Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Мутагенный эффект совместного действия сенсибилизаторов и лазерного излучения на растения

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Мутагенный эффект совместного действия сенсибилизаторов и лазерного излучения на растения"

РГ6 од

. _р о с с и ис1<а^1 академия сельскохозяйственных наук

всероссийский научно-исследовательский институт

растениеводства имени ii. и. ВАВИЛОВА

На правах рукописи

ПАЩЕНКО Василий Михайлович

УДК 577.34+575.117.12

/

МУТАГЕННЫЙ ЭФФЕКТ СОВМЕСТНОГО ДЕЙСТВИЯ СЕНСИБИЛИЗАТОРОВ И ЛАЗЕРНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ НА РАСТЕНИЯ

Специальность: 03.00.15 — генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических паук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1993

/

Работа выполнена! в Институте генетики АН РМолдова в 1989—

Научные руководители; доктор сельскохозяйственных наук, профессор Лысиков В. Н., кандидат биологических наук Бурилков В. К.

, Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Шварцман П. Я.; доктор биологических наук Архипов М. В.

Ведущая организация — Всероссийский НИИ сельскохозяйственной радиологии и агроэкологии РАСХН (г. Обнинск).

Защита состоится «3-^» ММ—^ 1993 г.

в 4 О часов на заседании Специализированного совета Д 020.18.02. по присуждению ученой степени доктора биологических наук во Всероссийском научно-исследовательском институте растениеводства им. Н. И. Вавилова по адресу: 190000, г. Санкт-Петербург, ул. Герцена, 44. ч 1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского института растениеводства им. Н. И. Вавилова.

1992 гг.

Автореферат разослан

1993 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, доктор биологических наук

Э. А. Гончарова

\

У

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТУ.

.Актуальность темы. К настоящему времени проблема создания ценного исходного материала для селекции новых сортов становится весьма актуальной. Интенсивная селекционная практика уже в значительной степени исчерпала потенциальные возможности большинства • сельскохозяйственных культур, вследствие чего имеющийся в распоряжении селекционеров генофонд той или иной культуры часто ие в состоянии полностью обеспечить решение поставленных задач. В сложившейся ситуации возникает необходимость в разработке новых методов, которые давали бы возможность управления уровнем и спектром .генетической изменчивости. Решение последней задачи имело бы большое значение Для ускорения селекционного процесса, изучения механизмов генетической изменчивости и Мутаций.

Использование^ известных в настоящее время мутагенов и реком-биногенов не обеспечивает в достаточной мере селективности воздействия на биологические макромолекулы определенного типа. Для решения проблемы селективности был предложен метод с использованием хромофорной группы молекулы интеркалятора-сенсибилизатора в качество посредника между лазерным излучением (ЛИ) и биологической макромолекулой. Недавно предложенный, этот метод переживает период становления. Уке известен ряд работ по его использованию в системах ¡.и. у|4-го для фотомодификации нуклеиновых кислот (НК)'. й, несмотря на то» что до настоящего времени нет общепринятой теории, удовлетворительно раскрывающей механизмы передачи энергии ЛИ с молекулы-сенсибилизатора на ДНК, что приводит к образованию разрывов в молекуле ДНК, перспективность метода для фотомодификации НК в системах ¡.и VI ^о уже очевидна. Вместе с тем, до настоящего времени пет работ по изучению эффектов совместного воздействия красителей-сенсибилизаторов и. ЛИ на веге-тируювде растения. Известны липь единичные■работы по цитогене-

- г -

ти чес ко íi оценке эффектов совместного действия сенсибилизаторов и ЛИ на цитотические растительные клетки. По всей вероятности, эю связано о новизной метода и отсутствием достаточно эффективных сенсибилизаторов для систеы tu. v/tvo.

Цель и задачи исследований. В соответствии о вышеизложенным, Сила поставлена целевая проблема по выявлению новых эффективных сенсибилизаторов и комплексной оценке мутауениого эффекта при совместном воздействии сенсибилизаторов и ЛИ на биологические объекты. В процессе решения указанной проблемы, она была разбита на следующие этапы:

1. Проведение на молекулярном уровне сравнительной оценки эффективности фотомодификации ДНК уке известными для систем <-И. vLíro сенсибилизаторами и ЛИ. Использование лазеров с различными длинами волн излучения, в'разкых режимах работы. Выявление и исследование новых, более эффективных сенсибилизаторов

с перспективой их использования в системах <-И- vivo.

2. Исследование эффектов воздействия на меристемные ткани растений сенсибилизаторов, ЛИ и их совместного действия.

3. Проведение цвтогенехической оценки при воздействии на меристеиные клетки растений сенсибилизаторов, ЛИ и их совместного . действия.

Изучение эффектов воздействия на прорастающую пыльцу-сенсибилизаторов, ЛИ и их совместного действия. ' .

5. Изучение возможности индуцирования мутаций у растений при их. обработке совместным действием сенсибилизаторов и ЛИ. 4

6. Изучение возможности индуцирования мутаций у растений при опылении их пыльцой, обработанной совместным Действием сеиси-билизаторов и. ЛИ.

Научная новизна. Разработана методика виявлекия новых сенсибилизаторов. С ей помощью выявлен новый сенсибилизатор б-меркаптопурин (6Ш1), который в комбинации с лазером ЛГИ-21 . ( Х=337 км) по эффективности фотосенсибилизации ДНК многократно превосходит ранее использованные. Предложены механизмы комплексо-обраэования ДНК - 6Ш и передачи световой энергии с молекулы 6Ш' на ДНК, что приводит к образованию однонитевнх и двунитевых разрывов (ОНР и ДНР) в молекуле ДНК.

Проведена цитогенетичеекая, оценка мутагенного эффекта совместного действия выявленных сенсибилизаторов и ЛИ на меристем-ные 'клетки корешков кукурузы. Обнаружено резкое увеличение числа хромосомных аберраций при одновременной воздействии 6Ш и ЛИ.

Обнарукен эффект нелинейного снижения прорастания пыльцы при ее обработке севыестныы действием сенсибилизаторов и ЛИ в разные моменты времени после начала закачивания. Продемонстрировано увеличение числа ОНР в геномной ДНК пыльцы при совмест-юм воздействии на неё 6Ш и ЛИ ( Д. =337 ни).

Разроботаны методики обработки проростков и пыльцы расге-[ий совместным действием сенсибилизаторов и ЛИ для индуцирова-1ия генетической изменчивости.

Впервые при обработке совместным действием 6ИП и ЛЙ(Д=Э37 м). проростков кукурузы и льна, получены наследственно изменение в формы растений.

Впервые при опылении кукурузы пыльцой, обработанной совестным действием 6Ш и ЛИ (Х<=337 нм), получены наследственно

змененныв в И^ форкы растений.,.....

По результатам работы поданы заявки на изобретения и получе-< 2 положительных решения. .

- и -

Практическая ценность. Практическая ценность исследования заключается в разработке и комплексной оценке нового метода индуцирования наследственной изменчивости, выявлении эффективных фотосенсибилизаторов б-меркаптопурина и хлорохина, получении ряда результатов, представляющих научный интерес.

Реализация результатов исследования. Предложен и проанализирован перспективный метод индуцирования наследственной изменчивости и даны рекомендации по его практическому применению для целей мутагенеза.

Апробация работ. Результаты исследования были' представлены в виде докладов на: ]У Всесоюзной научной конференции "Экологическая генетика растений, животных, человека", 1991г., Кишинев*, конференции молодых ученых "Актуальные проблемы физиологии растений и генетики", 1992г., Киев* VI съезде генетиков и селекционеров Молдовы, 1992г.* Кишинев* 1 Всесоюзной конференции по генетическим основам интродукции и акклиматизации растений, 1991г., Новосибирск-, на заседании ученого Совета Института генетики АН РМ, 1992г., Кишинев. •

Публикация исследований. По результатам исследований полу- ■ чено 2 положительных решения на изобретения, опубликованы 2 журнальных статьи и 3 тезисных доклада.

*

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 10» страницах машинописного текста^ включает 16.таблиц, 46 рисунков, состоит из введения, 9 глав, выводов и практических рекомендаций. Список использованной литературы включает 203 наименования, в том числе 136 иностранных авторов. * „

Условия, исходный материал и методика исследований. Экспериментальная работа проводилась в группе адресной изменчивости

- 'j -

Института генетики АН РМ в 1969 - 1992 гг. Часть работ, связанных о облучением препаратов проводилась в Институте физики АН Р!<. Деноитограммы электрофореграмм были сняты в Центре гаметной и клеточной селекции АН РМ. ЭПР - спектры были получены в Институте химии АН РМ.' Полевые опыты закладывались на экспериментальных полях ИГ и в теплицах Ботанического сада АН РМ.

' . чм - *

Объектами исследований служили кукуруза, томаты, лен. Линии кукурузы HliV ЧОЧ, МАЛ 95, XL 10, А 346 были получены из лаборатории, новой технологии селекции (ИГ, Кишинев). Томаты районированных сортов "Нистру" и "Факел" получены из коллекции КГ. Лен сорта "Новогоряский" получен из ВНИИ льна (г; Торжок, Россия).

Применялось стандартное оборудование для биохимических, цитологических и споктрофотоыетрических исследований, расположенное в' лаборатории адресной изменчивости ИГ АН РМ. ' .

Выделение из проростков ДНК производилось по методу.Лихтенштейна и ДреПпера. Образование ОНР и ДНР в ДНК регистрировалось методой гель-электрофореза в агарозных гелях в нативных и денатурирующих условиях.

В работе были использованы известие для систем viifc/-o красители-сенсибилизаторы акридин.оранжевый (АО), бромистый эти-дий (БЭ). Вместе с тем, по разработанной нами методике активно проводился поиск новых веществ, которые могли бы быть использованы if качестве эффективных сенсибилизаторов для систем си. vt-ti-o .

и ¿и. vuvo. ' ,

Для проведения цитологической оценки действия различных факторов на клетки меристемы, изучались хромосомные нарушения с использованием известной ана-телофанной методики.

Анализ возникших фекотонических отличий у растений и их наследование проводилось по семьям дли поколений Mj и Mg.

- б -

ССЩЕРЩИЕ РАБОТЫ.

Исследования фотомодификации нуклеиновых кислот, индуцированной интеркаляторами-сенсиоилизатораии и лазерным излучением.

Поиск нового эффективного прижизненного сенсибилизирующего красителя для нелинейного лазерного разрезания ДНК позволил отобрать из «Зольной группы (>50 препаратов) ряд веществ, до сих пор в качестве сенсибилизаторов не используемых. По эффективности фотомодификации ДНК в комбинации с лазером ЛГИ-2Г ( А=ЭЭ7 нм) к ним, в первую очередь, следует отнести б-меркаптопурин (6Ш). Сенсибилизирующие свойства, хотя и в значительно меньшей степени, проявили также впервые выявленные хлорохин (ХЛ) и аминохи-нол (АХ).

Наибольшая эффективность 6Ш при облучении комплексов ДНК-сенсибилизатор проявляется в образовании наибольшего числа однонитевых и двунитевых разрывов (ШР и ДНР) в молекулах ДНК. Калибровка длин фрагментов ДНК и денситометрия злектрофореграмм позволили рассчитать вффективность образования ДНР в нитях ДНК при облучении комплексов ДНК-сенсибилизатор ЛИ с Х=337 нм (Набл. I). Количество возникающих ДНР в ДНК в случае использования 6Ш в 2,6 раза больше, чей в случае с БЭ и в 5,2 раза больше' чем в случае с АО. Молярное отношение Г(краситель/нуклеотид ДНК) менялось в экспериментах от 1Д0 до 1/2. Исследованиями установлено, что в интервале плотностей мощности излучения от 0,5« юЪт/и^ до 0,7 ♦ Ю^т/м2 степень фрагментации ДНК не зависела от плотности мощности (Рц) ЛИ при постоянной плотности дози облучения. Выявленная закономерность выполняется для всех используемых сенсибилизаторов. По-видимому, в этом интервале Рм не проирходит качественных изменений механизмов передачи энергии ЛИ с молекулы сенсибилизатора на ДНК, а число ДНР в ДШ линейно зависит от Рм.

Были проведенн исследования по выяснение конкретных механизмов передачи энергии в указанном диапазоне интенсивностей. Для этого проводилось облучение комплексов ДНК-краситель в присутствии, разных концентраций тушителей радикалов СТР). Были сняты ЭПР - спектры комплексов ДНК-6МП, облученных в присутствии ТР и без* ни*. Били проведенн. эксперименты по фотодёградации молекул сенсибилизаторов'. Вышеприведенные исследования, свидетельствуют о наличии, как минимум, двух механизмов передачи энергии в указанном диапазоне интенсивностей. - Это механизм по радикальному типу и механизм, связанный с резонансной сенсибилизацией ДНК в комплексе ДНК-сенсибилизатор. В случае 6Ш механизм передачи энергии по радикальному типу преобладает.

...... . Таблица 1

Эффективность образования двунитевнх разрывов в ДНК при облучении ДНК и комплексов ДНК-сенсибилизатор ЛИ (Я=337 нм).

Используемый сенсибилизатор Средневесовая молекулярная масса ДНК т.п.н. Эффективность образования ДНР в ДНК в облучаемом о препарате (»10 )

ДНК ' 67 —

ДНК+ЛИ 65 3,87

ДНК-6МП+ЛИ 45 75,68

ДНК-БЭ+ЛИ 56 24,94

¿щк-ло+ли 61 12,47

дак-хл+ли 60 14,62

Облучение комплексов ДНК-краситель при повышенных темпе-атурах показало, что специфически возрастает степень фрйгмен-адии ДНК только в случае использования 6МП. Для остальных

сенсибилизаторов фрагментация ДНИ заметно не менялась. Измерения температур плавления ДНК и комплексов ДНК-сенсибилизатор, спектрометрические исследования и исследования по ингибироватш нуклеаэ-ной активности прорастающей пыльцы сенсибилизаторами, позволили предположить, что молекулы 6Ш могут взаимодействовать с ДНК ветра-, иваясь в главный или минорный желобок спирали, не меняя при зтоы информации сахаро-фосфатного остова ДНК. Проведенные нами приближенные расчеты, с учетом размеров молекул ДНК и 6Ш, допускают' оба варианта. Стабилизация при этом может происходить за счет электростатических сил взаимодействия ДНК и 6МП.

Эксперименты показали, что использование лазерных наносекунд-ных импульсов на длине волны 532 нм с Рц«= I010 Вт/м2 дает очень низкую эффективность фрагментации ДНК. В случае использования ЛИ с Д*532 нм, необходимо применение пикосекундных импульсов, которые позволяют получать порядка (I01-3- I0i¿i)Bt/m2, или производить поиск новых эффективных сенсибилизаторов специально для длины волны 532 нм. •

Вместе с тем, высокая эффективность фотомодификации ДНК при облучении комплексов ДШ-сенсибилиэатор ЛИ с А «=337 ни в. системе ¿и. vi-tro позволяет предполагать возможность использования эффекта совместного воздействия сенсибилизаторов и ЛИ в системах i*- vivo, Весьма перспективным представляется использование для целей мутагенеза выявленного сенсибилизатора 6Ш совместно с лазером ЛГИ-21 ( или с другим той же длины излучения, равной 337 нм). Определенный интерес, о этой точки зрения, представляют также выявленные сенсибилизатор ХЛ и АХ при совместной использовании с ЛГИ-21.

Исследования сенсибилизаторов на токсичностьт Исследования вкл0ч&лиъ8 себя изучение динамики прорастания семян в различных концентрациях красителей, миграцию молекул в прорастающие, семена.

и влияние поглощенного количества сенсибилизаторов на дальнейшее развитие растений.

Выяснено, что характер воздействия сенсибилизаторов на растущие корешки носит неоднозначный характер, т.е., наряду с ингйбиро-ванием развития, имеющего кесто при концентрациях (Ю^-КГ^М, при (10~б-10~8)М имеет место и стимулирующий эффект. 1

Спектрометрические исследования позволили рассчитать поглощение сенсибилизаторов одним прорастающий семенем кукурузы. . Таблица 2

■ Количество поглощенного сенсибилизатора одним прорастающим

семенем кукурузы. Линия Ш1У 404 (х!0"бг).

сенсибилизатор / БЭ . 6Ш ХЛ АО

количество поглощенного » сенсибилизатора через 24 часа 3,15 1,02 ' 4,73 . 2,75

— п — через 46 часов 3,80 1,40 5,10 3,00

Как видно из Табл. 2, скорость миграции 6Ш наиболее стабильна. Предположительно, это связано со значительной адсорбцией сравнительно крупных молекул БЭ, ХЛ, АО на структурных образованиях семян (оболочках, мембранах.и пр.). Малые размеры молекул 6Ш и их структурное сходство с молекулами аденина, возможно, позволяют им проницать в ткани семянадсорбируясь в меньшей степени.

Сравнение овечешФ в УФ свете эталонных комплексов ДНК-АО и замороженных клеток корешков кукурузы, проросшей в растворе АО . ( с = Ю--5 Н), позволило оценить попадание Ао в ядра клеток. Через 36 часов замачивания, в ядрах клеток корешков кукурузы присутствует АО в молярном отношении нуклеотидам ДНК не более чем

X » 1000. . - - о

После 72 часов ввдернки в растворах сенсибилизаторов, проросшие семена высаживались в грунт. К концу 3-ей недели показатели развития проростков для всех вариантов били схожи с контролем. Анализ вегетирующих растений не выявил достоверных различий между вариантами. Поколения растений в И^ также развивались одинаково.

Таким образом г I. С известной долей условности, по степени токсичности, используемые сенсибилизаторы можно расположить следующий образом: БЭ >ХЛ >6Ш>"А0.

2. При проращивании сеиян кукурузы в. концентрациях сенсибилизаторов в течение 72 часов, не происходит необратимого нарушения развития. Рост и развитие растений в дальнейшей восстанавливаются.

3. Мутагенного эффекта при воздействии сенсибилизаторов на семена не обнаружено.

Исследование способности светового излучения проникать в растительные ткани. На препарате' эпидермы с нижней стороны листа кукурузы, представляющей собой лонослой клеток, были сняты коэффициенты пропускания света для УФ и видимой'областей. Анализ полученных результатов позволяет утверждать«

1. ЛИ с А=337 ни наиболее оптимально для облучения растительных тканей, учитывая относительно высокую проникающую способность излучения (через ионослой клеток проникает 14% падающего светового потока) и достаточно высокую энергию квантов излучения.

2. С целью индуцирования изменчивости у растений, наиболее рациональным представляется облучение прорастающих из семени проростков на ранних стадиях развития. При этом, если семенная оболочка еще прикрывает проросток, её необходимо удалить, чтобы максимально открыть проросток для ¡воздействия ЛИ.

3. 'представляется перспективный использование ЛИ в сочетании с красителями-сенсибилизаторами для индуцироаания изменчивости

посредством воздействия на пыльцу, так как, учитывая строение пыльцевых зерен, полно оавдать попадания внутрь их значительной доли воздействующего светового потока.

Цитогенетическая оценка зф^ктов воздействия сенсибилизаторов и ЛИ на меристенние клетки кореаков кукурузы. Для облучения использовался лазер ЛГИ-21, так как предварительный анализ показал, что вероятность прямой или опосредованной модификации ДНК излучением с ^=337 ни крайне мала, что было подтверждено нашим исследованием. Как видно из табл. 3, при воздействии ЛИ ^а меристему корешков не отмечается достоверного увеличения числа хромосомных аберраций. Вместе с тем, увеличение плотности дозы облучения Рд приводит к снижению михотического индекса и при Рд порядка (4-7)-10^ Дк/м^ наблюдается 100% гибель клеток.

Таблица 3

биотический индекс и хромосомные аберрации в облученных клетках меристемы корешков кукурузы линии 1Ш 404; Рц^0,7 Ю^Вт/м^.

Бремя облучения Дж/м Митотический индекс, Кол-во ана- -тело фаз Число ХА, # Гибель корешков после аозд. ЛИ,$

Контроль - 16,14-0,37 547 0,54*0,31 -

2 сек 1,26 • ТО2 16,67^0,30 792 0,6310,28 0

10 сек 6,3 • Ю2 15,58-0,31 625 0,8010,36 0

30 сек 1,89. • ЮЭ 16,62^0',27 • '"788 - 0,7620-,31 0

I нин 3,78 -103 15,10^0,29 528 0,9410,42 0

Э мин 1,13 • 10ц 13,18*0,26 719 0,97*0,36 10 -■•

б мин 2,26-Ш4 5,40-0,16 278 1,08-0,62 70

10 мин 3,78 • Ю1* 0,80±0,07 49 2,0412,01 100

20 мин 7,56 -10^ отсутствие делящихся клеток.

Как видно, резкое снижение митотического индекса начинается при достикении плотности дозы Р =(0,4-1)- ю'^ Дж/ы*\

Проводились исследования по измерению митотического индекса и хромосомных нарушений в клетках меристемы корешков кукурузы при проращивании семян в различных концентрациях сенсибилизаторов (от 10"311 до 1<Г8Н). Установлено, что как и в случае ЛИ, достоверного увеличения числа хромосомных нарушений относительно контроля не наблюдается. Мекду тем, с очень высокой достоверностью отмечается во всех случаях снижение митотического индекса с ростом концентрации сенсибилизаторов. •

Таблица 4

Пиитический индекс (МИ) и хромосомные аберрации (ХА) в облученных клетках меристемы кукурузы, пророченной в различных концентрациях сенсибилизаторов* ¿=337 шц Рм= С^У-кАт/ы?; Т6бл= I мин.

' С,моль АО + ЛИ' хл + ли БЭ + ЛИ 6Ш + ЛИ

К.Н^'1 аи 16,4820,33 15,8020,29 14,4020,34 18,2220,38

ХА 0,4320,25 0,4720,28 0,4020,20 0,6520,32

Ют8 ш 16,1720,37 15,3120,33 12,9520,26 15,6020,32

ХА •0,5020,29. 0,6820,39 0,9820,49 • 0,6920,40

: ю-7 Ш1 »,5020,29 18,0920,34 11,2220,30 14,9420,29

ХА 0,4920,28 0,6920,34 2,7621,11 2,0020,55

ЯГ6 МИ 15,2620,35 12,3920,31. 5,0220,19 6,4320,22

ХА 0,9420,38 0,8220,47 4,5021,39 5,9021,41

10-5 МИ 10,7820,26 7,4220,22 2,3820,14 4,8320,19

ХА '1,0120,45 1,6920,60 2.2521.57 9.56*2.06

КГ* НИ 6,4020,22 1,1820,10 ' 0,3120,04 I,5120,II

ХА 1,4020,80 3,2822,28 -. - 4,5522,57

Ю-5 ; •ми 5,96*0,21 0,1620,04 - 0,1320,04

ХА 1,5220,87 . .. - - . . "

¡Сак видно из табл. Ь, отмечается достоверное увеличение числа ХА в случае 6Ш + ЛИ в 13,17 раз 3,79) ив 11,25 раз в

случае БЭ + ЛИ (-Ь = 2,89). В случае АО + ЛИ и ХЛ + ЛИ достоверного роста числа хромосомных нарушений не наблюдается. Обращает, на себя внимание корреляция между исследованием по лазерной фотомодификации да в комплексе ДНК-сенсибилизатор, когда 6ЫП проя-о вил в качестве сенсибилизатора наибольшую эффектность и наибольшим ростом числа ХА в случае обработки корешков кукурузы совмест- ' ним действием 6!,!П + ЛИ. !

Таким образом, проведенные цитогенетические исследования указывают на высокую эффективность системы лазер-сенсибилизатор при индуцировании хромосомных нарушений в клетках меристемы кореиков кукурузы, если для длины волны ЛИ 337 нм применяется сенсибилизатор 6Ш.

Эффекты совместного действия сенсибилизаторов и лазерного излучения на прорастающую пнльцу. Как известно, одним из крите-

риев чувствительности клеток к мутагенным факторам, могут быть эффекты, наблюдаемые при воздействии мутагенов на пыльцу. В этой части исследований было выяснено*

1. Возможность стимулирования прорастания пыльцы малыми дозами УФ ЛИ. Пыльца кукурузы и томатов облучалась в сухом ввде перед замачиванием в питательных средах (ПС) лазером ЛГИ-21 (А =337 нм).

2. Добавление в ПО сенсибилизаторов в малых концентрациях (

- Ю~0) М не оказывало стимулирующего действия на прорастание пыльцы. Дальнейшее увеличение концентрации оказывало явно иягиби-рущее действие на прорастание пыльцы кукурузы и томатов.

3. Анализ спектров поглощения лизатов пыльцы, снятых через разные промежутки времени после помещения пыльцы в ПС с добавленными сенсибилизаторами, а также спектров поглощения отмывающих растворов, позволил сделать вывод, что для всех сенсибилизаторов основнал

- т -

миграция молекул сенсибилизатора в пыльцевые зорна происходит уже в течение первой минуты замачивания. Наблюдения в люминесцентном микроскопе па прорастанием пыльцы, замоченной в ПС с добавлением АО и отмытой от АО через разные промежутки времени после замачивания, подтверждают этот вывод.

4. Продемонстрировано увеличение количества однояйцевых разрывов

в ДНК генома пыльцы при обработке пыльцевых зерен совместным действием 6ДО ( С=Ю"5М ) и ЛИ ( <= 0,9 • Ю8 Вт/и2* Тобл = 30 мин' ).

5. Выявлен эффект нелинейного снижения прорастания пыльцы, замо-. Чанной в ПС с добавленным сенсибилизатором н облученной в разные момент« времени после замачивания, связанный, по-видимому, с наличием интервала времени, в течение'которого прорастающая пыльца особенно уязвима к совместному действию сенсибилизаторов и ЛИ. Предложено объяснение наблюдаемому явлению, основанное на предположении & проникновении молекул сенсибилизатора в пыльцевые зерна и их включении в ДНК генома пыльцы через определенное время после начала замачивания ( для то^е.та 10 - 15 мин ).

Таким образом, результаты, полученные в этой части работы, не дают прямых доказательств, но указывают на возможный мутагенный эффект при обработке пыльцевых зерен совместным действием сенсибилизаторов (особенно 6МП) и лазерного излучения.

Красители - сенсибилизаторы как ингибиторы нуклеаз прорастающей пыльцы. В,результате проведенных экспериментов было обнаружено, что с увеличением количества пыльцы в ПС, резко возрастает её нуклеазная активность, выражающаяся в заметно более скорой деградации плазмидной ДНК, используемой нами в качестве субстрата. Было выяснено, что добавление в ПС сенсибилизатора БЭ позволяет значительно уменьшить нуклеазную активность пыльцы. В то же врем;,, 6Ш практически не ингибировал её. Очевидно, это связано с тем, что

6МП на является, в отличие от БЭ, янтаркалятором в классическом смысле и его комплексообразованив с ДНК не связано с изменением конформации сахаро-Ьосфатного остова спирали.

Таким образом, представляется возможным, что подобрав соответствующие концентрации тмин, экзогенной ДНК и интеркаляторов, мокко будет оптимизировать условия проникновения чужеродной ДНК в прорастающую пыльцу. В таком случае, можно использовать, янгер-каляторы для проведения генетической трансформации растений' посредством естественного процесса опыления-опЛодотворения. на интакт-ных растениях.

Индуцирование генетической изменчивости у растений посредством совместного воздействия сенсибилизаторов и ЛИ. Воздействие . производилось на 3-5 мм проросткй кукурузы -и льна. При этом А=337 нм; Рм= 0,5'107Бт/м2; Рд= 2,7-102де/м2. Рассматривались варианты: контрольно), ЛИ, АО, АО+ЛИ, БЭ, БЭ+ЛИ, ХЛ, 'ХЛ+ЛИ, 6МП, 6МП+ЛИ. Было исследовано по 30 растений на каждый вариант для кукурузы и по 100 растений для льна. Анализ вегетирующих растений кукурузы линии HMV 404 в Mj_ показал наличие резко выраженных фа но типических отличий от контроля (К) в варианте 6Ш+ЛИ у всех 30 растений и у 5 растений в варианте ХЛ+ЛИ. В остальных вариантах- достоверных отличий от К не наблюдалось. В М2 било внсаяено по 40 зерен кукурузы от растений » изменениями в Mi» Анализ М2 показал наличие измененных признаков- в 3-х семьях у растений варианта 6МП+ЛИ. В семье А найлюдались следующие фенотипы: , 1. Низкие, карликовые растения, высотой 20-30 см о расщепленным'початком на вершине. Метелки отсутствовали. При опшгашш с К эавязы-ваемость 5-10%. Количество растений - 12. 2. Низкорослые растения высотой 60-70 см. Количество растений - 11. 3. Растения фвкотипн-чески схожие с К, Количество растений - 17.

Семья Б : 1; Растения о одновременным развитием в метелке мужс-' ких и женских цветков. Завязнваемость при самоопылении 5-15^.

Высота кустов от 60 см до 100 см. Количество растений - 16. '' 2. 'Низкорослые растения с развитием метелки, представляющей

собой одну центральную веточку. Початки отсутствовали. Пыльца ' на ПС не прорастала. При опылонии ею К завязываемосги на происходило. Высота растений - 60-70 см. Количество растений - 5. 3. Растения, фенотипически схожие о К. Количество растений - 19. ' Семья. В i 1,Растения низкорослые. Высота куста 60-70 см. Коли' чёство листьев уменьшено. Завязнваемость при самоопылении 60-70$. Количество растений.- 9. 2. Растения,фенотипичёски схожие с Д. Количество растений - 31. •

Таким образом, в 3-х семьях из 30 в варианте совместного использования 6Ш и ЛИ в М2 наблюдались растения о измененными признаками, что, по всей вероятности, связано о генотиПическими изменениями, т.е.» с возникновением мутаций.

Результаты, полученные при обработке проростков льна совместным действием сенсибилизаторов и ЛИ приведены в таблице 6.

V Таблица 5

'Фактор ' воздействия Количество семей с изм. призн. : в Mj/ Количество семей о изм. приэн. в м2 . Виды изм. признаков • в М2

6Ш+ЛИ - М+Ш % БЭ+ЛИ .". 26 .17 -14 14 (53,8$) Полностью желтые проростки-23£ Желтая . 'точка роста -35?

В остальных вариантах растений с измененными признаками в М. не наблюдалось.

Таким образом, хотя большинство проявившихся в М^ изменений идентифицировано нами как мутанты, тем но менее, появление некоторых форы может быть обусловлено и другими генетическими и физиологическими механизмами, например, рекомбинациями, дли- . тельными модификациями и др. Окончательный вывод о природе наблюдаемых изменений может быть сделан только при анализе семей в Ц^ и ¡1^. Однако, весьма покаэамльно уае и, что измененные формы в 1^2 проявлялись только в случае совместного дейотвия ,6Ш и ЛИ, что коррелирует с наибольшей эффективностью сиотемы 6Ш + ЛИ при фотомодификации ДНК и при цитологических исследованиях. Продолжением исследований была работа по опилейив кукурузы пыль-, цой, обработанной 6Ш, ЛИ и их совместным действием..

Таблица б

Завязываемость семян на початках кукурузы линии Н№/ при опылении пыльцой, обработанной 6Ш, ЛИ и их совместным'действием

Вариант обработки Количество обработанных початков Завязываемость семян на початке

Контрольное самооп. 10 88

Пыльца облучена ЛЙ; в сухом виде 10 93

Пыльца замочена в ПС 10 29

Пы^ца забочена в 10 21 '

Пыльца замочена в ПС и облучена ЛИ 10 ", 2

Пыльца замочена в ПС+бМП И обл. ЛИ 10 0,5

Семена варианта ПС + бМП + ЛИ высаливались в грунт. Достоверных

отличий вегетирущих, растений, выращенных из этих семян не обнаружено, однако, при анализе початков, на одном из 20 анализируемых было обнаружено расщепление семян по цвету эндосперма, что свидетельствует на проявившуюся в мутацию. На початке наблюдалось 13 семян с белым эндоспермом, 15 светло-желтых семян и 12 хемно--желтых семян. Полученный результат говорит о возможности индуцирования мутаций у растений посредством обработки пыльцы 6МП * ЛИ о последующим опылением. *

ВЫВОД«

I. Комплексная оценка' предлагаемого метода, проведенная на молекУ-' лярнои, клеточном, организменком уровнях, устанавливает наличие мутагенного эффекта при совместном действии сенсибилизаторов и лазерного излучения на растительные объекты.

2« Выявленный по разработанной методике сенсибилизатор 6МП по эффективности фрагментации ДНК многократно превосходит ранее используемые для системы ¡.н >/Цго . красители АО и БЭ.

3. Ком'плексоооразование ДНК -6МП не приводит к изменению конформа-

: ции сахаро-фосфа! но го остова ДНК. .

4. Передача энергии ЛИ о молекулы 6Ш на ДНК, приводящая к появлению разрывов в цепи ДНК, происходит преимущественно по механизму радикального типа. Одновременно, хотя и в меньшей степени, энергия передается по механизму резонансной сенсибилизации ДНК.

5« При использовании лазера ЛГИ-21 (А. =337 нм) совместно с 6ЫП, наблюдается резкое достоверное увеличение числа ХА в клетках меристемы корешков кукурузы. При этом, раздельное воздействие . на меристему ЛИ и 6Ш1 к увеличению числа ХА не приводит.

б. При обработке проростков кукурузы и льна, совместным действием б МП и ЛИ (Я »337 нм), в М2 воэмохио появление генетически изме-неяннх форм растений. ...

7. Возможно получение нутаций у кукурузы при опылении растений пыльцой, обработанной совместным действием 6Ш и ЛИ (А=Э37 нм),

8. При замачивании пыльцы в ПС с добавлением сенсибилизаторов, основная ыиграция молекул сенсибилизаторов в пыльцевые зерна происходит уке в течение первой минуты замачивания,' , Существуют интервалы времени, в течение которых прорастающая пыльца, замоченная в ПС с добавлениям сенсибилизатором, наиболее' уяз* вима к воздействию ЛИ. Возможно, это связано с миграцией молекул сенсибилизаторов в пыльцевые зерна и их связыванием'с!ДНК. Обработка пыльцевых зерен совместным действием 6Ш и ЛИ ведет к увеличению числа однонитевых. разрывов в геномной ДНК пыльцы.

9» Излучение с А» ( 300 - 400 )нм наиболее оптимально для облучения растительных тканей'как обладающее относительно высокой проникав-' щей способностью и достаточно высокой энергией квантов излучения,

Ю.Интеркаляторы модно использовать в качестве эффективных ингибиторов нуклеаз прорастающей пыльцы.

РЕКОМЕНДАЦИЙ

1. Рекомендовать использование совместного действия лазера ЯГИ-21 и выявленного сенсибилизатора б-меркаптопурина для целей экспериментального мутагенеза.

2. Для индуцирования мутаций рекомендовать производить обработку проростков совместным действием сенсибилизаторов и ЛЙ на ранних стадиях развития проростков. В том случае", если семенная' оболочка прикрывает проросток, её необходимо удалить, чтобы максимально открыть проросток для воздействия ЛИ.

3. Рекомендовать производить опыление растений пыльцой, обработанной совместным действием сенсибилизаторов и ЛЙ для получения новых мутантных форм растений.

ИЗЛОЖЕНИЕ МАТЕРИАЛОВ ДИССЕРТАЦИИ В ПУБЛИКАЦИЯХ»

1. Пащейко В.Н. Заявка на изобретение■№ 5022116/13-002414 "Способ получения мутаций растений". Положительное решение от 16.02.93г.

2. Пащенко В.М. Заявка на изобретение К 5022092/13-002381 "Сенсибилизатор - интеркалятор". Положительное решение от 18.02.93г.

3. Пащенко В.М., Бурилков В.К», Лысиков В.И. Совместное действие красителей-сенсибилизаторов и ЛИ на митотические клетки кукурузы Тез. докл.^ Всес. ваучн. конф. "Экологическая генетика растений кивотиых, человека", 1991 г., Кишинев, с. 55.

4. Пащенко В.М. 'Мутагенный эффект действия сенсибилизаторов - иктер-каляторов и ЛИ на растения. Тез. докл. коиф. мол. ученых "Актуальные проблемы физиологии растений и генетики", 1992 г., Киев, с.122

5. Пащенко В.Н., Чеснбков Ю.В..» Бурилков В.К., Лысиков В.Н. Эффекты совместного действия УФ ЛИ и красителей-сенсибилизаторов на прорастающую пыльцу //Изв. АН РИ; сер. Биологические и химические науки, 1992 Г., 16 5, о. 19-24.

6. Чесноков Ю.В., Пащенко В.М.' Транспорт экзогенной ДНК посредством

. прорастающей пыльца. Материалы У[съезда МОГиС, 1992 г., Кишинев,

с. 50.

7. Пащенко В.II., Бурилков В.К., Чесноков Ю.В. К вопросу о возможном механизме взаимодействия ЛИ с комплексом ДНК-6МП. //Изв. АН РМ, сер. Биологические и химические науки, 1993 г., К I, с. 32-37.

РТТЬТшьВШЧЗак. 243.Tup.I00. 9.04.03.