Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние фотодинамического воздействия и его отдельных составляющих на морфофизиологические и биохимические показатели Drosophila melanogaster

ВАК РФ 03.00.01, Радиобиология

Автореферат диссертации по теме "Влияние фотодинамического воздействия и его отдельных составляющих на морфофизиологические и биохимические показатели Drosophila melanogaster"

На правах рукописи

КОЛТАКОВ Алексей Михайлович

ВЛИЯНИЕ ФОТОДИНАМИЧЕСКОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ И ЕГО ОТДЕЛЬНЫХ СОСТАВЛЯЮЩИХ НА МОРФОФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ И БИОХИМИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ ОКОвОРШЬА МЕЬАШвАвТЕК

(03.00.01 -Радиобиология)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ОБНИНСК-2006

Работа выполнена в ГОУ ВПО Калужском государственном педагогическом университете им. К.Э. Циолковского

Научный руководитель:

доктор биологических наук, академик РАЕН и ЛАН РФ, профессор Чернова Галина Васильевна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Петин Владислав Георгиевич

кандидат биологических наук, член - корреспондент РАЕН Козьмнн

Геннадий Васильевич

Ведущая организация:

ГНУ «Всероссийский научно - исследовательский институт сельскохозяйственной радиологии и агроэкологии Россельхозакадемии», г. Обнинск.

Защита состоится 27 июня 2006 года в 11.00 ч. на заседании диссертационного совета Д 001.011.01 при ГУ Медицинском радиологическом научном центре РАМН (249036, г. Обнинск Калужской обл., ул. Королева, д.4).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ Медицинского радиологического научного центра РАМН.

Автореферат разослан « 40 » мая 2006 года.

Ученый секретарь диссертационного совета

Палыга Г.Ф.

ffJLïf

Общая характеристика работы

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. Фотодинамические пропессы представляют собой сенсибилизированные хромофорами повреждения биологических структур видимым светом с потреблением молекулярного кислорода (Конев C.B., Волотовский И.Д., 1979) и являются разновидностью фотосенсибилизированных реакций (Черницкий Е.А., Воробей A.B., 1986). Фотодинамические (ФД) процессы широко распространены в природе и имеют большое значение для живых организмов (Румбалъ Я.В., 2000). Их изучение приобретает важное практическое значение в связи с тем, что в клинической практике получают широкое распространение методы направленного фотодинамического повреждения патологических образований, объединяемые под названием «фотодинамическая терапия» (ФДТ) (Плужников М.С. и др., 2002). ФДТ занимает важное место в современной медицине (Березин А.Н., Лощенов В.Б., 2002), широко применяется для лечения злокачественных опухолей различной локализации (Странадко Е.Ф., 1997), а также терапии ряда неонкологических заболеваний (Гейниц A.B. и др., 2002; Ершова Е.Ю. и др., 2002).

Однако данная методика нуждается в оптимизации (Каплан М.А. и др., 1999), т.к. недостаточная изученность некоторых ее аспектов приводит к снижению эффективности. Так, важным представляется более глубокое исследование системных эффектов ФД действия (ФДД) у сложных многоклеточных организмов. Недостаточно разработанным является вопрос об индивидуальной роли каждого из основных компонентов ФДТ в реализации конечного биологического ответа и, соответственно, применение оптимальных вариантов их сочетания, схем и режимов сеансов ФДТ. Кроме того, важный путь оптимизации метода заключается в подборе и апробации новых более эффективных безвредных фотосенсибилизаторов (Каплан М.А. и др., 1999; Пасс Х.И., 1993) и возможном сочетании ФДТ с другими видами терапий. Все эти исследования можно проводить с большей эффективностью при применении удобного модельного объекта или биологической тест-системы, поэтому большое значение приобретает экспериментальный поиск таких объектов и изучение на них закономерностей ФД действия.

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Целью настоящей диссертации являлось изучение ФД действия и влияния его отдельных компонентов на некоторые морфофизиологические и биохимические характеристики Drosophila melanogaster и определение возможностей использования данного вида как модельного объекта для оценки биологической эффективности различных видов ФДД. Для рекдедеодЦ ЦОД ^Ü^W^Plцели были решены следующие основные задачи: БИБЛИОТЕКА

С.-Петербург ОЭ

1. Изучить влияние ФД действия и его отдельных компонентов в дозах, применяемых в клинике, на показатели выживаемости и плодовитости ОгоБорЬПа те1аш^а51ег.

2. Исследовать результаты ФД воздействия и действия его отдельных компонентов на особей по соотношению полов в потомстве первого поколения и массе тела потомков.

3. Изучить влияние ФД действия на общее содержание РНК в теле имаго ОгозорИЛа те1апо£а<Лег.

4. Установить влияние половой принадлежности особей ОгочорЬ'Па те1апо£айег на степень их устойчивости к деструктивно-ингибирующему влиянию ФД действия и его составляющих.

5. Сравнить биологическую эффективность отдельных компонентов ФД действия и их сочетанного, комплексного влияния ва избранные показатели Е>го5орЫ1а melanogaster.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Предложена методика оценки биологической эффективности ФД действия на организменном и молекулярно-генетическом уровне организации через изучение его влияния на морфофизиологические и биохимические показатели БговорЬМа melanogaster. Получены конкретные данные о зависимости ряда параметров ПттеорЬПа те1апс^а51ег от численных значений компонентов ФДД при их отдельном или сочетанном действии. Установлен дифференцированный в зависимости от пола экспериментальной особи характер биологического ответа на влияние ФДД. Установлено влияние деструктивных ФД реакций на размножение и передачу наследственной информации у ОгозорЫ1а те!апо§айег.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. Предложенная в настоящей работе методика оценки биологической эффективности ФДД с использованием в качестве модельного объекта Е)го8орЫ1а текш^айег может быть использована для тестирования различных фотосенсибилизаторов перед их клинической проверкой, для экспериментального нахождения наиболее оптимальных вариантов сочетания компонентов ФДД, режимов и способов проведения сеансов фотодинамической терапии. Примененные в работе методы ФД воздействия могут быть использованы в сельском хозяйстве для борьбы с насекомыми -вредителями культурных растений. Полученные данные используются в ряде курсов при обучении студентов (специальность «Биология») в Калужском государственном педагогическом университете им. К.Э. Циолковского.

ПУБЛИКАЦИЯ РАБОТЫ. Результаты по материалам диссертации опубликованы в 8 научных работах.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Основные результаты исследований были доложены и обсуждены на Региональной научно-практической конференции «Проблемы преподавания безопасности жизнедеятельности

для учреждений образования» (Калуга, 2000 г.), на Межрегиональной научно-практической конференции «Река Ока - третье тысячелетие» (Калуга, 2001 г.), на научно-практической конференции российских ученых «Актуальные аспекты лазерной медицины» (Москва - Калуга, 2002), на второй Международной конференции «Неионизирующие электромагнитные излучения в биологии и медицине (БИО-ЭМИ 2002)» (Калуга, 2002 г.), на третьей Международной конференции «Неионизирующие электромагнитные излучения в биологии (БИО-ЭМИ 2005)» (Калуга, 2005 г.), на открытой научно - практической конференции преподавателей КПТУ им. К.Э. Циолковского (Калуга, 2006). Диссертация апробирована на расширенном заседании кафедры общей биологии КГПУ им. К.Э. Циолковского (2005 г.).

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ. Материал диссертации состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических предложений и списка литературы, включающего 208 наименований работ (в том числе 74 иностранных). Диссертация изложена на 150 страницах машинописного текста, включает 9 таблиц и 31 рисунок.

Содержание работы

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования служила Drosophila melanogaster (Drosophilidae, Díptera) линии Д-32 «дикий тип» - низкомутабильной линии, особи которой характеризуются следующим фенотипом: серое тело, красные глаза, нормальные крылья. Особи разводились в популяционных сосудах в термостатах при температуре 24,0 ± 0,1 °С на стандартной агаровой питательной среде (Медведев H.H., 1966).

Экспериментальное воздействие состояло из темнового действия фотосенсибилизатора (ФС), светового облучения, а также их сочетанного влияния. При темновом воздействии ФС определенное его количество, растворенное в заданном объеме стандартного физиологического раствора (0,9% р-р NaCl), добавлялось в питательную среду, на которой затем в термостате (t = 24,0 ± 0,1° С) в полной темноте в течение 96 ч содержались экспериментальные особи. В нашей работе применялись концентрации ФС в трофическом субстрате от 0,1 мг/мл до 52,5 мг/мл. В качестве фотосенсибилизатора использовался отечественный препарат «Фотогем» -производное гематопорфирина IX. Данный препарат разработан в 1992 году в МИТХТ им. М.В. Ломоносова под руководством А.Ф. Миронова, в 19921995 г.г. прошел клинические испытания и приказом Минздрава РФ № 47

от 10.02.1999 зарегистрирован в РФ и разрешен для медицинского применения и промышленного выпуска (Миронов А.Ф., 1999).

Исгочником светового облучения в нашей работе служила галогеновая лампа HALOPICA JCDRO/C, общей мощностью 50 Вт, снабженная интерференционным светофильтром ATO 1 - 630 (X - 633 -t 15 нм), энергетическая экспозиция излучения с заданной длиной волны 0,300 Вт/см2 (на расстоянии 10 см от источника). При данной интенсивности излучения экспозиционная доза, действию которой подвергается биообъект, рассчитывается по формуле:

N» t D - экспозиционная доза облучения, Дж/см2;

D= -, где N-мощность излучения, Вт

S t - время облучения, с;

S - площадь облучаемой поверхности, см2.

Тотальному облучению подвергались предварительно

наркотизированные диэтиловым эфиром особи с расстояния 10 см на дне чистой сухой чашки Петри с вентральной стороны. Применялись экспозиционные дозы облучения от 18.0 до 350,1 Дж/см2. Комплексное ФД действие осуществлялось путем последовательного применения темнового действия ФС и облучения. Все варианты экспериментального воздействия проводились в сильно затемненной лаборатории (значение освещенности, измеряемое люксометром Ю116, составляло не более 4 люкс) Контрольные особи Drosophila melanogaster подвергались аналогичным манипуляциям, но без воздействия ФС и облучения.

В качестве основных критериев анализа экспериментального воздействия использовались такие морфофизиологические показатели, как общая выживаемость (W), выживаемость самок (Wf) и самцов (Wm), плодовитость (F), оценивавшаяся по количеству вылетевших имаго F1; соотношение полов среди Fi-особей (отношение числа Ррсамцов к числу Fi-самок имаго), масса тела F,-oco6eK имаго (ш), а также биохимический показатель общего содержания РНК в теле РР-особей имаго.

Оценка выживаемости опытных особей проводилась по истечении 96 ч (4 сут) после воздействия, оценка плодовитости РР-особей, соотношения полов F,-особей и массы тела - на уровне анализа имаго.

При изучении влияния указанных экспериментальных факторов на выживаемость количество особей в одной повторности составляло 100 (50 S: 50 $), число повторностей в одном варианте опыта - 20 (такое же в контроле). Анализ общей выживаемости производился путем визуального подсчета количества выживших особей Drosophila melanogaster, при этом одновременно определялась раздельная выживаемость самок и самцов по отношению выживших особей к их исходному числу. Далее из каждой повторности отбиралось по 8 выживших особей (4 4 $), которые

пересаживались на свежий трофический субстрат и выдерживались на нем 24 ч, после чего удалялись. Остальные особи устранялись из эксперимента. Пробирки с отложенными РР-особями яйцами хранились в термостате ТС 80 M при температуре 24,0 ± 0,1° С до начала массового вылета особей имаго F^ Путем подсчета общего количества выживших Fi-особей определялась плодовитость (F) непосредственно подвергнутых экспериментальному воздействию особей родительского поколения, а также оценивалось соотношение полов среди F]-особей. Кроме того, определялась масса тела вылетевших Fr особей имаго, путем взвешивания на аналитических весах BJIP - 200 Г после предварительной наркотизации.

Показатель общего содержания РНК в теле РР-особей имаго определялся по методу Шмидта-Тангаузера с использованием двухволновой спектрофотометрии (Филиппович Ю.Б. и др., 1982; Алешина Т.Е., 2001). Производилось измерение специфического поглощения растворами нуклеиновых кислот УФ излучения за счет содержащихся в РНК азотистых оснований. Для этого измерялась оптическая плотность полученных при обработке модельного объекта растворов при различных длинах волн УФ излучения, и рассчитывалось содержание РНК в единице массы пробы.

Полученные результаты подвергались статистической обработке в программе «Microsoft Excel - 2003» на ПЭВМ. Использовались параметрические t-критерий Стьюдента и критерий %2 (Лакин Г.Ф., 1990).

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Влияние ФДД и его отдельных компонентов на выживаемость (жизнеспособность) Drosophila melanogaster

Важнейшим критерием анализа действия экспериментальных факторов на организм модельного объекта в нашей работе являлась выживаемость особей Drosophila melanogaster. Это связано с тем, что главной составляющей лечебного эффекта ФДТ является летальное ФД воздействие, вызывающее гибель клеток патологических очагов (Пасс Х.И., 1993; Плужников М.С. и др., 2002; Исаев В.М. и др., 2002). В результате проведенных исследований установлено, что действие отдельных компонентов ФДД (темнового действия ФС и облучения красным светом (633 ± 15 нм)) во всем диапазоне применявшихся концентраций и доз не оказывает достоверного влияния на показатель выживаемости Drosophila melanogaster. При применении сочетанного действия указанных компонентов, выражавшегося в совместном влиянии концентраций 0,1 мг/мл и доз облучения 18,0 - 150,0 Дж/см2 и 1,1 мг/мл с дозами облучения также от 18,0 Дж/см2 до 150,0 Дж/см2 установлено, что ни в одном из указанных вариантов опыта не наблюдалось достоверных различий выживаемости между подопытными и контрольными особями дрозофилы.

Однако при увеличении концентрации фотосенсибилизатора и более значительных дозах облучения зафиксирован выраженный летальный эффект. Так, в серии опытов с использованием постоянной концентрации ФС «Фотогем» в трофическом субстрате 5.2 мг/мл для дозы облучения 54,0 Дж/см2 зафиксировано уменьшение исследуемого показателя до 84,0% к уровню контроля (Р ^ 0,001), для максимальной в серии экспозиционной дозы 200,1 Дж/см2 - до 73,9% от контрольного уровня (Р < 0,001). В следующей экспериментальной серии с использованием постоянной концентрации ФС «Фотогем» в питательной среде 8,4 мг/мл в сочетании с дозой красного света 54,00 Дж/см2 зафиксировано статистически значимое снижение выживаемости особей до 79,5% по отношению к контролю (Р < 0,001), при повышении дозы излучения до 114,0 Дж/см2 - до 68,9% от аналогичного показателя контрольных (Р < 0,001), а при использовании экспозиционной дозы 200,1 Дж/см2 - до 59,5% от уровня контроля (Р <0,001). Таким образом, в нашей работе установлена тенденция увеличения летального действия ФДД при повышении дозы излучения в сочетании с постоянной концентрацией ФС.

При использовании более значительных концентраций фо! «сенсибилизатора в питательной среде 11,5 - 26,2 мг/мл также было зафиксировано снижение выживаемости Drosophila melanogaster. При этом анализ результатов всех проведенных экспериментов позволяет сделать вывод, что летальный эффект ФДД может увеличиться при возрастании значения обоих его компонентов. Так, в сочетании с концентрацией «Фотогема» в трофическом субстрате 11,5 мг/мл статистически значимое уменьшение выживаемости особей наблюдалось уже при применении дозы облучения 36,0 Дж/см2 и достигало величины 90,5% от контроля (Р < 0,05). При исследовании совместно с той же концентрацией ФС дозы облучения 54,0 Дж/см2 жизнеспособность подопытных особей дрозофилы составляет 75,5% от контрольной (Р < 0,001), при экспозиционной дозе 114,0 Дж/см2 она снижается до 57,6% от контроля (Р < 0,001). При дозе облучения 150,0 Дж/см2 выживаемость составляет 50,2% от уровня контроля, т.е. действие данного сочетания компонентов ФДД на модельный объект фактически эквивалентно влиянию «полулетальной дозы» LD50 какого-либо токсического химического соединения.

Еще более значительные изменения исследуемого показателя зафиксированы в нашей работе при использовании максимальных концентраций «Фотогема» в трофическом субстрате. Так, при действии на экспериментальных особей Drosophila melanogaster ФС в концентрации 21,0 мг/мл совместно с дозой облучения 36,0 Дж/см2 их выживаемость снижалась до 79,6% от контроля (Р < 0,001), с дозой облучения 54,0 Дж/см2 - до 62,9% от контрольных значений (Р < 0,001), при повышении дозы излучения до 150,0 Дж/см2 она уменьшается до 12,7% от уровня контроля (Р < 0,001), а при использовании максимальной из применявшихся нами

*

экспозиционной дозы облучения 350,1 Дж/см2 значение выживаемости подопытных особей составляло 8,0% от контроля (Р < 0,001).

Максимальный летальный эффект ФДД в нашей работе установлен при применении наибольшей концентрации ФС «Фотогем» 26,2 мг/мл. При совместном действии с ней излучения в дозе 36,0 Дж/см2 наблюдалось угнетение выживаемости подопытных особей до 70,7% от уровня контроля (Р < 0,001), при дозе облучения 54,0 Дж/см2 - до 43,0% от контроля (Р < 0,001), при дозе облучения 84,0 Дж/см2 - до уровня 13,8% к контролю (Р < 0,001), и при использовании дозы облучения 114,0 Дж/см2 была зафиксирована абсолютная летальность (Р < 0,001). Результаты исследований показаны на рис. 1.

ГО^Ч-ТПООООО т-А<ЛЮ*.ЛО<ПОи> Г (Ч N М С)

Доза облучения, Дж/см2

Рис. 1. Показатели выживаемости экспериментальных особей

ОгозорИИа melanogaster при разных вариантах сочетания компонентов

ФДД.

Примечание- здесь и далее различия достоверны при * - Р<0,05; ** -Р<0,01: ***-Р<0,001.

Таким образом, полученные данные убедительно свидетельствуют, что ФДД с указанными численными значениями двух основных компонентов

приводят к обусловленной ФД реакциями гибели модельного объекта. При этом при определенной величине интенсивности совместно действующих факторов (концентрация «Фотогема» 26,2 мг/мл и доза облучения 114,0 Дж/см2) наблюдается 100% - ная гибель всех особей экспериментальной популяции. Поэтому можно констатировать, что ФД действие в дозах из диапазона применяемых в клинической практике, способно приводить к летальности у сложных многоклеточных организмов, не содержащих в своем составе злокачественных клеток. ФД механизм гибели особей модельного объекта подтверждается тем, что отдельное воздействие основных компонентов ФДД не вызывает достоверного снижения выживаемости. Этот факт согласуется с данными других авторов (Исаев В.М. и др., 2002), согласно которым каждый из указанных компонентов в отдельности не эффективен для клинического применения. Обращает на себя внимание, что повышение летального действия ФДД может достигаться увеличением и дозы облучения и концентрации ФС.

Таким образом, полученные данные позволяют предположить, что схема сеансов ФДТ может подвергаться оптимизации в части изменения вариантов сочетания основных компонентов, и Drosophila melanogaster может быть удобным модельным объектом для нахождения таких вариантов опытным путем. Целесообразность применения данного вида в качестве модельного объекта обусловлена сходством значений доз ФДД, вызывающих летальный эффект у Drosophila melanogaster и применяющихся в клинической практике, а также такими особенностями дрозофилы, как высокая скоросгь размножения, большая плодовитость, короткий срок онтогенеза (Медведев H.H., 1966; Полуэктова E.H., 1975).

Собственные результаты также демонстрируют, что половая принадлежность особей модельного объекта влияет на их выживаемость после ФДД. Установлено, что варианты сочетания компонентов ФДД, вызывающие достоверные незначительные снижения «общей» выживаемости (без учета половой принадлежности) не менее чем до уровня 73,9% от контроля (например, сочетание концентрации «Фотогема» 11,5 мг/мл с дозой 54,0 Дж/см2) или очень значительные уменьшения «общей» выживаемости менее чем до уровня 22,9% от контрольного не привадят к достоверным различиям жизнеспособности самцов и самок, тогда как варианты ФДД, снижающие общую выживаемость менее чем до уровня 73,9% от контрольных значений, но не менее чем до 22,9%, сопровождаются достоверными различиями, при чем при идентичном ФДД выживаемость самок выше. В каждой опытной серии наблюдалось и отсутствие достоверных различий по выживаемости полов в отдельных опытах, и их наличие в зависимости от величины общей выживаемости.

Можно констатировать, что различия в жизнеспособности полов при ФДД у дрозофилы зависят не от конкретных значений сочетания компонентов, а от степени ФДД, т.е. количества повреждающих ФД

реакций, инициированных в теле особей. В связи с этим становится возможным представить результаты отдельных опытов на сводном графике зависимости дифференциальной выживаемости дрозофилы от величины общей жизнеспособности, представленной на рис.2.

общая выживаемость особей дрозофилы, % от контроля

Рис. 2. Показатели дифференциальной выживаемости самцов и самок йгозорИИа тnelanogaster при различных значениях смертности после экспериментального ФД воздействия.

Влияние ФДД и его компонентов на плодовитость БговорЬиа те1а|^а81ег

При изучении влияния отдельных компонентов ФДД на плодовитость модельного объекта получены следующие данные. Темновое действие фотосенсибилизатора «Фотогем» в концентрациях в питательной среде 0,1 мг/мл - 36,7 мг/мл достоверного влияния на плодовитость не оказывает. При использовании более высоких значений концентрации ФС в трофическом субстрате установлено слабо выраженное угнетающее влияние на исследуемый показатель. Например, при концентрации ФС 42,0 мг/мл плодовитость экспериментальных особей составляет 87,5% от контрольного показателя (Р < 0,05), при концентрации «Фотогема» 47,5 мг/мл плодовитость снижается до 84,9% к контрольному уровню (Р <0,05), а при максимальном значении концентрации ФС 52,5

мг/мл плодовитость дрозофилы составляла 78,9% от уровня контроля (Р < 0,01). Все концентрации «Фотогема», приводящие к достоверному изменению изучаемого показателя, превышают значения, использованные в наших экспериментах в сочетании с облучением.

При воздействии на БгозорЬПа ше1апо£аз1ег облучением красным светом (X = 630 ± 15 нм) без сочетания с ФС установлено, что при применении доз облучения менее 200,1 Дж/см2 достоверных изменений плодовитости не наблюдается. Облучение экспериментальных особей в дозе 200,1 Дж/см2 приводит к снижению данного показателя до уровня 88,0% от контроля (Р < 0,05). При дозе 250,2 Дж/см2 плодовитость ОговорЫк те1апо§аз1ег снижалась до 83,4% от контрольных значений (Р < 0,01), при дозе облучения 300,0 Дж/см2 значение плодовитости составляло 77,0% от контрольного уровня (Р < 0,001), а при применении максимальной в наших

экспериментах дозы облучения 350,0 Дж/см2 -71,4% от контрольного (Р < 0,001). Таким образом, в отношении плодовитости видимое излучение красного диапазона обладает ингибирующим действием только при дозах 200,1 Дж/см2 и более.

При изучении влияния ФДД на плодовитость минимальная концентрация «Фотогема» в трофическом субстрате, при которой наблюдались достоверные изменения плодовитости, составляла 5,2 мг/мл. При совместном влиянии данной концентрации ФС и дозы облучения 54,0 Дж/см2 зафиксировано статистически значимое (Р < 0,01) снижение данного показателя до уровня 84,8% от контрольного. Усиление ФД воздействия на особей дрозофилы приводит к более значительному снижению плодовитости. Так, например, при сочетанном действии концентрации ФС 5,2 мг/мл и дозы облучения 114,0 Д ж/см2 плодовитость подопытных особей снижается до 76,3% к контрольному значению (Р < 0,001), а при увеличении дозы излучения до 200,1 Дж/см2 достигает 64,1% от контроля (Р < 0,001). Использование концентрации ФС 11,5 мг/мл при сочетании с дозой облучения 114,0 Дж/см2 приводит к снижению до 32,9%, а при дозе 200,1 Дж/см2 - до 22,5% от контроля (Р < 0,001).

При увеличении концентраций ФС и доз облучения нами зафиксированы сильные ингибирующие эффекты в отношении плодовитости, вплоть до полной потери экспериментальными особями способности к размножению. Снижение плодовитости дрозофилы до нулевых значений наблюдалось при разных вариантах сочетания компонентов ФДД, например, при совместном действии концентрации ФС 15,7 мг/мл и дозы облучения 200,1 Дж/см2 или при концентрации ФС 21,0 мг/мл и доз облучения 114,0 Дж/см2. Таким образом, ФДД оказывает ингибирующий эффект на показатель плодовитости Г)го5орЬПа melanogaster, и величина снижения плодовитости зависит от количества инициируемых в теле особей модельного объекта ФД процессов. Причинами указанных

изменений являются, по-видимому, ФД повреждения гамет и их предшественников, а также клеток органов и тканей, ответственных за нормальное протекание процессов размножения, в частности гаметогенеза, « оплодотворения, начальных стадий бластуляции у ОгоБорЬПа те1ало§а81ег

(Ноздрачев А.Д. и др., 1999). График, объединяющий результаты опытных серий, представлен на рис.3.

Доза облучения, Дж/см2

|--► ФС 5,25 мг/мл • ФС8.40 мг/мл

I - - ФС 11,55 мг/мл —.— ФС 15,75 мг/мл

Концентрация - • ФС21,00 мг/мл —•—ФС 26,25 мг/мл

I__[ •—ФС 26,25 мг/мл __^

Рис 3 Показатели зависимости плодовитости экспериментальных особей Ого$орЫ1а те1апо%а$1ег от экспозиционной дозы облучения при различных фиксированных концентрациях ФС в трофическом субстрате

Влияние ФДД и его отдельных компонентов на соотношение полов среди Ргособей имаго

Изучение действия экспериментальных факторов на показатель соотношения полов среди Р,-особей позволяет установить их действие на Процессы передачи и реализации наследственной информации, т к. данный параметр относится не к непосредственно подвергнутым опытному

воздействию особям Drosophila raelanogaster, а к их потомству в первом поколении. Установлено, что темновое воздействие ФС «Фотогем» во всем диапазоне использованных в нашей работе концентраций от 0,1 мг/мл до 52,5 мг/мл, а также облучение экспериментальных особей без взаимодействия с ФС в экспозиционных дозах от 18,0 Дж/см2 до 350,1 Дж/см2 не приводят к достоверным изменениям соотношения полов среди F'i-особей. Анализ собственных данных показывает, что разные варианты сочетания концентрации ФС и дозы облучения, оказывающие достоверное угнетающее действие на ряд морфофизиологических показателей модельною объекта, в частности выживаемость, приводят также к статистически значимому изменению соотношения полов. Во всех опытах это изменение выражалось в снижении численности Fi-самцов имаго в сравнении с F]-самками. Величина изменения исследуемого показателя коррелировала с величиной снижения выживаемости дрозофилы

Например, сочетание концентрации ФС 5,2 мг/мл и дозы облучения 200,1 Дж/см вызывало снижение жизнеспособности подопытных особей до 73,9% к контрольному значению (Р < 0,001), а концентрации ФС 8,40 мг/мл и дозы облучения 84,0 Дж/см2 до 73,7% от контрольного уровня (Р < 0,001). Численность самцов Fi в этих опытах составляла 80,9% от числа самок (Р < 0,01) и 81,7% соответственно. Другая закономерность замечалась в том, что отношение числа Fi-самцов и FrcaMOK снижалось при усилении степени ФДД. Например, при сочетании концентрации «Фотогема» 11,7 мг/мл с дозой облучения 84,0 Дж/см2 число FL-самцов снижалось до 70,8% от контроля (Р < 0,001), а с дозой 150,0 Дж/см2- до 54,5% от числа Fi-самок (Р < 0,001). Сходные зависимости наблюдались и в других опытных сериях. Характерно, что во всех опытах, где наблюдалось достоверное изменение плодовитости экспериментальных особей, было зафиксировано значимое снижение числа Fi-самцов по отношению к числу Fj-самок. Это позволяет предположить, что ФДД в повреждающих дозах нарушает общие процессы размножения, что приводит к подавлению жизнеспособности Froco6efl имаго. При этом число F,-самок, в силу их большей устойчивости к внешнему воздействию, снижается в меньшей степени.

Влияние ФДД и его компонентов на показатели массы тела F,-особей имаго

Важным критерием анализа ФД воздействия в нашей работе являлось его влияние на массу тела F)-особей имаго. Согласно (Смирнов B.C., 1979). этот параметр является интегральным показателем интенсивности и направленности протекающих в организме биохимических реакций.

Анализ полученных данных показывает, что ФДД в определенном диапазоне оказывает ингибирующее влияние на массу тела Fi-особей имаго. Во всех проведенных экспериментах достоверного повышения массы тела

не было зафиксировано. Статистически значимое уменьшение исследуемого показателя установлено при применении концентраций «Фотогема» в трофическом субстрате 5,2 мг/мл - 26,2 мг/мл в сочетании с дозами облучения в разных экспериментальных сериях 36,0 - 250,1 Дж/см2. Так, например, при использовании различных доз облучения совместно с концентрацией ФС 5,2 мг/мл установлено, что при дозе 54,0 Дж/см2 масса тела Р|-самок достоверно снижается до 84,8% от контроля (Р < 0,01), а Рг самцов соответственно до 71,1% (Р < 0,001), при дозе 150,0 Дж/см2 -соответственно до 74,1% (Р < 0,001) и до 56,6% от уровня контроля (Р < 0,001) При применении более значительной концентрации ФС 11,5 мг/мл зафиксировано, что при той же дозе облучения 54,0 Дж/см2 масса тела Р,-самок снижалась до 76,9% к контрольному значению (Р < 0,001), т.е. ингибирующий эффект ФДД был выражен сильнее, а при использовании более значительной дозы облучения 150,0 Дж/см2 совместно с концентрацией «Фотогема» 11,5 мг/мл масса тела Ргсамок была снижена до 70,4% к контролю (Р < 0,001), а самцов - до 47,2% от контроля (Р < 0,001). Полученные результаты свидетельствуют, что снижение массы тела Рг особей имаго обусловлено ингибирующим влиянием ФД процесса на экспериментальных РР-особей. Это позволяет утверждать, что ФДД имеет пролонгированный эффект на морфофизиологические показатели ОговорЬйа melanogaster. Это зафиксировано также для других видов физического воздействия, например, ЭМИ КВЧ (Арсланов Т.А., 2002).

Исследование действия отдельных компонентов ФДД на параметр массы тела р!-особей имаго Е>гозорЫ1а melanogaster в нашей работе показало, что они в определенных диапазонах значений оказывают на него незначительно выраженное ингибирующее влияние. При этом максимальная величина изменения показателя массы тела даже в случаях отдельного применения наибольших из использованных в нашей работе концентраций ФС «Фотогем» и доз облучения была значительно меньшей, чем при их совместном применении в меньших дозах. Это хорошо согласуется с данными других авторов о большей эффективности совместного действия компонентов ФДД (Пасс ХИ., 1993; Исаев В.М. и др., 2002). Изучение темнового действия ФС «Фотогем» на массу тела Р,-особей в нашей работе показало, что концентрации ФС в трофическом субстрате 0,1 - 42,0 мг/мл не оказывают достоверного влияния на этот показатель. Только при увеличении концентрации «Фотогема» до 47,2 мг/мл наблюдалось статистически значимое снижение массы тела Р,-самок имаго до 91,1% от контроля (Р < 0,05) и Р,-самцов - до 89,2% от контрольных значений (Р < 0,01). Применение максимальной среди использованных нами концентраций ФС 52,5 мг/мл приводило к достоверному снижению массы тела Ргсамок до уровня 85,7% (Р < 0,01) и Р,-самцов - до 86,6% (Р < 0.01) от контрольного. При этом применение концентраций «Фотогема» в диапазоне 1,05 - 26,2 мг/мл, которые использовались в нашей работе совместно с

разными дозами облучения, не приводило к снижению массы Ргособей, соответственно наблюдавшееся в опытах с ФДД уменьшение ее у ОгоБорЬИа те!апо§аз1ег не было связано с темновой токсичностью.

Облучение РР-особей ОговорЬИа те1апо§а$1ег красным светом в экспозиционных дозах до 250,1 Дж/см2 включительно, согласно собственным данным, не приводит к статистически значимым изменениям массы тела Ерособей, в то время как при сочетанием действии с ФС эти дозы приводили к значительному снижению массы. При повышении доз облучения чафиксировано достоверное снижение данного показателя, величина которого положительно коррелировала с экспозиционной дозой.

Так, при облучении в дозе 300,0 Дж/см2 зафиксировано снижение массы тела Ргсамцов имаго до 85,2% от контрольного показателя (Р < 0,01), массы тела Ргсамок до 87,3% (Р<0,05). При воздействии дозой 350,1 Дж/см2 масса тела Р,-самцов снижалась значительней, чем в предыдущих опытах, до уровня 78,2% от контроля (Р < 0,001), масса тела Ррсамок тоже достоверно уменьшилась, но в меньшей степени, и составляла 84,1% от контроля (Р < 0,01). Результаты опытов представлены в таблице 1.

Таблица 1.

Показатели массы тела П - особей имаго Ого$ор1и1а melanogaster

потомков особей, непосредственно подвергнутых облучению __красным светом к = 633 нм _

JV? опыта Доза облучении, Дж/см2 Средняя масса тела Кгособей имаго на 1 повторность, М± т, мг Средняя масса тела Р,особей в % к контролю

Опьп Контроль самки самцы

самки самцы самки самцы

1 18,0 1,37 * 0,02 0,88 ±0,01 1,36 ±0,05 0,86 ± 0,03 100,7 102,3

2 36,0 1,34 ±0,02 0,89 ±0,01 1,38 ±0,04 0,88 ±0,02 97 1 101,1

3 54,0 1,33 ±0,01 0,91 ±0,01 1,35 ±0,04 0,89 ±0,02 98,5 102,3

4 84,0 1,35 ±0,03 0,85 ±0,02 138 ±0,05 0,87 ±0,01 97,8 97,7

5 114,0 138 ±0,05 0,84 ±0,03 139 ±0,05 0,88 ±0,03 99,3 95,5

6 150,0 1,35 ±0,04 0,90 ±0,04 1,37 ±0,05 0,88 ±0,03 98,5 102,3

7 200,1 131 ± 0,03 0,84 ±0,03 134 ±0,04 0,84 ± 0,04 97,8 96,8

8 250 2 1,41 ±0,02 0,92 ±0,01 1,39 ±0,04 0,90 ±0,03 101,4 102,2

9 300,0 * 1,37 ±0,01 ** 0,77 ±0,01 1,56 ±0,04 0,90 ±0,04 87,3 85,2

10 350,1 ** 1,20 ±0,02 *** 0,72 ±0,01 1,43 ±0,01 0,92 ±0,03 84,1 78,2

Экспозиционные дозы 300,0 Дж/см2 и 350,1 Дж/см2 при применении совместно с ФС приводили к снижению плодовитости РР - особей до нуля. Механизм ингибирующего влияния больших доз красного света на морфофизиологические показатели Drosophila melanogaster по-видимому является фотодинамическим, с участием какого-то эндогенного фотосенсибилизатора. Сходные выводы делаются в работах (Рубин А.Б., Фрайкин Г.Я., 1987; Беленикина Н.С., 1994).

Влияние ФДД на общее содержание РНК в теле Drosophila melanogaster

Изучение в нашей работе показателя общего содержания РНК в теле особей позволяло выявлять эффекты ФДД на молекулярно-генетическом уровне организации. Всего в экспериментах по определению общего содержания РНК в теле Drosophila melanogaster использовалось 6 различных вариантов сочетаний компонентов ФДД. Каждое из этих сочетаний приводило к снижению выживаемости особей модельного объекта до определенной величины, являющейся удобным ориентиром сопоставления результатов по содержанию РНК и выживаемости на всем диапазоне доз ФДД. Результаты эксперимента представлены в таблице 2.

Таблица 2.

Общее содержание РНК в теле особей при ФДД с разными вариантами сочетания концентрации ФС «Фотогем» дозы облучения

к» п/п Концентрация ФС в трофическом субстрате, мг/мл Доза облучения, Дж/см2 Общее содержание РНК в теле Drosophila melanogaster, Mi /мл * 10"', самцы Общее содержание РНК, %к контролю, самцы Общее содержание РНК в теле Drosophila melanogaster мг/мл * 10л, самки Общее содержание РНК, •/. к контролю самки Выживаемость полов при данном сочетании компонентов ФДД, % к контролю

самки самцы

1 контроль контроль 6,63 ± 0,07 100,0 7,47 ± 0,08 100,0 100,0 100,0

2 5,2 36,0 6,54 ±0,05 98,6 7,25 ± 0,05 97,2 94,9 97,3

3 11,5 36,0 ** 4,99 ±0,03 75,3 6,52 ±0,06 87,3 91,0 90,0

4 115 150,0 *** 3,40 ±0,05 51,3 ««* 5,37 ±0,06 71,9 *** 54,3 *** 46,!

5 15,7 150,0 *** 2,85 ± 0,04 43,0 *** 3,79 ±0,05 50,7 *** 22,2 *** 23,6

6 21,0 300,0 *** 2,68 ± 0,05 40,4 *** 3,40 ±0,06 45,5 **« 6,1 *** 4,9

7 26,2 114,0 **« 2,77 ±0,06 41,8 *** 3,35 ± 0,07 44,8 »** 0.0 *** 0,0

Приведенные данные свидетельствуют, что ФДЦ в повреждающих дозах приводит к уменьшению общего содержания РНК в теле дрозофилы. Снижение содержания РНК у Drosophila melanogaster наблюдалось при других видах опытного воздействия (Арсланов Т.А., 2002) и это, по-видимому, объясняется тем, что изменение транскрипции РНК, (Кузьмичев В.Е., 1997), является первичной фазой биологического ответа организмов на действие факторов внешней среды.

Выводы

1. Фото динамическое действие снижает выживаемость Drosophila melanogaster. При этом гибель 50% (LD59) экспериментальных особей наблюдалась при сочетании концентрации фотосенсибилизатора «Фотогем» в трофическом субстраге 11,5 мг/мл и дозы облучения (Л =- 633 ± 15 нм) 150,0 Дж/см2, а абсолютный летальный эффект при сочетании концентрации «Фотогема» 26,2 мг/мл и дозы облучения 114,0 Дж/см2.

2. Drosophila melanogaster может использоваться как удобный и доступный тест - объект для оценки деструктивного эффекта разных доз, режимов и способов фотодинамического действия (ФДД). сравнения эффективности различных фотосенсибилизаторов, т.к. согласно установленным дозовым зависимостям значительная смертность у дрозофилы возникает при использовании доз облучения и концентраций сенсибилизатора в диапазоне (36 - 350 Дж/см2), сходном с используемым в клинической практике.

3. Выживаемость особей Drosophila melanogaster в определенном диапазоне доз фотодинамического действия, вызывающем снижение общей выживаемости до 70,3% - 22,9% от контрольного уровня, зависит от их половой принадлежности. При этом выживаемость самок при равных дозах воздействия всегда выше. Таким образом, можно сделать определенные предположения о механизме влияния фотодинамического действия, и о том какие половые различия обеспечивают большую резистентность самок к его повреждающему эффекту.

4. Фотодинамическое действие на Drosophila melanogaster угнетающе влияет на ряд морфофизиологических показателей их потомков в первом поколении - Fi - особей - численность популяции, массу тела, соотношение полов. Степень угнетения каждого из данньгх показателей пропорциональна дозе фотодинамического действия. Данные факты демонстрируют, что фотодинамическое действие оказывает влияние на органы и структуры, ответственные за передачу и реализацию наследственной информации. Это может способствовать уточнению его механизмов и свидетельствует о наличии у него отдаленных последствий.

I !

t

I

5. Фото динамическое действие приводит к дозозависимому снижению общего содержания РНК в теле Drosophila melanogaster, предшествующего по времени угнетению морфофизиологических показателей. Это позволяет предположить, что одним из его последствий у дрозофилы является фотодинамическая деструкция молекул РНК, содержащихся в цитоплазме и снижение общего биосинтеза белка. Таким образом, биохимические показатели могут быть удобным индикатором степени деструктивного влияния фотодинамического действия.

6. Отдельные компоненты фотодинамического действия - темновое влияние фотосенсибилизатора в концентрациях более 42,0 мг/мл и облучение красным светом (А = 633 ± 15 нм) в экспозиционных дозах более 200 Дж/см2 оказывают слабое угнетающее влияние только на показатели плодовитости и массы тела Drosophila melanogaster, но не на выживаемость и соотношение полов среди F! - особей.

7. Совместное, комплексное влияние компонентов фотодинамического действия приводит к значительно более выраженному угнетению морфофизиологических показателей Drosophila melanogaster, чем их отдельное воздействие. Это свидетельствует о том, что снижение исследуемых показателей дрозофилы в экспериментах с использованием комплексного действия указанных компонентов обусловлено именно фотодинамическими процессами.

Практические предложения

1. Предложенная методика с применением Drosophila melanogaster как модельного объекта может быть использована для сравнения эффективности разных ФС, тестирования различных схем и режимов ФДД.

2. Полученные данные могут использоваться в учебных курсах «Основы радиобиологии», «Сельскохозяйственная радиология», «Основы фотобиологии», а также специальных курсах и практикумах при обучении по специальности «Биология» и «Радиобиология».

3. Предложенные методы ФД действия могут быть использованы в сельском хозяйстве для борьбы с насекомыми-вредителями сельскохозяйственных культур.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Чернова Г.В., Колтаков A.M., Бабкина В.В. Некоторые результаты изучения воздействия компонентов фотодинамической терапии на морфофизиологические признаки Drosophila melanogaster // Проблемы

преподавания безопасности жизнедеятельности для учреждений образования. Тезисы докладов региональной научно-практической конференции. - Калуга, 2000. - С. 48-50.

2. Чернова Г.В., Колтаков A.M., Бабкина В.В. Изучение комплексного характера воздействия компонентов фотодинамической терапии на морфофизиологическис признаки Drosophila melanogaster // Изучение природы бассейна реки Оки. Тезисы докладов Межрегиональной научно-практической конференции «Река Ока - третье тысячелетие». - Калуга, 2001.-С. 223-227.

3. Каплан М.А., Чернова Г.В., Желнина Н.В., Колтаков A.M., Бабкина В.В. Изучение биологической эффективности низкоинтенсивного лазерного излучения и компонентов фотодинамической терапии на некоторые морфофизиологические признаки Drosophila melanogaster // Актуальные аспекты лазерной медицины. Материалы научно-практической конференции российских ученых. - Москва - Калуга, 2002. - С. 339-341.

4. Чернова Г.В., Каплан М.А., Колтаков A.M., Эндебера О.П. Влияние компонентов фо го динамической терапии и их комплексного воздействия на признаки Drosophila melanogaster // Неионизирующие электромагнитные излучения в биологии и медицине (БИО-ЭМИ-2002). Труды международной конференции. - Калуга, 2002. - С. 10-15.

5. Колтаков A.M., Каплан М.А., Чернова Г.В. Сравнение угнетающего влияния отдельной составляющей ФДТ - красного света (633 нм) и комплексного фотодинамического воздействия на морфологические и физиологические параметры Drosophila melanogaster II Неионизирующие электромагнитные излучения в биологии и медицине (БИО-ЭМИ-2002). Труды международной конференции. - Калуга, 2002. - С. 16-22.

6. Чернова Г.В., Эндебера О.П., Колтаков A.M., Каплан М.А. Изменения некоторых морфофизиологических показателей насекомых под действием неионизирующих электромагнитных излучений // Труды регионального конкурса научных проектов в области естественных наук. - Вып.4. -Калуга: Эйдос, 2003. - С. 186 - 190.

7. Чернова Г.В., Эндебера О.П., Каплан М.А., Беденко В.П., Полонская Г.Н., Колтаков A.M. Модификация некоторых показателей живых организмов неионизирующими электромагнитными излучениями II Труды регионального конкурса научных проектов в области естественных наук. -Вып.6. - Калуга: Полиграф - Информ, 2004. - С. 304 - 316.

8. Колтаков A.M., Чернова Г.В., Каплан М.А. Изучение влияния половой принадлежности экспериментальных особей Drosophila melanogaster на их выживаемость после повреждающего фотодинамического воздействия И Сб. Неионизирующие электромагнитные излучения в биологии и медицине (БИО-ЭМИ-2005) Труды III межд. конф., Калуга, Россия 5-7 октября 2005,- Калуга: Изд-во КГПУ им. К. Э. Циолковского. - 2005. - С. 152 - 158.

Подписано в печать 02.05.2006. Формат 60x84/16. Бумага офсетная. Печать трафаретная. Усл. печ. л 1,5. Тираж 100 экз. Зак № 25.

Отпечатано АП «Полиграфия», г. Калуга, ул. Тульская 13а Лиц. ПЛД № 42-29 от 23.12.99

/тг

mi 1

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Колтаков, Алексей Михайлович

Введение.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. ф 1.1 Общая характеристика фотобиологических реакций, инициируемых видимым светом.

1.2 Деструктивные фотобиологические реакции. Фотосенсибилизированные процессы. Фотодинамическое действие видимого света.

1.3 Активные формы кислорода.

1.4 Фотодинамическое повреждение биомолекул клетки.

1.4.1 Повреждения белков.

1.4.2 Повреждения липидов.

1.4.3 Повреждения нуклеиновых кислот.

1.5. Прямое фотодинамическое повреждение клеточных органелл.

1.5.1. Повреждения ядра и наследственного аппарата.

• 1.6. Летальные и ингибирующие эффекты ФД воздействия на культивируемые клетки и на одноклеточные организмы.

1.7. Деструктивные ФД процессы в тканях и органах многоклеточных организмов. Летальные эффекты ФД воздействия на сложные многоклеточные организмы.

1.8. Метод ФДТ и его клиническое применение.

1.9. Влияние ФД действия на процессы реализации наследственной информации.

2.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1 Объекты исследования. 2.2. Характеристика применяемого воздействия и дозиметрия.

2.3.Методы исследования.

2.3.1. Измерение морфофизиологических признаков.

2.3.2. Определение общего содержания РНК.,.

2.4. Методы статистической обработки результатов.

3.РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1 Влияние ФДД на показатель выживаемости/смертности особей Drosophila melanogaster.

3.2 Влияние темнового воздействия ФС «Фотогем» и облучения красным светом (633±15 нм) на выживаемость Drosophila melanogaster.

3.3 Половые различия выживаемости особей Drosophila melanogaster, подвергнутых ФДД.

3.4 Влияние ФДД на показатели плодовитости Drosophila melanogaster.

3.5 Влияние темнового воздействия фотосенсибилизатора «Фотогем» на плодовитость Drosophila melanogaster.

3.6 Влияние облучения красным светом (633±15 нм) на плодовитость Drosophila melanogaster.

3.7 Влияние ФДД на соотношение полов в потомстве первого поколения Drosophila melanogaster.

3.8 Влияние отдельных компонентов ФДД на соотношение полов в потомстве первого поколения Drosophila melanogaster.

3.9 Влияние ФДД на массу тела (F] - особей) Drosophila melanogaster.

3.10 Влияние темнового воздействия ФС «Фотогем» на массу тела (Fj — особей) имаго Drosophila melanogaster.

3.11 Влияние облучения красным светом (633±15нм) на массу тела (Fj -особей) имаго Drosophila melanogaster.

-3.12 Влияние ФДД на содержание РНК в теле Drosophila melanogaster

4.0БСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

5. ВЫВОДЫ. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние фотодинамического воздействия и его отдельных составляющих на морфофизиологические и биохимические показатели Drosophila melanogaster"

Актуальность темы исследования:

Фотодинамические (ФД) процессы являются разновидностью фотобиологических процессов, протекающих с участием молекул фотосенсибилизатора (ФС). В ходе этих реакций происходит поглощение света молекулами хромофора-сенсибилизатора с последующей генерацией активного синглетного кислорода ('Ог), повреждающего биологические структуры (Конев, Волотовский, 1979). ФД процессы достаточно широко распространены в природе (Румбаль, 2000). Некоторые патологические состояния человека, например, различные виды порфирии и фотодерматозов, связаны с повышением уровня ФД процессов в организме из-за нарушений метаболизма или вредных внешних воздействий ( Идельсон, 1980).

Значение изучения закономерностей ФД процессов связано также с тем, что в клинической ' практике в последнее время прлучили широкое распространение методы направленного фотодинамического повреждения клеток, объединяемые под названием фотодинамическая терапия - ФДТ (Румбаль, 2000; Плужников и др., 2002). ФДТ является современным эффективным щадящим методом лечения злокачестренных опухолей различной локализации (Странадко и др., 2002), а также широко применяется для терапии ряда неонкологических заболеваний, например, гнойных, длительно незаживающих ран, трофических язв, псориаза, ревматоидного артрита и др. (Гейниц и др., 2002). Кроме того, ФД воздействие, лежащее в основе ФДТ, является базовым механизмом для метода флуоресцентной диагностики, также широко применяемой в клинической практике (Кулаев, Альмяшев, 1999; Велыиер и др., 1999; Шикунова и др., 2002). ФДТ является фотохимиотерапией, т.к. лечебный эффект осуществляется за счет повреждающего ФД действия на неопластические клетки двух основных компонентов - светового излучения и фотосенсибилизатора (ФС), которые при взаимодействии инициируют свободно-радикальные фотохимические реакции, вызывающие деструкцию клеток (Пасс, 1993). Основным результатом и целью применения ФДТ является интерфазная гибель клеток патологических очагов или их репродуктивная гибель.

Следовательно, среди всех возможных биологических эффектов фотодинамического действия (ФДД) основное практическое значение приобретает изучение его деструктивно-ингибирующего влияния на основные морфофизиологические показатели объекта. Такое изучение даёт возможность более глубокого понимания механизмов ФДД, закономерностей его влияния на основные показатели на разных уровнях организации. Важное значение для возможной оптимизации схем и методов ФДТ имеет оценка удельного веса каждого из двух компонентов ФДТ в конечном биологическом эффекте. Актуальной проблемой представлялось также изучение фотоповреждающих (ФП) эффектов ФДТ с использованием доступного и хорошо изученного в генетическом отношении объекта — Drosophila melanogaster. Предполагается, что именно эти его особенности позволят в сравнительно короткие сроки исследовать механизмы и закономерности действия ФДТ ца разных уровнях организации живого.

Цели и задачи исследования:

Целью настоящей диссертации является изучение влияния комплексного ФД воздействия и его отдельных компонентов на ряд морфофизиологических и биохимических показателей Drosophila melanogaster, определение возможности использования данного биологического вида в качестве модельного тест - объекта для сравнительной оценки эффективности различных фотосенсибилизаторов и вариантов сочетаний компонентов ФДД. Для реализации поставленной цели были решены следующие основные задачи:

1. Изучение комплексного ФД действия и действия его отдельных компонентов в дозах, входящих в диапазон используемых в клинической практике на организм Drosophila melanogaster с использованием критерия выживаемости (жизнеспособности) и на показатель плодовитости экспериментальных особей.

2. Исследования результатов ФД действия и действия его отдельных компонентов на соотношение полов в потомстве подвергнутых воздействию особей и их массу тела.

3. Изучение влияния ФД действия на общее содержание РНК в теле имаго Drosophila melanogaster.

4. Сравнение биологической эффективности отдельных компонентов ФДД и их сочетанного действия, выраженной в величинах изменения выбранных критериев анализа.

5. Оценка влияния половых различий экспериментальных особей Drosophila melanogaster на степень проявления изучаемых в работе признаков выживаемости, массы тела (Fi - особей), общего содержания РНК под влиянием ФДД и его отдельных компонентов.

Научная новизна:

Предложена методика оценки биологической эффективности ФД воздействия на организменном и молекулярно - генетическом уровне ррганизации путем изучения его влияния на ряд морфофизиологических и биохимических признаков Drosophila melanogaster. Произведено сравнение роли каждого отдельного компонента ФДД в реализации конечного биологического эффекта. Установлено влияние половой принадлежности экспериментальных особей на степень резистентности к повреждающему (ингибирующему) ФД воздействию. Установлено влияние деструктивного ФД действия на процессы размножения, передачи и реализации наследственной информации у многоклеточного эукариотического организма.

Впервые изучено:

1. Дозовые зависимости влияния ФДД с ФС «Фотогем» и его отдельных компонентов на показатель выживаемости (жизнеспособности) Drosophila melanogaster.

2. Влияние различных доз ФДД, а также красного света (633±15 нм, 0,3 л

Вт/см ) и темнового действия разных концентраций фотосенсибилизатора «Фотогем» на показатели плодовитости, соотношения полов особей в потомстве подвергнутых ФД действия родительских форм и средней массы тела Fj — особей имаго Drosophila melanogaster.

3. Действие разных степеней ФДД на общее содержания РНК в теле особей имаго избранного модельного объекта.

4. Взаимосвязь между величинами изменения указанных морфофизиологических и биохимических показателей Drosophila melanogaster при различных дозировках ФДД и соответствующими значениями выживаемости этого модельного объекта.

5. Влияние половой принадлежности экспериментальных особей Drosophila melanogaster на степень их естественной резистентности к повреждающему ФД действию.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. ФД действие с фотосенсибилизатором «Фотогем» приводит к снижению выживаемости особей Drosophila melanogaster при применении концентраций ФС в трофическом субстрате 5,2 мг/мл и более в сочетании с экспозиционными дозами облучения красным светом 36,0 Дж/см2 и более. Повышение дозы ФДД, связанное с увеличением численного значения одного или обоих его компонентов сопровождается усилением летального эффекта.

2. ФДД оказывает угнетающий эффект на морфофизиологические показатели как относящиеся непосредственно к подвергнутым экспериментальному влиянию особей дрозофилы, например, плодовитость, так и характеризующие их потомство, такие как соотнощение полов, масса тела имаго. Конкретная величина изменения указанных показателей зависит от дозы ФД воздействия.

3. ФДД приводит к снижению общего содержания РНК в теле особей Drosophila melanogaster при применении концентрации «Фотогема» в трофическом субстрате 11,5 мг/мл и более и экспозиционнрй дозы облучения 36,0 Дж/см и более.

4. Половая принадлежность экспериментальных цсобей Drosophila melanogaster влияет на их устойчивость к деструктивно — ингибирующему влиянию ФДД, т.е. на величины изменения основных морфофизиологических и биохимических показателей. При этом резистентность самок модельного объекта к повреждающему ФДД во всех случаях выше, рем у самцов, что выражается в меньшем снижении указанных показателей у женских особей в сравнении с мужскими при идентичных дозах ФДД.

5. Совместное, комплексное действие компонентов ФДД приводит к значительно более выраженному уменьшению основных морфофизиологических показателей Drosophila melanogaster: выживаемости, плодовитости, средней массы тела потомства, чем их отдельное влияние.

6. Различные варианты сочетания компонентов ФДД могут оказывать одинаковое ингибирующее действие на морфофизиологические показатели, если они вызывают идентичные изменения выживаемости. Величина деструктивных изменений морфофизиологических показателей у дрозофилы зависит только от количества первичных повреждающих ФД реакций в биообъекте.

Практическая значимость работы:

Предложенная методика изучения влияния ФДД на ряд морфофизиологических и биохимических параметров избранного модельного объекта — Drosophila melanogaster может успешно применяться для сравнения терапевтической эффективности различных ФС перед их клинической апробацией, а также различных режимов и способов проведения сеансов ФДТ, например, разных вариантов сочетаний основных компонентов ФД воздействия. Данная тест — система может способствовать уточнению методики клинического применения метода ФДТ.

Полученные в работе данные могут использоваться в учебном процессе в

ВУЗах при изучении радиобиологии неионизирующих излучений, фотобиологии у студентов биологических, экологических и сельскохозяйственных специальностей.

Предложенные методы ФД действия на насекомых могут быть использованы в сельском хозяйстве в качестве физико - химического способа борьбы с вредителями культурных растений.

Публикации работы:

Основные результаты; исследования, представленные в диссертационной работе, изложены в 8 публикациях.

Апробация работы:

Основные результаты исследований были доложены и обсуждены на Межрегиональной научно - практической конференции «Река Ока - третье тысячелетие» (Калуга, 2001 г.), на второй международной конференции «Неионизирующие электромагнитные излучения в биологии и медицине (БИО

- ЭМИ 2002)» (Калуга, 2002), на научно - практической конференции российских ученых «Актуальные аспекты лазерной медицины» (Москва -Калуга, 2002г.), на третьей международной конференции «Электромагнитные излучения в биологии (БИО - ЭМИ 2005)» (Калуга, 2005), на открытой научно

- практической университетской конференции преподавателей КГПУ им. К.Э. Циолковского (Калуга, 2006). Приведённые в диссертации результаты обсуждались на заседании теоретического семинара по вопросам радиобиологии неионизирующих излучений (1999 - 2005). Диссертация апробирована на расширенном заседании кафедры общей биологии КГПУ им. К.Э. Циолковского (2005 г.).

Структура и объем работы:

Диссертация изложена на 150 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, материалов . и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических предложений, списка литературы, содержащего 208 названий (в том числе 74 иностранных), приложения. Работа включает 31 рисунок и 9 таблиц.

Заключение Диссертация по теме "Радиобиология", Колтаков, Алексей Михайлович

ВЫВОДЫ:

1. Фотодинамическое действие снижает выживаемость Drosophila melanogaster.

При этом гибель 50% (LD50) экспериментальных особей наблюдалась при сочетании концентрации фотосенсибилизатора «Фотогем» в трофическом

Г) субстрате 11,5 мг/мл и дозы облучения (А = 633 ± 15 нм) 150,0 Дж/см, а абсолютный летальный эффект при сочетании концентрации «Фотогема» 26,2

WW О мг/мл и дозы облучения красным светом 114,0 Дж/см .

2. Drosophila melanogaster может использоваться как удобный и доступный тест - объект для оценки деструктивного эффекта разных доз, режимов и способов фотодинамического действия (ФДД), сравнения эффективности различных фотосенсибилизаторов благодаря тому, что согласно установленным дозовым зависимостям значительная смертность у дрозофилы возникает при использовании доз облучения и концентраций сенсибилизатора в диапазоне (36 - 350 Дж/см2), сходном с используемым в клинической практике.

3. Выживаемость особей Drosophila melanogaster в определенном диапазоне доз фотодинамического действия, вызывающем снижение общей выживаемости до 70,3% - 22,9% от контрольного уровня, зависит от их половой принадлежности. При этом выживаемость самок при равных дозах воздействия всегда выше. Таким образом, можно сделать определенные предположения о механизме влияния фотодинамического действия, и о том какие половые различия обеспечивают большую резистентность самок к его повреждающему эффекту.

4. Фотодинамическое действие на Drosophila melanogaster угнетающе влияет на ряд морфофизиологических показателей их потомков в первом поколении - Fi — особей - численность популяции, массу тела, соотношение полов. Степень угнетения каждого из данных показателей пропорциональна дозе фотодинамического действия. Данные факты демонстрируют, что фотодинамическое действие оказывает влияние на органы и структуры, ответственные за передачу и реализацию наследственной информации. Это может способствовать уточнению его механизмов и свидетельствует о наличии у него отдаленных последствий и необходимости их изучения.

5. Фотодинамическое действие приводит к дозозависимому снижению общего содержания РНК в теле Drosophila melanogaster, предшествующего по времени угнетению морфофизиологических показателей. Это позволяет предположить, что одним из его последствий у дрозофилы является фотодинамическая деструкция молекул РНК, содержащихся в цитоплазме и снижение общего биосинтеза белка. Таким образом, биохимические показатели могут быть удобным индикатором степени деструктивного влияния фотодинамического действия.

6. Отдельные компоненты фотодинамического действия - темновое влияние фотосенсибилизатора в концентрациях более 42,0 мг/мл и облучение красным ф светом (Л = 633 ± 15 нм) в экспозиционных дозах более 200 Дж/см2 оказывают слабое угнетающее влияние только на показатели плодовитости и массы тела Drosophila melanogaster, но не оказывают действия на выживаемость и соотношение полов среди Fi - особей.

7. Совместное, комплексное влияние компонентов фотодинамического действия приводит к значительно более выраженному угнетению морфофизиологических показателей Drosophila melanogaster, чем их отдельное воздействие. Это свидетельствует о том, что снижение исследуемых показателей дрозофилы в экспериментах с использованием комплексного действия указанных компонентов обусловлено именно фотодинамическими процессами.

• ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ:

1. Предложенная методика с применением Drosophila melanogaster в качестве модельного объекта может быть использована для изучения и сравнения биологической эффективности различных ФС, режимов облучения и способов проведения сеансов ФДТ.

2. Полученные данные могут быть использованы в учебных курсах «Основы фотобиологии», «Основы радиобиологии», «Сельскохозяйственная радиология», «Генетика» и спец. курсах и практикумах при обучении по специальностям «Биология» и «Радиобиология». 3. Использованная методика может применяться в качестве физико-химического метода борьбы с насекомыми - вредителями сельского хозяйства.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Колтаков, Алексей Михайлович, Калуга

1. Алесенко А.В., Пальмина Н.П. Биоантиокислители в регуляции метаболизма в норме и патологии.- М.: Наука, 1982. С. 84 — 100.

2. Алёшина Т.Е. Индуцированные низкоинтенсивным импульсным лазерным излучением (А,=890 нм) морфофизиологические и биохимические изменения в процессе развития организма: Автореф. дис. канд. биол. наук.-Калуга, 2001.- 23 с.

3. Арсланов Т.А. Оценка эффективности неионизирующего излучения крайне высоких частот на уровне некоторых биологических характеристик Drosophila melanogaster. Автореф. дис. канд. биол. наук.- Калуга, 2004. 24 с.

4. Беленикина Н.С. Исследование механизмов деструктивного и регуляторного действия оптического излучения на дрожжевые клетки. Автореф. дис. канд. биол. наук, М.: 1994.- 21 с.

5. Белишева Н.К., Мавринская Л.Ф., Свечникова Л.И. Цитогенетический эффект облучения личинок Drosophila melanogaster // Сб. Биологическое действие лазерного облучения.- Куйбышев: Изд-во КГУ. 1984.- С. 3-8.

6. Белов А.Д. Радиобиология. М.: Колос, 1999. 384 с.

7. Белоус Т.А., Франк Г.А., Соколов В.В. Морфологические изменения начального рака желудка при фотодинамической терапии // Российский• онкологический журнал.- 1997.- № 5.- С. 26-30.

8. Бердышев Г.Д., Голда Д.М., Зуй В.Д. Общая и молекулярная генетика.-Киев: Вища школа, 1984.- 239 с.

9. Блехман Г.И. Синтез белка в условиях стресса // Успехи современной биологии.- 1987-Т. 103.- Вып. З.-С. 340-350.

10. Блознелите Л., Пономарёв И.В. Эффективность фотодинамической терапии опухолей различной патологической структуры // Российский онкологический журнал.- 1997.-№4.- С. 18-21.

11. Брюсов П.Г., Матафонов В.А., Северцов А.Н. Фотодинамическая терапия при злокачественных опухолях // Вопросы онкологии.- 1994.- Т.Ю.-№№4-5-6.-С. 139-145. # 18. Вельшер JI.3., Стаханов M.JL, Виноградов А.В., Трутин А.И., Эскин

12. Владимиров Ю.А. Три гипотезы механизме действия красного (лазерного) света. // Эфферентная медицина./ Под ред. Чикина С.Л. М.: НИИ Физ. хим. медицины, 1994. - С. 23 - 35.

13. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах.- М.: Наука, 1972. 354 с.

14. Гаврилов Л.А., Гаврилова Н.С. Биология продолжительности жизни. 2-е изд. -М.: Наука.-1991.-280 с.

15. Гамалея Н.Ф., Михалкин И.А. Световая терапия опухолей с применением фотосенсибилизаторов // Экспериментальная онкология.- 1988.-№1.-Т10.- С. 9-16.

16. Гейниц А.В., Цыганова Г.И., Базантова J1.B,, Картусова JT.H. Актуальные проблемы лазерной медицины // Актуальные аспекты лазерной медицины. Материалы научно-практич. конф. Российских учёных Москва

17. Калуга, 3-5 октября 2002 года / Под ред. Гейница А.В., Цыгановой Г.И. Москва1. Калуга, 2002. С. 2-8.

18. Геодакян В.А. Дифференциальная смертность и норма реакции мужского и женского пола. Онтогенетическая и филогенетическая пластичность // Журн. общ. биологии. 1974. - Т.35. - №3. - С. 376 - 385.

19. Геодакян В.А. Эволюционная теория пола // Природа. 1991. - №8. - С. 60-69.

20. Геодакян В.А. Эволюционные хромосомы и эволюционный половой диморфизм // Изв. РАН. Сер. биол. 2000. - №2. - С. 133 - 148.

21. Гилберт С. Биология развития: в трёх томах / Пер. с англ.- М.: Мир,1993,- Т.1.-228 с.

22. Гилберт С. Биология развития: в трёх томах / Пер. с англ.- М.: Мир,1994, Т.2.-235 с.

23. Гладких С.П., Алексеев Ю.В., Полонский А.К. Молекулярно-биологические основы лазерной и фотодинамической терапии // Сб. Новые аспекты лазерной медицины и техники на пороге XXI века / научные труды ЛАН РФ № 5.- Москва-Калуга.- 2002.- С. 1-17.

24. Глинка М.И. Общая химия. Л.: Химия. - Ленингр.отд.- 1983. - 704

25. Грин Н., Стаут У., Тейлор Д. Биология: в 3-х тт. / Пер. с англ.- М.: Мир.- 1993. (Т.1-368 е., Т.2-325 е., Т.3-376 е.).

26. Гуринович Г.П., Лосев А.П. Применение порфиринов и хлоринов для исследования ФД действия оптического излучения / Под ред. А.Б. Рубина М.: Наука.- 1988.-231 с.

27. Даллакян Г.А. Рост популяции микроводорослей в условиях питательных сред, обогащённых синглетным кислородом // Известия Академии наук.- Серия биологическая.- №6.- 1998,- С. 751-754.

28. Дубинина Е.Е., Шугалей Н.В. Окислительная модификация белков // Успехи современной биологии.- 1993—Т.113-Вып. 1.-С. 71-82.

29. Детлаф Т.А. Безразмерные критерии времени развития зародышей, личинок и куколок дрозофилы и зародышей пчелы в таблицах нормального развития // Онтогенез.- 1995.- Т. 26.- №2.- С. 125-131.

30. Захаров С.Д., Иванов А.В. Светокислородный эффект в клетках и перспектива его применения в терапии опухолей // Квантовая электроника.-1999.- Т.29.- № 3.- С. 194-214. # 44. Захваткин Ю.А. Курс общей энтомологии. М.: Колос, 2001 376 с.

31. Иванов И.П. Влияние лазерного излучения на эмбриогенез дрозофилы // Кн. Биологическое действие лазерного излучения.- Куйбышев: КГУ.- 1984.-С. 19-22.

32. Идельсон Л.И. Лечение урокопропорфирии делагилом // Клиническая медицина.- 1980.- Т.58.- №5.- С. 61-72.

33. Измайлов Д.М. Колебательные изменения жизнеспособности и анализ механизмов старения популяции Drosophila melanogaster в ряду поколений в норме и после радиационного облучения. Автореф. дис. канд. биол. наук. — М.: 1993.-21 с.

34. Инге-Вечтомов С.Г. Генетика с основами селекции: Учеб. для биол. ® спец. ун-тов.- М.: Высш.шк., 1989.- 591 с.

35. Каплан М.А., Втюрин Б.М., Медведев B.C., Романко Ю.С., КлимановI

36. М.Е., Капинус В.Н. Опыт применения фотодинамической терапии в лечении первичного и рецидивного рака нижней губы // I Международная конференция

37. Лазерная и фотодинамическая терапия». Обнинск, 16-18 июня, 1999. Тезисы докладов. Под ред. Цыба А.Ф., Каплана М.А. Обнинск, 1999.- С. 27-28.

38. Каплан М.А., Мардынская В.П., Малыгина А.И., Бурмистрова Н.В.,

39. Каплан М.А., Романко Ю.А. ФДТ как новый радикальный метод лечения у больных с рецидивными опухолями «неудобной» локализации // Вопросы онкологии. 2000. - т.46. - №2. - С. 238.

40. Козлов В.И. Взаимодействие лазерного излучения с биотканями // Кн. Применение низкоинтенсивных лазеров в клинической практике / Под ред. Скобелкина O.K.- М., 1997.- С. 24-35.

41. Конев С.В., Волотовский И.Д. Фотобиология животной клетки.- JL: Наука, 1979.-324 с.

42. Конев С.В., Волотовский И.Д. Фотобиология.- Минск: Изд-во БГУ. -1979.-276 с.

43. Красновский А.А. Механизм образования и роль синглетного кислорода в фотобиологических процессах// Кн. Молекулярные механизмы биологического действия оптического излучения / Под ред. Рубина А.Б. М.: Наука.- 1988.- 231 с.

44. Крепак О.М., Языкова М.Ю. Влияние лазерного облучения на рост культуры // Кн. Биологическое действие лазерного излучения.- Куйбышев, КГУ.- 1984.- С. 39.

45. Кузьмичёв В.Е. Изучение действия инфракрасного низкоинтенсивного # лазерного излучения на различные стадии онтогенеза Apis mellifera и Drosophilamelanogaster. Дис.канд. биол. наук.- Калуга, 1997. 150 с.

46. Кулинский В.И., Колесниченко Л.С. Структура, свойства, биологическая роль и регуляция глутатионпероксидазы // Успехи современной биологии.- 1993.- Т.111.- Вып. 1.- С. 107-123.

47. Кулинский В.И. Активные формы кислорода и оксидативная модификация макромолекул: польза, вред и защита // Соросовскийобразовательный журнал.- 1999.- №1.- С. 2-8.

48. Лаптев В.П. Экспериментальное обоснование возможности применения соединений ряда порфина в фотодинамической терапии опухолей. Автореф. дис. канд. биол. наук.- М, 1991.- 23 с.

49. Лакин Г.Ф. Биометрия. М.: Высш школа.- 1990.- 352 с.

50. Лозовская Е.Л., Каплунский Г.Д., Сапежинский И.И. Супероксиддисмутазная активность и фотосенсибилизирующие свойства 2,5 — дигидроксибензолсульфоната//Биофизика. 1990. - 35. - №6. - С. 912-916.

51. Матвеева Н.П., Каплан М.А., Капинус В.Н., Романко Ю.С. Изменение лабораторных показателей в процессе фотодинамической терапии // Сб. I

52. Международной конференции «Лазерная и фотодинамическая терапия». Обнинск, 16-18 июня, 1999. Тезисы докладов. Под ред. Цыба А.Ф., Каплана М.А. Обнинск, 1999. С. 23 - 24.

53. Медведев Н.Н. Практическая генетика.- М.: Наука. — 1966.- 238 с.

54. Меерович И.Г. Фотодинамическая эффективность авидин-биотиновой системы, включающей биотинилированные антитела и производные фталоцианиновых ФС. Автореф. дис. канд. биол. наук.- М, 2001.- 19 с.

55. Миронов А.Ф. Фотосенсибилизаторы на основе порфиринов и родственных соединений // Итоги науки и техники. Серия «Современные проблемы лазерной физики».- Т.З.-М.: ВИНИТИ.- 1990.- С. 5-63.

56. Миронов А.Ф. Фотодинамическая терапия рака — новый эффективный метод диагностики и лечения злокачественных опухолей // Соросовский образовательный журнал.- № 8.- 1996.- С. 32-40.

57. Мыльников С.В. Динамика эмбриональной смертности в инбредных линиях дрозофилы // Онтогенез. 1991. — Т.22. — №1. — С. 93 - 95.

58. Ноздрачев А.Д., Поляков Е.Л., Лапицкий В.П., Осипов Б.С., Фомичёв Н.И. Анатомия беспозвоночных: пиявка, прудовик, дрозофила, таракан, рак. / Сер «Учебники для вузов. Специальная литература».- СПб.: Лань. 1999. -320с.

59. Объекты биологии развития. / Под ред. Детлаф Т.А. М.: Наука. 1975. -579 с.

60. Островский М.А., Фёдорович И.Б. Фотосенсибилизированное # окисление как механизм повреждающего действия света на сетчатку глаза //

61. Химическая физика.- 1996.- 15.- №1.- С.73-80.

62. Павлов А.Н. Воздействие электромагнитных излучений на жизнедеятельность: Учебное пособие. М.; Гелиос АРВ, 2002. — 354 с.

63. Пасс Х.И. Фотодинамическая терапия в онкологии: механизмы и клиническое применение // Физическая медицина.-1993.-T.3.-№3-4.-C. 5-22.

64. Печерских Е.В., Шитова JI.A., Якубовская Р.И., Деркачёва В.М.,

65. Плетнёв С.Д., Девятков Н.Д., Беляев В.П., Абдразинов М.Ш. Газовые лазеры в экспериментальной и клинической онкологии.- М.: Медицина.- 1978.-С. 72-75.

66. Полтораков А.П. Количественный анализ кривых выживания на основе теории рецепторов // Цитология. — 1997. Т.39. - №6. - С. 502 - 503.

67. Полтораков А.П. Анализ кривых выживания и гибели организмов с # помощью модели витальных рецепторов // Журн. общ. биологии. 1999. — Т.60.- №6. С. 596-621.

68. Полуэктова Е.Н. Митрофанов В.Г. Бурыченко Г.М. Дрозофила Drosophila melanogaster II Объекты биологии развития.- М: Наука.- 1975.- С. 128-146.

69. Посудин Ю.И., Лобода И.П., Лобода В.И. Фотодинамическая диагностика и терапия злокачественных опухолей // Клиническая хирургия.- № 5.- 1982.- С. 43-45.

70. Проблемы генетики в исследованиях на дрозофиле. — Новосибирск: Наука, 1977.-278 с.

71. Радиобиология. Биологическое действие ионизирующих излучений. / ® Итоги науки. Биологические науки. 1. Под ред. Кузина A.M. М.: Изд — во

72. Академии Наук СССР. 1957. - 435 с.

73. Разумовский С.Д. Кислород элементарные формы и свойства,- М.: Химия.- 1979.-304 с.

74. Рубин А.Б., Фрайкин Г.Я. Первичные молекулярные механизмы фотобиологических процессов и деструктивное действие оптического излучения // Успехи современной биологии.- 1987.- Т. 103,- Вып. 3.- С. 323-340

75. Румбаль Я.В. Изучение эффективности фотодинамического действия сенсибилизаторов, используемых в ФДТ, на клеточных моделях: Автореф. дис. канд. биол. наук.- М, 2000.- 20 с.

76. A.В., Цыгановой Г.И. Москва-Калуга, 2002. С. 357 359.

77. Сатарова Н.А., Шапошникова С.В., Блехман Г.И. Влияние дефицита влаги на синтез пре-мРНК у проростков пшеницы // Физиология растений.-1986.- Т.ЗЗ.- №4.- С. 731.

78. Себрант Ю.В., Троянский М.П. Лазеры и живая ткань. М.: Знание.- 1972.- С. 3-30.

79. Сапежинский И.И. Сенсибилизированное фотоокисление белков и других веществ. Возможное значение этих процессов в фотобиологии. / Кн. Молекулярные механизмы биологического действия оптического излучения / Под ред. Рубина А.Б.- М.: Наука.- 1988. 231 с.

80. Синяков B.C., Хайдакова М.И. К вопросу о глубине проникновения релеевских волн, возбуждаемых в живых тканях. // Актуальные проблемы заболевания и выздоровления. -М.: 1983, С. 154 - 156.

81. Скобелкин O.K., Козлов В.И., Гейниц А.В., Дашлин Н.А., Дербенёв

82. B.А. Применение лазерных хирургических аппаратов «Ланцет» в медицинской практике / Пособие для врачей.- М.:1996.- С. 12-21.

83. Смирнов B.C. Квази-энергия и правило поверхности // Применение количественных методов в экологии. Сб. статей УНЦ АН СССР.- Свердловск.-1979.-С. 117-124.

84. Странадко Е.Ф. Первый опыт фото динамической терапии рака в России // Сб. Лазерная и магнитная терапия в экспериментальных и клинических исследованиях. Тез. Докладов Ч.1.- Обнинск.- 1993.- С. 69-71.

85. Странадко Е.Ф. Фотодинамическая терапия // Сб. Применение низкоинтенсивных лазеров в клинической практике / Под ред. Скобелкина O.K. -М.:- 1997.-С. 173-185.

86. Странадко Е.Ф. Механизм действия фотодинамической терапии // Российский онкологический журнал.- 2000.- №4.- С. 52-56.

87. Узденский А.Б., Жаворонкова А.А., Миронов А.Ф., Кузьмин С.Г. Исследование фотодинамического действия новых фотосенсибилизаторов наизолированную нервную клетку // Известия АН Сер. Биологическая.- 2000.-№2.- С. 230-238.

88. Ушаков Б.П. О классификации приспособлений животных и растений и о роли цитоэкологии в разработке проблем адаптации // Проблемы цитоэкологии животных. Сб. научн. тр. JL: Наука, Ленингр. отд., 1963. — С. 5 -21.

89. Фрайкин Г.Я., Рубин А.Б. Влияние ближнего ультрафиолетового света на микроорганизмы // Известия АН СССР. Сер. Биологическая.- 1980.-№3.- С. 370-380.

90. Файн С., Клейн Э. Биологическое действие излучения лазера. / Пер. с англ.- М.: Атомиздат.- 1968.- С. 42-42.

91. Филлипович Ю.Б., Егорова Т.А., Севастьянова Г.А. Практикум по общей биохимии.-М.: Просвещение.- 1982.- 311 с.

92. Филлипович Ю.Б. Основы биохимии. М.: Высш. школа.- 1985.-503с.

93. Черницкий Е.А., Воробей А.В. Сенсибилирируемые фотопревращения клеток // Успехи современной биологии.- 1986.- Т. 101.- Вып. 1.- С. 100-119.

94. Чернова Г. В., Каплан М. А., Арсланов Т.А Некоторые особенности реагирования модельных объектов на ЭМИ КВЧ ММ-диапазона // Изучение природы бассейна реки Оки. Тез. докл. межрегион, научн. практич. конф.

95. Река Ока-третье тысячелетие», Калуга, 21-25 мая 2001.- Калуга: Изд-во КГПУим. К.Э. Циолковского. -2001.- С. 214-218.

96. Чиссов В.И., Соколов В.В., Филоненко Е.В., Карпова Е.С., Телегина JI.B. //Российский онкологический журнал.- 1998,- №4.- С. 3-12.

97. Шуйский Н.Н. Теоретические основы и развитие лазерной терапии. / Кн. Биологическое действие лазерного излучения.- Куйбышев,-1984.- С. 137143.

98. Эндебера О.П. Оценка биологической эффективности инфракрасного низкоинтенсивного импульсного лазерного излучения на уровне характеристик приспособленности у Drosophila melanogaster. Автореф. дис.канд. биол. наук.-Обнинск, 1996.- 20 с.

99. Ярмоненко С.П. Радиобиология человека и животных. М.: Высшая школа. 2004. - 549 с.

100. Altschuler М., Moscarenhas J.P. Heat shock // Bact. Man. Meet., Cold Spring Harbor, 1982, P. 321.

101. Bellnier D. A., Dougherty Т. I. Membrane lysis in Chinese hamster ovary cells treated with hematoporphyrin derivative plus light // Photochem. and Photobiol., 1982.-36.- P. 43-47.

102. Ben Amotz A., Shaish A., Avron M. Mode of action of the massively accumulated P-carotine of Dunaliella bardawii in protecting the alga against damage by excess irradiation. // Plant. Physiol. - 1989. - 91, №3, - P. 1040 - 1043.

103. Ben-Gur E., Oetjen J., Holowitz B. Silicon phthalacyanine Pc 4 and red light canses apoptosis in HIV-infected cells // Photochem. and Photobiol., 1997.- 65.-№3.-P. 456-460.

104. Berg K., Ma L.W., Moan J. Lysosomes and microtubules as tagets for P.C. T. Program and Abstr. 24th Annu.Meet.mer. Soc. Photobiol., Atlanta., Ga., June 1520 1996 // Photochem. and Photobiol., 1996.- 63, spec. Issue.- P. 79.

105. Berthianme F., Reiken S.R., Toner M., Tompkins R.G., Yarmush M. L. Anti-body targeted photolysis of bacteria in vivo // Biotechnology.-1994.- 12.- № 7, P. 703-706.

106. Bertoloni G., Lauro F.M., Cortella G., Merchat M. Photosensitizing activity of hematoporphyrin on staphylococcus aureus cells // Biotin Biophys. Acta.- 2000.-Jul.3.- 1475 (2).-P. 169-174.

107. Berus M.W., Bewley W., Sun C.H., Templin P. Free electron laser irradiation at 200 nm affects DNA synthesis in living cells // Proc. Nat. Acad. Aci. USA.- 1990.- 87.-№ 7.-P. 2810-2812.

108. Brandi G., Cattabeli F., Albano A., Cantoni O. Role of hydroxyl radicals in Escherichia coli killing induced by hydrogen peroxide // Free Radical Res. Commun. 1989. - 6, №1 - P.47 - 55.

109. Brun A., Sandberg S. Mechanisms of photosensitivity in porphyric patients with special emphasis on eritropoetic protoporphyria // J. Photochem. Photobiol., В.: Biol.- 1991.- 10.- P. 285-302.

110. Bulychev A.A., Vredenberg W.J. Enhancement of the light-triggered electrical response in plant cells following their de-energization with uncouplers // Physiol. Plant.- 1995.- 94.- №i. p. 64-70.

111. Cai Y. — S., Xu D., Mo X. Clinical, pathological and photochemical studies of laser injury of the retina // Health Phys. 1989. - 56, №5. p. 643 - 646.

112. Christian S., Gulliana M. New trends in photobiology (invited Review). Photosensitisation of mitochondria. Molecular and cellular aspects // J. Photochem. Photobiol.- B.:Biol.- 1990.- №5.- P. 133-150.

113. Cincotta L., Szeto D., Lampros E., Hasan Т., Cincotta A.H., Benzophenothiazine and benzoporphyrin derivative combination phototherapy effectivety eradicates large murine sarcomas // Photochem. and Photobiol.- 1996.-63.-№2.- P. 229-237.

114. Dahi T. A. Direct exposure of mammalian cells to pure exogenous singlet oxygen (*02) // Photochem. and Photobiol.- 1993.- 57.- № 2.- P. 248-254.

115. Daniell M.D., Hill J.S. A history of photodinamic therapy // Aust. N. Z. J. Surg.- 1991.-61.- P. 340-348.

116. Di Mascio P., Kaiser S., Sies H. Lycopene as the most efficient biological carotinoid singlet oxygen quencher // Arch. Biochem. and Biophys. 1989. — 274. -№2.-P. 532-538.

117. Duran N., Marcucci M.C, Gatti M. S. V., Leite L.C.C. Different lethal effects by enzyme — generated triplet indole-3-aldehyde in different Escherichia coli strains // J. Photochem. and Photobiol. B. 1990 4. - №4. - P. 371 - 378.

118. Evensen J. F. Moan I. Photodinamic action and chromosomal damage: a comparative study of hematoporphyrin derivative (HPD) with light and X-irradiation // J. Cancer. 1982.- 45.- P. 456-465.

119. Foote C.S. Definition of Type 1 and Type 2 photosensitized oxidation // Photochem. and Photobiol. 1991. - 54.- P. 659.

120. Gomer С J. DNA damage and repair in CHO cells following hematoporphyrin photoradiation//Cancer Lett.- 1980.- 11.- P. 161-167.

121. Hahn K.A., Panjehpour M., Li X. Fluence-dependent induction of micronuclei by aluminum phthalocyanine tetrasulfonate-mediated photodinamic• therapy // Photochem. and Photobiol.- 1996.- 63.- № 1.- P. 117-122.

122. Halliwell В., Aruoma О J. DNA damage by oxygen-derived species: its meckanism and measurement in mammalian systems // FEBS Lett.- 1991.- 281.- № 1-2.- P. 9-19.

123. Haseloff R. F., Ebert В., Roeder B. Generation of free radicals by photo excitation of pheophorbide a, haematoporphyrin and protoporphyrine. // J. Photochem. and Photobiol. 1989. 3. - №4. - P. 593 - 602.

124. He D., Taniuchi S., Sun C.H., Berus M.W., Cardiff R.D. The monoclonal antibody UCD/AB 6.01 conjugated to photosensitizers attaches to and photoinactivates epithelian tumor cells // Antibody, Immunoconjudgates and Radiopharm.- 1990.-3.-№ 3.-P. 199-211.

125. Henderson B.W., Donovan J.M. Release of prostoglandin E2 from cells by photodynamic treatment in vitro // Cancer Res.- 1989.- 49.- № 24.- PT.-l.- P. 68966900.

126. Kessel D. Sites of photosensitization dy derivatives of hematoporphurin // Photochem. Photobiol.- В.: Biol.- 1986.- 44.- P. 489 493.

127. Kessel D., Sun H.H. Enhansed responsiveness to photodynamic therapy-induced apoptosis after mitochondrial DNA depletion // Photochem. Photobiol.-1999.- Dec., 70 (6).- P. 937-940.

128. Kim C. S., Jung J. Inactivation of the respiratory chain in plant mitochondria by visible: The primary target for photodamage and endogenous photosensitizing chromophores // J. Photochem. and Photobiol.- В.- 1995.- 29, № 2-3.-P. 135-139.

129. Kochevar Irene E. Cytotoxicity and mutagenicity of excimer laser• radiation // Lasers. Surg, and Med. 1989. 9. - №5. - P. 440 - 445.

130. Korbelik M., Dougherty G.J. Photodynamic therapy mediated immune response against subcutaneous mouse tumors // Cancer Res. — 1999. 59. - №8. — P.1941 -1946.

131. Korutowski W., Girotti A. W. Singlet oxygen adducts of cholesterol: photogeneration and reductive turnover in membrane systems // Photochem. and Photobiol.- 1999.- Oct, 70 (4).- P. 484-489.

132. Laustriat G. Molecular mechanisms of photosensitizing // Biochemie.-1986.- 68.- P. 771-778.

133. Liang H., Do Т., Kasravi S., Aurasteh P., nguang A., Wang Z., Berns M.W. Chromosomes are target sites for photodinamic therapy as demonstrated bysubsellular laser microirradiation // J. Photochem. and Photobiol.- В.- 2000.- Feb, 54 (2-3).-P. 174-184.

134. Luna M.C., Ferrario A., Rucker N., Gomer C.J. Osolation snd initialcharacterization of photofrin mediated PDT resistant RIF tumor cell strains // Free Radic. Biol, and Med. 1990.- Supp.- № 1.- P. 81.

135. Midden W. R., Dahl T. A., Hartman P. E. Cytotoxicity but not mutagenecity in bacteria with exernally generated singlet oxygen // Spie Vol. 847. New directions in Photodynamic therapy. 1987. - P. 145 - 148.

136. Moan J., Waksvic H., Cristensen T. DNA singlet-strand breaks and sister chromatid exchanges induced by treatment with hematoporphyrin and light or by x• rays in human NHIK 3025 cells//Cancer Res.- 1980.-40.-P. 2915-2918.

137. Nir U., Ladan H., Malik Z., Nitzan Y. In vivo effects of porphurins on bacterial DNA // J. Photochem. Photobiol.- В.: Biol.- 1991.- 11.- P. 295-306.

138. Paiva M. В., Saxton R. E., Graeber L. P., Jongewoard N., Eshraghi A. A., Suh M.J., Paek W. H., Castro D. J. Improved photochemotherapy of malignant cells with daunomycin and the KTR laser // Laser Surg, and Med.- 1998.- 23.- №1.- P. 3339.

139. Pardue M. L., Scott M. P., Storti R. V., Lenguel J. A. Development and neurobiology of Drosophila. N.Y.:Plenumpress. 1980.- P. 31.

140. Peak J. G., Peak M. J. Induction of slowly developing alkali-ladile sites in human P3 cell DNA by UVA and blue and green-light photens: Action spectrum // J. Photochem. and Photobiol. - 1995. - 61.- №5.- P. 484-487.

141. Piette J. Biological conserquences associated with DNA oxidation mediated by singlet oxygen // J. Photochem. and Photobiol.- В.- Biol.- 11.- 1991.- P. 241-260.

142. Plartley J.A., Forrow S., Reszkak L., Lown J.W. Photosensitalisation by antracenedione anticancer agents // Int. J. Radiat. Biol. 1989 - 55. - №5. -P. 885 -886.

143. Pobler J.P. Photooxidation of cell membranes using eosin derivatives that locate in lipid or protein to study the role diffusible intermediates. // J. Photochem. and Photobiol.- 1989.-50.- №1.- P. 55-68.

144. Rafalowska U., Liu C.-J., Floyd R.A. Peroxidation induced changes in synaptosomal transport of dopamine and y-aminobutyric acid // Free Radic.Biol. and Med. 1990. - Suppl.№l. - P. 485 - 492.

145. Reveilland I., Niedzwiecki A., Bensch K., Fieming J.E. Expression of bovine superoxide dismutase in Drosophila melanogaster augments resistance to oxidative stress // Mol. and Cell Biol. 1991. - V. 11. - P. 632 - 640.

146. Rice L., Wainwright M., Phoenix D.A. Phothiazine photo sensitizers. III. Activity of methylene blue derivatives against pigmented melanoma cell lines // J. Chemother.-2000.-12.- №1.-P. 94 104.

147. Sandberg S., Romso I. Porphypin-sensitized photodynamic damage of isolated rat liver mitochondria // Biochem. Biophys. Acta.- 1980.- 593.- P. 187-195.

148. Schnitzhofer G. M., Krammer B. Photodynamic treatment and radiotherapy: combined effect on the colony-forming ability of V 79 Chinese hamster fibroblasts // Cancer Lett.- 1996.- Nov.- 12.- 108 (1).- P. 93.-99.

149. Takahama U., Sorata Y., Jan C. Y., Kimura M. Supression of photosensitized hemolysis by quercetin and promotion of the suppression by ascorbat• // Med., Biochem., and Chem. Aspects Free Radicals Res., Kyoto, 9-13 apr., 1988.

150. Vol. 1.- Amsterdam etc.- 1989.- P. 481-484.

151. Todd G.W. Water deficit and plant growth. V.3 N.Y.: Acad. Press. 1972. - P. 177.

152. Tseng M.T., Schuschke D. S., Reed M. W. R., Harty J. I., Wieman T. J., Fingar V. H. The influence of photodynamic therapy on the ultrastructure of the normal rat bladder // J. Photochem. and Photobiol.- 1991.- 59.- № 3-4.- P. 295-305.

153. Tudge S. H., Kaye A. H., Hill J. S. Modulation of light delivery in photodynamic therapy of brain tumors // J. Clin. Neurosci.- 1999.- 6.- № 3.- P. 227232.

154. Singlet molecular oxygen quenching by saturated and unsaturated fatty acids and by cholesterol // Photochem. and Photobiol.- 1989. 50. - №3. - P. 321 - 325.

155. Volden G., Christensen Т., Moan J. Photodynamic membrane damage of hematoporphyrin derivative treated HIK 3025 cells in vitro // Photochem. Photobiol.-1981.-3.- P. 105.

156. Warner W. G., Wei R. R., Kornhauser A. Oxidative damage to cellular DNA and RNA accompanying phototoxicity in vitro // Photochem. and Photobiol.-1994.- 59.- spec. Issue. P. 30-31.

157. Yamamoto К. K., Pellegrini M. Ribosome subunit to polysome ratios affect the synthetics of rRNA in Drosophila cells // Biochemistry. 29.- № 50.- P. 11029• 11032.

158. Young S., Bolton P., Dyson M., Harvey W., Diamatopoulos C. Macrophage responsiveness to light therapy // Lasers Surg, and Med. 1989, 9 №5. -P. 437-505.