Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Фотодинамическая активность производных хлорина е6: молекулярные и клеточные аспекты

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Фотодинамическая активность производных хлорина е6: молекулярные и клеточные аспекты"

АКАДЕМИЯ НАУК БЕЛАРУСИ ИНСТИТУТ ФОТОБИОЛОГИИ

На правах рукописи УДК 577.37:577.357.4В4.ЯЗ

ЗОРИНА Татьяна Евгеньевна

ФОТОДИНАМИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ПРОИЗВОДНЫХ ХЛОРИНА МОЛЕКУЛЯРНЫЕ И КЛЕТОЧНЫЕ АСПЕКТЫ

'03.00.02 - Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Минск 1992

Работа выполнена в НИЛ биофизики и биотехнологии при кафедре биофизики физического факультета Белгооуниверситета им. В. И. Ленина, Минск

Научные руководители - член-корреспондент АН Беларуси,

доктор физико-математических наук, профессор Г. П. Гуринович

доктор биологических наук, профессор С. Н. Черенкевич

Официальные оппоненты - доктор биологических наук ® Е. А. Черницкий,

кандидат биологических наук А. В. Иванов

Ведущая организация - Московский государственный университет

имени М. В. Ломоносова кафедра физико-химической биологии

Зашита состоится ¿¡эЗоЬйА*!. 1992 г. в ^ часов на

заседании специализированного Совета Д 006.05.01 по защите докторских диссертаций по специальности "биофизика" при Институте фотобиологии АН Беларуси (220733, Минск, ул.Скорины 27).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института фотобиологии АН Беларуси.

Автореферат разослан "<^3 " /М 1992 г.

Ученый секретарь специализированного Совета м. Шейко

Институт фотобиологии Академии наук Беларуси,1992

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Значительное увеличение интереса к

фотохикиотералии в последние годы связано с развитием метола

фотодинонической терапии рака (ФДТ), основа>$>го на

использовании комбинированного действия на опухоль видимого

света м фотосенсибилизирукяего пигмента. Наибольшие успехи в

развитии этого метода связаны с применением производного

гематопорфирина (ПГП), препарата, используемого в клинической

практике с 1960 г. /DoucMerty st al., 1975, 19G5, 1988/. Однако

ИГП обладает рядом недостатков, ограничивают« его возможности

как сенсибилизатора при ФДТ /Jory, J9B7; Kessel, 1983/. Среди

них основными являются многокомпонентный состав ПГП, а также /

низкиП коэффициент экстинкции в длинноволновой области спектра, обычно используемой для проведения ФДТ. Одним из наиболее перспективных путей развития ФДТ в последнее время является поиск новых более эффективных. фотосенсибилизаторов, превосходящих ПГП по своим фотофизическим и опухолелокализующим свойствам.

Б связи с этим большое значение приобретает исследование влияния особенностей химической структуры тетрапиррольных пигментов <ТПП) на их фотосенСибилизируюшие свойства при ФДТ. Установление подобных корреляций позволит значительно упростить процедуру отбора сенсибилизаторов, а также оптимизировать режимы.и методы проведения ФДТ.

Одним из наиболее перспективных сенсибилизаторов для ФДТ является производное хлорофилла "а" - хлорин ев (Хл ев), обладающий выгодными спектральными и энергетическими характеристиками < '=665 ни, s -- 4,a«to4 м~ см *>. Этот

пигмент способен избирательно локализоваться в солидных опухолях и сенсибилизировать их фотодеструкцию ^'уринович и др., 1936; Костенич и др., 1985/. Путем химической модификации ионогенных карбоксильных групп в молекуле Хл eR был получен ряд производных, различающихся по составу боковых заместителей в тетрапиррольном цикле: триметиловый эфир хлорина efi <ТМЭ Кл ев), яиметиловый эфир хлорина ев ( ДМЭ Хл ев> и этиленлиниид хлорина ев ОДА Хл ев>( рис.1).

Цель и задачи исследования. Цель работы состояла в

комплексном сравнении фотофизических, солюбилизациониых, фармакокинетических характеристик производных Хл е6, которые влияют на эффективность ФДТ. Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Сравнить спектрально-флуоресцентные и абсорбционные характеристики производных Хл ев в различных средах и биосистемах.

2. Изучить фотосенсибилизирувщие свойства производных Хл ев в растворе, клеточных мембранах и клетках.

3. Исследовать молекулярные и клеточные механизмы цитотоксического действия производных Хл ев.

4. Изучить механизмы транспорта производных Хл се в организме опухоленосителя.

5. Исследовать способность производных Хл ее накапливаться в опухолевых тканях и сенсибилизировать их повреждение.

Научная новизна работы. На примере группы пигментов производных хлорина ее. (Хл ев), а также тетракарбоксифенилпорфина (ТКФШ проведено комплексное исследование взаимосвязи между физико-химическими характеристиками молекул тетрапиррольных пигментов и их фотосенсибилизирукией эффективностью в растворах, модельных и клеточных системах. Установлено, что эффективность сенсибилизации фотоповре ждений модельных и клеточньс< биоструктур определяется способностью производных Хл ее связываться с клетками и клеточными мембранами.

Впервые проведено исследование фармакокинетики производных Хл еа. Установлено, что различия в опухолелокаяизующей способности исследованных пигментов обусловлены механизмами их транспорта в организме опухоленосителя.

Экспериментально обосновано преимущество использования производных Хл ее в сравнении с Хл е6 в фототерапии злокачественных новообразований.

Практическое значение работы. Диссертационная работа выполнялась в " рамках Республиканской научно-технической программы по онкологии <69.01.р). Полученные результаты могут быть использованы в научных организациях и• медицинских учреждениях, ведущих исследования по изысканию новых

ффективных фотосенсибилизаторов порфиринового класса, азработанные при выполнении работы методические приемы определение фотогемолитической и фотоцитотоксической ктивности пигментов in vitro и др. ) могут быть использованы ак критерии доклинической оценки эффективности тетралиррольных игментов как фотосенсибилизаторов для ФДТ злокачественных эвообразований.

Основные положения, выносимые на защиту. . Отличия флуоресцентных характеристик и квантового выхода гнерации 02 в водных растворах пигментов обусловлены азличным агрегационным состоянием исследованных пигментов. . Различия в эффективности фотосенсибилизированных повреждений петок и клеточных мембран производными 2л е обусловлены зодинаковой способностью пигментов связываться и накапливаться клетках и клеточных мембранах.

, Эффективность фотосенсибилизации повреждений клеток убывает ряду: ТМЭ Хл ев, ДМЭ Хл е6> ЭДА Хл ее. Хл ев, гематопорфирин ГП), тетракарбоксифенилпорфин .

. Исследованные хлорины и ТКФП различаются по сродству к ^лкам сыворотки крови. Неполярные производные Хл ек в лворотке крови образуют комплексы с липопротеинами низкой и sicokoii плотности (ЛНП и ЛВШ. Полярные пигменты Хл ef. и ТКФП зрбируются главным образом альбуминами и глобулинами сыворотки ?ови..

Изменения физико-химических свойств производных Хл }язанные с химической модификацией Хл е6 при замещении атомов здорода в карбоксильных группах на метилыше (диметиловый и зиметиловый зфиры Хл ев) и метильную и аминную (ЭДА Хл ев) зуппы приводят к изменению опухолелокализующей способности 1гмента и его эффективности как сенсибилизатора для ФДТ.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы

жладквались на II Всесоюзном совещании "Люминесцентный анализ медицине и биологии и- его структурное обеспечение" (Рига, 385), Всесоюзной конференции 1ю применению лазеров в клинике и ссперименте (Москва, 1987), I Всесоюзном рабочем совещании Зиофизика рака" (Черноголовка, 1987), ХШ Международной энференции по когерентной и нелинейной шпике (Минск, 198Й),

VII Всесоюзной конференции "Магнктнь1й резонанс в биологии и медицине" (Звенигород, 1989), Международной конференции, по фотодинамической терапии (София, 1989), Ш Конгрессе Европейского фотобиологического общества (Будапешт, 1989), Всесоюзной конференции "Проблемы синергизма в радиобиологии" (Пущино, 1989), XIV Международной конференции по когерентной и нелинейной оптике (Ленинград, 1091), Ш Всесоюзной конференции по фармакокинетике (Москва, 1991).

Публикации. По теме диссертации опубликована 21 печатная работа.

Структура' диссертации. Диссертация состоит из обзора литературы (глава 1), методической части (глава 2), изложения полученных результатов и их обсуждения - (главы 3-5), выводов и списка литературы, содержащего 197 ссылок. Полный объем диссертации составляет 177 страниц, включая 30 рисунков и 11 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность работы, сформулированы задачи исследования.

В первой главе дан обзор . литературных данных по применению производных порфиринов в качестве сенсибилизаторов для ФДТ солидных опухолей. Значительное внимание уделено данным по использованию для этик целей порфириновых и порфириноподобных соединений. Рассмотрены механизмы сенсибилизированных порфиринами фотохимических повреждений основных классов биологических молекул и связанных с ними структурных и функциональных нарушений в клетках и клеточных органеллах. На основании данных литературы проанализированы факторы, влияющие на эффективность ФДТ с использованием ТПП. Сделан вывод о том, что сенсибилизирующие свойства порфириног при ФДТ зависят как от фотофизическик свойств молекул пигментов, так и от их фармакокинетического поведения в организме опухаяекосителя. С учетом этого сформулированы конкретные задачи, решение которых необходимо для достижения поставленной в работе цели.

Во второй главе описаны материалы и методы исследований,

б

использованные при выполнении диссертационной работы.

Реактивы: Хл е и его производные были получены в ИФ Ail Беларуси, ГП.получен в МЙТХТ. Другие вешщества, используемые ь работе, имели следующую квалификацию: ТКФЕ - фирмы "Porphyrin product", 5,5-дитиобис-2-нитробензайная кислота,

супероксиддисмутаза, Д-манитол, триптофан - фирмы "Sigma" (США), сывороточный альбумин человека, акрилекс - "Reanal" (Венгрия), Triton Х-100 - "Ferak" (ФРГ), трипановый синий -"Ctiemapol- (ЧССР), 1,4-диазобицикло( 2,2,2 )октан - "Fluka" (ФРГ). Остальные реактивы - отечественного производства квалификации х.ч. или ч.д.а.

В работе использовали лецитин производства Харьковского завода бактерийных препаратов.

Среды. При работе с клетками и клеточными культурами использовали среды Игла и 193 (НЕМ), раствор Хэнкса, эмбриональную сыворотку, телят производства БелНИИ эпидемиологии и микробиологии Минздрава Беларуси; фосфатно-солевоИ буфер (ФСБ) Дюльбекко : 137 мМ NaCl; 2,7 мМ KCl; 8,7 мМ Na ПРО ; 1,48 лМ

2 4

КН РО .

г * •

Объекты исследования. Исследования с клетками in vitro проводили с использованием суспензий клеток экспериментальных опухолей (АРЭ, гепатомы А, рака легкого, солидной саркомы), полученных в институте цитологии и генетики АН Беларуси, а также . культуры клеток HeLa, L-41, фибробластоь куриных эмбрионов, полученных в БелНИИ эпидемиологии и микробиологии Минздрава Беларуси. Эритроциты выделяли из консервированной донорской крови. Мембраны эритроцитов (тени) получали по методу Доджа и соадт. /Dodge et al., 1963/. Бактериальные штаммы Escherichia coli К-12 ABl 157, AB2463recA13. ABl Blitiuvr A6, AB2480uvrA6recAl3 получены "из коллекции микроорганизмов ШГЖ БГУ им. В. Й. Ленина. Бактериальный штамм Bacillus subtil ia sh:>:i -из института общей генетики АН СССР.

Фармакокинетические исследования и фотолинвмичеиком повреждение опухолей изучали На мышах, носителях гепатомы Л и солидной саркомы, индуцированной метилхолантреном.

Методы исследования. Электронные спектры поглощения регистрировали на спектрофотометрах Sppcord uv-vis <П1Р> и

Beckman (ФРГ). Спектрально-флуоресцентные характеристик)

пигментов исследовали на автоматическом спектрофлуориметр!

SLH-4800 (США). Время, жизни флуоресценции (г ) измеряли hi

8

импульсном флуориметре PRA-3000 (Канада), работающем в режим* счета фотонов.

Эффективность фотогенерации *02 производными Хл ес> i растворах оценивали по окислению ДФ£Ф согласно метод; /Hatheson et at, 1974/.

Скорость процессов перекнсного окисления липидов в теня: эритроцитов регистрировали по тесту с тиобарбитуровой кислото; /Владимиров и- др, 1972/. Изменение количества мембранньп зн-групп в тенях эритроцитов при фотосенсибилизации хлоринам! определяли по методу /Торчинский, 1977/.

Скорость окисления триптофанилов белков теней' эритроцито! при облучении видимым светом в присутствии производных Хл ei определяли флуориметрически =236 нм, =335 нм).

Спектры ЭПР были сняты на ЭПР спектрометре РЕ-1306.

Гемо лиз эритроцитов исследовали методом малсугловоп светорассеяния с помощью лазерного нефелометра, описанного i работе /Татаринов и др. , 1980/.

Флуоресцентно-микроскопические исследования проводили Hi сканирующем люминесцентном микроскопе-фотометре HPV-2 Zeit: (ФРГ), сопряженном с компьютером. Микрофотосъемку вели i применением автоматической камеры Ortomat (ФРГ).

Жизнеспособность клеток определяли в тестах с трипановья синим и по выходу радиоактивного хрома /Линг, 1971/. Количеств! жизнеспособных бактериальных клеток определяли по числ; колоний, образующихся после высева на агаризованную питательну! среду на 24 часа инкубирования при 37°С.

Анализ распределения пигментов между компонентам сыворотки крови проводили методом гель-хроматографии н; колонках (2x90 см), заполненных "Акрилексом Р-300".

Изучение фармакокинетики производных Хл ев проводили н< мышах;носителях гепатомы А и солидной саркомы, индуцированно] метилколантреном. Концентрации пигментов в различных тканя: определяли по методу /Гуринович и др, 1986/.

Фотодинамическую терапию проводили на мышах, носителя:

солидной саркомы. Для эксперимента были выбраны 30 мышей с опухолями приблизительно одинакового размера. Сравнение эффективности фотовоздействия, сенсибилизированного Хл ев и ЭДА Хл е , проводили на 10-й день после облучения, определяя вес и площадь некроза опухоли.

В третьей главе представлены результаты исследований спектрально-флуоресцентных свойств и фотохимической активности производных Хл ев в растворах и в модельных биологических системах.

Рис.1. Структурные формулы Хл ев и его производных.

Хл е.

Г? =1* =Н:

1 2 '

И =он

ДМЭ Хл В : И =н, и =СН

О 1 2 3

ТМЭ Хл ее ЭДА Хл е.

И =осн

з . з

й =Н. И =СН

4 2 3

И =НН-СН -СН -НИ

Характерной особенностью спектров электронного поглощения исследованных пигментов является наличие интенсивной длинноволновой полосы поглощения при 660 нм, величина коэффициента экстинкции в которой более чем на порядок превышает соответствующие значения коэффициента экстинкции

длинноволновых полос ТКФД и ПГП (раздел 3.1).

Определены х , величины квантового выхода и времени

так

жизни флуоресценции производных Хл ев в различных растворителях и при связывании с сывороточным альбумином, липосомами и клетками. На основании полученных данных показано, что в неполярных органических растворителях все исследованные пигменты находятся в мономерном состоянии, при этом их абсорбционные и флуоресцентные характеристики практически не различаются. Неодинаковые изменения параметров флуоресценции при переводе Хл ее и его производных в водную среду (ФСБ) объяснены различиями в процессах образования агрегатов молекул этих пигментов в полярных растворителях. Полярный Хл ее (Кокт /вода= 15 в водной среде не агрегирует вплоть ' до концентраций 10~с И /Кочубеев и др. ,1989/. Его неполярные Производные ДМЭ Хл е , ТМЭ Хл ев и ЭДА Хл ев в водной среде находятся в виде агрегатов . Следствием ' этого является характерное для агрегатов ' Т1Ш . снижение квантового выхода и времени жизни флуоресценции, а также коротковолновый сдвиг и уширение спектров флуоресценции исследованных пигментов.

Связывание пигментов белками, липосомами, клетками приводит к их дезагрегации. Вследствие этого в суспензиях липосом и клеток, в растворе белка наблюдается увеличение квантовых выходов и времени жизни флуоресценции ДМЭ Хл е , ТМЭ Хл е0 и ЭДА Хл (табл.1).

В разделе 3.2 представлены результаты исследования фотоактивности производных Хл е в растворах и модельных биологических системах. Поскольку О считается основным агентом, инициирующим фотохимические реакции,

сенсибилизированные порфиринами в биосистемах, проведено исследование фотоокисления в присутствии производных Хл акцепторов синглетного кислорода. С использованием дифенилизобензофурана определено, что значения квантовых выходов генерации Ч) для всех производных Хл ев в мономерной Форме одинаковы и равны 0,5+0,1. Агрегация производных Хл ес в водных растворах ведет к снижению их фотоактивности в сравнения с Хл е , что находит отражение в уменьшении в 2,0-2.5 раза скорости фотосенсибилизировашшго ЭДА Хл е и ТМЭ Хл с

ю

Таблица 6.

Флуоресцентные характеристики хлорина е- к его производных в различных системах

Пигмент Квантовый выход флуоресценции, % хзрекя шш флуоресценции, не К

ацетон фосф. буфер Не1а САБ Л1ШОСОШ фосф. буфер дипосомы

1л е6 19,2+1,0 15,0+1,0 15,7+1,0 15,7+1,0 17,0+1,0 4,49+0,03 5,21+0,03 1Д

ДШ Хк е6 1а,б±1,о 1,2+1,0 10,4+1,0 8,5+1,0 12,4+1,0 1,73+0,Со 5,11+0,42 -

ЗДА Хд еб 18,9+1,0 5,5+1,0 11,0+1,0 14,58-1,0 10,5+1,0 3,80+0,20 5,12+0,03 5,0

ТЮ Хл е6 18,2+1,0 - 8,2+1,0 6,2+1,0 8,0+1,0 - 5,20+0,03 37,9

л - аоэффацаеет распределения пвгаентов з система октанол-вода

окисления триптофана в водных растворах.

Относительную фотоактивность пигментов, связанных с клеточными и биологическими мембранами, исследовали по скорости фотоокисления различных компонент эритроцитарных мембран. Исходя из результатов анализа изменения содержания триптофанилов и 8Н-групп белков эритроцитарных мембран, а также концентрации ТБК-активных продуктов перекисного окисления липидов сделан вывод, что все исследованные производные Хл --е являются эффективными сенсибилизаторами фотоповреждения как белков, так и липидов эритроцитарных мембран. Более высокая способность к солюбилизации в эритроцитарных мембранах ТМЭ Хл ев, ДМЭ Хл ев и ЭДА Хл ев по сравнению с Хл ее определяет количетвенные различия в скоростях 'фотосенсибилизированного повреждения хлоринами мембранных компонентов.

Дополнительную информацию о процессах

фотосенсибилизированного окисления мембран' в присутствии хлоринов позволяют получить результаты исследования окисления ЭПР-меток, локализованных на различной глубине (при Св, с и С1ватомах углеводородной цепи липидов) в липидном бислое липосомальных мембран. Более быстрое выгорание ЭПР-зондов в растворах неполярных ДМЭ Хл ев и ЭДА Хл ев в сравнении с Хл е6 и водорастворимым ТКФП согласуется с выводом о зависимости фотоактивности производных Хл ев от их способности солю-билизироваться в мембранных структурах.

Сравнение кинетических констант скорости окисления различных доксильных радикалов позволяет предположить, что наиболее вероятные центры локализации ДМЭ Хл ее и ЭДА Хл ее смещены в углеводородную фазу липидной мембраны по сравнению с центрами локализации Хл е .

Удобной моделью для изучения процессов

фотосенсибилизированного повреждения клеточных мембран является фотосенсибилизированный гемолиз эритроцитов. В разделе 3.3 представлены характеристики гемолиза эритроцитов человека при облучении видимым светом а присутствии производных Хл еь, а также . ГП и ТКФП. Методом ингибиторного анализа с использованием акцепторов различных активных форм кислорода показано, что процесс повреждения эритроцитов в исследованной

системе опосредован, главным образом, действием *0 .

Проведено сравнение фотогемолитической активности исследованных пигментов при облучении суспензии эритроцитов светом с \=506 ни.При условии равенства поглощенных доз их фотогемолитическая активность убывает, в ряду ТМЭ Хл е0> ЭДА Хл.ев> Хл ее> ГД >ТКФП. Установленные различия в скоростях

гемолиза коррелируют индуцировать фотохимс

со способностью пигментов связываться и дческие повреждения в тенях эритроцитов.

Описанные в разделе 3.1 и 3.2 результаты показывают, что отличия собственных фотофизических свойств пигментов не могут служить причиной их различной фотоактивности, регистрируемой по скорости фотосенсибилизированного гемолиза эритроцитов и окислению компонентов клеточных мембран. На основании * этого было сделано заключение, что основную роль в определении эффективности повреждения клеток и клеточных мембран играет способность произв'одных Хл ев связывается с клеточными мембранами. В пользу этого свидетельствует наличие корреляции между коэффициентом распределения молекул сенсибилизаторов в двухфазной системе октанол-вода и их фотоактивностью в суспензии эритроцитов и эритроцитарных мембран.

Четвертая глава диссертационной работы посвяшена изучению процессов взаимодействия производных Хл ев с различными типами клеток.

В разделе 4.1 представлены результаты исследования механизмов накопления и локализации различных производных Хл еп в опухолевых клетках в условиях in vitro.

Показано, что в бессывороточной среде накопление пигментов определяется их способностью солюбилизироваться клеточными мембранами. В присутствии в среде инкубации сыворотки крови связывание сенсибилизаторов контролируется процессами взаимодействия сывороточных белков с клетками. Установлено, что основную роль в накоплении производных Хл ев в среде, содержащей сыворотку, играет рецептор-опосредованный эндоцитоз ЛНП. Вследствие этого, в присутствии сыворотки крови скорость накопления хлоринов в 'клетках весьма чувствительна к изменению характеристик среды инкубирования, а также метаболического состояния клеток. Более высокая скорость накопления ТМЭ Т.п с ,

'jjia Хл еь ь опухолевых клетках в этих условиях объясняется иысоким сродством этих неполярных соединений к липопротеинам сыворотки крови.

Метод флуоресцентной микроскопии позволил охарактеризовать /ыкышзацню исследованных сенсибилизаторов в клетках. Показано, что, как и ряд других порфиринов /Ito, 1983; Фролов, 1088/ производные Хл е локализуются, главным образом, в мембранных структурах клетки. Распределение интенсивности флуоресценции между различными компартментами клетки при их окрашивании в бессыаороточной среде однотипно для различных производных Хл ев. При инкубировании клеток с ЭДА Хл е ' и ТМЭ Хл ee а присутствии сыворотки крови отмечено появление в цитоплазме ярко светящихся гранул, предположительно эндосом и первичных лизосом клетки, что согласуется с выводом о вовлеченности в процесс накопления этих пигментов в клетках эндоцитоза комплексов сывороточных белков и молекул сенсибилизаторов.

Результаты исследования фотоактивности, производных Хл ее в суспензиях опухолевых клеток in vitro рассматриваются в разделе 4.2. bee исследованные производные Хл ев эффективно сенсибилизируют повреждение клеток различных культур и экспериментальных опухолей. Фотоцитотоксическая активность этих сенсибилизаторов более чем на порядок превышает активность ГП и ТКФП в пересчете на одинаковую концентрацию пигментов в клеточной суспензии. Фотоактивность производных Хл ее хорошо коррелирует с их способностью связываться опухолевыми клетками. Вследствие этого, при облучении видимым, светом клеток в присутствии ТМЭ Хл ев и ЭДА Хл ее скорость их инактивации в 2-2.5 раза выше в сравнении с Хл ев. Для различных типов опухолевых клеток расположение хлоринов в ряду активности не изменяется. В то же время, чувствительность самих клеток к фотосенсибилизированному производными Хл ев воздействию существенно различается. Анализ кинетики инактивации клеток АРЭ ь динамике роста опухоли показал, что чувствительность опухолевых клеток на поздних стадиях развития опухоли значительно увеличивается. Важной особеностью процесса фотосёнсибилизираванной клеточной инактивации в условиях in vitro является наличие различающихся по фоторезистентности

сублиний в популяции клеток экспериментальной опухоли. Об этом свидетельствуют результаты исследования изменений хромосомной структуры популяции клеток АРЭ после фотосенсибилизировзжюго Хл е воздействия. Полученные результаты показывают, что биохимические и ультраструктурные особенности клеток злокачественных опухолей должны учитываться при разработке методов ФДТ. }

Дополнительно 'проиллюстрировать. влияние структурно-функциональных характеристик клеток на их чувствительность к сенсибилизированному порфиринами фотоповреждению позволяют результаты исследования кинетики фотоинактивации различных штаммов бактериальных клеток (раздел 4.3. ). Показано, что с особенрстями структурной организации плазматической

мембраны и клеточной стенки связано более чем 200-крптнор различие в чувствительности грамлоложителышх и

грамотрицательных Ъактерий к сенсибилизированному Хл е фотоповреждению. Клеточная стенка грамотрицательных бактерий снижает способность порфиринов связываться и окрашивать плазматическую мембрану /Bertoioni et ai., 1984/. Вследствие этого, хотя ДМЭ Хл eß и ЭДА Хл eß сенсибилизируют инактивацию клеток Е.coli более эффективно, чем Хл е . различия э скоростях фотоинактивации в этом случае в несколько раз меньше, чем для клеток эукариотов.

Бактерии Е.coli, лишенные ряда ферментных систем репарации ДНК проявляют значительно более высокую чувствительность к фотоповрежцению в присутствии Хл е , чем исходный штамм. Это свидетельствует о том, что в процессе фотовоздействия при сенсибилизации грамотрицательных бактерий производными Хл происходит повреждение генетических систем клеток. Однако для клеток, плазматическая мембрана которых доступна молекулам сенсибилизатора, роль повреждений генетических систем г» процессах клеточной фотоинактивации, по-видимому, невелика. Об этом свидетельствуют данные об отсутствии различий п скоростях фотосенсибилизированного повреждения исходного штзнмэ грамположительных бактерий В. oubt.i 11я и штаммов, несущих дефекты в системе репарации ДИК. Этот вывод согласуется с донными ряда работ /Ito, 1933; Hoan а!. , 1987/. в «if»r«pn*

показано, что при фотосенсибилизации зукариотических клеток значительных повреждений генетической системы в процессе клеточной инактивации не наблюдается.

Результаты исследования фармакокинетических характеристик производных Хл ев в организме опухоленосителей и фотодинамическая терапия с использованием этих сенсибилизаторов представлены в пятой главе.

Одним из основных процессов, определяющих эффективность ФДТ, является распределение пигмента в организма опухоленосителя после введения. Этот процесс в свою очередь контролируется механизмами транспорта сенсибилизатора в крови. Поскольку константа связывания большинства ТПП белками сыворотки крови достаточно велика, транспорт пигментов в организме осуществляется в виде комплексов с сывороточными белками. Результаты исследования связывания производных Хл ее белками сыворотки крови (раздел 5.1) показали, что основные переносчики этих пигментов в организме различаются. Если Хл ев связывается в сыворотке крови в основном сывороточными альбуминами, то 90К ТМЭ Хл ее и 75 3: ЭДА Хл е6 образуют в сыворотке крови комплексы с ЛНП и ЛЕИ. При этом для неполярных производных Хл ев характерно относительно высокое сродство к ЛНП. На основании описанных в этом разделе данных сделано заключение, что механизмы транспорта в крови для Хл ев и его производных существенно различаются.

Важной характеристикой, определяющей применение фотосенсибилизаторов для ФДТ, является контрастность распределения пигментов в организме опухоленосителя. В работе изучены кинетики накопления производных хлорина ев в опухолевой и мышечной тканях у мышей, носителей гепатомы А. Количественным показателем, характеризующим контрастность распределения пигментов 1п ухуо^ может служить отношение концентраций пигментов в опухоли и , мышце. Сравнение значений данного параметра для исследованных пигментов показывает, что ТМЭ Хл е6 и ЭДА Хл е. обладают значительно большей селективность»

О

распределения а организме опухоленосителя по сравнению с Хл ес. Контрастности накопления Хл ее, ЭДА Хл ев и ТМЭ Хл ее равны 3.5, 10.0 и 7.5, соответственно. Аналогичные данные по

Влияние ФДТ на массу и площади некроза опухоли.

Н, -г 1,2

О, 9

О, б

0,3

а)

80

60

40

20

а) средняя масса (М) опухоли в группе животшлх.

б) средняя величина площади некротированной поверг!"'."--(Я) опухоли относительно общей площади поверхности пп,-н,>,11! ( в X ) в группе животных.

А - группа контрольных животных (10 мышей); Б - группа животных после ФДТ с использованием Хл е <10);

В

группа животных после <$ЛТ с использованием ЗЛА <ч

I

1 7

иследоьашш распределения пигментов а различных тканях опухоленосигеля ролучены при изучении фармакокинетики Хл ев к ЭДА Хл ев на мышах, носителях индуцированной саркомы.

Установленные значительные отличия в контрастности накопления пигментов в опухолевой ткани могут быть связаны с различными механизмами их транспорта в организма апухоленоситеяя.

Относительно большое количество ЭДА Хл е_ и ТМЭ Хл е ,

Б 6

связывемого ЯНН, обуславливает большее накопление пигмента в опухолевой ткани за счет специфического взаимодействия ЛНП с опухолевыми клетками, имеющими на своей поверхности большее количество рецепторов к этому типу липопротештв.

Такой механизм накопления пигментов в клетке обуславливает Солее' медленное достижение максимальной концентрации ЭДА Хл ее и ТМЗ Хл ев в опухолевой ткани в сравнении с Хя ее, который транспортируется в комплексе • с сывороточными альбуминами. Различиями в механизмах транспорта исследованных пигментов объясняется неодинаковая скорость выведения их из крови.

Высокая опухолелокализующая способность производных Хл ее позволяет предположить, что они будут являться более эффективными фотосенсибилизаторами при ФДТ. Это предположение было подтверждено результатами ФДТ с использованием Хл ев и ЭДА Хл ее у мышей, носителей индуцированной саркомы (раздел 6.3). ЭДА Хл сенсибилизирует фотоповреждение опухолевой ткани в большей степени,.чем Хл е^. Об этом свидетельствует торможение роста опухоли, а также более ярко выраженные некротические изменения опухолевой ткани после ФДТ (рис.2).

ВЫВОДИ

1. При исследовании спектрально-флуоресцентных

характеристик производных .Хл еб в растворах и при связывании с белком, липосомами и клеточными мембранами установлено,что различия спектральных параметров производных Хл ев обусловлены неодинаковой степенью агрегации молекул пигмента. В отличие от Хл е0 *, который находится в мономерном состоянии во всех исследованных растворителях, его производные при переводе в

водную среду агрегируют. Все производные Хл е эффективно сорбируются бедками,, модельными и клеточными мембрзнеми. При связывании с белками, модельными мембранами, клетками неполярные пигменты дезагрегируют.

2. С использованием в качестве акцептора 'о,} дифенилизобензофурана установлено, что квантовый выход генерации 'о2 в этаноле дл?: всех производных Хл гг> равен 0,5^0,1. Сравнение скоростей фотосенсибилизированного окисления акцепторов синглетного кислорода в растворах и в Сионе»йранах показало, что различия в фотоактивности производных Хл зависят от степени агрегации и распределения пигментов м<?ллу водной средой и мембраной.

3. Изучены кинетические характеристики фотогемолиаэ эритроцитов, сенсибилизированного производными Хл и , о так.те ГП и • ТКФП. По фотогемолитической активности исследованные пигменты располагаются в ряду ТМЭ Хл ев > ДИЭ Хл ев > ЭДА Хл е0 > Хл е > ГП > ТКФП.

4 Проведено . сравнение фотоцитотоксической активности производных Хл е6 для различных типов опухолевых клеток (АКЭ. НеЬа, 1.-41, рак легкого, гепатома А). Независимо от типа опухолей эффективность фотосенсибилизации повреждения клеток убывает в ряду ТЮ Хл ее, ДМЭ Хл ев,ЭДА Хл ев, Хл ев, ГП, ТКФП и хорошо коррелирует со способностью пигментов накапливаться в клетках.

5 Чувствительность опухолевых клеток к повреяшаючему действию видимого света в присутствии производных Хл увеличивается на поздних стадиях развития опухоли. Установлено,, что следствием фотосенсибилизированного воздействия пигментов является изменение хромосомной структуры популяции опухолевых клеток.

6 На примере 1 бактериальных клеток показано. что индуцированные фотооблучением в присутствии производных ?ч <>п повреждения генетических структур репарируотся. Предполагается, что снижение жизнеспособости бактериальных клеток с неизмененными системами репарации ДНК обусловлено фотосенсибилизированным повреждением клеточной мембраны. Особенности организации клеточной стенки обуславливают ^

н>и 200 раз меньшую чувствительность к действию видимого света грая-отрицательных бактерий в сравнении с грам-положигельными.

7. Исследованные производные Ял е6 и ТКФП различаются па сродству к белкам сыворотки крови. Неполярные производные Хл ес а сыворотке крови образуют комплексы с липопротеинами низкой и высокой плотности. Полярные пигменты Хл ее и ТКФП сорбируются альбуминами и глобулинами сыворотки крови.

8. Установлено, что связывание пигмента клетками в бессывороточной среде определяется способностью сенсибилизатора солюбилизироваться клеточными мембранами. В среде, содержащей сыворотку крови, скорость накопления различных хлоринов в клетке зависит от их сродства к липопротеииам низкой плотности. В присутствии сыворотки крови процесс накопления пигментов в значительной степени контролируется рецептор-опосредованным зндоцитозом сывороточных белков.

Ч. Изучено распределение Хл' ео, ЭЛА Хл ео и ТМЭ Хл ее в тканях животных-опухоленосителей (индуцированная саркома, гепатома А). Показано, что все пигменты избирательно накапливаются в опухолях. Максимальная контрастность накопления ал ее в опухолевой ткани достигается через 6 часов, а ТМЭ Хл ее к ЭДА Хл е6через 18-24 часа после введения. Контрастность накопления в опухолевой ткани ЭДА Хл ее и ТМЭ Хл ев значительно выше в сравнении с Хл ев.

10. На экспериментальных животных-опухоленосителях показано, что ЭДА Хл ев является более эффективным фотосенсибилизатором для фотодинамической терапии в сравнении с Хл ев.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Зорина Т.Е. Исследование взаимодействия производных порфирина с сывороточным альбуминам и липасомами флуоресцентными методами //Люминесцентный анализ в медицине и биологии и его аппаратурное обеспечение: Тез.докл.-Рига, 1985.-С.87.

2. Зорина Т.Е., Черенкевич С.Н.Изучение комбинированного дейсгьия лазерного излучения и порфириновых сенсибилизаторов на

клетки //Применение лазеров в клинике и эксперименте. Тез.докл.-Москва, 1887.-С.124.

3. 'Зорин В. П.,' Зорина Т.Е., Лркатоо Ю. М. и др Молекулярные и клеточные аспекты применения хлорина ев к его производных при фототерапии рака // I Всесоюзное рабочее совещание "Биофизика рака": Тез. догсл. -Черноголовка, 1037, -С. 57.

4. Зорина Т.Е., Фомичев'Л. Ю. , Черенкевич С. Н. ЛШ-тропное деЯтвив хлорина ее - . фотосенсибилизатора опухолево^трансформированных тканей // X Всесоюзное рабочее совещание "Биофизика рака": Тез.докл.-Черноголовка, 1987.-С.58.

5. Зорина Т.Е., Фомичсв А. Ю. , Зорин В. П., Черенкевич С. П. Фотосенсибилнзированное хлорином ед повреждение бактерия с различными дефектами систем репарации ДНК //Микробиология. -1988. -Т. 57, вып. В. -С. 1007-1009.

6. Гурииович • Г. П., Зорина Т.Е., Зорин В. П. и др. йчзтосенсибилизированные хлоринами и порфиринаии структурные повреждения эритроцитов// Биофизика. -1988. -T. хххIV, вып. 2.-С. 314-317.

7. Зорина Т.Е., Сараевская М. В., Черенкевич С. Н. Изменение структурно-функциональных характеристик эритроцитов при фотосенсибилизированном гемолизе под действием лазерного излучения// Вестник БГУ им. В. И. Ленина. -1980. - сер. 2, III.-С. 30-33.

8. Зорин В. П. , Зорина Т.Е., Саржевская М. В. , Черенкевич С.Н.Взаимодействие производных порфирина и хлорина с липосомами. Спектрально-флуоресцентное исследование //Деп. в ВИНИТИ 23.12.88, Н9128-В38.

9. Гуринович Г. П., Зорина Т.Е., Зорин В. П. и др. Повреждение опухолевых клеток излучением гелий-неонового лязерэ в присутствии хлоринов и порфиринов// Известия АН СССР, серия физическая.-1989.-Т.53.-С.1153-1156.

10. Зорин В. П., Мельнов С. Б., Зорина Т.Е., Черенкевич С. И. Изменение скорости, фотосенсибилизированного хлорином еп, повреждения клеток асцитной карциномы Зрлиха в процессе развития опухоли // Докл.АН БССР.-1383,- Т.33, NG.-С.585-567.

11. Гуринович Г. П., Зорина Т.Е., Аркатов Ю. М. и др. Исследование распределения хлорина е и его производим« d

клетках Heia метолом люминесцентной микроскопии // Цитология.-1989..- Т. mi, НЭ.-С. 1058-1063.

12. Зорина Т.Е., Финик B.C., Левая Т.С. и др. Исследование и.'"!:)даш парамагнитной и флуоресцентной спектроскопии механизмов взаимодействия In ее и его произаодиых с липосомами // YXI Всесоюзная конференция "Магнитный резонанс в биологии и медицине": Тез. докл. - Звенигород. -1989. -С. 65.

13. Uurinovich G. Р. , Zorina Т.Е. ч Zorin V. P. et al . Localization, accumul at. i on anci photodynamic action of cftlurin и and its derivatives! on tumor ceila // I nternat i опн! conference on photodynamic therapy : Abstracts.-Sofia. 1989.-P. 6.

14. Gurinovich G.P. , Samal * A. B. , Zorina Т.Е. The ptiotosens i t i z i ng action of ell I or i ns on hemostasia system // International conference on photodynamic therapy: Abstracts.-Sofia, 1909.- P. 79.

15. Gurinovich G. P., Hel-'nov S. B., Zorina Т. E. et al. f'fiotodestruct i ve anci biochemical aspects of antitumor action of chlorina // Third congress of the European society for [ihotabiology: Astracts.- Budapest, 1969. - P. 293.

16. Фомичев А. Ю. , Зорина Т.Е., Зорин В. П. и др. Комбинированное действие видимого света в присутствии сенсибилизатора и ионизирующего излучения на бактерии // Материалы Всесоюзной конференция "Проблемы синергизма и радиобиологии",- 1990,- С.25-27.

17. Gurinovich G. Р. , Zorina Т.Е., Helnov S.B. et al. Photodynamic activity of chlorin eo and chlorin ethylenediamide in vitro and in vivo. - J. Photochcm. Pisotobioi. (принята к печати в 1991 году).

18. Самаль А. Б., Зорина Т.Е., Черелкевич С. Н. Сенсибилизированное хлорином е6 фотоингибирование агрегации тромбоцитов. Участие активных форм кислорода // Гематология и трансфузиология.-19Э1.- Т.34, Н4.- С.19-21.

19. Гуринович Г. П., Зорин В. П. , Зорина Т.Е. и др. Фотодинамическая терапия солидных опухолей с использованием производных хлорина е . Клеточные и тканевые аспекты // XIV Международная конференция по когерентной и нелинейной оптике

(КиНО'О! ): Тез. докл. - Ленинград, 1991.- Т. II . - С. Г И.

20. Фомиче в A.D., Зорин В. II. , Зорина Т.Е., Черенкевич (..F.I Фотоповреждение грамполо-жительных и грамот рииятеямн-п бактериальных клеток в присутствии производных хлорина // Микробиология.-1991. - Т. 60, ИЗ. - С. 507-511.

21. Зорин В. П., Хлудеев И. И., Зорина Т.Е. ч др. Мехзни -чп,! транспорта и локализации производных порфирина . в опухолевой ткани // .Третья Всесоюзная конференция по фармакокмнетчке: Трз докл. -1991. - С. 98.

Подписано к печати ■ 9.01.1992. Формат 60x84 1/16

Усл.п.л. 1,0 Тираж 100 экз. Заказ Н 13 . Бесплотно 220080, Минск, ул.Бобруйская 7. Отпечатано на ротапринте БГУ им. В. И. Ленина