эффектах длинноволнового УФ-излучения у дрожжей рода Candida. В кн.:Фотобиология животной клетки.Л.:Наука,1979,с.157-159.

7.Фрайкин Г.Я. .Поспелов М.Е.,Рубин, Л.Б.Предварительное и пострадиационное действие длинноволновых ультрафиолетовых лучей на клетки различных видов Candida .облученных коротковолновым ультрафиолетом.-Микробиология,1979,т.48,№3,с.447-450.

в.Гончаренко E.H..Горская Т.Г..Капля С.А., Ковалева 3.А.,Рубин Л.Б., Фрайкин Г.Я. О возможных механизмах фотозащиты дрожжевых клеток Pichia. guilliermondii от действия ионизирующей радиации.-Радиобиология ,1980,т.20, *2,с.266-268.

9.Фрайкин Г.Я..Рубин Л.Б.Влияние ближнего ультрафиолетового света на микроорганизмы.-Изв.АН СССР.Сер.биол.,1980,№3.с.370-379.

10.Фрайкин Г.Я. .Страховская М.Г..Рубин Л.Б.Изучение влияния пуромици-на и красителя акридинового оранжевого на проявление фотозащиты дрожжей Candida guilliermondii от летального действия коротковолнового ультрафиолета.-Биол.науки,1980,№6,с.33-36.

И.Бурчуладзе Т.Г..Валева С.А..Фрайкин Г.Я. .Рубин Л.Б.Изучение особенностей летального действия УФ излучения 266нм высокой интенсивности на дрожжевые клетки.-Квантовая электрон. .1981,т.8.М2.с.2638-2643.

12.Бурчуладзе Т.Г..Фрайкин Г.Я..Рубин Л.Б.Изучение специфики поражения дрожжевых клеток высокими интенсивностями у.-ф.излучения 266 нм.-Докл.АН СССР,1981,т.256,№5,с.1239-1243.

13.Фрайкин Г.Я. .Иванова Э.В..Поспелов М.Е. .Страховская М.Г..Рубин Л.Б. О фотозащите дрожжей Saccharom^ces cerevisiae от летального действия у.-ф.света 254 и 313нм.-Докл.АН СССР,1981,т.261,Jfö,с.1257-1259.

14.Бурчуладзе Т.Г..Меньшонкова Т.Н..Симукова H.A..Будовский Э.И., Фрайкин Г.Я..Рубин Л.Б.Действие у.-ф.излучения высокой интенсивности на ДНК.-Докл.АН СССР, 1982,т.264,JI4,с.983-986.

15.Иванова Э.В..Поспелов М.Е..Страховская М.Г..Фрайкин Г.Я. Конкурентное действие ультрафиолетовых лучей разной длины волны на выживаемость Saccharomyc.es cerevisiae.-Микробиология, 1982,т.51,№5,с. 761-764.

16.Страховская М.Г..Фрайкин Г.Я.,Гончаренко Е.Н.Влияние экзогенного серотонина на выживаемость клеток Candida guilliermondii , облученных коротковолновым ультрафиолетом.-Изв.АН СССР.Сер.биол.,1982, *5,с.767-770.

17.Страховская М.Г..Фрайкин Г.Я. .Рубин Л.Б.О роли серотонина в проявлении эффектов фотозащиты и усиления летального действия коротковолнового ультрафиолетового света на дрожжи Candida guilliermondii.-

- Изв.АН СССР.Сер.бяол.,1982,№4,о.624-630.

18.Страховсяач М.Г.,Севдалина A.M.,Фрайкин Г.Я.0 влиянии фотоиндуци-, рованного синтеза серотонина на фотореактивацию дрожжей Saccha-romvjces cerevisiae .-Еиол.науки,1983,№3,с.25-28.

19.Фрайкин Г.Я.,Рубин Л.Б.Механизмы фотобиологаческих реакций микробных и растительных организмов.В кн.:Применение лазеров в био-логии.М.:изд.М1У,1983,о.7-11.

20.Поспелов М.Е.,Иванова Э.В.,Фрайкин Г.Я.Роль повреждения ДНК в инактивации дрожжей Saccharomvjces cerevisiae ультрафиолетовым све том 313нм.-Биол.науки,1984,№1,с.35-37.

21.Иванова Э.В.,Фрайкин Г.Я.Влияние серотонина на долю индуцированных ультрафиолетовым светом и рентгеновским облучением повреждений в ДНК.-Биохимия,1985,T.50,JiS,c.I374-I376c

22.Фрайкин Г.Я.,Страховская М. Г. .Иванова Э.В.Влияние серотонина на выход УФ-ивдуцированных тиминовых димеров в ДНК.-Биофизика, 1985, т.30,№4,С.564-567.

23. Страховская М. Г., Кирпичникова Н.А..Фрайкин Г.Я .Конкурентное взаимодействие серотонина и красителя акридинового оранжевого о ДНК,-Биол.науки,1986, JHI,с.33-36.

24.Фрайкин Г.Я.,Бурчуладзе Т.Г.,Поспелов М.Е.,Рубин Л.Б.Механизм фо- ■ тоинактивации дрожжевых клеток видимым светом.-Докл.АН СССР, 1986, t.29I,Jf6,c.I502-I504.

25.Поспелов М.Е.,Туровецкий В.Б..Фрайкин Г.Я.0 роли повреждения мембран в инактивации дрожжевых клеток видимым светом.-йикробпологпя,

1987, т. 56, J65, с. 882-885.

26.Рубин А.Б.,Фрайкин Г.Я.Первичные молекулярные механизмы фотобиологических процессов и деструктивное действие оптического излучения.-Успехи соврем,биологии,1987,т.103,№3,0.323-339.

27.Фрайкин Г.Я.Некоторые проблемы современной ультрафиолетовой фотобиологии. -Физиология растений,1987,т.34,№4,0.712-719. -

28.Фрайкин Г.Я.,Беленикина Н.С.,Поспелов М.Е.,Тимофеев К.Н.Йсследо-вание роли активированных форы кислорода в фотоинактивации дрожжевых клеток видимым светом.-Биофизика,1987,т.32,И,с.42-45.

29.Фрайкин-Г.Я..Поспелов М.Е..Бурчуладзе Т.Г.,Рубин Л.Б.Изученке ш-ханизма летального действия видимого света на клетки дрожжей Candida guilliermondii .-Изв.АН СССР. Сер.биол., 1987,Лб,с.783-786.

30.Фрайкин Г.Я.Механизмы УФ-яцдуцированных деструктивных и фотоко-дифицирупцих реакций у микроорганизмов. В кн. : Молекулярные мэха- • низки биологического действия оптического излучения.Ы.:Наука,

1988,c.I54-I64.

31.Praikin G.Y..Pospelov U.K.,Rubin L.B. Repair of 313-nm Induced lesions and photoprotcotion in yeast Candida guilliermondii.-Photochem.Photobiol.,1977,v.26,N 4,p.371-375.

32.Praikin G.Y.,Rubin L.B. Some physiological effects of near-ultraviolet light on microorganisms.-Photochem.Photobiol.,1979.v.29,

S 1,p.185-187.

33.Praikin G.Y.,Pospelov M.E.,Rubin L.B. Enhancement of the far-UV lethality in yeast Candida guilliermondii by near-UY post-irradia tion.- Photochem. Photobiol.,1980,v.31,H 1,p.87-88.

34.Praikin G.Y..Strakhovskaya M.G., Rubin L.B. Involvement of near-UV-induced synthesis of serotonin in photoprotection and in potentiation of far-UV lethality in the yeast Candida guilliermondii.-Photochem.Photobiol., 1981, v.33,H 6,p.839-843.

35.Praikin G.Y.,Strakhovskaya M.G.,Rubin L.B. Photomimetic effect of serotonin on yeast cells irradiated by far-UV radiation.-Photochem. Photobiol.,1982,v.35,«.6,p.799-802.

36.Rubin L.B.,Burchuladze T.G..Praikin G.Y. Two-photon inactivation, photoreactivation and photoprotection in yeast cells irradiated by 266 nm-laser radiation.- Photochem. Photobiol.,1982,v.35,H 6, p.789-791.

37.Praikin G.Y..Ivanova E.V.»Strakhovskaya H.G. Inhibition of thymine dimer formation in DNA by serotonin.- Photobiochem. Photo-biophys.,1986,v.12,M 3-4,p.289-293.

38.Praikin G.Y..Pospelov U.E.,Ivanova E.V. Action speotrum for suppression of succinate oxidase activity in yeast mitochondria.-Photobiochem. Photobiophys.,1986,v.11,N 1,p.67-71.

39.Praikin G.Y.,Hear-ultraviolet-induced modification of far (mid)-ultraviolet lethality in yeastiphotoprotection and synergism. Inj Pirat European Congress of Photobiology.Grenoble (Prance),1986, p.156.

40.Praikin G.Y. Photogeneration of activated oxygen species in vivo and their role in inactivation of cells by visible light.In: Activated oxygen species in biological systems.Varna (Bulgaria),1986, p.39.

41.Praikin G.Y., Ivanova E.V.,Strakhovskaya H.G. Inhibition of pho-toenzymatic repair of DBA thymine diners in Saccharomyces cerevi-siae by serotonin.. In:Pirat European Congress of Photobiology. Grenoble (Prance),1986,p.181.

4'8

Информация о работе

Фрайкин, Григорий Яковлевич
доктора биологических наук
Москва, 1988
ВАК 03.00.02

Автореферат

Похожие работы