Разработка методов оптической микроскопии и спектрального анализа применительно к исследованию новых противоопухолевых препаратов

Назарова, Анна Ивановна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка методов оптической микроскопии и спектрального анализа применительно к исследованию новых противоопухолевых препаратов
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Разработка методов оптической микроскопии и спектрального анализа применительно к исследованию новых противоопухолевых препаратов"

УДК 57 086.2 615.277.3

на правах рукописи

Назарова Анна Ивановна

Разработка методов оптической микроскопии и спектрального анализа применительно к исследованию новых противоопухолевых препаратов

03 00 02 - биофизика

автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва - 2005

Работа выполнена в лаборатории структурной биологии Института биоорганической химии им М М Шемякина и Ю А Овчинникова РАН

Научный руководитель

кандида! физико-математических наук, доцент

Феофанов Алексей Валерьевич

Официальные онпонешы

доктор биологических наук профессор Красновский Александр Александрович

доктор физико-математических наук, профессор Пащенко Владимир Захарович

Ведущая организация'

Институт биологии гена РАН

Защита состоится 2005 г в 20 час 0о мин на заседании

Диссертационного Совета К 212 156 03 при Московском физико-техническом институте (141700, Московская обл ,: Дол! онрудный, Институтский пер. 9,

МФТИ).

С диссертацией можно ознакомиться в библио(еке МФТИ Автореферат разослан « /6 » 2005 г

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат физико-ма1емашческих наук ~ Ъ'р--'.....-......— - В Е Брагин

ЩОе-Ч 777с0~

я // а/г

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Введение. Актуальность проблемы. Метод фотодинамической терапии (ФДТ)-новое перспективное направление лечения опухолей, интенсивно развивающееся в России Метод ФДТ основан на накоплении в опухолевой ткани введенного в организм фотосенсибилизатора (ФС), действие которого активируется локальным световым облучением и сопровождается генерацией активных форм кислорода (АФК), приводящих в итоге к гибели опухолевых клеток [Dougherty Т et al, 1998] Полученные за последние 10 лет результаты использования метода ФДТ в клинике показали успешность его применения для лечения опухолей различной локализации [Соколов и др, 1998] Возможности применяемых в клинике ФС первого поколения на сегодняшний день практически исчерпаны Дальнейшее развитие ФДТ напрямую связано с разработкой ФС нового поколения, поглощающих свет в более длинноволновой области, обладающих повышенной селективностью накопления в опухоли и улучшенными фотодинамическими характеристиками Для успешной разработки новых ФС необходимо детальное знание молекулярных и клеточных механизмов их действия, глубокое понимание структурных особенностей ФС, определяющих их функциональную активность Несмотря на многообразие ведущихся в этой области исследований, остается много пробелов в выявлении зависимостей между структурой и функцией ФС, и ощущается недостаток в методах (методиках) исследования, обеспечивающих получение такой информации

Благодаря интенсивному поглощению и флуоресценции ФС в красной области спектра, методы оптической спектроскопии и микроскопии предоставляют большие возможности для исследования и оптимизации свойств ФС. В их числе метод лазерной сканирующей конфокальной микроскопии, который обеспечивает неразрушающий анализ распределения и локализации флуорофоров в живых клетках и срезах тканей с трехмерным пространственным разрешением Получить дополнительную информацию о состоянии, микроокружении и молекулярных взаимодействиях ФС в клетках и тканях можно, совместив конфокальную микроскопию со спектральным анализом в методе конфокальной микроскопии и реконструкции спектральных изображений (КОМИРСИ) [Feofanov et al 1997]. Возможности оптических методов анализа применительно к разработке и изучению ФС реализованы далеко не полностью Поэтому в настоящее время актуальным является детальная разработка этих методов, включая метод КОМИРСИ, применительно к исследованию структурных особенностей ФС, определяющих их функциональную активность

Цель и задачи исследования. Цель данной диссертационной работы состояла в разработке на основе методов оптической микроскопии и спектрального анализа новых методик изучения структурно-функциональных особенностей ФС и в применении этих методик для исследования и разработки новых отечественных

ФС, фотосенса, безметального сульфатированного фтапоцианина (Рс5„) и циклоимидных производных хлорина рб (ЦИХЛ) В связи с этим поставлены следующие задачи.

1 На основе метода КОМИРСИ разработать универсальные методики количественного анализа ФС в опухолевых клетках, методики исследования локализации ФС в клеточных структурах

2 Разработать методики исследования и количественной оценки связывания ФС с компонентами плазмы крови и сыворотки на основе комбинированного использования методов электрофореза и микроспектрального анализа

3 На основе метода КОМИРСИ разработать универсальные методики измерения и анализа распределения ФС в опухолевых и нормальных тканях животных и человека

4 Исследовать взаимосвязи между структурой ЦИХЛ и их физико-химическими и биологическими свойствами, определяющими функциональную активность этих ФС в опухолевых клетках

5 Выявить наиболее перспективные ЦИХЛ для разработки на их основе препаратов для ФДТ рака

Научная новизна. Все разработанные в диссертации методики и результаты исследований получены впервые На основе метода КОМИРСИ разработаны универсальные методики количественной оценки концентрации ФС и их комплексов внутри клеток и тканей Разработана и успешно применена схема комплексного сравнительного исследования молекулярных и клеточных свойств ФС, позволяющая выяснить влияние структуры молекулы на ключевые свойства, определяющие фотодинамическую активность ФС в живых клетках Впервые разработана методика комбинированного применения методов электрофореза и микроспектрального анализа, позволяющая охарактеризовать связывание ФС с компонентами плазмы крови

Исследованы новые группы перспективных ФС, представляющие значительный интерес для клинического применения Впервые исследованы ключевые свойства ЦИХЛ, определяющие фотодинамическую активность этих ФС в клетках Впервые установлена внутриклеточная локализация ЦИХЛ и изучена ее зависимость от структуры ФС Впервые изучено распределение РсБ,, и препарата «Фотосенс» в гканях, позволяющее понять механизмы фотодинамического повреждения опухоли этими ФС. Показана применимость и перспективность метода КОМИРСИ для анализа особенностей накопления и распределения ФС в опухолевых тканях пациентов

Практическое значение работы. Предложенные методики исследования ФС применимы на разных этапах тестирования ФС в растворах, в опухолевых клетках, в тканях экспериментальных животных и в тканях пациентов Проведенные исследования позволили уточнить некоторые свойства применяемого в клинике препарата «Фотосенс» Результаты, полученные в данной

работе, содействовали созданию на основе PcSn (п=2, 3) нового препарата для ФДТ опухолей «Фталасенс», который находится сейчас на стадии клинических испытаний С учетом результатов данного исследования принято решение о разработке препаратов для ФДТ на основе наиболее эффективных ЦИХЛ Результаты разработки метода КОМИРСИ и данные о взаимосвязи структура -свойства ФС успешно используются в совместных научных исследованиях с МНИОИ им П А Герцена, ФГУП Г1Щ «НИОПИК», МГАТХТ им МВ Ломоносова В сотрудничестве с МНИОИ им П А Герцена начато применение метода КОМИРСИ для анализа накопления и распределения новых отечественных ФС в пробах тканей пациентов для повышения эффективности ФДТ рака Разработанные методики представляют интерес для научно-исследовательских институтов и фирм, занимающихся разработкой новых ФС, включая НИИ онкологии им проф Н Н Петрова, Институт клинической онкологии РОНЦ им Н Н Блохина РАМН, ГНЦ лазерной медицины Минздрава России, ММА имени И М. Сеченова, Институт биомедицинской химии РАМН, Институт биохимии им А. Н Баха РАН; Медицинский радиологический научный центр РАМН, Ташкентский научный центр хирургии им акад В В. Вахидова; Сибирский центр лазерной медицины и др

Апробация работы. Результаты работы были представлены на Международном симпозиуме' «Достижения в науке для открытия новых лекарств» (Москва, 2005), Международной конференции по физико-химической биологии, посвященной 70-летию со дня рождения акад Ю А Овчинникова (Москва, 2004), 1-ой конференции Европейской федерации фармацевтических наук. «Оптимизация систем доставки лекарств. Новые направления » (Версаль, Франция, 2003); 9-м и 10-м конгрессах Европейского фотобиологического общества (Лиллехамер, Норвегия, 2001; Вена, Австрия, 2003), XI международной конференции по химии порфиринов и их аналогов (Суздаль, 2003), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты» (Москва, 2003); 2-м международном симпозиуме «Прольем свет на проблему заболеваний Оптическая диагностика для нового поколения » (Реймс, Франция, 2002), VI чтениях, посвященных памяти академика Ю А Овчинникова, (Москва, 2002); XX международной конференции по фотохимии (Москва, 2001), 9-й международной конференции по спектроскопии биологических молекул (Прага, Чешская Республика, 2001), XLII1 научной конференции МФТИ "Современные проблемы фундаментальных и прикладных наук" (Москва, 2000); V всероссийском съезде онкологов (Казань, 2000), XXV Европейском конгрессе по молекулярной спектроскопии (Коимбра, Португалия, 2000), на совместном семинаре лаборатории структурной биологии ИБХ РАН, кафедры химии и технологии биологически активных соединений МГАТХТ им М В Ломоносова и лаборатории модификаторов и протекторов МНИОИ им П А Герцена (Москва, 2004), международном семинаре в рамках проекта ИНТ АС (Москва, 2004)

Конкурсная поддержка работы. Данная рабспа выполнялась в соответствии с научно-технической программой правительства Москвы, Миннауки РФ и РАН "Разработка и внедрение в медицинскую практику новых методов и средств диагностики и лечения онкологических и других заболеваний" Проведенные исследования поддержаны грантами РФФИ 01-04-49298, 02-04-08043 и 02-0422001 НЦНИ а, а также международными грантами PICS Национального центра научных исследований Франции, ИНТ АС №01-0461 и НАТО № LST CLG 9777077

Публикации. Основные результаты диссертации изложены в 24 публикации, включая 6 статей в рецензируемых журналах

Личный вклад. Все представленные в диссертации результаты получены автором лично или при его определяющем участии

Объём и структура диссертации. Диссертация состоит из Введения трех глав и заключения Список цитированной литературы содержит 163 наименований Работа изложена настраницах и содержит 12 таблиц и 53 рисунка

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ. Первая глава содержит критический обзор литературы, посвященный двум основным темам анализу ранее полученных результатов структурно-функциональных исследований ФС с особым вниманием к механизмам фотодинамического действия и использованию в исследованиях ФС методов оптической микроскопии и спектрального анализа на разных уровнях структурной opi анизации (раствор, клетки, ткани, организм)

ФДТ выгодно отличается от традиционных методов лечения рака на основе химиотерапии и лучевой терапии избирательностью поражения опухоли и отсутствием общего токсического воздействия на организм Из обзора литературы следует, что локализация ФС в клетках изучена детально только для ФС с максимумами поглощения в области 620-660 ттм, в то время как ФС нового поколения поглотают в области 700-800 нм, более оптимальной для глубокого проникновения света в ткани На основе опубликованных данных довольно сложно проследить закономерности влияния структуры на свойства ФС в биологических системах (клетках и тканях), поскольку варьируются и хромофорный центр, и боковые заместители

В обзоре литературы показано, что большая часть данных о количественном накоплении ФС в культивируемых опухолевых клетках и тканях опухолевых моделей основана на исследовании соответствующих эксгракюв При эюм определяется общая конценфация ФС, включая агрегаты, хотя только мономерная форма ФС в клетках и тканях обладает фотодинамической активностью Активно используются контактные методы определения уровня накопления ФС в тканях т vivo с помощью оптоволоконной техники, но они регистрируют общий сигнал от нескольких слоев ткани В ряде работ отмечалось плохое соответствие

результатов таких т vivo исследований и данных микроскопии [Witjer et al, 1997] Поэтому необходим был метод, позволяющий измерить концентрацию мономерной фотоактивной формы ФС в живых клетках и срезах тканей и связать фотодинамическую активность т vivo и т vitro с локализацией и уровнем накопления ФС в клетках и тканевых структурах

Вторая глава содержит описание материалов, применявшихся методов и разработанных методик Образцы PcSn (п= 1,5, 2,4, 3,1, 3,8) и «Фотосенс» (препарат, состоящий из смеси ди-(A1PcS2), три- (AlPcS3) и тетра- (A1PcS4) сульфатированных производных алюминия) были синтезированы в ГНЦ "НИОПИК" (рис 1) Компоненты фотосенса были разделены с помощью ВЭЖХ к х н И В Назимовым ЦИХЛ с различными заместителями были синтезированы в МГАТХТ им М В Ломоносова в лаборатории профессора А Ф Миронова

В исследованиях применялись методы спектрофотометрии и флуориметрии, эпифлуорес-центная микроскопия и метод КОМИРСИ Для измерений методом КОМИРСИ использовали конфокальный сканирующий микроспектрометр V-45 (Dilor, Франция) и установку для конфокальной ^ сканирующей микроспектроскопии, созданную па

)=1 Фотосенс основе спектрографа OMARS-89 (Dilor, Франция) и микроскопа Olympus ВН-2 (Япония) (рис 2) В Рис. l.r=so3Na шшНп=1 - зависимости от задачи возбуждение спектров 4 группы на молекулу) осуществлялось одним из трех лазеров Аг+-лазером,

He-Nc лазером или непрерывным Nd3+-YAG лазером С помощью метода КОМИРСИ в каждой точке объекта (клетка, ткань) с субмикронным пространственным разрешением измеряется спектр флуоресценции [Feofanov A et al, 1995] На основании спектрального анализа определяются микроокружение и молекулярные комплексы ФС При этом возможно распознавание комплексов с перекрывающимися спектрами, максимумы которых различаются на 5 нм Каждый спектр раскладывается на линейную комбинацию спектров ФС в различных состояниях и собственной флуоресценции объекта С помощью процедуры реконструкции получается спектральное изображение клетки (двумерное или трехмерное), отражающее распределение ФС и его комплексов Обработка спектральных изображений проводилась с помощью программ LABSPEC (Dilor), Vision, ImageJ

Рис. 2. Принципиальная схема экспериментальной установки для конфокальной сканирующей микроспектроскопии АФ- анализирующий фильтр, ГФ- голографический фильтр, ДЗ-дихроичное зеркало, 3- зеркало, ИФ- интерференционный фильтр, КД- конфокальная диафрагма, Л- линза, Р- решетка, С- входная щель спектрографа, СЗ- сферическое зеркало, СП- светоделительпая пластина (50 50), ФВ- фильтр возбуждения, ФНП- фильтр нейтральной плотности

В рамках данной диссер! анионной работы были разработаны методики количественною анализа ФС в клетках Для эюго в условиях иденшчных клеючным экспериментам измерялась калибровочная зависимость интенсивности сигнала от концентрации ФС в растворе На основании спектральных изображений ФС или его молекулярных комплексов рассчшывалась средняя концентрация ФС в определенных клеточных или тканевых структурах При этом учитывались изменение (тушение или увеличение) итттенсивности сигнала ФС в различных комплексах и состояниях, а также вклад собственной флуоресценции клетки На основании полученных концентраций в отдельных клетках проводился статистически достоверный анализ на ограниченной выборке клеток Такой расчет правомочен благодаря использованию конфокальной оптической схемы, обеспечивающей измерение сигнала от одинаковых микрообъемов образца Для

описания кинетической кривой накопления ФС в цитоплазме клеток использовалось уравнение'

Ссу,(0 = Се.К1/(Т„р+1) (1),

где СоДО - средняя цитоплазматическая концентрация ФС, зависящая от времени инкубации I, Са - концентрация ФС во внешней среде, К - максимальное значение отношения Сс;,/Ссх при насыщении накопления, Тир - время инкубации, при котором Ссу1 достигает 50% от уровня насыщения

Данные по выведению ФС из клеток анализировались с помощью уравнения Ссу,(0= Сс>1(0) ехр(-1п21 /Тед (2),

где Ссу1(0) -средняя цитоплазматическая концентрация ФС в момент времени, когда ФС был удален из внешней среды, Тс|- - время полувыведения ФС из клеток

Для выяснения внутриклеточной локализации ФС использовали селективные флуоресцентные зонды для клеточных органелл. Зонды и ФС одновременно возбуждали лазером с подходящей длиной волны На основе полученных с помощью метода КОМИРСИ спектральных изображений распределения зонда и ФС в клетке рассчитывали коэффициенты, характеризующие степень их солокализации

Для определения связывания ФС с липопротеинами и белками в плазме (сыворотке) крови разработана комбинированная методика на основе гель-электрофореза и микроспектроскопии Анализ электрофореграмм осуществляли сканируя гель с помощью микроспектрометра и измеряя в каждой точке образца спектр флуоресценции По спектрам идентифицировали сигнал ФС и характеризовали молекулярные взаимодействия ФС в разных зонах электрофореграммы В результате такого анализа получали профили распределения ФС и его комплексов в геле вдоль полосы разделения образца Отметим высокую чувствительность данного метода и возможность использования микроколичеств ФС. Коэффициенты К-,ф, характеризующие процентное распределение ФС между компонентами плазмы крови (сыворотки), рассчитывали по формуле.

Кэф=1/1ЕХ 100% (3),

где I - интенсивность флуоресценции ЦИХЛ интегральная по исследуемому участку профиля, Ь - интенсивность интегральная по всему профилю

Третья глава содержит описание и обсуждение результатов исследования новых ФС, поглощающих в красной и ближней ИК области (рис 3) С использованием сульфатированных производных фталоцианина А1РсЯ„ и РсБ,, отработаны универсальные методики изучения ФС методами оптической микроскопии и спектроскопии, и применимость методик доказана в исследованиях этих ФС Отработанные методики обеспечили основу для проведения комплексного исследования большой группы перспективных ФС нового поколения - ЦИХЛ и изучения влияния заместителей на фотохимические и биологические свойства ЦИХЛ.

600 640 680 720 760 Длина волны,нм

Рис. 3. Спектры поглощения А1Рс54(») в воде, РсБгд в Тритоне Х-100 (О), ЦИХЛ1(+) и ЦИХЛ8 (♦) в 1 % растворе кремофора Е1. Спектры соответствуют мономерной форме ФС

III. 1. Исследование ФС на основе сульфатированных фталоцианинов.

Ill I 1 Особенности молекучярных взаимодействий l'cS„

Целью исследования молекулярных взаимодействий является оценка способности ФС связываться с биологическими молекулами, что помогает понять особенности взаимодействий ФС в более сложных живых системах Кроме того, знание характеристичных изменений в спектрах флуоресценции ФС, вызываемых связыванием с биологическим молекулами, необходимо, чтобы идентифицировать эти комплексы в живых клетках и корректно определить внутриклеточную концентрацию ФС при использовании метода КОМИРСИ

На основании анализа спектров поглощения и флуоресценции в растворах установлено, что PcS„ легко встраивается в мицеллы нейтрального детергента Тритон Х-100, липосомы и кремофор EL (CrEL), в меньшей степени способен связываться с сывороточным альбумином и РНК и не взаимодействует с ДНК Показано, что способность PcSn встраиваться в мембранные системы убывает с увеличением числа сульфогрупп в молекуле

Для исследований на опухолевых клетках и животных была выбрана наиболее фотодинамически-активная (по данным МНИОИ им ПА Герцена) смесевая субстанция со средним числом сульфогрупп на молекулу 2,4 (PcS2,4) /// I 2 Анализ накопления Рс$2 4 в клетках

С помощью метода КОМИРСИ показано, что PcS2,4 связывается на цитоплазматической мембране клеток аденокарциномы легкого человека А549, а 1акже проникает в цитоплазму и накапливается в околоядерной области (рис 4)

мкг/мл

t8 Рис. 4. Распределение PcS21 в

клетках AS49 Клетки инкубировали 6 с 2 мкг/мл PcS2 4 в течение 30 мин 4 (а) Микрофотография клетки (б) Клеточное распределение PcS^ 4, измеренное методом J-0 КОМИРСИ

Отметим, что меюдом КОМИРСИ измерялась внугриклеточная концентрация мономерной фотоактивной формы ФС Агрегаты PCS24 не флуоресцируют и не генерируют АФК Сравнение внутриклеточных спектров со спектрами в модельных системах т vitro показало, что мономерный PCS24 в клетках связан

№

я?

•4Ш

ц Щй,

„ Г '^Г

преимущественно с мембранными структурами и в меньшей степени с белками В результате анализа, измеренных с помощью метода КОМИРСИ, кинетической (рис 5а) и концентрационной (рис 56) зависимостей накопления Рс824 клетками А549 установлено, что время полунакопления Рс82>4- 1 ч, а полу выведения - 4,5 ч При увеличении содержания в смесевом препарате компонентов РсЯ 1 или РсЯ] накопление ФС в опухолевых клетках уменьшалось (для РсЯ-^ и РсЯ) 5 в 1,7 и 3 раза, соответственно), что объясняет данные МНИОИ им ПА Герцена о пониженной фотоцитотоксичности РсЯч,«, РсБ 15

^ J 4 э о /8 Концентрация в среде, мкг/мл

Время инкубации, ч

Рис. 5. (а) Кинетика накопления (•) и удержания (о) PcS2l4 в цитоплазме клеток А549 (б) Концентрационная зависимость накопления PcS2 4 в клетках А549 Ccyt - средняя цитоплазматическая концентрация PcS2,4

По данным электрофореза PcS2,4 связывается с белками сыворотки, присутствующими в культуральной среде Образование этих комплексов снижает уровень накопления PcS24 в кленах в 8 раз по сравнению с инкубацией в среде без сыворотки

III 1 3 Исследование накопления PcS2,4 в различных структурах ткани

Метод КОМИРСИ был разработан и применен для изучения с субмикронным разрешением локализации и относительных концентраций PcS2,4 в экспериментальных моделях злокачественных опухолей карциномы молочной железы Эрлиха (КЭ), карциномы легких Льюиса (KJTJI), лимфоидной лейкемии Р388 (Р388), меланомы В16 (В16) Обнаружено, что PcS2 4 преимущественно накапливался в опухолевых клетках и прилегающих тканевых структурах (структурах кожи, жировой ткани, соединительной ткани, обогащенной фиброзными компонентами и инфильтрованной макрофа!ами и фибробластами) в мономерной фотоактивттой форме (рис 6, табл 1) В опухолях Р388 и В16 содержание PcS2>4 было ниже, чем в прилегающих структурах кожи, а КЭ и KJIJT накапливали PcS2;1 лучше, чем структуры кожи Степень накопления PcS2i, зависела от вида опухоли' накопление в опухолевых клетках карцином (КЭ, KJIJI) было одинаково и в 1,4 и 2 раза выше, чем в В16 и Р388 соответственно Содержание PcS2,4 в далеко отстоящих здоровых тканях (коже, мышцах и соединительной ткани) было в 2-3 раза ниже, чем в аналогичных структурах, прилежащих к опухолевому узлу Накопление PcS2 4 в подкожной жировой ткани не зависело от расстояния до опухоли Из пониженного содержания PcS24 в

кровеносных сосудах следует, что вклад в общую фотодинамическую активность ФС механизма, связанного с прямым разрушением питающих опухоль сосудов, мал

Табл. 1. Распределение РсЯг4 в различных структурах опухолевой ткани

Тип тканевой структуры вид опухоли I

опухоль Эр лих а лимфома Р-388 карцинома легких Льюиса меланома В16

Опухолевые клетки 14+2 7±1 14+1 10+1

Соединительная ткань 4±1 7±1 8+1 11±2

Мышечные волокна н/д 6±1 12+1 9±1

Кровеносные сосуды 1,7±0,6 2,0+0,4 1,5±0,4 5±1

Структуры кожи 1) эпидермис 9±2 14±2 9±1 14±3

2) дерма 10,9+0,4 13±2 13+1 12±1

3) эпителий волосяной н/д 9±2 14+1 13±1

сумки 4) волосяная сумка н/д 9±2 18±2 6,5±0,6

5) жировая ткань 9±1 7+1 13±1 9±1

6) проток потовой железы 3+1 н/д н/д н/д

7) эпителий потовой железы 8+1 н/д н/д н/д

8) сальные железы 21 19±2 29±3 н/д

контроль по здоровым 4±2 4+1 4+1 4+1

тканям

Концентрации ФС (относительные единицы) были определены т я/н, используя метод КОМИРСИ Н/Д-данные тканевые структуры не были зарегистрированы в изучаемых образцах

Л Б В

Рис. 6. Накопление РсЭг 1 в криостатном срезе КЭ (А), КЛЛ (Б), Р388 (В) 1-микрофотография среза, окрашенного гематоксилин-эозином, П-распределение Рс52,4 Метка-20 мкм 1-соединительная ткань, 2- жировая ткань, 3- потовые железы, 4- эпидермис, дерма, 6- эпителий волосяного фолликула, 7- волос, 8- сальные железы, 9- опухоль, 10- сосуд

Содержание PcS2 4 в участках опухоли, прилегающих к коже в 2-3 раза выше, чем на краю опухолевого узла, граничащем с соединительной и мышечной тканью Отмечен высокий уровень накопления PcS2,4 в области некроза, указывающий на целесообразность проведения повторного сеанса ФДТ со значительной задержкой по времени и при снижении дозы PCS24 для более полного подавления опухолевого роста Отметим, что отношение концентраций PcS2,4 опухоль/ здоровая ткань достигает 3,5 для ряда опухолей, что выше, чем в случае фотосенса [Feofanov et al , 1999] Очевидно, что именно это свойство PcS2 4 предопределяет его более высокую эффективность т vivo по сравнению с фотосенсом

III I 4 Исследование связывания 3- AIPcSj сЧСА

Проведено детальное изучение связывания с человеческим сывороточным альбумином (ЧСА) одного из компонентов фотосенса, 3-A1PcS4, интенсивно накапливающегося в прилегающей к опухоли соединительной ткани [Feofanov et al, 1999] Для исследования A1PcS4-4CA взаимодействий использовались изменения в спектре поглощения A1PcS4 при связывании с ЧСА' сдвиг полосы поглощения на 3 нм и изменение формы спектра (рис 7а) Спектры поглощения AIPCS4 в растворе ЧСА были разложены на линейную комбинацию связанной и свободной форм AIPCS4 С учетом изменения экстинкции связанной формы рассчитывались концентрации связанного и свободного AIPCS4 Изотермы связывания, полученные прямым и обратным титрованием, анализировали с помощью модели Скэтчарда в приближении двух независимых центров связывания (рис.76).

600 640 680 720 Длина волны,нм

(в)

10- \

08- \

06- X

04- . X % 4

02-

2 4 6 8 10 [ AlPcS„ ]/[HSA]

Рис. 7. (а) Пример разложения спектра А1Рс$4 в растворе ЧСА (+) на спектры свободного (•) и связанного (■) лиганда Расчетный спектр (А) совпадает с экспериментальным (б) График Скэтчарда для А1()с8 |/ЧСА (20мМ Тпв-Нс!, рН 7,4, 24°С) Я-молярное отношение концентраций связанного А1Рс84 и ЧСА Ь - концентрация свободного лиганда (в) Титрование А1Рс84 раствором ЧСА при 24°С (+), 37°С (А) и в присутствие 0,5 М ЫаС1 (•) а -степень связывания А1Рс54 (отношение концентраций связанного и свободного лигандов)

Решение системы параметрических уравнений с помощью программы Mathcad PLUS 5 0 дало следующие значения констант ассоциации Kd|-(l,2±0,2)xl06 М"1, Kd2-(6 3+0 4)х104 М"1 при 24 °С При 37 °С К„, понижалась до (3,3±0,3)х 105 М"' (рис 7в) Увеличение ионной силы раствора значительно уменьшает степень связывания AIPCS4 (рис 7в), указывая на преимущественно электростатический характер взаимодействия AIPCS4 с ЧСА

Высокое сродство AlPcS^ к основному белку плазмы крови свидетельствует, что ЧСА является эндогенным переносчиком AlPcS4 На основании титрования комплексов 4CA-A1PcS4 растворами лигандов с известными центрами и константами связывания установлено, что центр высокоаффинпого связывания расположен в домепе I ЧСА и перекрывается с участком связывания для гемина Второй центр свя!ывания AlPcS4 не совпадает с основными известными центрами связывания для низкомолекулярных лигандов в субдоменах ГГА и ГГГА

III I 5 Иссчедование методом КОМИРСИ накопления и распределения препарата Фотосенс в различных тканевых структурах опухоли пациента.

Впервые метод КОМИРСИ был применен для исследования накопления ФС в различных структурах тканей меланомы кожи человека (пациента) Для многокомпонентного препарата «Фотосенс» необходимо было выяснить роль его компонентов в реализации фотодинамического эффекта, и с чем связаны побочные эффекты этого препарата Из сравнения со спектрами фракций фотосенса в различных модельных системах [Feofanov et al, 1999] получили, что в опухоли человека фотоактивный мономерный фотосенс присутствует в следующих состояниях 1) AIPCS2, AlPcSi, AIPcS.(, связанные с белками, 2) AIPCS2 в липидоподобном окружении

Табл. 2. Результаты исследования накопления фотосенса в меланоме кожи человека

Название структуры С' С С3 1С

кератинизированный 0,155±0,001 0,13±0,01 0,43±0,05 0,71 ±0,01

эпидермис некератинизированный 0,17+0,01 0,14±0,02 0,6+0,1 0,9+0,1

дерма 0,7+0,1 0,4+0,1 0,7+0,1 1,9±0,3

опухоль 0,32+0,04 0,37+0,04 1,4±0,2 2,1+0,2

артерия стенка сосуда 0,4+0,1 0,34±0,04 1,2±0,1 1,9+0,2

просвет сосуда 0,05±0,01 0,06+0,01 0,17±0,05 0,27+0,03

С - концентрация А1Рс83 и А1Рс84, связанных с белками, С - концентрация А1Рс82, связанного с белками, С3 - концентрация А1Рс82 в липидоподобном микроокружении, £С - общая концентрация фотосенса Значения концентраций приведены в относительных единицах

Исследования методом КОМИРСИ показали, что концентрации фотосеиса в опухоли и дерме почти равны (табл 2) Это объясняет кожную фототоксичность

фотосенса В опухоли концентрация мономерного AIPCS2 в липидоподобном окружении в 4 раза превышала концентрацию высоко сульфатированных компонентов фотосенса Таким образом, фотодинамическое повреждение опухоли обеспечивает фракция AIPCS2 Концентрации фотосенса в опухоли и стенках сосудов прилежащих к опухоли тканей одинаковы Можно предположит!), что для фотосенса характерны 2 механизма фотодинамического действия (А) уничтожение опухолевых клеток путем прямого воздействия на сами опухолевые клетки за счет внутриклеточной фракции ФС; (Б) подавление роста опухоли и ее уничтожение путем разрушения окружающих и питающих опухоль сосудов

III.2. Исследование ФС на основе циклоимидных прои {водных хлоринарб.

Исследован новый класс ФС - ЦИХЛ (рис 8), поглощающих на границе ИК области (табл 3) Исследованы 3 группы соединений' отрицательно заряженные, нейтральные и катионные

R,0 О

ФС R2 RJ R.

ЦИХЛ1 сн=сн2 (СН2),ОН н н

ЦИХЛ2 сн=сн. (СН2)2ОН н н

цихлз сн=сн2 OCOCHj н н

ЦИХЛ4 сн=сн2 он СНз н

ЦИХЛ5 сн=сн2 ОСНз СНз н

ЦИХЛ6 сн=сн2 СН2СООН СНз н

ЦИХЛ7 сн=сн2 (СН2)2СООН СНз н

ЦИХЛ8 сно (СН2),ОН н н

ЦИХЛ9 сно осн, СНз н

ЦИХЛ10 CH-NOH ОСНз СНз н

ЦИХЛ11 сно он СНз н

ЦИХЛ12 сн=снсно ОСОСНз СНз н

ЦИХЛ 13 сн=снсно ОН СНз н

ЦИХЛ14 сн=снг (СН2)зОН Н ОН

ЦИХЛ15 сн=сн2 Mi-co-^^vai, СНз н

ОН

-Xrw

Рис. 8. Структурные формулы ЦИХЛ

ЦИХЛ18

о-с-с Н,

III.2.1. Исследование физико-химических свойств ЦИХЛ.

ЦИХЛ не растворимы в воде, поэтому необходимо было подобрать растворитель оптимальный для исследования ЦИХЛ in vitro и т vivo Сравнительное изучение ЦИХЛ, растворенных в ДМСО, 5% эмульсии CrEL и 1%

растворе ЧСА показало, что СгЕЬ является наиболее подходящей солюбилизирующей системой Разрешенный к применению в клинике, СгЕЬ обеспечивал стабилизацию мономерной формы соединений, как в концентрированных (5-10% СгЕЬ), так и в очень разбавленных водных растворах (0,002-0,005% СгЕЬ) Поддержание мономерной формы важно, так как агрегирование снижает способность ЦИХЛ проникать в раковые клетки

Известно, что опухолевые клетки характеризуются повышенной экспрессией на поверхности клеток лектинов - специфических углевод-связывающих белков [СаЬшБ, 1988] Исследована возможность использовать для направленной доставки ФС к опухолевым клеткам липосом, оснащенных специфическими углеводными векторами, обеспечивающими распознавание определенных лектинов на мембране клеток С помощью метода КОМИРСИ показано, что эндоцитоз векторных липосом происходит в 1,5 раза быстрее, чем контрольных Однако на сегодняшний момент использование вектор-направленных липосом не обеспечило ожидавшегося значительного увеличения селективности, и эмульсия СгЕЬ остается наиболее простой и эффективной солюбилизирующей системой для ЦИХЛ

Табл. 3. Физико-химические характеристики ЦИХЛ

ЦИХЛ Ху, нм е, х104М''см"' Р, мМ фРь хЮ5 Ф V * шн

ЦИХЛ1 711 3,25 1,6 2,1+0,1 0,66±0,02 1

ЦИХЛ2 709 3,15" 0,5" - 0,59±0,0б" 0,6

цихлз 711 3,42" 1,6" - 0,35±0,04# 0,2

ЦИХЛ4 713 3,91" 1,6' - 0,51±0,05" 0,14

ЦИХЛ5 710 2,91е 0,7" 1,63±0,02 0,73+0,06* 0,6

ЦИХЛ6 708 3,44 1,6 2,3±0,1 0,60±0,08 0,7

ЦИХЛ7 708 3,0 1,6 1,5+0,1 0,65+0,06 0,4

ЦИХЛ8 742 3,7 1,3 0,27+0,01 0,53+0,06* 0,5

ЦИХЛ9 742 2,62 0,9 0,27+0,03 0,40±0,05* 0,06

ЦИХЛ 10 720 3,06 1,7 1,5+0,1 0,53±0,03* 0,4

ЦИХЛ 11 742 2,75 0,35 - - -

ЦИХЛ 12 734 2,8 0,3 - - -

ЦИХЛ 13 744 2,5 0,2 - - -

ЦИХЛ 14 710 3,03 0,7 2,6±0,1 0,63+0,03 0,25

ЦИХЛ 15 699 35 1 1,1+0,1 0,52+0,04 0,68

ЦИХЛ 16 693 3,19 1 0,50±0,05 0,55±0,04 0,16

ЦИХЛ 17 702 1,4 0,5 1,1+0,1 0,30+0,03 0,06

ЦИХЛ 18 710 2,66 0,8 0,77+0,05 0,45+0,02 0,5

"Данные из работы [ТеоГапоу е1 а1, 2004] ^ - максимум (}-полосы поглощения ЦИХЛ в 1% СгЕЬ, е - коэффициент молярной экстинкции на длине волны Р- концентрация насыщенного раствора в 10 % СгЕЬ, ф- квантовый выход генерации синглетного кислорода в 0,1 % СгЕЬ ( в 1 % СгЕЬ) при рН 7,3, фрЬ - квантовый выход фотовыгорания, Уот„ - относительная эффективность фотоиндуцированной генерации супероксид-иона в 1% СгЕЬ (32°С, рН 7,3), когда за единицу принята эффективность генерации супероксид-иона соединением ЦИХЛ1

Исследование молекулярных взаимодействий показали, чго ЦИХЛ связываются с лилидными структурам, слабо связываются с белками и не связываются с ДНК

В проведенных исследованиях показано, что в мембранно-связанном состоянии ЦИХЛ под действием света с высоким квантовым выходом генерируют синглетный кислород (табл 3), но не образуют гидроксильные радикалы Обнаружено, что в присутствии СгЕЬ происходит светоиндуцированное ЦИХЛ-опосредованное образование супероксид-ионов Сь*~ (табл 3), и концентрация СгЕЬ является фактором, лимитирующим скорость генерирования О2* Предполагается, что в подходящем клеточном микроокружении ЦИХЛ помимо генерации синглетного кислорода могут образовывать 02*~ Измерены квантовые выходы фотоиндуцированной деградации ЦИХЛ, величины которых (табл 3) свидетельствуют, что ЦИХЛ обладают достаточно высокой фотостабильностью.

Ш.2. 2. Исследование биологических свойств ЦИХЛ.

III2 2 I Исследование связывания ЦИХЛ с компонентами плазмы и сыворотки крови.

Плазма крови человека.

«г- 31 С. чо ^

(а) - « (б) с 2

Молекулярный вес . .

шш! к 1| 1 т тт

I § (') I в § § 0

ч ч * ч ч е

► 1

JIHTH-CrEL

белки

0.2 0.4 0.6 0.8 Длина пробега, oih. ед.

0.2 0.4 0.6 0.8 1.< Д.шна upofiei а, ош. еч.

Рис. 9. Связывание ЦИХЛ1 с компонентами плазмы крови человека и ЭТС

Представлены распределения белков, окрашенных Кумасси R250, в электрофорезах 12 5% плазмы крови человека (я) и ЭТС (б), липопротеинов, окрашенных Суданом черным В, в элек грофорезах цельной плазмы крови (в) и ЭТС (г), зависимости интенсивности флуоресцентного сигнала ЦИХЛ1 (д, е) в геле от расстояния от стартовой линии лектрофореза (длина пробега) и сопоставлении с соответствующим расположением липопрогеинов и белков (—О—) - профиль собственной электрофоретической подвижности ЦИХЛ в 0 02% CrEL

(----)- профиль распределения доли ЦИХЛ1, связанной с белками, а (—) - доли ЦИХЛ1,

связанной с липидами Обозначения ЛОНП - липопротеины очень низкой плотности, ЛНП -липопротеины низкой плотности, ЛВП - липопротеины высокой плотности, Ф - фронтальная зона, содержащая альбумин, а- и (3-глобулины

Исследования показали, что в плазме крови человека практически все ЦИХЛ переходят из СгЕЬ-ассоциированного состояния в состав комплексов с компонентами плазмы' отрицательно заряженные ЦИХЛ преимущественно связываются с белками, нейтральные ЦИХЛ образуют комплексы с ЛОНП (рис 9, табл 4) Это согласуется с исследованиями в растворах, показавшими, что заряженные ЦИХЛ, в отличие от нейтральных, легко образуют комплексы с ЧСА и а-глобулинами Отметим, что в плазме крови мыши отрицательно заряженные и нейтральные ЦИХЛ переходят из СгЕЬ-ассоциированной формы в преимущественно (57-80%) связанную с ЛВП в отличие от плазмы крови человека, где с ЛВП связывалось не более 20% ЦИХЛ Благодаря спектральным изменениям, происходящим с ЦИХЛ при связывании с белками и липопротеинами при анализе гелей по спектрам флуоресценции были надежно идентифицированы комплексы ЦИХЛ с СгЕЬ, липопротеинами и белками.

Табл. 4. Относительное распределение ЦИХЛ (КЭф, %) между компонентами плазмы крови человека и ЭТС_______

ЦИХЛ Плазма крови человека ЭТС

CrEL ЛОНП лнп ЛВП белки CrEL ЛНП ЛВП белки

ЦИХЛ1 0 15±1 5±1 20+4 60±4 10+2 43±3 44+1 3±1

ЦИХЛ2 0 24+2 13+1 6±1 57+3 16±2 47±5 31+1 6+1

цихлз 40+4 3±1 22±2 13±1 22±2 51±5 16±6 33±1 0

ЦИХЛ 4 47+7 20+5 16+1 17±5 0 60±10 14±1 26±4 0

ЦИХЛ5 12±1 78+8 8+1 2±1 0 32+6 44±1 24±1 0

ЦИХЛ6 12+2 0 18±3 5±1 65+3 0 71+5 21+1 8±1

ЦИХЛ7 0 5±1 25+2 0 70+4 9+3 67±3 16±2 8±1

ЦИХЛ8 0 6+1 0 14+1 80+4 0 27±3 63±3 10+2

ЦИХЛ 9 9±1 30±2 7+1 40±4 14+1 40+5 13+5 47+6 0

ЦИХЛ 10 6+1 0 24±2 31+4 39±2 32±5 22+2 44±6 2+1

ЦИХЛ 14 0 24+4 11±4 2+1 63±4 10±5 65±1 25±1 0

ЦИХЛ 18 0 11+4 0 3+1 86±4 40±5 44±5 16±1 0

В 100% эмбриональной телячьей сыворотке (ЭТС) ЦИХЛ связываются преимущественно с липопротеинами В составе ЭТС почти нет белков, образующих комплексы с ЦИХЛ (рис 9, табл 4) При инкубации клеток в присутствии 10% ЭТС соединения находятся преимущественно в CrEL-ассоциированном состоянии Таким образом, именно физико-химические свойства самих ЦИХЛ, а не их комплексов с компонентами ЭТС предопределяют внутриклеточную локализацию

1112 2 2 Иссчедовапия ЦИХЛ методом КОМИРСИ па живых клетках

ЦИХЛ 1-ЦИХЛ 10, ЦИХЛ14-ЦИХЛ18 эффективно проникают в клетки А549 и накапливаются в цитоплазме в мономерной флуоресцирующей форме (рис 10) Установлено, что гидрофобные заместители R2 и R-, предопределяют

избирательное накопление ЦИХЛ9 и ЦИХЛ10 в линидных каплях (клеточные органоиды, ответственные за хранение нейтральных липидов и стериновых эфиров); полярные и анионные группы способствуют преимущественному концентрированию ЦИХЛ1, ЦИХЛ7, ЦИХЛ8, ЦИХЛ14, ЦИХЛ16, ЦИХЛ18 в аппарате Гольджи и связыванию с эндоплазматическим ретикулумом (ЭР), катионные заместители Яг вызывают селективное накопление ЦИХЛ15 и ЦИХЛ17 в лизосомах (рис 10) Отметим, что анионное ЦИХЛ6 в равной степени накапливалось в липидных каплях, аппарате Гольджи и ЭР Проникновение в клетки катионных, анионных и нейтральных ЦИХЛ происходит с участием разных механизмов клеточного транспорта

°' ; • V* V Г*

(б) (в) ■ . * (г) , * % у -

Ф \ * (ЯЖ* * Рис.10 Анатиз вн\ гриктсточной токализации в живых клетках А549 ЦИХЛ6 (а-г), ЦИХЛ1 (й-л), ЦИХЛ15 (1-й) с испотьзованием ф т) оресцир) ющих зондов клеточных органе п.

- У« 'ЧШИ У ' , • • ■ /к) ШкьшшаяШИШШж * .Л окрашивающих тигшдные кати (г), ЭР (ж), аппараи Гольджи (к) лизосомы (н) (а о 1 /) -микрофотографии ктеток (метка -5 мкм) Распредстение в клетках ЦИХЛ1 (е и) компонен I а ЦИХЛ6 с Х^-716 нм (б) компонента ЦИХЛбе \|,=711 нм(«) и ЦИХЛ 15 («) Черный цвет дтя спектральных изображений (б-г), (е) (ж), (и), (к), (м) Г»), соотвс1Ств\ ет наибольшей интенсивности сигната

(м)" л- • . <

Из спектрального анализа следует, что ЦИХЛ в клетках находятся в мембранно-связанном состоянии и их микроокружение соответствует микроокружению в эмульсии СгЬЬ и лецишновых липосомах Исключение -ЦИХЛ, накапливающиеся в липидных каплях, параметры микроокружепия которых соответствуют микроокружению в частицах липопротеинов Максимальным накоплением в клетках обладали ЦИХЛ6 и ЦИХЛ 10, но из-за бысхрого выведения ЦИХЛ6, сю фотодинамическая активность была ниже (шбл 5) Соединения с гидрофобными и катионными заместителями обладали более длшельными временами полунакопления ЦИХЛ15-ЦИХЛ17 с Ы-изоникспинил метилпиридиниевой группой очень быстро выводились из клеток Уыеводный заместитель не улучшил фото динамических характеристик ЦИХЛ 18

Сравнительный анализ измеренных физико-химических и клеточных характеристик ЦИХЛ адекватно объясняет наблюдаемые отличия в фотоиндуцированной цитотоксичности

Табл. 5. Клеточные свойства ЦИХЛ

ЦИХЛ ИК90, нМ# Локализация в клетке К Т„р, МИН Тсг. МИН

ЦИХЛ1 180+20 Аппарат Гольджи, ЭР 5,5Ю,4 3015 60110

ЦИХЛ6 230±20 ЛК, аппарат Гольджи, ЭР 1111 3016 1714

ЦИХЛ7 240±20 Аппарат Гольджи, ЭР 8+1 24112 50110

ЦИХЛ 8 180±50 Аппарат Гольджи, ЭР 5,0Ю,4 1015 711

ЦИХЛ9 180+10 ЛК 5,410,4 6015 30110

ЦИХЛ 10 110+20 ЛК, аппарат Гольджи, ЭР 10+0,5 90110 4018

ЦИХЛ 11 »1000 в клетки не проникает

ЦИХЛ 12 »1000 в клетки не проникает

ЦИХЛ 13 »1000 в клетки не проникает

ЦИХЛ 14 180120 Аппарат Гольджи, ЭР 3,8+0,4 3015 60110

ЦИХЛ 15 800±20 лизосомы 3,0Ю,3 200±30 812

ЦИХЛ 16 390±10 Аппарат Гольджи, ЭР 5,5±0,3 380±30 8

ЦИХЛ 17 1700120 лизосомы 1,9Ю,2 3015 8

ЦИХЛ 18 620130 Аппарат Гольджи, ЭР 3,4+0,2 80±18 150±20

По данным МНИОИ им П А Герцена, ИК90 - концентрация, соответствующая 90% уровню фототоксичности, К- максимальное отношение внутриклеточной концентрации ФС к его концентрации в среде, Тир - время полу накопления ФС в клетках, - время полувыведения

ФС из клеток

Выводы

1 На основе методов оптической спектроскопии и микроскопии предложена схема исследования новых ФС, позволяющая выяснить влияние структуры молекулы на ключевые свойства, определяющие фото дин амическую активность ФС в живых клетках

2 Разработана и успешно применена для циклоимидных производных хлорина рб новая комбинированная меюдика на основе электрофореза и микроспсктроскопии, позволяющая определить, какие компоненты плазмы крови являются переносчиками ФС, и оценить долю связанного с ними ФС

3 На основе метода КОМИРСИ разработаны универсальные методики, позволяющие измерить концентрацию мономерной фотодинамически-активной формы ФС в живых клетках, охарактеризовать локализацию и распределение ФС в клетках и срезах тканей

4 Исследование различных экспериментальных моделей мышиных опухолей показало, что субстанция РсБг^ на основе сульфатированных фталоцианинов эффективно накапливается как в клетках опухоли, так и в прилегающих тканевых структурах, причем степень накопления РсЗг^ в опухоли зависит от ее вида

5 Из анализа полученных данных следует, что противоопухолевый эффект ФДТ с применением PcS24 и фотосенса реализуе1ся за счет двух механизмов фотодинамического действия (А) уничтожение опухолевых клеток путем прямого воздействия на них внутриклеточной фракции ФС, (Б) подавление роста опухоли опосредованное разрушением поддерживающих опухоль тканевых структур за счет накапливающейся в них фракции ФС

6 Выявлено, что с помощью заместителей, введенных в пиррольные циклы A, D и в имидный цикл Е, можно эффективно влиять на ключевые физико-химические свойства циклоимидных производных хлорина рб, управлять

* кинетикой их интернализации и удержания в опухолевых клетках, контролировать

внутриклеточную локализацию и способствовать значительному внутриклеточному накоплению, обеспечивая тем самым усиление фотодинамической активности этих соединений в раковых клетках

7 Установлено, что циклоимидные производные хлорина рб являются эффективными ФС, поглощающими на границе ближней ИК-области 131,! 5'-N-(З'-гидроксипропил)циклоимид хлорина рб, 175-метил-3-гидроксииминометил -3-девинил-13',13'-Ы-метоксициклоимид хлорина рб можно рассматривать, как наиболее перспективные соединения для разработки на их основе препаратов для ФДТ.

Список публикаций

1 А.И. Назарова, А В Феофанов, Т А. Кармакова, Г В Шаронов, А Д Плютинская, Р И. Якубовская, В С. Лебедева, А.Ф Миронов, Ж -К Моризо, П Вини Впияиие заместителей на фотохимические и биологические свойства 13,15-N-циклоимидных производных хпорина рб Биоорган. Химия 2005, т 31, №5, с 1-14

2 ЕЛ Водовозова, А.И. Назарова, А В Феофанов, Р В Холоденко, Г В Пазынина, Г.П Гаенко, HB. Бовин, Юл Г Молотковский Взаимооействие чипосои, несущих углеводные детерминанты, с клетками мелапомы человека Биологические мембраны 2004, т 21, № 1, с 53-64

3 Феофанов А В , Назарова А.И , Кармакова Т А , Плютинская А Д , Гришин А И , Якубовская Р И , Лебедева В С , Рузиев Р Д , Миронов А Ф , Моризо Ж -К , Вини П, Фотобиоюгические свойства 13,15-N-ÍKap6oKcu\iemwi)- и (2-карбокстгтп)-циклоимидиых производных хлоринарб Биоорган Химия 2004, т 30, №4, с 417-428

4. Т Karmakova, A Feofanov, A. Nazarova, A Grichine, R Yakubovskaya, Е Luk'yanets, J.-C Maunzot and Р Vigny Distribution of metal-free suljonated phthalocyanine in subcutaneously transplanted murine tumors J Photochem Photobiol В 2004, v 75, № 12, p. 81-87.

5. A Feofanov, A Grichine, T. Karmakova, A Pljutinskaya, V Lebedeva, A. Filyasova, R Yakubovskaya, A Mironov, M Egret-Charlier and P Vigny Near-infraredpholosensitizer on the basis of cycloimide derivative of Murin рб 13,15-N-f3'-hydmxypropyl)cycloimide chlorinрб Photochem Photobiol 2002, v 75, № 6, p 633-643

6 A. T. Filyasova, I A Kudclina, A V Feofanov A spectroscopic study of interaction of tetrasulf mated aluminum phthalncyanme with human serum albumin J Mol Struct 2001, v 565-566, p 173-176

7 A.I. Nazarova, A A Ignatova, G.V Sharonov, T A Karmakova, A D Pljutinskaya, R I Yakubovskaya, M A Grin, A F Mironov, P Vigny, С Otto and A V Feofanov Cationic cycloimide derivatives of chlonn p6 and bacteriochlonn as photosensitizers targeted to lysosomes Int Symp Advanvces in Science for Drug Discovery, Moscow, 2005, B-29

8 T Karmakova, A. Nazarova, A Pankratov, N Kazachkina, R Yakubovskaya, V. Lebedeva, R Ruziyev, A Mironov, J -C Maurizot, P Vigny and A V Feofanov Tissue distribution and m vivo photosensitizing activity of cycloimide derivatives of chlorin p6. Int. Symp Advanvces in Science for Drug Discovery, Moscow, 2005, B-30.

9. Назарова А.И , Шаронов Г В , Игнатова Н С., Кармакова Т.А , Плготинская А Д, Лебедева В С , Грин М А , Рефрежье М., Феофанов А В , Якубовская Р И , Миронов А Ф, Моризо Ж -К , Вини П Циклоимидные произвоОные хюрина рб, как основа Очя соЮания эффективных фотосенсибичизаторов с контролируемой впутрюиеточнои чокашзациеи Тезисы докладов и стендовых сообщений международной конференции по физико-химической биологии, посвященной 70-летию со дня рождения академика Ю А Овчинникова ИБХ РАН, Москва, 2004, с 102-103.

10 Vodovozova Е , Nazarova A., Feofanov А , Kholodenko R , Gaenko G , Bovin N , and Molotkovsky J Interaction of liposomes hearing carbohydrate determinants with melanoma cells In Abstracts of 1st EUFEPS Conf. on Optimising Drug Delivery and Formulation New Challenges m Drug Delivery, Versailles, France, 2003, p. 158

11 А В Феофанов, Г В Шаронов, А.И. Назарова, Т А Кармакова, А И Гришин, А Д Плютинская, Р И Якубовская, В С. Лебедева, Р Д Рузиев, А Ф. Миронов, Ж -К Моризо, П Вини Оптимизация структуры циклоимидных производных хлорина рб для фотоОинамической терапии рака IX Международная конференция по химии порфиринов и их аналогов 8-12 сентября 2003 г, г Суздаль Труды конференции Ред Т А Агеева, Иваново' Ивановский государственный химико-технологический университет, 2003, с 339-341

12 Karmakova Т А , Sharonov G V , Grichine А I, Plyutinskaya A D , Nazarova A.I., Feofanov А V , Kazachkina N I, Yakubovskaya R I, Lebedeva V S , Ruziev R D , Mironov A F , Refregiers M , Maurizot J -C and Vigny P Cycloimide derivatives of chlorin рб - novel near-lRphotosensitizers The 10lh Congress of the European Society for Photobiology, Vienna, Austria, September 6-11, 2003, p 92

13 ТА Кармакова, Г В Шаронов, А И Гришин, А Д Плютинская, А.И. Филясова, А В Феофанов, Н И Казачкина, Р И Якубовская, В С Лебедева, Р Д. Рузиев, А Ф Миронов, П Вини Структурно-функциональные взаимосвязи фотосенсибичизаторов на примере циклонииОных производных хлорина рб Российский биотерапевтический журнал 2003, т 1, № 1, с. 25

14 Шаронов Г В , Филясова А.И , Плютинская А Д , Гришин А И , Кармакова Т А , Феофанов А В , Лебедева В С , Миронов А Ф , Якубовская Р И , Вини П Изучение вчияния структуры боковых заместителей на свойства, определяющие фотодииамическую активность циклоимиОных производных хлорина рб VI чтений, посвященных памяти академика Ю А Овчинникова, 25 ноября-2 декабря 2002 г, Москва - Пущино, с 29

15 A Gnchine, G Charonov, A. Filyasova, A Pljutinskaya, Т Karmakova, A. Feofanov, R Yakubovskaya, V Lebedeva, A Mironov, M Refregiers, M Egret-Charlier, and P. Vigny. Structure-functional relations of cycloimide derivatives of chlonn рб as studied with the confocal spectral imaging (CSI) technique. In' Proc of the II Int Symp Shedding light on

disease Optical diagnostics for the new millenium / Eds G D Sockalingum, M Manfait, Reims, France, 2002, p 68

16 A Feofanov, A Grichme, T Karmakova, N Kazachkina, E Pecherskih, A. Filyasova, R Yakubovskaya, E Luk'yanets, V Derkacheva, M Egret-Charlier and P Vigny Mechanisms oj pholodynamic action of metal-free sulfonated phthalocyanines in living cells as probed with confocal spectral imaging technique In Book of Abstracts of the 9-th Intern Conf on the Spectrosc of Biol Molecules, Ed V KopeckyJr,K Ruszova and J Stepanek, 2001, v 2, p B256

17 G V Sharonov, A. I. Filyasova and A V Feofanov fluorescences study of interactions between aluminium octacarboxyphtalocyamne and human serum albumin In Book of Abstracts of the 9-th Intern Conf on the Spectrosc of Biol Molecules, Ed V KopeckyJr,K Ruszova and J Stepanek, 2001, v l,p A163

18 T Karmakova, A Feofanov, A Grichine, R Yakubovskaya, G Fomina, A. Filyasova, E Luk'yanets, V Derkacheva, M Egret-Charlier and P Vigny Cellular and tissue distribution of metal-free phthalocyanme In Book of Abstracts of the 9-th Congress of the Euiopean Society for Photobiology, 2001, p 175-176.

19 A Feofanov, A Grichine, A. Filyasova, T Karmakova, A Plyutinskaya, R Yakubovskaya, V Lebedeva, R Ruziev, A Mironov, M Egret-Charlier and P Vigny Photobiological effects oj cycloimide derivatives о/ chlorin p6, new promising near-lR photosensitizers In Book of Abstracts of the XX-th Intern Conf on Photochemistry, Ed A. Chibisov, 2001, p 262-263

20 A Feofanov, A Grichine, A. Filyasova, T Karmakova, N Kazachkina, E Pecherskih, R Yakubovskaya, E Luk'yanets, V Derkacheva, M Egret-Charlier and P Vigny Pholodynamic effect with metal-free disulfonaledphthalocyanme In' Book of Abstracts of the XX-th Intern Conf on Photochemistry, Ed A Chibisov, 2001, p 241-242

21 A V. Feofanov, Yu S Alaverdian, A.I. Filyasova, О A Fedorova, A V Koshkin, S P. Gromov and M V Alfimov Complexation of crowned spironaphthoxazme with magnesium cations as probed by SERS spectroscopy In Book of Abstracts of the 1st Intern Conf on Advanced Vibrational Spectroscopy, 2001, p P18 218

22 A. Filyasova, I Kudelina, A Feofanov Study of interaction o) tetrasuljonated aluminum phthalocyanme with human serum albumin In Book of Abstracts of XXV European Congress on Molecular Spectrosc / Ed R Fausto, E Diogo, 2000, p 297

23 А Феофанов, А Гришин, И Куделина, А. Филясова, T Кармакова, Р Якубовская, М Эгрет-Шарлье, П Вини, Метоо конфока ¡ьной микроспектроскопии и реконструкции спектрапьных изображений (КОМИРСИ) н нсаеоованиих новых противоопухопевых соединений Высокие технологии в онкологии Материалы V Всеросийского съезда онкологов, 4-7 октября 2000, Казань, т 1, с 229-230

24 Филясова А. И., Вини П, Гришин А И , Кармакова Т А , Феофанов А В , Фомина Г И, Якубовская Р И ИсаеОование методой конфокальной микроспектроскопии чокачизации и механизмов действия су ¡ьфатированного фталоцианина в срезах опухолевых тканей XLIII Научная конференция МФТИ "Современные проблемы фундаментальных и прикладных наук", 24 ноября-9 декабря 2000 г, Москва, ч. 6, с 43.

Заказ № 1717 Подписано в печать 14 09 05 Тираж 100 экз Ус 1 п 1 0,88

ООО "Цифровичок", те I (095) 797-75-76 и'wwcfr.ru, е-тш1.ш/о@с/г ги

Р16190

РНБ Русский фонд

2006-4 11100

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Назарова, Анна Ивановна

Список использованных сокращений.

Введение.

Глава I. Обзор литературы.

1.1. Метод фото динамической терапии.

1.1.1. Молекулярные механизмы фото динамического действия ФС.

1.1.2. Реакционная способность АФК по отношению к биологическая молекулам. f^, I. 1.3. Механизмы селективного накопления и локализации ФС в опухоли.

I. 1.4. Биологические процессы, вызываемые ФДТ.

I. 1.5. Способы доставки противоопухолевых препаратов.

I. 1.6. Особенности химического строения и синтеза PC и хлоринов.

I. 1.7. Физико-химические свойства ФС.

I. 1.8. Биологические свойства ФС.

I. 1.8. 1. Связывание ФС с компонентами плазмы крови и сыворотки. 27 I. 1.8.2. Механизмы проникновения, локализация и накопление ФС в клетках.

I. 1.8.3. Накопление ФС в различных тканях и органах.

1.2. Исследование ФС методами оптической микроскопии и спектрального анализа.

1.2.1. Базовые исследования основных физико-химических свойств ФС.

1.2.2. Исследования ФС внутри клеток.

1.2.3. Исследования локализации и накопления ФС в различных тканях и органах.

Цель и задачи исследования.

Глава II. Материалы и методы.

И. 1. Химические реагенты.

II.2. Использованные ФС.

И.З. Изготовление липосом.

11.4. Используемые приборы.

11.5. Измерение генерации активных форм кислорода (АФК).

11.6. Определение фотостабильности ЦИХЛ.

11.7. Молекулярные взаимодействия ФС в растворах.

И. 8. Эксперименты на культуре клеток.

II.9. Приготовление экстрактов тканей мышей. ф И. 11. Разработка методик КОМИРСИ.

II. 11.1. Методика изучения связывания ФС с компонентами плазмы и сыворотки крови на основе комбинирования методов гель-электрофореза и

КОМИРСИ.

II. 11.2. Методика измерения концентрации ФС и их комплексов в живых клетках методом КОМИРСИ.

И. 11.3. Методика определения внутриклеточной локализации ФС методом

КОМИРСИ.

II. 11.4. Методика исследования распределения ФС в срезах тканей методом КОМИРСИ.

II. 11.5. Спектральные измерения и их обработка.

Глава III. Результаты и обсуждение

III. 1. Исследование ФС на основе сульфатированных фталоцианинов.

III. 1.1. Исследование молекулярных взаимодействий сульфатированных фталоцианинов.

III. 1.1.1. Особенности состояния и спектров PcSn в органических растворителях.

III. 1.1.2 Исследование взаимодействий PcSn с модельными системами, имитирующими мембраны, и биологическими молекулами.

III. 1.2. Анализ накопления PcS2,4 клетками.

III. 1.3. Исследование распределения и взаимодействий PcS2,4 в различных структурах опухолевых тканей.

III. 1.4. Исследование связывания 3-A1PcS4 с ЧСА.

III. 1.5. Исследование методом КОМИРСИ накопления и распределения препарата «Фотосенс» в различных тканевых структурах меланомы кожи пациента.

III.2. Исследование ФС на основе циклоимидных производных хлорина рб.

111.2.1. Исследование физико-химических свойств ЦИХЛ.

111.2.1.1. Исследование солюбилизаторов для приготовления стоковых растворов ЦИХЛ.

111.2.1.2. Исследование взаимодействия липосом, несущих углеводные детерминанты для направленной доставки ФС к опухолевым клеткам, с клетками меланомы.

111.2.1.3. Исследование молекулярных взаимодействий ЦИХЛ.

111.2.1.4. Фотостабильность ЦИХЛ.

111.2.1.5. Исследование генерации АФК.

111.2.1.5.1. Исследование генерации *ОН и '02.

111.2.1.5.2. Исследование генерации Ог*-.

111.2.2. Исследование фотобиологических свойств ЦИХЛ.

111.2.2.1. Исследование связывания ЦИХЛ с компонентами плазмы крови и сыворотки.

111.2.2.2. Исследование фармакокинетики ЦИХЛ1 в экстрактах тканей экспериментальных животных.

111.2.2.3. Исследование ЦИХЛ в живых клетках.

111.2.2.3.1. Выбор солюбилизатора для приготовления стоковых растворов ЦИХЛ.

111.2.2.3.2. Особенности состояния ЦИХЛ в клетках.

111.2.2.3.3. Внутриклеточная локализация ЦИХЛ.

111.2.2.3.4. Особенности внутриклеточного накопления и удержания

ЦИХЛ.

0 III.2.2.3.5. Фототоксичность и темновая токсичность.

III.2.2.3.6. Изучение механизма мембранного и внутриклеточного транспорта ЦИХЛ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка методов оптической микроскопии и спектрального анализа применительно к исследованию новых противоопухолевых препаратов"

Применение методов оптической микроскопии в биологии и медицине имеет давнюю историю. Основоположник научной микроскопии Левенгук А., изготовив линзы с 300 кратным увеличением, впервые наблюдал биологические объекты и их движение в капиллярах еще в 1673 году. Сейчас при стремительном развитии науки методы оптической микроскопии являются неотъемлемым этапом в исследовании биологических объектов и механизмов действия лекарственных препаратов. Наибольший интерес сейчас представляет наблюдение живых объектов в реальном времени, что исключает артефакты, происходящие с биологическим объектом в процессе его приготовления (фиксации, окрашивания и т. п.). Это стало возможным благодаря развитию лазерной сканирующей конфокальной микроскопии, позволяющей получать трехмерные изображения объектов во времени. Получить дополнительную информацию о биологически активном соединении (БАС), его состоянии и микроокружении в биологическом объекте можно дополнив конфокальную микроскопию методами спектрального анализа. В связи с этим был предложен метод конфокальной микроскопии и реконструкции спектральных изображений (КОМИРСИ). Метод КОМИРСИ основан на измерении с субмикронным пространственным разрешением и анализе в каждой точке сканируемого объекта полных спектров флуоресценции. Это позволяет установить пространственное распределение исследуемого БАС и его молекулярных комплексов в сканируемом объекте, учтя вклад собственной флуоресценции объекта в общий флуоресцентный сигнал. По спектрам флуоресценции можно определить микроокружение и молекулярные взаимодействия БАС, имеющие непосредственное отношение к его функциональной активности.

В данной диссертации представлены результаты разработки метода КОМИРСИ применительно к исследованию новых противоопухолевых соединений фотосенсибилизаторов (ФС) для фотодинамической терапии (ФДТ). Метод ФДТ - новое направление лечения рака, получившее широкое развитие в России. Он основан на накоплении в опухолевой ткани введенного в организм ФС, действие которого активируется локальным световым облучением и сопровождается генерацией активных форм кислорода (АФК), приводящих в итоге к гибели опухолевых клеток [Dougherty, 2002; Dougherty et al., 1998]. ФДТ выгодно отличается от химиотерапии избирательностью поражения опухоли и отсутствием общего токсического воздействия на организм, благодаря чему интерес к методу ФДТ в клинической онкологии в России растет от года к году. В связи с этим в качестве объектов исследования были выбраны новые перспективные отечественные ФС. ФС идеально подходят для исследования методами флуоресцентной микроскопии и спектроскопии благодаря их интенсивному поглощению и флуоресценции в красной и ближней ИК-области.

Применяемые в клинике ФС первого поколения имеют поглощение в области 620640 нм, где глубина проникновения света в ткани мала. Это затрудняет лечение опухолей больших размеров, требует больших доз препарата и высокой мощности терапевтического излучения. Проницаемость тканей для света возрастает с увеличением длины волны излучения, обеспечивая более глубокое поражение опухоли. Одной из задач ведущейся в настоящее время разработки ФС нового поколения является сдвиг их длинноволнового поглощения в область оптимального проникновения света для ткани: 700-800 нм. Кроме того, разработка новых ФС направлена на улучшение их фотофизических характеристик, избирательности накопления в опухоли, увеличение фототоксичности, уменьшение побочных эффектов, в частности, за счет оптимизации скорости выведения ФС из кожи больного.

В рамках данной диссертационной работы были разработаны универсальные методики изучения ФС методами оптической микроскопии и спектроскопии, позволившие заполнить пробелы в исследовании новых ФС на пути от синтеза до клиники. Методики отработаны и их применимость доказана в исследованиях двух ФС второго поколения на основе сульфатированных производных фталоцианина: тетрасульфатированного фталоцианина алюминия и безметального сульфатированного фталоцианина. Использование отработанных методик позволило провести комплексное исследование другой группы перспективных ФС нового поколения на основе циклоимидных производных хлорина рб.

Сульфатированные фталоцианины являются одним из перспективных классов фотосенсибилизаторов второго поколения. Выбор сульфатированных фталоцианинов обусловлен их низкой темновой токсичностью, высокой фотостабильностью и высокой фотодинамической активностью по сравнению с порфириновыми аналогами, применяемыми на данный момент в клинической практике. Кроме того, синтез этих соединений относительно прост и дешев. Наибольшей активностью из известных металло-комплексов обладают сульфатированные фталоцианины алюминия и цинка. На основе смеси сульфофталоцианинов алюминия с различной степенью сульфатирования предложен отечественный препарат "Фотосенс", который сейчас уже начал применяться в клинике [Соколов и др., 1995].

Тетрасульфатированный фталоцианин алюминия - один из компонентов, входящих в состав фотосенса. Именно этот компонент фотосенса накапливается в высоких концентрациях в прилегающей к опухоли соединительной ткани [Feofanov et al, 1999].

Вследствие этого фотодинамическое воздействие фотосенса, по-видимому, в значительной степени происходит за счет разрушения окружающих и питающих опухоль тканевых структур. С целью выяснения возможных переносчиков тетрасульфатированного фталоцианина алюминия в крови в диссертации было проведено детальное исследование связывания этого соединения с транспортным белком плазмы крови- человеческим сывороточным альбумином (ЧСА).

Среди работ по исследованию фталоцианинов существует ряд публикаций, в которых безметальные сульфатированные производные фталоцианина (PcSn, где п-среднее число сульфогрупп на молекулу) признаны фотодинамически неактивными [Brasseur et al., 1987; Sonoda et al., 1987; Evensen et al., 1987; Rosenthal, 1991]. По результатам этих работ дальнейшее изучение PcS„ было признано бесперспективным.

Разработанная сотрудниками ГНЦ "НИОПИК" новая методика синтеза PcSn дала возможность перепроверить фотодинамический эффект с применением данных соединений. Как показали эксперименты, новосинтезированные PcSn обладают существенной фотодинамической активностью in vitro и in vivo. Так, по данным исследований, проведенных в МНИОИ им. П. А. Герцена, фотодинамический эффект с применением PcS2,4 в несколько раз превышал активность металлозамещенных сульфофталоцианов и других исследовавшихся ранее эффективных ФС на основе порфирина и хлорина. Это свидетельствовало о перспективности дальнейших исследований данного соединения и разработки на его основе препарата для фотодинамической терапии.

Механизм действия сульфатированных фталоцианинов как на тканевом, так и на клеточном уровне до настоящего времени был не изучен. В связи с этим, в данной диссертации были исследованы: локализация, кинетика накопления и удержания PcSn клетками; зависимость внутриклеточной концентрации от концентрации сенсибилизатора во внеклеточной среде; механизм проникновения препарата в опухолевые клетки. Было проведено изучение локализации и уровня накопления в клетках смесевых субстанций PcSn с различной степенью сульфатирования.

Для направленного создания эффективного ФС необходимо глубокое понимание взаимосвязи между структурой молекулы, ее физико-химическими и биологическими свойствами. К настоящему времени изучено много соединений, обладающих эффективной генерацией АФК [Sternberg and Dolphin, 1998]. Однако на основе опубликованных данных довольно сложно проследить закономерности влияния структуры на свойства ФС в биологических системах (клетках и тканях), так как отличия затрагивают и хромофорный центр, и боковые заместители. Многие известные ФС предоставляют ограниченные возможности для направленной модификации их структуры. Например, фталоцианины и нафталоцианины - симметричные молекулы, и введение заместителей происходит сразу по нескольким положениям с равной эффективностью [Ambros, 1991]. Еще сложнее ввести в эти ФС разные функциональные группы, и тем более, контролировать их взаимное расположение.

Для изучения возможности управления свойствами ФС за счет изменения структуры, нами была исследована серия циклоимидных производных хлорина рб (ЦИХЛ) с различными заместителями в пиррольных циклах A, D и имидном цикле Е (рис. 2). ////Разработаны/синтезированы в лаб. проф. А.Ф. Миронова МИТХТ/// ЦИХЛ являются новой группой ФС, поглощающих в более длинноволновой области, чем фталоцианины (максимумы поглощения лежат в диапазоне 690-750 нм). Было исследовано влияние электроноакцепторных заместителей, заряда и степени гидрофобности заместителей на фотохимические и биологические свойства ЦИХЛ, такие как растворимость, молекулярные взаимодействия с биологическими молекулами, фотостабильность, способность образовывать АФК, механизм проникновения в клетки, количественные параметры накопления в опухолевых клетках и особенности клеточной фармакокинетики, связывание с различными компонентами плазмы крови и сыворотки. Знание этих характеристик и их взаимосвязей со структурой молекулы позволяет глубже понять механизмы действия ФС и прогнозировать их эффективность in vivo.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Назарова, Анна Ивановна

Выводы

1. На основе методов оптической спектроскопии и микроскопии предложена схема исследования новых ФС, позволяющая выяснить влияние структуры молекулы на ключевые свойства, определяющие фото динамическую активность ФС в живых клетках.

2. Разработана и успешно применена для сульфатированных фталоцианинов и циклоимидных производных хлорина рб новая комбинированная методика на основе электрофореза и микроспектроскопии, позволяющая определить, какие компоненты плазмы крови являются переносчиками ФС, и оценить долю связанного с ними ФС.

3. На основе метода КОМИРСИ разработаны универсальные методики, позволяющие измерить концентрацию мономерной фотодинамически-активной формы ФС в живых клетках, охарактеризовать локализацию и распределение ФС в клетках и срезах тканей.

4. Обнаружено, что AIPCS4 эффективно связывается за счет электростатического взаимодействия с ЧСА. Центр высокоаффинного связывания характеризуется константой связывания (1,2±0,2)х107 М*1 при 24°С, понижающейся до

3,3±0,3)х105 М'1 при 37°С, расположен в домене I ЧСА и перекрывается с участком связывания для гемина.

5. Исследование различных экспериментальных моделей мышиных опухолей показало, что субстанция PcS2,4 на основе сульфатированных фталоцианинов эффективно накапливается как в клетках опухоли, так и в прилегающих тканевых структурах, причем степень накопления PcS2,4 в опухоли зависит от ее вида.

6. Из анализа полученных данных следует, что противоопухолевый эффект ФДТ с применением PcS2,4 и фотосенса реализуется за счет двух механизмов фотодинамического действия: (А) уничтожение опухолевых клеток путем прямого воздействия на них внутриклеточной фракции ФС; (Б) подавление роста опухоли опосредованное разрушением поддерживающих опухоль тканевых структур за счет накапливающейся в них фракции ФС.

7. Выявлено, что с помощью заместителей, введенных в пиррольные циклы A, D и в имидный цикл Е, можно эффективно влиять на ключевые физико-химические свойства циклоимидных производных хлорина рб, управлять кинетикой их интернализации и удержания в опухолевых клетках, контролировать внутриклеточную локализацию и способствовать значительному внутриклеточному накоплению, обеспечивая тем самым усиление фотодинамической активности этих соединений в раковых клетках.

8. Установлено, что циклоимидные производные хлорина рб являются эффективными ФС, поглощающими на границе ближней ИК-области. П'ДЗ'-И-(З'-гидроксипропил)циклоимид хлорина рб, 175-метил-3-гидроксииминометил -3-девинил-131,151 -N-метоксициклоимид хлорина рб можно рассматривать, как наиболее перспективных кандидатов для изучения фотодинамической активности ЦИХЛ на животных и разработки на основе ЦИХЛ препаратов для ФДТ.

БЛАГОДАРНОСТИ

В заключение я хотела бы выразить искреннюю благодарность моему научному руководителю - старшему научному сотруднику лаборатории Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН кандидату физико-математических наук, доценту Алексею Валерьевичу Феофанову за руководство, внимание и помощь, оказанные при выполнении работы и подготовке рукописи. Я очень благодарна старшему научному сотруднику лаборатории модификаторов и протекторов МНИОИ им. П. А. Герцена кандидату биологических наук Кармаковой Татьяне Анатольевне за консультации, помощь и руководство при подготовке и проведении биологических экспериментов и ведении клеточных культур. Хочу выразить глубокую признательность сотрудникам группы оптической спектроскопии лаборатории структурной биологии Института биоорганической химии им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН, особенно Георгию Владимировичу Шаронову, за консультации, советы и помощь при проведении экспериментов. Хочу поблагодарить старшего научного сотрудника лаборатории химии липидов Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН кандидата химических наук Водовозову Елену Львовну за консультации и помощь при работе с липосомами.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Механизм действия нехелатированных с металлами сульфатированных фталоцианинов как на тканевом, так и на клеточном уровне до настоящего времени был не изучен. В связи с этим, в данной диссертации были исследованы: локализация, кинетика накопления и удержания PcSn опухолевыми клетками; зависимость внутриклеточной концентрации от концентрации PcSn во внеклеточной среде; механизм проникновения PcSn в опухолевые клетки. Было проведено изучение локализации и уровня накопления в клетках смесевых субстанций PcSn с различной степенью сульфатирования. В этих исследованиях метод КОМИРСИ был применен для количественной оценки внутриклеточного накопления и распределения PcSn в живых клетках, изучения молекулярных взаимодействий этих ФС в растворах и во внутриклеточном окружении. С использованием метода КОМИРСИ изучены локализация и распределение PcSn в различных структурах опухолевых тканей мышей, а также зависимость этих характеристик от вида перевивной опухоли. Проведенные в диссертации исследования содействовали созданию на основе PcSn нового препарата для ФДТ рака -"Фталосенса". На данный момент фталосенс находится на стадии клинических исследований.

Помимо мышиных опухолей изучались срезы опухолей больных. Впервые метод КОМИРСИ был разработан и применен для исследования распределения фотосенса в меланоме человека. Полученные результаты показали перспективность применения метода, и врачи МНИОИ им. П. А. Герцена признали необходимым проведение расширенных исследований накопления и распределения ФС в пробах тканей пациентов методом КОМИРСИ для повышения эффективности терапии.

Для изучения возможности управления свойствами ФС за счет изменения структуры, нами была исследована серия ЦИХЛ с различными заместителями в пиррольных циклах A, D и имидном цикле Е. Данные соединения - гидрофобны, поэтому были исследованы разные системы растворителей для приготовления концентрированных растворов данных ФС в мономерной форме с перспективой дальнейшего использования этих растворов для введения препарата в кровь. Наибольшего внутриклеточного проникновения и активности удалось достичь с помощью эмульсии CrEL. Было проведено исследование возможности увеличения селективности доставки ФС в клетки опухоли с использованием определенных вектор-направленных липосом. По результатам проведенного исследования CrEL был признан наиболее эффективным солюбилизатором, обеспечивающим стабилизацию мономерной формы ЦИХЛ в водной среде.

Сопоставлены особенности связывания ЦИХЛ с компонентами эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) и внутриклеточной локализацией соединений. Установлены значительные отличия в профилях взаимодействия ЦИХЛ с компонентами плазмы крови человека, мыши и ЭТС. Знание этих характеристик и их взаимосвязей со структурой молекулы позволяет глубже понять механизмы действия ФС и прогнозировать их эффективность in vivo. Это возможно позволит объяснить различия фотодинамического действия оказываемого ФС на экспериментальных животных и человека, а также позволит проследить путь ФС при попадании в кровоток.

Знание временной зависимости накопления ФС в различных органах и крови необходимо для правильного выбора временного промежутка между введением ФС и облучением опухоли, подбора дозы, способа введения препарата. Впервые метод микроспектроскопии бьш успешно применен для исследования ЦИХЛ1 в экстрактах различных тканей животных при изучении фармакодинамики ЦИХЛ1. Благодаря использованию микроколичеств исследуемых образцов и очень высокой чувствительности к содержанию в них ФС, а также благодаря спектральному анализу, позволяющему выделить полезный сигнал на фоне многокомпонентной флуоресценции экстрактов, данный подход представляется эффективным для понимания распределения и уровня накопления ФС в различных жизненно-важных органах и физиологических жидкостях.

Проведенные исследования выявили наиболее перспективные способы создания высокоактивных ЦИХЛ с поглощением в ближней ИК-области, управления их внутриклеточной локализацией и избирательностью нацеливания этих ФС на определенные внутриклеточные мишени. Кроме того на примере соединений ЦИХЛ6 и ЦИХЛ 10 показано, что с помощью подходящих заместителей можно обеспечить распределенное фотодинамическое воздействие сразу на несколько клеточных структур-мишеней. Благодаря успешной комбинации боковых заместителей для соединения ЦИХЛ6 удалось достичь высокого коэффициента накопления в опухолевых клетках, приближающегося к 10, и высокой фотодинамической активности. Выявлена корреляция между накоплением ФС в клетках и фотодинамической активностью на культуре клеток. Таким образом, получено, что, помимо внутриклеточной локализации, изменяя структуру ЦИХЛ, можно влиять на уровень накопления в клетках, скорость клеточного накопления и выведения при сохранении высокой фотодинамической активности этих соединений. Это обеспечивает возможность выбора ФС со свойствами оптимальными для ФДТ. Полученные результаты указывают, что ЦИХЛ являются эффективными ФС с поглощением в ближней ИК-области. С учетом результатов данного исследования принято решение о разработке препаратов для ФДТ на основе наиболее эффективных ЦИХЛ.

Результаты разработки метода КОМИРСИ и данные о взаимосвязи структура -свойства ФС успешно используются в совместных научных исследованиях с МНИОИ им. П. А. Герцена, ФГУП ГНЦ «НИОПИК», МГАТХТ им. М.В. Ломоносова. В сотрудничестве с МНИОИ им. П. А. Герцена начато применение метода КОМИРСИ для анализа накопления и распределения новых отечественных ФС в пробах тканей пациентов для повышения эффективности ФДТ рака. Разработанные методики представляют интерес для научно-исследовательских институтов и фирм, занимающихся разработкой новых ФС, включая: НИИ онкологии им. проф. Н. Н. Петрова; Институт клинической онкологии РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН; ГНЦ лазерной медицины Минздрава России; ММА имени И. М. Сеченова; Институт биомедицинской химии РАМН; Институт биохимии им. А. Н. Баха РАН; Медицинский радиологический научный центр РАМН; Ташкентский научный центр хирургии им. акад. В. В. Вахидова; Сибирский центр лазерной медицины и др.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Назарова, Анна Ивановна, Москва

1. Ackroyd R., Kelty С., Brown N., Reed M. The history of photodetection and photodynamic therapy. Photochem. Photobiol., 2001, v. 74, n. 5, p. 656-669.

2. Ambros M., MacRobert A. J., Morgan J., Rumbles G., Foley M., Philips D. Time-resolved fluorescence spectroscopy and intracellular imaging of disulphonated aluminium phthalocyanine. J. Photochem. Photobiol. B: Biol., 1994, v. 22, p. 105-117.

3. Amyere M., Mettlen M., Smissen P.V.D., Platek A., Payrastre В., Veithen A., Courtoy P.J. Origin, originality, functions, subversions and molecular signalling of macropinocytosis. Int. J. Med. Microbiol., 2002, v. 291, p. 487-494.

4. Barchi J.J. Emerging roles of carbohydrates and glycomimetics in anticancer drug design. Curr. Pharm. Design., 2000, v. 6, p. 485-501.

5. Beaven Gilbert H., Chen Shi-Hua, d' Albis A., Gratzer W. B. A spectroscopy study of the haemin-human-serun-albumin system. Eur. J. Biochem, 1974, v. 41, p. 539-546

6. Berg K., Bommer J. C., Moan J. Evaluation of sulfonated aluminum phthalocyanines for use in photochemotherapy. Cellular uptake studies. 1989, Cancer Letters, v. 44, p. 7-15.

7. Bissonnette R., Tremblay J.-F., Juzenas P., Boushira M., Lui H. Systemic Photodynamic Therapy with Aminolevulinic Acid Induces Apoptosis in Lesional T Lymphocytes of Psoriatic Plaques. J. Investigative Dermatology, 2002, v. 119, n. 1, p. 77-83.

8. Blais J, Amirand C, Ballini JP, Debey P, Foultier MT, Patrice T. Photofrin-induced fluorescence in progressive and regressive murine colonic cancer cells: correlation with cell photosensitivity. J. Photochem. Photobiol. В., 1995, v. 27, p.225-231

9. Blomback В., Hanson L. Plasma proteins. 1979, by John Wiley & Sons, Ltd.

10. Bonnett R., Martinez G., Photobleaching of sensitisers used in photodynamic therapy. Tetrahedron., 2001, v. 57, p. 9513-9547.

11. Bors W., Saran M., Lengfelder E., Michel C., Fuchs C., Frenzel C. Detection of oxygen radicals in biological reactions. Photochem.Photobiol., 1978, v. 28, p. 629-638.

12. Bourre L, Thibaut S., Briffaud A., Rousset N., Eleouet S., Lajat Y., Patrice T. Indirect detection of photosensitizer ex vivo. Photochem. Photobiol., 2002, v. 67, p. 23-31.

13. Broderson R. Bilirubin. Solubility and interaction with albumin and phospholipid. Biol Chem., 1979, v. 254, n. 7, p. 2364-2369.

14. Camus M.-C., Chapman M., Forgez P., Laplaud P. Distrbution and characterization of the serum lipoproteins and apoproteins in the mous, Mus musculus. J. Lipid Research., 1983, v. 24, p. 1210-1228.

15. Chan W. S., MacRobert A. J., Philips D., Hart I. R., Use of charge couple device camera for imaging of intracellul phthalocyanines. Photochem. Photobiol., 1989, v. 50, p. 617-624.

16. Cheung R, Solonenko M, Busch TM, Del Piero F, Putt ME, Hahn SM, Yodh AG. Correlation of in vivo photosensitizer fluorescence and photodynamic-therapy-induced depth of necrosis in a murine tumor model. J Biomed Opt. 2003, v. 8, n. 2, p. 248-252.

17. Datta-Gupta N., Malakar D., Walters E., Thompson B. Binding studies of three water-soluble polycationic porphyrins with human serum albumin. Res. Commun. Chem. Pathol. Pharmacol., 1988, v. 60, n. 3, p. 347-360.

18. DeFrees S.A., Phillips L., Guo L., Zalipsky S. Sialyl Lewis x Liposomes as a Multivalent Ligand and Inhibitor of E-Selectin Mediated Cellular Adhesion. J. Am. Chem. Soc., 1996, v. 118, p.6101-6104.

19. Dhami A., Philips D. Comparison of the photophysics of an aggregating and non-aggregating aluminium phthalocyanine system incorporated into unilamellar vesicles. J. Photochem. Photobiol. A: Chemistry, 1996, v. 100, p. 77-84.

20. Dockal M, Carter D, Ruker F. The three recombinant domains of human serum albumin. Structural characterization and ligand binding properties. J. Biol. Chem., 1999, v. 274, n. 41, p. 29303-29310.

21. Dolmans D.E., Fukumura D., Jain R.K. Photodynamic therapy for cancer. Nat. Rev.Cancer., 2003, v. 3, p. 380-387.

22. Dougherty T. An update on photodynamic therapy applications. J. Clin. Laser Med. Surg., 2002, v. 20, n. 1, p. 3-7.

23. Dougherty T.J., Gomer C.J., Henderson B.W., Jori G., Kessel D., Korbelik M., Moan J., Peng Q., 1998. Photodynamic therapy. J.Natl.Cancer Inst., v. 90, p. 889-905.

24. Evensen J. F., Moan J. A test of different photosensitizers for photodynamic treatment of cancer in a murine tumor model. Photochem. Photobiol., 1987, v. 46, n. 859-865.

25. Feofanov A., Charonov S., Kudelina I., Fleury F., and Nabiev I. Localization and Molecular Interactions of Mitoxantrone Within Living K562 Cells as probed by Confocal Spectral Imaging Analysis. Biophys. J., 1997, v. 73, p. 3317-3327.

26. Foley M., Excited triplet state photophysics of the sulphonated aluminium phthalocyanines bound to human serum albumin, Photochem. Photobiol. B: Biology, 1997, v. 38, p. 10-17.

27. G.N. Vorozhtsov, V.M. Derkacheva, N.I. Kazachkina, Eu.A. Luk'yanets, A.V. Feofanov, G.I. Fomina, V.I. Chissov, R.I. Yakubovskaya, Sulfonated phthalocyanines as photosensitizers for photodynamic therapy, RU patent No. 2183635, dated July 20,2002.

28. Gabius H.J. Tumor Lectinology: At the Intersection of Carbohydrate Chemistry, Biochemistry, Cell Biology, and Oncology. Angew. Chem. Int. Ed. Eng., 1988, v. 27. p. 12671276.

29. Gal D., McDonald C., Porter J.C., Simpson E.R. Cholesterol metabolism in cancer cells in monolayer cul-ture. Ill Low density lipoprotein metabolism, Int. J. Cancer, 1981, v. 28, p. 315319.

30. Gantchev Т., Ouellet R, van Lier J. Binding interactions and conformational changes induced by sulfonated aluminum phthalocyanines in human serum albumin. Arch Biochem Biophys., 1999, v. 366, n. 1, p. 21-30.

31. Gigli M, Doglia SM, Millot JM, Valentini L, Manfait M. Quantitative study of doxorubicin in living cell nuclei by microspectrofluorometry. Biochim Biophys Acta. 1988, v.950, n. 1, p. 13-20.

32. Grahm A., Li G., Chen Y., Morgan J., Oseroff A., Dougherty Т., Pandey R. Structure-activity relationship of new octaethylporphyrin-based benzochlorins as photosensitizers for photodynamic therapy. Photochem.Photobiol., 2003, v. 77, p. 561-566.

33. Granville D.J., McManus B.M., Hunt D.W.C. Photodynamic therapy: shedding light on the biochemical pathways regulating porphyrin-mediated cell death. Histol.Histopathol., 2001, v. 16, p. 309-317.

34. Haylett A., Moore J. Comparative analysis of foetal calf and human low density lipoprotein: relevance for pharmacodynamics of photosensitizers. J. Photochem.Photobiol. B: Biology, 2002, v. 66, p. 171-178.

35. Howe L., Zhang J. Z. The effect of Biological substrates on the Ultrafast Excited-state Dynamics of zinc phthalocyanine in solution. Photochem. Photobiol., 1998, v. 67, n. 1, p. 90-96.

36. Howe L., Zhang J. Z. Ultrafast studies of excited-state dynamics of phthalocyanine and zinc phthalocyanine tetrasulfonate in solution. J. Phys. Chem. A., 1997, v. 101, p. 3207-3213.

37. Javaid В., Watt P. and Krasner N. Photodynamic Therapy (PDT) for Oesophageal Dysplasia and Early Carcinoma with mTHPC (m-Tetrahydroxyphenyl Chlorin): A Preliminary Study. Lasers Med. Sci. 2002, v. 17, p. 51-56.

38. Johannes L., Lamaze C. Clathrin-dependent or not: is it still the question? Traffic., 2002, v. 3, p. 443-451.

39. Jori G. and Reddi E. The role of lipoproteins in the delivery of tumour-targeting photosensitizers. Int J Biochem., 1993, v. 25, n. 10, p.1369-1375.

40. Jori G. In vivo transport and pharmacokinetic behavior of tumour photosensitizers. Ciba Found Symp., 1989, p. 146, p. 78-94.

41. Kandela I., Bartlett J., Indig G. Effect of molecular structure on the selective phototoxicity oftriarylmethane dyes towards tumor cells. Photochem. Photobiol. Sci., 2002, v. 1, p. 309-314.

42. Keston A.S. Brandt R. The fluorometric analysis of ultramicro quantities of hydrogen peroxide Anal. Biochem., 1965, v. 11, p. 1-5.

43. Kimel S., Tromberg B.J., Roberts W.G., Berns M.W. Synglet oxygen generation of porphyrins, chlorins, and phthalocyanines. Photochem.Photobiol., 1989, v. 50, n. 2, p. 175-183.

44. Kirpotin D., Park J.W., Hong K., Zalipsky S., Li W.-L., Carter P., Benz C.C., Papahadjopoulos D. Sterically stabilized anti-HER2 immunoliposomes: design and targeting to human breast cancer cells in vitro. Biochem., 1997, v. 36. v. 66-75.

45. Konan Y.N., Gurny R., Alleman E. State of art in the delivery of photosensitizers for photodynamic therapy. J.Photochem.Photobiol.B Biol., 2002, v. 6, p. 89-106.

46. Kongshaug M, Moan J, Cheng LS, Morgan AR. Binding of etiopurpurin to human plasma proteins. Delivery in cremophor EL and dimethyl sulphoxide. III. Int J Biochem Cell Biol., 1995,v. 27, п. 5, p. 481-492.

47. Kongshaug M., Moan J., Brown S. The distribution of porphyrins with different tumour localizing ability among human plasma proteins. Br. J. Cancer. 1989; v. 59, p. 184-188.

48. Kragh-Hansen U . Structure and ligand binding properties of human serum albumin. Dan Med Bull. 1990, v. 37, п. 1, p. 57-84.

49. Kraljic I., Mohsni S. A new mtthod for the detection of singlet oxigen in aqueous solutions. Photochem. Photobiol. 1978, v. 28, p. 577-581.

50. Krasnovsky A. Singlet molecular oxygen in photobiochemical systems: IR phosphorescence studies. Membr. Cell Biol., 1998, v. 12 p. 665-690.

51. Lamola A, Asher I, Muller-Eberhard U, Poh-Fitzpatrick M. Fluorimetric study of the binding of protoporphyrin to haemopexin and albumin. Biochem J, 1981, v. 196, n. 3, p. 693698.

52. Maman N., Dhami A., Philips D., Brault D. Kinetic and equilibrium studies of incorporation of di-sulphonated aluminium phthalocyanine into unilamellar vesicles, Biochimica et Biophysica Acta, 1999, v. 1420, p. 168-178.

53. Margaron P., Gregoire M.-J., Scasnar , Ali H., Van Lier J. E. Structure-photodynamic acttivity relationships of a series of 4-substituted zinc phthalocyanines, Photochem. Photobiol., 1996, v. 63, n. 2, p. 217-223.

54. Metz J., Friedberg J. Endobronchial photodynamic therapy for the treatment of lung cancer. Chest. Surg. Clin. N. Am., 2001; v. 11, n. 4, p. 829-839.

55. Miskovsky P. Hypericin—a new antiviral and antitumor photosensitizer: mechanism of action and interaction with biological macromolecules. Curr. Drug. Targets., 2002, v. 3, n. 1, p. 55-84.

56. Moan J., Rimington C., Western A.The binding of dihematoporphyrin ether (photofrin II) to human serum albumin.Clin. Chim. Acta., 1985, v. 145, n. 3, p. 227-236.

57. Moghissi K, Dixon K, Stringer M, Freeman T, Thorpe A, Brown S. The place of bronchoscopic photodynamic therapy in advanced unresectable lung cancer: experience of 100 cases. Eur. J. Cardiothorac. Surg., 1999, v. 15, n. 1, p. 1-6.

58. Moghissi K., Dixon K. Photodynamic Therapy (PDT) in Esophageal Cancer: A Surgical View of its Indications Based on 14 Years Experience. Technol .Cancer Res. Treat., 2003, v. 2, n. 4, p. 319-326.

59. Moghissi K., Dixon K., Hudson E., Stringer M., Brown S. Endoscopic laser therapy in malignant tracheobronchial obstruction using sequential Nd YAG laser and photodynamic therapy. Thorax., 1997, v. 52, p. 281-283.

60. Monsigny M., Midoux P., Mayer R., Roche A.C. Glycotargeting: influence of the sugar moiety on both the uptake and the intracellular trafficking of nucleic acid carried by glycosylated polymers. Biosci. Rep., 1999, v. 19, p. 125-132.

61. Monsigny M., Roche A.C., Midoux P. Endogenous lectins and drug targeting. Ann. NY Acad. Sci. 1988., v. 551. p. 399-414.

62. Monsigny M., Roche A.-C., Midoux P. Glycoconjugates as carriers for specific delivery of therapeutic drugs and genes. Adv. Drug Deliv. Rev., 1994, v. 14, p. 1-24.

63. Morgan J., Lottman H., Abbou C., Chopin D. 1994 A comparison of direct and liposomal antibody conjugates of sulfonated aluminum phthalocyanines for selective photoimmunotherapy of human bladder carcinoma. Photochem. Photobiol., v. 60, p. 486-496 .

64. Morlet L., Vonarx V., Foultier M.T., Gouyette A., Stewart C., Lenz P., Patrice T. In vitro and in vivo spectrofluorometry of a water -soluble meta-tetrahydroxyphenyl)chlorin (m-THPC) derivative. J. Photochem. Photobiol. В., 1997, v. 39, p. 249-257.

65. Nardello V., Aubry J.-M. Measurement of photo generated singlet oxigen in aqueous media. Methods Enzymol., 2000, v. 319, p. 50-58.

66. Niedre M., Peterson M.S., Wilson B.C. Direct near-infrared luminescence detection of singlet oxygen generated by photodynamic therapy in cells in vitro and tissues in vivo. Photochem.Photobiol., 2002, v. 75, n. 4, p. 382-391.

67. Nishiyama N., Stapert H., Zhang G.-D., Takasu D., Jiang D.-L., Nagano Т., Aida Т., Kataoka K. Light-Harvesting Ionic Dendrimer Porphyrins as New Photosensitizers for Photodynamic Therapy Bioconjugate Chem., 2003, v. 14, p. 5866

68. Nyman E., Hynninen P.Research advances in the use of tetrapyrrolic photosensitizers for photodynamic therapy. J. Photochem. Photobiol. B: Biology, 2004 v. 73, p. 1-28.

69. Obochi M., Boyle, van Lier J. Biological activities of phthalocyanines. XIII. The effects of human serm components on the in vitro uptake and photodynamic activity of zinc phthalocyanine. Photochem. Photobiol, 1993, v. 57, n. 4, p. 634-640.

70. Oleinick N.L., Morris R.L., Belichenko I. The role of apoptosis in response to photodynamic therapy: what, where, why and how. Photochem. Photobiol. Sci., 2002, v. 1, p. 121.

71. Paquette В., Ali H., Langlois R., Van Lier J. DNA damage and repair following treatment of V-79 cells with sulfonated phthalocyanines, Photochem. Photobiol., 1987, v. 45, n. 6, p. 769773.

72. Peklmans L., Helenius A. Endocytosis via caveolae. Traffic., 2002, v. 3, n. 5, p. 311-320.

73. Peng Q., Moan J., Farrants G., Danielsen H., Ramington C. Localization of potent photosensitizers in human tumor LOX by means of laser scanning microscopy. Cancer Letters, 1991, v. 58, p. 17-27.

74. Petyaev I. M., Hunt V. J. Micellar acceleration of oxigen-dependent reactions and its potential use in the study of human low density lipoprotein. Biochem. Biophys. Acta, 1997, v. 1345, p. 293-305.

75. Pierlot C., Aubry J.-M., Briviba K., Sies H., Di Mascio P. Naphthalene endoperoxides as generators of singlet oxigen in biological media. Methods Enzymol., 2000, v. 319, p. 3-20.

76. Pogue, B. W.; Ortel, В.; Chen, N.; Redmond, R. W.; Hasan, T. A photobiological and photophysical-based study of phototoxicity of two chlorins. Cancer Res., 2001, v. 61, p. 717724.

77. Polo L., Valduga G., Jori G., Reddi E. 2002. Low-density lipoprotein receptors in the uptake of tumour photosensitizers by human and rat transformed fibroblasts. Int. J. Biochem. Cell. Biol., v. 34, n. l,p. 10-23.

78. Reddi E. Role of delivery vehicles for photosensitizers in the photodynamic therapy of tumours. J. Photochem Photobiol В., 1997, v.37, n. 3, p. 189-195.

79. Rodal S.K., Skretting G., Garred O., Vilhardt F., van Deurs В., Sandvig K. Extraction of cholesterol with methyl-beta-cyclodextrin perturbs formation of clathrin-coated vesicles. Mol.Biol.Cell, 1999, v. 10, p. 961-974.

80. Rosenthal I. Phthalocyanines as photodynamic sensitizers. Photochem. Photobiol., 1991, v. 53 p. 859-870.

81. Rousset N., Vonarx V., Eleouet S., Carre J., Bourre L., Lajat Y., Patrice T. Cellular distribution and phototoxicity of benzoporphyrin derivative and Photofrin. Res. Exp. Med., 2000, v.199, p. 341-357.

82. Subtil A., Gaidarov G., Kobylarz K., Lampson M.A., Keen J.H., McGraw Т.Е. Acute cholesterol depletion inhibits clatrin-coated pit budding. Proc.Nat.Acad.Sci.USA, 1999, v. 96, p. 6775-6780.

83. Sandvig, K., Deurs B. Entry of ricin and Shiga toxin into cells: molecular mechanisms and medical perspectives. EMBO J., 2000, v. 19, p. 5943-5950.

84. Shanmugathasan S., Edwards C., Boyle R.W. Advances in modern synthetic porphyrin chemistry, Tetrahedron, 2000, v. 56, p. 1025-1046.

85. Shen T.Y. Saccharide determinants in selective drug delivery. Ann. NY Acad. Sci., 1987, v. 507, p. 272-280.

86. Snyder S., Verma A, Trifiletti R. The peripheral-type benzodiazepine receptor: A protein of mitochondrial outer membranes utilizing porphyrins as endogenous ligands. FASEB J, 1987, v. 1, p. 282-288.

87. Sobolev S., Jans D, Rosenkranz A. Targeted intracellular delivery of photosensitizers. Prog. Biophys. Mol. Biol, 2000, v. 73, p. 51-90. ,

88. Spikes J. Phthalocyanines as photosensitizers in biological 'systems and for the photodynamic therapy of tumors. Photochem. Photobiol., 1991, v. 43, p. 859-870.

89. Sternberg E.D., Dolphin D. Porphyrin-based photosensitizers for use in photodynamic therapy. Tetrahedron, 1998, v. 54, p. 4151-4202.

90. Stewart F., Baas P., Star W. What does photodynamic therapy have to offer radiation oncologists (or their cancer patients). Radiother.Oncol., 1998, v. 48, p. 233-248.

91. Sugio S, Kashima A, Mochizuki S, Noda M, Kobayashi K. Crystal structure of human serum albumin at 2.5 A resolution. Protein Eng. Jun., 1999, v. 12, n. 6, p. 439-46.

92. Tanielean C., Mechin R, Serghrouchni R. Mechanistic and Kinetic Aspects of Photosensitization in the presence of oxigen. Photochem. Photobiol., 2000, v. 71, n. 1, p. 12-19.

93. Usui Y., Kamogawa K. A standard system to determine the quantum yield of singlet oxygen formation in aqueous solution. Photochem. Photobiol., 1974, v. 19, p. 245-247.

94. Valisa P., Favard C., Roussel В., Ballini J.P., Amirand C., Sharonov S., Chadeuf G., Egret-Charlier M., Manfait M., Da Silva E., Vigny P. J. Trace Microprobe Techniques., 1995, v. 13, p. 251-253.

95. Vodovozova E.L., Gayenko G.P., Razinkov V.I., Korchagina E.Y., Bovin N.V., Molotkovsky J.G. Saccaride-assisted delivery of cytotoxic liposomes to human malignant cells. Biochem. Mol. Biol. Int., 1998, v. 44. p. 543-553.

96. Vogel К., Wang S., Lee R.J., Chmielewski J.A., Low P.S. Peptide-Mediated Release of Folate-Targeted Liposome Contents from Endosomal Compartments. J. Am. Chem. Soc., 1996, V. 118, P. 1581-1586.

97. Wang L.H., Rothberg K.G., Anderson R.G. Mis-assembly of clathrin lattices on endosomes reveals a regulatory switch for coated pit formation. J.Cell Biol., 1993, p. 1107-1117

98. Weng M., Zhang M.-H., Shen T. Electron transfer interaction between hypocrellin A and biological substrates and quantitative analysis of superoxide anion radicals. J. Chem. Soc., Perkin Trans., 1997, v. 2, p. 2393-2397.

99. Will O., Gocke E., Eckert I., Schulz I., Pflaum M., Mahler H.-C., Ере B. Oxidative DNA damage and mutations induced by a polar photo sensitizer. Mutation Research. 1999, v. 435, p. 89-101.

100. Wilting J., Willem F., Janssen L., Weideman M. The effect of albumin conformation on the binding of warfarin to human serum albumin. J Biol Chem, 1980, v. 255, n. 7, p. 3032-3037

101. Wood S., Andrew H., Brown S. Symposium- in- print. The subcellular localization of Zn(II) phthalocyanines and their redistribution on exposture to light. Photochem. Photobiol., 1997, v. 65, n. 3, p. 397-402.

102. Woodburn K, Chang CK, Lee S, Henderson B, Kessel D. Biodistribution and PDT efficacy of a ketochlorin photosensitizer as a function of the delivery vehicle. Photochem. Photobiol., 1994, v. 60, n. 2, p. 154-159.

103. Woodburn K. Kessel D. Effect of Dansity-gradients on the binding of Phpotosensitizing agent to plasma proteins. Int. J. Biochem.Cell Biol., 1995, v.127, n. 5,499-506.

104. Woodburn K., Vardaxis N., Hill J., Kaye A., Reiss J, Phillips D. Evaluation of porphyrin characteristics required for photodynamic therapy. Photochem. Photobiol., 1992, v. 55, n. 5, p. 697-704.

105. Wyld L., Reed M.W., Brown N.J. Differential cell death response to photodynamic therapy is dependent on dose and cell type. Brit.J.Cancer, 2001, v. 84, p. 1384-1386.

106. Xiao M. H.,Daniel C., Structure of human serum albumin. Nature, 1992, v. 358, p. 209-215

107. Yamazaki N., Kojima S., Bovin N.V., Andre S., Gabius S., Gabius H.-J. Endogenous lectins as targets for drug delivery. Adv. Drug Deliv. Rev., 2000, v. 43, p. 225-244.

108. Yang Hongying, Wang Fuyuan, Zhang Zhiyi Photobleaching of chlorins in homogeneous and heterogeneous media. Dyes and Pigments, 1999, v. 43 , p. 109-117.

109. Zhang M., Zhang Z., Blessington D., Li H., Busch Т., Madrak V., Miles J., Chance В., Glickson J., Zheng G., Pyropheophorbide 2-Deoxyglucosamide: A New Photosensitizer Targeting Glucose Transporters. Bioconjugate Chem., 2003, v. 14, p. 709-714.

110. Zweytick D., Athenstaedt K., Daum G. Intracellular lipid particles of eukaryotic cells. Biophys. Acta, 2000, v. 1469, № 2, p. 101-120.

111. Бовин H.B. Гликоконъюгаты на основе полиакриламида инструменты для изучения лектинов, антител, гликозилтрансфераз в гликобиологии, цитохимии и гистохимии. Биоорган, химия, 1996, т. 22, с. 643-663.

112. Буторина Д.Н., Красновский А.А. мл., Приезжев А.В. Исследование кинетических параметров синглетного молекулярного кислорода в водных растворах порфиринов. Влияние детергентов и тушителя азида натрия. Биофизика, 2003, т. 48, №2, стр. 201-209.

113. Вакуловская Е.Г., Летягин В.П., Погодина Е.М. Фото динамическая терапия и флуоресцентная диагностика у больных раком молочной железы. Российский биотерапевтический журнал, 2003, №4, т. 2. с. 57-60.

114. Вакуловская Е.Г., Шенталь В. В. Фотодинамическая терапия и флюоресцентная диагностика у больных раком кожи головы и шеи Материалы VI Российской онкологической конференции Москва, 26-28 ноябр 2002, с. 44-45.

115. Гельфонд М., Барчук А., Васильев Д., Стуков А. Возможности фотодинамической терапии (ФДТ) в онкологической практике. Российский биотерапевтический журнал, 2003, №4, т. 2. с. 67-72.

116. Кантор Ч., Шиммел П., Биофизическая химия, Мир. Москва. 1985, т. 3.

117. Карнаухов. В. Спектральный анализ в клеточном мониторинге состояния окружающей среды. Наука, Москва, 2001.

118. Корчагина Е.Ю., Бовин Н.В. Синтез спейсирированных трисахаридов с групповой специфичностью крови А и В, их фрагментов и структурных аналогов. Биоорган, химия, 1992, т. 18, с. 283-298.

119. Красновский А.А. Фотодинамическое действие и синглетный кислород. Биофизика, 1987, т. 49, №2, с. 305-321.

120. Красновский А.А., Егоров С. Ю., Назарова О. В., Ярцев Е. И., Пономарев Г. В., Фотогенерация сингетного молекулярного кислорода водорастворимыми порфиринами. Биофизика, 1987, т. 32, №6, с. 982-993.

121. Кузнецова Н.А., Калия О. JI. Фото каталитическая генерация активных форм кислорода в биологических средах в методе фото динамической терапии. Росс. хим. журн., 1998, т. 42, с. 36-49.

122. Лукъянец Е. А. Новые сенсибилизаторы для фотодинамической терапии. Росс. хим. журн., 1998, т. 42, с. 9-16.

123. Марри Р., Д. Греннер, П. Мейс, В. Родуэлл, Биохимия человека. Москва, «Мир», 1993, т. 1, с. 259,.

124. Меерович И. и Оборотова Н. Применение липосом в фотохимиотерапии: 1. Липосомы в ФДТ. Российский биотерапевтический журнал, 2003, №4, т. 2. с. 3-8.

125. Миронов А., Разработка сенсибилизаторов второго поколения на основе природных хлориновю Росс. хим. журн., 1998, т. 42, с. 23-36.

126. Соболев А., Розенкранц А., Гилязова Д. Подходы к направленной внутриклеточнойдоставке фотосенсибилизаторов для увеличения их эффективности и придания клеточнойспецифичности. Биофизика, 2004, т. 49, №2, с. 351-378.

127. Чиссов В., Соколов В., Булгакова Н. (Жаркова), Филоненко Е. Флюоресцентная эндоскопия, дермаскопия и спектрофотометрия в диагностике злокачественных опухолей основных локализаций. Российский биотерапевтический журнал, 2003, №4, т. 2. с. 45-56.

128. Чиссов В.И., Соколов В. В., Филоненко Е. В. Фотодинамическая терапия злокачественных опухолей. Росс. хим. Журн., 1998, т. 42, с. 5-9.

129. Якубовская Р., Казачкина Н., Кармакова Т., Шитова Л., Печерских Е.Скрининг и медико-биологическое изучение отечественных фотосенсибилизаторов. Росс. хим. журн., 1998, т. 42, с. 17-23.

Информация о работе

Назарова, Анна Ивановна
кандидата физико-математических наук
Москва, 2005
ВАК 03.00.02

Диссертация

Разработка методов оптической микроскопии и спектрального анализа применительно к исследованию новых противоопухолевых препаратов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы