Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль PEDF в образовании фибриллярных внеклеточных структур при миопии

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Роль PEDF в образовании фибриллярных внеклеточных структур при миопии"

Минкевич Наталья Игоревна

РОЛЬ РЕЭР В ОБРАЗОВАНИИ ФИБРИЛЛЯРНЫХ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ СТРУКТУР ПРИ МИОПИИ

03.01.03 — молекулярная биология

8 АПР 2013

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

005051972

Пущино-2013

005051972

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и ЮА Овчинникова Российской Академии Наук

Научные руководители:

кандидат химических наук [Костанян Ирина Александровца|

член-корреспондент РАН,

доктор химических наук, профессор Липкин Валерий Михайлович

Официальные оппоненты:

Новоселов Владимир Иванович - доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биофизики клетки РАН, главный научный сотрудник лаборатории механизмов рецепции.

Уткин Юрий Николаевич - доктор химических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчишшкова РАН, заведующий лабораторией молекулярной токсинологии.

Ведущая организация: Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского Московского государственного университета им. М.В.Ломоносова.

Защита диссертации состоится "11" апреля 2013г. в 15 час. 30 мин. на заседании Диссертационного совета Д 002.038.01 при Институте биофизики клетки РАН по адресу: 142290, г.Пущино Московской области, Институтская, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке НЦБИ РАН по адресу: 142290, г.Пущино Московской области, Институтская, 3. Автореферат разослан «_» _2013 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета

/?< 1 р

кандидат биологических наук / /I. (¿л. Смолихина Татьяна Ивановна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Близорукость, или миопия, является всемирно распространенным глазным заболеванием, охватывающим все возрастные группы пациентов. Прогрессирование миопии в первую очередь связано с поражением соединительно-тканной капсулы глаза -склеры, чья опорная функция, морфологическая структура и биохимические показатели при миопии существенно нарушаются. Процесс деградации внеклеточного матрикса склеры, сопровождающий развитие заболевания, является предметом исследования ученых как важнейший для понимания этиологии близорукости и возможностей предотвращения и лечения этого заболевания.

PEDF (pigment epithelium-derived factor), глобулярный гликопротеин с молекулярной массой 50,1 кДа, отнесенный к семейству неингибиторных серпинов, является мультифункционапьным фактором. К числу его биологических активностей относятся нейропротекторная, антиангиогенная, дифференцирующая активности. PEDF принимает участие в регуляции клеточного цикла и апоптоза. Внимание ученых привлекает его возможное участие в широком спектре патологических процессов, в том числе сопровождающих развитие ряда глазных заболеваний. Определены биологически активные фрагменты, отвечающие за дифференцирующее, нейропротекторное и антиангиогеиное действие фактора, исследуются механизмы воздействия PEDF на различные типы клеток, предложены пути использования генноинженерных конструкций, несущих в себе ген PEDF, для предотвращения и лечения различных, в том числе зрительных патологий.

Известно, что при хориоретинальной дистрофии - часто возникающем осложнении при близорукости, являющемся следствием структурных и трофических изменений в склере, содержание PEDF во влаге передней камеры миопических глаз снижено в два раза по сравнению с нормой. Основным источником PEDF в глазу являются клетки пигментного эпителия и сетчатки, однако некоторое его количество также вырабатывается фибробластами склеры. Сравнительно с клетками пигментного эпителия, фибробласты склеры как продуценты PEDF являются значительно менее изученным объектом. В связи с вышеизложенным, исследования фактора PEDF, вырабатываемого фибробластами миопической склеры, представляются актуальными и важными, особенно в свете их возможного вклада в понимание патологии развития близорукости.

Цели и задачи исследования.

Цель настоящей работы - изучение особенностей и выявление возможных нарушений метаболизма молекулы ГЕБИ при прогрессирующей близорукости.

Задачи исследования.

1. Предложить новый тип исследуемых образцов, взятие которого не наносит вреда здоровью пациента, и доказать их пригодность для исследования.

2. Выявить возможные нарушения метаболизма фактора РЕОР, секретируемого фибробластами миопической теноновой капсулы человека

3. Изучить природу обнаруженных нарушений метаболизма фактора РЕБР, секретируемого фибробластами миопической теноновой капсулы человека.

4. Рассмотреть влияние обнаруженных нарушений на жизнеспособность клеток-продуцентов фактора РЕОР (фибробластов склеры и теноновой капсулы) и на структуру окружающих их опорных тканей.

Научная новизна работы. Предложен новый тип образцов глазных тканей, взятие которого не наносит вреда здоровью пациентов, пригодный для исследования метаболизма фактора РЕОР. Показано изменение при близорукости соотношения содержания изоформ фактора РЕОР в тканях склеры и теноновой капсулы глаза человека и его водорастворимости. Выявлено присутствие в склере и теноновой капсуле близоруких пациентов устойчивой к ограниченному протеолизу собственными ферментами организма формы фактора РЕОР. Предложена и подтверждена гипотеза о накоплении при близорукости нерасщепленного фактора РЕОР в виде нерастворимых агрегатов. На примере рекомбинантных молекул полноразмерного фактора РЕОР и усеченного с С-конца фактора РЕОР исследована возможная природа образуемых ими фибриллярных структур. Исследовано воздействие нерастворимых фибрилл, образуемых полноразмерным РЕОР, на жизнеспособность фибробластов склеры и теноновой капсулы, а также предположено их влияние на структуру коллагеновых волокон, составляющих околоклеточное пространство склеры.

Практическая ценность работы. В настоящее время изучение биомеханических процессов, протекающих в склере глаза человека при близорукости, является одной из приоритетных задач современной биологии и медицины. Свойство РЕОР формировать амилоидоподобные фибриллярные структуры в опорных тканях глаза может служить важной опорной точкой для дальнейших исследований в области механизма возникновения близорукости, разработки методов ранней диагностики и предсказания хода течения болезни, а также способов ее предотвращения и лечения.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены и обсуждены на XIX Зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (2007, Москва); на III Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (2007, Москва-Пущино); на XII Международной конференции по миошш (2008, Квинслэнд, Австралия); на Конгрессе Европейской ассоциации зрения и глазных исследований (2008, Порторож, Словения); на IX съезде офтальмологов России (2010, Москва); на XIV, XVIII, XIX международных конференциях и дискуссионного научного клуба «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии 1Т+М&Ес?006, IT+M&Ec'2010, IT+M&Ec'2011», (2006, 2010, 2011, Украина, Крым, Ялта-Гурзуф); V Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (2011, Петрозаводск).

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 13 печатных работ, в том числе 4 статьи в рекомендованных ВАК РФ журналах.

Структура н объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 120 страницах, иллюстрирована 28 рисунками и 3 таблицами. Список цитируемой литературы включает 212 источников.

Данная работа является частью совместного исследования, проводимого лабораторией белков гормональной регуляции (ИБХ РАН) и доктором биологических наук, ведущим научным сотрудником ФГБУ "МНИИ ГБ им.Гельмгольца" Минздрава России Иомдиной E.H.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Тенонова капсула как объект для прижизненного исследования патологии склеры.

Основным источником PEDF, гликопротеина с молекулярной массой около 50 кДа, относящегося к семейству неингибиторных серпинов, в глазных тканях является пигментный эпителий сетчатки, но определенные его количества также вырабатываются фибробластами склеры. Однако прижизненные исследования склеры человека в значительной степени затруднены тем, что получить экспериментальный образец чрезвычайно трудно, медицииские вмешательства, сопровождаемые иссечением ее фрагментов, редки. Основываясь на данных Shauly et al., 1992, согласно которым фибробласты склеры и теионовой капсулы (соединительнотканной оболочки, прилежащей к склере) практически идентичны, мы предположили, что при прогрессирующей близорукости фибробласты теноповой капсулы подвержены тем же патологическим изменениям, что и фибробласты миопической склеры. Таким образом, исследование особенностей метаболизма PEDF в ткани теноновой капсулы, вероятно, может служить инструментом для понимания возможных патологических процессов, протекающих в миопической склере. В отличие от склеры, фрагменты теноновой капсулы могут быть легко и без вреда для здоровья пациента получены в процессе операции склеропластики [Иомдина и др., 2008].

Для проверки этой гипотезы мы исследовали содержание фактора PEDF в образцах суммарных водорастворимых белковых фракций, полученных из прижизненных образцов склеры и теноновой капсулы глаз с миопической рефракцией, сравнив его количество и электрофоретическую подвижность между группами образцов, полученных из двух типов ткани, а также с образцом рекомбинантного белка. Иммунологическая идентичность PEDF, продуцируемого фибробластами склеры, фибробластами теноновой капсулы, а также рекомбинантного PEDF (Chemicon International, Германия), была исследована при помощи методов электрофореза по Лэммли в денатурирующих условиях в 12% ПААГ и Весгерн-блоттинга с использованием поликлонапьных кроличьих антител против полноразмерного PEDF.

Результаты, представленные на рис. 1, показали, что иммунореакгивные белковые •полосы в составе суммарных водорастворимых белковых фракций присутствуют как в образцах, полученных из склеры (рис. 1, б), так и в образцах, выделенных из теноновой капсулы (рис. 1, в). Белок из образцов склеры (рис. 1, 26) и теноновой капсулы (рис. 1, 2в) взаимодействует с высокой специфичностью с поликлональными антителами к PEDF.

без осложнений. Обработка результатов проводилась при помощи программы Microsoft Excel.

Экспериментальная группа

Рис. 3 Сравнительное содержание водорастворимого фактора РЕОГ в теноновой капсуле глаз пациентов с различными диагнозами. Ось абсцисс: объединенные экспериментальные группы и подгруппы образцов; ось ординат: усредненное внутри группы количественное содержание фактора РЕйГ (в мкг на 1 мг ткани образца).

3. PEDF4S является продуктом деградации PEDF50

Наши дальнейшие исследования были направлены на объяснение наблюдаемого впервые феномена значительного снижения концентрации либо отсутствия в детектируемых количествах одной из изоформ фактора PEDF в белковых экстрактах из тканей теноновой капсулы людей, страдающих близорукостью. Мы предположили, что изоформа PEDF45 является продуктом деградации полноразмерного фактора PEDF, происходящей при участии собственных протеиназ организма (сериновых протеиназ, а также матриксных металлопротеиназ ММР2 и ММР9). Известно также, что наиболее чувствительным к действию этих ферментов в составе PEDF является участок экспонированной петли, содержащий в своем составе связь Leu382-!"!!!-383 [Carrell et al., 1987]. После протеолиза этой связи и отщепления Зб-членного фрагмента Thr383-Pro418 расчетная масса молекулы PEDF должна снижаться на 5 кДа. Эти данные дали нам основания предположить, что выявляемая в образцах «контрольной» группы изоформа PEDF с молекулярной массой 45 кДа есть не что иное, как продукт ограниченного протеолиза полноразмерного PEDF по связи Leu382-Thr383, присутствующая в ткани в детектируемом количестве. Следует отметить, что связь Leu382-Tlir383 не является единственным сайтом расщепления сериновыми протеиназами и матриксными металлопротеиназами в составе молекулы PEDF. Однако прочие сайты в

нерасщегшенном факторе находятся в экранированном третичной структурой молекулы состоянии. Имеются литературные данные, говорящие о том, что после расщепления по связи Leu382-Thr383 происходит общая потеря молекулой фактора присущей ей эллиптичности, что говорит о снижении ее а-спиральности [Stratikos et all, 1999]. Это должно приводить к доступности для взаимодействия с ферментами некоторых ранее экранированных сайтов расщепления вышеперечисленными протеазами и возможности дальнейшего протеолиза.

Для проверки гипотезы о происхождении PEDF45 в результате ограниченного протеолиза полноразмерной изоформы фактора мы получили поликлональные кроличьи антитела к . пептидным фрагментам, соответствующим аминокислотным последовательностям фактора PEDF человека Lys345-Glu366 и Phe394-Asp414 (рис. 4), без конъюгирования химически синтезированных пептидов с высокомолекулярным белком.

345k1tgkpikltqvehragfewne366

394fifvlrdtdtgallfigkild414

Рис. 4 Аминокислотные последовательности илшуногенных пептидов Lys34S-Glu366 и Phe'4-Asp"4.

Животных (кроликов) иммунизировали по разработанной нами схеме. Выделение антител из сывороток крови осуществлялось при помощи аффинной хроматографии на колонках с белок А-сефарозой CL-4B (Pharmacia Fine Chemicals, Швеция). Титр полученных антител определяли методом непрямого иммуноферментного анализа (ELISA). Специфичность связывания антител определяли при помощи Вестерн-блоттинга суммарных водорастворимых белковых фракций теноновых капсул, а также рекомбинантного полноразмерного фактора PEDF.

При помощи полученных поликлональных антител к фрагментам фактора PEDF человека Lys345-Glu366 и Phe394-Asp414 мы проанализировали две группы образцов теноновой капсул, каждая из которых содержала 20 «экспериментальных» и 10 «контрольных» образцов. В рамках исследования при помощи методов денатурирующего электрофореза по Лэммли и Вестерн-блоттинга рассматривались экстракты водорастворимых белков, содержащихся в ткани теноновых капсул.

Результаты исследования, представленные на рис. 5, показали, что при окрашивании иммуноблотов антителами к фрагменту PEDF Lys345-Glu366 в составе белковой водорастворимой фракции идентифицируются одна или две иммунореактивные полосы с электрофоретическими подвижностями, соответствующими молекулярным массам около 50 кДаи 45 кДа —полноразмерный фактор PEDF и его 45 кДа изоформа. В белковых экстрактах

9

последовательности образцов кДНК РЕБР, для обнаружения вероятных мутаций гена ресі/ и изменений в последовательности аминокислотной цепи белка, способных влиять на его третичную структуру и доступность для взаимодействия с протеиназами серпиновой петли фактора.

В результате исследования 20 образцов генетического материала, полученного от пациентов, страдающих высокими степенями близорукости, а также 10 образцов «контрольной» группы, мутаций выявлено не было. Полученные данные позволяют заключить, что развитие близорукости не сопровождается обязательными мутационными заменами в аминокислотной последовательности фактора. Таким образом, можно сделать вывод о том, что мутационные замены в аминокислотной цепи фактора РЕОИ не являются причиной его устойчивости к ограниченному протеолизу собственными протеиназами организма.

6. В теноновых капсулах мпопических глаз часть РЕИР присутствует в водонерастворимом состоянии.

Еще одним фактором, способным стать причиной устойчивости РЕИИ к ограниченному протеолизу, может быть ограниченная растворимость этого белка в физиологической внутриклеточной среде. Для проверки этой гипотезы мы провели последовательные выделения суммарных белков ткани теноновой капсулы - при помощи фосфатного буфера с содержанием ингибитора сериновых протеиназ (РМБИ), для выделения водорастворимых белков, и при помощи фосфатного буфера с содержанием детергента и хаотропного агента (2% додецилсульфат натрия и 2М мочевина), для выделения остающихся в образцах после первой экстракции водонерастворимых белков. Дальнейшее исследование проводили с использованием методов ПААГ-электрофореза в денатурирующих условиях и Вестерн-блотгинга с использованием поликлональных антител против полноразмерного рекомбинантного фактора РЕСЖ Поправка на возможное разное количество клеточного материала, обработанного в составе образцов, вводилась при помощи определения количества белка ОАРОН составе экстрактов

Результаты исследования показали, что в тканях теноновых капсул больных близорукостью присутствует большое количество фактора РЕОИ, не выделяющегося без применения детергента (рис. 8, А: дорожки 2, 4). В образцах «экспериментальной» группы интенсивность иммунореактивных полос, соответствующих водонерастворимой форме РЕОР, значительно превышает интенсивность полос, соответствующих водорастворимой форме фактора (рис. 8, А: дорожки 1,3):

1эксп(РЕ0Р„)/1эксп(РЕ0Рр) = 3,1±0,8

(I - интенсивность иммунореакгивных полос на фотографической реплике; РЕБРН -водонерастворимая форма РЕОР, РЕОИр - водорастворимая форма РЕБР).

В образцах «контрольной» группы водонерастворимая форма фактора также присутствовала (рис. 8, А: дорожки б, 8), однако не превышая общего количества водорастворимого РЕОИ (рис. 8, А: дорожки 5, 7):

1контр(РЕОР„)/ 1ко1ггр(РПОР1р) = 1,1±0,32

(I - интенсивность иммунореакгивных полос на фотографической реплике; РЕОРн -водонерастворимая форма РЕРР, РЕРР^р - суммарные водорастворимые изоформы РЕОР).

Присутствие водонерастворимой формы РЕОР в контрольных образцах может объясняться тем, что ткань теноновой капсулы, как и склеры, является достаточно прочной структурой, изобилующей коллагеновыми волокнами, способными затруднять обмен содержимого ткани с экстракционным объемом, что преодолевается при введении в экстракционный буфер детергента Однако, даже учитывая этот фактор, содержание водонерастворимого РЕОР в тканях «экспериментальной» группы остается значительным, существенно превышающим таковое в тканях «контрольной» группы (соотношение усредненных количеств равно 2,82). Кроме того, малое количество САРОН в экстрактах нерастворимых белков подтверждает хорошее качество выделения (рис. 8, Б). Среди водонерастворимых белков как «экспериментальной», так и «контрольной» групп детектировались только иммунореактивные полосы с молекулярной массой 50 кДа, соответствующей полноразмерному фактору (рис. 8, А).

(а) (б) (в) (г)

Рис. 12 Иммунодот-анализ препаратов белков с помощью антител, специфичных к амилоидным фибриллам, (а): РЕйР-(44-414); (б): РЕйр-(44-382); (в): серпин РАМ; (г): альфа-синуклеин.

Таким образом, экспериментальные данные подтверждают нашу гипотезу о том, что нарушение ограниченного протеолиза фактора РЕОИ по связи Ьеи382-Т1"1Г383, наблюдаемое в теноновых капсулах близоруких глаз, приводит к накоплению нерасщепленного белка в клетках фибробластов. Они также дают основания предполагать, что накапливающийся в тканях склеры и теноновой капсулы глаза непротеолизированный фактор РЕИР формирует амилоидоподобные фибриллярные структуры, способные, по-видимому, разрушать наружные мембраны фибробластов и выходить во внеклеточный матрикс (где обнаруживаются в виде внеклеточного ореола при помощи иммуногистохимического окрашивания). Это предположение также подтверждают данные, полученные в исследовании [Иомдина и др., 2008], при изучении морфологической структуры теноновых капсул с помощью трансмиссионной электронной микроскопии. В этой работе было показано, что при высокой миопии нарушается процесс формирования коллагеновых волокон, в результате чего наряду с нормальными волокнами, образованными плотно упакованными фибриллами коллагена, выявляются нерегулярное расположение и дезинтеграция фибрилл в волокне и волокон в матриксе. Нередко встречаются зоны, не содержащие коллагеновых структур, с повышенным количеством протеогликанов [Иомдина и др., 2008].

В результате накопления нерастворимых агрегатов фактора РЕЭР в околоклеточной среде фибробластов может нарушаться процесс формирования коллагеновых волокон. Это, в свою очередь, будет приводить к ослаблению опорной функции склеры и, как следствие, к её патологическому растяжению, трофическим нарушениям сосудистой оболочки и сетчатки миопического глаза, и вносить свой вклад в деформацию глазного яблока и в развитие миопических осложнений на глазном дне - главным патологическим признакам прогрессирующей миопии. Кроме того, скопление большого количества нерастворимых белковых агрегатов в межклеточном пространстве может препятствовать нормальному функционированию фибробластов.

выводы

1. Показана иммунологическая идентичность РЕВР склеры и теноновой капсулы, что позволяет вместо РЕОБ миопической склеры в качестве объекта исследования использовать РЕОИ теноновой капсулы, которая в отличие от склеры может быть легко и без вреда для здоровья пациента получена в процессе операции склеропластики.

2. В экстрактах водорастворимых белков теноновых капсул идентифицирована изоформа РЕЛИ с молекулярной массой 45 кДа, являющаяся продуктом ограниченного протеолиза полноразмерного фактора РЕЭР по связи Ьеи382-ТЬг383. Обнаружено значительное уменьшение количества изоформы РЕОР45 в ткани теноновой капсулы близоруких глаз по сравнению с контролем, а также общее снижение содержания водорастворимого фактора РЕОИ при близорукости.

3. Выявлена устойчивость фактора РЕОР близоруких глаз к ограниченному протеолизу собственными протеолитическими ферментами организма.

4. Установлено, что наблюдаемое в тканях склеры и теноновой капсулы глаза при миопии нарушение нормального процессинга РЕОИ приводит к накоплению нерасщепленного белка в клетках фибробластов, сопровождающемуся образованием нерастворимых агрегатов.

5. Показано, что фибриллярные нерастворимые агрегаты, формируемые полноразмерным фактором РЕИР в тканях склеры и теноновой капсулы глаз пациентов, страдающих различными формами близорукости, имеют амилоидоподобную структуру.

6. Высказано предположение, подтвержденное рядом полученных данных, что амилоидоподобные фибриллярные структуры, состоящие из молекул нерасщепленного РЕОИ, способны разрушать клеточные мембраны фибробластов и выходить во внеклеточный матрикс, что приводит к нарушению формирования коллагеновых волокон, и, как следствие, к усилению миопического растяжения склеры.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи

1. Мннкевич H.H.. РакитинаТ.В., Богачук А.П., Радченко В.В., Морозова-Роше Л.А., Янамандра К., Иомдина E.H., Бабиченко И.И., |Костанян H.A.j Липкин В.М. Формирование амилоидоподобных фибриллярных структур и разрушение фибробластов теноиовой капсулы при прогрессирующей близорукости как следствие устойчивости фактора пигментного эпителия к ограниченному протеолизу. Биоорганическая химия, 2012, Т. 3 8, № 6, С. 683 -690.

2. Минкевич Н.И.. Липкин В.М., Костанян И.А. PEDF - неингибиторный серпин с нейропротекторной и антиангиогенной активностями. Ada naturae, 2010, Vol. 2, P. 74-84.

3. Минкевич Н.П.. Ковалева Е.В., Ракитина Т.В., Радченко В.В., Бабиченко И.И., Иомдина E.H., Костанян И.А. Патологическое фибриллообразование при прогрессирующей миопии. Современные проблемы науки и образования, 2008, № 6 (Электронный журнал, приложение "Биологические науки"), URL: http://online.rae.ru/225 (дата обращения 24.09.2012).

4. Иомдина E.H., Тарутга Е.П., Игнатьева Н.Ю., Костанян И.А., Минкевич Н.И.. Какуев Д.Л., Радченко В.В., Шехтер А.Б., Данилов H.A., Кварацхелия Н.Г., Чернышева С.Г. Фундаментальные исследования биохимических и ультраструктурных механизмов патогенеза прогрессирующей миопии. Российский офтальмологический журнал, 2008, Т. 1, С. 7-12.

Тезисы докладов на конференциях

1. Липкин В.М., Богачук А.П., Минкевич H.H.. Иомдина E.H., Курылева И.М., Бабиченко И.И., Костанян И.А. Изучение функциональной роли белков зрительной системы в патогенезе близорукости (миопии). Тезисы докладов V Российского симпозиума «Белки и пептиды», Петрозаводск, 8-12 августа 2011, с. 107.

2. Богачук А.П., Липкин В.М., Минкевич H.H.. Иомдина E.H., Курылева И.М., Костанян И.А. Изучение роли белков зрительной системы в патогенезе миопии и перспективы применения в клинической практике. Труды XIX Международной конференции и дискуссионного научного клуба "Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии". Украина, Гурзуф, 31 мая - 10 июня 2011 г, с. 231-232.

3. Липкин В.М., Минкевич H.H.. Ракитина Т.В., Какуев Д.Л., Бабиченко И.И., Иомдина E.H., Морозова-Рош Л.А., Костанян И.А. Изучение функциональной роли фактора из пигментного эпителия PEDF при развитии близорукости (миопии). Труды XVIII международной конференции и дискуссионного научного клуба «Новые информационные

технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии IT + М&Ес'2010», Украина, Крым, Ялта-Гурзуф, 31 мая -10 июня 2010, с. 97.

4. Иомдина Е.Н., Смирнова Т.С., Вахидова JI.T., Костанян И.А., Мипкевич Н.И. Патогенетические механизмы нарушений метаболизма соединительной ткани при прогрессирующей миопии. Тезисы докладов IX съезда офтальмологов России. Москва, 16-18 июня 2010, с.116.

5. Iomdina Е., Kostanyan I., Radchenko V., Kakuev D., Minkevich N.. Shekhter A., Tarutta E., Kvaratskhelija N. Derangement of Pigment Epithelium Derived Factor (PEDF) Activity in Progressive Myopia. EVER Congress, Portoroz, Slovenia, October 1-4 2008, Abstract book, P.70.

6. Iomdina E., Ignatieva N.. Shekhter A., Danilov N., Grokhovskaya T., Kostanyan I., Minkevich N.. Tarutta E., Kvaratskhelija N., Chernysheva S. Study of Tenon's capsule pathology in progressive myopia. Abstracts of XHth International Myopia Conference, Queensland, Australia, July 8-12 2008, P.35.

7. Мипкевич Н.И.. Ковалева E.B., Бабиченко И.И., Иомдина Е.Н., Лазук А.В., Костанян И.А. Является ли миопия одной из форм амилоидоза? III Российский симпозиум «Белки и пептиды», Москва-Пущино, 17-21 сентября 2007, тезисы докладов, С. 104.

8. Мипкевич Н.И.. Ковалева Е.В., Бабиченко И.И., Иомдина Е.Н., Костанян И.А. Является ли миопия формой амилоидоза? XIX Зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», Москва, 7-9 февраля 2007, тезисы докладов, С. 27.

9. Костанян И.А., Иомдина Е.Н., Мипкевич Н.И.. Жохов С.С., Смирнова И.В., Лазук А.В. Нарушение ограниченного протеолиза фактора дифференцировки пигментного эпителия в тканях теноновой капсулы у детей с прогрессирующей близорукостью. Труды XIV международной конференции и дискуссионного научного клуба «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии 1Т+М&Ес'200б», Украина, Крым, Ялта-Гурзуф, 31 мая-9 июня 2006, с.277-278.

Подписано в печать: 05.03.2013

Заказ № 8220 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Минкевич, Наталья Игоревна, Москва

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской Академии Наук

На правах рукописи

04201354941

Минкевич Наталья Игоревна

РОЛЬ РЕБЕ В ОБРАЗОВАНИИ ФИБРИЛЛЯРНЫХ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ СТРУКТУР ПРИ МИОПИИ

03.01.03 - Молекулярная биология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители:

кандидат химических наук [Костанян Ирина Александровна

член-корреспондент РАН, доктор химических наук, профессор Липкин Валерий Михайлович

Москва, 2013

Оглавление

ВВЕДЕНИЕ....................................................................................................................................5

1. ФАКТОР ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ ПИГМЕНТНОГО ЭПИТЕЛИЯ: ОСОБЕННОСТИ СТРУКТУРЫ, БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ И УЧАСТИЕ В МЕТАБОЛИЗМЕ

(Обзор литературы).......................................................................................................................7

1.1. Введение..................................................................................................................................8

1.3. Структура РЕБР и кодирующего его гена.........................................................................10

1.3.1. Ген РЕБР человека............................................................................................................10

1.3.2. Пространственная структура молекулы РЕБР...............................................................11

Расположение поверхностных зарядов.....................................................................................11

1.3.3. РЕБР - член семейства неингибиторных серпинов.....................................................17

1.3.4. Степень фосфорилирования молекулы РЕБР влияет на его антиангиогенную и нейротрофную активности.........................................................................................................19

1.3.5. Внутриядерная локализация РЕБР..................................................................................22

1.3.6. Распространенность и эволюционная консервативность фактора РЕБР....................24

1.4. Эффекты, оказываемые РЕБР на клетки и ткани различного происхождения..............26

1.4.1. Дифференцирующее действие РЕБР и его влияние на метаболизм раковых клеток 26

1.4.2. Нейропротекторное действие РЕБР................................................................................28

1.4.3. Антиангиогенное действие РЕБР....................................................................................30

1.4.4. Проапоптотическая активность РЕБР.............................................................................32

1.4.5. РЕБР как перспективный терапевтический агент..........................................................36

1.5. Рецепторы РЕБР...................................................................................................................37

1.5.1. РЕБР-Я...............................................................................................................................37

1.5.2. Ламининовый рецептор....................................................................................................40

1.5.3 Взаимодействие с Р1-АТР синтазой.................................................................................42

2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.........................................................................................45

2.1. Введение................................................................................................................................46

2.2. Тенонова капсула как объект для прижизненного исследования патологии склеры....47

2.3. Различное содержание изоформ фактора РЕБР в тканях близоруких людей и в тканях контрольной группы....................................................................................................................49

2.4. РЕБР45 является продуктом деградации РЕБР50............................................................54

2.5. В тканях миопических глаз РЕБР устойчив......................................................................57

к ограниченному протеолизу собственными ферментами организма.............. .....................57

2.6. Мутационные замены не являются причиной устойчивости PEDF к ограниченному

протеолизу....................................................................................................................................60

2.7. В теноновых капсулах миопических глаз часть PEDF присутствует в водонерастворимом состоянии..................................................................................................60

2.8. Иммуногистохимические исследования образцов тканей склеры и теноновой капсулы.

63

2.9. Полноразмерная изоформа рекомбинантного PEDF........................................................64

является малорастворимой.........................................................................................................65

2.10. PEDF-(44-418) является амилоидогенным белком..........................................................68

3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.......................................................................................72

3.1. Материалы.............................................................................................................................73

3.1.1. Реактивы.............................................................................................................................73

3.1.2. Сорбенты............................................................................................................................74

3.1.3. Антитела и адьюванты......................................................................................................74

3.1.4. Ферменты...........................................................................................................................74

3.1.5. Штаммы, клеточные линии и плазмидные векторы......................................................75

3.1.6. Наборы готовых реактивов...............................................................................................75

3.1.7. Микробиологические среды и буферы............................................................................76

3.2. Методы..................................................................................................................................79

3.2.1. Сбор клинического материала.........................................................................................79

3.2.2. Выделение и очистка белковых препаратов...................................................................79

3.2.3. Определение концентрации белка...................................................................................80

3.2.3.1. Метод Лоури-Фолина.....................................................................................................80

3.2.3.2. Метод Бредфорд.............................................................................................................80

3.2.4. Получение поликлональных антител к пептидным фрагментам PEDF.......................81

3.2.4.1 Иммунизация подопытных животных...........................................................................81

3.2.4.2 Очистка поликлональных антител.................................................................................81

3.2.5. Денатурирующий электрофорез белков в полиакриламидном геле............................82

3.2.6. Вестерн-блоттинг..............................................................................................................82

3.2.6. 1. Электроблоттинг белков...............................................................................................82

3.2.6.2 Определение иммуно-реактивных белков....................................................................83

3.2.7. Количественное определение PEDF................................................................................84

3.2.8. Иммуногистохимические исследования.........................................................................85

3.2.9. Поиск мутационных замен в генеpedf............................................................................87

3.2.9.1. Получение кДНК PEDF.................................................................................................87

3.2.9.2. Полимеразная цепная реакция......................................................................................87

3.2.9.3. Лигирование....................................................................................................................88

3.2.9.4. Приготовление компетентных клеток Е. coli...............................................................88

3.2.9.5. Трансформация компетентных клеток Е. coli..............................................................88

3.2.9.6. Отбор рекомбинантных клеток при помощи ПЦР......................................................89

3.2.9.7. Выделение плазмиды.....................................................................................................89

3.2.9.8. Определение нуклеотидных последовательностей.....................................................89

3.2.10. Получение рекомбинантного PEDF...............................................................................90

3.2.10.1 Клонирование PEDF......................................................................................................90

3.2.10.2 Наработка PEDF в бакуловирусной системе..............................................................90

3.2.10.3 Контроль экспрессии рекомбинантных белков..........................................................91

3.2.10.4. Выделение рекомбинантных белков из клеток насекомых......................................91

3.2.11. Атомно-силовая микроскопия PEDF.............................................................................92

3.2.12. Дот блот анализ...............................................................................................................93

4. ВЫВОДЫ.................................................................................................................................94

5. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.....................................................................................................96

6. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.......................................................................................................99

ВВЕДЕНИЕ

Близорукость, или миопия, является всемирно распространенным глазным заболеванием, охватывающим все возрастные группы пациентов. Прогрессирование миопии в первую очередь связано с поражением соединительно-тканной капсулы глаза -склеры, чья опорная функция, морфологическая структура и биохимические показатели при миопии существенно нарушаются. Процесс деградации внеклеточного матрикса склеры, сопровождающий развитие заболевания, является предметом исследования ученых, как важнейший для понимания этиологии близорукости и возможностей предотвращения и лечения этого заболевания.

PEDF (pigment epithelium-derived factor), отнесенный к семейству неингибиторных серпинов, является мультифункциональным регуляторным фактором, одним из наиболее важных для нормального развития и функционирования тканей глаза. К числу его биологических активностей относятся протекторное воздействие на нейроны сетчатки, антиангиогенная активность, дифференцирующее воздействие на клетки пигментного эпителия. PEDF принимает участие в регуляции клеточного цикла и апоптоза. Внимание ученых привлекает его возможное участие в широком спектре патологических процессов, в том числе сопровождающих развитие ряда глазных заболеваний.

Основным источником PEDF в глазу являются клетки пигментного эпителия и сетчатки, однако некоторое его количество также вырабатывается фибробластами склеры. Сравнительно с клетками пигментного эпителия, фибробласты склеры как продуценты PEDF являются значительно менее изученным объектом. Исследования фактора PEDF, вырабатываемого фибробластами миопической склеры, представляются актуальными и важными, особенно в свете их возможного вклада в понимание патологии развития близорукости.

Данная работа является частью исследований, проводимых в ИБХ им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН в рамках идентификации и структурно-

функциональных исследований новых белков, участвующих в патогенезе ряда социально-значимых заболеваний, и разработки на их основе подходов для диагностики и лечения этих заболеваний. Цель работы состояла в изучении особенностей и выявлении возможных нарушений метаболизма молекулы PEDF при прогрессирующей близорукости.

Выражаю глубочайшую признательность моим научным руководителям, кандидату химических наук И.А. Костанян и заведующему лабораторией белков гормональной регуляции, доктору химических наук, профессору В. М. Липкину за постоянное внимание, обучение, помощь в профессиональном росте и направление в работе.

Искренне благодарю доктора биологических наук E.H. Иомдину за предоставленный экспериментальный материал и ценнейшую медицинскую информацию, доктора медицинских наук, профессора И.И. Бабиченко за проведение иммуногистохимических исследований и консультирование в вопросах гистологии, и доктора физико-математических наук, профессора JI.A. Морозову-Рош за проведение атомно-силового микроскопирования образцов рекомбинантного PEDF.

За неоценимую помощь в исследованиях и оформлении диссертации искренне благодарю кандидата химических наук Т.В. Ракитину и Д.Л.Какуева, глубоко признательна коллективу лаборатории белков гормональной регуляции ИБХ РАН за теплую дружественную обстановку, помощь и поддержку в работе.

Безмерную благодарность за терпение и поддержку во всем выражаю моей семье, внесшей огромный вклад в мое становление как исследователя и сделавшей возможным завершение этой работы.

Также благодарю кандидата химических наук И.Л. Родионова за синтез пептидных фрагментов PEDF.

1. ФАКТОР ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ ПИГМЕНТНОГО ЭПИТЕЛИЯ: ОСОБЕННОСТИ СТРУКТУРЫ, БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ И УЧАСТИЕ В МЕТАБОЛИЗМЕ

(ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

1.1. Введение

Фактор PEDF, впервые идентифицирований в культуральной среде клеток пигментного эпителия сетчатки глаза, представляет собой мультифункциональный гликопротеин, экспрессируемый практически всеми типами тканей млекопитающих и птиц, и эволюционно консервативный среди позвоночных. На основании первичной и третичной структуры белка и структуры соответствующей ему кДНК фактор классифицирован как неингибиторный серпин. К числу основных функций PEDF относятся: а) дифференцирующее действие, оказываемое на разнообразные эмбриональные и раковые клетки, б) протекторное действие на зрелые нейроны и другие клетки нейронального происхождения, в) антиангиогенная активность, угнетение формирования новых сосудов. Кроме того, PEDF обладает противовоспалительным эффектом, а также проапоптотическим действием на эндотелиальные и раковые клетки.

1.2. Идентификация фактора PEDF в различных типах клеток.

Фактор дифференцировки пигментного эпителия (Pigment Epithelium-Derived Factor, PEDF) был впервые идентифицирован в 1989 году группой американских исследователей под руководством L.V. Johnson в культуральной среде клеток пигментного эпителия сетчатки глаза, выделенных из плода человека [1,2]. При изучении действия этой среды на клетки ретинобластомы линии Y-79 было обнаружено, что она вызывает остановку неограниченного роста и деления этих клеток. При этом более 90% клеток приобретают морфологические и биохимические характеристики зрелых нейронов [1]. С помощью электрофоретических и хроматографических методов из культуральной среды выделили белок с молекулярной массой около 50 кДа, обладающий указанным действием на клетки Y-79. Он получил название PEDF (pigment epithelium-derived factor) - фактор, выделенный

из пигментного эпителия. Как было установлено позднее, РЕОР человека состоит из одной полипептидной цепи, содержащей 418 а.о. (рис. 1) [3].

1 М0АЬУЪЬЬС1САЬЬСНЗЗС<2 20

21 ЫРАИРРЕЕС, I: ; ОЗТСАЬУИИреекуружьаааузыесуЯЬУКУКЗ 70

71 ЗМ5РТТМуЬЬЗРЬЗУАТАЪЗАЪЗЬСА0ЕКТЕ311ННАЪУУОЫгЗРО1НС 120

121 ■УКЕЬЬОТУТАРО1НЪИЗАЗ11УЕЕИЪ11КЗЗЕУАРЕЕКЗУСТ|Р1УЬТ 170

171 СЫРКЬОЪОЕ1ЫЫМУОАОМ|С|ЬА|ЗТ|Е1РОЕ131ЬЬЬСУА|Е|СОИУТК 220

221 ЕОЗККТ|ЪЕОЕУЪОЕЕКТУКУРММЗБРКАУЬКУСЪ§3|ЬЗСК1АОЪРЬТС 270

271 ЗМЗИЕЕЪРЪКУТО|ЩЫНЗЪТЗ|Е1Н|1|Р|ЪКТУОАУЬТУРКЪКЬЗ 320

321 УЕСЕУТКЗЬОЕМКЪОЗЬЕОЗРОЕЗК1ТСКР1КЬТОУЕНКАСЕЕ№ЫЕОСА^ 370

371 ТТРЗРСЬОРАН^Т1ЕРЬОУНЬ№РЕ1ЕУЪРОТОТСАЬЬЕ1СК1ЕОРКСР 418

Рисунок 1. Аминокислотная последовательность фактора РЕОР. Выделены: желтым фоном - серпиновая петля; голубым - сайт 1Ч-гликозилирования; зеленым - пептид, ответственный за антиангиогенную функцию, сиреневым — пептид, ответственный за нейротрофную функцию; серым - сайты фосфорилирования; синим - кластер отрицательно, коричневым -положительно заряженных аминокислот. Подчеркнуты и выделены жирным шрифтом сигналы внутриядерной локализации, жирным красным шрифтом и рамкой выделена связь

Ь382_Т383 [4_12].

Практически одновременно РЕОР был выделен из культуры легочных фибробластоподобных клеток человека линии \VI-38 [13]. Был также обнаружен его мышиный аналог, каспин [14]. Степень гомологии кДНК РЕОР и каспина составляет 82,7%, их аминокислотных последовательностей - 85,6%.

К настоящему времени известно, что РЕОР экспрессируется почти во всех тканях млекопитающих и птиц и выполняет множество функций. К их числу относятся: дифференцирующее действие на эмбриональные и опухолевые клетки: протекторное действие на зрелые нейроны и другие клетки, входящие в состав нервной ткани;

антиангиогенная активность - угнетение формирования новых сосудов. Поэтому данный белок представляет большой интерес как регуляторный фактор развития клеток и тканей.

1.3. Структура PEDF и кодирующего его гена

1.3.1. Ген PEDF человека

Ген pedf человека является единственным в геноме и локализован в коротком плече хромосомы 17 на его дистальном участке - 17р13.3 [15, 16]. Он имеет длину около 16 т.п.н. и включает в себя 8 экзонов, разделенных 7 интронами. Экзон-интронные контакты подчиняются консенсусному правилу AG/GT. Длина экзонов варьирует от 92 до 377 п.н. Промоторный регион гена расположен в 5'-фланкирующей области; при этом СААТ блок находится в позиции -43 относительно точки инициации транскрипции. В 5'-концевой области гена pedf, вплоть до -5 т.п.н., находится кластер Alu-повторов, включающий 8 полных и 3 частичных Alu-элемента. Ген наследуется по доминантно-рецессивному механизму [17].

Ген pedf кодирует последовательность из 418 а.о. (рис. 1) [3]. В N-концевой части

PEDF, сразу после инициаторного метионина, находится 17-членный гидрофобный участок

с последовательностью, характерной для сигнального фрагмента, обеспечивающего

секрецию белка из клетки [3, 18]. Однако последовательность зрелого PEDF,

21

секретируемого из клеток-продуцентов, начинается с позиции Asn ; в соответствии с этим, зрелая полипептидная цепь содержит 398 а.о. [19, 20].

1.3.2. Пространственная структура молекулы PEDF.

Расположение поверхностных зарядов

Зрелая молекула фактора представляет собой единый полипептид, организованный в асимметричную глобулу с радиусом <3,05 нм. Около 60% а.о. PEDF формируют десять а-спиралей и три (3-слоя (рис. 2). В положениях Ser24, Ser114 и Ser227 находятся сайты фосфорилирования [4]. Посттрансляционные модификации PEDF включают N-концевой остаток пироглутаминовой кислоты, образующийся в результате дезаминирования остатка Gin , и канонический сайт N-гликозилирования -Asn-Leu-Thr- в положениях 285-287. Согласно картам Фурье, присоединение первого компонента полисахаридной цепочки, N-ацетилглюкозамина, идет к остатку Asn . Присоединяемые полисахаридные структуры гетерогенны и имеют молекулярный вес около 4 кДа; их наличие объясняет разницу между