Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение эффективности фотодинамического действия сенсибилизаторов, используемых в фотодинамической терапии, на клеточных моделях

ВАК РФ 03.00.01, Радиобиология

Автореферат диссертации по теме "Изучение эффективности фотодинамического действия сенсибилизаторов, используемых в фотодинамической терапии, на клеточных моделях"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

им. М. В. ЛОМОНОСОВА ^ |> ^ ^ д

Биологический факультет 1 3 ДЕК 70011

На правах рукописи

Румбаль Яна Викторовна

ИЗУЧЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ ФОТОДИНАМИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ СЕНСИБИЛИЗАТОРОВ, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ В ФОТОДИНАМИЧЕСКОЙ ТЕРАПИИ, НА КЛЕТОЧНЫХ МОДЕЛЯХ

03.00.01 - радиобиология

Автореферат на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2000

Работа выполнена в Московском Государственном Университете в лаборатории радиационной биофизики кафедры биофизики

Научные руководители:

кандидат биологических наук, И. М. Пархоменко кандидат биологических наук, А. П. Зарубина

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор, И. И. Пелевина доктор биологических наук, профессор, А. Я. Потапенко

Ведущее учреждение:

Государственный Научный Центр Лазерной Медицины МЗРФ

на заседании Диссертационного Совета Д.053.05.74 при Московское Государственном Университете им М. В. Ломоносова по адресу: 119899, г Москва, ГСП, Воробьевы горы, МГУ, Биологический факультег.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ. Отзывы просим направлять по адресу : 119899, г. Москве ГСП, Воробьевы горы, МГУ, биологический факультет, Диссергационны] Совет Д.053.05.74.

Автореферат разослан " ^ " НО<{($ 2000 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета

доктор биологических наук, профессор О. Р. Колье

Защита диссертации состоится

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. Энергия видимого света, имеющего длину элны 400 - 750 нм, составляет около 45% всей энергии солнечного спектра, адающей на землю. При прохождении через атмосферу он ослабляется в еныпей степени по сравнению с ультрафиолетовым. В связи с этим видимый зет является одним из наиболее важных экологических факторов, влияющих а живые организмы. Видимый свет является основным источником энергии ля поддержания жизни, а фоторегуляторные реакции необходимы для равильной организации физико-химических процессов, протекающих в стоклеточных и многоклеточных организмах. Наибольшую группу отобиологических процессов, которые вызывает видимый свет, составляют отоэнергетические (фотосинтез), фотоинформационные (зрение у животных), фоторегуляторные (фототропизм, фототаксис, фотопериодизм и другие) роцессы. Последние активно влияют на многие стороны жизнедеятельности рганизмов - рост, развитие, дифференциацию, биосинтез различных ерментов, пигментов и других биологически активных соединений.

Однако, видимый свет способен вызывать и деструктивные реакции, посредуемые как эндогенными так и экзогенными сенсибилизаторами, тедствием которых может стать повреждение или гибель организма. Так, ногие метаболиты, поглощающие свет видимой области спектра, помимо юих основных функций, обладают побочным фотосенсибилизирующим гйствием, вызывающим повреждения компонентов клеток - белков, липидов, уклеиновых кислот.

Интерес к проблемам фотодеструкции, изучение ее механизмов, свойств

;нсибилизаторов привело к значительным успехам в этой области

¡¡следований, что нашло и практическое применение. В последнее время

:обенно интенсивно развивается медицинское использование процессов

отодеструкции, в частности для лечения раковых опухолей методом

1

фотодинамической терапии (ФДТ). В основе этого метода лежит поврежденш видимым светом клеток опухоли, способных избирательно накапливал сенсибилизаторы порфириновой природы. В настоящее время разрабатываютсз основы и модифицированного метода ФДТ. В его основе лежит накоплен» эндогенных порфиринов, индуцированное предшественником биосинтез; порфиринов' 5-аминолевулиновой кислотой (АЛК). Проводятся интенсивны! исследования динамики накопления экзогенных и эндогенны: сенсибилизаторов и их превращений в опухоли, однако многие количественны закономерности и молекулярио-клсточные механизмы фотодинамическог действия требуют изучения на клеточном уровне, например, на культивируемы клетках млекопитающих [Zhengwen Xiao et. al., 1998].

Кроме того, все больше исследований ведется по использованию метод ФДТ в работе с бактериальными инфекциями, в связи с проблемой высоко устойчивости микроорганизмов к антибиотикам [Malik et al., 1990]. Б микроорганизмах, особенно на дрожжах, исследуется фотодинам ичсска активность различных экзогенных сенсибилизаторов и пути АЛЬ индуцировашюго синтеза эндогенных сенсибилизаторов-порфиринов. Таки образом, микроорганизмы и культивируемые клетаи млекопитающих можи использовать в качестве удобной модели для изучения механизмов регуляци биосинтеза порфиринов, изучения закономерностей и механизме фотодинамического действия эндогенных и экзогенных сенсибилизаторов отработки новых клинических методов фотодинамической инактивации клетс с их помощью.

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы было изучею закономерностей накопления, распределения и эффективное] фотодинамического действия некоторых экзогенных и эндогеннь сенсибилизаторов на клеточных моделях.

В соответствии с этим были поставлены следующие задачи:

-получить зависимости фотодинамического действия различал

2

яосенсибилизаторов от их концентрации, времени инкубации клеток с деятелем и от дозы светового воздействия на двух клеточных моделях: льтивируемых in vitro клетках млекопитающих и биолюминесцентной стеме in vivo - генно-инженерных штаммах Escherichia coli, с онировашшми в них lux-оперонами 3-х разных видов светящихся бактерий;

-сравнить эффективность действия различных сенсибилизаторов на пользуемые клеточные модели;

-отработать условия для создания модели быстрого отбора экзогенных нсибилизаторов путем сравнения их действия на колониеобразование льтивируемых клеток млекопитающих и на колониеобразование и »люминесценцию светящихся бактерий.

Научная новизна работы. Впервые показано, что биолюминесцентная стема светящихся бактерий чувствительна к действию различных >тосе нсибилизаторов.

Обнаружена корреляция фотодинамического действия эндогенных вдуцированных AJIK) и экзогенных фотосенсибилизаторов на активность 'нкционирования биолтоминесцентной системы бактерий и лониеобразующую способность культивируемых клеток млекопитающих.

Изучены соотношения между накоплением в клетках и »тодинамической эффективностью фотодитазина, а также временная и нцентр анионная зависимости накопления протопорфирина IX у льтивируемых клеток HeLa.

Практическая значимость работы. Обнаруженная нами корреляция иодинамического действия сенсибилизатора на интенсивность олюминесценции светящихся бактерий и на выживаемости культуры клеток :La, позволяет использовать клетки светящихся микроорганизмов в качестве обной модели для быстрого и эффективного отбора экзогенных нсибилизаторов, а так же для подбора их действующих концентраций.

Отработанные условия использования лиофильно высушенных

з

и регидратарованных светящихся бактерий в качестве биосенсора для оценк фотодинамического действия фотосенсибилизаторов позволяют создат эталоны для биотестирования, способные храниться в течение длительног времени (до одного года), и использовать их по мере необходимости дл достаточно дешевого экспресс анализа.

Полученные данные о возможности усиления фотодинамическог повреждения клеток млекопитающих с помощью модификации процессо биосинтеза порфиринов также могут иметь не только теоретическое, но практическое значение при фотодинамической терапии опухолей, культивируемые клетки млекопитающих могут быть использованы в качеств адекватной модели для отработки действующих концентраций для ФДТ.

Корреляция фотодинамического повреждения биолюминесцентно системы и колониеобразующей способности у бактерий позволяй использовать предложенные подходы при подборе сенсибилизаторов дл фотодинамической антимикробной химиотерапии (ФАХТ).

Апробация работы. Основные результаты работы доложены на Международной конференции по биофизике (Каир, 1998), на II Съез; биофизиков России (Москва, 1999).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 тезисов, статья, 2. статья сдана!в печать.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзор литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждени заключения, основных выводов и списка литературы. Содержание работ представлено на 97 страницах машинописного текста, иллюстрировано 2 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Объекты исследований. Эксперименты проводили на культур фибробластов китайского хомяка линии НАТ-10 (прежнее название ВПчН РАР-28, клон 237), на культуре опухолевых клеток НеЬа, а также *

4

;ветящихся бактериях Escherichia coli К 12 TAG hsd R17 hsd M the reí Al sup i44 A (lac-pro AB) F' (tra D36 pro AB+ lac Lq lac ZA Ml 5). В Escherichia coli )ыли ранее клонированы lux-опероны из разных видов светящихся бактерий. Толученные генно-инжеперные штаммы хранятся в ГОСНИИ Генетики и в иборатории биологически активных веществ кафедры микробиологии »дологического факультета МГУ.

Методы работы с культивируемыми клетками млекопитающих.

Культивирование клеток. Культуру фибробластов китайского хомяка юддерживали в стеклянных флаконах, при температуре 37°С, в среде, остоящей из среды Игла, среды 199 (в соотношении 1:1) с добавлением 10% ыворотки крупного рогатого скота. Перед использованием каждую партию ыворотки инактавировали дополнительно прогреванием до 56°С в течение 15 тинут. К сыворотке добавляли антибиотики. Культуру пересевали обычно два аза в неделю, после образования монослоя. Клетки для пересева снимали со текла версеном (0,02% ЭДТА), 3-5 минутной инкубацией при 37°С. Культуру пухолевых клеток HeLa выращивали на питательной среде 199 с добавлением 0% сыворотки крупного рогатого скота.

Для оценки колониеобразуклцей способности клеток их разбавленную успензто (~ 500 клеток на пробирку) высевали в среду с более высоким удержанием сыворотки, 20%. Концентрацию клеток подсчитывали в камере оряева. Облученные и контрольные клетки культивировали 7-8 дней до бразования макроколоний. Макроколонии фиксировали по Карнуа, крашивали смесью гематоксилин-эозин и по отношению числа колоний в энтрольных и облученных пробирках определяли выживаемость клеток.

Прикрепленные клетки облучали в полной питательной среде через сутки эсле посева.

Источники излучения и условия облучения. Для выделения света видимой Зласти спектра (>380 нм) использовали ртутную лампу высокого давления

ДРШ-1000. Излучение более коротких длин волн отсекали светофильтром БС-8 Излучение направлялось на стеклянную пробирку с объектом, помещенную ] термостатируемый держатель на расстоянии 15 см от источника света Непосредственно перед образцом помещали водный фильтр толщиной 2 ci Интенсивность излучения на уровне образца составляла 60 Вт/м2.

Получение экстрактов из клеток млекопитающих и измерение спектро поглощения и флуоресценции клеточных экстрактов. Для получения экстракго клетки растили в течение 3-х суток для получения монослоя. После 2-х кратно: промывки слоя раствором Хенкса клетки соскребали пластиковым скребком центрифугировали при 200 g х 5 мин, затем к осадку добавляли 2 мл смес хлорная кислота (0,1N) : метанол (1:1) и центрифугировали при 1500 х 20 миг Полученный супернатант использовали для измерения спектров флуоресценци и поглощения.

Для выделения различных эндогенных порфиринов использовали чисты хлороформ по вышеописанной методике.

Спектры флуоресценции снимали на спекгрофлуориметре Hitachi-85( Для регистрации спектров флуоресценции суспензии клеток использовал треугольную кварцевую кювету, что позволяло минимизировать потери и светорассеяние. Спектры поглощения снимали на спектрофотометре Hitach 556 и Hitachi- 557.

Методы работы с бактериальными штаммами.

Культивирование клеток. После облучения бактерии выращивали пр 28° С в LB- бульоне. Состав сред (г/л): модифицированная жидкая среда LB бакто-триптон - 10, бакто-дрожжевой экстракт - 5, NaCl - 5, ампицилли 100мкг/мл, вода дистиллированная - до 1 л, рН = 7,0 - 7,2. При определени колониеобразования использовали агаризованную среду того же состава, добавлением 20 г/л агар-агара.

Выращивание бактерий в жидкой среде осуществляли при 28° С в течем

12 часов в глубинных условиях на качалке, имеющей 220 об/мин, в колб*

6

эъемом 750 мл со 100 мл соответствующей питательной среды.

Определение титра клеток проводили с помощью нефелометрического шерения оптической плотности суспензии (1=670 нм.) и выражали в шичестве клеток в мл суспензии, пользуясь стандартной калибровочной

5ивой.

Лиофилизапия. Лиофилизацию трансформированных светящихся клонов доводили в защитной среде, содержащей 1% желатина, 1% глутаминовой 1Слоты, 10% сахарозы в дистиллированной воде, рН=7,5-7,8 (pH доводили ^центрированным раствором NaOH).

Предварительно бактерии выращивали до середины логарифмической азы роста при 28° С в LB-бульоне, содержащем 100 мкг ампициллина, дважды ;нтрифугировали при +4°С при 7000 об/мин в течение 20 мин с ;реосаждением в физиологическом растворе. Биомассу бактерий /спендировали в защитной среде до концентрации 7,0*Ю10 - 2*10и клеток/мл, юсшга по 2,5 мл в стеклянные бюксы (объемом 15-20 мл.); медленно 1Мораживали жидким азотом и лиофильно высушивали в течение 20 часов на ггановке 0,98 (Венгрия).

Остаточная влажность лиофильно высушенных препаратов составляла 1%. Образцы лиофилизированных бактерий хранили при 4°С без доступа sera, периодически проверяя после регидратации их жизнеспособность и стивность их биолюминесцентной системы.

Регидратация бактерий. При работе с Е. coli регидратацию лиофильно лсушенных бактерий осуществляли добавлением 10 мл охлажденной до +4°С, гстиллированной воды (рН=7,5). Суспензии всех клонов бактерий лдерживали 30 мин. при +4°С. Затем добавляли 40 мл дистиллированной воды >мнатной температуры и выдерживали 20 мин при комнатной температуре, а 1я клона Е. coli р ХгаЬ 7-20 мин. при 37°С). После этого регидратированные истерии использовали в экспериментах. К образцам добавляли выбранную

концентрацию фотосенсибилизатора и освещали их через 20 мин инкубации красителем.

Измерение биолюминесценции бактерий. Интенсивность свечени бактерий регистрировали с помощью люминометра "Биотокс-6 (сконструированного в Российской Федерации) в кюветах с 0,5 - 1,0 м исследуемой суспензии бактерий. Интенсивность биолюминесценции выражал в относительных единицах. Продолжительность измерения составляла 5-15 сю при комнатной температуре.

Облучение бактерий. Облучение лиофильно высушенных б актер и проводили после их регидратации в дистиллированной воде рН = 7,5 (р] доводили с помощью №С1). Облучение свежевыращенных бактерий проводил в такой же дистиллированной воде.

Жизнеспособность микроорганизмов определяли по н колониеобразующей способности путем подсчета макроколоний, выросших течение суток при 30°С на агаризованной ЬВ- среде со 100 мкг/м ампициллина.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Клетки НеЬа и фибробласты китайского хомячка облучали белым свето (А>380 нм). Как видно из рис. 1 в широком интервале доз от 18 до 72 кДж/> практически не наблюдается заметного снижения выживаемости ни одного I штаммов. Кроме того, при дозе выше 72 кДж/м2, когда начинает проявлять« некоторое снижение выживаемости, достигающее всего 30% от исходно! уровня при 108 кДж/м2 , уже невозможно избежать влияния инфракрасно! излучения. Очевидно, уровень эндогенных порфиринов, обладаюпц фото динамической активностью, в этих клетках достаточно мал.

С целью повысить уровень эндогенных порфиринов клетки инкубирова!

с АЛК в концентрациях от 0,2 до 1 мМ. При использовании концентрации 0

$

М и срока инкубации 4 часа, обычно применяемых большинством авторов, мы бнаружили увеличение повреждения клеток (рис. 2) по сравнению с еобработанным контролем (данные представлены для клеток НеЬа).

Время, мин О 2 4 6 8 10 12 14 16

100

о4

2

га

га

л Я

10

О 20 40 60 80 100 120

Доза, кДж/м2

100

Время, мин 5 10 15 20 25 30

20 40 60 80 100 120

Доза, кДж/м2

0

Рис. 1. Зависимость ыживаемости клеток НеЬа (1) и итайского хомяка (2) от дозы елого света (А>380 нм).

Рис. 2. Зависимость выживаемости клеток НеЬа от дозы белого света после инкубации с 0,5 мМ АЛК (2) и без нее (1).

В спектрах флуоресценции суспензий клеток после 4-х часовой :нкубации с 0,5 мМ АЛК при 37°С были зарегистрированы значительные вменения в соотношении порфиринов у обоих типов клеток (рис. За и Зб).В онтрольных клетках ярко выражена полоса 600 нм, связанная скорее всего с ассеянием, а также два слабо выраженных плеча при 615-620 нм и 633 нм. В летках, обработанных АЛК (кривая 2), возрастает пик флуоресценции при 33 нм, характерный для протопорфирина IX, и незначительно возрастает пик плечо) при \= 615-625 нм, соответствующий пулу уро- и копропорфиринов.

Кроме того, как видно из сравнения рис За и 36, АПК вызвала более заметное увеличение концентрации протопорфирина ГХ в опухолевых клетках, чем в нормальных.

отн. ед.

Рис. За и 36. Спектры флуоресценции суспензий клеток НеЬа (а), : фибробластов китайского хомяка (б).

1- контроль без добавок, 2- АЛК 0,5 мМ. В суспензии содержалось 5* 1С клеток.

В экспериментах с различными концентрациями АЛК было показано, чт наиболее эффективное накопление порфиринов наблюдается при концентраци

ю

мМ (рис. 4) и длительности инкубации 6 часов (рис. 5). Однако определение живаемости показало, что в этих условиях АЛК токсична сама по себе в шоте.

Помимо эндогенных фотосенсибшшзаторов-порфиринов в эксперименте в клинике широко используются экзогенные сенсибилизаторы. Поэтому едующим этапом нашей работы было изучение фотодинамической фективности двух экзогенных красителей: гидрофильного фотосенса и пофильного фотодитазина.

Сравнение эффективности двух фотодинамических красителей, фотосенса фотодитазина, показало, что более эффективен фотодитазин. Возможно, это язано с тем, что, он более гидрофобен и лучше адсорбируется на мембране, торая является, по-видимому, основной мишенью при фото динамической струкции.

Для того, чтобы выяснить оптимальные условия облучения клеток НеЬа с

О 3 6 9 12 15 18 21 24

фая, часы

Рис. 4. Зависимость копления протопорфирина IX от пользуемой концентрации АЛК.

Рис. 5.Кинетика накоплетя протопорфирина IX при инкубации с 0,6 мМ АЛК.

и

фотодитазином мы снимали кривые выживаемое™ с разными концентрациям фотодитазина и при различных временах инкубации. Из полученных кривы видно, что увеличите времени инкубации вначале приводит к возрастали эффективности фотодинамического повреждения, но начиная с 3-х часо дальнейшее увеличение времени инкубации практически не влияет 1 выживаемость клеток (рис. 6).

Однако, из полученных нами спектральных данных следует, ч инкубация в течение суток приводит к значительному увеличению количест) красителя, ассоциированного с клетками. На рис. 6 представлены дашш свидетельствующие об отсутствии корреляции между накопление фотодинамического красителя в клетке и гибелью клеток под действием бело света. Видимо, адсорбированного на мембране за первые 2-3 часа инкубат красителя достаточно для достижения максимально возможного уров фотодинамической деструкции в данной клеточной модели.

Время, мин 0 2 4 6 8 10 12 14

10

0 9 18 27 36 45 54

Доза, кДж/м2

0 5 10 15 20 25

Рргхт инкубахдаи, часы.

Рис. 7. Зависимость выживаемости

Рис. 6. Соотноше!

клеток НеЬа от дозы белого света в присутствии фотосенса -1 и фотодитазина -2 (С=3мкг/мл).

накопления фотодитазина клетках -1 и гибели клеток облученных в дозе 36 кДж/м2

Одной из экспериментальных клеточных моделей, позволяющих быстро ентггь степень повреждения клеток, являются светящиеся бактерии. К стоящему времени на основе использования морских светящихся бактерий, <этх как Vibrio fisheri, Photobacterium phosphoreum, разработаны стандартные стемы "Микротокс", "Токситест" и "Мутатокс" широко используемые для ределения токсичности самых разнообразных химических соединений, (мимо морских светящихся бактерий получен ряд гешюинженерных штаммов "olí, с клонированным в них lux-опероном светящихся бактерий. Эти штаммы были использованы нами для оценки эффективности фотодинамических асителей.

Эксперименты по инкубации светящихся бактерий с красителем казали, что 15-20 минут инкубации до начала освещения достаточно для стижения уровня фотодинамического повреждения, характерного для данной зы света (рис. 8).

л в о о в п S о а о

Ен

а:

100

а

Время, мин 6 8 10

Доза, кДчс/м2

Рис. 8. Зависимость фотодинамического действия белого света в 1исугствии фотодитазина (3 мкг/мл) на свечение генно-инженерного штамма coli от времени инкубации с красителем. (1 - 5мин, 2-25 мин, 3-40 мин).

13

Сравнение эффективности действия двух фотодинамических красителе фотосенса и фотодитазина, показало, что, как и на клетках HeLa, бол< эффективен фотодитазин (рис. 7, 9). Данные о корреляции биолюминесценщ клеток Е. coli и выживаемости клеток HeLa в присутствии фотодитази приведены на рис. 10.

Рис. 9. Фотодинамическое действие фотосенса (1), фотодитазина (2' концентрации 3 мкг/мл и AJIK (3) в концентрации 0,5 мМ на свечение E.coli.

Поскольку имеются многочисленные экспериментальные данные рефляции биосинтеза порфиринов у ряда микроорганизмов, в том числе E.coli, с помощью АЛК, подходы, используемые в ФДТ опухолей, мо оказаться перспективными и в фотодинамической антимикробной терапии связи с этим нами была изучена также зависимость биолюминесценции Е. < от дозы видимого света после инкубации с АЛК. Инкубацию с АЛК провод! в течение 20 мин. В нетоксичной концентрации 0,2 мМ АЛК оказала бо. эффективное фотосенсибилизирующее действие, чем фотосенс и фотодитаз как на культуру HeLa, так и на биолюминесценцию Е. coli (рис. 9).

Время, МИН

0 2 4 6 8 10 12 14 16

100

0 10 20 30 40 50 60

Доза, кД^к/нй

Время, мин О 2 4 6 8 1012 1416

Рис. 10. Зависимость выживаемости клеток HeLa -1 и интенсивности элюминесценции Е. coli -2 от дозы белого света, (фотодитазин 3 мкг/мл).

Исследования чувствительности Е. coli к фотодинамическому действию юго света в присутствии фотосенса, проведённые па трех различных шоинженерных штаммах, показали, что по чувствительности они мало пмались между собой. Это значит, что любой из штаммов мог бы послужить делью для отбора фотодинамически активных концентраций гсибилизаторов. Штамм рХгаЬ7 выглядит наиболее подходящей моделью для тодинамических исследований, поскольку он более устойчив к потоку фракрасного излучения.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Исследования биологического действия некоторых физических факторов

различные клеточные модели (ионизирующая радиация, УФ-изучение

шичных диапазонов) свидетельствует о том, что основные закономерности

ix эффектов определяются мишенью этого действия. Сходство

15

эффектов, наблюдаемых на 2-х различных клеточных моделях: культивируемых клетках млекопитающих и Е. coli, определяется, по-видимому тем, что мембранные системы клетки являются основной мишеньк фотодинамической деструкции.

В частности, различия в фотодинамической эффективности дву. используемых экзогенных сенсибилизаторов, фотодитазина и фотосенс связано, возможно с тем, что фотодитазин, как более гидрофобное соединение лучше связывается с мембраной и таким образом вызывает более ярк выраженную фотодинамическую деструкцию, как в клетках HeLa, так и клетках Е. coli. Фотосенс, благодаря своим гидрофильным свойствам, видим накапливается по большей части в цитоплазме и, в результате, в наши экспериментах оказывает меньший фотодинамический эффект. Эти различи хорошо проявляются, несмотря на различия в фотовыцветании эти соединений: фотодитазин быстро выгорает на свету, а фотовыцветани фотосенса в используемом нами диапазоне доз света отсутствует.

Однотипное действие фотодитазина на клетки HeLa и на клетки Е. со может быть связано с тем, что повреждение мембраны в результат взаимодействия с активными формами кислорода (АФК) является одним v ключевых факторов фото динамического повреждения. В клетках HeLa эт приводит к снижению колониеобразования в результате интерфазной частично репродуктивной их гибели, а в клетках генноинженерного штамма i coli это приводит к снижению интенсивности биолюминесценции, которг зависит от активности люциферазы, локализованной, по-видимому, бактериальной мембране.

Известно, что основной причиной гибели клеток при фотодинамическс деструкции является апоптоз, одна из основных форм интерфазной гибел Однако, определенный вклад в снижение колониеобразования может вносить репродуктивная гибель, связанная в основном с повреждениями ДНК. Частич!

репродуктивная гибель может быть связана и с изменениях

16

ггоплазматической мембраны, например, с нарушением ее адгезивных свойств снижением способности клеток к прикреплению к стеклу. Кроме того, >вреждение мембраны при фагодинамическом действии, как при действии 1ШШОВОЛНОВОГО УФ- излучения, в результате определенной эследователъности процессов (нарушение работы элекгрошю-транспортной :пи, накопление продуктов перекисного окисления липидов, вызывающих упреждения в ДНК) может вызывать не только к интерфазную, но и ¡продуктивную гибель клеток.

В отношении биолюминесцентной системы микроорганизмов элынинство исследователей склоняется к тому, что либо вся эта система, либо з крайней мере часть компонентов, участвующих в биолюминесцентной ;акции, локализована в мембранах,. Видимо именно поэтому как в клетках eLa, так и у способной к биолюминесценции генноинженерной Е. coli. ембранотропный фотосенсибилизатор вызывает более выраженное эвреждение, чем гидрофильный.

Есть также основания предполагать, что фотодитазин является более |>фекгавным сенсибилизатором, чем фотосенс, благодаря тому, что он лучше роникает в клетки из-за меньших размеров и особенно из-за меньшего зличества заряженных боковых групп.

Особый интерес представляют полученные нами сравнительные данные 5 эффективности действия фотосенса, фотодитазина и АЛК как на клетках eLa, так и клетках Е. coli. Фотодинамическая эффективность исследованных эединений и в той и в другой модели составляет ряд ФС > ФД > АЛК, что эзволяет считать перспективным дальнейшее использование светящихся истерий в качестве модели для быстрой предварительной оценки темновой жсичности и фотосенсибилизирующей активности новых соединений в отодинамической терапии.

Определение эффективности действия антимикробных и

ротивоопухолевых веществ, в частности, фотодинамических

17

красителей исследуется, главным образом, на культуре тканей. Однако, эп исследования можно проводить и на микроорганизмах in vivo с помощы< биолюминесценции светящихся бактерий. Ключевым требованием дл применения биолюминесценции является установление строгой корреляци между биолюминесценцией и жизнеспособностью клеток, определяемой п подсчету выросших колоний на агаризованной питательной среде. Проведении нами сравнительные исследования биолюминесценции и жизнеспособност указывают, что такая корреляция имеет место.

Измерения in vivo биолюминесценции регидратированных лиофильи высушенных клеток, светящихся бактерий позволяет проводить исследования довольно короткий срок (0,5-1час). Подсчет клеток, образовавших колони широко используется в микробиологической, санитарной и медицинскс практике. Развитие методов, позволяющих быстрее, чем все известные раш методы, за сравнительно короткий срок (0,5-1 час) решать поставленнь конкретные задачи, такие как выбор действующей концентрации и време! инкубации, имеет важное значение в лабораторных исследованиях и в практик

Генетическая инженерия позволяет вводить биолюминесцентнь фенотип в нужные клетки микроорганизмов и, поскольку эмиссия света завис; от жизнеспособности бактерий, такие конструкции дают возможность получа новые биосенсоры для оценки in situ эффективности фотодинамическо действия сенсибилизаторов в отношении интересующих исследователя rpyi микроорганизмов. Эффективность этого метода обеспечивается как коротю временем анализа, так и простотой использования и дешевизной.

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ.

1. При изучении фотодинамического действия фотосенса фотодитазина обнаружена корреляция в их повреждающем воздействии на дг клеточных моделях - культивируемых клетках млекопитающих HeLa и ген]

сенерных штаммах грамотрицательных бактерий E.coli. Показано, что учение одинаковыми дозами света клеток, проинкубированных с наковым количеством красителя, приводит к одинаковой степени снижения колониеобразования клеток HeLa, так и интенсивности бактериальной люминесценции.

2. Обнаружено что на обеих моделях используемый гидрофильный сибилизатор фотосенс менее эффективен, чем более гидрофобный одитазин.

3. Показано, что динамика накопления фотодитазина культивируемыми тками HeLa не связана линейно с его фотодинамической эффективностью по iy колониеобразованияЛСоличества красителя, связавшегося с клетками в ение первых трех часов инкубации, достаточно для максимального •явления эффекта.

4. Выявлено, что экзогенные сенсибилизаторы обладают меньшей |)ективностью, чем эндогенные, образованные из добавленной шолевулиновой кислоты. На обеих моделях сенсибилизаторы образуют ряд ! < ФД < АЛК по возрастанию фотодинамической деструкции.

5. Впервые показано, что биолюминесцентная система светящихся ггерий по чувствительности к фото динамическому действию красителей 13ка к колониеобразованию культивируемых клеток млекопитающих, что ;воляет рекомендовать люминесцентные бактерии в качестве модели для ¡ярого отбора фотосенсибилизаторов, используемых в ФДТ онкологических нфекционных заболеваний.

Основные материалы диссертации оппубликованы в следующих работах:

1. Rumbal Ja. V., Нал YS., Strakhovskaya M.G., Parkhomenko I. M. rtodynamic destruction in cultured marnmalian cells and its modification.// Book of stracts of the Second International Biophysics Conférence, 1998 p.72.

19

2. Хан Енсу, Страховская М.Г., Пархоменко И. М., Румбаль Я. Е Модификация красным светом УФ-поражения культивируемых клето млекопитающих // Вестник Московского Университета, серия биология, 2000,

3. Румбаль Я. В. Исследование корреляции фотодинамического действк некоторых фотосенсибилизаторов на двух экспериментальных моделях. Школа-Конференция Биофизические Горизонты, в печати.

4. Румбаль Я. В., Хан Енсу, Пархоменко И. М., Страховская М. ] Фотодинамическая деструкция культивируемых клеток млекопитающих и < модификация.//П Съезд биофизиков России 1999 т. 3 с.1071.

5. Страховская М. Г., Румбаль Я. В., Зарубина А. П., Пархоменко И. IV Фотодинамические эффекты, опосредованные порфиринами, i генноинженерных светящихся штаммах Е coli. Микробиология, в печати.

6. Страховская М. Г., Румбаль Я. В., Зарубина А. П., Пархоменко И. N Светящиеся генноинженерные штаммы Е coli как новая модель для изучеш фотодинамического действия порфириновых сенсибилизаторов. Радиационн биология. Радиоэкология, в печати.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Румбаль, Яна Викторовна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Некоторые закономерности фотодинамического действия.

1.1.1. Фотосенсибилизируемые реакции.

1.1.2. Активные формы кислорода.

1.1.3. Определение типа фотосенсибилизируемых реакций.

1.1.4. Фотосенсибилизированное повреждение биомолекул и органелл клетки.

1.2. Метод фото динамической терапии.

1.3. Регуляция биосинтеза эндогенных порфириновых флуорофоров и фотосенсибилизаторов

1.3.1. Цепь биосинтеза порфиринов и гемов.

1.3.2. Оптические и флуоресцентные свойства эндогенных порфиринов.

1.4. Использование клеточных моделей в экспериментальных исследованиях и лабораторной практике

ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

2.2.1. Фотодинамическая деструкция в присутствии эндогенных порфиринов

2.2.2. Фотодинамическая деструкция в присутствии экзогенных фото динамических красителей.

2.2.3 Фотодинамическое действие на светящиеся микроорганизмы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение эффективности фотодинамического действия сенсибилизаторов, используемых в фотодинамической терапии, на клеточных моделях"

Актуальность работы. Энергия видимого света, имеющего длину волны 400 - 750 нм, составляет около 45% всей энергии солнечного спектра, падающей на Землю. При прохождении через атмосферу он ослабляется в меньшей степени по сравнению с ультрафиолетовым излучением. В связи с этим видимый свет является одним из наиболее важных экологических факторов, влияющих на живые организмы. Видимый свет является основным источником энергии для поддержания жизни, а фоторегуляторные реакции необходимы для правильной организации биологических процессов, протекающих в одноклеточных и многоклеточных организмах. Наиболее важную группу фотобиологических процессов, которые вызывает видимый свет, составляют фотоэнергетические (фотосинтез), фотоинформационные (зрение у животных; фототропизм, фототаксис, фотопериодизм и другие - у растений) и фоторегуляторные процессы. Последние активно влияют на многие стороны жизнедеятельности организмов - рост, развитие, дифференцировку, биосинтез различных ферментов, пигментов и других биологически активных соединений.

Первоначальным событием, способным запустить цепь тех или иных фоторегуляторных реакций, является поглощение видимого света хромофорами, которые по своим структурным особенностям могут быть разделены на три основные группы: 1) циклические и линейные тетрапирролы, (порфирины, фитохромобилин, фикоцианины); 2) полиены (ретиналь); 3) ароматические соединения (флавины, тетрагидрофолаты) [Сапежинский, 1988]. Основным хромофором в пигменте фитохроме, запускающем процессы фотоморфогенеза и фотопериодизма у зеленых растений при действии на них красного и дальнего красного света, является билитриен (фитохромобилин), который представляет собой разомкнутый тетрапиррольный цикл. Зрительный родопсин содержит ретиналь. Возможными фоторецепторами синего света, запускающего процессы фототропизма, каротиногенеза и фототаксиса являются соединения флавиновой природы.

Однако видимый свет способен вызывать и деструктивные реакции, опосредуемые как эндогенными, так и экзогенными сенсибилизаторами. Следствием этих реакций может стать повреждение или гибель организма.

Многие метаболиты, поглощающие свет видимой области спектра, помимо своих основных функций, обладают побочным фотосенсибилизирующим действием, вызывающим повреждения компонентов клеток - белков, липидов, нуклеиновых кислот. В состав клеток входят сотни окрашенных веществ, способных поглощать видимый свет и являющихся потенциальными фотосенсибилизаторами. Это витамины, флавины, флавиновые ферменты, НАДН2, каротиноиды, гемсодержащие вещества (хлорофилл и др.), порфирины, билирубин [Сапежинский, 1988, Черницкий, Воробей, 1988]. Кроме того, участвовать в повреждении клетки могут и экзогенные сенсибилизаторы, попавшие в нее - ароматические углеводороды, многие красители, применяющиеся в косметике, пищевой и легкой промышленности, а также лекарственные вещества, такие как тетрациклин, хлорпромазин.

Процессы фотосенсибилизации вызывают особый интерес по ряду причин. Во-первых, создание мощных источников света и повышение уровня загрязненности окружающей среды увеличивают вероятность фотоповреждений с участием экзогенных сенсибилизаторов. Эти фотоповреждения могут вызывать различные кожные заболевания, включая, например, рак кожи. Некоторые нарушения метаболизма в организме приводят к чрезмерному накоплению в тканях эндогенных фотосенсибилизаторов. Так, при наследственном заболевании эритропоэтической протопорфирии увеличение уровня протопорфирина в эритроцитах человека вызывает фотосенсибилизированные реакции, приводящие к гемолизу эритроцитов. В связи с этим возникает проблема защиты и профилактики клеток от фотосенсибилизированных повреждений.

Во-вторых, необходима разработка и усовершенствование способов направленного фотоповреждения клеток и биологических структур, например, для развития метода фотодинамической терапии (ФДТ) опухолей и некоторых кожных заболеваний.

Интерес к проблемам фотодеструкции, изучение ее механизмов, свойств сенсибилизаторов привело к значительным успехам в этой области исследований, что нашло и практическое применение. В последнее время особенно интенсивно развивается медицинское использование процессов фотодеструкции, в частности, для лечения раковых опухолей методом фото динамической терапии. В основе этого метода лежит повреждение видимым светом клеток опухоли, способных избирательно накапливать сенсибилизаторы порфириновой природы. В настоящее время разрабатываются основы и модифицированного метода ФДТ, принцип которого заключается в накоплении эндогенных порфиринов, индуцированном предшественником синтеза порфиринов 5-аминолевулиновой кислотой (АЛК).

В основном в клинике используется облучение красным светом лазерных источников. Это связано с тем, что воздействие красного излучения может быть уникальным, так как, с одной стороны, в дальней красной и ближней инфракрасной области (800-1200 нм) максимальным является проникновение излучения в биологические ткани; с другой - можно использовать достаточно большие дозы излучения, не опасаясь его повреждающего действия, так как энергия фотонов в этой области спектра низка.

В связи с интенсивным развитием клинического применения фотодинамических эффектов ведутся сравнительные исследования динамики накопления экзогенных и эндогенных сенсибилизаторов в различных опухолях

Zhengwen Xiao et al, 1998], однако, молекулярно-клеточные механизмы фотодинамического действия на клеточном уровне, в том числе, на культивируемых клетках млекопитающих изучены ещё не достаточно.

В связи с возрастающей устойчивостью микроорганизмов к антибиотикам растет интерес к исследованиям фотодинамической инактивации бактериальных клеток, вызывающих различные заболевания [Malik et. al. 1990, Yoshimura et. al., 1996]. На основе этих исследований и клинических разработок складывается в настоящее время метод фотодинамической антимикробной химиотерапии (ФАХТ).

Поэтому активно исследуется фотодинамическая активность различных эндогенных сенсибилизаторов и пути AJlK-индуцированного синтеза эндогенных сенсибштизаторов-порфиринов в клетках различных организмов. В этих исследованиях одноклеточные организмы, прежде всего, различные виды дрожжей и бактерий, и культивируемые клетки млекопитающих рассматриваются в качестве удобной модели для изучения механизмов регуляции биосинтеза порфиринов и отработки новых методов фотодинамической инактивации клеток с помощью эндогенных и экзогенных сенсибилизаторов.

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы было изучение закономерностей накопления, распределения и эффективности фотодинамического действия некоторых экзогенных и эндогенных сенсибилизаторов на клеточных моделях. Были использованы две модели -культивируемые клетки млекопитающих, о фотодинамическом повреждении которых судили по тесту колониеобразования, и светящиеся бактерии - генно-инженерные штаммы Е. coli с встроенным lux-опероном, - о фотодинамической деструкции которых судили по изменению интенсивности их биолюминесценции.

В соответствии с этим были поставлены следующие задачи:

-получить на культивируемых клетках млекопитающих зависимости фотодинамического действия от дозы видимого света, концентрации и длительности воздействия различных фотосенсибилизаторов;

-на клеточной модели, позволяющей быстро оценить степень фотодинамического повреждения - светящихся бактериях - получить дозовые, концентрационные и временные зависимости действия экзогенных сенсибилизаторов;

- сравнить на этих моделях эффективность действия различных сенсибилизаторов;

- на основании сравнения действия фотосенсибилизаторов на колониеобразование культивируемых клеток млекопитающих и на биолюминесценцию светящихся бактерий отработать модель для быстрого отбора экзогенных сенсибилизаторов на основании данных об изменении биолюминесценции светящихся бактерий.

Научная новизна работы. Впервые показано, что биолюминесцентная система светящихся бактерий чувствительна к действию различных фотосенсибилизаторов и предложено использовать их для оценки эффективности фото динамического действия. При сравнении фотодинамического действия экзогенных фотосенсибилизаторов в культуре клеток млекопитающих и на бактериях (генно-инженерные штаммы Е. coli, клонированные с lux-опероном) обнаружено, что их влияние на биолюминесценцию бактерий коррелирует с их действием на колониеобразование у клеток млекопитающих. Аналогичная зависимость наблюдается и при индукции биосинтеза эндогенных сенсибилизаторов с помощью АПК.

Полученные данные могут быть использованы для разработки метода быстрой оценки эффективности различных сенсибилизаторов.

Изучены соотношения между накоплением в клетках и фотодинамической эффективностью фотодитазина, а также временная и концентрационная зависимости накопления протопорфирина IX у культивируемых клеток HeLa.

Научная и практическая значимость работы.

Обнаружено, что фотодинамическое повреждение клеток светящихся бактерий приводит не только к их репродуктивной гибели по тесту колониеобразования, но и к снижению их биолюминесценции в ранние сроки после воздействия. Эта реакция биолюминесцентной системы на освещение в присутствии фотосенсибилизатора связана, по-видимому, с тем, что при фотодинамической деструкции повреждается дыхательная цепь, в результате чего в клетке истощается уровень восстановленных флавинов, необходимых для функционирования люциферазы.

Обнаруженная нами корреляция интенсивности биолюминесценции Е. coli и выживаемости культуры клеток HeLa, облученных в одной и той же дозе, позволяет предложить клетки светящихся микроорганизмов, в том числе лиофильно высушенные и регидратированные, в качестве удобной модели для быстрого и эффективного отбора экзогенных сенсибилизаторов, а так же для подбора их действующих концентраций.

Полученные данные о возможности усиления фотодинамического повреждения клеток млекопитающих с помощью модификации процессов биосинтеза порфиринов также могут иметь не только теоретическое, но и практическое значение при фотодинамической терапии опухолей, а предложенные клеточные системы могут быть использованы в качестве адекватной модели для отработки действующих концентраций для ФДТ и ФАХТ.

Апробация работы. Основные результаты работы доложены на II Международной конференции по биофизике (Каир, 1998), на II Съезде биофизиков России (Москва, 1999).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 тезисов, 1 статья, 2 статьи приняты в печать.

Заключение Диссертация по теме "Радиобиология", Румбаль, Яна Викторовна

Выводы.

1. При изучении фотодинамического действия фотосенса и фотодитазина обнаружена корреляция в их повреждающем воздействии на двух ( клеточных моделях - культивируемых клетках млекопитающих HeLa и генно-инженерных штаммах грамотрицательных бактерий E.coli. Показано, что облучение одинаковыми дозами света клеток, проинкубированных с одинаковым количеством красителя, приводит к одинаковой степени снижения как колониеобразования клеток HeLa, так и интенсивности бактериальной биолюминесценции.

2. Обнаружено что на обеих моделях используемый гидрофильный сенсибилизатор фотосенс менее эффективен, чем более гидрофобный фотодитазин.

3. Показано, что динамика накопления фотодитазина культивируемыми клетками HeLa не связана линейно с его фотодинамической эффективностью по тесту колониеобразования. Количества красителя, связавшегося с клетками в течение первых трех часов инкубации, достаточно для максимального проявления эффекта.

4. Выявлено, что экзогенные сенсибилизаторы обладают меньшей эффективностью, чем эндогенные, образованные из добавленной аминолевулиновой кислоты. На обеих моделях сенсибилизаторы образуют ряд ФС < ФД < АПК по возрастанию фотодинамической деструкции.

5. Впервые показано, что биолюминесцентная система светящихся бактерий по чувствительности к фотодинамическому действию красителей близка к колониеобразованию культивируемых клеток млекопитающих, что позволяет рекомендовать люминесцентные бактерии в качестве модели для быстрого отбора фотосенсибилизаторов, используемых в ФДТ онкологических и инфекционных заболеваний.

Заключение.

Исследования биологического действия различных физических факторов на различные клеточные модели (ионизирующая радиация, УФ-излучение различных диапазонов) свидетельствует о том, что основные закономерности этих эффектов определяются мишенью этого действия. Сходство эффектов, наблюдаемых на 2-х различных клеточных моделях, культивируемых клетках млекопитающих и способных к биолюминесценции штаммах Е. coli, позволяют предположить, что и в фотодинамической деструкции ее основные закономерности определяются ее мишенью.

В частности, различия в фотодинамической эффективности двух используемых экзогенных сенсибилизаторов, фотодитазина и фотосенса на обеих моделях связаны, возможно с тем, что фотодитазин, как более гидрофобное соединение, локализуется на мембране и таким образом вызывает более ярко выраженную фотодинамическую деструкцию, как в клетках HeLa, так и в клетках Е. coli. Фотосенс, благодаря своим гидрофильным свойствам, видимо, накапливается по большей части в цитоплазме либо менее прочно связывается с мембраной и, в результате, в наших экспериментах вызывает меньший фотодинамический эффект. Эти различия хорошо выражены, несмотря на различия в фотовыцветании этих соединений: фотодитазин очень быстро выгорает на свету, а фотовыцветание фотосенса в используемом нами диапазоне доз света отсутствует.

Однотипное действие фотодитазина на клетки HeLa и на клетки Е. coli может быть связано с тем, что повреждение мембраны является одним из ключевых для снижения колониеобразования клеток HeLa в результате интерфазной и репродуктивной их гибели, и для снижения интенсивности биолюминесценции генно-инженерного штамма Е. coli.

Известно, что основной причиной репродуктивной гибели клеток является повреждение ДНК. Однако определенный вклад в нее может вносить и изменение цитоплазматической мембраны, например, изменение ее адгезивных свойств и снижение способности клеток к прикреплению к стеклу [Яаеу е! а1., 1982]. Кроме того, повреждение мембраны как при действии длинноволнового УФ-излучения, так и при фотодинамическом действии, в результате определенной последовательности процессов (нарушение работы электронно-транспортной цепи, накопление продуктов перекисного окисления липидов, вызывающих повреждения в ДНК) может вызывать не только к интерфазную, но и репродуктивную гибель клеток.

В отношении биолюминесцентной системы микроорганизмов большинство исследователей склоняется к тому, что эта система или по крайней мере часть ее компонентов, участвующих в биолюминесцентной реакции локализована в мембранах [Ые'етап е! а1., 1977; Данилов, Егоров, 1990]. Лишь немногие полагают, что полученные ими экспериментальные данные свидетельствуют о том, что биолюминесцентная система может находиться в цитозоле и в периплазматическом пространстве [Сальников и др., 1984]. Видимо именно поэтому, как и в клетках НеЬа, у способной к биолюминесценции генно-инженерной Е. соИ мембранотропный фотосенсибилизатор вызывает более выраженное повреждение, чем гидрофильный.

Кроме того, есть основания предполагать, что фотодитазин является более эффективным сенсибилизатором, чем фотосенс, благодаря тому, что он лучше проникает в клетки из-за меньших размеров, особенно из-за меньшего количества заряженных боковых групп.

Следует отметить, что в клинических исследованиях, где практикуется многократное облучение опухоли, которое обычно более эффективно, чем однократное длительное облучение [Мевзшапп еГ а1.5 1997, ОгЙ1 е! а1., 1998], и где каждая доза в серии не меньше тех доз, которые мы использовали при однократном облучении, фотосенс действует как более эффективный фотосенсибилизатор. Возможно, это связано с отсутствием его фотовыцветания. Следует упомянуть, что этим же свойством обусловливается и крайне высокая и длительная его фототоксичность для кожи [Огф е1. а1., 1998]. Таким образом, в случае использования больших доз света фотосенс оказывает более эффективное фотодинамическое воздействие, а при воздействии доз видимого света на порядок меньших более эффективным фотосенсибилизатором является фотодитазин.

Высокая эффективность действия эндогенного сенсибилизатора АЛК, вероятно, связана с местом внутриклеточной локализации синтезируемого протопорфирина IX. В работе [Кепр ТаЬа1а е1 а!., 1997] при сравнительном изучении фотодинамической эффективности экзогенного протопорфирина IX, локализующегося на цитоплазматической мембране и протопорфирина IX, образующегося в митохондриальной мембране при добавлении к клеткам АЛК, было обнаружено значительно большее повреждение клеток при действии эндогенного протопорфирина IX. Было показано, что добавление 0,7 мМ АЛК в среду культивирования клеток НеЬа приводит к образованию внутри клеток примерно Ю"10 М протопорфирина IX на мг белка, такое же количество протопорфирина IX оказывается прочно связанным с клетками после их инкубации с 10"6 М экзогенного протопорфирина. При этом примерно одинаковое количество внутриклеточного протопорфирина IX, индуцированного АЛК и накопленного из экзогенно добавленного препарата, снижало выживаемость клеток НеЬа до 0,01% и до 90% соответственно.

В наших экспериментах с АЛК получены аналогичные данные. Добавление 0,5 мМ АЛК, которая, судя по данным литературы, вызывает образование примерно такого же количества протопорфирина IX, что и добавление 10"3мМ протопорфирина IX, приводило к большему повреждению клеток, чем добавление 3,8*10"3 мМ фотодитазина.

Остается пока неясным, идет ли фотодинамическое повреждение колониеобразования клеток HeLa и биолюминесцентной системы микроорганизмов в соответствии с первым или вторым типом фотодинамического повреждения. В частности, по результатам британских исследователей фотодинамическая деструкция с помощью аналога фотосенса -дисульфоната фталоцианина алюминия в клетках млекопитающих идет в основном по первому типу, а в бактериальных и дрожжевых клетках протекает, наоборот, по второму типу [Oldham & Phillips, 2000].

Наиболее интересно то, что полученные сравнительные данные об эффективности действия фотосенса, фотодитазина и АЛК на клетках HeLa и клетках Е. coli (фотодинамическая эффективность исследованных соединений и в той и в другой модели составляет ряд ФС > ФД > АЛК) позволяют считать перспективными дальнейшие исследования фотодинамической эффективности красителей на светящихся бактериях. На их основе может быть создана модель для быстрой предварительной оценки темновой токсичности и фотосенсибилизирующей активности новых соединений для фотодинамической терапии.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Румбаль, Яна Викторовна, Москва

1. Быховский В.Я., Зайцева Н.И. Микробиологический синтез тетрапиррольных соединений (1989), Итоги науки и техники, сер. биол. химия, Т.32.

2. Болдырев А. А. Карнозин, М. изд МГУ 1998.

3. Гуринович Г.П., Лосев А.П. Применение порфиринов и хлоринов для исследования фотодинамического действия света на организмы (1988) Молекулярные механизмы биологического действия оптического излучения (под ред. Рубина А.Б.) Наука, Москва.

4. Данилов В. С., Егоров Н.С. (1990) Бактериальная биолюминесценция.

5. Досон Р, Эллиот Д, Эллиот У, Джонс К. Справочник биохимика 1991.

6. Красновский A.A. (мл.). Механизм образования и роль синглетного кислорода в фотобиологических процессах (1988) Молекулярные механизмы биологического действия оптического излучения (под ред. Рубина А.Б.) Наука, Москва.

7. Кратасюк Г. А. Подоплелов А. В. Кратасюк В. А. и др. О возможном участии синглетного кислорода в возбуждении бактериальной биолюминесценции. // Докл. АН СССР. -1977г. т. 236. с. 1247-1240.

8. Сальников М.В., Высоцкий Е. С., Заворуев В. В., Межевикин В. В., Изменения периплазматического пространства светящихся бактерий взависимости от интенсивности люминесценции. Микробиология, (1984) т.53., 744-747.

9. Сапежинский И.И. Сенсибилизированное фотоокисление белков и других веществ. Возможное значение этих процессов в фотобиологии (1988) Молекулярные механизмы биологического действия оптического излучения (под ред. Рубина А.Б.) Наука, Москва.

10. Стом Д. И., Гиль Т. А., Балаян А. Э., (1993) Бактериальная люминесценция и биотестирование.

11. Черницкий Е.А., Воробей А.В. Фотосенсибилизированные повреждения биологических мембран (1988) Молекулярные механизмы биологического действия оптического излучения (под ред. Рубина А.Б.) Наука, Москва.

12. Черницкий Е.А., Воробей А.В.,.Сенсибилизируемые фотоповреждения клеток, (1986) ,Успехи современной биологии, 101, 1, 100-112.

13. Almanashu, S., В. Masalia, R.Hadar, М. Suissa, and J. Kuhn. 1990. Fusion of lux A and lux В and its expression in E. coli, S. cerevisiae and D. melanogaster. J. Biolumin. Chemilumin. 5: 89-97.

14. Atlante A., Quagliariello E., Passarella S., Moreno G. and Salet C. Carrier thiols are targets of Photofrin 2 photosensitization of isolated rat liver mitochondria (1990) J. Photochem. Photobiol., B: Biol., 10 11-21.

15. Bachowski G.J., Morehouse K.M. and Girotti A.W. Porphyrin-sensitized photoreactions in the presence of ascorbate: oxidation of cells membrane lipids and hydroxyl radical traps (1988) Photochem. Photobiol., 47, 635-645.

16. Bertoloni G, Reddi E, Gatta M, Burlini C, Jori G Factors influencing the haematoporphyrin-sensitized photoinactivation of Candida albicans. J Gen Microbiol 1989 Apr;135 (Pt 4):957-66.

17. Bertoloni G, Lauro FM, Cortella G, Merchat M Photosensitizing activity of hematoporphyrin on staphylococcus aureus cells. Biotin Biophys Acta 2000 Jul 3;1475(2): 169-74.

18. Blum A. and Grossweiner (1985) Singlet oxigen generation by protoporphyrin IX, uroporphyrine I and hematoporphyrin derivate at 546 nm in phosphate buffer.

19. Borg D.C. and Schaich K.M. Cytotoxity from coupled redox cycling of autoxidizing xenobiotics and metals (1974) Isr. J. Chem., 24, 38-53.

20. Brun A. and Sandberg S. Mechanisms of photosensitivity in porphyric patients with special emphasis on erythropoietic protoporphyria (1991) J. Photochem. Photobiol., B: Biol., 10, 285-302.

21. Bulich A. A. & Isenberg D. L., Use of the luminescent bacterial system for the rapid assessment of aquatic toxicity. Instrum. Soc. Am. Transactions (1981) V20, 2933.

22. Bulich A. A. & Isenberg D. L., Use of the luminescent bacterial system for the rapid assessment of aquatic toxicity. Advances in Instrumentation (1980) V. 35, 35-40.

23. Chiggino K. P., L. E. Bennet and R. W. Henderson (1988) Photochemical propeties of porphyrine c: an agent for use in tumor phototherapy. Photochem. Photobiol. 47, 65-72.

24. Christian S. and Guiliana M. New trends in photobiology (Invited review). Photosensitization of mitochondria. Molecular and cellular aspects (1990) Journal of Photochemistry and photobiology, B: Biology, 5, 133-150.

25. Canistraro S. and Van de Vorst A. Photosensitization by hematoporphyrin: ESR evidence for free radical induction in unsaturated fatty acids and for singlet oxygen production (1977) Biochem. Biophys. Res. Commun., 74, 1177-1185.

26. Ceckler T.L., Bryant R.G., Penney D.P. Gibson S.L. and Hilf R. 31P-NMR spectroscopy demonstrates decreased ATP levels in vivo as an early response to photodynamic therapy (1986) Biochem. Biophys. Res. Commun., 140, 273-279.

27. Chacon J.N., Jamieson G.R. and Sinclair R.S. Dye-sensitised photo-oxidation of the methyl and phenyl esters of oleic and linoleic acids (1987) Chem. Phys. Lipids., 43, 81-99.

28. A. Dailey, ed. Biosynthesis of Heme and Chlorophylls (1990), McGrow-Hill Publishing Company, N.-Y.

29. J. R. Bloomer and J.G. Straka, Porphyrin methabolism, The Liver: Biology and Pathobiology (I.M. Arias ed.), 2nd ed. (1988), Raven, N.-Y., p.p. 451-466.

30. Felix C.C., Reszka K. and Sealy R.C. Free radicals from photoreduction of hematoporphyrin in aqueous solution (1983) Photochem. Photobiol., 37,141-147.

31. J.M. Fernandez, M.D. Bilgin and L.I. Grossweiner, Singlet oxygen generation by photodynamic agents,/. Photochem. Photobiol BiBiol, 37(1997) 131-140.

32. Foote C.S. Definition of Type 1 and Type 2 photosensitized oxidation (1991) Photochem. Photobiol., 54, 659.

33. Gallegos ER, DeLeon Rodriguez I, Martinez Guzman LA, Perez Zapata AJ In vitro study of biosynthesis of protoporphyrin IX induced by delta-aminolevulinic acid in normal and cancerous cells of the human cervix. Arch Med Res 1999 May-Jun;30(3): 163-70.

34. Georgakoudi I, Foster TH Singlet oxygen- versus nonsinglet oxygen-mediated mechanisms of sensitizer photobleaching and their effects on photodynamic dosimetry. Photochem Photobiol 1998 Jun;67(6):612-25

35. Gibson S.L. and Hilf R. Photosensitization of mitochondrial cytochrom c oxidase by hematoporphyrin derivative and related porphyrins in vitro and in vivo (1983) Cancer Res., 43, 4191-4197.

36. Girotti A.W. Photosensitized oxidation of cholesterol in biological systems: reaction pathways, cytotoxic effects and defense mechanisms (1992) J. Photochem. Photobiol. B: Biol., 13, 105-118.

37. Girotti A.W. Photodynamic lipid peroxidation in biological systems (1990) Photochem. Photobiol., 51, 497-509.

38. Girotti A.W. Mechanisms of lipid peroxidation (1985) J. Free Rad. Biol. Med., 1, 87-95.

39. Girotti A.W. and Thomas J.P. Superoxide- and hydrogen peroxid-depdndent lipid peroxidation in intact and tritondespersed erythrocyte membranes (1984) Biochem. Biophys. Res. Commun., 118, 474-480.

40. Girotti A.W., Bachowski G.J. and Jordan J.E. Lipid peroxidation in erythrocyte membranes: cholesterol peroxide analyses in photosensitized and xanthine oxidase-catalysed reactions (1987) Lipids, 22, 401-408.

41. Gottschlich S, Lippert BM, Schade W, Werner JA Time-resolved fluorescence spectroscopy of a hematoporphyrin derivative used for photodynamic therapy of cancer. Res Commun Mol Pathol Pharmacol 1997 Nov;98(2):237-40

42. Hendrich C, Huttmann G, Lehnert C, Diddens H, Siebert WE Photodynamic laser therapy for rheumatoid arthritis. Cell culture studies and animal experiments. Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc 1997;5(l):58-63

43. Hilf R., Gibson S.L., Murant R.S., Ceckler T.L. and Briant R.C. Mitochondria in cancer cells as targets of photodynamic therapy (1987) Proc.Soc.Photo-opt.Instram. Eng., 847, 2-10.

44. Joris Kloek Akkermans W, Beijersbergen van Henegouwen. Derivatives of 5-aminolevulinic acid for photodynamic therapy: enzymatic conversion into protoporphyrin. J. Photochem Photobiol 1998 Jan 67:1 150-154, 1998.

45. Kessel D, Sun HH Enhanced responsiveness to photodynamic therapy-induced apoptosis after mitochondrial DNA depletion Photochem Photobiol 1999 Dec;70(6):937-40.

46. Lagerberg JW, Uberriegler KP, Krammer B, VanSteveninck J,Dubbelman TM Plasma membrane properties involved in the photodynamic efficacy of merocyanine 540 and tetrasulfonated aluminum phthalocyanine Photochem Photobiol 2000 Mar;71(3):341-6.

47. Liang H, Do T, Kasravi S, Aurasteh P, Nguyen A, Huang A, Wang Z, Berns MW Chromosomes are target sites for photodynamic therapy as demonstrated by subcellular laser microirradiation. J Photochem Photobiol B 2000 Feb;54(2-3):175-84

48. J.C. Kennedy, R.H. Pottier and D.C. Pross, Photodynamic therapy with endogenous protoporphyrin IX: basic principles and present clinical experience, J. Photochem. Photobiol. B: Biol, (5(1990) 143-148.

49. Koren H, Alth G Photodynamic therapy in gynaecologic cancer. J Photochem Photobiol B 1996 Nov;36(2): 189-91.

50. Korytowski W, Girotti AW Singlet oxygen adducts of cholesterol: photogeneration and reductive turnover in membrane systems. Photochem Photobiol 1999 C)ct;70(4):484-9

51. Koller M.-E. and Romso J. Studies on the uptake of porphyrin by isolated mitochondria (1978) Biochim. Biophys. Acta, 503, 238-250.

52. Koller M.-E. and Romso J. Uptake of proptoporphyrin 9 by isolated rat liver mitochondria (1980) Biochim. J., 188, 329-335.

53. Gilbert Laustriat. Molecular mechanisms of photosensitisation. Biochimie, 68 (1986) 771-778.

54. P. Luppa, K. Jakob, W. Ehret, The production of porphyrins from delta-aminolevulinic acid by Haemophilus parainfluenzae., J. Med. Microbiol., 39 (1993) 262-267.

55. Maighen E. A. Molecular biology of Bacterial bioluminiscence (1991) Mcrobiological Reviews,Mar. P. 123-142.

56. Malz F.R. 1987. Chemische, physicalische und biologische Analysen zur Abwasser-untersuchung.//Abwassertechnik. V. 38.1.1. P. 11-13.

57. Mantel J., Freidin M., Bulich A.A., Perry H. 1983. The effect of radiation on bioluminescent bacteria: possible use of luminescent bacteria as a biological dosemeter.// Phys. in Medicine and Biol. V.28.1.5. P.599-602.

58. Malik, J. Hanania, Y. Nitzan. New trends in photobiology (invited review). Bactericidal effects of photoactivated porphyrins an alternative approach to antimicrobial drugs. J. Photochem. Photobiol. B. Biol., 5 (1990) 281-293.

59. Mc. Elroy W. D., Green A. Enzimatic propetyes of bacterial lusiferase// Arch. Biochem. Biophys. -1955. V. 56. 1. 240-255.

60. M. Merchat, G. Bertolini, P. Giacomini, A. Villanueva, G. Jori. Mesosubstituted cationic porphyrins as efficient photosensibilizers of Gram-positive and Gram-negative bacteria. J. Photochem. Photobiol. B. Biol., 32 (1996) 153-157.

61. Messmann H, Szeimies RM, Baumler W, Knuchel R, Zirngibl H, Scholmerich J, Holstege A Enhanced effectiveness of photodynamic therapy with laser light fractionation in patients with esophageal cancer. Endoscopy 1997 May;29(4):275-80.

62. Meulen F. M. K. Ibrahim. H.J. C. M Sterenborg, L. V. Alphen, A. Maikoe, J. Dankert. Photodynamic destruction of Haemophilus parainfluenzae by endogenously produced porphyrins. J. Photochem. Photobiol. B. Biol. 40 (1997).

63. Midden W.R., Dahl T.A., Hartman P.E. Cytotoxity but no mutagenecityin bacteria with externally generated singlet oxygen (1987) SPIE Vol. 847. New directions in Photodynamic Therapy.

64. Murant R.S., Gibson S.L. and Hilf R. Photosensitizing effects of Photofrin II on the site-selected mitochondrial enzymes adenylate kinase and monoamine oxidase (1987) Cancer Res, 47,4323-4328.

65. Nakamura T, Fukui H, Ishii Y, Fujita M, Hori K, Ejiri K, Ejiri M, Fujimori Shape-memory alloy loop snare for endoscopic photodynamic therapy of early gastric cancer. Endoscopy 2000 Aug;32(8):609-13.

66. Ne'eman Z, Ulitzer S, Branton D, J. W. Hastings// Membrane polypeptide co-induced with the bacterial bioluminescent system// J. Biol. Chem.-1977. V. 252. 14. 5150-5154.

67. Nir U, Ladan H, Malik Z. and Nitzan Y. In vivo effects of porphirins on bacterial DNA (1991) J. Photochem. Photobiol. B: Biol, 11, 295-306.

68. Y. Nitzan, M. Gutterman, Z Malik, B. Ehrenberg, Inactivation of Gram-negative bacteria by photosensitized porphyrins, J. Photochem. Photobiol. 55 (1992) 89-96.

69. Ofner JG, Bartl B, Konig S, Thumfart WF Photodynamic therapy in selected cases at the Ent Clinic. J Photochem Photobiol B 1996 Nov;36(2): 185-7.

70. Ofner JG, Schlögl H, Kostron H Unusual adverse reaction in a patient sensitized with Photosan 3. J Photochem Photobiol B 1996 Nov;36(2): 183-4.

71. Oldham TC, Phillips D. Triplet-state photophysics of aluminium phthalocyanine sensitizer in murine cancer cells. J Photochem Photobiol B 2000 Mar;55(l):16-9.

72. Orenstein A, Klein D, Kopolovic J, Winkler E, Malik Z, Keller N, Nitzan Y The use of porphyrins for eradication of Staphylococcus aureus in burn wound infections. Immunol Med Microbiol 1997 Dec;19(4):307-14.

73. Orenstein A, Kostenich G, Malik Z The kinetics of protoporphyrin fluorescence during ALA-PDT in human malignant skin tumors. Cancer Lett 1997 Dec 9;120(2):229-34.

74. Orth K, Russ D, Beck G, Ruck A, Beger HG Photochemotherapy of experimental colonic tumours with intra-tumorally applied methylene blue. Langenbecks Arch Surg 1998 Aug;383(3-4):276-81.

75. Piette J. Biological consequences associated with DNA oxidation mediated by singlet oxigen (1991) J. Photochem. Photobiol. B: Biol, 11, 241-260.

76. Radakovic-Fijan S, Rappersberger K, Tanew A, Honigsmann H, Ortel B Ultrastructural changes in PAM cells after photodynamic treatment with delta-aminolevulinic acid-induced porphyrins or photosan. J Invest Dermatol 1999 Mar;l 12(3):264-70.

77. Raev B.A., Chirkov Yu.Yu., Parkhomenko I.M. 1983. The effect of low doses of X-rays irradiation on cAMP level in Chinese hamster fibroblasts.// Experientia. V.38.1. 12. P. 1310-1311.

78. F. Ricchelli, Photophysical properties of porphyrins in biological membranes, J. Photochem. Photobiol. B:Biol., 29 {1995) 109-118.

79. Robinson DJ, de Bruijn HS, van der Veen N, Stringer MR, Brown SB, Star WM Protoporphyrin IX fluorescence photobleaching during ALA-mediated photodynamic therapy of UVB-induced tumors in hairless mouse skin. Photochem Photobiol 1999 Jan;69(l):61-70

80. Sassa S., Heme biosynthesis in eiythroid cells. In: Regulation of hemoglobin synthesis (1983), Elsevier, N.-Y, p.p. 359-383.

81. Sandberg S. and Romslo I. Porphyrin-sensitized photodynamic damage of isolated rat liver mitochondria (1980) Biochem. Biophys. Acta, 593, 187-195.

82. Schnitzhofer GM, Krammer B Photodynamic treatment and radiotherapy: combined effect on the colony-forming ability of V79 Chinese hamster fibroblasts. Cancer Lett 1996 Nov 12;108(l):93-99.

83. Smith L.L. Cholesterol Autoxidation (1981) Plenum, New York.

84. Strakhovskaya M. G., Shumarina A. O., Fraikin G. Ya., Rubin A. B., Endogenous porphyrin accumulation and photosensitisation in the yeast Saccaromices serevisiae in the present of 2,2-dipiridil. J. Photochem. Photobiol. B. Biol. 49 (1999) 18-22.

85. Szocs K, Gabor F, Csik G, Fidy J. Delta-Aminolevulinic acid-induced porphyrin synthesis and photodynamic inactivation of Escherichia coli. J Photochem Photobiol B 1999 May;50(l):8-17.

86. Terzis AJ, Dietze A, Bjerkvig R, Arnold H Effects of photodynamic therapy on glioma spheroids. Br J Neurosurg 1997 Jun;l 1(3): 196-205.

87. Ulitzur Sh.1991. The use of intact luminous bacteria in analitical chemistry, clinical microbiology and acute toxicity. In: Biotechnology: bridging research and applications. P. 79-87.

88. Uspenskii LV, Chistov LV, Kogan EA, Loshchenov VB, Ablitsov IuA, Rybin VK, Zavodnov Via, Shiktorov DI, Serbinenko NF, Semenova IG Endobronchial laser therapy in complex preoperative preparation of patients with lung diseases. Khirurgiia 2000;(2):38-40.

89. Uzdenskii AB, Zhavoronkova AA, Mironov AF, Kuz'min SG Study of the photodynamic effect of new photosensitizers ori the single neuron Izv Akad Nauk Ser Biol 2000 Mar-Apr;(2):230-8.

90. Verma A., Nye J.S. and Snyder S.H. Porphyrins are endogenous ligands for the mitochondrial (peripheral-type) benzodiazepin receptor (1987) Proc.Natl.Acad.Sei. U.S.A., 84, 2256-2260.

91. G. A. Wagnieres, W.M. Star and B.C. Wilson, In vivo fluorescence spectroscopy and imaging for oncological applications, Photochem. Photobiol, 68 (1998) 603-632.

92. Yoshimura M, Namura S, Akamatsu H, Horio T Antimicrobial effects of phototherapy and photochemotherapy in vivo and in vitro. Br J Dermatol 1996 Oct;135(4):528-32.

93. Zarubina A.P., Yudina T.P., Danilov V.S., Spiridonov S.E. 1996.Some properties of a new Photorabdus luminescens strain ZM from Moldavian Heterorabditis sp. Russian Journal ofNematology. V.4.11. P.103-107.