Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Рецептор фактора роста эндотелия сосудов второго типа

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Рецептор фактора роста эндотелия сосудов второго типа"

На правах рукописи

005533751

Корчагина Анна Александровна

Рецептор фактора роста эндотелия сосудов второго типа (получение рекомбпнантпого препарата, моноклональных антител и системы направленного транспорта)

03.01.04 - Биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 6 СЕН 2013

Москва 2013

005533751

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства Здравоохранения Российской Федерации, в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Государственный научный центр социальной и судебной психиатрии имени В.П. Сербского» Министерства Здравоохранения Российской Федерации.

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН, Чехонин Владимир Павлович

Официальные оппоненты:

Парфенова Елена Викторовна

доктор медицинских наук, профессор, ИЭК ФГБУ «РКНПК» МЗ РФ, зав. лабораторией

Ярыгин Константин Никитич

доктор биологических наук, профессор, член корреспондент РАМН, ФГБУ «ИБМХ» РАМН, зав. лабораторией

Ведущее учреяедение: ФГБУН «Научно-исследовательский институт физико-химической медицины Федерального медико-биологического агентства».

Защита состоится «17» октября 2013 г. в 1500 часов на заседании Диссертационного Совета Д 001.010.01 при ФГБУ «Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича» РАМН по адресу: 119121, Москва, ул. Погодинская, д. 10, стр.8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «ИБМХ» РАМН Автореферат разослан « » сентября 2013 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета - £

кандидат химических наук

~~ Карпова Е.А.

Актуальность

Важнейшим фактором прогрессии и роста солидных опухолей является неопластический ангиогенез, ключевую роль в регуляции которого играет фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) и его рецептор II типа (VEGFR2) [Tong R.T. et al., 2004, Baeriswyl V. et al., 2009, Sia D et al., 2013]. VEGFR2 является основным медиатором VEGF-опосредованной трансдукции сигнала в эндотелиальных клетках [Carmeliet P. et al., 2000] как при физиологическом, так и при патологическом ангиогенезе [Hicklin D.J. et al., 2005, Shibuya M., 2008, Silva S.R. et al., 2011]. Во взрослом организме рецептор экспрессируется эндотелиальными клетками кровеносных сосудов, эндотелиальными прогениторными клетками, мегакариоцитами и гаматопоэтическими клетками. Кроме того, показано увеличение экспрессии VEGFR2 малигнизированными клетками различных типов солидных опухолей [Kranz A. et al., 1999, Dales J.P. et al., 2004, Seto T. et al., 2006, Ghosh S. et al., 2008, Smith N.R. et al., 2010, Sia D. et al., 2013]. Все больше появляется данных, что интенсификация синтеза VEGFR2 ведет к повышению выживаемости опухолевых клеток в условиях постоянной гипоксии и является одной из причин развития химиорезистентности и образования более агрессивного фенотипа опухолей [Calvani et al., 2006, Yang F. et al., 2011, Chatterjee S. et al., 2013]. Поэтому VEGFR2, как основной рецептор трансдукции проангиогенного сигнала, может рассматривается в качестве перспективной молекулярной мишени не только для антиангиогенной терапии, но также как вектор для селективного транспорта наноразмерных систем в малигнизированную ткань [Motzer R.J. et al, 2006, de Bouard S. et al., 2007, Zhou J. etal., 2012, WickiA. etal., 2012].

Исследования ингибиторов VEGFR2, действие которых направлено на подавление пролиферации, миграции и выживаемости эндотелиоцитов, и приводящее к регрессии сосудистой сети, снижению плотности и диаметра сосудов, нарушению их проницаемости и замедлению роста опухоли, формируют новое научное направление патогенетической терапии опухолей [Miletic H. et al., 2009, Norden A.D. et al., 2009, Wang F. et al., 2011]. В настоящее время целый ряд ингибиторов VEGFR2 проходит клинические испытания, включая препарат на основе моноклональных антител к экстраклеточному фрагменту VEGFR2 (рамуцирумаб) [SpratlinJ. etal., 2011, Clarke J.M.etal., 2013].

Несмотря на многообещающие результаты преклинических исследований, эффективность антиангиогенных препаратов в клинике оказывается существенно ниже, особенно в случае терапии опухолей мозга. Малигнизированные клетки обладают высокой устойчивостью и способностью быстро адаптироваться, поэтому для повышения

эффективности противоопухолевой терапии должны разрабатываться новые стратегии селективной терапии [Shojaei F. etal., 2008, Bikfaivi A. etal., 2011, Liu W. etal., 2011].

В последнее время исследуются возможности применения VEGFR2 в качестве молекулярного вектора для направленной доставки контейнерных систем, загруженных терапевтическими или диагностическими препаратами. Известно, что неопластические сосуды имеют ряд структурных и функциональных особенностей: хаотичный характер ветвления, многочисленные петли, переплетения, слепые отростки, отсутствие структурированности, малое количество окружающих перицитов и высокую проницаемость сосудистой стенки [Nagy J.A. et al., 2002, Jain R.K. et al„ 2005, Nagy J.A. et al., 2009]. Более того, в случае опухолей головного мозга имеет место выраженное нарушение структуры гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) [Caraglia М. et al., 2012, Chacko A.M. et al., 2013]. Такие структурные особенности сосудистой сети можно использовать для избирательной доставки наноразмерных контейнеров в опухолевую ткань. Так, было продемонстрировано повышение эффективности терапии и доставки лекарственных препаратов с использованием липосомальных систем, загруженных доксорубицином и конъюгированных с aHTH-VEGFR2 антителами на мышиных моделях рака молочной железы и колоректального рака [Wicki A. et al., 2012]. Тем не менее аспекты использования моноклональных антител к VEGFR2 для доставки наноконтейнеров в опухоли мозга и изучение селективности их распределения в малигнизированной ткани остаются неизученными.

Цель работы: Изучить эффекты моноклональных антител к рекомбинантному экстраклеточному фрагменту рецептора второго типа фактора роста эндотелия сосудов на миграцию клеток в монослойных культурах и перспективы их применения для разработки контейнерных систем направленного транспорта диагностических и лекарственных препаратов в клетки-мишени глиом.

Задачи:

1. Получить штамм-продуцент, высокоэффективно продуцирующий рекомбинантный экстраклеточный фрагмент VEGFR2 рецептора.

2. Получить гибридому, продуцирующую моноклональные антитела к VEGFR2, провести иммунохимическую характеристику полученных антител.

3. Разработать метод количественного лиганд-рецепторного анализа VEGFR2.

4. Исследовать влияние моноклональных антител к VEGFR2 на миграцию клеток культуры глиомы Сб.

5. Оценить селективность накопления векторных наноконтейнерных систем на основе моноклональных aHTH-VEGFR2 антител в опухолевых клетках.

Научная новизна:

Выявлена способность моноклональных антител к VEGFR2 ингибировать миграцию глиомных клеток в тесте повреждения монослоя клеток глиомы С6 (wound healing test).

В ходе исследования показано свойство моноклональных aHTH-VEGFR2 антител повышать эффективность и специфичность накопления векторных наногелей на основе ПЭГ-б-ПМАК клетками культуры глиобластомы человека U87-MG и глиомы Сб.

На интракраниальной модели глиомы впервые продемонстрирован эффект захвата и накопления векторных наногелей, конъюгированных с моноклональными aHTH-VEGFR2 антителами клетками глиомы С6 при системном введении.

Установлена способность полученного рекомбинантного экстраклеточного фрагмента VEGFR2i.ni взаимодействовать с лигандом в лиганд-рецепторном иммуноблот-анализе и разработана высокоселективная система лиганд-рецепторного анализа для количественного определения VEGFR2.

Практическая значимость:

Разработанный лиганд-рецепторный анализ на основе метода непрямого твердофазного иммуноферментного метода может быть рекомендован в качестве системы для количественного определения растворимых форм VEGFR2 рецептора в биологических жидкостях.

Разработанная векторная наноконтейнерная система на основе моноклональных антител, конъюгированных с наногелями, может применяться для повышения эффективности терапии и диагностики онкологических заболеваний в эксперименте.

Положения, выносимые на защиту

1. Иммунизация мышей рекомбинантным препаратом VEGFR2i ш позволяет получать гибридные клетки, продуцирующие высокоаффинные моноклонапьные aHTH-VEGFR2| п1 антитела.

2. Миграция глиомных клеток в тесте повреждения монослоя глиомы С6 {wound healing test) ингибируется моноклональными aHTH-VEGFR2 антителами.

3. Клетки глиомы С6 способны захватывать и накапливать векторные наногели, конъюгированные с моноклональными aHTH-VEGFR2 антителами при системном введении.

Апробация диссертационной работы

Основные положения диссертационной работы были представлены и обсуждены на XXVIII (91-й) СЕССИИ ОБЩЕГО СОБРАНИЯ РАМН (4-5 июня 2013 г.); Межлабораторных конференциях ФГБУ «ГНЦ ССП им. В.П. Сербского», Москва, 20112013; Международной Пироговской научной медицинской конференции студентов и молодых ученых, Москва, 2011-2013.

Первичная экспертиза диссертации произведена на совместной научно-практической конференции коллектива сотрудников кафедры и отдела медицинских нанобиотехнологий медико-биологического факультета ГБОУ ВПО «Российского Национального Исследовательского Медицинского Университета имени Н.И. Пирогова» Минздрава Российской Федерации и сотрудников отдела фундаментальной и прикладной нейробиологии ФГБУ «ГНЦ ССП им. В.П. Сербского» 12 июля 2013 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ, из них пять - статей в журналах, рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, четырех глав, выводов и библиографического указателя. Работа изложена на 120 страницах машинописного текста, содержит 1 таблицу, 1 схему и 28 рисунков. Список литературы включает 6 отечественных и 239 иностранных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы

Получение экстраклеточного фрагмента VEGFR2nn. Последовательность ДНК, кодирующая внеклеточный фрагмент VEGFR2 рецептора (900 пар нуклеотидов с I-III Ig-подобные домены), была синтезирована из кДНК библиотеки мозга человека («Invitrogen», США) при помощи полимеразной цепной реакции с использованием специфических олигонуклеотидных праймеров с введенными сайтами рестрикции EcoRI и Xhol. Затем кДНК клонировали в экспрессирующие векторы рЕТ32а и рЕТ28а по сайтам рестрикции EcoRI и Xhol. Ориентацию клонированного гена в плазмидном векторе анализировали методом секвенирования («Евроген», Россия).

Клетки штаммов E.coli BL21(DE3), Rosetta(DE3) трансформировали плазмидными векторами pET32a/TRX-VEGFR2i.m, pET28a/VEGFR2un. Культуру клеток выращивали в среде Лурия-Бертани с добавлением антибиотиков для pET32a/TRX-VEGFR2i_m

ампициллин, в случае pET28a/VEGFR2i-m - канамицин, при использовании штамма Rosetta(DE3) в среду добавляли хлорамфеникол. Для индукции синтеза рекомбинантного белка к клеткам добавляли ИПТГ до конечной концентрации 1 мМ при достижении оптической плотности (Юбоо=0,8. После 4-х часов индукции клетки осаждали центрифугированием, затем лизировали добавлением лизирующего буфера с 6 М гуанидин гидрохлоридом при рН=8,0 к клеточному осадку. Рекомбинантный белок очищали от растворенных телец включения с помощью металлохелатной хроматографии на Ni2+-NTA агарозе как в денатурирующих, так и в гибридных условиях согласно протоколу фирмы Irrvitrogen. Иммунохимическую характеристику полученного препарата VEGFR2i.ni осуществляли с использованием коммерческих антител к экстраклеточному фрагменту VEGFR2 рецептора («Sigma», США) методом иммуноблот-анализа.

Метод лиганд-рецепторного анализа. Рекомбинантый препарат VEGFR2 или VEGF/trx (0,6 мкг/лунка) иммобилизовали в лунках полистиролового 96-луночного планшета («Corning», США) в 0,05 М натрий-карбонатном буфере (pH 9,6, 0,05 М ЫагСОз, 0,05 М №НСОз) в течение 10 часов при 4°С. Рекомбинантный VEGF ранее был получен и любезно предоставлен Леопольд A.B. [Леопольд A.B. и др., 2011]. После каждой стадии инкубации полистироловый планшет троекратно промывали рабочим буфером (фосфатный буфер с добавлением 0,2% Твина-20 и 0,2% Тритона Х-100 рН=7,4, содержащий на 1 литр: 8 г NaCl, 0,2 г KCl, 1,44 г Na2HP04, 0,24 г КН2РО4). Для блокирования неспецифических сайтов связывания в лунки вносили 5% раствор БСА (бычий сывороточный альбумин) и инкубировали 40 минут, после чего промывали. Затем в лунки с иммобилизированным рецептором добавляли VEGF/trx, и, наоборот, в лунки с иммобилизированным VEGF добавляли рекомбинантный VEGFR2hh в равных концентрациях 600 нг/мл и титровали до 0,6 нг/мл соответственно. В качестве положительного контроля в лунки с VEGF добавляли коммерческие антитела к VEGF («Sigma», США), а в лунки с VEGFR2i.ni антитела к VEGFR2 («Sigma», США). Инкубацию проводили в течение 2 часов при комнатной температуре на шейкере, далее отмывали рабочим буфером три раза. После чего в лунки с иммобилизированным VEGF/trx вносили первичные антитела к VEGFR2 в разведении 1:1000, а в лунки с иммобилизированным рецептором вносили антитела к VEGF в разведении 1:2000. Инкубировали при комнатной температуре в течение часа. Детекцию межмолекулярного взаимодействия осуществляли препаратом козьих антител к IgG мыши, конъюгированными с пероксидазой хрена в разведении 1:10000 («Sigma», США), и тетраметилбензидином («Amresco», США).

Получение моноклональных антител. Получение моноклональных антител проводили по методике Köhler и Milstein в нашей модификации [Чехонин В.П., и др., 2001]. Самок мышей линии Balb/c иммунизировали очищенным препаратом рекомбинантного VEGFR2mh (25 мкг) с полным адъювантом Фрейнда («Difco laboratories», США). Схема иммунизации состояла из двух циклов, каждый из которых включал четыре подкожных введения антигена (1 раз в 10 дней) и заключительное интраперитонеальное введение. Слияние спленоцитов проводили с клетками миеломной культуры SP2/0-Agl4, дефектными по ферменту гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрансферазе (ГГФРТ) с использованием полиэтиленгликоля 3,0003,700 («Sigma», США). Полученные клетки выращивали на селективной среде с добавлением гипоксантина, аминоптерина и тимидина в течение двух недель, что позволило элиминировать клетки SP2/0-Agl4 и сохранить гибридные. Гибридные клетки культивировали в ростовой среде RPMI-1640 с содержанием 1% 100 мМ пирувата натрия, 1% 200 мМ L-глутамина, 1% антибиотика-антимикотика (пенициллин 10000 ед/мл, стрептомицин 10000 мкг/мл и амфотерицин В 25 мкг/мл) и 10% сыворотки новорожденных телят.

Константа аффинности антител. Константу аффинности антител при связывании с рекомбинантным VEGFR2 определяли по методу Битти непрямым твердофазным ИФА [Beatty J.D. etal., 1987] по формуле:

где: [Ag] - посадочная концентрация антигена с большим значение; [Ag'] -посадочная концентрация антигена с меньшим значением; [АЬ] — равновесная концентрация антител при концентрации антигена [Ag]; [АЬ'] - равновесная концентрация антител при концентрации антигена [Ag'].

Исследование биологической активности антител. Клеточный монослой культуры С6 нарушали и измеряли начальную площадь повреждения, свободную от клеток. Затем вносили препараты антител в концентрации 10 мкг/мл: aHTH-VEGFR2 антитела, анти-VEGFRl антитела, авастин, неспецифические антитела мыши класса IgG. Через 9 часов регистрировали степень восстановления монослоя в месте повреждения, применяя программный пакет «Leica LAS AF», т.е. определяли оставшуюся площадь повреждения и рассчитывали процент свободной области через 9 часов относительно первоначальной. Расчеты, построение диаграмм и статистический анализ проводили с использованием пакета «Microsoft Excel 2010».

К,

aff 2(п[ЛЬ']-[АЬ])

п-1

Синтез наногелей, конъюгация с векторными группами. Первая стадия заключается в самоорганизации цепей полиэтиленгликоль-б-полиметакриловой кислоты (ПЭГ-б-ПМАК) в блок-иономерный комплекс (БИК) в присутствии ионов двухвалентных металлов. Блок-иономерные комплексы ПЭГ-б-ПМАК и Са2+ были образованы путем добавления к водному раствору блок-сополимера 0,1 М раствора СаСЬ при рН 8,0. Далее в ядро БИК вводились ковапентные сшивки между карбоксильными группами полиметакриловой кислоты и аминогруппами 1,2-этилендиамина в присутствии водорастворимого карбодиимида [Nukolova N.V. et al., 2011]. Ионы металла удаляли хелатированием с ЭДТА и последующим диализом против воды. Полученные наногели метили флуоресцеинизотиоцинатом (ФИТЦ). Формирование наноразмерных комплексов подтверждали методами динамического рассеяния света.

Конъюгацию полученных антител осуществляли через линкер ИНг-ПЭГ-МАЛ. Тиолирование антител проводили по известной методике [Hermanson G.T., 2008]. Активированные антитела инкубировали с N1Ь-ПЭГ-МАЛ в фосфатном буфере в течение 10 ч при 4°С. Затем активировали карбоксильные группы наногелей 10 экв. КДИ и N-гидроксисукцинимида (NHS) в течение 10 мин при рН 5,5 и комнатной температуре, затем очищали от побочных продуктов реакции гель-фильрацией (Sephadex G25 «Sigma», США). Активированные наногели смешивали с антителами в фосфатном буфере (на 1 литр: 8 г NaCl, 0,2 г КС1, 1,44 г Na2HP04, 0,24 г КН2Р04, рН 7,4), и реакционную смесь перемешивали при 4°С в течение ночи. Конъюгаты наноконтейнеров с антителами очищали методом гель-хроматографии на колонке (3x50 см, Sepharose CL-6B, 1 мл/мин), оснащенной УФ-детектором (280 нм).

Анализ накопления наногелей клетками культур С6 и U87-MG in vitro. Клетки культуры С6 и U87-MG фиксировали 4% параформальдегидом (рН 7,4) в течение 30 мин при комнатной температуре, после чего оставляли в рабочем буфере на 10 часов при 4°С. Далее клетки отмывали фосфатным буфером и вносили образцы флуоресцентно-меченых наноконтейнеров (ФИТЦ-наногель). Для анализа специфического накопления анти-VI:GFR2-naHore.ieii за счет связывания презентированного антигена моноклональными антителами эксперимент проводили на трех модификациях наноконтейнеров: наногели, конъюгированные с полученными моноклональными антителами к VEGFR2 (анти-УЕОР112-наногели), наногели, конъюгированные с неспецифическими иммуноглобулинами мыши (IgG-наногели), наногели без конъюгации с антителами. Перед внесением препараты наногелей нормировали по концентрации ФИТЦ на планшетном анализаторе Victor ХЗ («PerkinElmer», США) фильтры 485/535. Инкубировали образцы в течение 1 часа и трехкратно промывали фосфатным буфером.

7

Анализ накопления и распределения наногелей в глиоме in vivo. Эксперименты проводили на самках крыс породы Wistar (3 месяца, 250 г) со стереотаксически имплантированной глиомой С6 по описанной методике [Чехонин В.П. и др, 2007]. Препараты флуоресцентно-меченых наноконтейнеров (анти-УЕОЕ112-наногели, IgG-наногели и наногели) нормировали по концентрации ФИТЦ и вводили в бедренную вену на 16-е сутки после имплантации опухоли. Иммунохимическую активность векторных наногелей (анти-УЕОРК2-наногсли) исследовали методами твердофазного ИФА и на клетках культуры С6 и U87-MG in vitro перед инъекцией. Через 48 ч проводили трансаортальную перфузию мозга 4% параформальдегидом и готовили срезы (30 мкм). Для визуализации астроглиального вала срезы мозга докрашивали поликлональными антителами к GFAP (Alexa Fluor 594). Флуоресцентный анализ накопления проводили на инвертированном микроскопе DMI 6000 («Leica», Германия) и конфокальном сканирующем микроскопе AIR MP («Nikon», Япония).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

Получение экстраклеточного фрагмента VEGFR2

В результате клонирования кДНК VEGFR2[-m в векторы рЕТ32а и рЕТ28а были получены две экспрессирующие конструкции с геном VEGFR2i_m (рис. 1). Электрофоретический анализ экспрессии рецептора VEGFR2i.ni в ДСН-ПААГ показал, что наибольший уровень экспрессии белка, равно как и наибольший выход белка в обоих случаях, наблюдался в штамме E.coli Rosetta(DE3): в конструкции pET32a/TRX-VEGFR2i. in выход белка составил 13±2 мг/мл, в то время как выход белка в конструкции рЕТ28а составил 1±0,3 мг/мл, поэтому в дальнейшем для экспериментов использовали VEGFR2, полученный в рЕТ32а. Выделенный VEGFR2i_m с помощью металлохелатной аффинной хроматографии на Ni2+-NTA агарозе показал, что полученный препарат выделяется практически без примеси бактериальных белков и соответствует рассчитанной молекулярной массе 50 кДа (рис. 2, Б)

Amp ^

"г

Стоп-кодон

6490bp pET32a/VEGFR2

/

Стоп-кодон

pET28a/VEGFR2

)

Рисунок 1. Схематическое изображение используемых в работе экспрессионных конструкций. (А) В экспрессионный вектор рЕТ32а была клонирована последовательность VEGFR2i.ni с 46-320 а.о. на 1М-терминальном конце с последовательностью белка-слияния тиоредоксина. (Б). В экспрессионном векторе рЕТ28а с клонированным VEGFR2i.ni на Ы-терминальном конце отсутствует белок-слияния. Контроль транскрипции осуществляется под Т7 промотором; бЬПэ - шесть гистидинов, й-х - тиоредоксин.

Иммунохимический анализ препарата VEGFR2i.ni с помощью коммерческих моноклональных антител методом иммуноблоттинга показал, что рецептор визуализируется в виде четких, одиночных полос, соответствующих ожидаемой молекулярной массе - 50 кДа (рис 2, А).

Рисунок 2. Анализ рекомбинантного экстраклеточного фрагмента VEGFR2. (А)

иммуноблот-анализ VEGFR2 с использованием коммерческих антител к VEGFR2 («Sigma», США); треки 1-3 - очищенный препарат VEGFR2 (50 кДа) в денатурирующих условиях; (Б) Электрофореграмма очищенного препарата VEGFR2 в денатурирующих условиях.

Исследование способности рецептора связываться слигандом

Способность полученного рекомбинантного экстраклеточного фрагмента VEGFR2|. ш взаимодействовать с лигандом исследовали методами лиганд-рецепторного анализа в постановке ИФА и иммуноблот-анализа. По данным лиганд-рецепторного анализа, биотинилированный препарат VEGFR2un взаимодействует с иммобилизированным на полистироловом планшете VEGF. При этом чувствительность метода составила 4±0,5

нг/мл в экспериментах с биотинилированным рецептором II типа, в то время как в эксперименте с использованием коммерческих анти-УЕОРЯ2 антител чувствительность была ниже и составила всего 6±0,3 нг/мл (Рис. 3, А).

60 45

30 20

Рисунок 3. Лиганд-рецепторный анализ VEGFR2 с VEGF. В постановке метода ИФА

(А) Красная кривая - взаимодействие VEGF с VEGFR2, в качестве первичных антител использовали коммерческие aHTH-VEGFR2 («Sigma», США), чувствительность составила 6 нг/мл (N=3); Синяя кривая - взаимодействие VEGF с биотинилированным рецептором VEGFR2, чувствительность составила 4 нг/мл; (Б) Лиганд-рецепторный анализ в постановке иммуноблоттинга: Трек 1 - VEGF (35 кДа); трек2 - VEGFR2 (50 кДа); трек 3 -маркер молекулярной массы («Sigma», США).

Кроме того, взаимодействие лиганда с полученным рекомбинантным рецептором было также подтверждено с помощью иммуноблот-анапиза в двух вариантах постановки: когда на ПВДФ мембрану был перенесен лиганд и наоборот, когда на мембрану был перенесен рецептор. В обоих случаях наблюдалось взаимодействие лиганда с рецептором VEGFR2 (рис 3, Б). Таким образом, лиганд-рецепторный анализ показал, что полученный препарат обладает VEGFR2 способностью взаимодействовать с лигандом.

Получение моноклональных антител

Иммунохимическую характеристику полученных моноклональных антител к УЕСРЯ2 исследовали методом иммуноблот-анализа. На первом этапе очищенные антитела были протестированы на специфичность взаимодействия с рекомбинантным препаратом УЕСРЯ2 рецептора. В связи с тем, что иммунизация мышей проводилась рекомбинантным препаратом с белком-слияния тиоредоксином, все тестирования антител к УЕОРЯ2 проводились параллельно с тиоредоксином. Иммуноблот-анализ не выявил взаимодействия полученных антител к УЕСРК2 с белком-слияния, поэтому можно

10

утверждать, что полученные антитела специфично распознают минорную полосу антигена УЕСРЯ2 молекулярной массы 50 кДа (рис. 4, трек 1) так же, как и коммерческие антитела к рецептору (рис. 4, трек 8).

Рисунок 4. Иммуноблот-анализ антител к VEGFR2 с рекомбинантным и нативным антигеном. 1 - рекомбинантный препарат VEGFR2i_ni\trx визуализирован полученными моноклональными aHTH-VEGFR2 антителами; 2 - тиоредоксин визуализирован полученными моноклональными aHTH-VEGFR2 антителами; 3 - VEGFR1 визуализирован полученными моноклональными aHTH-VEGFR2 антителами; 4 - лизат клеток глиомы С6 крысы; 5 - лизат клеток HUVEC; 6 — лизат клеток E.coli, не трансформированных генетической конструкцией с последовательностью VEGFR2; 7 - маркеры молекулярной массы («Сибэнзим», снизу вверх: 30, 40, 50, 60,80, 100, 150, 250 кДа); 8 - рекомбинантный препарат VEGFR2un\trx визуализирован коммерческими антителами к экстраклеточному фрагменту VEGFR2 («Sigma», США).

Хорошо известно, что рецепторы VEGFR2 и VEGFR1 являются гомологичными рецепторами [Rahimi N.. 2006]: гомология экстраклеточных доменов составляет более 33%, поэтому необходимо было исследовать способность полученных моноклонапьных антител к VEGFR2 рецептору перекрестно взаимодействовать с VEGFR1. Для этого был проведен иммуноблоттинг с использованием в качестве антигена рекомбинантного экстраклеточного фрагмента VEGFR1 с полученными антителами. На рис. 4 (трек 3) представлены результаты иммуноблот-анапиза: полученные антитела не визуализируют рецептор первого типа. Препарат VEGFR2i.ni рецептора, очищенный методом металлохелатной хроматографии, мог содержать незначительные примеси бактериальных белков, которые содержат гистидины и, следовательно, конкурируют с VEGFR2i.ni рецептором за связывание с Ni2+-NTA агарозой. Поэтому необходимо было исследовать способность полученных антител взаимодействовать с бактериальными белками E.coli. В качестве контроля использовали лизат бактериальных клеток E.coli штамм Rosetta(DE3), не трансформированный генетической конструкцией, несущей ген VEGFR2 (рис. 4, трек

6). Данные иммуноблот-анализа показали, что полученные антитела не визуализируют бактериальные белки Е.соИ (рис. 4, А).

На втором этапе необходимо было изучить способность визуализировать нативный рецептор VEGFR2, представленный в культурах клеток HUVEC и глиомы Сб. Моноклональные aHTH-VEGFR2 антитела выявили мажорные полосы в районе 230 кДа как в культуре клеток С6 (рис. 4, трек 4), так и HUVEC (рис.4, трек 5). Таким образом, было показано, что полученные моноклональные антитела к VEGFR2i_m визуализируют не только рекомбинантный рецептор, но и нативный рецептор, представленный в клетках. Определение константы аффинности

Полученная константа аффинности моноклональных антител к рекомбинантному препарату VEGFR2 составила Ка= l,8±0,12*10s М"1. Изотипирование полученных антител показало, что они принадлежат к классу IgG2a.

Иммунофлюоресцентный анализ локализации VEGFR2 клетках различных линий с помощью моноклональных aHTn-VEGFR2 антител

Полученные антитела к VEGFR2 были охарактеризованы методом иммуноцитохимического анализа на VEGFR2-no3HTHBHbix клеточных линиях: глиомы С6 крысы, U87-MG глиобластомы человека, НЕК293 и на эндотелиальной культуре клеток HUVEC. В качестве отрицательного контроля использовали неспецифические мышиные иммуноглобулины в эквивалентной концентрации.

На фиксированных клетках С6 полученные антитела к VEGFR2 визуализировали преимущественно цитоплазматический пул рецептора (рис. 5) вследствие постоянного синтеза рецептора в эндоплазматическом ретикулуме, что соответствует общепринятым мировым данным. Кроме того, VEGFR2 в неактивном состоянии преимущественно локализуется в цитоплазме в результате интернализации, и только небольшая часть представлена на мембране [Gampe! А. et а!., 2006, Scott А. et al., 2009].

Рисунок 5. Иммунофлюоресцентный анализ VEGFR2 рецептора моноклональными aHTH-VEGFR2 антителами на клетках С6 глиомы. А - визуализация неспецифическим препаратом IgG мыши; Б - визуализация моноклональными aHTH-VEGFR2 антителами; Вторичные антитела - препарат козьих антител к IgG мыши, конъюгированных с Alexa Fluor 488 («Invitrogen», США); Ядра клеток докрашены DAPI («Invitrogen», США).

Такое гранулярное иммунофлюоресцентное окрашивание цитоплазматического пула наблюдалось при визуализации VEGFR2 рецептора полученными антителами на фиксированных клеточных культурах U87-MG, НЕК293 и HUVEC (рис. 6). В отрицательных контролях специфической флюоресценции не было.

А Я 0 25 Б ^ШжАfc МП^

В 0 мт 25 Г 0 м™ 25

Рисунок 6. Иммунофлюоресцентный анализ VEGFR2 рецептора моноклональными aHTH-VEGFR2 антителами. А — клетки глиобластомы U87 человека; Б - клетки культуры НЕК293; В - клетки культуры HUVEC; Г -клетки глиомы С6 визуализация неспецифическиеим препаратом IgG мыши. Вторичные антитела - препарат козьих антител к IgG мыши, конъюгированных с Alexa Fluor 488 («Invitrogen», США); ядра клеток докрашены DAPI («Invitrogen», США).

Исследование мембранного пула VEGFR2 проводили на клетках культуры С6 глиомы, которые метили 5 мМ мембранным гидрофобным флюоресцентным красителем Dil. После чего проводили визуализацию живых клеток моноклональными антителами к VEGFR2, которые выявляли рецептор в виде зернистых кластеров, что характерно для мембранного пула рецептора (Рис. 7, А).

Рисунок 7. Иммунофлюоресцентный анализ VEGFR2 рецептора моноклональными aHTH-VEGFR2 антителами на живой культуре клеток С6 глиомы. Зеленый канал -визуализация моноклональными aHTH-VEGFR2 антителами, красный канал -визуализация мембранным красителем Dil; А - совмещенное иммунофлюоресцентное изображение; Б - ядра клеток окрашенные DAPI («Invitrogen», США); В - визуализация мембранного пула VEGFR2; Г - визуализация мембранных структур клетки, окрашенных красителем Dil. Вторичные антитела - препарат козьих антител к IgG мыши, конъюгированных с Alexa Fluor 488 («Invitrogen», США);

Таким образом, полученные данные иммуноцитохимического окрашивания культур клеток С6, HUVEC, U87-MG и НЕК293 моноклональными антителами к VEGFR2 показали специфическую визуализацию цитоплазматического и мембранного пула рецептора, который экспрессируется данными клеточными культурами.

Рисунок 8. Иммунофлюоресцентный анализ срезов мозга крыс с экспериментальной глиомой С6 aHTH-VEGFR2 антителами. А — визуализация препаратом неспецифического IgG мыши; Б - визуализация VEGFR2 на клетках глиомы С6 с помощью aHTH-VEGFR2 антител. В, Г - визуализация рецептора VEGFR2, стрелками показаны VEGFR2-no3HTOBHbie эндотелиоциты сосудов; Вторичные антитела — препарат козьих антител к IgG мыши, конъюгированных с Alexa Fluor 488 («Invitrogen», США); Ядра клеток докрашены DAPI («Invitrogen», США)

На следующем этапе был проведен иммуногистохимический анализ VEGFR2 на срезах головного мозга крыс с глиомой Сб. Сравнительный анализ различных регионов мозга крысы с экспериментальной глиомой выявил экспрессию VEGFR2 рецептора как эндотелиальными клетками сосудов, которые имеют характерную серповидную форму клеток и уплощенные ядра, так и глиомными клетками (рис. 8 Б, В, Г).

Кроме того, полученные антитела визуализировали клетки глиомы С6, характеризующиеся повышенной экспрессией рецептора (рис. 8, Б). При визуализации неспецифическими антителами IgG флюоресценции не наблюдалось (рис. 8, А).

При иммуногистохимическом анализе было продемонстрировано, что клетки С6 глиомы способны экспрессировать VEGFR2 рецептор, при этом уровень экспрессии рецептора в разных участках глиомы носил гетерогенный характер. Вероятнее всего это может быть связано с тем, что опухоль имеет участки некроза, характеризующиеся

15

тканевой гипоксией [Ting Н. et al., 2011]. В участках некроза наиболее выражена гипоксия, которая является главным регулятором ангиогенеза и активатором синтеза VEGFR2 и VEGF. Более того, антитела к VEGFR2 визуализировали эндотелиоциты микрососудов, полученная иммунофлюоресцентная картина характерна для рецептора VEGFR2. Таким образом, иммуногистохимический анализ показал, что полученные антитела к VEGFR2 на срезах головного мозга крыс с интракраниальной глиомой С6 визуализируют клетки экспрессирующие рецептор.

Исследование биологической активности полученных моноклональных антител на клетках культуры С6 глиомы.

Исследование биологической активности моноклональных антител к VEGFR2 проводили методом повреждения поверхности клеточного монослоя культуры клеток глиомы Сб. В качестве отрицательного контроля использовали неспецифические антитела IgG.

Широкое применение в клинической практике в терапии опухолей получили гуманизированные антитела к VEGF - бевацизумаб (авастин), который ингибирует пролиферацию, миграцию и выживаемость клеток, тем самым замедляя рост опухолей и образование кровеносных сосудов в опухоли [Chekhonin V.P. et al., 2012], поэтому его использовали в качестве контроля-сравнения эффективности ингибирования восстановления монослоя.

В бессывороточную ростовую среду добавляли моноклональные aiiTH-VEGFR2 антитела, бевацизумаб и неспецифические антитела IgG в концентрации 10 мкг/мл. Через 9 часов рассчитывали процент свободной поверхности, т.е. долю оставшейся площади от первоначальной.

Было показано, что моноклональные антитела к VEGFR2 замедляли восстановление монослоя клеток глиомы С6 (рис.9, А) по сравнению с контролем так же, как и коммерческий препарат. Однако бевацизумаб в эквивалентной концентрации замедлял восстановление монослоя в 2 раза по сравнению с неспецифическими антителами (Рис. 9), в то время как полученные моноклональные антитела к VEGFR2 в 1,6 раза. В контроле через 6 часов наблюдалось заполнение мигрирующими клетками зоны повреждения монослоя, а через 9 часов наблюдалось полное восстановление (рис.9, В). Для сопоставления результатов опыта и контроля «свободную» площадь через 9 часов инкубации с препаратами антител нормировали относительно первоначальной «свободной» площади. После чего рассчитывали процент оставшейся «свободной» площади, который отражает степень замедления клеточной миграции в области

нарушения монослоя. В случае анти-УЕОР112 антител и авастина среднее значение площади, свободной от клеток глиомы, составило 56±4% и 70±5,4% от первоначальной площади через 9 часов. В случае неспецифических антител и отрицательного

контроля без добавления антител значение составило 35±3% и 19±7% «свободной площади» соответственно.

1

I

70 56

35

Площадь повреждения монослоя через 9 часов

Рисунок 9. Площадь повреждения монослоя клеток С6 глиомы через 9 часов. По оси

ординат процент оставшейся свободной площади от повреждения относительно первоначальной площади до внесения препарата. Синий столбец - положительный контроль - препарат авастин, сохраняется 70% свободной площади (N=3, 8=5,4); Красный столбец - антитела к УЕОРК2 рецептору, 56% свободной площади (N=3, 8=4, р<0,05); Зеленый столбец - отрицательный контроль - неспецифические антитела через 9 часов сохраняется 35% свободной площади (N=3, 8=3,8).

Таким образом, достоверно показано (р<0,01), что моноклональные антитела к УЕОРЯ2 ингибируют восстановление монослоя клеток культуры глиомы С6 крысы при внесении их в концентрации 10 мкг/мл в 1,6 раза более интенсивно по сравнению с неспецифическими антителами ^С в той же концентрации. Кроме того, эти значения сопоставимы с таковыми для широко применяемого в клинике при лечении опухолей препарата авастин, который ингибирует восстановление монослоя в 2 раза интенсивнее по сравнению с неспецифическими антителами.

Принцип действия антител в тесте восстановления монослоя заключается в следующем: известно, что клетки С6 глиомы секретируют УЕвР, поэтому при добавлении антител к УЕОРЯ2 происходит ингибирование трансдукции внутриклеточного сигнала за

17

счет подавления связывания с VEGF, т.к. полученные антитела стерически экранируют сайты связывания лиганда с рецептором. В результате это приводит к ингибированию проведения внутриклеточного сигнала и замедлению миграции клеток. Селективный захват и накопление векторных наногелей клетками глиомы С6

Помимо применения моноклональных антител к VEGFR2 рецептору в качестве ингибитора ангиогенеза, еще одним перспективным направлением является направленная адресная доставка диагностических и лекарственных препаратов с их помощью. Убедительно продемонстрирован феномен гиперэкспрессии синтеза VEGFR2 опухолевыми клетками различных типов новообразований [Kranz A. et al., ¡999, Dales J.P. et al., 2004, Seto T. et al., 2006, Ghosh S. et al., 2008, Smith N.R. et al., 2010, Sia D. et al., 2013, Claesson-Velsh L. et al., 2013]. Кроме того, полученные нами данные свидетельствуют, что опухолевые клетки глиального происхождения (С6 крысы и U87-MG человека) характеризуются повышенным уровнем экспрессии данного рецептора. Таким образом, VEGFR2 может быть молекулярной мишенью для доставки наноразмерных контейнеров в опухоли мозга, т.к. он экспрессируется эндотелиоцитами опухолевых сосудов и опухолевыми клетками. В связи с чем была поставлена задача оценить перспективы применения рецептора в качестве молекулярной мишени и моноклональных анти-VEGFR2 антител в качестве векторных молекул для селективной доставки контейнерных систем в клетки-мишени.

В качестве контейнера были выбраны наногели, относящиеся к классу гидрогелей, состоящие из гидрофильной или амфифильной полимерной сетки, которая стабилизирована межмолекулярными взаимодействиями или химическими связями [Kabanov A.V. et al., 2010]. На первом этапе методом ИФА было показано, что моноклональные антитела сохраняют иммунохимическую активность к антигену VEGFR2 после стадии конъюгирования наногелей с антителами. На следующем этапе была исследована возможность связывания полученных анти-УЕОРК2-наногелей с презентированным на опухолевых клетках антигеном и селективного накопления таких систем за счет специфического взаимодействия компонентов системы антиген-антитело. Концентрация вносимых препаратов нормировалась по ФИТЦ и составляла 35 пмоль/мл. В качестве отрицательных контролей использовали наногели, конъюгированные с неспецифическими антителами IgG, и наногели без модификации.

Сравнительный флюоресцентный анализ выявил, что в случае наногелей, конъюгированных с антителами к VEGFR2 (рис. 10 А, Б) происходит выраженное накопление препарата по сравнению с немодифицированными наногелями и наногелями,

конъюгированными с неспецифическими иммуноглобулинами, где наблюдалась слабая флюоресценция (рис. 10 В, Г).

А

Б

' % I | *' • /

wnj. ' ■ " *

В Г

Рисунок 10. Иммунофлюоресцентный анализ накопления векторных наногелей, конъюгированных с aHTH-VEGFR2 антителами. (А) накопление наногелей, конъюгированных с VEGFR2 антителами на культуре клеток глиомы С6; (Б) накопление наногелей, конъюгированных с VEGFR2 антителами на культуре клеток U87-MG; (В) наногели, конъюгированные с неспецифическим препаратом IgG; (Г) невекторные наногели; ядра докрашивали DAPI («Invitrogen», США)

Полученные данные свидетельствует о том, что aHTH-VEGFR2 антитела в качестве векторной группы наногелей связывают презентированный антиген, способствуя селективному накоплению контейнеров в цитоплазме. В случае наногелей, конъюгированных с IgG и немодифицированными наногелями специфического накопления не наблюдалось.

Селективный захват и накопление векторных наногелей в опухоли in vivo

На заключительном этапе стояла задача изучить распределение aHTH-VEGFR2-наногелей в клетках ортотопической (интракраниальной) глиомы при внутривенном введении. Для сравнительного анализа животным с имплантированной глиомой вводили наногели, конъюгированные с полученными моноклональными антителами к VEGFR2 (aнти-VEGFR2-нaнoгeли), наногели, конъюгированные с неспецифическими иммуноглобулинами мыши (IgG-наногели) и наногели без конъюгации с антителами (500

мкг/на животное). Флюоресцентный анализ срезов головного мозга показал, что в случае векторных наногелей,

конъюгированных с УЕСРК2 антителами детектировалась флюоресценция в различных регионах опухоли, при этом распределение сигнала носило

гетерогенный характер (рис. И, А).

Рисунок 11. Флуоресцентный анализ накопления векторных наногелей, конъюгированных с УЕСР112

антителами в интракраниальной глиоме С6 через 48 часов.

(А) Векторные наногели, конъюгированные с антителами к УЕОРЯ2 (зеленый); (Б) Отрицательный контроль наногели, конъюгированные с препаратом

неспецифических ^в; (В) Отрицательный контроль невекторные наногели; Ядра докрашены ОАР1 (синий)

В то время как в случае немодифицированных наногелей

накопление наблюдалось исключительно в регионе внутриопухолевого некроза (рис. 11, В), при введении наногелей, конъюгированных с неспецифическими иммуноглобулинами флуоресцентная метка визуализировалась в опухоли (рис. 11, Б), однако распределение наногелей имело мозаичный характер, а интенсивность сигнала объективно уступала векторному препарату.

Ряд важных особенностей солидных опухолей и неопластической сосудистой сети позволяет использовать контейнерные системы для доставки лекарств. Способность макромолекул и

супрамолекулярных структур проникать и накапливаться в опухолевой ткани обусловлена повышенной проницаемостью неопластических сосудов [NagyJ.A. et al., 2002, Jain R.K. et al., 2005, Nagy J.A. et al., 2009]. Известно, что в малигнизированной ткани активно протекают процессы ангиогенеза, а сама опухоль высоко васкуляризована. Кроме того, в случае опухолей головного мозга имеет место выраженное нарушение структуры гематоэнцефалического барьера [Caraglia М. et al., 2012, Chacko A.M. et al., 2013]. Такие структурные особенности сосудистой сети можно использовать для направленной доставки наноразмерных контейнеров в опухолевую ткань.

Для определения границы опухолевой ткани срезы головного мозга были дополнительно визуализированы антителами к GFAP (глиофибриллярный кислый белок), позволив детектировать астроглиальный вал из реактивных астроцитов. На приведенных микрофотографиях видно, что в случае векторных наноконтейнеров происходит накопление преимущественно в центральной части опухолевого очага (рис. 12, А), которую ограничивает астроглиальный вал, характеризующийся повышенной экспрессией GFAP белка [Michael V. et al, 2010, Chekhonin KP. et al., 2012] в то время, как наноконтейнеры, конъюгированные с неспецифическими иммуноглобулинами, практически не накапливаются в глиомной ткани (рис 12 В, рис. 11 Б)

Конфокальная микроскопия позволила определить, происходит ли захват глиомными клетками векторных наногелей. Антитела к VEGFR2 рецептору, как векторная молекула, объективно повышают накопление глиомными клетками наногелей по сравнению с наногелями, конъюгированных с неспецифическими антителами (рис. 12 Б, Г).

Результаты проведенного исследования свидетельствуют о том, что конъюгация наногелей с aHTH-VEGFR2 антителами способствует специфическому захвату и накоплению наноконтейнеров глиомными клетками. Есть все основания полагать, что дальнейшее развитие технологий создания подобных наноконтейнерных систем на основе VEGFR2 антител позволит значительно повысить эффективность доставки диагностических и лекарственных препаратов в клетки опухоли.

А

С КАР

•4

Л *

/ л

Шг

апти- -\Е(;ГК2 наногели о мт 5оо

В

СГЛР

11111101 СМИ 0 мт 500

Рисунок 12. Иммунофлуоресцентный анализ срезов головного мозга крысы с интракраниальной глиомой. (А, Б) Накопление клетками глиомы С6 наногелей, конъюгированных с анти-УЕСРК2 антителами; (В, Г) отрицательный контроль -наногели, конъюгированные с неспецифическими иммуноглобулинами; Красный цвет -окрашивание анти-ОРАР антителами астроглиального вала, границы опухолевой ткани. Зеленый цвет — накопление векторных наногелей глиомными клетками

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенной работы был получен экстраклеточный фрагмент УЕОРЯ2 рецептора в прокариотической системе Е.соН, который обладает способностью взаимодействовать с лигандом-УЕОР. Накопленные сегодня данные свидетельствуют о том, что концентрация растворимой формы рецептора второго типа может служить маркером для анализа эффективности подобранной антиангиогенной терапии, комбинированной с химиотерапией у пациентов с онкологическими заболеваниями. Поэтому разработанный лиганд-рецепторный анализ на основе метода непрямого твердофазного иммуноферментного метода может быть рекомендован в качестве системы

для количественного определения растворимых форм УЕОРГ(2 рецептора в биологических жидкостях.

Используя полученный рекомбинантный экстраклеточный фрагмент УЕОРЯ2 рецептора, удалось получить высокоспецифичные моноклональные антитела, которые могут уже сегодня применяться в двух активно развивающихся направлениях -антиангиогенная терапия и направленный транспорт.

Было продемонстрировано, что анти-УЕОРЯ2 антитела способны замедлять миграцию клеток глиомы С6 в 1,6 раза по сравнению с неспецифическими антителами. Другим перспективным направлением применения полученных анти-УЕОР112 антител является направленный транспорт контейнерных систем с терапевтическими или диагностическими препаратами, что может значительно улучшить диагностику онкологических заболеваний, характеризующихся повышением экспрессии второго типа рецептора, а также эффективность проводимой химиотерапии. В качестве наноконтейнеров могут использоваться полимерные конструкции на основе блок иономерных-комплексов полиэтиленгликоль-б-полиметакриловой кислоты. К основным преимуществам таких наногелей можно отнести высокую эффективность загрузки и стабильность в кровотоке.

Проведенные исследования показали, что внутривенное введение наногелей, конъюгированных с анти-УЕСРР2 антителами, крысам с интракраниальной глиомой С6 объективно увеличивает специфичность и эффективность накопления в опухолевой ткани векторных систем по сравнению с наногелями, конъюгированными с неспецифическими иммуноглобулинами. Более того, за счет распознавания анти-УЕОР112 антителами рецептора, представленного на опухолевых клетках, происходит захват векторных наносистем глиомными клетками-мишенями.

Таким образом, полученные антитела могут быть в дальнейшем использованы не только для антиангиогенной терапии, но и как молекулярный вектор для увеличения эффективности доставки диагностических и лекарственных препаратов в опухолевую ткань.

ВЫВОДЫ:

1. Клонирование в плазмиду рЕТ32а кДНК, кодирующую с I-III иммуноглобулин-подобные домены экстраклеточного фрагмента VEGFR2, позволило получить штамм E.coli Rosetta(DE3)_pET32a/VEGFR2l продуцирующий VEGFR2i ^ с выходом 13±2 мг/л.

2. Лиганд-рецепторный анализ, разработанный на основе непрямого твердофазного иммуноферментного анализа, позволяет определять VEGFR2 с пределом чувствительности 4±0,5 нг/мл.

3. Иммунизация мышей рекомбинантным препаратом VEGFI^ ш позволила получить B-лимфоциты селезенки, способные при слиянии с клетками миеломной культуры Sp2/0-Agl4 образовывать гибридные клетки, продуцирующие моноклональные

8 -I

антитела к VEGFI^ , характеризующиеся константой аффинности - 1,8±0,12*10 M .

4. Моноклональные антитела к VEGFR2 обладают способностью ингибировать миграцию глиомных клеток на 56±4% в тесте повреждения монослоя клеток глиомы С6 ( wound healing test).

5. Ковалентная конъюгация моноклональных aHTH-VEGFR2 антител с блок-иономерными наногелями (диаметр 100±10 нм) на основе ПЭГ-б-ПМАК, объективно повышали специфичность их накопления в клетках интракраниальной опухоли при внутривенном введении.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Корчагина A.A., Шеин С.А., Леопольд A.B., Волгина Н.Е, Турина О.И., Лазаренко И.П., Антонова О.М., Баклаушев В.П., Чехонин В.П. Получение рекомбинантного экстраклеточного фрагмента рецептора второго типа фактора роста эндотелия сосудов (VEGFR2) и моноклональных антител к нему // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2013. Т. 157(9). С. 335-340.

2. Chekhonin V.P., Shein S.A., Korchagina A.A., Gurina O.I. VEGF in tumor progression and targeted therapy. // Curr Cancer Drug Targets. 2013. 13(4): 423-436.

3. Чехонин В.П., Шеин C.A., Корчагина A.A., Турина О.И. Роль VEGF в развитии неопластического ангиогенеза. // Вестник РАМН. 2012. (2) С. 23-34.

4. Шеин С.А., Турина О.И., Леопольд A.B., Баклаушев В.П., Корчагина A.A., Гриненко Н.Ф., Иванова Н.В., Волгина Н.Е., Рябухин И.А., Чехонин В.П. Получение моноклональных антител к рекомбинантному фактору роста эндотелия сосудов. // Клеточные технологии в биологии и медицине. 2012. (1) С. 24-28.

5. Леопольд A.B., Баклаушев В.П., Корчагина A.A., Шеин С.А., Гриненко Н.Ф., Павлов К.А., Рябухин И.А., Чехонин В.П. Лиганд-рецепторный анализ в оценке функциональной активности рекомбинантных VEGF и экстраклеточного фрагмента VEGFR-1 человека. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2011. Т. 152(12). С. 647-651.

6. Корчагина A.A., Леопольд A.B. Оптимизация экспрессии рекомбинантного экстраклеточного фрагмента второго рецептора фактора роста эндотелия сосудов в E.coli // Материалы VI Международной Пироговской научной медицинской конференции студентов и молодых ученых, Москва 2011 г. Вестник РГМУ. 2011. спец. выпуск (1). С. 229-230.

7. Леопольд A.B., Баклаушев В.П., Павлов К.А., Корчагина A.A. Экспрессия биологически активного экстраклеточного домена рецептора фактора роста эндотелия сосудов FLT-1 в Escherichia coli. II Материалы VI Международной (XV Всероссийской) Пироговской научной медицинской конференции студентов и молодых ученых, Москва 2011 г. Вестник РГМУ. 2011. спец. выпуск (1). С. 230-231.

8. Корчагина A.A., Шеин С.А. Получение моноклональных антител к рецептору второго типа фактора роста эндотелия сосудов. // Материалы VIII Международной Пироговской научной медицинской конференции студентов и молодых ученых, Москва 2013 г. Вестник РГМУ. 2013. спец. выпуск (1). С. 237.

9. Shein S. A., Nukolova N.V., Korchagina A.A., Baklaushev V.P., Gurina O.I., Chekhonin V.P. Anti-VEGF-coated immunoliposomes for targeted delivery therapeutics in brain tumors. // 5th International Conference on Drug Discovery and Therapy. Dubai 2013. Abstracts. P. 136.

10. Shein S.A., Nukolova N.V., Korchagina A.A., Baklaushev V.P., Gurina O.I., Chekhonin V.P. Anti-VEGF antibodies as targeting moieties for delivery nanocarriers into brain tumors. // World Biotechnology Congress 2013. Boston 2013. Abstracts. P. 151-152.

Заказ № 48-Р/09/2013 Подписано в печать 11.09.13 Тираж 110 экз. Усл. п.л. 1,4

ООО "Цифровичок", тел. (495) 797-75-76 www.cfr.ru; е-тай: info@cfr.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Корчагина, Анна Александровна, Москва

Министерство здравоохранения Российской Федерации

Российский национальный исследовательский медицинский университет

имени Н.И. Пирогова

Кафедра медицинских нанобиотехнологий

На правах рукописи

04201361763

Корчагина Анна Александровна

Рецептор фактора роста эндотелия сосудов второго типа (получение рекомбинантного препарата, моноклональных антител и системы

направленного транспорта)

Специальность: 03.01.04 - Биохимия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: академик РАМН, профессор, доктор медицинских наук В.П. Чехонин

Москва 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ........................................................................................................3

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ...........................................................................................8

Значение УЕОР112 для неопластического ангиогенеза и антиангиогенной терапии.............8

Введение.........................................................................................................................................8

Структура рецепторов семейства УЕСР11..................................................................................8

Биологические функции УЕСРКЛ.............................................................................................11

УЕСРЯ2 и его биологическая роль............................................................................................12

Опухолевый ангиогенез..............................................................................................................17

Ингибиторы УБОРЯ рецепторов в антиангиогенной терапии опухолей..............................21

Функциональное значение растворимых форм рецепторов...................................................28

Резистентность опухолей к антиангиогенной терапии............................................................31

Направленная доставка наноконтейнеров................................................................................36

Перспективы и заключение........................................................................................................38

ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ................................................................................40

Полимеразная цепная реакция...................................................................................................40

Молекулярное клонирование.....................................................................................................42

Трансформация клеток Е.соИ плазмидной ДНК......................................................................42

Анализ клонов..............................................................................................................................43

Подбор условий индукции экспрессии белка...........................................................................44

Культивирование клеток Е.соН для препаративной наработки белка....................................44

Выделение и очистка рекомбинантного белка.........................................................................45

Аффинная хроматография на агарозе......................................................................45

Денатурирующий электрофорез белков в ДСН-ПААГ...........................................................46

Иммуноблот анализ.....................................................................................................................46

Измерение концентрации белка.................................................................................................47

Биотинилирование белка............................................................................................................47

Метод лиганд-рецепторного анализа........................................................................................48

Культуры клеток..........................................................................................................................48

Скрининг гибридом.....................................................................................................................50

Аффинная хроматография на протеин А-сефарозе..................................................................52

Константа аффинности антител.................................................................................................52

Определение класса иммуноглобулинов..................................................................................53

Конкурентное взаимодействие...................................................................................................53

%У

Тест восстановления монослоя..................................................................................................53

Синтез наногелей, конъюгация с векторными группами........................................................54

Анализ накопления наногелей in vitro.......................................................................................55

Анализ накопления и распределения наногелей в глиоме in vivo..........................................56

ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ......................................................................................................57

Клонирование гена кодирующего экстраклеточный домена VEGFR2 в экспрессирующие векторы.........................................................................................................................................57

Анализ экспрессии VEGFR2i.ni рецептора в различных конструкциях.................................58

Металлохелатная хроматография на Ni2+-NTA агарозе..........................................................60

Получение и ммунохимический анализ моноклональных антител........................................62

Исследование специфичности моноклональных антител.......................................................64

Конкурентное связывание моноклональных антител к VEGFR2...........................................67

Иммунофлюоресцентный анализ моноклональных антител..................................................69

Лиганд-рецепторный анализ взаимодействия рекомбинантного экстраклеточного фрагмента VEGFR2 с VEGF.......................................................................................................76

Исследование биологической активности полученных моноклональных антител на клетках культуры С6 глиомы в экспериментах in vitro...........................................................78

Накопление векторных наногелей в клетках С6 глиомы in vitro............................................82

Накопление векторных наногелей в опухоли in vivo...............................................................85

ГЛАВА IV. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.....................................................................90

ВЫВОДЫ:...................................................................................................................................98

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.....................................................................................................100

а-'

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Akt/PKB - протеин киназа В Ang - ангиопоэтин

bFGF - основной фактор роста фибробластов DAG - диацилглицерол

DAPI - флуоресцентный ядерный краситель 4',6-диамидино-2-фенилиндол

Dil - флуоресцентный липофильный краситель (549/565)

EGF - эпидермальный фактор роста

EGFR - Рецептор эпидермального фактора роста

Erk - Extracellular signal-regulated kinases

FAK - киназа фокальной адгезии

FDA - food and drug administration

FGF - фактор роста фибробластов

GBM - мультиформная глиобластома

GFAP - глиофибриллярный кислый протеин

НЕК293 - линия человеческой эмбриональной почки 293

HGG - глиомы III-IV степени злокачественности

HS-

HIF1 а-транскрипционный фактор индуцируемый гипоксией 1-альфа

HUVEC - линия человеческих эндотелиоцитов из пупочной вены

IgG - неспецифические иммуноглобулины

IL - интерлейкин

IP3 - инозитол трифосфат

IRE-la- inositol-requiring enzyme 1-alpha

MAP2K/MEP - Mitogen-Activated Protein Kinase Kinase

МАРК - Mitogen-activated protein kinases

MMP - матриксные металлопротеиназы

Nrp - нейропилин

OD - оптическая плотность

p53 - белок 53

PFS6 - выживаемость без прогрессии в течение 6 месяцев PI3K - фосфоинозитол 3-киназа PIP2 - фосфоинозитол 4,5-бифосфат

PIP3 - фосфоинозитол 3,4,5-трифосфат

РКС - протеин киназа С

PLC-y - фосфолипаза С-гамма

P1GF - плацентарный фактор роста

SDFla (CXCL12) - стромальный фактор 1-альфа

TGF-a - трансформирующий фактор роста

TNF-a - Фактор некроза опухоли-альфа

VE-cadherin - васкулярно-эндотелиальный кадгерин

VEGF - фактор роста эндотелия сосудов А

VEGFR1 (Flt-1) - рецептор 1 типа фактора роста эндотелия сосудов

VEGFR2 (KDR) - рецептор 2 типа фактора роста эндотелия сосудов

Wnt - бета-катениновый сигнальный путь

БИК - блок-иономерный комплекс

БСА - бычий сывороточный альбумин

ГЭБ - гематоэнцефалический барьер

ДСН - додецилсульфат натрия

ДМСО - диметилсульфоксид

ИГХ - иммуногистохимический анализ

ИФА - иммуноферментный анализ

ИЦХ - иммуноцитохимический анализ

кДа - килодальтон

КДИ - карбодиимид

МАЛ - малеимидная группа

МРТ - магнитно-резонансная томография

ПААГ - полиакриламидный гель

ПВДФ - поливинилиденфторидная мембрана

ПСА - аммония персульфат

ПЭГ - полиэтиленгликоль

ФИТЦ - флуоресцеинизотиоцианат

ЦНС - центральная нервная система

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

ЭПР - эндоплазматический ретикулум

АКТУАЛЬНОСТЬ

В 2012 г. национальный институт рака США прогнозировал диагностирование 22910 новых случаев первичных опухолей головного мозга у взрослых и более 13700 случаев летальных исходов. Глиомы высокой степени злокачественности - наиболее быстроразвивагощиеся и агрессивные опухоли головного мозга (WHO grade III-IV). Из них наиболее злокачественной является мультиформная глиобластома (GBM), средняя выживаемость, при которой составляет менее 2 лет [1]. Вследствие быстрой прогрессии, высокого уровня васкуляризации, активного ангиогенеза, интенсивной инвазии, резистентности и низкой эффективности доставки лекарственных препаратов подходы традиционной химиотерапии остаются неэффективными [2,3]. Поэтому необходимо детальное изучение стратегий избирательного ингибирования критических стадий опухолеобразования и поиск новых опухоль-ассоциированных молекулярных мишеней.

Физиологический ангиогенез - процесс образования и формирования новых кровеносных сосудов, который активно протекает как в пренатальном, так и постнатальном онтогенезе. Однако нерегулируемый ангиогенез приводит к образованию неопластической сосудистой сети, которая с одной стороны обеспечивает кровоснабжение и питание малигнизированной ткани, а с другой - служит нишей для перивазальной инвазии и метастатической диссеминации [4]. Таким образом, рост и развитие солидных опухолей в значительной степени зависит от плотности сосудистой сети [2], поэтому антиангиогенные подходы, направленные на регрессию патологических сосудов, могут позволить замедлить рост солидных опухолей и повысить выживаемость пациентов.

Ключевую роль в регуляции неопластического ангиогенеза играет фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) и его рецептор II типа (VEGFR2) [4,5]. VEGFR2 является основным медиатором VEGF-опосредованного сигнала в эндотелиальных клетках [6,7], а также играет важную роль в трансдукции как при физиологическом, так и при патологическом ангиогенезе [8,9,10]. Во взрослом организме рецептор экспрессируется эндотелиальными клетками кровеносных сосудов, эндотелиальными прогениторными клетками, мегакариоцитами и гаматопоэтическими клетками. Показано увеличение экспрессии VEGFR2 малигнизированными клетками различных типов солидных опухолей [11,12,13,14], кроме того, в некоторых типах опухолей, например, при колоректальном раке, наблюдается повышенная экспрессия рецептора не только клетками опухолевых кровеносных сосудов, но и клетками лимфатических сосудов [11].

Все больше появляется данных, что повышенный синтез УЕОР112 ведет к увеличению выживаемости опухолевых клеток в условиях постоянной гипоксии и может являться одной из причин развития химиорезистентности и образования более агрессивного фенотипа опухолей [15,16,17]. Поэтому УЕОР112, как основной рецептор трансдукции проангиогенного сигнала, может рассматривается в качестве перспективной молекулярной мишени не только для антиангиогенной терапии, но также как вектор для селективного транспорта наноразмерных систем в малигнизированную ткань [18,19,20,21].

На сегодняшний день ведутся исследования ингибиторов УЕОРЯ2, направленных на подавление пролиферации, миграции и выживаемости эндотелиоцитов, что приводит к регрессии сосудистой сети, уменьшению плотности и диаметра сосудов, а также снижению проницаемости сосудов, замедляя рост опухоли [1,22,23]. В настоящее время целый ряд ингибиторов УЕ0РК2 проходит клинические испытания, включая препарат на основе моноклональных антител к экстраклеточному фрагменту УЕОРЯ2 (рамуцирумаб) [1,241,242].

Несмотря на многообещающие результаты преклинических исследований, эффективность антиангиогенных препаратов в клинике оказывается существенно ниже, особенно в случае опухолей мозга, так как малигнизированные клетки обладают высокой устойчивостью и способностью быстро адаптироваться [24,25,26,27], поэтому для повышения эффективности противоопухолевой терапии должны разрабатываться новые стратегии избирательной терапии.

В последнее время УЕОР112 исследуется как молекулярный вектор для

направленной доставки контейнерных систем, загруженных терапевтическими или

диагностическими препаратами. Известно, что неопластические сосуды имеют ряд

структурных и функциональных особенностей: хаотичный характер ветвления,

многочисленные петли, переплетения, слепые отростки, отсутствие структурированности,

малочисленность перицитов и высокую проницаемость [28,29,30]. Более того, в случае

опухолей головного мозга происходит выраженное нарушение структуры

гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) [31,32]. Такие структурные особенности

сосудистой сети можно использовать для избирательной доставки наноразмерных

контейнеров в опухолевую ткань. Было продемонстрировано повышение эффективности

терапии и доставки лекарственных препаратов с использованием липосомальных систем,

загруженных доксорубицином и конъюгированных с анти-УЕОРН2 антителами на

мышиных моделях рака молочной железы и колоректального рака [21]. Тем не менее,

6

аспекты применения моноклональных антител к VEGFR2 для доставки наноконтейнеров в опухоли мозга и изучение селективности их распределения в малигнизированной ткани остаются неизученными.

Цель работы: Изучить эффекты моноклональных антител к рекомбинантному экстраклеточному фрагменту рецептора второго типа фактора роста эндотелия сосудов на миграцию клеток в монослойных культурах и перспективы их применения для разработки контейнерных систем направленного транспорта диагностических и лекарственных препаратов в клетки-мишени глиом.

Задачи:

1. Получить штамм-продуцент, высокоэффективно продуцирующий рекомбинантный экстраклеточный фрагмент VEGFR2 рецептора.

2. Получить гибридому, продуцирующую моноклональные антитела к VEGFR2, провести иммунохимическую характеристику полученных антител .

3. Разработать метод количественного лиганд-рецепторного анализа VEGFR2.

4. Исследовать влияние моноклональных антител к VEGFR2 на миграцию клеток культуры С6 глиомы в экспериментах in vitro.

5. Оценить селективность накопления векторных наноконтейнерных систем на основе моноклональных анти- VEGFR2 антител в опухолевых клетках.

Научная новизна: Выявлена способность моноклональных антител к VEGFR2 ингибировать миграцию глиомных клеток в тесте повреждения монослоя клеток глиомы С6 (wound healing test).

В ходе исследования показано свойство моноклональных aHTH-VEGFR2 антител повышать эффективность и специфичность накопления векторных наногелей на основе ПЭГ-б-ПМАК клетками культуры глиобластомы человека U87-MG и глиомы Сб.

На интракраниальной модели глиомы впервые продемонстрирован эффект захвата и накопления векторных наногелей, конъюгированных с моноклональными airai-VEGFR2 антителами клетками глиомы Сб при системном введении.

Установлена способность полученного рекомбинантного экстраклеточного фрагмента VEGFR2i.ni взаимодействовать с лигандом в лиганд-рецепторном иммуноблот анализе и разработана высокоселективная система лиганд-рецепторного анализа для количественного определения VEGFR2.

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Значение VEGFR2 для неопластического ангиогенеза и антиангиогенной терапии Введение

Ангиогенез - процесс формирования кровеносных сосудов из уже существующих, васкулогенез — процесс формирования кровеносных сосудов de novo из клеток-предшественников. Процессы физиологического ангиогенеза наиболее активны во время эмбриогенеза и органогенеза, а также при репарации поврежденных тканей.

Семейство рецепторов тирозинкиназ (РТК) и различные факторы роста играют ключевую роль в регуляции ангиогенеза. Прежде всего это подсемейство рецепторов фактора роста эндотелия сосудов (VEGF - Vascular endothelial growth factor), представленное VEGFR1, VEGFR2 и VEGFR3. Эти рецепторы обладают способностью связываться как с общими, так и со специфическими лигандами [33].

Ключевыми регуляторами роста сосудистой сети являются VEGF-A и его тирозинкиназные рецепторы VEGFR1 (Flt-1), VEGFR2 (KDR) [34,35]. VEGFWEGFR2-опосредованная трансдукция сигнала запускает внутриклеточные сигнальные пути (PI3K/Akt, МАРК, eNOS, FAK и др.), которые активируют пролиферацию, синтез антиапоптотических белков, клеточную миграцию и повышение проницаемости сосудов [6]. VEGFR2 рецептор преимущественно представлен на эндотелиальных клетках, в то время как VEGF секретируется клетками той ткани, которая нуждается в кровоснабжении (макрофаги, астроциты, кардиомиоциты и др.). Таким образом, при недостаточном кровоснабжении и оксигенации ткани клетки передают сигнал через VEGF/VEGFR2 комплекс на эндотелиоциты, активируя процессы ангиогенеза. В результате происходит рост и ветвление сосудов, увеличивается просвет и повышается их проницаемость не только за счет эндотелиальных клеток близлежащих сосудов, но и за счет эндотелиальных прогениторных и гематопоэтических клеток, которые мигрируют из костного мозга в очаги ангиогенеза.

Структура рецепторов семейства VEGFR

Рецепторы подсемейства VEGFR состоят из четырех основных участков: внеклеточного N-концевого лиганд-связывающего фрагмента, трансмембранного а-спирального участка, внутриклеточных тирозинкиназного и С-терминального участков [36]. Внеклеточный гликозилированный "N-концевой фрагмент VEGFR2 и

УЕСРШ рецепторов состоит из семи ^-подобных доменов (иммуноглобулин-подобных доменов). Взаимодействие лиганда УЕйР с рецептором проис