Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка наносомных препаратов на основе флаволигнанов и антиангиогенных белков
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия
Автореферат диссертации по теме "Разработка наносомных препаратов на основе флаволигнанов и антиангиогенных белков"
005"^'
На правах рукописи
Луценко Елена Валерьевна
РАЗРАБОТКА НАНОСОМНЫХ ПРЕПАРАТОВ НА ОСНОВЕ ФЛАВОЛИГНАНОВ И АНТИАНГИОГЕННЫХ БЕЛКОВ
03.01.04 - Биохимия
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
* А фев гт
МОСКВА 2012
005049741
Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений Россельхозакадемии
Научный консультант:
доктор биологических наук, руководитель группы нанотехнологии и нанопрепаратов
ГНУ ВИЛАР Россельхозакадемии Фельдман Наталия Борисовна
Официальные оппоненты:
академик РАМН,
доктор медицинских наук, профессор, заведующий лабораторией биохимии ФГБУ ННЦ Наркологии
Минздравсоцразвигия России Панченко Леонид Федорович
член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор, заведующий лабораторией клинической биохимии
РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН Кушлинский Николай Евгеньевич
доктор биологических наук,
профессор кафедры биохимии РУДН Калинина Елена Валентиновна
Ведущая организация: Институт1 биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН
Защита состоится « 2013 г. в 14.00 на заседании
Диссертационного совета Д.212.203.13 при Российском университете дружбы народов по адресу: 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 8, медицинский факультет.
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Российского университета дружбы народов то адресу: 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 6.
Автореферат разослан« ^ » 201г>г.
Учёный секретарь
Диссертационного совета Д.212.203.13 доктор биологических наук, профессор
Е.В. Лукашева
Актуалытсть проблемы.
Одной из важнейших задач современной медицинской биохимии является поиск новых и совершенствование уже имеющихся путей создания эффективных препаратов для терапии целого ряда патологий, представляющих серьезную угрозу жизни населения практически всех стран мира. Среди этих патологий, часто связанных с техногенными факторами и ухудшением экологической обстановки, — поражения печени различного генеза, целый ряд онкологических заболеваний, а также патологий, связанных с нарушениями ангиогенеза. В настоящее время первостепенное внимание научным и медицинским сообществом уделяется поиску средств или их комбинаций, обладающих комплексным профилактическим и терапевтическим потенциалом, позволяющим снизить риск возникновения и осуществить эффективную терапию патологий, связанных с неблагоприятными факторами окружающей среды. Особое значение при этом придается снижению токсичности препаратов, увеличению их биодоступности, отсутствию врожденной или приобретенной резистентности ткани-мишени к действию препарата. К наиболее перспективным препаратам, отвечающим требованиям современной медицины, относятся растительные флаволигнаны, входящие в состав силимарина, а также антиангиогенные белки ангиостатин и эндосгатин.
Рядом исследований было продемонстрировано, что флаволигнаны силимарина являются сильными антиоксидантами и способны инактивировать как свободные радикалы, так и активные формы кислорода в клетке, что во многом обусловливает их высокую гепатопротекторную и терапевтическую эффективность при лечении таких заболеваний печени, как токсические и вирусные гепатиты, цирроз, лекарственные, радиационные и ишемические повреждения и др. Флаволигнаны обладают также высоким потенциалом в профилактике и лечении онкологических заболеваний. Применение препаратов из расторопши пятнистой практически никогда не вызывает побочных реакций и отличается значительной терапевтической эффективностью. Тем не менее эти препараты не лишены недостатков, главными из которых являются низкая растворимость и биодоступность. Создание растворимых форм препаратов с повышенной биодоступностью и терапевтической эффективностью является актуальной задачей, решение которой находится в сфере нанотехнологий, которые могут позволить получать инъекционные формы препаратов, содержащие гидрофильный биодеградабельный носитель и гидрофобное действующее вещество.
В исследовании молекулярных механизмов биологической активности флаволигнанов силимарина в последние годы достигнут значительный прорыв, позволяющий с оптимизмом рассматривать новые стратегии борьбы с онкологическими и другими заболеваниями. Изучение путей и возможностей терапии патологий печени и подавления опухолевого процесса с помощью флаволигнанов представляет актуальную научно-практическую задачу, решение которой может внести существенный вклад в современную молекулярную медицину и клиническую онкологию.
Помимо гепатозащитных и противоопухолевых свойств растительных флаволигнанов важной составляющей частью их биологической активности является недавно открытая способность к подавлению ангиогенеза. Высокой антиангиогенной активностью обладают также пептиды ангиостатин и эндостатин, которые, как и флаволигнаны, могут быть использованы для терапии широкого спектра патологий, связанных с нарушениями ангиогенеза. Ангиогенез играет ключевую роль в эмбриогенезе и представляет собой физиологический процесс, заключающийся в образовании кровеносных капилляров из предсуществующих капиллярных отростков и организации капилляров в сосудистую сеть. Во взрослом здоровом организме ангиогенез находится под жестким контролем регуляторных систем организма, обеспечивающих баланс между позитивными и негативными регуляторами ангиогенеза, и, в основном, поддерживается на низком уровне или носит периодический и кратковременный характер. Неадекватная или несбалансированная васкуляризация является причиной многочисленных патологических состояний, приводящих к таким заболеваниям как ишемическая болезнь сердца, ретинопатия, атеросклероз и др. Очевидно, что применение антиангиогенных агентов может стать эффективным инструментом в терапии таких патологий. Особенно важную роль ангиогенез играет в процессе развития злокачественных новообразований, условием прогрессии и метастатической активности которых является привлечение кровеносных капилляров, формирующихся из предсуществующих сосудов. Антиангиогенные агенты, вызывающие деструкцию опухолевой кровеносной сети и лишающие опухоль питания и оксигенации, могут быть использованы для проведения противоопухолевой терапии. Важным инструментом повышения эффективности противоопухолевой терапии является применение антиангиогенных агентов (флаволигнанов силимарина, ангиостатина и эндостатина) в составе липосомных или полимерных наночастиц, полученных с использованием методов современной биохимии и нанобиотехнологии.
В связи с этим разработка и изучение биологической и терапевтической активности напосомных форм антианпюгенных агентов является одной из актуальных задач современной медищшы, имеющих важное теоретическое и прикладное значение. Применение нанопрепаратов нового поколения может позволить разработать новые эффективные терапевтические стратегии и увеличить арсенал средств лечения различных патологий печени, онкологических заболеваний и патологий, связанных с нарушениями ангиогенеза.
Исходя из этого целью данного исследования являлась разработка наносомных препаратов с флаволигнанами силимарина и антиангиогенными белками ангиостатином и эндостатином, а также сравнительное изучение их терапевтической активности и биодоступности с помощью биохимических методов.
В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи: создать липосомную форму флаволигнанов силимарина из расторопши пятнистой, обладающую повышенной биодоступностью;
исследовать накопление и распределение липосомной формы силимарина в органах и тканях-мишенях экспериментальных животных;
изучить антигепатотоксическую активность липосомной формы в сравнен™ со свободным силимарином;
исследовать возможность использования липосомной формы силимарина в клинике при терапии заболеваний печени;
- изучить возможность применения липосомной формы силимарина в качестве кормовой добавки в сельском хозяйстве;
исследовать противоопухолевую и антиангиогенную активность препаратов силимарина на культурах опухолевых и эндотелиальных клеток и в модельных экспериментах ш vivo в схемах как индивидуальной терапии, так и в сочетании с традиционными химиопрепаратами;
изучить возможность использования липосомной формы силимарина в комбинированной терапии химиорезистентных опухолей;
- создать полимерные мицеллы на основе модифицированного поли-N-винилпирролидона, включающие флаволигнаны силимарина и антиангиогенные белки ангиостатин и эндостатин, и исследовать их терапевтическую противоопухолевую активность.
Основные положении, выносимые па защиту.
• Гепатозащитная и противоопухолевая активность флаволигнанов силимарина может быть существенно увеличена за счет использования их в составе липосом и полимерных мицелл.
• Липосомная форма силимарина при инъекционном введении может быть эффективно использована в терапии патологий печени и злокачественных новообразований.
• Применение липосомной формы силимарина в комплексной терапии больных хроническим вирусным гепатитом С с умеренной степенью тяжести приводит к улучшению биохимических показателей крови и нормализации белково-синтетической функции печени.
• Введение липосомной формы силимарина в качестве кормовой добавки в рацион цыплят-бройлеров вызывает положительную динамику изменения основных биохимических, физиологических и зоотехнических показателей птицы.
• Комбинированное применение липосомного силимарина с противоопухолевым антибиотиком доксорубицином для лечения злокачественных новообразований, в том числе и химиорезистентных, позволяет добиться значительно более высокого терапевтического эффекта in vivo, чем при применении индивидуальных препаратов в режиме монотерапии.
• Полимерные мицеллы, созданные на основе модифицированного поли-N-виншширролидона и включающие антиангиогенные белки (ангиостатин, эндостатин) или флаволигнаны силимарина, обладают противоопухолевой активностью, значительно превышающей активность входящих в их состав свободных веществ.
Научная новизна работы.
Разработаны оригинальные методики, позволяющие получать наносомные формы силимарина, обладающие повышенной биодоступностью. Впервые продемонстрирована возможность применения липосомных препаратов флаволигнанов в инъекционной форме при терапии патологий печени и злокачественных новообразований. Продемонстрировано, что введение силимарина в липосомной форме способствует преимущественному накоплению препарата в тканях-мишенях его
антш епатотоксического действия (печеш! и селезенке), а также в опухолевой ткани и органах, пораженных метастазами.
Впервые продемонстрирована возможность применения тшосомной формы сшшмарина для профилактики и лечения острого токсического гепатита, а также снижения токсического влияния алкоголя на печень.
Впервые продемонстрирована противоопухолевая и антиангиогенная активность липосомного сшшмарина в отношении линий опухолевых (LNCaP, MCF-7, НТ1080) и эндотелиальных клеток (HUVEC, АВАЕ, SVEC4-10).
В экспериментах на животных с модельными опухолями меланомы В16 и аденокарциномы молочной железы линии Са755 продемонстрировано значительное увеличение терапевтической противоопухолевой эффективности действия липосомных форм флаволигнанов по сравнению со свободными препаратами. В экспериментах in vivo продемонстрирована высокая противоопухолевая и антиметастатическая активность липосомных форм флаволигнанов по сравнению со свободными препаратами в отношении модели карциномы легкого Льюис (3LL).
В экспериментах in vitro и in vivo продемонстрировано, что комбинированное применение липосомного силимарина с противоопухолевым антибиотиком доксорубицином для лечения злокачественных новообразований позволяет добиться значительно более высокого терапевтического эффекта, чем при применении индивидуальных препаратов в режиме монотерапии. Показана высокая эффективность комбинированной терапии препаратами липосомного силимарина и доксорубицина химиорезистентных опухолей.
Разработаны методы получения полимерных мицелл на основе поли-N-винилпирролидона, включающих антиангиогенные белки (ангиостатин, эндостатин), а также флаволигнаны силимарина и силибинин. В экспериментах in vivo продемонстрировано, что противоопухолевая активность полученных препаратов значительно превышает активность входящих в их состав свободных веществ.
Практическая значимость исследования.
Разработанная липосомная форма силимарина может эффективно применяться в клинике при комплексной терапии больных хроническим вирусным гепатитом С с умеренной степенью тяжести в качестве детоксидирующего, гепатопротекторного средства, улучшающего функциональное состояние печени и способствующего поддержанию ее функций.
Разработанные напосомпыс препараты на основе флаволштшнов силимарина н антиангиотенных белков могут быть использованы для дальнейших исследовашш в области практической онкологии с перспективой перехода в разряд препаратов, проходящих доклинические испытания.
Применение наносомных флаволигнанов и антиангиогенных белков в виде инъекционных форм позволяет использовать их в дозах существенно ниже традиционных, что при повышении эффективности значительно снижает стоимость курса терапии.
Продемонстрированное преимущество комбинированной терапии опухолей с использованием липосомного силимарина и традиционных противоопухолевых антибиотиков представляет большой практический интерес при подборе наиболее эффективных схем противоопухолевой терапии. Применение липосомной формы силимарина в комбинации с доксорубицином может оказаться эффективным средством терапии химиорезистентных опухолей.
Липосомная форма силимарина при ее введении в рацион цыплят-бройлеров оказывает положительное влияние на основные биохимические, физиологические и зоотехнические показатели, что свидетельствует о перспективности ее практического применения в сельском хозяйстве в качестве кормовой добавки.
Практическая значимость работы подтверждается тем, что по ее результатам получено 14 патентов РФ на изобретение.
Апробация диссертационной работы. Результаты исследований доложены на конференциях: II Международной конференции «Молекулярная Медицина и Биобезопасность», Москва, 2005; XIII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», Москва, 2006; 19th Meeting of the European Association for Cancer Research, Budapest, Hungary, 2006; XVI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», Москва, 2009; IV Международном Форуме «Интегративная медицина», Москва, 2009; XVII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», Москва, 2009.
Публикации: основные материалы работы изложены в 13 статьях, материалах 8 конференций, 14 патентах РФ на изобретение, 4 монографиях.
Сщуктура II объем диссертации. Диссертация изложена па 210 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, результаты и их обсуждение, общие выводы и указатель цитируемой литературы (305 источников). Работа иллюстрирована 38 рисунками и 23 таблицами.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
ОБЪЕКТЫ II МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Для реализации поставленных задач были использованы следующие методы исследования:
• физико-химические (методы ультразвуковой обработки и экструзии, электронная и световая микроскопия, лазерная корреляционная спектроскопия, спектрофотометрия, центрифугирование, электрофорез, хроматография);
• биологические (исследование биологической активности препаратов на культурах клеток, исследование антигепатотоксической активности на моделях острого токсического гепатита и алкогольной интоксикации, исследование противоопухолевой и антиметастатической активности на моделях экспериментальных опухолей у животных).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ II ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Получение липосомной формы силимарнна
Для получения липосомной формы сшшмарина применяли метод экструзии (выдавливания вещества дисперсной фазы через тонкие отверстия в дисперсионную среду под высоким давлением). Липосомы получали ультразвуковой обработкой дисперсии оволещгтин-холестерин-силимарин с последующим многократным продавливанием через ядерный поликарбонатный фильтр. Размеры липосомных частиц, определенные с помощью метода электронной микроскопии, находились в диапазоне от 182 до 201 нм (рис. 1). Средний размер полученных липосомных частиц, определенный с помощью метода лазерной корреляционной спектроскопии, составлял 192±69 нм (рис. 2). Такой размер позволяет липосомным микровезикулам относительно свободно проходить через стенки кровеносных капилляров и накапливаться в тканях,
500 нм
40. 3530-
S 25' p
S 20
У
g 1510
5 0
Рис. 1. Электронная микрофотографии липосомных частиц с силимарином, полученная с помощью сканирующего электронного микроскопа PHILIPS SEM 515.
Размер частиц, нм
Рис. 2. Диаграмма распределения липосомных частиц по размерам, полученная методом лазерной
корреляционной спектроскопии.
где инкапсулированный терапевтический агент высвобождается. Концентрации липидов и силимарина в полученной дисперсии составляли 25 мг/мл и 6 мг/мл соответственно.
Накопление и распределение свободного силимарина и его липосомной формы в органах экспериментальных животных
Накопление и распределение препаратов силимарина исследовали как на здоровых интактных мышах, так и на животных с привитыми опухолями легочной карциномы Льюис (ЗЬЬ). При этом препарат свободного силимарина вводили внутрижелудочно через зонд, а яипосомную форму - внутривенно. Поскольку основным действующим компонентом силимарина является силибинин, содержание которого в препарате составляет около 90%, распределение силимарина в органах экспериментальных животных оценивали по распределению данного компонента, используя в качестве контроля стандартный препарат очищенного силибинина.
Результаты исследования приведены в табл. 1 и 2. Как видно из табл. 1, в отличие от вводимого перорально свободного препарата силимарина, лишь незначительное количество которого попадает из желудка в остальные органы, внутривенное введение силимарина в липосомной форме способствует его преимущественному накоплению в тканях печени и селезенки, являющихся основными мишенями его антигепатотоксического действия. Эти результаты коррелируют с литературными данными о том, что липосомы при попадании в организм
аккумулируются в основном в органах, содержащих макрофаги рстикуло-эндотслиальной системы, таких как печень и селезенка [Ошштопс! 1999]. Известно также, что лшюсомные препараты способны накапливаться также в областях, характеризующихся изолированной васкулатурой, таких как опухоли [Ошттопс1 1999]. В связи с этим представляло интерес сравнительное исследование распределения препаратов силимарина в организме животных с модельными солидными опухолями. Эксперимент проводили на модели мышиной карциномы Льюис (31Х), характеризующейся высокой степенью метастазирования в легочную ткань. Как видно из табл. 2, в отличие от свободного силимарина его липосомная форма попадает преимущественно в опухолевую ткань. Кроме того, почти вдвое увеличивается содержание препарата при его введении в составе липосом в пораженных метастазами легких экспериментальных животных. При этом, хотя уровень силимарина, попавшего в печень, значительно снижается, концентрация его достаточна для поддержания функций данного органа в условиях пораженного организма.
Таблица 1. Накопление и распределение препаратов силимарина в органах интактмых здоровых мышей линии С57В1/6 после 10-кратного введения в дозе 20 мг/кг веса.
Орган Концентрация силибинина, мкг/г
Силимарии Липосомная форма силимарина
Печень 5,3±0,7 48,4±9,1**
Легкие 2,6±0,3 3,7±0,8
Желудок 76,1±10,2 6,4±1,2**
Кожа 0,8±0,2 1,3±0,4
Селезенка 3,9±0,7 10,2±0,9*
Почки 1,9±0,4 2,3±0,6
*р<0,05; **р<0,01
Таблица 2. Накопление и распределение препаратов силимарина в органах и опухолевой ткани мышей линии С57В1/6 с привитыми солидными опухолями мегастазирующей легочной карциномы Льюис (ЗЬЬ) после 10-кратного введения в дозе 20 мг/кг веса.
Орган/ткань Концентрация силибинина, мкг/г
Силимарии Липосомная форма силимарина
Печень 4,2±0,7 32,1±7,4**
Легкие 3,9±0,3 6,2±1,1**
Желудок 64,0±10,2 3,1 ±0,6*
Кожа 0,7±0,2 0,9±0,2
Селезенка 3,1±0,7 11,3±0,9**
Почки 1,5±0,3 1,9±0,5
Опухоль 5,2±0,7 58,6±11,3**
*р<0,05; **р<0,01
Исследование антитоксической активности лнносо.чной формы сили.марина
Исследование антитоксической активности липосомной формы силнмарина проводили на стандартной модели острого токсического гепатита у мышей. В опытах были использованы белые беспородные мыши в половозрелом возрасте.
Липосомный сшшмарин вводили внутривенно в дозе 100 мг/кг веса животного. В качестве токсического средства использовали раствор четыреххлористого углерода или парацетамол (модель лекарственного гепатита). Одной группе животных препарат вводили ежедневно в течение 6 суток до введения токсина (схема профилактики); другой экспериментальной группе липосомный сшшмарин вначале вводили за 1 ч до введения токсина, а затем еще трижды с интервалом в 2 дня (схема лечения). В качестве препарата сравнения использовали нелипосомный силимарин, который вводили внутрижелудочно по аналогичным схемам в соответствующих дозах. Контрольным животным вводили только токсин (четыреххлористый углерод или парацетамол) и растворитель в эквиобъемных дозах. Через сутки после последнего введения препаратов животных декапитировали и проводили вскрытие и изучение биохимических показателей крови. Результаты исследований приведены в табл. 3, 4.
Таблица 3. Антитоксическая активность липосомной формы силнмарина.
Токсин Схема применения препарата Относительная масса печени* Активность АЛАТ** Активность АСАТ** Общий белок**
СС14 Не вводился (контроль) 136,7±2,6 451,6±10,8 203,2±8,8 64,0±5,0
Профилактика 126,4±3,1" 246,3±9,6* 124,1±2,9" 84,2±6,3"
Лечение 127,1±2,4* 263,1±10,4* 144,8±6,3* 81,4±6,8*
Парацетамол Не вводился(контроль) 148,1±2,6 412,8±12,0 218,2±9,7 59,8±4,7
Профилактика 125,2±1,9" 229,0±8,7" 138,7±4,9" 80,9±6,0"
Лечение 124,6±1,7" 267,8±6,9" 142,0±8,б" 86,6±5,9"
* - % от массы печени здоровых интактных животных ** - % от показателей у здоровых интактных животных
* р<0,05
Как видно из табл. 3,4, у животных, не подвергавшихся лечению, после введения токсиканта наблюдались все признаки острого гепатита: по сравнению со здоровым контролем в группе животных, получавших в качестве токсиканта ССЦ, относительная масса печени была увеличена на 36,7%, уровни АЛАТ и АСАТ повышены на 351,6% и 103,2% соответственно, уровень общего белка был понижен на 36%; применение в качестве токсиканта парацетамола приводило к увеличению массы печени на 48,1%, повышению уровней АЛАТ и АСАТ на 312,8% и 118,2%, понижению уровня общего белка на 40,2%.
Таблица 4. Антнюкспчсская акгивность свободною сплнмарнпа.
Токсин Схема применения препарата Относительная масса печени* Активность АЛАТ" Активность АСАТ** Обшнн белок**
ССЦ Не вводился(контроль) 136,7±2,6 451,6±10,8 203,2±8,8 64,0±5,0
Профилактика 131,1 ±3,5 387,8±8,9" 177,3±5,4" 71,8±4,8
Лечение 130,2±2,1 376,1±9,8" 186,9±7,0" 69,3±6,9
Парацетамол Не вводился(контроль) 148,1±2,6 412,8±12,0 218,2±9,7 59,8±4,7
Профилактика 137,3±2,1 351,6±9,7" 167,4±6,1" 72,1±5,6
Лечение 136,7±2,0 364,3± 11,3" 174,0±7,9" 75,9±6,3
* - % от массы печени здоровых интактных животных ** - % от показателей у здоровых интактных животных
* р<0,05
Схемы как профилактики, так и лечения препаратами силимарина острого токсического гепатита, вызванного введением ССЦ, приводили к нормализации всех исследуемых показателей, при этом эффект от применения липосомной формы был существенно выше, чем от применения свободного силимарина. Относительная масса печени снижалась как в случае профилактики, так и лечения гепатита препаратом липосомного силимарина, приближаясь к массе печени здоровых интактных животных (табл. 3). Влияние свободного силимарина на этот показатель в обоих случаях было менее выраженным (табл. 4). Активность трансаминаз АЛАТ и АСАТ в сыворотке крови снижалась при применении липосомного силимарина в схеме профилактики в 1,8 и 1,6 раза соответствешю (в 1,2 и 1,2 раза при применении свободного силимарина); в схеме лечения эти показатели снижались в 1,7 и 1,4 раза соответственно после введения липосомного препарата (в 1,2 и 1,1 раза после введения нелипосомного); уровень общего белка повышался в среднем в 1,3 раза при введении липосомного препарата и в 1,1 раза - свободного силимарина (табл. 3, 4).
Аналогичная тенденция наблюдалась при изучении эффективности применения препаратов силимарина в схемах профилактики и лечения лекарственного гепатита, вызванного введением парацетамола. Активность АЛАТ и АСАТ снижалась в схеме профилактики в 1,8 и 1,6 раза при применении липосомного препарата ив 1,2 и 1,3 раза при применешш нелипосомного. Лечение липосомным препаратом приводило к снижению активности АЛАТ и АСАТ в 1,6 и 1,5 раза соответственно; препарат свободного силимарина снижал эти показатели в 1,1 и 1,2 раза. Применение препаратов также приводило к повышению уровня общего белка как в схеме профилактики (в 1,4 раза в случае липосомного силимарина и в 1,2 раза в случае нелипосомного), так и лечения лекарственного гепатита (в 1,5 и в 1,3 раза соответствешю).
Изучение морфологии печени подтвердило развитие гепатита во всех группах животных, получавших ССЦ. В группе нелеченого контроля печень макроскопически имела зернистую поверхность, неравномерный красновато-коричневый тон с легкой желтушностью, была упругой на разрыв, что свидетельствовало о наличии воспалительного процесса и дистрофических изменений в печени. При гистологическом исследовании препаратов печени, окрашенных гематоксилин-эозином, также отмечались признаки острого гепатита: нарушение дольчатой структуры органа и наличие вновь образовавшихся неправильных долек, очаги некроза и развитие на их месте грануляционной ткани, лимфоидно-лейкоцитарная инфильтрация долек. Вены были патологически расширены, переполнены кровью, гепатоциты дистрофичны (рис. 3, Б). При окраске на липиды наблюдались крупные, часто сливающиеся капли жира.
Рис. 3. Микрофотографии парафиновых срезов печена животных в схеме лечения острого токсического гепатита, вызванного введением СО4. Окраска — гематоксилин-эозин. Ув. х400; А — интактный контроль, Б - гепатит; В - силимарин; Г - липосомная форма силимарина.
В группе животных, получавших препарат свободного силимарпна по схеме лечения, признаки острого токсического гепатита были менее выражены, чем в контроле: печень имела более равномерный тон, зернистость практически отсутствовала, консистенция была менее упругой. При гистологическом исследовании наблюдалось практически полное отсутствие некроза, существенное ослабление дистрофических изменений, развития ложных долек, воспалительной реакции (рис. 3, В); капли жира были мельче, отсутствовало диффузное поражение всех гепатошгтов. На срезах печени животных, получавших липосомную форму силимарпна, признаки гепатита практически отсутствовали - инфильтрация долек была слабо выражена, зоны некроза отсутствовали (рис. 3, Г).
Таким образом, применение липосомной формы силимарина положительно влияет на обменные, метаболические, холеретические и дезинтоксикационные функции печени как при профилактике, так и при лечении острого токсического гепатита. Эффект от липосомной формы силимарина как в случае токсического (вызванного применением ССЬ), так и лекарственного (от введения парацетамола) острого гепатита превышал эффект от нелипосомного препарата.
Действие липосомной формы силимарина исследовали также на мышах, подвергшихся форсированной алкогольной интоксикации. Этанол давали экспериментальным животным в течение шести суток, после чего в течение 3 дней вводили внутрижелудочно исследуемый препарат. Состояние интоксикации печени алкоголем характеризовали содержанием малонового диальдегида. Малоновый диальдегид определяли в гомогенатах печени спектрофотометрическим методом. Уровень малонового диальдегида у животных, получавших только этанол, увеличивался в 3,6 раза по сравнению со здоровыми интактными мышами; применение липосомной формы силимарина значительно снижало этот показатель, что наглядно показано в табл. 5. Проведенные исследования двигательной активности показали, что препарат нормализует поведенческие реакции в постинтоксикационный период.
Таблица 5. Влияние липосомной формы силимарина на уровень малонового диальдегида у мышей, подвергшихся форсированной алкогольной интоксикации.
Схема применения препарата Уровень малонового диальдегида*
Не применялась 360,4±28,7
Ежедневно в течение 3 дней 224,9±19,4**
* - % от уровня малонового диальдегида у интактных животных
** - р<0,05
Таким образом, применение липосомпой формы силимарииа улучшает метаболические процессы в организме и способствует уменьшению токсического влияния алкоголя и предупреждению развития соматических заболевашш, обусловленных алкогольной интоксикацией.
Оценка клинической эффективности липосомной формы силимарииа (БАД «Липосил») при терапии хронического вирусного гепатита С
На сегодняшний дети, в России отмечается устойчивая тенденция к росту числа заболеваний печени. Такая ситуация связана с резко ухудшившейся в последнее время экологической обстановкой, снижением качества потребляемых населением продуктов питания, приемом большого количества медикаментов, а также с общим ослаблением иммунитета населения. В связи с широким распространением вирусных гепатитов и паразитарных заболеваний в статистике патологий печени одно из первых мест занимают заболевания инфекционного характера [Оншценко 2002]. Наиболее распространенной и трудно поддающейся лечению патологией печени инфекционного генеза является хронический вирусный гепатит С. Традиционные схемы фармакотерапии гепатита С включают в себя различные группы лекарственных препаратов: дезинтоксикационные, противовоспалительные, желчегонные, индукторы ферментных систем, витамины и другие средства, улучшающие обмен веществ. Однако все чаще в последнее время для лечения этой патологии печени применяются растительные средства. Терапевтический эффект растительных лекарственных средств достигается сочетанием желчегонного, противовоспалительного, спазмолитического, капилляроукрепляющего, иммуностимулирующего и антиоксидантного действия [Айсхата и др. 2003]. Наиболее перспективным растительным средством для применения в гепатологии является силимарин. Однако монопрепараты силимарииа, как правило, не обладают высокой эффективностью, что обусловлено физико-химическими свойствами действующего вещества: силимарин, обладая низкой растворимостью, имеет очень низкую биодоступность [Franschini 2002]. Как показали предыдущие исследования, применение силимарииа в липосомной форме позволяет существенно повысить эффективность его антигепатотоксического и гепатопротекторного действия как за счет повышения биодоступности, так и вследствие изменения органного распределения.
Разработанная липосомная форма силимарииа была зарегистрирована и разрешена к применению в качестве биологически активной добавки (торговое
название «Липосил», Свидетельство о гос\'дарственной регистрации №77.99.23.3.У.7785.8.09 от 19.08.2009 г., ТУ 9364-001-11249814-09).
Клинические исследования БАД «Липосил» проводились на базе ГУЗ «Областная клиническая инфекционная болышца» г. Воронежа под руководством гл.врача инфекциониста вышей категоршг A.A. Монастырского (протокол исследований №1 от 27.11.2009 г.). Целью исследований являлось изучение безопасности и эффективности БАД «Липосил» и обоснование его применения как дополнительного средства в комплексе стандартных лечебных мероприятий у больных с хроническим вирусным гепатитом С.
В исследовании участвовал 31 больной с хроническим вирусным гепатитом С (диагноз подтвержден методами ИФА и ПЦР). Эффективность действия БАД «Липосил» оценивалась в сравнении с традиционно используемым в комплексной терапии гепатита С гепатопротекгорным препаратом «Карсил», содержащим в качестве активного вещества сухой экстракт расторопши пятнистой плодов (силимарин). Для этого из общего числа участников эксперимента было выделено 2 группы больных. В группе №1 на фоне традиционной терапии (диета, витаминотерапия, ферментные препараты) проводили лечение «Липосилом», в группе №2 применялось сочетание традиционной терапии с «Карсилом». Суточные дозы препаратов в пересчете на силибинин (основной компонент силимарина) составляли: для «Карсила» - 210 мг, для «Липосила» - 60 мг.
В начале и по завершении терапии оценивали общую клиническую картину заболевания, проводили общий анализ крови и анализ биохимических показателей крови (тимоловая проба, протромбиновый индекс, глюкоза, амилаза, АЛАТ, общий белок).
Все больные при поступлении предъявляли жалобы на общую слабость, утомляемость, снижение работоспособности. У многих обследованных больных были жалобы на нарушение аппетита, боли в правом боку, горечь во рту и чувство дискомфорта в эпигастрии.
Все больные хорошо переносили «Липосил». Побочных эффектов, доступных обнаружению современными методами исследования, выявлено не было.
После проведения лечения у всех больных отмечалась положительная динамика клинической картины заболевания. После окончания курса лечения «Липосилом» слабость отмечалась лишь в 41,2% случаев (по сравнению с 71,4% при терапии с включением «Карсила»), У пациентов, принимавших «Липосил», отмечалось 100%-ное
восстановление аппетита, в отличие от группы сравнения, в которой которых аппетит восстановился не у всех больных. Болезненность при пальпации в правом боку после окончания терапии отмечалась только в группе наблюдешь при лечении с «Карснлом» (17,6%). Также после завершения терапии «Липосилом» у 30,8% больных наблюдалось исчезновение чувства дискомфорта в эпигастрии, в то время как при применении «Карсила» у 7% больных чувство дискомфорта возникло вновь. По другим показателям разницы в группах не отмечалось.
Полученные результаты позволяют сделать вывод, что «Липосил» оказывает более выраженное по сравнению с препаратом «Карсил» положительное влияние на самочувствие больных хроническим гепатитом и приводит в большинстве случаев к устранению жалоб, характерных для этих больных.
Включение в терапию «Липосила» или «Карсила» не оказывало существенного влияния на показатели общего анализа крови пациентов (табл. 6).
Таблица 6. Показатели общего анализа крови в динамике у пациентов, получавших «Липосил» и «Карсил».
Показатели Исследуемая группа («Липосил») N=17 Группа сравнения («Карсил») N=14
До лечения После лечения До лечения После лечения
Гемоглобин 137,76± 11,20 126,41±31,20 133,60±11,60 134,70±7,24
Эритроциты 4,23±0,30 4,43±0,10 4,15±0,32 4,26±0,18
Цветной показатель 0,95±0,01 0,98±0,01 0,95±0,02 0,94±0,04
Тромбоциты 237,38+30,00 4,99±1,60 4,93±0,90 5,16+1,30
Палочкоядерные, % 3,71±2,20 3,47+1,60 3,50+1,30 3,10+1,52
Сегментоядерные, % 50,71+8,90 51,18±12,80 50,80±5,40 54,3±4,90
Лимфоциты, % 38,59±7,30 34,18±11,10 38,90+4,68 34,70±5,3
Эозинофилы, % 2,08+0,90 1,65±1,10 1,90±1,30 2,10+1,70
Моноциты, % 5,35±2,80 5,65+2,20 5,10±2,52 5,70+2,02
СОЭ 5,65+3,40 5,41±3,20 6,40±4,56 5,70±2,44
Данные биохимического исследования крови пациентов, участвовавших в эксперименте (табл. 7), свидетельствуют о том, что «Липосил» повышает уровень амилазы и значительно снижает уровень АЛАТ, что свидетельствует о его гепатозащптном действии. «Липосил» также снижал показатель тимоловой пробы практически до нормы, что свидетельствует о нормализации белково-синтетической функции печени. Уровни общего белка, глюкозы, протромбиновый индекс у пациентов обеих групп были в нормальных пределах как до, так и после лечения.
Таблица 7. Сравнительная оценка биохимических показателей крови в динамике у больных в группах, получавших «Липосил» и «Карсил».
Показатели Исследуемая группа («Липосил») N=17 Группа сравнения («Карсил») N=14
До лечения После лечения До лечения После лечения
Тимоловая проба, ед. 4,65±1,50 4,01 ±2,00 5,55±2,65 4,85±1,78
Протромбиновый индекс, % 90,24+11,00 84,75± 13,60 91,90±5,30 85,40±17,80
Глюкоза, моль/л 4,54±0,30 3,77±1,40 4,46±0,38 3,93±0,79
Амилаза, ед. 3,80±0,8 4,80+0,70 4,14±0,90 3,95+1,37
АЛАТ, моль/л 755,88+208,90 641,29±380,30 793,10±286,92 541,40±244,88
Общий белок, г/л 71,5±3,5 68,1 ±2,4 77,2±3,6 72,3±2,4
Сравнение биохимических показателей у больных исследуемой группы («Липосил») и группы сравнения («Карсил») выявило аналогичную направленность результатов к концу курса лечения. Хотя достоверных различий в изменении биохимических показателей выявлено не было, положительная динамика изменения в группе, получавшей «Липосил», была более выраженной (табл. 7). Однако следует отметить, что применяемая в соответствиями с инструкцией к БАД «Липосил» доза силимарина в липосомной форме в данном исследовании была в 3,5 раза меньшей, чем доза свободного силимарина («Карсил»), Следует ожидать, что при переводе «Липосила» в категорию лекарственных средств с увеличением разрешенной терапевтической дозы эффект от его клинического применения будет существенно более выраженным.
Таким образом, полученные результаты исследования свидетельствуют об эффективности и безопасности применения липосомной формы силимарина в форме БАД «Липосил». Применение «Липосила» оказывает выраженное положительное влияние на самочувствие больных хроническим гепатитом С, хорошо переносится больными и не вызывает побочных эффектов, а также приводит к улучшению биохимических показателей крови и нормализации белково-синтетической функции печени. «Липосил» может применяться в комплексной терапии больных хроническим вирусным гепатитом С с умеренной степенью тяжести в качестве детоксицирующего, гепатопротекторного средства, улучшающего функциональное состояние печени и способствующего поддержанию ее функций.
Исследование возможности применении лнпосомнон формы силимарина в сельском хозяйстве в качестве кормовой добавки при выращивании цыплят-бройлсров
В последнее время мировая птицеводческая промышленность уделяет особое внимание качеству, безопасности и экологической чистоте попадающих на стол потребителя продуктов питания. По этой причине в большинстве стран, в частности в странах Европейского союза, уже отказались от использования антибиотиков и стимуляторов роста при выращивании птицы [Фисинин 2003; Егоров 2007]. Однако в отсутствие химиотерапевтических препаратов возрастает угроза развития и последующего распространения у птицы инфекционных заболеваний. Бороться с этой проблемой возможно путем создания кроссов птицы, не восприимчивых или мало восприимчивых к определенным инфекциям, однако такие мероприятия очень растянуты во времени и требуют больших финансовых затрат. Наиболее перспективным подходом к решению проблемы отказа от использующихся в настоящее время препаратов является поиск новых эффективных и безопасных средств, способствующих укреплению собственного иммунитета птицы, положительно влияющих на ее здоровье, зоотехнические и физиологические показатели. Широкий арсенал таких средств можно найти среди природных биологически активных соединений. Природные экстрактивные вещества растительного происхождения оказывают мягкое стимулирующее воздействие на метаболические процессы в организме птицы, что положительно влияет на ее продуктивные показатели, вызывает усиление иммунного ответа, увеличивая тем самым жизнеспособность и сохранность поголовья. К преимуществам применения растительных экстрактивных компонентов следует также отнести их относительно низкую себестоимость. Одним из наиболее перспективных растительных биологически активных веществ является комплекс флаволигнанов расторопши пятнистой - силимарин. Высокая антиоксидантная активность силимарина может способствовать не только защите организма и укреплению здоровья птицы, но также играть важную роль в сохранении качества и обеспечении безопасности кормов, препятствуя их прогорканию и микробной контаминации. Ярко выраженные гепатопротекторные свойства силимарина делают его также перспективным средством при выращивании цыплят-бройлеров и несушек, где вследствие высокого уровня метаболических процессов необходима дополнительная защита печени. Таким образом, силимарин может найти широкое применение в сельском хозяйстве, и, в частности, в птицеводстве. Как показали предыдущие
эксперименты но изучению аптигсиаютоксическои активности различных форм силимарина, существенное повышение его биодоступности и терапевтической эффективности становится возможным путем применения силимарина в липосомной форме. Кроме того, благодаря более выраженной терапевтической активности становится возможным применение силимарина в меньших дозах относительно доз нативного действующего вещества. Кроме этого, эссендиальные фосфолипиды, используемые при создании липосомной формы, могут способствовать увеличению мясной продуктивности и повышению антиоксидантного статуса птицы. Целью данного раздела исследования явилось изучение безопасности липосомной формы силимарина и ее влияния на основные показатели у птицы при прибавлении ее в корма цыплят-бройлеров.
Испытания проводили на цыплятах-бройлерах кросса Cobb-Avian 48 в условиях вивария ГУП «Загорское ЭПХ ВНИТИП-РАСХН», Московская область (к. с.-х. н. E.H. Андрианова, J1.M. Присяжная под руководством д.б.н., акад. РАСХН И.А. Егорова; отчет об испытаниях утвержден директором ВНИТИП РАСХН акад. РАСХН В.И. Фисининым). Для опыта было сформировано 2 группы - контрольная, выращивавшаяся в стандартных условиях, и опытная, дополнительно получавшая с кормом липосомную форму силимарина в дозе 200 г/тонну корма. В результате исследования зоотехнических показателей птицы контрольной и опытной групп было установлено, что падеж в группе, получавшей липосомную форму силимарина, отсутствовал; сохранность поголовья в этой группе превысила сохранность в контрольной группе на 2,86% и составила 100%. Под влиянием липосомной формы силимарина снизились такие показатели, как расход корма, его конверсия, и увеличился среднесуточный прирост живой массы (данные не приведены), что может быть обусловлено более активным метаболизмом питательных веществ в организме птицы под воздействием силимарина.
Показатели общего клинического анализа крови опытной и контрольной экспериментальных групп соответствовали норме (табл. 8). Наиболее заметные различия между в группах были отмечены по показателям, характеризующим объем эритроцитов (объем эритроцитов в опытной группе был более однородным, чем в контроле) и количество лейкоцитов: в крови опытной группы этот показатель был ниже, чем в контроле (табл. 8).
Таблица 8. Результаты общего клинического анализа крови цыплят-бройлеров кросса СоЬЬ-Л\тап 48 опытной (при применении липосомной формы силимарина) и контрольной групп.
Показатель Контроль Опыт
Гемоглобин, г/л 91,2 107,5
Эритроциты, млн/мкл 3,2 3,8
Среднее содержимое гемоглобина в эритроцитах, пг 28,50 28,29
Объем эритроцитов, фл (мкм3) (42,86-130,77) (88,46-113,04)
Гематокрит, % 41 41
Лейкоциты, тыс/мкл 36 27
СОЭ, мм/час 2,0 3,0
Миелоциты, % 0 0
Метамиелоциты, % 0 0
Палочкоядерные, % 0 0
Сегментоядерные, % 0 0
Базофилы, % 4 3
Эозинофилы, % 8 7
Лимфоциты, % 59 55
Моноциты, % 10 9
Псевдоэозинофилы, % 19 26
Биохимическое исследование сыворотки крови (табл. 9) показало, что содержание общего белка в обеих экспериментальных группах находилось в пределах физиологической нормы, однако в группе, получавшей липосомную форму силимарина, значите этого показателя было на 9,4% выше, чем в контроле. Кроме этого, в опытной группе возрос альбумино-гаммаглобулиновый индекс: его расчетное значение составляло 0,99 против 0,88 в контроле (альбумино-глобулиновый индекс в контрольной и опытных группах составлял соответственно 0,49 и 0,53). Изменение этих биохимических показателей может быть обусловлено активацией белково-синтетической функции печени под влиянием силимарина, а также снижением скорости распада альбуминов и превращением их в другие белки, частично в глобулины. Хотя значения показателей содержания холестерина в сыворотке крови обеих экспериментальных групп в целом не отклонялись от нормы, в группе, получавшей липосомную форму силимарина, содержание холестерина оказалось на 23,8% ниже относительно контроля, что может быть связано с проявлением гипохолестеролэмической активности силимарина, способствующей более эффективному метаболизму и распределению жиров в тканях цыплят опытной группы.
Таблица 9. Биохимические показатели крови цыплпт-бройлеров кросса ((||}|>-Л\¡;ш 48 опытной (при применении липосомной формы силимарпна) и контрольной групп.
Показатель Контроль Опыт
Общий белок, г/л 43,6 47,7
Альбумины, % 32,7 34,7
а-глобулины, % 17,3 18,6
р-глобулины, % 12,8 11,6
у-глобулины, % 37,2 35,1
Холестерин, ммоль/л 3,74 2,85
Кальций, ммоль/л 2,94 2,55
Фосфор, ммоль/л 2,18 2,24
АСАТ, ед/л 245,6 204,9
АЛАТ, ед/л 3,3 2,2
Показатели фосфорно-кальциевого обмена (содержание общего кальция и неорганического фосфора в сыворотке крови) в группах также соответствовало физиологической норме, однако следует отметить, что содержание фосфора в сыворотке крови группы, получавшей липосомную форму силимарина, было выше, чем в сыворотке контрольной группы. Как известно, фосфор играет важнейшую роль в метаболических процессах живых организмов, а фосфоршшрование является ключевым механизмом, обеспечивающим регуляцию кишечной абсорбции, гликолиза, окисления углеводов, транспорта липидов, обмена аминокислот и др. Таким образом, повышение уровня фосфора в сыворотке под воздействием липосомной формы силимарина может свидетельствовать о положительном влиянии исследуемой кормовой добавки на состав и качество мяса.
При биохимическом исследовании сыворотки крови было установлено, что добавление в корм липосомной формы силимарина приводит к снижению активности ферментов АЛАТ и АСАТ на 33,3% и 16,6% соответственно (табл. 9), что может быть связано с проявлением гепатопротекторной активности силимарина.
Гистологическое исследование препаратов печени не выявило патологических изменений в структуре печени цыплят-бройлеров контрольной и опытной групп, однако печень цыплят опытной группы была заметно более однородной по структуре и отличалась меньшим количеством видимых лейкоцитов (рис. 4 А, Б). Добавление в корм липосомной формы силимарина также оказало положительное влияние на содержание витаминов в печени. Так, содержание витамина А в печени цыплят опытной группы значительно (на 34,2%) превышало его содержание в контроле (71,0мкг/г против 46,7мкг/г в контроле). По содержанию витаминов Вг иЕ в печени
птицы существенных различий между группами не выявлено, а отклонения не превышают ошибку метода определения (10%).
Рис. 4. Микрофотографии препаратов срезов печени цыплят-бройлеров контрольной группы (А) и группы, получавшей с кормом липосомную форму силимарина (Б). Окрашивание гематоксилином-эозином. Ув. х400.
Таблица 10. Химический состав и содержание аминокислот в гомогенате съедобных частей тушки бройлеров (в пересчете на абсолютно сухое вещество).
Показатель Группа
Контроль Опыт
Вода, % 73,17 72,25
Протеин, % 89,75 84,81
Жир, % 2,21 7,82
Сырая зола, % 4,16 3,84
Общее количесгво аминокислот, % 80,23 72,97
Заменимые аминокислоты, % 49,70 44,68
Незаменимые аминокислоты, %: 30,53 28,29
аланин 4,99 4,57
цистеин 0,90 0,84
гистидин 4,48 4,03
аргинин 4,64 4,53
аспарагиновая кислота 7,48 6,96
тирозин 3,09 2,62
серин 3,41 3,02
глутаминовая кислота 13,47 12,61
пролин 3,92 2,41
глицин 3,32 3,09
лизин 6,98 6,72
валин 3,71 3,45
метионин 2,67 2,50
изолейцин 3,40 3,18
треонин 6,54 5,98
фенилаланин 3,38 2,88
При оценке качества мяса экспериментальных цыплят-бройлеров (табл. 10) было установлено, что мясо цыплят опытной группы содержало на 0,92% меньше влагн по сравнению с контролем. Содержание протеши в мясе цыплят опытной группы было на 7,26% ниже, чем в контроле, что прежде всего связано со снижением содержания заменимых аминокислот. По уровню незаменимых аминокислот значительных различий между опытной и контрольной группами отмечено не было (табл. 10).
Таким образом, введите липосомной формы силимарина в рацион цыплят-бройлеров является безопасным и вызывает положительную динамику изменения основных зоотехнических и физиологических показателей птицы, что свидетельствует о перспективности ее практического применения в сельском хозяйстве в качестве кормовой добавки.
Сравнительное исследование противоопухолевой и антиангиогениой активности различных форм силимарина in vitro
Сравнительное исследование цитотоксической активности силимарина и его липосомной формы проводили на клетках фибросаркомы человека линии НТ1080, карциномы молочной железы человека линии MCF-7 и карциномы простаты линии LNCaP. В качестве дополнительного контроля использовали смесь силимарина с лецитином с концентрациями компонентов, эквимолярными липосомной форме силимарина (в пересчете на силибинин). Было установлено, что ЦТА липосомной формы препарата для исследуемых клеточных линий выше, чем у нелипосомных (рис. 5). В отношении клеток НТ1080 IC50 составила 0,3 мкМ для липосомной формы силимарина и 4,9 мкМ для свободного силимарина (рис. 5, А), в то время как для клеток линии MCF-7 аналогичный показатель составил 0,7 и 22,9 мкМ, соответственно (рис. 5, Б). Для клеток линии LNCaP IC50 составляла для липосомной и нелипосомной форм силимарина 0,3 и 8,6 мкМ, соответственно (рис. 5, В). ЦТА смеси силимарина с лецитином во всех случаях была близка к активности свободного силимарина, лишь ненамного превышая ее.
Данные о влиянии силимарина, его смеси с лецитином и липосомной формы препарата на выживаемость эндотелиальных клеток различных линий представлены в табл.11. Силимарин в различных формах оказывал выраженное дозозависимое ингибирующее действие в отношении пролиферации эндотелиальных клеток пупочной вены зародыша человека (HUVEC) (табл. 11). При этом ЦТА липосомной формы
Концентрация, мкМ
Концентрат!я, мк-М
Концентрация, мкМ
Рис. 5. Влияние различных форм силимарина на выживаемость опухолевых клеток
фибросаркомы человека линии НТ1080 (А), карциномы молочной железы человека линии МСГ-7 (Б) и карциномы простаты линии ЦЧСаР (В).
силимарина (1С50 1.9 мкМ) значительно превышала
активность свободного
препарата (1С50 11,ЗмкМ), так же как и его смеси с лецитином (1С5о 10,1 мкМ).
Аналогичные данные были получены при исследовании нитотоксической активности препаратов
силимарина в отношении других клеточных линий -эндотелиальных клеток аорты быка АВАЕ и эндотелиальных клеток лимфатических сосудов мыши вУЕС4-10 (табл. 11). ЦТА липосомной формы силимарина превышала
активность свободного
препарата в отношении клеток НиУЕС, АВАЕ и 5УЕС4-10 в 5,9, 2,6 и 5,3 раза, соответственно. Таким образом, применение силимарина в составе липосом позволяет значительно повысить его цитотоксическое действие на пролиферирующие эндотелиальные клетки.
Таблица П. Цитотоксическая активность препаратов силимарииа в отношении различных линий пролиферируюших эндотелиальных клеток.
Линия клеток ICsci, мкМ
Силимарин Силимарин + лецитин Линосомная форма силимарина
HUVEC 11,3 10,1 1,9
АВАЕ 7,6 7,7 2,9
SVEC4-10 43,5 28,1 8,2
Для исследования влияния препаратов силимарина на процесс ангиогенеза использовали in vitro анализ развития капилляров в матригеле, имитирующем препарат внеклеточного матрикса. Данный метод достаточно полно отражает процесс неоваскуляризации, происходящий in vivo, и основан на наблюдении и подсчете количества капиллярных трубок, образующихся в матригеле под воздействием исследуемых препаратов.
Рис. 6 иллюстрирует зависимость количества образующихся в матригеле капилляров от действующей концентрации силимарина, применяемого как в обычной, так и в липосомной форме. Как видно из приведенной диаграммы, применение липосомной формы силимарина дозозависимо препятствует образованию капилляроподобных структур из эндотелиальных клеток HUVEC (рис. 6, Б).
Концентрация, мкМ Концентрация, мвИ
Рис. 6. Влияние нелиносомной (А) и липосомной (Б) форм силимарина на образование капилляров из эндотелиальных клеток пупочной вены зародыша человека (Н1 \1( ) в матригеле.
Эффект от применения нелипосомных форм силимарина был также дозозависимым, но менее выраженным, чем в случае липосомной формы (рис. 6, А). В табл. 12 приведены сравнительные данные о влиянии препаратов на процесс образования капиллярных трубок в матригеле при исследуемой дозе 50 мкМ. Как видно
из табл. 12, силимарин, применяемый в липосомной форме, оказывает значительно более выраженное действие на исследуемый процесс, чем его нелипосомные формы.
Таблица 12. Влияние препаратов силимарина в концентрации 50 мкМ на образование капилляров из клеток НСУЕС в матригеле.
Препарат Количество капиллярных трубок
Силимарин 25,2+1,8
Силимарин + лецитин 21,8+1,7
Липосомная форма силимарина 14,0+1,1*
* р<0,05
Исследование противоопухолевой активности препаратов силимарина т \ч\'(>
Противоопухолевую активность препаратов силимарина исследовали на трех линиях модельных опухолей у мышей - меланомы В16, метастазирующей легочной карциномы Льюис 31Х и аденокарциномы молочной железы Са755. Активность липосомной формы силимарина сравнивали с активностью свободного препарата, а также эквимолярной смеси силимарина и лецитина. Поскольку растворимость свободного силимарина в воде крайне низка, его, так же как и смесь силимарина с лецитином, водили животным внутрижелудочно. Терапию начинали через 48 часов после перевивки опухоли; курс терапии составлял 10 ежедневных инъекций исследуемых препаратов. Однократная доза силимарина в пересчете на силибинин
была равна 20 мг/кг веса животного.
На рис. 7 отображена динамика роста привитых солидных опухолей у контрольных и экспериментальных животных. Как видно из представленных данных, эффекты от применения нелипосомного
силимарина и его смеси с лецитином практически не различались и были достаточно слабо выражены. Показатель торможения роста опухолей (ТРО) составлял в этих экспериментальных группах 14,9% и 24,7% соответственно (данные на
—□— Контроль —О— Силимарин —О— Силимарин + лешгшн —Л— Лнносомпая форма си.шмарнна
15 20 25
Дни после прививки опухоли
Рис. 7. Динамика развития опухолей меланомы В16 у мышей С57В1/6 под действием терапии препаратами
силимарина.
момент гибели контрольных животных). В случае применения липосомной формы силимарина наблюдалось значительно более эффективное ингибированне роста опухоли (ТРО 55,9%), приводившее к существенному увеличению СПЖ животных по сравнению как с нелеченым контролем, так и мышами, получавшими нелипосомные формы препарата (табл. 13).
Таблица 13. Влияние препаратов силимарина на рост опухолей и продолжительность жизни мышей с привитыми опухолями меланомы В16.
Группа животных / препарат ОРО*, % СПЖ, дни УСПЖ, %
Контроль 100 29,1 ±2,9 -
Силимарин 85,1 34,7±3,9 19,3
Силимарин + лецитин 75,3 35,9±4,6 23,4
Липосомная форма силимарина 44,1 47,2±3,4" 62,1
* данные на 28 день эксперимента
Результаты исследования противоопухолевой активности препаратов силимарина в отношении лёгочной карциномы Льюис (31Х) приведены на рис. 8 и в табл. 14. Как видно из приведенных данных, эффект от применения липосомной формы силимарина в отношении торможения роста опухолей (ТРО) сохранялся даже через неделю после отмены курса лечения (ТРО 49%), в то время как в других экспериментальных группах животных после прекращения введения препаратов развитие опухолей продолжалось (рис. 8). Так, ТРО у мышей, получавших нелипосомный силимарин, составляло на 20 день эксперимента лишь 12%; у группы
*♦ р<0,05
животных, которым вводили смесь силимарина с лецитином, этот показатель был равен 37%. Эти данные могут свидетельствовать об
увеличении времени циркуляции
липосомного средства в крови и
снижении скорости деградации
Рис. 8. Динамика развития опухолей легочной карциномы Льюис (ЗЬЬ) у мышей С57В1У6 под действием терапии препаратами силимарина.
5 1 0 15 20 25 30 35
Дни после прививки опухали
активного компонента липосом (силимарина). Применение
липосомной формы силимарина приводило также к более выраженному увеличению средней
продолжительности жизни леченых
животных но сравнению со свободным препаратом или его смссыо с лецитином (табл 14).
Таблица 14. Влияние препаратов силнмарина на рост опухолей и продолжительность жизни мышей с привитыми опухолями легочной карциномы Льюис (31Х).
Группа животных / препарат ОРО, % СПЖ, дни УСПЖ, %
12 день 20 день
Контроль 100 100 31,3±2,4 -
Силимарин 77 88 37,2±3,8 18,9
Силимарин + лецитин 62 66 38,6±2,9» 23,4
Липосомная форма силимарина 47 51 45,2±3,1* 44,3
* р<0,05
Данные, полученные в результате исследования терапевтической активности препаратов силимарина на мышах, несущих опухоли Са755, подтверждают отмеченный в предыдущих экспериментах противоопухолевый эффект силимарина и в особенности его липосомной формы (табл. 15). Как видно из таблицы, применение препаратов силимарина приводит к ингибированию роста опухолей у мышей, наибольшему в случае липосомной формы препарата (ТР0 61% на момент отмены курса лечения и 36% на 20 день эксперимента) и существенному увеличению СПЖ леченых животных. Показатели ТРО свободного силимарина и его смеси с лецитином были близки и составляли к моменту отмены курса лечения 32 и 39%, а на 20 день эксперимента 16 и 18%, соответственно. Интерес к проведению эксперимента на модели эстроген-зависимой линии опухолевых клеток аденокарциномы молочной железы Са755 [Со1(1т 1961] был вызван структурным сходством флаволигнанов расторопши с эстрогенами. Поскольку соединения, входящие в состав силимарина, являются структурными аналогами эстрогенов, они, по-видимому, могут конкурировать с последними за связывание с их ядерными рецепторами. Ингибирование рецепторов эстрогенов флаволигнанами подавляет транскрипцию эстроген-зависимых генов, снижая, таким образом, стимулирующее влияние эстрогенов на развитие опухолевых клеток.
Таблица 15. Влияние препаратов силимарина на рост опухолей и продолжительность жизни мышей с привитыми опухолями аденокарциномы молочной железы линии Са755.
Группа животных / препарат ОРО, % СПЖ, дни УСПЖ, %
12 день 20 день
Контроль 100 100 34,6±4,4 0
Силимарин 68 84 39,3±4,6 13,6
Силимарин + лецитин 61 82 40,4±3,3 16,9
Липосомная форма силимарина 39 64 49,4±3,8* 42,9
* р<0,05
Нссле.ншапис антнмсгастатнчсскои активности препаратов силимарина
Для оценки аитпметастатической активности как липосомной, так и нелнпосомной форм силимарина проводили эксперимент па мышах с подкожно привитой опухолью карциномы легкого Льюис (ЗЬЬ) на фоне удаления первичного опухолевого узла. Первичную опухоль удаляли на 8 день после перевивки. Исследуемые препараты начинали вводить на следующие сутки после удаления первичной опухоли. Липосомный силимарин вводили экспериментальным животным внутривенно в течение 10 дней в дозе 20 мг/кг (в пересчете на силибшшн). Нелипосомный препарат вводили мышам по той же схеме перорально.
Антиметастатический эффект оценивали на момент начала гибели контрольных животных. Ингибирование процесса метастазирования препаратами оценивали, сравнивая среднюю массу пораженных метастазами легких контрольной и экспериментальных групп (для этого был введен показатель ТРМ — торможение роста метастазов). Одновременно использовали условные показатели интенсивности метастазирования - количество метастатических узлов в легочной ткани, частоту метастазирования опухоли. Результаты исследования приведены в табл. 16.
Таблица 16. Влияние препаратов силимарина на интенсивность метастазирования подкожно привитой опухоли карциномы легкого Льюпс (31Х) на фоне удаления первичного опухолевого узла (приведены данные на момент гибели животных).
Препарат Рецидив Легкие Частота метастазирования* Интенсивность метастазирования**
Средняя масса, мг ТРМ, %
Контроль - 394,2±27,1 8/8 5,75+2,91
Силимарин - 374,6±69,4 5 8/8 4,89±1,93
Липосомная форма силимарина - 236,5±95,8*** 40 5/8 1,50±1,31***
* В графе «Частота метастазирования» указано количество животных с метастазами / количество животных в группе.
** В графе «Интенсивность метастазирования» указано среднее количество метастатических колоний в легких на животное (учитываются все животные группы, в том числе и с не пораженными метастазами легкими). *** р<0,05
Метастазы в легких были выявлены у 62,5% животных, получавших липосомный силимарин, в то время как у контрольных мышей и мышей, получавших нелипосомную форму силимарина, метастазы наблюдались в 100% случаев. В группе животных, подвергнутых терапии липосомным препаратом, была также снижена интенсивность метастазирования. Величина показателя ТРМ у животных, получавших
липосомныи препарат, была значительно выше, чем у животных, подвергавшихся терапии свободным сшшмарином. Наблюдавшееся незначительное снижение массы легких и количества образовавшихся в них метастатических колоний у мышей, получавших нелипосомный силимарин, по сравнению с нелеченым контролем было статистически недостоверным.
Таким образом, включение силимарина в липосомы приводит к значительному повышению его специфической противоопухолевой и антиангиогенной активности. Подобный эффект обусловлен, с одной стороны, увеличением времени пребывания препарата в крови и его избирательным накоплением в области опухолевых кровеносных сосудов, с другой - более эффективным проникновением силимарина в составе липосом через мембрану внутрь клетки, где он оказывает своё цитотоксическое действие. Включение нерастворимого в обычных условиях в воде силимарина в состав липосом делает возможным применение его в виде инъекционной формы для лечения как заболеваний печени, так и для терапии солидных опухолей различной локализации, а также заболеваний, сопровождающихся повышенной васкулярнзацией.
Исследование возможностей совместного использования силимарина и доксорубинина в комбинированной терапии опухолей
Доксорубицин является одним из химиотерапевтических агентов, проявляющих широкий спектр терапевтической активности против различных типов рака, включая карциномы молочной железы и простаты [Kish 2001, Raghavan 1997, Von Hoff 1979]. Однако эффективность химиотерапии доксорубицином ограничивается невозможностью достижения достаточной концентрации препарата без проявления системной токсичности. Для увеличения терапевтического потенциала химиопрепаратов и снижения системной токсичности в последние годы широко применяются методы комбинированной химиотерапии. Плюрипотентное действие флаволигнанов на опухоли позволяет рассматривать их в качестве перспективных агентов для комбинированного терапевтического применения с другими химиопрепаратами.
Исследование цитотоксической активности индивидуальных доксорубицина и силимарина в липосомной форме проводили на культурах опухолевых клеток карциномы молочной железы человека MCF-7 и мышиного лимфолейкоза Р388, используя как первичные линии клеток, чувствительные к доксорубицину (Wt), так и
культуры с приобретенной резистентностью к этому антибиотику (Ас1гК). Результаты исследования приведены на в табл. 17.
Таблица 17. Цитотоксическая активность препараюв силимарина н доксорубицина в отношении клеточных линий карциномы молочной железы человека М( I'-7 и лнмфолейкоза мыши Р388, чувствительных (Wt) и резистентных (Л<1гК) к доксорубинину.
Препарат Линия клеток 1С50, мкМ
XVI
Доксорубицин МСР-7 0,39 4,23
Р388 0,27 3,45
Липосомная форма силимарина МСР-7 0,78 0,79
Р388 0,50 0,59
Как видно из табл. 17, ЦТА липосомной формы силимарина в отношении обеих линий клеток практически не зависела от их резистентности к доксорубицину. В то же время ЦТА доксорубицина в отношении резистентных клеток МСР-7 и Р388 была ниже его активности в отношении чувствительных штаммов в 10,8 и 12,8 раз, соответственно. При этом клетки линии Р388 оказались более чувствительными к действию обоих препаратов, чем клетки МСР-7.
Для следующего эксперимента добавляли к клеткам смесь препаратов доксорубицина и липосомного силимарина в концентрациях 0,1 мкМ и 0,2 мкМ
Контроль ДР ЛФС ДР + ЛФС Контроль ДР ЛФС ДР+ЛФС
Рис. 9. Влияние на выживаемость клеток доксорубицина (ДР) и липосомной формы силимарина (ЛФС) при их добавлении индивидуально и в виде смеси к клеткам линии М(1-7 чувствительного (Л) и резистентного (Б) тина. Дозы препаратов составляли 0,2 мкМ для ЛФС (в пересчете на силибинин), 0,1 мкМ для ДР в случае клеток МС Т-~ \\ 1 и 1,0 мкМ для клеток МСК-7/А(1гК.
Рис. 10. Влияние на выживаемость клеток доксорубицина (ДР) и липосомной формы силимарина (ЛФС) при их добавлении индивидуально и в виде смеси к клеткам линии Р388 чувствительного (А) и резистентного (Б) типа. Дозы препаратов составляли 0,2 мкМ для ЛФС (в пересчете на снлибинии), 0,1 мкМ для ДР в случае клеток 1'388/\М и 1,0 мкМ для клеток Р388/Ас1гК.
соответственно для чувствительных клеток и 1 мкМ и 0,2 мкМ соответственно для резистентных штаммов. Выбранные концентрации препаратов были близки к 1Сю (концентрациям, вызывающим гибель 10% клеток), рассчитанным по кривым ингибирования роста клеток. Результаты эксперимента приведены на рис. 9 и 10. Как видно из приведенных данных, в отношении как чувствительных, так и резистентных штаммов обеих клеточных линий смесь доксорубицина с липосомным силимарином проявляет ингибируюгций эффект, превышающий эффекты индивидуальных препаратов. При этом в случаях чувствительных клеток линии MCF-7 и обоих типов клеток линии Р388 наблюдается синергизм действия препаратов. Так, степень синергизма составляла 27% для клеток MCF-7/Wt, 61% для клеток P388/Wt и 22% для клеток P388/AdrR. В случае резистентных клеток линии MCF-7 следует говорить о потенцировании действия препаратов.
Исследование противоопухолевого эффекта от применения силимарина как в липосомной, так и нелипосомной форме, и доксорубицина проводили на моделях мышиной меланомы линии В16 (мыши С57В1/6) и перевиваемого мышиного лимфолейкоза линии Р388 (мыши DBA2). Препараты вводили ежедневно в течение 5 дней, начиная лечение через 24 часа после перевивки опухоли. Ежедневная доза препаратов силимарина составляла 20 мг/кг в пересчете на силибинин. Доксорубицин вводили внутривенно в дозе 0,5 мг/кг веса животного. В качестве дополнительного контроля использовали группу животных с опухолями, получавших доксорубицин по той же схеме, но в дозе 5 мг/кг, близкой к терапевтической.
-□-К<>11!|)1>. II.
—V— ДР 0,5 мг/кг —О—ДР 5 ж/кг —О—СМ —ЛФС
—О—СМ + ДР 0,5 мг/кг ЛФС + ДР 0,5 мг/кг
10 15 20 25 ЗП 35
Днн после прививки опухоли
Рис. 11. Влияние препаратов силимарина (СМ) и доксорубицина (ДР), применяемых индивидуально и в схеме сочетанной терапии, на развитие опухолей меланомы В16 у мышей С57В1/6. ЛФС - липосомнаи форма
ги.пимапина.
торможения роста опухолей значительно индивидуальных препаратов.
Рис. 11 иллюстрирует
влияние препаратов силимарина и доксорубицина на рост опухолей меланомы В16 у мышей. Как видно из приведенных данных,
индивидуальное применение
доксорубицина в дозе 0,5 мг/кг оказывало слабо выраженное ингибирующее воздействие на рост опухолей у животных. В то же время терапевтический эффект от комбинированного применения препаратов силимарина и доксорубицина в отношении превышал таковой от применения
Таблица 18. Эффективность индивидуальной и комбинированной терапии мышей линии С57В1/6 с привитыми солидными опухолями меланомы В16 препаратами силимарина и доксорубицином.
Группа животных/препарат ТРО*, % СПЖ, дни УСПЖ, %
Контроль - 29,1±2,8 -
Доксорубицин 0,5 мг/кг 12,2 31,7±3,5 8,9
Доксорубицин 5 мг/кг 90,0 66,2±6,2* 127,6
Силимарин 21,2 36,6±4,0* 25,7
Липосомный силимарин 45,3 44,3±3,9* 52,3
Силимарин Доксорубицин 0,5 мг/кг 49,7 30,7±4,1 59,0**
Липосомный силимарин Доксорубицин 0,5 мг/кг 92,5 67,1±6,3* 130,6***
* данные на 28 день эксперимента ** степень синергизма 41,4%
*** степень синергизма 53,1%
* р<0,05
Как видно из табл. 18, показатель торможения роста опухоли (ТРО) в случае комбинированной терапии доксорубицином и силимарином и в особенности липосомной формой последнего значительно выше, чем сумма аналогичных показателей от действия индивидуальных препаратов, что позволяет говорить о синергизме действия силимарина и доксорубицина. Степень синергизма, рассчитанная
по показателям ТРО, составляла в случае нслипосомноп формы силимарипа и доксорубшшна 32,8% и в случае совместного применения липосомной формы силимарипа и доксорубицина 37,8%. Аналогичный синергетический эффект наблюдался и в отношении влияния исследуемых препаратов на увеличение средней продолжительности жизни животных (табл. 18).
В табл. 19 приведены данные о влиянии как индивидуально, так и совместно применяемых препаратов силимарипа и доксорубшшна на продолжительность жизни мышей DBA2 с привитым внутрибрюшинно лимфолейкозом Р388. Как видно из таблицы, в отличие от индивидуально вводимого доксорубшшна в дозе 0,5 мг/кг, не практически оказывавшего влияния на СПЖ экспериментальных животных, сочетанное применение этого антибиотика с препаратами силимарина позволяет достигнуть увеличения СПЖ, существенно превышающего суммарные эффекты от применения индивидуальных препаратов. Степень синергизма составляла в случае нелипосомной формы силимарина и доксорубицина 19,5%, в случае липосомной формы силимарина и доксорубицина 31,2%.
Таблица 19. Эффективность индивидуальной н комбинированной терапии мышей линии ЭВА2 с привитыми внутрибрюшинно опухолями лимфолейкоза Р388 препаратами силимарина н доксорубицином.
Группа животных/препарат СПЖ, дни УСПЖ, %
Контроль 8,1±0,7 -
Доксорубицин 0,5 мг/кг 8,3±1,3 2,6
Доксорубицин 5 мг/кг 15,4±2,3" 89,6
Силимарин 10,4±2,1 27,9
Липосомный силимарин 11,5±1,7" 42,0
Силимарин Доксорубицин 0,5 мг/кг 11,2±2,0* 37,9**
Липосомный силимарин Доксорубицин 0,5 мг/кг 13,3±1,7* 64,8***
* данные на 28 день эксперимента ** степень синергизма 19,5% *** степень синергизма 31,2% " р<0,05
Следует отметить, что эффекты от сочетанного применения силимарина, применяемого в липосомной форме, и доксорубицина в дозе 0,5 мг/кг как в отношении ингибирования роста опухоли, так и увеличения продолжительности жизни животных приближались к аналогичным эффектам от применения доксорубицина в близкой к терапевтической дозе 5 мг/кг. Основным побочным действием доксорубицина является его высокая кардиотоксичность [Weisburst 1980]. Продемонстрированная настоящим
исследованием возможность значительного снижения терапевтической дозы доксорубицина при его применении в схемах комбшшровашюй терапии с препаратами сшшмарина без ущерба терапевтическому эффекту от суммарного применения этих препаратов открывает перспективу значительного снижения системной токсичности антибиотика.
Исследование in vivo противоопухолевого действия совместно применяемых доксорубицина и силимарина на модели опухоли с приобретенной резистентностью к доксорубицину
Исследование проводили на модели мышиного лимфолейкоза P388/AdrR, резистентного к адриамицину. Штамм лимфолейкоза поддерживался путем внутрибрюшинной перевивки мышам DBA2 при постоянной поддерживающей терапии доксорубицином. Лечение животных начинали через 24 часа после перевивки опухолевых клеток. Препараты вводили ежедневно в течение 5 дней. Ежедневная доза препаратов силимарина составляла 20 мг/кг в пересчете на силибинин. Доксорубицин вводили внутривенно в дозе 5 мг/кг веса животного. Параллельно проводили аналогичный эксперимент на животных с привитыми опухолями не резистентной к данному препарату линии лимфолейкоза P388/Wt.
Данные о влиянии исследуемых препаратов на продолжительность жизни экспериментальных животных с лимфолейкозами линий P388/Wt и P388/AdrR приведены в табл. 20 и 21, соответственно.
Таблица 20. Эффективность индивидуальной и комбинированной терапии мышей линии DBA2 с привитыми внутрибрюшинно опухолями лимфолейкоза P388/Wt препаратами силимарина и доксорубицином в дозе 5 мг/кг.
Группа животных/препарат СПЖ, дни УСПЖ, %
Контроль 8,1 ±0,7 -
Доксорубицин 5 мг/кг 15,4±2,3* 89,6
Силимарин 10,4±2,1 27,9
Липосомный силимарин 11,5±1,7* 42,0
Силимарин Доксорубицин 5 мг/кг 18,5±2,7* 128,4**
Липосомный силимарин Доксорубицин 5 мг/кг 19,9±3,2* 145,3***
* р<0,05
** степень синергизма 8,5% *** степень синергизма 9,4%
Как видно из приведенных данных, эффект от индивидуальной терапии докеорубицшюм мышей с резистентными к этому антибиотику опухолями был существенно шше, чем в случае аналогичной терашш опухолей чувствительного штамма. Однако в случае дополнительного введения в схему терашш препаратов сшшмарина чувствительность резистентных опухолей Р388/Д(1гЯ значительно повышалась, хотя полного обращения резистентности не наблюдалось (табл. 21).
Таблица 21. Эффективность индивидуальной и комбинированной терапии мышей линии DBA2 с привитыми внутрибрюшинно опухолями лимфолейкоза P388/AdrR препаратами силимарипа и докеорубицшюм в дозе 5 мг/кг.
Группа животных/препарат СПЖ, дни УСПЖ, %
Контроль 8,3±0,8 -
Доксорубицин 5 мг/кг 10,2±0,9* 23,4
Силимарин 10,5±1,1* 26,7
Липосомный силимарин 11,6±1,0* 39,5
Силимарин Доксорубицин 5 мг/кг 11,7±1,2* 41,2
Липосомный силимарин Доксорубицин 5 мг/кг 12,5±0,9* 50,9
* р<0,05
Поскольку эффект от сочетанного применения препаратов силимарина и доксорубицина не превышал сумму эффектов индивидуально вводимых препаратов, но был тем не менее выше, чем эти индивидуальные эффекты, следует говорить о потенцировании противоопухолевого действия доксорубицина препаратами силимарина в случае резистентных опухолей. При этом наиболее эффективной оказалась схема комбинированной терашш, включавшая доксорубицин и липосомную форму силимарина.
Известно, что при химиотерапии больных со злокачественными новообразованиями докеорубицшюм наблюдается врожденная или достаточно быстро развивается приобретенная резистентность опухоли к этому антибиотику. Полученные в настоящей работе результаты свидетельствуют о том, что комбинированная терапия препаратами силимарина и доксорубицина может применяться с высокой эффективностью для лечения пациентов с приобретенной и врожденной резистентностью к доксорубицину.
Получение и сравнительное исследование противоопухолевой активности ш vivo полимерных мицелл на основе поли-1Ч-винилпирролидона, включающих флаволш наны силимарина и аншаш иогенные препараты
Для получения мицелл использовали сополимер поли-Ы-винилпирролидона со стеариновой кислотой с мол. массой 4000 Да. В результате работы были получены полимерные мицеллы со следующими соотношениями [активное вещество/полимер]: 1:1 для силибинина (основного компонента силимарина), 1:2 для силимарина и эндостатина и 1:3 для ангиостатина (полимерные мицеллы с эндостатином были получены и исследованы в Московском НИИ медицинской экологии совместно с Поздняковой Н.В.). При данных соотношениях веществ степень включения в мицеллы составляла в случае ангиостатина 78%, эндостатина - 84%, силимарина - 95%, силибинина — 98%.
„nlllllllllll
Размер частиц, нм
Размер частиц, нм
В
10
Размер час
IOO
иц, нм
100 1000 Размер частиц, нм
Рис. 12. Распределение размеров мицелл на основе поли-1\-винилпирролидона, включающих ангиостатин (А), эндостатин (Б), силимарин (В) и силибинин (Г).
Данные о распределении размеров полимерных мицелл, полученные методом динамического светорассеяния, представлены на рис. 12. Диапазон размеров частиц составлял для препарата, содержащего ангиостатин - от 10 до 400 нм, эндостатин - от 17 до 100 нм; размеры частиц с силимарином и силибинином были несколько больше и составляли от 80 до 230 нм и от 70 до 200 нм соответственно. Усредненный диаметр мицелл составлял: для ангиостатина - 110нм, эндостатина - 55,8 нм, силимарина -110 нм, силибинина - 120 нм.
Поскольку свободные пептидные формы ангиостатина и эндостатина быстро выводятся из организма через почки [8сарраЬсс1 2002], актуальной задачей является исследование противоопухолевой активности антиангиогенных белков, включенных в состав полимерных мицелл. Создание мицеллярных форм этих белков позволило бы значительно увеличить эффективность их действия. Исследования противоопухолевой активности ангиостатина и эндостатина, включенных в состав полимерных мицелл на основе поли-Ы-винилпирролидона, показали, что при внутривенном введении препаратов животным в дозах 100 мг/кг веса в течение 20 дней приводит к значительному снижению интенсивности опухолевого роста как по сравнению с контролем (животные, не получавшие препаратов), так и с животными, которым вводили препараты свободных белков (рис. 13, А, Б). Показатели ТРО на день отмены курса терапии полимерными мицеллами, включающими ангиостатин и эндостатин, составляли 78,9% и 66,3% соответственно. Показатели ТРО для свободных препаратов ангиостатина и эндостатина составляли 67,1% и 41,2% соответственно. Наряду с
Дни после прививки опухоли Дни после прививки опухоли
Рис. 13. Влияние свободных и включенных в полимерные мицеллы ангиостатина (А) и эндостатина (Б) на рост опухолей меланомы В16 у мышей линии С57В1/6. Препараты вводили внутривенно в течение 20 дней в дозах 100 мг/кг.
торможением рос1а опухолей при применении полимерных мицелл, включающих ангиостатин или эндостатин, наблюдалось также значительное УСПЖ животных как по сравнению с контролем, так и с группой животных, получавших свободные антиангиогенные белки (табл. 22).
Таблица 22. Влияние свободных антиаш иогенных препаратов и включающих их полимерных мицелл на увеличение продолжительности жизни мышей линии С57В1/6 с привитыми опухолями меланомы В16 по сравнению с нелеченым контролем.
Группа животных СПЖ, дни УСПЖ, % СПЖ, дни УСПЖ, %
Контроль 33,2±3,6 - 33,2±3,6 -
Свободный препарат Мицеллы
Ангиостатин 42,6±3,3* 28,3 46,3±3,1* 39,5
Эндостатин 41,4±3,1* 24,7 45,8±3,2* 37,9
Силимарин 39,2±2,9* 18,2 47,2±3,4*'* 42,1
Силибинин 41,4±3,3* 24,6 49,2±3,7*'* 48,2
* р<0,05 по отношению к контролю
* р<0,05 по отношению к аналогичному свободному препарату
Поскольку как силимарин, так и силибинин обладают крайне низкой растворимостью в воде, их как препараты сравнения вводили экспериментальным животным внутрижелудочно через зонд в виде суспензии в крахмальном клейстере. Препараты полимерных мицелл с данными веществами, обладающие достаточной гидрофильностью, вводили внутривенно. Как видно из рис. 14, А, Б, пероральное введение как силимарина, так и силибинина приводило к незначительному
А
-Контроль -Сшшмарнн
- Наночастины с силимарнном
Б '
Дни после прививки опухоли
- Контроль
- Сплнбнннн Наночастикы с енлнбшннюм
Дни после прививки опухоли
Рис. 14. Влияние свободных и включенных в полимерные мицеллы силимарина (А) и силибинина (Б) на рост опухолей меланомы В16 у мышей линии С57В1/6. Препараты вводили в течение 5 дней в дозах 100 мг/кг, свободные силимарин и силибинин -перорально, полимерные мицеллы - внутривенно.
пигпбпровшшю опухолевого роста (значение показателя ТРО составляли 18,0% и 35,9%, соответственно). Применение данных препаратов в форме полимерных мицелл позволяет существешю увеличить их ингнбирующее воздействие на рост опухолевых клеток (ТРО составляет 69,1% для мицелл с силимарином и 82,3% - с силибинином), что приводит к значительному увеличению СПЖ животных по сравнению как с контролем, так и с пероральным применением чистых веществ (табл. 22). При пероральном применении силимарина и силибинина более 50% вещества накапливается в печени уже через 1 ч после приема препарата и затем выводится из организма [Zhao 1999], не успевая достигнуть опухолевой ткани. Применение препаратов в составе полимерных мицелл позволяет им накапливаться преимущественно в опухоли, где они, постепенно высвобождаясь из состава полимерных контейнеров, оказывают свое биологическое действие.
Представленные данные свидетельствуют о том, что силимарин, и особенно силибинин, в составе полимерных мицелл оказывают более выраженный терапевтический эффект по сравнению с аналогичными формами ангиостатина и эндостатина. Требуются дополнительные исследования для поиска наиболее эффективных схем терапевтического применения наноформ аитиангиогенных агентов.
выводы
1. Впервые создана липосомная форма снлимарина из расторопши пятнистой, обладающая повышенной биодоступностью и пригодная для инъекционного применения.
2. Продемонстрировано, что при внутривенном введении силимарина в липосомной форме препарат преимущественно накапливается в тканях-мишенях его антигепатотоксического действия — печени и селезенке, а также в опухолевой ткани и органах, пораженных метастазами.
3. Впервые продемонстрирована возможность применения липосомной формы силимарина для профилактики и лечения острого токсического гепатита, а также снижения токсического влияния алкоголя на печень.
4. В результате клинических исследований показано, что применение липосомной формы силимарина (БАД «Липосил») в схеме комплексной терапии больных хроническим вирусным гепатитом С приводит к улучшению биохимических показателей крови и нормализации белково-синтетической функции печени.
5. Показано, что введение липосомной формы силимарина в рацион цыплят-бройлеров вызывает положительную динамику изменения основных биохимических, физиологических и зоотехнических показателей птицы, что свидетельствует о возможности ее практического применения в сельском хозяйстве в качестве кормовой добавки.
6. Впервые продемонстрирована противоопухолевая и антиангиогенная активность липосомной формы силимарина в отношении культур опухолевых и эидотелиальных клеток. В экспериментах на животных с модельными опухолями продемонстрировано значительное увеличение противоопухолевой и антиметастатической активности силимарина в липосомной форме по сравнению со свободным препаратом.
7. В экспериментах in vitro и in vivo продемонстрировано, что комбинированное применение липосомного силимарина с противоопухолевым антибиотиком доксорубицнном для лечения злокачественных новообразований, в том числе и химиорезистентных опухолей, позволяет добиться значительно более высокого терапевтического эффекта, чем при применении индивидуальных препаратов в режиме монотерапии.
8. Разработаны методы получения полимерных мицелл па основе модифицированного поли-Ы-винилпирролцдона, включающих антиангиогенные белки (ангиостатпн, эндостатин), а также флаволнгнаны силимарина и силибинин. В экспериментах in vivo продемонстрирована высокая противоопухолевая активность полученных препаратов полимерных мицелл, значительно превышающая активность входящих в их состав свободных веществ.
Список научных работ, опубликованных по теме диссертации
1. Дигтярь A.B., Луценко Е.В., Луценко C.B., Северин С.Е. Система плазминогена человека: физиологические функции, участие в патологических процессах и современная фармакотерапия. Молекулярная Медицина, 2006, №1, с. 11-23.
2. Фельдман Н.Б., Позднякова Н.В., Николаенко ТВ., Дигтярь A.B., Кривошеева О.С., Луценко Е.В., Грицкова И.А., Луценко C.B., Северин С.Е., Швец В.И. Полимерные мицеллы на основе поли-Ы-виниппирролидона как эффективные средства доставки противоопухолевых антиангиогенных препаратов. Молекулярная медицина, 2006, №4, с. 33-37.
3. Луценко Е.В., Николаенко ТВ., Архапчев М.Ю., Орищенко ДА., Киселев С.М., Фельдман Н.Б., Луценко C.B., Швец В.И., Быков В.А. Сравнительное исследование антиангиогенной и противоопухолевой активности различных форм силимарина. Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии, 2006, №3, с. 21-27.
4. Дигтярь A.B., Луценко Е.В., Киселёв С.М., Фельдман Н.Б., Луценко C.B., Северин С.Е. Повышение терапевтической эффективности ангиостатина путём конъюгирования с противоопухолевым антибиотиком. Материалы заочной международной конференции «Приоритеты фармацевтической науки и практики», 2006, с. 58-60.
5. Луценко Е.В., Дигтярь A.B., Николаенко Т.В., Захарова И.В., Фельдман Н.Б., Луценко C.B. Исследование противоопухолевой активности липосомной формы силимарина. Материалы заочной международной конференции «Приоритеты фармацевтической науки и практики», 2006, с. 355-357.
6. Позднякова Н.В., Корженевский Д А., Луценко Е.В., Архапчев М.Ю., Дигтярь A.B., Фельдман Н.Б., Луценко C.B., Северин С.Е. Разработка метода получения растворимой формы рекомбинантного человеческого эндостатина и исследование его противоопухолевого потенциала. Молекулярная медицина, 2007, №2, с. 13-19.
7. Луценко Е.В., Друзь Е.А., Кашникова Т.В., Лужнов Н.Д., Фельдман Н.Б., Луценко C.B., Быков В.А. Трансдермальные системы доставки липосомных форм растительных флаволигнанов. Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии, 2008, №6, с. 42-46.
8. Луценко Е.В., Архапчев М.Ю., Друзь Е.А., Кашникова Т.В., Архапчев Ю.П., Фельдман Н.Б., Луценко C.B., Быков В.А. Получение и изучение антигепатотоксической активности наносомной формы флаволигнана силикристина. Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии, 2008, №6, с. 19-23.
9. Луценко C.B., Кашникова Т.В., Хмыров A.B., Друзь Е.Л., Ледешкова О.Н., Фельдман Н.Б., Лужнов Н.Д., Луценко Е.В. Изучение влияния липосомной формы силимарина на биохимические показатели сыворотки крови и продуктивность цыплят-бройлеров. Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук, 2008, №6, с. 44-46.
10. Луценко C.B., Архапчев М.Ю., Друзь Е.А., Кашникова Т.В., Фельдман Н.Б., Луценко Е.В., Быков В. А. Исследование гепатопротекторной активности липосомных наночастиц с силикристином. Материалы международной научно-практической конференции «Ботанические сады в 21 веке: сохранение биоразнообразия, стратегия развития и инновационные решения», Белгород, 2009, с. 412-414.
11. Кашникова Т.В., Друзь Е.А., Фельдман Н.Б., Луценко C.B., Стрелкова Л.Б., Луценко Е.В., Быков В.А. Оценка активности транспортных наносистем, включающих биофлавоноиды, с помощью микросомальной биотест-системы. Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии, 2009, №3, с. 22-26.
12. Архапчев М.Ю., Кашникова Т.В., Друзь Е.А., Лужнов Н.Д., Луценко C.B., Архапчев Ю.П., Фельдман Н.Б., Луценко Е.В., Быков В.А. Микроскопическое исследование липосомного силикристина и его гепатопротекторного действия. Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии, 2009, №4, с. 21-24.
13. Друзь Е.А., Александрова Т.В., Лужнов Н.Д., Луценко Е.В., Фельдман Н.Б., Луценко C.B., Быков В.А. Разработка систем трансдермальной доставки биофлавоноидов рутина и силимарина. Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии, 2010, №5, с. 46-51.
14. Дигтярь A.B., Луценко Е.В., Фельдман Н.Б., Киселёв С.М., Грицкова И.А., Луценко C.B., Северин С.Е. Антиангиогенная терапия с использованием нанотехнологий. Материалы II Международной конференции «Молекулярная Медицина и Биобезопасность», Москва, 2005, с. 119-120.
15. Киселёв С.М., Дигтярь A.B., Луценко Е.В., Фельдман Н.Б., Луценко C.B., Северин С.Е. Новые противоопухолевые биопрепараты, сочетающие цитотоксические и антиангиогенные свойства. Материалы II Международной конференции «Молекулярная Медицина и Биобезопасность», Москва, 2005, с. 155.
16. Луценко Е.В., Дигтярь A.B., Фельдман Н.Б., Луценко C.B., Быков В.А. Цитотоксическая эффективность липосомной формы силимарина in vitro. Материалы XIII Российского национального конгресса «Человек и лекарство», Москва, 2006, с. 639.
17. Фельдман Н.Б., Николаенко Т.В., Дигтярь A.B., Луценко Е.В., Луценко C.B., Быков В.А. Липосомная форма силимарина и ее противоопухолевая активность. Материалы XIII Российского национального конгресса «Человек и лекарство», Москва, 2006, с. 659.
18. Severin S.E., Lutsenko S.V., Feldman N.B., Pozdnyakova N.V., Digtyar A.V., Lutsenko E.V., Kaplun A.P., Shvets V.l. Inhibition of melanoma B16 growth in mice by liposomal forms of angiostatin and endostatin. Abstracts of 19th Meeting of the European Association for Cancer Research, Budapest, Hungary, 2006, p. 176.
19. Друзь E.A., Кашникова T.B., Ледешкова O.H., Лужнов H.Д., Луценко C.B., Фельдман Н.Б., Луценко Е.В., Быков В.А. Применение липосомных форм растительных флаволигнанов в трансдермальных системах. Материалы XVI Российского национального конгресса «Человек и лекарство», Москва, 2009, с. 651-652.
20. Кашникова Т.В., Друзь Е.А., Лужнов Н.Д., Фельдман Н.Б., Луценко Е.В., Луценко C.B. Комплексный препарат на основе силимарина для терапии заболеваний и поддержания
функциональной активности печени. Материалы IV Международного Форума «Интегративная медицина», Москва, 2009, с. 225-226.
21. Монастырский A.A., Притулина Ю.Г., Друзь Е.А., Фельдман Н.Б., Луценко C.B., Луценко Е.В. Клиническая оценка гепатопротекторной активности препарата липосомного силимарина (БАД «Липосил»), Материалы XVII Российского национального конгресса «Человек и лекарство», Москва, 2010, с. 683-684.
22. Гороховец Н.В., Диггярь A.B., Корженевский Д.А., Луценко Е.В., Луценко C.B., Макаров В.А., Позднякова Н.В., Северин Е.С., Северин С.Е., Соловьев А.И., Фельдман Н.Б. Препарат человеческого эндостатина и способ его получения. Патент РФ № 2278688, приоритет от 2.12.2004 г.
23. Быков В.А., Безруков Д А., Диггярь A.B., Каплун А.П., Красильникова В В., Луценко Е.В., Луценко C.B., Фельдман Н.Б., Швец В.И. Ингибитор ангиогенеза, антиангиогенная фармацевтическая композиция на его основе и способ лечения злокачественных новообразований. Патент РФ № 2287341, приоритет от 01.03.2005 г.
24. Быков В.А., Луценко Е.В., Луценко C.B., Фельдман Н.Б. Биологически активная добавка для снижения алкогольной зависимости на основе расторопши пятнистой. Патент РФ №2274400, приоритет от 31.03.2005.
25. Быков В.А., Луценко Е.В., Луценко C.B., Фельдман Н.Б. Средство и способ лечения и профилактики онкологических заболеваний. Патент РФ № 2283658, приоритет от
29.03.2005.
26. Дигтярь A.B., Луценко Е.В., Луценко C.B., Фельдман Н.Б. Применение флаволигнанов для подавления избыточной и патологической пролиферации эндотелия сосудов. Патент РФ № 2291706, приоритет от 21.06.2005.
27. Дигтярь A.B., Луценко Е.В., Луценко C.B., Фельдман Н.Б. Противоопухолевый липосомный препарат направленного действия. Патент РФ № 2292898, приоритет от 02.08.05.
28. Луценко Е.В., Луценко C.B., Фельдман Н.Б. Композиция для лечения и профилактики онкологических заболеваний. Патент РФ №2311917, приоритет от 27.12.2005.
29. Луценко Е.В., Луценко C.B., Фельдман Н.Б. Биокомпозиция, обладающая антитоксическим и антиапоптозным действием, профилактическая биологическая добавка на ее основе. Патент РФ№ 2319498, приоритет от 26.12.05.
30. Луценко Е.В., Луценко C.B., Фельдман Н.Б. Профилактическая композиция на основе веществ фенольной природы и фосфолипидов. Патент РФ №2306945, приоритет от
15.02.2006.
31. Луценко Е.В., Луценко C.B., Фельдман Н.Б. Способ получения гидрофильного комплекса на основе флаволигнанов и фосфолипидов. Патент РФ № 2310453, приоритет от 28.02.06.
32. Луценко Е.В., Луценко C.B., Фельдман Н.Б. Профилактическая композиция на основе веществ фенольной природы. Патент РФ № 2354395, приоритет от 29.05.06.
33. Быков В.А., Луценко Е.В., Луценко C.B., Фельдман Н.Б. Средство для профилактики колибактериоза птиц. Патент РФ № 2355410, приоритет от 05.04.07.
34. Луценко C.B., Фельдман Н.Б., Луценко Е.В. Профилактическая композиция на основе веществ фенольной природы в липосомной форме. Патент РФ № 2372929, приоритет от 07.08.08.
35. Луценко C.B., Фельдман Н.Б., Луцепно Е.В., Кашникова Т.В., Друзь Е.Л. Композиция для терапии патологий печени и онкологических заболеваний. Патент РФ № 2379046, приоритет от 18.11.2008.
36. Луценко Е.В., Фельдман Н.Б., Луценко C.B. Современные подходы к созданию противоопухолевых биопрепаратов нового поколения. Москва, 2004,112 с.
37. Луценко C.B., Фельдман Н.Б., Луценко Е.В. Биотехнологические аспекты создания противоопухолевых препаратов направленного действия. Великий Новгород, 2005, 80 с.
38. Луценко C.B., Фельдман Н.Б., Луценко Е.В., Быков В.А. Растительные флаволигнаны. Биологическая активность и терапевтический потенциал. Москва, 2006,236 с.
39. Луценко C.B., Фельдман Н.Б., Луценко Е.В., Быков В.А. Нанобиотехнология и медицина. Москва, 2010, 280 с.
Луценко Елена Валерьевна (Россия)
РАЗРАБОТКА НАНОСОМНЫХ ПРЕПАРАТОВ НА ОСНОВЕ ФЛАВОЛИГНАНОВ IIАНТИАНГПОГЕННЫХ БЕЛКОВ
Работа посвящена разработке и исследованию перспектив применения наносомных препаратов флаволигнанов расторопши пятнистой (силимарина) и антиангиогенных белков ангиостатина и эндостатина. Впервые получена липосомная форма силимарина, обладающая повышенной биодоступностью, и изучено ее распределение в органах и тканях при внутривенном введении. В экспериментах in vitro и in vivo продемонстрирована высокая гепатозащитная, противоопухолевая, антиметастатическая и антиангиогенная активность липосомной формы силимарина. Установлено, что применение липосомного силимарина совместно с доксорубицином позволяет существенно снизить резистентность опухолей к этому антибиотику. Доказана перспективность применения липосомной формы силимарина в клинике при комплексной терапии больных хроническим вирусным гепатитом С. Предложено использование липосомной формы силимарина в сельском хозяйстве в качестве кормовой добавки при выращивании цыплят-бройлеров. Впервые получены наночастицы на основе поли-М-винилпирролидона, включающие ангиостатин и эндостатин, силимарин и силибинин. Доказана высокая противоопухолевая активность полученных препаратов наночастиц, значительно превышающая активность входящих в их состав свободных веществ.
Lutsenko Elena Valeryevna (Russia)
DEVELOPMENT OF NANOSOMAL PREPARATIONS ON THE BASIS OF FLAVONOLIGNANS AND ANTIANGIOGENIC PROTEINS
The thesis is devoted to development and research of prospects of application of nanosomal preparations of flavonolignans from Silybum marianum L. (silymarin) and antiangiogenic proteins (angiostatin and endostatin). The liposomal formulation of silymarin with increased bioavailability was prepared, and its distribution at intravenous introduction in organs and tissues was studied. High hepatoprotective, antitumor, antimetastatic and antiangiogenic activities of liposomal silymarin was demonstrated in vitro and in vivo. It was found that application of liposomal silymarin together with the doxorubicin allows to reduce drug resistance of tumors to this antibiotic. It was proved that liposomal silymarin could be successfully used in clinic at complex therapy of patients by chronic viral hepatitis C. It was offered to use liposomal silymarin in agriculture as a feed additive at cultivation of broilers. For the first time nanoparticles including angiostatin, endostatin, silymarin and silibinin were received on the basis of the poIy-N-vinylpyrroIidone. It was proved that antineoplastic activity of the received nanoparticles considerably exceeds activity of the free substances.
Подписано в печать:
14.11.2012
Заказ № 7998 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru
Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Луценко, Елена Валерьевна, Москва
ГОСУДАРСТВЕННОЕ НАУЧНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЛЕКАРСТВЕННЫХ И АРОМАТИЧЕСКИХ РАСТЕНИЙ
РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ
05^01350358 На правах рукописи
ЛУЦЕНКО ЕЛЕНА ВАЛЕРЬЕВНА
РАЗРАБОТКА НАНОСОМНЫХ ПРЕПАРАТОВ НА ОСНОВЕ ФЛАВОЛИГНАНОВ И АНТИАНГИОГЕННЫХ БЕЛКОВ
03.01.04. - биохимия
Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук
Научный консультант доктор биологических наук
Фельдман Наталия Борисовна
МОСКВА 2012
ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ......................................................................8
ВВЕДЕНИЕ.............................................................................................10
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ........................................................19
1.1. Гепатопротекторное действие силимарина...............................22
1.1.1. Механизмы гепатопротекторного действия силимарина..23
1.1.2. Роль силимарина в снижении уровня холестерола в крови ............................................................................................................30
1.1.3. Действие силимарина при повреждениях печени алкогольного генеза.........................................................................33
1.1.4. Терапевтическое действие силибинина при отравлении токсинами зеленой поганки (Amanita phalloides).........................34
1.2. Действие силибинина и силикристина на клетки почек..........39
1.3. Биодоступность силимарина.......................................................39
1.4. Дозы и токсичность силимарина................................................41
1.5. Противоопухолевая активность силимарина............................41
1.5.1. Химический канцерогенез и противоопухолевое действие силимарина.......................................................................................41
1.5.2. Индуцирующее влияние силибинина на дифференцировку опухолевых клеток...........................................................................53
1.5.3. Роль силимарина/силибинина в регуляции клеточного цикла..................................................................................................54
1.5.4. Влияние силимарина/силибинина на регуляторные белки семейства Rb и факторы транскрипции E2F.................................58
1.5.5. Блокирование силимарином/силибинином каскада передачи регуляторного сигнала ЕвРЯ-^МАРК/ЕЯК1 /2...........59
1.5.6. Действие силимарина/силибинина на каскад передачи регуляторных сигналов, индуцируемых инсулиноподобными факторами роста...............................................................................62
1.5.7. Подавление силимарином/силибинином сигнального пути, приводящего к активации фактора транскрипции КБ-кВ...........64
1.5.8. Антиоксидативное фотопротекторное действие си л имарин а/ си либинина..................................................................68
1.5.9. Противовоспалительное действие силимарина..................73
1.5.10. Иммуномодулирующие эффекты силимарина.................74
1.6. Антиангиогенный потенциал силимарина................................78
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ..............88
2.1. Выделение силибинина из экстракта расторопши пятнистой.88
2.2. Тонкослойная хроматография препаратов силимарина/силибинина.....................................................................89
2.3. Получение нативного ангиостатина...........................................89
2.4. Получение рекомбинантного эндостатина человека................91
2.5. Получение липосомной формы силимарина.............................91
2.6. Определение степени включения веществ в липосомы...........92
2.7. Изучение липосомных частиц с помощью электронной микроскопии........................................................................................93
2.8. Определение размеров липосомных частиц..............................93
2.9. Исследование накопления силибинина в тканях экспериментальных животных..........................................................94
2.10. Исследование антитоксической активности липосомной формы силимарина на модели острого токсического гепатита.....95
2.11. Исследование антитоксической активности липосомной формы силимарина на модели алкогольной интоксикации экспериментальных животных..........................................................96
2.12. Микроскопическое исследование морфологии печени экспериментальных животных..........................................................96
2.13. Клинические исследования безопасности и эффективности липосомного силимарина (БАД «Липосил»)....................................97
2.14. Изучение безопасности липосомной формы силимарина и ее влияния на основные зоотехнические и физиологические показатели цыплят-бройлеров...........................................................98
2.15. Исследование цитотоксической активности препаратов in vitro........................................................................................................99
2.15.1. Клеточные линии.................................................................99
2.15.2. Определение ЦТА препаратов в отношении культур клеток MCF-7, НТ1080, LNCaP, АВАЕ, SVEC4-10 и Р388.......100
2.15.3. Определение ЦТА препаратов в отношении клеток линии HUVEC............................................................................................100
2.15.4. Оценка выживаемости клеток..........................................101
2.16. Исследование влияния препаратов силимарина на образование капилляров в матригеле..............................................101
2.17. Исследование противоопухолевой активности препаратов силимарина in vivo.............................................................................102
2.18. Исследование антиметастатической активности препаратов силимарина.........................................................................................103
2.19. Исследование противоопухолевой активности доксорубицина и препаратов силимарина при их сочетанном применении..........104
2.20. Получение полимерных мицелл с ангиостатином, эндостатином, силимарином и силибинином.................................104
2.21. Определение размеров наночастиц........................................105
2.22. Исследование противоопухолевой активности препаратов
наночастиц.........................................................................................105
2.23. Статистическая обработка результатов.................................106
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.............................107
3.1. Получение липосомной формы силимарина...........................107
3.2. Накопление и распределение свободного силимарина и его липосомной формы в органах экспериментальных животных ....108
3.3. Исследование антитоксической активности липосомной формы силимарина............................................................................111
3.3.1. Исследование антитоксической активности различных форм силимарина на модели острого токсического гепатита... 111
3.3.2. Исследование антитоксической активности липосомной формы силимарина на модели алкогольной интоксикации экспериментальных животных.....................................................118
3.4. Оценка клинической эффективности липосомной формы силимарина (БАД «Липосил») при терапии хронического вирусного гепатита С........................................................................119
3.5. Исследование возможности применения липосомной формы силимарина в сельском хозяйстве в качестве кормовой добавки при выращивании цыплят-бройлеров.............................................125
3.6. Сравнительное исследование антиангиогенной и противоопухолевой активности различных форм силимарина.... 134
3.6.1. Исследование цитотоксической активности препаратов силимарина в отношении культур опухолевых клеток.............136
3.6.2. Оценка цитотоксической активности препаратов силимарина в отношении эндотелиальных клеток различных линий...............................................................................................138
3.6.3. Влияние препаратов силимарина на образование капилляров в матригеле.................................................................140
3.6.4. Противоопухолевая активность препаратов силимарина in vivo...................................................................................................142
Противоопухолевая активность препаратов силимарина в
отношении меланомы В16.........................................................143
Противоопухолевая активность препаратов силимарина в
отношении лёгочной карциномы Льюис (3LL).......................144
Противоопухолевая активность препаратов силимарина в отношении аденокарциномы молочной железы линии Са755 ......................................................................................................146
3.6.5. Исследование антиметастатической активности препаратов силимарина.................................................................147
3.7. Исследование возможностей совместного использования силимарина и доксорубицина в комбинированной терапии опухолей.............................................................................................150
3.7.1. Цитотоксическая активность препаратов силимарина и доксорубицина in vitro...................................................................150
3.7.2. Противоопухолевая активность доксорубицина и липосомной формы силимарина in vivo.......................................157
3.7.3. Исследование in vivo противоопухолевого действия совместно применяемых доксорубицина и силимарина на модели опухоли с приобретенной резистентностью к доксорубицину...............................................................................161
3.8. Получение и сравнительное исследование противоопухолевой активности in vivo полимерных мицелл на основе поли-N-винилпирролидона, включающих флаволигнаны силимарина и антиангиогенные белки....................................................................164
3.8.1. Получение и определение размеров полимерных мицелл с антиангиогенными агентами........................................................166
3.8.2. Исследование противоопухолевой активности полимерных мицелл in vivo.................................................................................168
ВЫВОДЫ...............................................................................................174
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ.............................176
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
CDK - циклинзависимые киназы
Cdkl - ингибиторы циклинзависимых киназ
Cipl/p21, Kipl/p27 - представители семейства ингибиторов
циклинзависимых киназ DMBA - 7,12-диметилбензоантрацен E2F, SRF, TCF - факторы транскрипции EGFR, erbBl - рецептор эпидермального фактора роста егЬВ2, егЬВЗ, егЬВ4 - рецепторы семейства EGF IC5o - inhibiting concentration, молярная концентрация вещества,
вызывающая гибель 50% клеток IGF - инсулиноподобный фактор роста IGFBP-3 - белок, связывающий инсулиноподобные факторы IL - интерлейкин
IRS-1 - субстрат-1 рецептора инсулина
МТТ - 3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолия бромид NF-кВ - ядерный фактор кВ OD - optical density, оптическая плотность Rb - белок ретинобластомы
SAPK, JNK - активируемые стрессом протеинкиназы TNF-a - фактор некроза опухоли a
ТРА - форболовый эфир 12-О-тетрадеканоилфорбол-13-ацетат
VEGF - фактор роста сосудистого эндотелия
AJIAT - аланинаминотрансфераза
АСАТ - аспартатаминотрансфераза
АФК - активные формы кислорода
ГГТ - у-глутамилтрансфераза
ДР - доксорубицин
ДСН - додецилсульфат натрия
ДХН - дезоксихолат натрия
ИПТГ - изопропилтио-Р-Б-галактопиранозид
МЕКК, МКК, МЕК, ЕШС1/2, МАР - протеинкиназы
ОРО - относительный размер опухоли
ОФ ВЭЖХ - обращеннофазовая высокоэффективная жидкостная
хроматография ПААГ - полиакриламидный гель ПКС - протеинкиназа С СМ - силимарин
СПЖ - средняя продолжительность жизни экспериментальных
животных ТРМ - торможение роста метастазов ТРО - торможение роста опухоли ТФРа, ТС Га - трансформирующий фактор роста УСПЖ - увеличение средней продолжительности жизни
экспериментальных животных ФСБ - фосфатно-солевой буфер ЦТА - цитотоксическая активность ЭДТА - этилендиамин тетраацетат ЭФР, ЕвЕ - эпидермальный фактор роста
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность проблемы
Одной из важнейших задач современной медицинской биохимии является поиск новых и совершенствование уже имеющихся путей создания эффективных препаратов для терапии целого ряда патологий, представляющих серьезную угрозу жизни населения практически всех стран мира. Среди этих патологий, часто связанных с техногенными факторами и ухудшением экологической обстановки, - поражения печени различного генеза, целый ряд онкологических заболеваний, а также патологий, связанных с нарушениями ангиогенеза. В настоящее время первостепенное внимание научным и медицинским сообществом уделяется поиску средств или их комбинаций, обладающих комплексным профилактическим и терапевтическим потенциалом, позволяющим снизить риск возникновения и осуществить эффективную терапию патологий, связанных с неблагоприятными факторами окружающей среды. Особое значение при этом придается снижению токсичности препаратов, увеличению их биодоступности, отсутствию врожденной или приобретенной резистентности ткани-мишени к действию препарата. К наиболее перспективным препаратам, отвечающим требованиям современной медицины, относятся растительные флаволигнаны, входящие в состав силимарина, а также антиангиогенные белки ангиостатин и эндостатин.
Рядом исследований было продемонстрировано, что флаволигнаны силимарина являются сильными антиоксидантами и способны инактивировать как свободные радикалы, так и активные
формы кислорода в клетке, что во многом обусловливает их высокую гепатопротекторную и терапевтическую эффективность при лечении таких заболеваний печени, как токсические и вирусные гепатиты, цирроз, лекарственные, радиационные и ишемические повреждения и др. Флаволигнаны обладают также высоким потенциалом в профилактике и лечении онкологических заболеваний. Применение препаратов из расторопши пятнистой практически никогда не вызывает побочных реакций и отличается значительной терапевтической эффективностью. Тем не менее эти препараты не лишены недостатков, главными из которых являются низкая растворимость и биодоступность. Создание растворимых форм препаратов с повышенной биодоступностью и терапевтической эффективностью является актуальной задачей, решение которой находится в сфере нанотехнологий, которые могут позволить получать инъекционные формы препаратов, содержащие гидрофильный биодеградабельный носитель и гидрофобное действующее вещество.
В исследовании молекулярных механизмов биологической активности флаволигнанов силимарина в последние годы достигнут значительный прорыв, позволяющий с оптимизмом рассматривать новые стратегии борьбы с онкологическими и другими заболеваниями. Изучение путей и возможностей терапии патологий печени и подавления опухолевого процесса с помощью флаволигнанов представляет актуальную научно-практическую задачу, решение которой может внести существенный вклад в современную молекулярную медицину и клиническую онкологию.
Помимо гепатозащитных и противоопухолевых свойств растительных флаволигнанов важной составляющей частью их биологической активности является недавно открытая способность к
подавлению ангиогенеза. Высокой антиангиогенной активностью обладают также пептиды ангиостатин и эндостатин, которые, как и флаволигнаны, могут быть использованы для терапии широкого спектра патологий, связанных с нарушениями ангиогенеза. Ангиогенез играет ключевую роль в эмбриогенезе и представляет собой физиологический процесс, заключающийся в образовании кровеносных капилляров из предсуществующих капиллярных отростков и организации капилляров в сосудистую сеть. Во взрослом здоровом организме ангиогенез находится под жестким контролем регуляторных систем организма, обеспечивающих баланс между позитивными и негативными регуляторами ангиогенеза, и, в основном, поддерживается на низком уровне или носит периодический и кратковременный характер. Неадекватная или несбалансированная васкуляризация является причиной многочисленных патологических состояний, приводящих к таким заболеваниям как ишемическая болезнь сердца, ретинопатия, атеросклероз и др. Очевидно, что применение антиангиогенных агентов может стать эффективным инструментом в терапии таких патологий. Особенно важную роль ангиогенез играет в процессе развития злокачественных новообразований, условием прогрессии и метастатической активности которых является привлечение кровеносных капилляров, формирующихся из предсуществующих сосудов. Антиангиогенные агенты, вызывающие деструкцию опухолевой кровеносной сети и лишающие опухоль питания и оксигенации, могут быть использованы для проведения противоопухолевой терапии. Важным инструментом повышения эффективности противоопухолевой терапии является применение антиангиогенных агентов (флаволигнанов силимарина, ангиостатина и эндостатина) в составе липосомных или полимерных наночастиц,
полученных с использованием методов современной биохимии и нанобиотехнологии. В связи с этим разработка и изучение биологической и терапевтической активности наносомных форм антиангиогенных агентов является одной из актуальных задач современной медицины, имеющих важное теоретическое и прикладное значение. Применение нанопрепаратов нового поколения может позволить разработать новые эффективные терапевтические стратегии и увеличить арсенал средств лечения различных патологий печени, онкологических заболеваний и патологий, связанных с нарушениями ангиогенеза.
Исходя из этого целью данного исследования являлась разработка наносомных препаратов с флаволигнанами силимарина и антиангиогенными белками ангиостатином и эндостатином, а также сравнительное изучение их терапевтической активности и биодоступности с помощью биохимических методов.
В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи:
- создать липосомную форму флаволигнанов силимарина из расторопши пятнистой, обладающую повышенной биодоступностью;
- исследовать накопление и распределение липосомной формы силимарина в органах и тканях-мишенях экспериментальных животных;
- изучить антигепатотоксическую активность липосомной формы в сравнении со свободным сили
-
Луценко, Елена Валерьевна
-
доктора биологических наук
-
Москва, 2012
-
ВАК 03.01.04
- Роль PEDF в образовании фибриллярных внеклеточных структур при миопии
- Рецептор фактора роста эндотелия сосудов второго типа
- Молекулярные механизмы обеспечения метаболической толерантности в условиях действия веществ растительного и животного происхождения
- Молекулярные механизмы взаимодействия в организме биогенных веществ животного и растительного происхождения
- Получение и иммунохимический анализ рекомбинантных фактора роста эндотелия сосудов и его первого растворимого рецептора
