Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Фотоиндуцибельные защитные эффекты при комбинированном действии разных длин волн оптического излучения на дрожжевые клетки

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Фотоиндуцибельные защитные эффекты при комбинированном действии разных длин волн оптического излучения на дрожжевые клетки"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В. Ломоносова Биологический факультет

На правах рукописи

ПИНЯСКИНА Елена Владимировна

ФОТОИНДУЦИБЕЛЫ1ЫЕ ЗАЩИТНЫЕ ЭФФЕКТЫ ПРИ )МБИНИРОВАННОМ ДЕЙСТВИИ РАЗНЫХ ДЛИН ВОЛН ОПТИЧЕСКОГО ИЗЛУЧЕНИЯ НА ДРОЖЖЕВЫЕ КЛЕТКИ

03.00.02-биофюика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1995

Работа выполнена на кафедре биофизики биологического факультета МГУ

им. М.В. Ломоносова

Научный руководитель: доктор биол. наук, профессор Фрайкин ГЛ.

Официальные оппоненты: доктор биол. наук, профессор

Завильгельский Г.Б. доктор биол. наук Кридкий М.С.

Ведущая организация Институт биофизики клетки РАН

Защита состоится 30 ноября в 1530 ч на заседании диссертационного совета К.053.05.68 в МГУ

Адрес: 119899, Москва, МГУ, биологический факультет

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета М1

Автореферат разослан ЗОсктября 1995 года

Ученый секретарь диссертационного совета

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В связи с происходящими в последнее время изменениями в экологической обстановке, затрагивающими в том числе и эблученность живых организмов, остро стоит вопрос об устойчивости апологических систем к повреждающему действию солнечного ультрафиолетового (УФ) излучения (290-380 нм), достигающего поверхности Земли. К таким изменениям относится повышение уровня загрязненности жружающей среды, увеличивающее вероятность протекания Ззотосенсибилизированных деструктивных реакций в генетическом аппарате и иембранных структурах клеток, а также рост интенсивности биологически наиболее активных средневолновых УФ (СУФ)- лучей солнца (290-320 нм) в жосфере в результате частичного истощения озонового слоя атмосферы, "реди многих экологических последствий разрушения озонового слоя особое ;начение имеет то обстоятельство, что даже слабое повышение интенсивности ГУФ-света значительно увеличит эффективность канцерогенного действия олнечного излучения. Всё это требует изучения клеточных защитных 1еханизмов, способных обеспечить устойчивость биологических систем при величении интенсивности солнечного УФ-излучения.

Среди известных защитных механизмов, уменьшающих повреждающие ффекты УФ-излучения, важную роль играют процессы фотоиндуцированной ашиты и репарации клеток. Наиболее изученным и широко аспространенным процессом такого рода является ферментативная ютореактивация, которая заключается в восстановлении жизнеспособности леток, инактивированных коротковолновым УФ (КУФ)-излучением (220-290 м), при последующем облучении длинноволновым УФ (ДУФ)- и синим ветом (350-450 нм). Ферментативная фотореактивация осуществляется с частием специального светочувствительного фермента фотолиазы, способного фотовозбужденном состоянии расщеплять УФ-индуцированные иримидиновые димеры ДНК, вносящие основной вклад в КУФ-инактивацию леток (Sanear, 1990). Известны также эффекты фотозашиты клеток от стального действия КУФ-излученил. В отличие от фотореактивации отозащитные эффекты показаны пока только на ряде штаммов бактерий и

дрожжей и проявляются они в том, что предварительное облучение клетс ДУФ-светом (320-380 нм) увеличивает их устойчивость к КУФ-облучени (Ъ^ег, 1983; РгаПип, 1992). Однако, различаясь по феноменологии механизмам действия, процессы ферментативной фотореактивации фотозащиты сходны в том, что они направлены на устранение лиЕ предотвращение образования пиримидиновых димеров в ДНК и активным инициации этих процессов является свет видимого и/или ДУФ-диапазонс спектра.

До сих пор не установлена активность длинноволнового видимого све: в фотозащите (реактивации) клеток от УФ-инактивации. Также отсутствуй сведения о фотоиндуцированном повышении устойчивости клеток инактивирующим воздействиям ДУФ-излучения и видимого света, в осно] которых лежат фотосенсибилизированные повреждения, отличные < пиримидиновых димеров ДНК.

Цель настоящей работы выявление и изучение защитнь

фотобиологических эффектов при комбинированном действи длинноволнового видимого света и оптического излучения различных дли волн экологического диапазона.

Были поставлены следующие основные задачи:

- исследовать влияние длинноволнового видимого света на устойчивое: клеток к СУФ-излучению (290-320 нм);

- выяснить роль длинноволнового видимого света в устойчивости клетс при фотодинамическом действии оптического излучения в диапазоне 320-4С нм и 400-600 нм;-

-провести спектрофлуориметрический и абсорбционный анал) изолированных клеточных фракций с целью обнаружения хромофоро имеющих поглощение в длинноволновой видимой области спектра.

Научная новизна. В работе получены новые данные, впервь демонстрирующие активность длинноволнового видимого света в защитнь фотобиологических эффектах и позволяющие констатировать существоваш не известной ранее фотоиндуцибельной защитной системы, способнс обеспечить повышенную устойчивость клеток при летальном действа оптического излучения экологического диапазона дл(1н волн.

Выявлена эффективность длинноволнового видимого света с максимумом в спектре действия при 680 нм в фотовосстановлении дрожжевых :леток, инактнвированных оптическим излучением СУФ-, ДУФ- и видимого .иапазонов спектра. Обнаружение эффектов фотовосстановления при [нактивирующих воздействиях ДУФ- и видимого света является первым казанием на возможность фоторепарации повреждений, образующихся по ютодинами чес кому механизму в генетическом аппарате и мембранных труктурах клетки с участием эндогенных фотосенсибилизаторов.

Установлен общий характер закономерностей проявления обнаруженных ффектов, что свидетельствует о функционировании в дрожжевых клетках аиной фотоиндуцибельной защитной системы, не специфичной в отношении рироды летальных фотоповреждений.

Впервые для дрожжевых клеток показано наличие длинноволнового оглощения с максимумом в красной области при 670 нм, принадлежащее еидентифицированному хромофору, локализованному в плазматических ембранах. Близкое совпадение зарегистрированного максимума с главным аксимумом в спектре действия фотовосстановления клеток позволяет осматривать этот хромофор в качестве кандидата на роль первичного оторецептора обнаруженной фотоиндуцибельной защитной системы.

Научно-практическая значимость. Работа выполнена в плане одной из иочевых проблем современной фотобиофизики, связанной с изучением ундаментальных механизмов взаимодействия света с живой клеткой и :тойчивости биологических систем к повреждающему действию оптического ¡лучения. Полученные данные расширяют существующие представления о ¡еточных защитных системах, направленных на повышение изнеспособности клеток при инактивирующих воздействиях света. Они кже открывают перспективы для разработки новых подходов к решению жной в практическом отношении проблемы защиты живых организмов от структивного (в том числе канцерогенного) действия солнечного излучения.

Апробация работы. Основные результаты диссертации были доложены 1И представлены на 20-м ежегодном съезде американского этобиологического общества (Марко Айленд, Флорида, США, 1992), 11-м еждунар. фотобиологическом конгрессе (Киото, Япония, 1992), 11-м

Междунар. биофизическом конгрессе (Будапешт, Венгрия, 1993), конгрессе Европейского фотобиологического общества (Марбург Германия,1993), Междунар. симпозиуме "Биологическое действие света' (Атланта, Джорджия, США, 1995).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзор; литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения заключения и основных выводов. Содержание работы представлено на с машинописного текста, иллюстрировано 20 рисунками и таблицей цитированно-Щиитературных источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования. В работе использовали клетки дрожжей Candid; guilliermondii ВСБ-656 (культура получена во ВНИИсинтезбелок) i Saccharomyces cerevisiae: cot-7 la-дикий штамм и два его мутанта-дефицитны! по эксцизионной репарации ДНК штамм rad-3-2 (X36B-3A) и дефицитный ni пострепликативной репарации ДНК штамм rad- 50-1 (g218/4d), любезн! предоставленные И.П. Арман (Институт молекулярной генетики РАН).

Культуры дрожжей выращивали по стандартной схеме при 32°С н косяках (сусло-агар) и в колбах на 500 мл со 100 мл жидкой питательно! среды следующего состава: NH4H2P04 - 2 г, (NH4)2HP04 - 0.5 г, K2S04 - 0.2 i MgSO^ - 0.2 г, дрожжевой автолизат - 20 мл, сахароза - 1.2%, вод дистиллированная - 1 л (начальное значение рН 5.7). В опытах использовал! дрожжи, выращенные на качалке ( 230 об/мин ) в течение 7 ч из клеток смытых с суточного косяка.

Облучательиые установки и условия облучения. Исследование спектро действия проводили на специальной термостатируемой установке. Источнико! излучения служила ртутная лампа высокого давления ДРШ-ЮОС Монохроматический свет в диапазоне 320-750 нм получали с помощь} дифракционного спектрографа (линейная дисперсия 1 нм/мм). Рассеянно излучение более коротких длин волн отсекали фильтром БС-5. Интенсивност

2 2

монохроматического света варьировали от 0.1 Вт/м до 2 Вт/м . Для выделени

света разных спектральных областей использовали лампу ДРШ-1000 в сочетании со светофильтрами: УФС-2+ЖС-3 (СУФ, 290-320 нм); БС-5+УФС-6 (ДУФ, 320-380 нм); ЖС-10+СЗС-21 (видимый свет, 400-600 нм). Излучение фокусировалось на кювету с объектом, помещенную в закрытый термостатируемый держатель на расстоянии 15 см от источника света. Интенсивность излучения на уровне образца составляла: СУФ-5, ДУФ-15, видимого света - 60 Вт/м2. Интенсивность света измеряли высокочувствительным термоэлементом РТН-30С (ВНИЦОФИ).

Облучение суспензий дрожжей (концентрация 105 клеток/мл) проводили в минеральной (солевой) среде с 1% сахарозы. Концентрацию клеток рассчитывали на основании данных подсчета их количества в камере Горяева. Выживаемость дрожжей определяли методом микроколоний.

Изолированные плазматические мембраны и митохопбрии получали из дрожжей C.guilliermondii (10" клеток) по методу Бассей с соавт. (Bussey et al., 1979). Для получения сферопластов использовали глюзулазу из Helix pomatia. С целью стабилизации плазматических мембран лизированные сферопласты обрабатывали конканавалином А. Концентрацию белка измеряли микрометодом Лоури (procedure № 690 per Sigma Research Kits and Reagents, St. Lou is, MO, USA). В данной части работы использовали реактивы фирма "Sigma" (США).

Получение экстрактов из плазматических мембран и митохондрий. Для получения этилацетатного экстракта к навеске плазматических мембран (10 мг белка) добавляли 10 мл смеси этилацетата с ледяной уксусной кислотой (3:1, v/v).Экстракцию проводили на мешалке при 4°С в течение 1 ч. После центрифугирования (650 g х 15 мин) этилацетатный слой отделяли в делительной воронке и промывали дважды ледяной дистиллированной водой для удаления уксусной кислоты. Хлороформный экстракт из плазматических мембран (10 мг белка) или митохондрий в 0.25М сахарозе (концентрация белка 0.2 мг/мл) получали при встряхивании (30 мин при 4°С) этих препаратов со смесыо (9 мл) хлороформ-метанол (2:1, v/v) и отделении хлороформной фракции. При проведении экстракции использовали реактивы, не содержащие флуоресцирующих примесей.

Спектры флуоресценции и возбуждения флуоресценции снимали н спектрофлуориметре Hitachi-850 (Япония) в 1-сантиметровой квадратно кварцевой кювете. При анализе густых суспензий плазматических мембра ( концентрация белка 10 мг/мл ) в 50 мМ фосфатном буфере (pH 7.( использовали треугольную кварцевую кювету с боковой стороной 1 с\ которую располагали под углом 45° к направлению возбуждающего света. Вс спектры флуоресценции снимали при ширине щели возбуждения 6 нм ширине щели флуоресценции 3 нм, а все спектры возбуждения флуоресценци - при 3 и 6 нм соответственно. С целью уменьшения побочных эффекте светорассеяния между возбуждающим светом и кюветой ставили светофильт} пропускающий свет >350 нм, а на выходе флуоресценции - фильт] пропускающий свет >430 нм.

Спектры поглощения экстрактов из плазматических мембран митохондрий регистрировали на спектрофотометре Hitachi-557 (Япония) в 1 сантиметровой квадратной кварцевой кювете.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ГЛАВА 1. ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ ДЛИННОВОЛНОВОГО ВИДИМОГО СВЕТА Н ВЫЖИВАЕМОСТЬ ДРОЖЖЕВЫХ КЛЕТОК, ИНАКТИВИРОВАННЫХ ОПТИЧЕСКИ! ИЗЛУЧЕНИЕМ РАЗНЫХ ДИАПАЗОНОВ СПЕКТРА

1.1. Обнаружение эффекта фотореактивации при комбинированном действии СУФ-излучения и длинноволнового видимого света

Для того чтобы выяснить, оказывает ли длинноволновый видимый све влияние на выживаемость дрожжевых клеток, облученных СУФ-излучение(» нами была проведена серия поисковых экспериментов. В этих опытах клетю облученные фиксированной дозой СУФ (2.4 кДж/м2), снижавшей уровень и выживаемости до -30%, подвергали воздействию монохроматического света области 600-730 нм, варьируя интенсивность и время облучения в широко диапазоне их значений.

Были найдены режимы облучения, при которых монохроматически свет (610, 630, 660, 680, 710, 730 нм) значительно увеличивал выживаемое!

^УФ-инактивированных дрожжевых клеток. Типичные кривые, :арактеризующие зависимости выживаемости таких клеток от дозы (времени) >блучения, представлены на рис.1. Видно, что максимальная эффективность >бнаруженной фоторективации достигается уже при кратковременном несколько мин) воздействии монохроматического красного света в малых юзах. С увеличением дозы (времени) облучения эффективность ютореактивации снижается.

Результаты более детального изучения закономерностей выявленного ффекта рассматриваются в следующих разделах.

1.2. Спектр действия и общие закономерности фотореактивации

Для дальнейшей характеристики обнаруженной фотореактивации прежде сего необходимо было изучить спектр действия эффекта. При этом мы не олько оценивали относительную эффективность монохроматического расного света, но и изучали действие "синей" (400-600 нм) и ДУФ (320-380 м) областей оптического спектра.

Для определения активности монохроматического света указанных бластей нами были проведены эксперименты, в которых клетки подвергали оследовательному облучению фиксированной дозой СУФ-излучения (2.4 Дж/м2) и монохроматическим светом разных длин волн в области 320-600 м. Интенсивность света была выравнена и, как в случае изучения действия онохроматического красного света, составляла ~ 0.2 Вт/м2. Установлено, что УФ-свет (334, 365 нм) неактивен, тогда как монохроматический свет всех спользованных длин волн видимом части спектра (405, 436, 500, 546, 578 нм) овышает выживаемость СУФ-инактивированных клеток. При этом характер тисимостей фотореактивапии от дозы (времени) облучения "синим" светом соден с таковым для соответствующих зависимостей, представленных на 1 с. I.

Исходя из эффективности фотовосстановления клеток на начальных пшенных) участках дозовых кривых, мы построили спектр действия отореактивации (рис.2). Полученный спектр действия

6.0

4.0 -

2.0

0.0

400 450 500 550 600 650 700 750 _Длина волны, нм_

Рис. 1

Рис. 2

Рис. 1. Зависимость фотовосстановлени!] СУФ-инактивированных клеток от до (времени) облучения монохроматическим светом в области 600-730 нм: 1-730, 2-710, 610, 4-630, 5-660, 6-680 нм. Доза СУФ-излучения-2.4 кДж/м2. Каждая точка отражг среднее значение из 7 экспериментов

Рис. 2. Спектр действия фотореактивации клеток, инактивированных СУФ-излучение Относительная активность отражает эффективность фотореактивации при данной дли волны по отношению к эффективности при 405 нм, которая принята за единш Эффективность фотореактивации при каждой длине волны определяли как величт обратную дозе монохроматического света, при которой выживаемость СУ< инактивированных клеток возрастала до 50 % (см. рис. 1)

эбнаруживает главный максимум в красной области при 680 нм, небольшой максимум при 430-440 нм и характеризуется достаточно сложной структурой. Эднако, можно считать, что он принадлежит одному типу фотореактивации (в юследующем изложении обозначим её как ФРбко) 11 отражает участие одного ]юторецептора в инициации процессов, приводящих в итоге к восстановлению кизнеспособности СУФ-облученных клеток. В пользу этого свидетельствует :ходная форма дозовых кривых фотореактивации при всех использованных шинах волн в диапазоне 400-730 нм.

Установленная форма кривых принципиально отличается от известных юзовых кривых, характерных для ферментативной фотореактивации, которые |ри достаточно высоких дозах синего света достигают уровня насыщения. 1спользуя указанные различия, мы предприняли попытку разделить два типа ютореактивации, изменяя соответствующие режимы облучения синим светом, оторый активен как в ферментативной фотореактивации, так и в ФРб80 • Эти ксперименты мы проводили только на клетках S.cerevisiae, поскольку спользуемый в работе штамм дрожжей C.guilliermondii не способен к >ерментативной фотореактивации. Клетки сначала облучали фиксированной озой СУФ - света (2.4 кДж/м2), а затем подвергали их воздействию онохроматического света 405 нм разной интенсивности: ~0.2 Вт/м2 в первые 3 мин и И.5 Вт/м2 при дальнейшем облучении этой же суспензии. Из олученных данных ( рис.3) отчетливо видно наличие двух форм кривых отореактивашш: одной (при малых временах и дозах облучения), фактерной для ФР6м), и второй (имеющей насыщение при больших временах дозах облучения), типичной для ферментативной фотореактивэции. Важно зачеркнуть, что ФР^п проявляется и при понижении температуры до 4°С во >емя действия фотореактивирующего света (рис. 3) (ферментативная этореактивпцпя в таких условиях, как известно, не наблюдается). Этот факт эжет указывать на фотохимическую природу процессов, протекающих на шальной (световой) стадии ФР<,хо.

Последующие эксперименты показали, что понижение температуры до С в период между облучением клеток реактивирующим светом и их высевом питательную среду приводит к постепенному снижению эффективности Р№0 и к полному её исчезновению к 3 ч выдерживания. По-видимому, такой

ю

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 Доза облучения, кДж/м2

3.0

Время облучения, мин 0 5 10 15 20 25 30

1 2.0

1.0

т

т~

0 60 120 180 240 300 360 Доза облучения, Дж/м 2

Рис. 4

Рис. 5

Рис. 4. Кривые выживаемости клеток при облучении СУФ (1) либо последовать монохроматическим светом (680 нм) и СУФ. Дозы монохроматического света: 2-12 24, 4-60, 5-120, 6-180, 7-240, 8-360 Дж/м2. Каждая точка отражает среднее значени« 5 экспериментов

Рис. 5. Дозовая зависимость 680 нм-индуцированной фотозащиты клеток от С' облучения. Относительная активность определена как отношение доз СУФ-излучс при 37 9с выживаемости клеток, облученных последовательно монохроматичес светом (680 нм) и СУФ и только СУФ (см. рис. 4)

териод времени необходим для завершения тех фотоиндуцированных биохимических процессов в клетке, которые в итоге приводят к реализации эффекта ФР6М1.

Рассмотренные выше данные свидетельствуют о наличии у дрожжей 5.сегеу1.<пае двух различных фотореактивирующих систем, направленных на даличение выживаемости СУФ-инактивированных клеток, - ФРбяо 11 ферментативной фотореактивации. Как известно, ферментативная ¡ютореактивация наблюдается только при последовательном облучении клеток :начала УФ-излучением, а затем реактивирующим светом. В этой связи 1нтересно было проверить, можно ли уменьшить летальное действие СУФ-■влучения, предварительно облучая клетки монохроматическим светом длин юлн, активных прп ФРбхо-

Экспериментальный материал, полученный при изучении данного юпроса, представлен в следующем разделе.

1.3. Фотозащитный эффект при комбинированном действии длинноволнового видимого света и СУФ-излучения

В этой серии экспериментов клетки последовательно облучали сначала монохроматическим светом 680 нм (наиболее эффективным при ФРььч))* а дтем возрастающими дозами СУФ-излучения. Было установлено, что при 'акой последовательности воздействия свет 680 нм защищает клетки от СУФ-шактивации (рис.4). Исходя из приведенных на рис.4 данных, мы определили ависимость эффекта фотозащиты от дозы (времени) облучения юнохроматическим светом (рис.5). Необходимо отметить, что форма кривой, сражающей эту зависимость, отлична от формы дозовой криво]! фотозащиты, шдуцированной ДУФ-светом, которая ранее была показана у дрожжей Рга 1 к111 е! а!., 1977), но аналогична такоиой для соответствующих кривых [)Р6Хо (см. рис 1). Важно подчеркнуть, что такой же характер зависимости становлен и для света других длин волн в диапазоне 400-730 нм, также ктивных в обнаруженной фотозащите, и наибольшую активность проявлял юнохроматический красный свет 680 нм (поэтому по аналогии с ФРбхо |бозначим её как ФЗ(,хо). ДУФ-свет (334, 365 нм) при использованных

режимах облучения (малые времена и дозы) был неактивен в ФЗ^о. в то врем как максимум в спектре действия ДУФ-индуцированной фотозащит! расположен именно в этой области, а видимый свет был неактивен (Фрайкиг 1988). Кроме того, мы показали, что эффективность ФЗбяо, как 11 ФРбы максимальна в отсутствии интервала времени между облучениями клето фотозащитным и СУФ-светом и не изменяется при понижении температур] до 4°С во время облучения монохроматическим светом. В противоположное! ФЗбяо вызываемая ДУФ-светом фотозащита наблюдается только при условш если между воздействиями ДУФ - и СУФ-излучениями имеете температурозависимый интервал времени (2-4 ч) (Fraikin et al, 1981).

Таким образом, очевидно, что Ф3(,ж) принципиально отлична от ране известной ДУФ-индуцированной фотозащиты. Вместе с тем ФЗ^о п изученным закономерностям проявления сходна с ФРб^о. Это позволяе считать, что обнаруженные нами эффекты обусловлены функционированием дрожжевых клетках одной фотоиндуцибельной защитной системы.

Изложенный выше экспериментальный материал показывает, что участием данной системы уменьшается летальное действие СУФ-излучени! которое связано преимущественно с образованием пиримидиновых димеров 6,4- аддуктов в ДНК (Moan and Peak, 1989).

Задача следующего этапа работы состояла в исследовании рол фотоиндуцибельной защитной системы в повышении устойчивости дрожжевь: клеток к инактивирующему действию ДУФ-света. В этом случае указаннь: выше фотопродукты не вносят вклад в фотоинактивацию клеток (Tyrrell ап Keyse, 1990) и основными летальными повреждениями являютс одноцепочечные разрывы ДНК (Фрайкин и др., 19S9), которые образуются участием эндогенных фотосенсибилизаторов и активированных фор кислорода, т.е. по фотодинамическому механизму (Foote, 1991).

1.4. Исследование комбинированного действия ДУФ-излучения и видимого света

В этой серии экспериментов, используя ранее найденные режим облучения, которые были оптимальны при фотоиндуцированном повышени выживаемости СУФ-облученных клеток, мы выявили эффеь

'ис. 6. Зависимости фотовос становления ДУФ-шгактивированных дрожжевых клеток т дозы (времени) облучения монохроматическим светом 680 нм: 1-дикий штамм, 2-гутантный штамм гасЗ 50-1. Дозы ДУФ-облучения: 67.5 кДж/м2 (1), 18 кДж/м2 (2)

■ис. 7. Зависимости фотовосстановления СУФ-инакишированных дрожжевых клеток т дозы (времени) облучения монохроматическим светом 680 нм: 1-дикий штамм, 2-гутантный штамм гас! 3-2. Дозы СУФ-облучекия: 2.4 кДж/м2 (1), 0.2 кДж/м2 (2)

фотовосстановления ДУФ-инактпвированных клеток. Установлено, что повышение уровня выживаемости таких клеток наблюдается при воздействии света всех использованных ранее длин волн в диапазоне 400-730 нм, причем максимальный эффект фотореактивации проявлялся при облучении клеток красным светом 680 нм, а форма дозовых кривых фотореактивации была аналогична форме соответствующих кривых, приведенных на рис.1. Также было показано, что на эффективность фотореактивации (как и при ФРбйО в случае действия СУФ-излучения) не влияет понижение температуры до 4 °С во время облучения монохроматическим светом.

Полученные результаты дают основания считать, что в фотовосстановлении клеток при летальном действии ДУФ-излучения участвует та же фотоиндуцибельная защитная система, что и при действии СУФ-излучения. Это в свою очередь свидетельствует о том, что данная система направлена на устранение не только пиримидиновых димеров (как ферментативная фотореактивация), но и других фотоповреждений, образующихся в ДНК путем фотосенсибилизации (например, одноцепочечные разрывы). Известно, что СУФ- и ДУФ-индуцированные повреждения могут ликвидироваться системами репарации ДНК, из которых основными являются эксцизионная и пострепликативная. Поэтому представлялось целесообразным проверить, не связано ли действие обнаруженной нами фотоиндуцибельной защитной системы с фотоиндуцированной активацией этих репарационных систем.

1.5. Изучение роли систем репарации ДНК в проявлении эффектов фотореактивации

Для решения поставленного вопроса мы исследовали способность к ФР0М) мутантных штаммов дрожжей (S.cerevisiae), дефицитных по эксцизионной (rad 3-2) и пострепликативной (rad 50-1) репарации ДНК. Предварительно было показано, что такие клетки более чувствительны к СУФ (rad 3-2) и ДУФ (rad 50-1) по сравнению с диким штаммом. Опыты по фотореактивации проводились по следующей схеме: клетки дикого штамма и мутантов rad 3-2 пли rad 50-1 облучали фиксированной дозой СУФ (2.4 кДж/м2) или ДУФ (18 кДж/м-), после чего их подвергали воздействию монохроматического света 680 нм. Как следует из полученных данных (рис.6,

10СП

Время облучения, мин О 30_60_90

120

1-1-1-1-1-го 360 4000 6000 8000 10000

2

Доза облучения, Дж/м

Время облучения, мин

100 -Р ? 10 15 25 39

70 50

30' 20

т—■—I—1—1—1—I—1—I—'—1

0 60 120 180 240 300 360 Доза облучения, Дж/м2

Рис. 3 Рис. 8

мс. 3. Зависимости фотовосстановления СУФ-инактивированных клеток от дозы

ремени) облучения монохроматическим светом 405 нм при 22°С (кривая 1) и 4°С ривая 2). Доза СУФ-излучения-2.4 хДж/м2 (-30% выживаемости)

1с. 8. Зависимость фотовосстановления дрожжевых клеток, инактивированных щимым светом (400-600 нм, 216 кДж/м2), от дозы (времени) облучения знохроматическим светом (680 нм)

7), фотореактивация мутантных штаммов наблюдается, причем ei эффективность примерно такая же, как и у дикого штамма. Эти данные могу указывать на то, что устранение СУФ-, ДУФ-нндуцнрованных поврежденш ДНК в процессе ФРоко осуществляется без участия эксцизпонной \ пострепликативной репарации. Очевидно, действие фотоиндуцибельно] защитной системы ■ включает какой-то другой механизм ликвидации такт повреждений.

Установление того факта, что действие фотоиндуцибельной защитно! системы не специфично в отношении природы повреждений ДНК, привело ь постановке вопроса о возможном участии этой системы в устраненш фотоповреждений не только в генетическом аппарате, но и в других клеточны> структурах.

1.6. Эффект фотореактивации при фотодинамической инактивации клеток

видимым светом

При фотодинамической инактивации дрожжевых клеток большими дозами видимого света (400-600нм) основной мишенью является не ДНК, а плазматическая мембрана (Поспелов и др., 19S7).

Проведенные нами эксперименты с использованием описанных выше оптимальных при ФРьхо режимов облучения показали, что инактивированные видимым светом клетки можно восстановить при воздействии на них монохроматическим светом в области 400-730 нм с максимальной эффективностью реактивации при 6S0. нм. Принципиально важно, что типичная дозовая кривая фотореактивации в этом случае (рис. 8 ) имеет такой же вид, как и аналогичные дозовые кривые при фотореактивации клеток, инактивированных СУФ- (ДУФ) светом (см. рис. 1). Следовательно, в фотовосстановлении жизнеспособности дрожжевых клеток, инактивированных видимым светом, участвует та же фотопндуцибельная система, что и при летальном действии УФ-излучений. Иными словами, данная защитная система активна не только в устранении различных повреждений ДНК, но и в случае фотодинамической деструкции плазматических мембран.

Таким образом, очевидно, что во всех рассмотренных случаях обнаруженная нами фотопндуцибельная защитная система действует по

щему первичному механизму, запускаемому одним клеточным >торецептором.

ГЛАВА 2. ПОИСК ПЕРВИЧНОГО ФОТОРЕЦЕПТОРА ФОТОИНДУЦИБЕЛЫЮЙ ЗАЩИТНОЙ СИСТЕМЫ

Из полученного нами спектра действия ФРб.чо (см. рис.2) следует, что рвичный фоторецептор фотоиндуцибельной защитной системы должен глощать в видимом диапазоне спектра с выраженным максимумом в асной области при 680 нм. Поэтому для определения фоторецептора мы овели поиск внутриклеточного соединения, которое имело бы поглощение в инноволновой видимой области спектра, используя абсорбционный и ектрофлуориметрический анализ различных клеточных фракций.

Поскольку ранее было установлено, что в изолированных дрожжевых pax не содержатся хромофоры, поглощающие в видимой области спектра 'райкин, 19SS), мы провели анализ других клеточных структур, а именно: элированных плазматических мембран и митохондрий, а также клеточной :творимой фракции.

При анализе растворимой фракции, полученной после нтрифугированмя (15000 g х 20 мин) изолированных сферопластов juilliermondii, зарегистрированы спектры поглощения и флуоресценции, эактерные для НАДН и соединений флавиновой природы, которые 5аничивались сине-зеленой областью видимого спектра. Более инноволнового поглощения и флуоресценции мы не наблюдали.

Спекрофлуориметрическии анализ изолированных плазматических мбран выявил одно соединение, флуоресцирующее в красной области жтра с максимумом -685 нм. Были зарегистрированы спектры уоресценции этого соединения, экстрагированного из плазматических мбран в этилацетат и хлороформ, с максимумами соответственно при 675 и ) нм, а также спектр возбуждения флуоресценции с основным максимумом 1 410 нм и четырьмя менее интенсивными пиками в области 500-630 нм, | характерно для соединений порфириновой природы (Gouterman, 1978). пичную для порфиринов структуру обнаружил и спектр поглощения

флуоресцирующего соединения, экстрагированного из плазматически мембран в этилацетат (рис.9). Сопоставление спектра поглощения со спектро действия ФРШ (см. рис. 2) показывает, что это соединение не може претендовать на роль первичного фоторецептора рассмотренной выи фотоиндуцибельной защитной системы.

В отличие от спектра поглощения этилацетатного экстракта в спектр поглощения хлороформного экстракта из плазматических мембра обнаруживается максимум в более длинноволновой красной области при 67 нм (рис.10), где порфириновое соединение уже не поглощает. Следовательш поглощение с максимумом при 670 нм принадлежит какому-то другом соединению, которое экстрагируется из плазматических мембран в хлорофорк но не в этилацетат.

Наиболее вероятно, что это соединение имеет поглощение и в облает 400-650 нм. В пользу этого может указывать изменённая структура спектр поглощения порфиринового соединения в хлороформе (см. рис. 10 и 5 вследствие наложения спектров двух различных соединений. Отметим, что на1 не удалось зарегистрировать флуоресценцию соединения с длинноволновьп максимумом поглощении при 670 нм ни в хлороформном экстракте, ни изолированных плазматических мембранах. В этом заключается ещё одн отличие этого соединения от флуоресцирующего соединения порфириново: природы.

Обращает на себя внимание тот факт, что длинноволновый максимум спектре поглощения нефлуоресцирующего соединения близко совпадает главным максимумом в спектре действия ФРбхо (см- рис.2). Это позволяе рассматривать данное соединение в качестве кандидата на роль первичноп фоторецептора обнаруженной нами фотоиндуцибельной защитной системы.

Последующий анализ, проведенный с изолированными митохондриями показал, что в спектре поглощения их хлороформного экстракта отсутствуе длинноволновый максимум при 670 нм, и этот спектр является типичным № порфиринов. На основании данных спекрофлуориметрических измерен))) содержащийся в митохондриях порфирин может быть отнесен 1

-I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I

350 400 450 500 550 600 650

и.из 1

л н о

о

н0.02

о

ч

к «

ей «

о

®0.01

н и О

0.00

670

—I—■—I—1—I—1—I—1—I—'—I—1—I—'—I—'—I

400 440 480 520 560 600 .640 680 720

Длина волны, нм

Длина волны, нм

Рис. 9

Рис. 10

Рис. 9. Спектр поглощения этилацетатпого экстракта из изолированных плазматических мембран Рис. 10. Спектр поглощения хлороформного экстракта из изолированных плазматических мембран

протопорфирину. По своим флуоресцентным характеристикам он отличен с порфиринового соединения, локализованного в плазматических мембранах.

Таким образом, в результате проведенного анализа нами обнаружены де связанных с плазматическими мембранами соединения: одно флуоресцирующее порфириновой природы и второе - нефлуоресцирующе( имеющее длинноволновый максимум поглощения при 670 нм, которое може выступать в качестве первичного фоторецептора фотоиндуцибельно защитной системы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенных исследований нами впервые выявлен активность длинноволнового видимого света в повышении жизнеспособност клеток при летальном действии оптического излучения СУФ (290-320 нм' ДУФ (320-380 нм) и видимого (400-600 нм) диапазонов спектр: Фотовосстановление дрожжевых клеток, инактивированных этим ("экологическими") видами оптического излучения, наблюдается пр кратковременных воздействиях малых .доз монохроматического света области 400-730 нм с главным максимумом в спектре действия при 680 нл-Эффект увеличения выживаемости облученных клеток показан не только пр: пострадиационном, но и при предварительном действии монохроматическог света, причем дозовые кривые обоих эффектов имеют аналогичную форму характерным оптимумом при определенной дозе и загибом при её повышении Такая зависимость эффектов от дозы (времени) облучения может отражат сложный в кинетическом отношении характер первичных фотопревращенш фоторецептора, а отсутствие зависимости эффектов от температуры при е понижении до 4°С во время действия монохроматического света указывает н фотохимическую природу процессов, протекающих на начальной (световой стадии.

Установленная форма дозовых кривых обнаруженных эффекта принципиально отличается от формы дозовых кривых, известных дл: ферментативной фотореактивации и фотозащиты, которые с ростом дозь синего и /или ДУФ-света достигают уровня насыщения. В отличие о процессов ферментативной фотореактивации и фотозащиты, действие которы:

шляется строго специфичным в отношениии пиримидиновых димеров ДНК, >бнаруженная нами фотоиндуцибельная система опосредует реакции, 1риводящие к устранению не только разных типов СУФ- и ДУФ-пщуцированных повреждений ДНК, но и фотоповреждений, образующихся в тлазматических мембранах при облучении дрожжевых клеток большими юзами видимого света. Полученные данные являются первым указанием на юзможность фоторепарации летальных повреждений, возникающих в "енетическом аппарате и мембранных структурах клеток при ^отодинамическом действии оптического излучения ДУФ- и видимого щапазонов спектра. Общий характер закономерностей проявления эффектов Зютовосстановления жизнеспособности дрожжевых клеток, инактивированных СУФ-, ДУФ- и видимым светом, свидетельствует о том, что в их основе лежит :диный, ранее не известный фотоиндуцибельный защитный механизм, «пускаемый на первичной стадии одним клеточным фоторецептором.

Результаты спектрофлуориметрического и абсорбционного анализа изолированных клеточных фракций показывают, что только в плазматических мембранах дрожжей находится соединение, имеющее длинноволновый максимум поглощения при 670 нм, который близко совпадает с основным максимумом (при 680 нм) в спектре действия эффектов фотовосстановления клеток. Это позволяет рассматривать локализованное в плазматической мембране соединение в качестве кандидата на роль первичного фоторецептора выявленной нами фотоиндуцибельной защитной системы. Данные о её высокой квантовой чувствительности, а также триггерном характере действия указывают на существование весьма эффективных механизмов биохимического усиления, которые инициируются первичным фоторецептором и способны обеспечить устойчивость клеток при инактивирующем действии оптического излучения различных длин волн экологического диапазона.

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ

1. Впервые выявлена активность длинноволнового видимого света в индуцировании защитных фотобиологических эффектов при летальном действии на дрожжевые клетки оптического излучения СУФ (290-320 нм), ДУФ (320-380 нм) и видимого (400-600 нм) диапазонов спектра.

2. Спектр действия фотовосстановления инактивированных клеток обнаруживающий главный максимум в красной области при 680 нм принципиально отличен от известных спектров действия процессо! фотореактивации и фотозащиты, направленных на репарацию либс предотвращение образования только пиримидиновых димеров ДНК.

3. Полученные данные о фотовосстановлении клеток, инактивированньо ДУФ- и видимым светом, являются первым указанием на возможност! фоторепарации повреждений, образующихся по фотодинамическом} механизму в генетическом аппарате и мембранных структурах клетки.

4. Установленный общий характер закономерностей проявления эффектов фотовосстановления клеток при их инактивации оптическим излучением разных диапазонов спектра, которые индуцируют различные типы фотоповреждений, позволяет констатировать наличие в дрожжевых клетках единой, ранее не известной фотоиндуцибельной защитной системы, не специфичной в отношении природы летальных фотоповреждений.

5. С использованием спектрофлуориметрического и абсорбционного анализа изолированных клеточных фракций впервые для дрожжевых клеток показано наличие длинноволнового поглощения с максимумом в красной области при 670 нм, принадлежащее неидентифицированному хромофору, локализованному в плазматических мембранах. Близкое совпадение зарегистрированного максимума с главным максимумом в спектре действия фотовосстановления клеток позволяет рассматривать этот хромофор в качестве кандидата на роль первичного фоторецептора обнаруженной фотоиндуцибельной защитной системы.

Основные материалы диссертации опубликованы в следующих статьях:

1. Страховская М.Г., Пиняскина Е.В., Фрайкин Г.Я. Исследование флуоресценции изолированных плазматических мембран дрожжей в видимой области спектра.// Биофизика. 1995. Т.40. № 6. С. 810-814.

2. Фрайкин Г.Я., Пиняскина Е.В., Страховская М.Г., Рубин А.Б. Новая фотоиндуцибельная защитная система в клетках Candida guilliermondii при летальном действии средневолнового ультрафиолетового излучения.// Доклады РАН. 1995. Т. 343. № 2. С.265-267.

3. Фрайкин Г.Я., Страховская М.Г., Пиняскина Е.В. О локализации порфиринового соединения в плазматических мембранах дрожжей и его участии в фотосенсибилизации перекисного окисления липидов. //Биохимия. 1995. Т. 60. № 7. С.1 155-1160.

Fraikin G.Ya., Strakliovskaya M.G., Pinyaskina E.V.. Localization of

Porphyrin-Type Compound in Yeast Plasma Membranes and Its Involvement in Pliotosensilization of Lipid Peroxidation. // Biochemistry (Moscow). 1995. Vol. 60. № 7. P. 877-880.

4. Fraikin G., Pinyaskina E. New Type of Photoreactivation of UVB-inactivated Cells. // Photodermatol., Pliotoimmunol. Photomed. 1995. Vol. II. P. 23.

Тираж 100 экз.