Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Физиологический анализ дозозависимости сосудистых эффектов эндотелина-1

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Физиологический анализ дозозависимости сосудистых эффектов эндотелина-1"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМ. М.В.ЛОМОНОСОВА

Биологический факультет

м_

На правах рукописи УДК 591.111.8; 617.172.1

ГРАФОВ Михаил Алексеевич

ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ДОЗОЗАВИСИМОСТИ СОСУДИСТЫХ ЭФФЕКТОВ ЭНДОТЕЛИНА-!

03.00.13. - физиология человека и животных

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1996

Работа выполнена на кафедре физиологии человека и животных (заведующий -академик РАМН, проф.И.П. Ашмарин) Московского Государственного Университета им.М.ВЛомоносова

Научные руководители:

доктор биологических наук Н.А.Медведева доктор медицинских наук, профессор О.С.Медведев

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор В.И.Капелько академик РАМН, профессор Ю.А.Владимиров

Ведущее учреждение:

Научно-исследовательский ииститут Общей патологии и патофизиологии

Защита состоится 9 декабря 1996 г. в 15 часов 30 минут на заседании специализированного Ученого Совета Д.053.05.35. по защите диссертаций Биологического факультета Московского Государственного Университета им, М.В.Ломоносова по адресу:

119899 Москва, Воробьевы горы, Биологический факультет МГУ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан 9 ноября 1996 г.

Ученый секретарь специализированного Совета: кандидат биологических наук

а

У

/Б.А.Умарова/

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Функционирование сердечно-сосудистой системы в юрме определяется балансом воздействий регуляторных факторов различной [рироды. Изменение соотношения этих влияний в различных условиях обусловливает широкий спектр адаптивных реакций гемодинамики. В то же время, нарушение редукции какого-либо из вазоактивных факторов приводит к смещению равновесия регуляции работы сердца и сосудов и - как следствие - развитию патологии.

Одним из основных источников гуморальных факторов, обеспечивающих окальную регуляция тонуса сосудов, является эндотелий сосудистой стенки. В ндотелиальных клетках под влиянием различных стимулов синтезируются и ыделяются в кровоток оксид азота, простагландипы, тромбоксаны, эндотелии, ндотелий-зависимын фактор гиперполяризации и некоторые другие вазоактнвные генты. Среди них эндотелии-1 имеет самый широкий и до сих пор относительно [алоизученный спектр физиологической активности.

Впервые этот пептид, состоящий из 21 аминокислотного остатка был выделен з культуры эндотелиальных клеток аорты свиньи в 1988 году (Yanagisana et al). 1осле 8 лет интенсивного изучения он характеризуется как мощный эндогенный егулятор самых разнообразных функций организма. В фармакологических сследованнях показано, что эндотелии-1 оказывает положительные ино- и ронотропные эффекты на сердце (Firth et al.. 1990: Qiu et al.. 1992), разнонаправленно зменяет тонус сосудов (Мартынова и др.. 1991; Mac Lean et al., 19X9), принимает частие в регуляции основных параметров крови и процессов тромбообразования Filep et al., ¡991), а также модулирует другие регу;шорные воздействия на сердечно-осудистую систему. Однако, ввиду крайне низкого содержания пептида в крови и канях его физиологическая роль в регуляции гемодинамики достаточно плохо зучена.

В нормальных условиях концентрация эндотелина-1 в плазме крови пределяется в пределах 0.3 -н 1.5 фмолъ/ мл. Уровень циркулирующего пептида может величиваться в 10-50 раз при разнообразных физиологических и патологических остояииях организма (Горбачева и др.. 1991; обзоры - Battistini et al., 1993; Lusher et /., 1993). Значение повышенных концентраций пептида остается предметом искуссии. С одной стороны, эндотелин-1 является самым мощным осудосуживающим фактором и, хотя эти данные получены с использованием

фармакологических доз пептида, вполне вероятно его участие в индуцировании ишемии органов и гипертонических изменений гемодинамики при патологии. С другой стороны, в силу проадаптивной направленности ряда эффектов эндотелина-1 повышение его концентрации в крови может отражать компенсаторные реакции организма различной длительности. Несомненным представляегся лишь факт, что циркулирующий пептид оказывает основное влияние на сосуды, их тонус (и в первую очередь - на сосудистый эндотелий), и что это влияние может изменяться с изменением концентрации эндотелина-1 в крови.

Цель и задачи исследования. Исходя из вышесказанного целью настоящего исследования явилось изучение значения различных концентраций эндотелина-1 в регуляции тонуса сосудов. Для ее решения были поставлены следующие задачи:

1. Определить изменения сопротивления коронарных сосудов наркотизированных крыс в зависимости от дозы вводимого эндотелина-1.

2. Изучить влияние пептида на функционирование эндотелия изолированной аорты крыс.

3. Исследовать действие высоких доз пептида на культивируемые клетки эндотелия и гладких мышц сосудов.

4. Проанализировать возможные мембранотропные эффекты эндотелина-1.

Научная повита работы. При выполнении данной работы была впервые

изучена роль точных концентраций эндотелина крови в регуляции сопротивления коронарных сосудов крыс и дозозависимости этих эффектов. Данные об отставленном угнетении пептидом эндотелий-зависимого расслабления и независимости этого эффекта от известных типов эндотелиновых рецепторов не имеют аналогов в литературе. Новыми являются также сведения о возможности эндотелина взаимодействовать с липидными структурами и изменять их основные свойства.

Научно-практическое значение работы. Представляемое исследование выполнено в рамках фундаментальной проблемы изучения регуляции сердечнососудистой системы. Полученные результаты расширяют современные представления о роли различных коцентраций эндотелина-1 в регуляции тонуса сосудов. Анализ данных указывает на наличие краткосрочных и отставленных эффектов пептида. Быстро проявляющиеся воздействия эндотелина-1 на тонус сосудов по-видимому опосредуются рецепторами ЕТа и ЕГЬ типов, расположенными в эндотелиальных и гладкомышечных клетках. Отставленные эффекты заключаются в угнетении

эндотелий-зависимого расслабления аорты через 1 ч после ее инкубации с эндотелином-1, которое сохраняется на фоне несслсктивнои блокады известных эндотелиновых рецепторов. Эти данные свидетельствуют о нала чаи неизученного механизма действия пептида: либо через невыявленный тип рецепторов, либо по пущ независимому от активации рецепторов вообще. В пользу последнего свидетельствует способность ондотслина-1 увеличивать удельную электропроводность бислойны.х липидных мембран.

Обобщенные результаты позволяют сформулировать представление о различной физиологической роли циркулирующего эндотелина-1 в норме и при повышении его содержания в крови.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 работ.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 2-ом и 3-м международных симпозиумах "Механизмы действия ультрамалых доз" (Москва, 1992; Бордо, Франция, 1993); VIII международном симпозиуме "Сосудистые нейроэффекторные механизмы" (Кананаскис, Канада, 1994); конференции "Артериальная гипертензия. Эксперименталальные и клиническиие аспекты" (Санкт-Петербург, 1995); конференции молодых физиологов и биохимиков России "Биохимические и биофизические механизмы физиологических функций" (Санкт-Петербург, 1995); международном симпозиуме "Рецепторы пептидов" (Монреаль, Канада, 1996). Результаты неоднократно докладывались на заседаниях кафедры физиологии человека и животных Биологического факулыещ МГУ им.М.В.Ломоносова.

Объем и структура работы. Работа изложена на 110 страницах машинописного текста и иллюстрирована И рисунками и 6 таблицами. Диссертация состоит из вступления, обзора литературы, главы с описанием материалов и методов, изложения материалов собственных исследований, обсуждения результатов и выводов. Список цитируемой литературы включает 175 отечественных и иностранных публикаций.

Автор глубоко признателен сотруднице НИИ общей патологии и патофизиологии Евгении Борисовне Манухиной, сотрудникам ИЗК кардиологического научного центра Александру Лапшину, Ольге Степановой, Юрию Романову, сотруднице Московского медицинского университета Евгении Александровне Корепановой, чья неоценимая помощь позволила состояться данной работе.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Аутоперфузия коронарных сосудов наркотизированных крыс. Исследования выполнены на 10 самцах нелинейных белых крыс (питомник Крюково) массой 250 -330 г., наркотизированных нембуталом (50 мг/кг, внутрибрюшшшо). Аутоперфузию коронарных сосудов проводили по модифицированному нами методу VetterleinSchmidt (Vetterlein, Schmidt, 1985; Медведева и др., 1992). Кровь для аутоперфузии забирали из левой сонной артерии с помощью катетера, соединенного с системой шунта (Рис.la, 1), включавшую в себя последовательно соединенные силиконовую трубку с 20 МГц пьезокерамическим кристаллом допплеровского расходомера (РисЛа, 2), отведение для введения веществ (3), датчик для измерения перфузионного давления ("Stathara", США; РисЛа, 4), а также стеклянный катетер специальной формы (Рис.16), который через правую сонную артерию вводили в остиум левой коронарной артерии.

Временное падение артериального давления и начало кровотока в системе левая сонная артерия - шунт - коронарное русло свидетельствовали о точном введении катетера. В ходе эксперимента непрерывно регистрировали артериальное давление, перфузионнос давление и кровоток через систему шунта. Сопротивление коронарных сосудов определяли как отношение перфузионного давления к коронарному кровотоку, из которого вычитали сопротивление собственно системы шунта. Внутрикоронарную инфузию веществ проводили в течение 4-х минут со скоростью 0.04 мл/мин., что составляло в среднем 2-4% от исходного уровня кровотока через систему и при введении физиологического раствора не приводило к достоверным изменениям регистрируемых параметров. Эндотелии-1 (Sigma) разводили в 0.9% растворе NaCl и вводили в 4-х суммарных дозах: 0.2 фмоль/кг, 20 фмоль/кг, 2 пмоль/кг и 0.2 нмоль/кг. В ходе каждого эксперимента изучали эффекты внутрикоронарного введения физиологического раствора и не более двух разных доз пептида. Интервал между введениями эндотелина-1 составлял 30 - 40 мин. По окончании эксперимента животному вводили увеличенную дозу нембутала и выполняли процедуру морфоконтроля.

Рисунок 1. Экспериментальная схема аутоперфузии коронарных сосудов наркотизированных крыс.

Обозначения: а - общий вид: 1- система шунта, 2 - допплеровский расходомер, 3 - инфузор, 4 - датчик давления; б - стеклянный катетер, увеличенный вид.

Эксперименты па колечках аорты крыс, В работе использовали самцов крыс линии \Vistar весом 200 - 350 г. (виварий Института общей патологии и патофизиологии). Немедленно после декапитации у животного извлекали нисходящую аорту и помещали в ледяной раствор Кребса. Колечки сосуда длиной 3.5 мм помещали в термостатируемую (37 ± 1°С), непрерывно аэрируемую (95% СЬ и 5% СО2) камеру, заполненную физиологическим раствором и вертикально растягивали на стальных зажимах с нагрузкой 1.2 г. Физиологический раствор (раствор Кребса)

имел следующий состав: NaCl-130 мМ, глюкоза - 11 мМ, КаНСОз - 14.9 мМ, КС1 - 4.7 мМ, СаС12 - 2.5 мМ, MgS04 - 1.2 мМ, КН2РО4 - 1.18 мМ (рН = 7.4).

Рисунок 2. Стандартный протокол экспериментов на колечках изолированной аорты.

Ацетипхопин 5"1б+5«Ю,М

НИ

Эндотелии-!, 10 пМ

Эндотепин-1,1 пМ Физ.раствор

Ацетипхопин

Ш*

1°

Нор адреналин М(Г*,5«10"'М

ООО f

С t PD 142393, Диметапсупьфоксид)

0000 оооооооооо

Норалреналин 5«Ю"'М

Обозначения: РО 142893 - неселективный антагонист эндотелиновых рецепторов;

•1Т - введение веществ; о - смена физ .раствора в камере

Стандартный протокол экспериментов на изолированных колечках аорты представлен на рис.2. В ходе экспериментов оценку эндотелий-зависимого расслабления как показатель функционального состояния эндотелия и эндотелий-независимого расслабления как показатель чувствительности гладких мышц сосуда к N0 производили на препаратах предварительно сокращенных норадреналином, 5х 10-7М. При достижении плато сократительного ответа вводили сосудорасширительные вещества в следующих рангах суммируемых концентраций: ацетилхолин - 5х10"9-^5х10"5М, АТФ - 10'7-г 10"4М, нитропруссид натрия - Ю'10* Ю-6 М. Через 15 - 20 мин. после отмывки препарата вводили одну из концентраций эндотелина-1 (001, 0.1, 1 или 10 нМ) или деполяризующий раствор КС1 (80 мМ), или растворитель (10% раствор С2Н5ОН). Объем введения составлял 15 мкл (для КС1 - 600

мкл в физиологическом растворе), время инкубации с веществами - 35 мин. Последующий период отмывки составлял 60 мин, во время которых раствор в рабочей камере сменялся каждые 5 мин. Эта процедура приводила к полному возврату тонуса сосуда, увеличенного констрикторными веществами, к исходному уровню. На этом фоне расширительный резерв препаратов анализировался еще раз по схеме, описанной выше (см. рис.2).

В отдельной серии экспериментов за 10 мин. до эндотелина-1 вводили несслектнвный антагонист эндотелиновых ЕТа/ЕТЬ рецепторов - PD 142893 (Acetyl-D-Dip-Leu-Asp-lle-lle-Trp-OH; D-dip = 3,3-D-diphenylalanine, "California peptides", США), кошролем служило введение растворителя - 30 мкл. ДМСО.

Величины изометрического сокращения оценивали в мг., уровень расслабления сосуда - в % по отношению к значению предварительно вызванного сокращения. Математическую обработку результатов проводили с помощью нелинейного регрессионного анализа: для каждой кривой, выражающей зависимость доза-эффект вычисляли индивидуальную величину ЕС50 - концентрации агониста, введение которой вызывает эффект равный половине максимального значения. Для статистического анализа полученных результатов использовали t-критернй Стьюдента для парных и непарных выборок.

Исследования с использованием клеточных культур. Исследование возможной токсичности высоких доз эндотелина-1 проводили с использованием культивируемых эндотелиальных клеток пупочной вены человека и гладкомышечных клеток аорты кролика. Выделение клеток проводили по общепринятой стандартной методике (Chamley-Campbell el а!.. 1979; Maciag et al., 1979; Antonov et al„ 1986; Birukov el al„ 1991). В ходе 4х-дневной инкубации с эндотелином-1 в концентрациях 0.1 и 10 пМ отдельно и в совокупности с антагонистом его рецепторов изучали изменение морфологии клеток и их плотности.

Изучение проводимости модельных лиаидных мембран. Модельные бислойные мембраны формировали на основе раствора липидов (азолектин, Sigma) в сквалснс или п-декане (15 mi/мл). В экспериментах использовали стандартную установку для определения проводимости мембран (Корепанова и др., 1989; 1994). Формирование искусственной мембраны контролировали с помощью светового микроскопа. Генерация напряжения происходила через определенные промежутки времени попеременно через один из электродов или постоянно с помощью одного из них.

После .установления бислойной мембраны эндотелин-1 или растворитель (10% раствор С2Н5ОН) вводили в обе камеры в одинаковом объеме (до 150 мкл) для избежания её выдавливания. Возможные изменения проводимости мембраны (падение разности напряжений) фиксировались в течение 20-ти минут, после чего липидный бислой механически разрушали. Сопротивление мембраны оценивали по формуле Mueller с сотр. (1962).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние эндотелина-1 различных концентраций на сопротивление коронарных сосудов крыс. Общее сопротивление перфузируемых коронарных сосудов в среднем по 10 опытам было равно 52.7 ± 9.6 мм рт.ст./мл./мин. (пределы 16.4+70.5 мм рт.ст./мл./мин.), величина среднего артериального давления составила 125.9 ± 4.9 мм рт. ст. Внутрикоронарная инфузия физиологического раствора (0.9-% NaCl) не вызывала достоверных изменений ни одного из регистрируемых параметров. Введение эндотелина-1 в дозах от 0.2 фмоль/кг до 2 пмоль/кг не приводило к значимым изменениям системного артериального давления. Это позволило нам сделать предположение о том, что регистрируемые с помощью данного метода изменения сопротивления коронарного русла в ответ на эндотелин-1 отражают непосредственное влияние пептида на тонус сосудов, а не обусловлены адаптивными механизмами при изменении параметров системной гемодинамики.

Другим преимуществом данной методики является возможность создания точно расчитываемого (на основании непрерывно регистрируемых значений кровотока в системе шунта) уровня разведения экзогенно вводимого пептида в коронарной циркуляции. Это позволило нам моделировать сдвиги концентрации циркулирующего эндотелина-1 до значений, которые наблюдаются при различных физиологических и патофизиологических условиях.

Основываясь на литературных данных, мы использовали параметры инфузии эндотелина-1, которые позволяли создавать нормальные или патофизиологические сдвиги концентраций пептида в коронарной циркуляции: 0.01 -s- 0.02 фмоль/мл (при суммарной дозе вводимого эндотелина-1 0.2 фмоль/кг), 1 н- 2 фмоль/ мл (20 фмоль/ кг), 0.1 -г 0.2 пмоль/ мл (2 пмоль/ кг). Инфузия в течение 4 мин

Рисунок 3. Влияние инфузии физиологических концентраций эндотелина-1 (ЕТ-1) на коронарное сопротивление наркотизированных крыс!

I-.-1-1---1-,-,-Г-1-1-1-,-.-.-1

0 5 10 15

Время, мин

Г-1-1-'-'-I-1-'—""-1 I-1-1-'---!

0 5 10 15

Время, мин

двух наиболее низких из изучаемых концентраций вызывала только расширение коронарных сосудов: максимальное уменьшение общего коронарного сопротивления (на 13.6 ± 4.9%, п=6 и 20.6 ± 6.5%, п=6 по сравнению с исходным уровнем для каждой дозы, соответственно) достоверно отличалось от изменений сопротивления при контрольной инфузии физиологического раствора (р<0.05, рис.3). Всрояжо. такая высокая чувствительность сосудов к довольно низким дозам гуморального фактора может быть объяснена на основании данных о распределении разных типов эндотелиновых рецепторов. Согласно литературе, рецепторы ЕТв класса в сосудистой системе представлены преимущественно в эндотелиальных клетках и опосредуют

(через стимулированное выделение эндотелий-зависимых факторов расслабления) гипотензивное действие эндотелина (Takayanagi et al.. 1991). Другой тип - ЕТа -широко представлен в гладких мышцах сосудов и его активация селективными лйгандами вызывает сосудосуживающую реакцию (А га: et al., 1990: Takayanagi et al.,

1991). Представляется вероятным, что увеличение концентрации циркулирующего в крови эндотелина-1 может приводить к увеличению его связывания только с рецепторами эндотелиальных клеток и, как следствие, усилению секреции эндотелий-зависимых факторов расслабления и уменьшению тонуса сосудов. Чувствительность к таким незначительным для других гормонов концентрациям может обеспечивать подкласс рецепторов, характеризующийся высокой степенью аффинности. Данные о существовании в одном и том же типе ткани рецепторов с одинаковой селективностью к лигандам, но различающихся в 100 -1000 раз по уровню чувствительности представлены в нескольких работах (Sokolovsky et al., 1992; Hiley, 1995; Warner et al., 1996). Таким образом, эндотелии-1 в коцентрациях, которые наблюдаются при физиологических и патофизиологических условиях, вызывает только расширение коронарных сосудов наркотизированных крыс. Можно предположить, что у животных с нормальной реактивностью сосудов пептид не может приводить к ишемии миокарда.

Увеличение суммарной концентрации вводимого пептида до 2 пмоль/кг (разведение в коронарном русле до 0.1 н- 0.2 пмоль/мл, п=5) приводило к исчезновению его сосудорасширяющего эффекта, и даже вызывало увеличение сопротивления коронарных сосудов после окончания инфузии, которое все же не было достоверным (рис.4). Мы предполагаем, что при данной концентрации циркулирующий пептид способен проникать через эндотелий сосудов в количестве, достаточном для активации специфических рецепторов гладких мышц и достижения значимого сокращения сосудов. Этот поздний сократительный ответ по-видимому маскирует быстро проявляющийся расширительный (Медведева и др..

1992). Более того, эндотелии-1 в самой высокой дозе 0.2 нмоль/кг (сдвиг концентрации в коронарном русле до 10 20 нмоль/мл, п=2) вызывал только мощное сокращение коронарных сосудов (на 62.0% ), которое наблюдалось уже во время инфузии пептида (рис.4).

Подобное проишемичекое действие высоких доз пептида отмечалось уже целым рядом авторов (Ezra et al.. 1989; Larkin et al.. 1989: ClnzelJ.-P., Clozel M.. 1989).

В описываемой серии экспериментов мы показали, что данный эффект проявляется лишь при введении эндотелина-1 в фармакологических количествах, т.е. в условиях, которые не зарегистрированы при изучении концентраций эндогенно1 о гормона. Тем не менее, сосудосуживающее действие пептида привлекает пристальный интерес. В наших опытах значительное увеличение сопротивления коронарных сосудов наблюдалось в течение длительного периода рсмени после окончания инфузии.

Рисунок 4. Влияние инфузии фармакологических доз эндотелина-1 на сонропшдение коронарных сосудов наркотизированных крыс.

О 5 10 15

Время, мин

I-1-1-Т--1 1 I-1-I-1 |-1-I-1-■-1

О 5 10 15

Время, мин

Согласно литературе, экзогенно вводимый эндотелии достаточно быстро элиминируется из кровотока и его концентрации в крови снижаются до значений, близких к исходным (П? Мисс} е/ а!.. 19НН). Таким образом его длительное

сосудосуживающее действие должно опосредоваться изменением состояния какой-либо из систем, принимающих участие в регуляции сердечно-сосудистой системы. В связи с тем, что мы изучали эффекты внутрисосудистого введения эндотелина-1, логично предположить, что основным местом его воздействия является эндотелий сосудов.

Эндотелиальный монослой в силу своего ключевого положения между кровотоком и гладкими мышцами, а также благодаря значительной секреторной активности, играет важную роль в регуляции гемодинамики. Нарушение его функционирования сопровождает многие заболевания сердечно-сосудистой системы, а в некоторых случаях - лежит в основе их патогенеза (Чазова, 1996; Rubanyi. 1993). Между тем практически все подобные патологические состояния сопровождаются увеличенным содержанием эндотелина-i в крови. Учитывая это, в следующей серии экспериментов мы изучали влияние различных доз эндотелина-1 на состояние эндотелия.

Влияние эндотелина-1 на эндотелий-зависимое и эндотелий-независимое расслабление сосудов. В опытах на изолированных колечках аорты крыс состояние эндотелия оценивалось по величине расслабления сосудов на ацетилхолин и АТФ, действие которых опосредуется выделением эндотелий-зависимых факторов релаксации (Furchgott, Zawadski, 1980; обзоры - Медведева, Медведев, 1990; Rubanyi, 1993; Bredt, Snyder, 1994). В наших экспериментах такая оценка проводилась дважды: до и через 1 час после 35-минутной инкубации сосудов с исследуемыми веществами (рис.2).

Основные параметры вызванного ацетилхолином расслабления изолированной аорты и их изменение после инкубации сосуда с исследуемыми веществами представлены в табл.1. Тестирование эндотелий-зависимого расслабления проводили после достижения плато сократительного ответа колечек аорты на норадренапин (см. Протокол экспериментов, рис.2). Среднее значение вызванного норадреналином, 5х10"7 М увеличения изометрического напряжения сосудов составило 418.5 ± 17.0 мг. Достоверных различий по этому показателю между отдельными группами не наблюдалось. На фоне увеличенного тонуса сосудов введение ацетилхолина в ранге суммируемых концентраций 5* 10^+5x10"5 М приводило к дозозависимому расслаблению препаратов. Максимальные значения падения тонуса варьировали в среднем по группам от 46.6 ± 6.6 % до 53.6 ± 6.6 % от

его исходного уровня (табд.1) и также не различались между собой. Введение эидотслшш в низких дозах (концентрации в камере 10'", Ю-10 М) и 15 мкл 10-% раствора этилового спирта (контрольные условия) практически не изменяло изомефическое напряжение нрепараюв в течение всего 35 мин. периода инкубации. Содержание сосудов в контрольных условиях не приводило к значимым изменениям регистрируемых параметров эндотелий-зависимого расслабления при повторном тестировании, что указывает на адекватность использовавшегося протокола экспериментов. Инкубация колечек аорты с эндотеззином-1 в концентрациях 10"11 М и Ю"10 М (наиболее близко отражающих его физиологический уровень в крови» вызывала лишь незначительное увеличение расслабления в ответ на максимальные концентрации ацетилхолина (табл.1). Вероятно, в основе этого эффекта лежит способность эндотелина-1 стимулировать синтез и секрецию эндотелиальных факторов расслабления как in xitro (Warner et ul., 1992), так и in vivo (De Nucci et al, 1988).

Таблица 1. Основные характеристики вызванного ацетилхолпном расслабления сосудов до и после их инкубации в контрольных условиях и с исследуемыми веществами.

"Условия Расслабление, ¡и тест Изменение Изменение Расслабление. 2й тест

инкубации напряжения ответов и а

F.Cso. ЦМ максимум. при инкуба- NA. 5* I0'7 М. ЕСзо, цМ максимум.

0 ции с в-ми. мг в°1;к 1-му тесту; " а

контроль 0.18 53.6 + 6.6 0 14.4+ 4.6 0.22 53.5 ± 7.5

ЕТ-1. 10рМ 0.27 51.2= 5.7 0 14.5 ± 0.5 0.27 60.01 5.Х

ET-1,0.1 п.М 0.20 46.6 1 7.6 0 15.9 1 3.5 0.22 65.4 г 10.9

ЕТ-1,1 пМ 0.22 53.0 ± 4.1 101.6 ±11.0 35.1 ± 3.8++ 0.59* 45.8 ± 3.2

ЕТ-1.10 пМ 0.27 50.4+ 3.9 486.2 ± 37.1 26.0 ± 3.9 0.19* 58.2 ± 4.0

KCl, 80 шМ 0.22 45.7 ± 6.4 500.7+ 27.0 5.5 i 3.7 0.14* 64.016.2*

Обозначения: ЫА - норадреналин; НТ-1 - эндотелия-1; * - р < 0.05. ** - р < 0.01 - по сравнению с аналогичными значениями лля 1 -го теста в этой же группе; ++ - р < 0.01 но сравнению с изменениями в контрольной группе.

Увеличение концентрации пептида до 10"9-Я0"8 М приводило к дозозависимому увеличению тонуса сосудов до 101.6 ± 11.0 мг (п=18) и 486.2 ± 37.1 мг (п=17), соответственно (табл.1). Инкубация сосудов сэндотелином-1, Ю"9 М сдвигала кривую доза-эффект расслабления сосуда вправо (р<0.05) с относительным уменьшением максимальной величины ответа (Рис.5). Угнетающее действие пептида на состояние эндотелия проявилось также в более чем двухкратном увеличении величины ЕСзо (с 0.22 цМ до 0.59 цМ, р < 0.05). Этот эффект не является избирательным по отношению к вызываемому ацетилхолином расслаблению сосудов, т.к. аналогичные данные получены в опытах с АТФ. У сосудов предсокращенных норадреналином введение АТФ в ранге суммируемых концентраций Ю-7 -г- Ю"4 М вызывало развитие дозозависимого расслабления в среднем до 81.9 ± 6.1% (ЕС» = 9.7 цМ). Инкубация препаратов аорты с эндотелином-1 в концентрации 10~9 М приводила к уменьшению их чувствительности к АТФ: величина ЕС50 увеличивалась с 12.2 цМ до 40.7 рМ (р < 0.01) при практически неизменных максимальные зарегистрированных значениях расслабления (77.1 ± 4.6% - в первом и 74.7 ± 10.5% -во втором тестах).

Несколько противоречивым с этой точки зрения являются результаты инкубирования сосудов с эндотелином-1 в концентрации Ю-8 М (Рис.5). В этих экспериментах после действия пептида наблюдали увеличение и эндотелий-зависимого расслабления, и общей чувствительности к ацетилхолину (р<0.05; табл.1). Основным различием эффектов двух доз эндотелина-1 является значительно более мощная констрикция, вызываемая максимальной концентрацией (486.2 + 37.1 мг против 101.6 ± 11.0 мг, р < 0.001). Согласно литературным данным, длительное, сильное увеличение тонуса сосудов приводит к компенсаторным реакциям, выражающимся в увеличении продукции эндотелиальных факторов расслабления и усилении чувствительности сосудистых гладких мышц к их влиянию (Медведева, Медведев, 1988: ЯиЬапуи 1993). Вероятно, что данное явление лежит и в основе различного действия двух высоких концентраций эндотелина-1. Для проверки предположения провели серию экспериментов, в которых в качестве сосудосуживающего фактора использовали деполяризующий раствор КС1. В концентрации 80 мМ К.С1 вызывал увеличение изометрического напряжения сосудов близкое по величине с действием эндотелина-1, Ю-8 М (500.7 ± 27.0 мг, табл.1). После

инкубации препаратов аорты в этих условиях эндотелий-зависимое расслабление также увеличивалось. Это выразилось как в усилении максимальных ответов на ацетилхолин (р < 0.05), так и в уменьшении величины ЕС50(с 0.22 цМ до 0.14 цМ, р < 0.05).

Рисунок 5. Изменение вызванно1 о ацешлхолином (Ach) расслабления

изолированной аорты после инкубации с эндогелином-1 (ET-I) высоких концентраций.

75

-50-

FT-J, 1пМ

J-1

» ЕСя,=0.22цМ • ВСя=0.59цМ*

-9-8-7-6 -5 log i Ас El), M

-4

75-

«-50-J

ч

>о 25-1

в. о-1

ЕТ-1, 10 пМ

БС50 = 0.27 цМ HV = 0.19|lM*

-8-7-6-5 log I Ach], M

1 -ц тест; • - 2-ой тест

Подтверждением того, что увеличение вызванного ацешлхолином расслабления после инкубации сосудов с эндотелином-1, М не опосредуется

прямым действием пептида на состояние эндотелия, стали опыты с нитропруссидом натрия. Это вещество в физиологических условиях распадается с образованием

оксида азота и, таким образом, относится к классу эндотелий-независимых

сосудорасширяющих факторов. Следовательно, изменения вызываемого нитропруссидом натрия расслабления отражает изменение чувствительности гладких мышц к действию оксида азота эндогенной или экзогенной природы. В наших опытах эндотелии-! в концентрации 10"8 М вызывал отставленное увеличение эндотелий-

независимого расслабления. Как и в случае действия ацетилхолина, возрастали

максимальные ответы на нитропруссид (с 89.2 ± 7.6% до 105.7 ± 1.8%, р < 0.05; п=6) н

значительно уменьшалась величина ЕС50 (с 14.2 пМ до 4.8 пМ, р < 0.01). Блокада эндотелиновых рецепторов неселективным антагонистом РО 142893 примерно в 10

раз снижала сосудосуживающее действие максимальной дозы пептида и одновременно предотвращала развитие обоих эффектов. Таким образом, эндотелин-1 в концентрации Ю-8 М вызывает увеличение чувствительности гладких мышц к сосудорасширяющим факторам опосредованно через развитие высокого напряжения сосудов.

В работах других авторов было показано, что пептид способен уменьшать эндотелий-независимое расслабление изолированных сосудов (Mucdonuld et al, 1989) и эндотелий-зависимое расширение сосудов in vivo (Hagar, 1994). Однако, в этих экспериментах введение нитропруссида натрия и ацетилхолина осуществлялось в присутствии повышенных концентраций эндотелина-1 и, следовательно, эффект пептида мог опосредоваться его прямым сосудосуживающим действием. В наших экспериментах определение состояния эндотелия проводилось через 60 мин после инкубации колечек аорты с пептидом и, следовательно, зарегистрированные изменения отражают отставленные эффекты пептида.

Вызываемое эндотелином-1 угнетение эндотелий-зависимого расслабления наблюдалось и при совместной инкубации сосудов с пептидом и неселективным антагонистом эндотелиновых рецепторов PD 142893. На фоне предварительно введенного антагониста эндотелин-1, 10"9 М не проявлял сосудосуживающего действия вообще (п=8; по сравнению с 101.6 ± 11.0 мг в опытах без блокады рецепторов), а эффекты пептида в концентрации 10"8 М снижались в несколько раз (с 486.2 ± 37.1 мг до 92.9 ± 21.9 мг, n=9; р < 0.0001). Тем не менее, в этих условиях пептид как в концентрации 10"9 М, так и в концентрации 10~8 М вызывал гораздо более значительное угнетение эффектов ацетилхолина (Рис.6). Достоверные значения получены как для изменения холиночувствителыюсти в целом (ECso увеличивалась с 0.22 до 0.38 цМ, р < 0.05 и с 0.16 до 0.37 цМ, р < 0.01, соответственно), так и для уменьшения расслабления на максимальные дозы агониста (р < 0.05 и р < 0.001, соответственно).

Таким образом, эндотелин-1 вызывает угнетение эндотелий-зависимого расслабления сосудов даже на фоне блокады обоих типов его рецепторов. Данные о подобном эффекте в доступной нам литературе отсутствуют. Представляется вероятным, что данное воздействие либо опосредуется неизвестным в настоящий момент типом рецепторов, либо не зависит от их активации вообще. Назначение данной реакции, как и ее механизмы, представляется неоднозначным. Вызванное

эндотелином уменьшение эндотелий-зависимого расслабления может лежать как в основе патологического угнетения эндотелия (например, при повреждении миокарда, вызванном ишемией-реперфузией - 1л>(ег ег а!., 199!), так и служить компенсаторной реакцией при заболеваниях, сопровождаемых гиперактивациен эндотелия (например, при эндотоксиновом шоке - Маес/а ее а!.. 1995). Примечательно, что и развитие эндотоксинового шока, и повреждение миокарда характеризуются повышением уровня эндогенного эндотелина-1 в плазме крови (обзор - ВаиШт е; а!.. 1993).

Рисунок 6. Изменение вызванного ацетилхолином (АсЬ) расслабления изолированной аорты после инкубации с эндо! слипом-1 (БГ-1) на фоне блокады эндотелиновых рецепторов.

75-1

«50-

1а

«25-

0-1

РО&ЕТ-1,1пМ

.Лг-Л

• НСя = 0.22 ¡лМ

• ЕСда = 0.38 цМ*

75-1

о'50' в

я 25-1

0-

/>/)<£ £7-/, 10 пМ

V

Л"

ЕС5„ = 0.16 |дМ ЕС« = 0.37 ц\1*

-9 -8 -7-6-5-4 1о8 1 АсЬ|, М

-9-8-7-6 -5 [ Л с Ь |, VI

о- 1-й тест; • - 2-ой тест

Изучение возможных механизмов вызываемой пептидом дисфункции эндотелия мы провели на основании данных о близком структурном родстве пептидов эндотелиновой группы и токсинов яда змеи Л1гасШ.\р1ч сп^сиккик^х. обозначаемые как сарафотоксины а, Ь, с, (1 [или Бба, Э6Ь, Ббс, БбсЗ] (Yanagisawa ег а!.. 1988; Бококп-хку, 1991). Согласно БокоЬулку с сотр. (1992) кроме прямой гомологии для этих веществ существует еще и общий спскчр физиологической и патофизиологической активности. Исходя из этого в следующей серии экспериментов мы изучали возможное токсическое влияние эндотелина-1 на культивируемые клетки сосудов.

Влияние эндотелиш-1 на состояние культивируемых гладкомышечных и эндотелиальных клеток сосудов. Эксперименты проводили на гладкомышечных

клетках аорты кролика и эндотелиальных клетках пупочной вены человека. Эндотелии-1 в концентрациях Ю-9 М и Ю-7 М добавляли в культуральную среду в течение 4-х дней, после чего анализировали морфологию и изменение плотности клеток. Добавление пептида в высоких дозах никак не повлияло на прикрепление и распластывание клеток во всех опытах. Нарушение морфологии или значительное изменение плотности клеток также не было отмечено ни в одной из экспериментальных групп. Между тем как достоверное токсическое влияние других веществ приводит к более чем десятикратному уменьшению последнего показателя.

Полученные результаты соответствуют данным о влиянии пептида на клетки нейронального происхождения (Nikolov et al., ¡993). Как было показано повреждение мозговых структур, наблюдаемое in vivo при системном введении эндотелина-1, объясняется сильной ишемией вследствие сосудосуживающего действия пептида. Прямого токсического действия в этих экспериментах также не было обнаружено. Таким образом, согласно литературным данным и результатам, полученным в наших экспериментах, эндотелии-1 даже в очень высоких (фармакологических) концентрациях не оказывает токсического влияния на клетки сосудистой природы и, как следствие, на функционирование тканей.

Другим предположением о механизме угнетающего действия пептида на эндотелий явилось допущение о том, что эндотелии-1 может накапливаться в липидных мембранах клеток и изменять либо их свойства, либо функционирование белков, встроенных в такие мембраны. Согласно литературе такая форма активности характерна для большого спектра эндогенных пептидов (вещество Р, брадикинин, кальцитонин-ген-родственный пептид и др.) и некоторых токсинов пептидной природы (обзор - Mousli et al., 1990). Общим свойством таких веществ является наличие гидрофобной последовательности в структуре молекулы и суммарный положительный заряд аминокислотных последовательностей (чаще всего +1+2). Данных о подобной активности для эндотелина мы не обнаружили. Тем не менее, согласно литературе, СООН-конец молекулы пептида образует гидрофобный "хвост", перед которым расположены два положительно заряженных аминокислотных остатка (Yanagisawa et al., 1988). Исходя из этого, следующим шагом в нашей работе стал анализ возможного взаимодействия пептида с липидными структурами.

Взаимодействия шдотелина-1 с липидными структурами. Определение возможности для эндотелина-1 накапливаться в липидных структурах мы провели по принципу биотестирования, в которых эффекторным органом служили колечки

изолированной аорты крыс, а измеряемым параметром - сохранение сосудосуживающей активности раствора эндотелина-1. Как показали результаты, присутствие яипидов в инкубационной камере, а еще в большей степени -предварительное выдерживание пептида в срсде лиииды-вода приводя! к уменьшению эффектов 10 нМ раствора эндотелина в несколько раз. Уровень вызываемого в этом случае сокращения сосудов приблизительно равен эффекту эндотелина-1, 5 х 10'10 М + 1 х Ю-9 М в контрольных условиях. Следовательно, молекулы пептида в растворе липиды-вода распределяются преимущественно в гидрофобной фазе в возможном соотношении 10:1. Это позволило нам высказать предположение, что эндотелии-1 может накапливаться в природных липидных структурах в результате как-либо изменяя их свойства. Анализ этой гипотезы был проведен при исследовании изменений удельной электропроводности искусственных липидных мембран под действием эндотелина-1.

Основным способом их получения является растворение азолектина (смеси природных липидов) в н-декане или сквалене. В зависимости от растворителя можно получить практически полностью бислойные сткруктуры (сквален) или мембраны с вкраплениями жидкости между слоями липидов (н-декан). В наших экспериментах использовались обе эти модели. В ходе эксперимента мембраны формировали на отверстии в тефлоновой пластинке и в течение 20 мин регистрировали изменения ее удельной электропроводности. В контрольных экспериментах этот показатель практически не изменялся со временем. В опытах со скваленом введение эндотелина-1 в концентрациях 1 х Ю*8 т5х 10"s М также не приводило к значимым изменениям свойств мембран.

В противовес этому в опытах с н-деканом пептид дозозависимо (с

максимумом примерно в 100 раз) увеличивал удельную электропроводность искусственных мембран. Согласно литературе, такая активность может отражать либо изменение свойств липидов (и прежде всего - температуру фазового перехода), либо каналообразующие свойства самого пептида (обзоры - Крепе, 1981; Eriksson, 1992). Тем не менее, последнее свойственно преимущественно лишь широкому кругу антибиотикоов (Корепшюва и др., 1989; 1994). но не эндогенным регуляторным гормонам. Вероятно, встраивание эндотелина-1 в мембраны может вызывать конформационные изменения липидов и, как следствие, изменение их состояния. В любом случае мы считаем, что увеличение удельного сопротивления мембран под действием эндотелина-1 может быть ассоциировано с его независимым от рецепторов

угнетающим влиянием на состояние эндотелия. Как уже говорилось, пептид способен изменять потенциал сосудистых клеток, но механизм осуществления этого эффекта практически не выяснен (Машки ¡993). Несомненно, и определение

характера действия эндотелина-1, и его возможная связь с вызываемым пептидом изменением функционального состояния эндотелия нуждаются в проведении дополнительных, более тщательных экспериментов.

ВЫВОДЫ

1. Эндотелии-1 при увеличении его концентраций в крови до 0.02 ч- 2 фмоль/мл вызывает только расширение коронарных сосудов наркотизированных крыс.

2. Инкубация изолированных сосудов с эндотелином-1 в концентрациях 1-10 пМ вызывает угнетение эндотелий-зависимого расслабления, которое сохраняется на фоне блокады эндотелиновых рецепторов.

3. Эндотелин-1 в концентрациях до 100 пМ не оказывает токсического влияния на культивируемые эндотелиальные и гладкомышечные клетки.

4. Эндотелин-1 способен накапливаться в липидных структурах и, в концентрациях 8-40 пМ вызывать увеличение электропроводности бислойных липидных мембран.

5. Эндотелин-1 в низких (физиологических) концентрациях вызывает уменьшение сопротивления сосудов в ответ на введете пептида, и потенциацию эндотелий-зависимого расслабления в ответ на другие вазомоторные факторы. Увеличение концентрации пептида приводит к значительному сужению сосудов и угнетению эндотелий-зависимого расслабления. Полученные результаты позволяют сделать предположение о различной физиологической роли циркулирующего эндотелина-1 в норме и при повышении его содержания в крови.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

!. Medvedeva N.A., Grafov М.А., Medvedev O.S. Fffects of low doses of endolhelm-1 on the coronary vascular resistance of anesthetized rats. // Abstracts of the 2-nd international Congress on Ultra Low Doses. Bordeaux, Francc. 1-2.10.1993. p.29.

2. Medvedeva N.A., Grafov M.A., Medvedev O.S. Physiological concentrations of cndothelm-1 produce only coronary vessels dilation in anesthetized rats. // Canadian J.Physiol.Pharmacol, v.72, Suppl.4. p.39.I994 (Abstract),

3. Графов M.A., Медведева H.A., Медведев О.С. К вопросу о роли эндотелина-1 различных концентраций в регуляции сопротивления коронарных сосудов у крыс. II В сб.:"Артериальная гинертензия. Эксперименталальные и клиническиие аспекты". Тезисы докладов конференции. Санкт-Петербург, 30 мая - 1 июня 1995 г. стр.19.

4. Графов М.А., Медведева Н.А., Медведев О.С. Физиологические концентрации эндотелина-1 вызывают только расширение коронарных сосудов наркотизированных крыс. // Бюллетень экспериментальной биологии ц медицины, т.120, ном.7. стр.16-19. 1995.

5. Графов М.А.. Лапшин А.В. Эндотелии-1 угнетает эндотелий-зависимое расслабление через нерецепторный механизм. // В сб.: "Биохимические и биофизические механизмы физиологических функций." Материалы конференции молодых физиологов и биохимиков России. Сани-Петербург, 19.-21.09.1995. стр.52.

6. Medvedeva N.A., Grafov М.А., Davydova S.A., Medvedev O.S. Physiological role of cndothelin-l in coronary vessels control in anesthetized rats. // In: Universities as Centres of Fundamental Research. Book II. Medicine. Moscow University Press. P.149-156. 1995.

7. Grafov M.A, Lapshm A.V., Rubina A.Yu., Manukhina E.B., Medvedeva N.A., Medvedev O.S. No role for PD 142893 in prevention of delayed endothelial dysfunction due to endothelin-1. // Abstracts of the International Symposium "Peptide Receptors". Montreal, Canada. 28.07.-01.08.1996. p.70.

8. Графов M.A., Лапшин A.B., Рубина А.Ю., Манухина Б.Б., Медведева Н.А.. Медведев О.С. Эндо!елин-1 модулирует вызванное ацетилхолином расслабление изолированной аорты крысы. // Доклады АН. т.351, ном.1. 1996.