Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Генетический полиморфизм молекул сосудистой регуляции у больных с периферическими витреохориоретинальными дистрофиямидистрофиями

ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Генетический полиморфизм молекул сосудистой регуляции у больных с периферическими витреохориоретинальными дистрофиямидистрофиями"

На правах рукописи

Серебренникова Светлана Викторовна

ГЕНЕТИЧЕСКИЙ ПОЛИМОРФИЗМ МОЛЕКУЛ СОСУДИСТОЙ РЕГУЛЯЦИИ У БОЛЬНЫХ С ПЕРИФРИЧЕСКИМИ ВИТРЕОХОРИОРЕТИНАЛЪНЬШИ ДИСТРОФИЯМИ

03.03.01 - физиология 14.03.03 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

12 ДЕК 2013

Чита-2013

005543768

005543768

Работа выполнена в ГБОУ ВПО "Читинская государственная медицинская академия" Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Научный руководитель: заслуженный работник высшей школы РФ, доктор медицинских наук, професор Витковский Юрий Антонович.

Официальные оппоненты:

Корытов Леонид Иннокентьевич, доктор медицинских наук, профессор кафедры нормальной физиологии ГБОУ ВПО "Иркутский государственный медицинский университет" Минздрава России.

Харинцева Светлана Владимировна, доктор медицинских наук, заведующая кафедрой офтальмологии с курсом отоларингологии ГБОУ ВПО "Читинская государственная медицинская академия" Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт медицинских проблем Севера" Сибирского отделения Российской Академии медицинских наук, г. Красноярск.

Защита состоится "¿^декабря 2013 года в^ОО часов на заседании диссертационного совета при ГБОУ ВПО "Читинская государственная медицинская академия" Министерства здравоохранения Российской Федерации (адрес 6720090, г. Чита, ул. Горького, 39-а).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО "Читинская государственная медицинская академия" Министерства здравоохранения Российской Федерации (адрес 6720090, г. Чита, ул. Горького, 39-а).

Автореферат разослан ноября 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Д.208.118.01

доктор медицинских наук,

профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Периферические витреохориорети-нальные дистрофии (ПВХРД) - это группа заболеваний, которая характеризуется различными дегенеративными изменениями сетчатки крайних отделов глазного дна и встречается у пациентов с различными видами рефракции. ПВХРД обнаруживаются в общей популяции в 513% случаев [Азнабаев М.Т. и соавт., 2005; Щуко А.Г. и соавт., 2008].

Наличие прогностически опасных видов ПВХРД является основной причиной развития отслойки сетчатки и, как следствие этого, -снижения зрения. По данным литературы, ПВХРД встречаются в 9096% у больных с отслойкой сетчатки [Щербакова С.Ю., 2009; Mitry D., 2009; Orozco-Gomez L.P., 2008]. Отслойка сетчатки остается в настоящее время значимой медико-социальной проблемой. Частота регматогенной отслойки сетчатки в общей популяции достигает 10-15 случаев на 100 тыс. населения, в 10% случаев она двухсторонняя [Бут-кевич В.И. и соавт., 2005, Щуко А.Г. и соавт., 2008; Meier Р., 2008; Mitry D., 2009]. Большинство пациентов с данной патологией - люди трудоспособного возраста. Слепота, возникающая на фоне отслойки сетчатки, занимает 6-7 место среди всех возможных причин потери трудоспособности [Терехович М.В. и соавт., 2009]. Возникновение дистрофий возможно в любом возрасте, с одинаковой вероятностью у мужчин и женщин [Батманов Ю.Е. и соавт., 2007, 2008; Зимина М.Г., 2009; Кудинова-Савченко H.A. и соавт., 2009; Мироненко JI.B. и соавт., 2010].

Учитывая тот факт, что в ранней фазе ПВХРД протекает почти бессимптомно, выявление данного заболевания в большинстве случаев происходит на стадиях, сопровождающихся уже необратимыми изменениями сетчатки. Сложившаяся ситуация ставит вопрос о необходимости поиска молекулярно-генетических предикторов ранней диагностики периферических витреохориоретинальных дистрофий. В настоящее время есть все основания относить ПВХРД к группе мультифак-торных заболеваний, развивающихся на фоне нарушения сосудистой регуляции сетчатки. В то же время, вероятно, первичные генетические эффекты определяют особенности продукции молекул сосудистой регуляции и рецепторов к ним. К сожалению, в наши дни молекуляр-но-генетические исследования не коснулись проблемы ПВХРД. Эти обстоятельства объясняют актуальность исследования полиморфизмов генов сосудистой регуляции при ПВХРД.

Цель исследования - изучить генетический полиморфизм молекул сосудистой регуляции у больных с периферическими витреохори-оретинальными дистрофиями и оценить их клинико-прогностическое значение для развития заболевания в этническом аспекте.

Для достижения цели решались следующие задачи:

1. Выявить и оценить частоту встречаемости аномальных аллельных вариантов генов ЕБШ ^198Лбп), еШБ (С786Т), УЕОРА(С634С), А ОТ (Мег235ТЬг) и их сочетаний среди больных с ПВХРД и относительно здоровых резидентов в русской и бурятской этнических группах.

2. Установить степень риска формирования ПВХРД у носителей аномальных аллельных вариантов генов ЕОШ (Ьуз198Азп), еКОБ (С786Т), УЕОРА (С634С), АвТ (Ме1235ТЬг) среди резидентов Забайкальского края.

3. Сравнить содержание эндотелина-1, метаболитов оксида азота и сосудистого эндотелиального фактора роста в слезной жидкости и плазме крови у пациентов с ПВХРД и здоровых лиц русской и бурятской национальностей с учетом генотипов ЕОШ (Ьуз198Азп). еКОБ (С786Т), УЕОРА (С6340), АСТ (Ме1235ТЬг) и их комбинаций.

4. Оценить роль полиморфизма генов молекул сосудистой регуляции в развитии осложнений ПВХРД.

Научная новизна исследования. Впервые обнаружено, что ал-лельные варианты еШБ (С786Т), АСТ (Мс*235ТЬг), ЕБ>П (Ьуя198АХп) предрасполагают к развитию ПВХРД, влияют на развитие осложнений заболевания в русской и бурятской этнических группах. Носители неблагоприятных аллельных вариантов генов еКОБ (С786Т), АСТ (Ме1235ТЬг) бурятской национальности имеют более высокий риск формирования ПВХРД по сравнению с таковыми русской национальности.

Впервые установлено, что уровень эндотелина-1 в слезной жидкости больных с ПВХРД обеих этнических групп увеличен по сравнению со здоровыми. Содержание метаболитов оксида азота в плазме крови пациентов с ПВХРД и здоровых лиц бурятской национальности выше по сравнению с аналогичными группами у русских, тогда как в слезной жидкости пациентов с ПВХРД русской и бурятской национальности их уровень ниже по сравнению с контрольной группой. У пациентов обеих национальностей заметно увеличивается содержание УЕвР в слезной жидкости при развитии осложнений ПВХРД. По мере развития осложнений ПВХРД в виде разрывов и отслойки сетчатки уровень

эндотелина-1 повышался, а метаболитов оксида азота снижался.

Впервые выявлено, что различные аллельные варианты и генотипы влияют на уровень молекул сосудистой регуляции в слезной жидкости. Наличие аллелиАбп полиморфизма гена Е1Ж1 (Ьуз198А5п) обуславливает повышенное содержание эндотелина-1 в слезной жидкости больных ПВХРД не зависимо от национальности. Носительство аллели С у русских и аллели Т гена еЫОБ (С786Т) у бурят в гомо- и гете-розиготоном состоянии определяет более высокое содержание метаболитов оксида азота в слезной жидкости здоровых и больных ПВХРД. НосительстЕо аллели О полиморфизма гена УЕОРА (С634в) в гомо- и гетерозиготном состоянии способствует более высокой продукции ростового фактора у здоровых и больных ПВХРД не зависимо от национальности. У больных - носителей генотипа С/С и САЗ падает содержание УЕвР в плазме крови.

Теоретическая и практическая значимость работы. В результате исследования получены новые данные о патогенезе ПВХРД, демонстрирующие роль генов молекул сосудистой регуляции еМОБ (С786Т), ЕЭЫ1 (Ъуз198Азп), УЕСРА (С634й) и АвТ (Ме1235ТЬг) в механизмах развития заболевания. Носительство патологических аллелей оказывает влияние на продукцию молекул сосудистой регуляции и развитие осложнений ПВХРД среди представителей русской и бурятской этнических групп.

Выявленные факты позволяют оценить риск развития ПВХРД в этническом аспекте и разработать новые методы прогнозирования и ранней диагностики заболевания среди резидентов русской и бурятской национальностей. Полученные сведения о наличии полиморфизмов еШв (С786Т), ЕЭШ (Ly.sl98A.sn), УКОРА (С634С) иЛОТ(Мс1235Т1:г) могут быть включены в генетический паспорт индивидуумов и использоваться для оценки риска развития ПВХРД.

Внедрение результатов работы. Теоретические положения, раскрываемые в диссертации, внедрены в учебный процесс на кафедрах нормальной физиологии и офтальмологии ГБОУ ВПО "Читинская государственная медицинская академия".

Апробация работы. Результаты исследования доложены на Всероссийской научно-практической конференции с международным участием, посвященной 60-летию Читинской государственной медицинской академии "Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины" 16 октября 2013 года.

Положения, выносимые на защиту:

1. Носители неблагоприятных аллельных вариантов генов eNOS (С786Т), EDN1 (Lys 198Asn) русской национальности и EDN1 (Lys 198 Asn), VEGFA(C634G), AGT (Met235Thr) бурятской национальности имеют более высокий риск развития ПВХРД. У пациентов с ПВХРД независимо от национальности встречаемость генотипа Asn/Asn гена EDN1 (Lys 198Asn) выше при наличии осложнений. У бурят с отслойками сетчатки отсутствуют нормальные генотипы генов EDN 1 (Lys 198 Asn), VEGFA(C634G) и AGT (Met235Thr). Распределение полиморфизмов генов eNOS (C786T),AGT(Met235Thr) у резидентов Забайкальского края имеет этнические особенности.

2. В слезной жидкости пациентов с ПВХРД русской и бурятской национальностей уровень эндотелина-1 увеличивался, а метаболитов оксида азота и сосудистого эндотелиального фактора роста снижался по сравнению с контрольной группой. Концентрация молекул сосудистой регуляции в слезной жидкости зависит от клинических проявлений ПВХРД.

3. Содержание эндотелина-1, метаболитов оксида азота и VEGF в слезной жидкости у пациентов с ПВХРД зависит от полиморфизма генов EDN1 (Lys 198Asn), eNOS (С786Т), AGT(Met235Thr) и VEGFA (C634G) и их сочетаний, присутствует этнический компонент. Влияние полиморфизмов генов EDN1 (Lysl98Asn), eNOS (С786Т), AGT (Met235Thr) и VEGFA (C634G) на развитие данной патологии носит этнический характер.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 131 странице машинописного текста, иллюстрирована 2 рисунками и 32 таблицами. Состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования и клинической характеристики больных, шести глав собственных результатов исследования, главы обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, состоящего из отечественных и зарубежных источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе с обследуемыми лицами соблюдались этнические принципы, предъявляемые Хельсинкской Декларацией Всемирной Медицинской Ассоциации (World Medical Association Declaration ofHelsinki, 1964, 2000 ред.).

Клиническая характеристика группы больных с ПВХРД. Методом сплошной выборки обследовано 213 пациентов с ПВХРД, проживающих на территории Забайкальского края. Средний возраст пациентов составил 34±6 лет. С целью изучения этнического компонента все больные были разделены на 2 группы:

- Первая группа - 131 пациент с ПВХРД (38 мужчин и 93 женщины) русской национальности;

- Вторая группа - 82 пациента с ПВХРД (17 мужчин и 65 женщин) бурятской национальности.

Данные об этнической принадлежности выясняли путем опроса, включая указания на национальную принадлежность предков до третьего поколения.

Критерии исключения из исследования: пациенты с наличием сопутствующих заболеваний, таких как гипертоническая болезнь, сахарный диабет, онкологические заболевания, а также больные с наличием глазной патологии (глаукома, возрастная макулярная дегенерация, катаракта, конъюнктивиты, кератиты, увеиты, вторичные отслойки сетчатки, дегенеративный ретиношизис). Исключены из исследования пациенты, пользующиеся контактными линзами, беременные, спортсмены, лица, перенесшие оперативные вмешательства в течение последних трех месяцев, в том числе лазерные и хирургические операции на глазах.

Контрольную группу составили 196 человек, проживающие на территории Забайкальского края, сходные по половым и возрастным характеристикам, не имеющие на момент исследования ПВХРД и соматической патологии.

Всем испытуемым проводилось офтальмологическое обследование, включающее определение остроты зрения (без коррекции, с коррекцией), биомикроскопию переднего отрезка глаза, биомикроофтальмоско-пшо (в условиях мидриаза) с помощью контактной трехзеркальной линзы Гольдмана, измерение внутриглазного давления - по показаниям.

Молекулярно-генетнческое исследование для выявления полиморфизмов генов е1Ч08(С786Т),ЕВМ (Ьу5198А5п),АСТ(Мег235ТЬг) н УЕСР (С634С). Забор крови осуществляли утром натощак из куби-тальной вены в вакутейнер с 3,8% цитратом в объеме 5.0 мл. Выделение ДНК осуществляли при помощи набора реагентов для биологических проб (НПФ "Литех", Россия, Москва). Выявление мутаций проводилось методом ПЦР с аллель-специфичными нраймерами (НПФ "Литех" -экспресс", Россия, Москва). Детекция продуктов амплификации осуществляли электрофоретическим способом.

Иммуноферментный анализ (ИФА). Для определения содержания эндотелина-1, VEGF и метаболитов оксида азота использовалась слезная жидкость и плазма крови 213 пациентов с ПВХРД и 196 здоровых лиц. В группе пациентов с ПВХРД забор слезы производился на больном и парном глазу. Нестимулированную слезную жидкость собирали из нижнего коныонктивального мешка с помощью стерильной одноразовой пластиковой насадки в объеме 20 мкл в стерильные пробирки типа "Эппендорф" и хранили при температуре -20°С. Во время проведения исследования она разводилась в 10 раз буфером для цитокинов Cytokine Assay Buffer (Upstate-Millipore, Watford, UK). Концентрацию ЭТ-1 и VEGF определяли методом иммуноферменткого анализа с применением тест-систем (ЗАО "Вектор-Бест", Новосибирск; "Biomedica gruppe", Австрия). Уровень оксида азота изучали по конечным продуктам его метаболизма -нитроксида-нитрита (N02) с использованием раствора Грисса.

Статистическая обработка результатов. Обработка результатов выполнена методами непараметрической и вариационной статистики с применением программы Statistica 6.0 (StatSoft Inc., США) и электронных таблиц Microsoft Excel, версия ХР. При сравнении изучаемых клинических и лабораторных показателей использовались непараметрические методы в связи с ненормальным распределением значений в вариационных рядах. При сравнении групп использовался критерий Манна-Уитни. Различия между сравниваемыми вариационными рядами считали значимыми при р<0,05. Данные представлены в виде медианы (Me) и интерквартального (25-й и 75-й персентили) интервала - указывали в скобках. Статистически значимые различия между группами по количественным признакам оценивались при помощи критерия Манна - Уитни (U-тест). Для сравнения групп по качественному бинарному признаку применялся критерий у/ (точный критерий Фишера). Для определения частот аллельных вариантов генов использовался закон Харди-Вайн-берга. Вычислялась относительная вероятность события (ОР).

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

В основу нашего исследования мы положили гипотезу о ведущем значении нарушений региональной гемодинамики в патогенезе ПВХРД.

Как известно, в развитии ПВХРД и отслойки сетчатки важную патогенетическую роль играет нарушение кровообращения глаза [Позде-еваО.Г., 2012; Саксонова Е.О., 2000]. Причины, приводящие к таким изменениям - различные. Однако, факторами, обуславливающими ин-

дивидуальное реагирование механизмов регуляции сосудистого тонуса в норме и патологии, являются генетические.

В первом блоке наблюдений мы изучили частоты аллельных вариантов генов EDN1 (Lys) 98Asn), eNOS (С786Т), VEGFA(C634G) и AGT (Met235Thr) среди пациентов с ПВХРД и здоровых лиц Забайкальского края с учетом этнических особенностей распределения. Мы исходили их того, что полиморфизмы генов при различных заболеваниях имеют разные уровни распространенности в регионах мира. Возможные положительные ассоциативные связи между полиморфизмами и заболеваниями сетчатки, установленные внутри одной популяции, необязательно будут таковыми в других популяциях.

Установлено, что у пациентов с ПВХРД бурятской национальности превалирует нормальная аллель С, а у русских - аномальная аллель Т полиморфизма гена eNOS (С786Т) (табл. 1).

Таблица 1

Распределение генотипов и частоты аллельных вариантов гена eNOS (С786Т) среди резидентов русской и бурятской национальностей

Показатель Русские Буряты

Группа контроля Пациенты с ПВХРД Группа контроля Пациенты с ПВХРД

Генотипы

С/С 41 (36,6%) 23(17,5%) р=0,016 5 (5,9%) р,=0,001 24 (29,3%) р=0,002

ОТ 46 (41,1%) 50 (38,2%) 26 (31,0%) 41 (50,,%)

Т/Т 25 (22,3%) 58 (44,5%) р=0,016 53 (63,1%) р,=0,001 17 (20,7%) р=0,001 р, =0,019

Всего 112 131 84 82

Аллели

С 128 (57,1%) 96 (36,6%) р=0,008 36 (21,4%) р, =0,001 89 (54,3%) р=0,001 р,=0,033

Т 96 (42,9%) 166 (63,4%) р=0,016 132 (78,6%) р,=0,001 75 (45,7%) р=0,004

Всего 224 262 168 164

Примечание: р - уровень статистически значимых различий по сравнению с контрольной группой; р, - уровень статистически значимых различий по сравнению с русскими (%2-тест).

Резиденты бурятской национальности - обладатели "дикого" варианта гена eNOS (С-аллель) в большей степени предрасположены к развитию ПВХРД, тогда как присутствие аномальной Т-аллели носит про-тективный характер. Встречаемость заболевания у носителей Т-аллели значительно меньше. Учитывая высокую частоту аномальной аллели (Т) в контрольной группе у резидентов бурятской национальности (78,6%), можно предположить, что ген eNOS имеет прямое отношение к патогенезу ПВХРД.

Обнаружено, что среди пациентов русской национальности, имеющих ПВХРД, 82,5%, а среди бурят - 92,7% носителей аномальной аллели гена EDN1 Lysl98Asn. Этнических различий встречаемости генотипов и аллельных вариантов гена EDNlLysl98Asn между резидентами русской и бурятской национальностей выявлено не было.

Среди бурят с ПВХРД аномальный генотип G/G гена VEGFA (С634G) встречался в 2,5 раза чаще по сравнению с контрольной группой. Таким образом, буряты с ПВХРД - обладатели аномальной аллели G и патологического генотипа G/G в большей степени предрасположены к развитию ПВХРД. Этнических различий встречаемости генотипов и аллельных вариантов гена VEGFA(C634G) среди резидентов русской и бурятской национальности не обнаружено.

Выявлено, что 91,4% пациентов с ПВХРД бурятской национальности являлись носителями аномального варианта гена AGT Met235Thr. У всех бурят с отслойками сетчатки встречалась Thr-аллель, из них в 50% случаев в гомозиготном состоянии. В бурятской этнической группе у больных с разрывами сетчатки мутантная аллель Thr встречалась чаще, чем у русских с таким же типом ПВХРД. Выявлены этнические различия: у бурят с ПВХРД аномальная аллель Thr встречалась чаще, а нормальная аллель Met реже, чем у русских.

Мы не обнаружили изменений концентрации эндотелина-1, метаболитов оксида азота и VEGF в плазме крови пациентов с ПВХРД и здоровых лиц. Однако мы выявили изменение уровня молекул сосудистой регуляции в слезной жидкости.

Установлено, что у русских в группе пациентов с ПВХРД содержание эндотелина-1 в слезной жидкости в 2,3 раза выше по сравнению с контрольной группой. Такая же закономерность прослеживалась у пациентов бурятской национальности: содержание эндотелина-1 в слезной жидкости у больных в 1,7 раза выше по сравнению со здоровыми (табл. 2).

Таблица 2

Уровень эндотелина-1 (фмоль/мл) в слезной жидкости больных с ПВХРД русской и бурятской национальностей; Ме (25-й; 75-й персентили)

Русские Буряты

Контрольная группа п=П2 Глаза с ПВХРД п=196 Парные таза п=66 Контрольная группа п=84 Глаза с ПВХРД п=117 Парные глаза п=47

0,87 (0,46; 1,36) 2,04 (1,22; 2,52) р=0,001 1,56 (0,87; 2,21) 0,84 (0,53; 1,13) 1,44 (1,14; 2,02) р=0,001 р, =0,001 1,02 (0,91; 1,44)

Примечание: п - количество глаз; р - уровень статистически значимых различий по сравнению с контрольной группой; - уровень статистически значимых различий по сравнению с русскими (Критерий Манна-Уитни).

У пациентов с ПВХРД русской и бурятской национальностей уровень метаболитов оксида азота в слезной жидкости оказался в 4 и 4,8 раза ниже по сравнению с контрольными группами. У бурят с ПВХРД уровень метаболитов оксида азота в слезной жидкости выше по сравнению с русскими (табл. 3).

Таблица 3

Уровень метаболитов N0 (мкг/мл) в слезной жидкости больных с ПВХРД русской и бурятской национальностей;

Ме (25-й; 75-й персентили)

Русские Буряты

Контрольная группа п—13 2 Глаза с ПВХРД п=196 Парные глаза п=66 Контрольная группа п=84 Глаза с ПВХРД п=117 Парные глаза п=47

4,35 (3,50; 5,29) 0,92 (0,46; 1,41) р=0,001 1,25 (0,84; 2,41) р=0,001 4,30 (3,91; 5,08) 1,07 (0,61; 3,89) р=0,001 р,=0,049 1,75 (0,77; 2,49) р=0,001

Примечание: п - количество глаз; р - уровень статистически значимых различий по сравнению с контрольной группой; р! - уровень статистически значимых различий по сравнению с русскими (Критерий Манна-Уитни).

Выявлено, что концентрация метаболитов оксида азота в плазме крови пациентов с ПВХРД и здоровых лиц бурятской национальности выше по сравнению с аналогичными группами у русских.

В обеих этнических группах прослеживается увеличение содержания эндотелина-1 и уменьшение концентрации метаболитов оксида азота в слезной жидкости пациентов с ПВХРД по сравнению со здоровыми лицами. Причем максимальный уровень эндотелина-1 и минимальный уровень метаболитов N0 был обнаружен в слезной жидкости пациентов с отслойками сетчатки.

Проанализировав изменения уровня эндотелина-1, метаболитов оксида азота в слезной жидкости, мы предложили коэффициент риска развития осложнений ПВХРД (К), равный соотношению содержания эндотелина-1 и метаболитов оксида азота. Предварительно все данные были переведены в единую систему (фмоль/мл) (табл. 4).

Таблица 4

Уровень эндотелина-1, метаболитов N0 в слезной жидкости пациентов русской национальности с различным течением ПВХРД; Ме (25-й; 75-й персентили)

Контрольная группа п=112 Неосложнен-11 ы с ПВХВД п=99 пвхщ, осложненные разрывами сетчатки п=83 ПВХЩ, осложненные отслойкой сетчатки п=14

ЭТ-1 (фмоль/мл) 0,87 (0,46; 1,36) 1,65 (0,71; 2,02) 1,96 (1,55; 2,33) р=0,035 2,35 (1.18; 3,53) р=0,001 р,=0,049

NOx (мкг/мл) 4,35 (3,50; 5,20) 1,07 (0,80; 1,60) р=0,001 0,92 (0,46; 1,53) р=0,001 0,53 (0,34; 0,92) р=0,001 р,=0,022

N04 (фмоль/мл) 94565,2 (76086,9 115000,0) 23260,9 (17391; 34782,6) 20000,0 (10000,0; 33260,9) 11521,7 (7391,3; 20000,0)

K=GT-1/N04 х ю-6 9,20 (6,05; 11,8) 70,93 (40,83; 58,08) 98,0 (70,05; 155,0) 203,96 (159,65; 176,5)

Примечание: п-количестао глаз, р - уровень статистически значимых различий по сравнению с контролем; р - уровень статистически значимых различий по сравнению с группой пациентов с неосложненным течением ПВХРД (Критерий Манна-Уитни).

Предложенный нами коэффициент отражает преобладание вазокон-стрикторного или вазодилатирующего эффекта. У пациентов бурятской национальности мы получили аналогичные результаты. Среди пациентов с отслойками сетчатки обеих этнических групп этот коэффициент оказался максимальным и превышал норму на два порядка. В связи с этим, предложенный коэффициент может применяться в качестве предиктора осложнений ПВХРД.

Обнаружено, что в слезной жидкости здоровых лиц русской и бурятской национальностей увеличивался уровень УЕОЕ по сравнению с больными. Также установлено, что у пациентов обеих национальностей заметно повышалось содержание УЕОР в слезной жидкости при развитии осложнений ПВХРД, что является свидетельством развития репаративных процессов (рис. 1).

нг/мл

40

35

зо ;

25 у-20 4" 15 10

5 {о 4-

Контрольная Неосложненные ПВХРД группа ПВХРД осложненные

ретинэльными разрывами

ПВХРД, осложненные отслойкой сетчатки

я Русские О Буряты

■ - уровень статистически значимых различий по сравнению с контролем; ** - уровень статистически значимых различий по сравнению с неослож-ненным течением ПВХРД;

***- уровень статистически значимых различий по сравнению с группой пациентов с ПВХРД, осложненных разрывами сетчатки; ♦ - уровень статистически значимых различий по сравнению с русскими. Рис. 1. Уровень УЕОР в слезной жидкости у пациентов русской и бурятской национальностей с неосложненным и осложненным течением ПВХРД

Мы изучили зависимость концентрации вазоактивных веществ от генотипов, а также изменение содержания эндотелина-1, метаболитов оксида азота и VEGF при сочетании полиморфных вариантов генов EDN1 (Lysl98Asn), eNOS (С786Т), VEGFA(C634G) и AGT (Met23 5Thr).

На концентрацию эндотелина-1 в слезной жидкости оказывал влияние генотип EDN1 (Lysl98Asn). Установлено, что в слезной жидкости пациентов с ПВХРД русской и бурятской национальностей уровень эндотелина-1 среди носителей генотипов Asn/Asn и Lys/Asn выше по сравнению с гомозиготами по нормальной аллели Lys. У пациентов с ПВХРД обеих национальностей среди носителей генотипа Lys/Asn и Asn/Asn содержание эндотелина-1 в слезной жидкости было выше по сравнению со здоровыми резидентами, обладателями аналогичных генотипов в контрольных группах (табл. 5).

Таблица 5

Уровень эндотелина-1 (фмоль/мл) в слезной жидкости пациентов с ПВХРД и здоровых лиц русской и бурятской национальностей в зависимости от генотипов гена EDN1 (Lysl98Asn);

Me (25-й; 75-й персентили)

Генотип

Lys/Lys Lys/Asn Asn/Asn

Русские Контрольная группа п=112 1,39 (1,10; 1,95) 0,88 (0,53; 1,51) 0,87 (0,79; 3,23)

Пациенты с ПВХРД п=196 1,12 (0,89; 1,17) 2,10 (1,99; 2,10) р=0,008 р, =0,001 2,70 (2,19; 3,16) р,=0,001

Буряты Контрольная группа п=84 0,92 (0,80; 1,04) 0,61 (0,44; 1,76) 1,35 (0,91; 1,73) р,=0,001

Пациенты с ПВХРД п=117 ■ 0,65 (0,45; 0,94) 2,0 (1,44; 2,08) р=0,001 р, =0,001 2,13 (1,76; 2,35) р=0,001 р, =0,008 р,=0,001

Примечание: п - количество глаз; р - уровень статистически значимых различий по сравнению с контрольной группой; р, - уровень статистически значимых различий с генотипом Lys/Lys; р2 - уровень статистически значимых различий по сравнению с русскими (Критерий Манна-Уитни).

Таким образом, наличие патологического аллельного триплета Asn полиморфизма EDN1 (Lys 198 Asn) обуславливает высокое содержание эндотелина-1 в слезной жидкости у гетерозигот Lys/Asn и гомозигот Asn/Asn.

Продукция оксида азота и содержание в слезной жидкости его метаболитов зависит от полиморфизма фермента eNOS (С786Т). Среди обладателей генотипа Т/Т русской национальности, у которых обнаружены периферические дистрофии сетчатки, уровень метаболитов оксида азота в слезной жидкости ниже, чем у генотипа С/С. И наоборот, у представителей бурятской национальности с ПВХРД содержание метаболитов оксида азота в слезной жидкости выше у гомозигот по аномальной аллели Т, чем у носителей С/С генотипа.

Снижение уровня метаболитов оксида азота в слезной жидкости пациентов с ПВХРД, возможно, связано с изменением активности эн-дотелиальной NO-синтазы - продукта полиморфного гена.

У пациентов с ПВХРД бурятской национальности концентрация VEGF в плазме крови и слезной жидкости у носителей генотипа G/G полиморфизма VEGFA (C634G) существенно выше, чем у гомозигот С/С.

В русской этнической группе обнаружено повышение уровня VEGF в плазме крови у носителей генотипа G/G по сравнению с гомозиготами по нормальной С-аллели.

Различия в генах, регулирующих сосудистый тонус, могут сказываться на уровне продукции кодируемых белков и, тем самым, на соотношении вазоконстрикторов и вазодилататоров. В связи с этим полиморфизм генов EDN1 (Lysl98Asn), eNOS (С786Т), VEGFA (C634G), AGT (Met235Thr) представляет значительный интерес, т.к. именно эти белки вносят наибольший вклад в регуляцию сосудистого тонуса.

Мы оценили распространенность сочетания отдельных полиморфизмов генов сосудистой регуляции в норме и при ПВХРД. Под сочетанием полиморфных вариантов генов мы принимали комбинацию гомозигот по аномальной аллели двух и более генов.

В русской этнической группе при сочетании гомозиготных генотипов по аномальной аллели гена eNOS-786 (С/С) и VEGFA-634 (G/G) уровень эндотелина-1 в слезной жидкости выше, а метаболитов оксида азота - ниже. Подобные результаты получены при сочетании генотипов eNOS-786 (С/С) и EDN1-198 (Asn/Asn). А концентрация VEGF в слезной жидкости резко снижена при сочетании аномальных генотипов eNOS-786 (Т/Т) и VEGFA-634 (G/G).

При сочетании гомозиготных генотипов по аномальной аллели гена VEGFA-634 (G/G) и EDN1-198 (Asn/Asn) уровень эндотелина-1 в слезной жидкости пациентов с ПВХРД бурятской национальности оказался выше, а метаболитов оксида азота - заметно ниже (табл. 6).

Таблица 6

Уровень эндотелина-1, метаболитов оксида азота и VEGF в слезной жидкости бурят с ПВХРД при сочетании полиморфных вариантов генов EDN1 (Lys 198Asn), AGT(Met235Thr) и VEGF (C634G)

VEGFA-634 (С/С) + EDN1-19S (Lys/Lys) VEGFA-634 (G/G) + EDN1-198 (Asn/Asn) VEGFA-634 (C/C) + AGT-235 (Met/Met) VEGFA-634 (G/G) + AGT-235 (Thr/Thr)

ЭТ-1 (фмоль/мл) 1,1 (0,8; 1,2) 1,6 (1,2; 1,6) p=0,023 0,8 (0,6; 1,1) 1,7 (1,2; 2,2) p=0,010

NO (мкг/мл) 1,75 (1,56; 1,95) 0,76 (0,69; 0,85) p=0,031 1,59 (0,97; 2,76) 0,79 (0,54; 1,01) p=0,047

VEGF (нг/мл) 22,0 (17,3; 60,5) 22,1 (19,9; 23,5) 25,2 (14,9; 26,8) 16,9 (11,2; 25,3) p=0,05

Примечание: р - уровень статистически значимых различий по сравнению с сочетанием генотипов по нормальным аллелям (Критерий Манна-Уитни).

Очевидно, уникальный ансамбль аллельных вариантов генов EDN1 (Lysl98Asn), eNOS (С786Т), VEGFA (C634G), AGT (Met235Thr) может отчасти определять характер индивидуального реагирования в механизмах развития ПВХРД. В связи с этим нами был изучен уровень эндотелина-1 и метаболитов оксида азота и VEGF в слезной жидкости и плазме крови у здоровых лиц и пациентов с ПВХРД с учетом аллельных вариантов генов EDN1 (Lysl98Asn), eNOS (С786Т), VEGFA (C634G) и AGT (Met235Thr).

Полученные результаты подтвердили, что ПВХРД является полигенным заболеванием. В результате мутаций структура гена или промотора участка может менять скорость транскрипции, стабильность мРНК или качество и активность продуцируемого белка. Это, в конечном итоге, сказывается на активности регуляторных молекул.

Решающее значение в регуляции сосудистого тонуса придается эндотелиальным факторам. Одно из направлений функционирования эндотелия - его участие в формировании адекватного кровотока, что обеспечивается согласованием агрегатного состояния крови и тонуса сосудов. Сочетание на эндотелии вазоконстрикторов и вазодилатато-ров в физиологических условиях является основой для адекватного кровотока, особенно в сосудах микроциркуляции [Кузник Б.И., 2012; Лупинская З.А., 2003]. Эндотелиальный слой регулирует местный сосудистый тонус и участвует в формировании системных гемодинами-ческих реакций, являясь конечным звеном нейрогенной и гуморальной регуляции сосудистого тонуса, где эта реакция реализуется и моделирует различные внутриклеточные процессы.

Таким образом, получены новые сведения о роли полиморфизма генов молекул регуляции сосудистого тонуса в механизмах развития периферических витреохориоретинальных дистрофий и их осложнений. Концептуальная схема патогенеза ПВХРД представлена на рис. 2.

Рис. 2 Концептуальная схема включения отдельных звеньев патогенеза в развитие осложнений ПВХРД

Мы считаем, что исследование генов молекул сосудистой регуляции может оказаться востребованным для прогнозирования развития ПВХРД и его осложнений. Полученные сведения о наличии полиморфизма генов eNOS (С786Т), AGT (Met235Thr), EDN1 (Lysl98Asn) и VEGFA (C634G) могут быть включены в генетический паспорт индивидуумов и совместно с другими полиморфизмами использоваться для оценки риска развития ПВХРД.

ВЫВОДЫ

1. Встречаемость полиморфизмов генов сосудистой регуляции у пациентов с ПВХРД зависит от этнической принадлежности. У лиц бурятской национальности с ПВХРД превалирует аллель С, а у русских - аллель Т полиморфизма гена eNOS (С786Т). Среди здоровых лиц бурятской национальности чаще встречается генотип С/С, а с ПВХРД - G/G полиморфизма VEGFA (C634G). Наличие аллели G полиморфизма VEGFA (C634G) располагает их к развитию ПВХРД. Генотип Met/Met полиморфизма гена AGT Met235Thr среди русских с ПВХРД встречается в 4 раза чаще, чем среди бурят. В бурятской этнической группе обладатели аномальной аллели полиморфизма гена AGT Met235Thr в большей степени предрасположены к развитию ПВХРД. Носители неблагоприятных аллельных вариантов генов eNOS (С786Т), AGT (Met235Thr) бурятской национальности имеют более высокий риск формирования ПВХРД но сравнению с таковыми русской национальности.

2. Уровень эндотелина-1 в слезной жидкости больных с ПВХРД обеих этнических групп увеличен по сравнению со здоровыми лицами. Среди пациентов с ПВХРД русской национальности содержание эндотелина-1 в слезной жидкости в 2,3 раза, а бурятской - в 1,7 раза выше, чем у здоровых. Содержание метаболитов оксида азота в плазме крови пациентов с ПВХРД и здоровых лиц бурятской национальности выше по сравнению с аналогичными группами у русских. Уровень метаболитов оксида азота в слезной жидкости пациентов с ПВХРД русской и бурятской национальности ниже по сравнению с контрольной группой. Уровень VEGF в слезной жидкости у больных ПВХРД русской и бурятской национальностей ниже, чем у здоровых лиц.

3. У пациентов обеих национальностей заметно увеличивалось содержание VEGF в слезной жидкости при развитии осложнений ПВХРД.

У русских содержание VEGF в слезной жидкости контрольной группы и пациентов с ПВХРД, осложненными ретинальными разрывами, ниже в два раза по сравнению с резидентами бурятской национальности.

4. Коэффициент К, отражающий соотношение концентрации эндотели-на-1 и метаболитов оксида азота, существенно повышался по мере развития осложнений ПВХРД. У пациентов с ретинальными разрывами, предложенный коэффициент К увеличивался в 10 раз, а с отслойками сетчатки - в 23 раза по сравнению с неосложненным течением заболевания.

5. Наличие аллели Asn полиморфизма гена EDN1 (Lysl98Asn) обуславливает повышенное содержание эндотелина-1 в слезной жидкости больных с ПВХРД не зависимо от национальности. У обладателей генотипа Asn/Asn выявлялся наиболее высокий уровень, генотипа Lys/Asn - средний и генотипа Lys/Lys - низкий уровень эндоте-лина-1 в слезной жидкости. Концентрация эндотелина-1 у пациентов ПВХРД больше относительно здоровых лиц.

6. У пациентов с ПВХРД бурятской национальности - носителей Т/Т-генотипа полиморфизма гена eNOS (С786Т) уровень метаболитов оксида азота в плазме крови выше по сравнению с С/С генотипом. Носительство аллели С у русских и аллели Т гена eNOS (С786Т) у бурят в гомо- и гетерозиготоном состоянии определяет более высокое содержание метаболитов оксида азота в слезной жидкости здоровых и больных ПВХРД. При ПВХРД содержание метаболитов NO в слезной жидкости у бурят, которые являются носителями аномальной аллели Т в гомозиготном и гетерозиготном состоянии, в 6 раз выше по сравнению с пациентами русской национальности.

7. Носительство аллели G полиморфизма гена VEGFA (C634G) в гомо-и гетерозиготном состоянии способствует более высокой продукции ростового фактора у здоровых и пациентов с ПВХРД не зависимо от национальности. У больных-носителей генотипа С/С и C/G падает содержание VEGF в плазме крови. У пациентов с ПВХРД русской этнической группы, обладателей генотипа G/G, концентрация VEGF в слезной жидкости в 5,5 раз выше по сравнению с аналогичной группой бурятской национальности.

8. В плазме крови пациентов бурятской национальности уровень VEGF увеличивался при сочетании аномальных генотипов генов EDN1 (L,ysl98Asn) и VEGF (C634G). При сочетании гомозиготных генотипов по аномальной аллели гена VEGFA-634 (G/G) и EDN1-198 (Asn/Asn),

генотипов VEGFA-634 (G/G) и AGT-235 (Thr/Thr) уровень эндоте-лина-1 в слезной жидкости наиболее сильно повышался, а метаболитов оксида азота - снижался. В русской этнической группе при сочетании гомозиготных генотипов по аномальной аллели гена eNOS-786 (С/С) и VEGFA-634 (G/G), eNOS-786 (С/С) и EDN1-198 (Asn/ Asn) концентрация эндотелина-1 в слезной жидкости росла, а метаболитов оксида азота - падала. Содержание VEGF в слезной жидкости резко снижено при сочетании аномальных генотипов eNOS-786 (Т/Т) и VEGFA-634 (G/G).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи, опубликованные в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки России:

1. Серебренникова C.B. Полиморфизм гена эндотелиальной NO-синта-зы (С786Т) у больных с периферическими витреохориоретинальны-ми дистрофиями в Забайкальском крае [Электронный ресурс] / C.B. Серебренникова, Ю.А. Витковский //Забайкальский медицинский вестник. - 2012. - №1. - С. 17-21. - Режим доступа: http:// medacadem.chita.ru/zmv (дата обращения 01.12.2012).

2. Серебренникова C.B. Содержание эндотелина-1 в плазме крови и слезной жидкости у больных с периферической витреохориорети-нальной дистрофией в Забайкальском крае [Электронный ресурс] / C.B. Серебренникова, JI.A. Голубина, Ю.А. Витковский//Забайкальский медицинский вестник. - 2012. - №2. - С. 17-19. - Режим доступа: http://medacadem.chita.ru/zmv (дата обращения 15.03.2013).

3. Серебренникова C.B. Полиморфизм гена эндотелина-1 (Lysl98Asn) у больных с периферической витреохориоретинальной дистрофией в Забайкальском крае / C.B. Серебренникова, Л.А. Голубина, Ю.А. Витковский // Дальневосточный медицинский журнал. - 2012. - №4. -С. 76-78.

4. Серебренникова C.B. Генетический полиморфизм эндотелина-1 (Lys 198Asn) у пациентов с периферической витреохориоретинальной дистрофией в Забайкальском крае / C.B. Серебренникова, A.A. Петров, Ю.А. Витковский // Молекулярная медицина. - 2013. -№2. -С. 54-56.

Работы, опубликованные в других изданиях:

5. Serebrennikova S.V. The levels of endothelin-1 in the plasma of patients with peripheral vitreoretinal degeneration / S.V. Serebrennikova, Yu.A. Vitkovsky U Trombosis research: Abstracts and proceedings of the 22nd Internashional Congress on Thrombosis. Nice, France, 6 - 9 October, 2012.-Vol.130.-P. 140.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Ген АСТ - ген ангиотензиногена

Ген ЕПЖ1 - ген эндотелина-1

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ГЩР - полимеразная цепная реакция

ПВХРД - периферические витреохориорегинальные дистрофии

Э'Г-1 - эндотелии-1

N0 - оксид азота

>Юх - суммарное количество метаболитов оксида азота

(нитратов и нитритов)

е>Ю8 - эндотелиальная синтаза оксида азота

НИМ - фактор, индуцируемый гипоксией

\TEGF - сосудистый эндотелиальный фактор роста

Лицензия ИД №03077 от 23.10.00. Подписано в печать 14.11.2013. Бумага офсетная. Гарнитура Times New Roman Формат 60 х 84 '/16. Усл. печ. л. 1,0 Тираж 100. Заказ № 150/2013.

Отпечатано в редакционно-издательском центре ЧГМА 672090, Чита, ул. Горького, 39-а.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Серебренникова, Светлана Викторовна, Чита

Министерство здравоохранения Российской Федерации Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего

профессионального образования «Читинская государственная медицинская академия»

04201 45521 7 На правах рукописи

Серебренникова Светлана Викторовна

ГЕНЕТИЧЕСКИЙ ПОЛИМОРФИЗМ МОЛЕКУЛ СОСУДИСТОЙ РЕГУЛЯЦИИ У БОЛЬНЫХ С ПЕРИФЕРИЧЕСКИМИ ВИТРЕОХОРИОРЕТИНАЛЬНЫМИ ДИСТРОФИЯМИ

03.03.01 - физиология

14.03.03 - патологическая физиология

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Научный руководитель: Заслуженный работник высшей школы РФ, доктор медицинских наук, професор Ю.А. Витковский

Чита - 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список сокращений.........................................................................5

Введение.......................................................................................6

Актуальность проблемы...................................................................6

Цель и задачи исследования...............................................................7

Задачи..........................................................................................7

Научная новизна......................................................................:......8

Теоретическая и практическая значимость работы...................................9

Положения, выносимые на защиту.......................................................9

Внедрение результатов работы..........................................................10

Апробация и практическая реализация работы.......................................10

Глава 1. Обзор литературы................................................................11

1.1. Периферические витреохориоретинальные дистрофии. Определение. Классификация. Клиническая картина............................................11

1.2. Особенности метаболизма сетчатки. Патогенетические аспекты формирования ПВХРД...............................................................15

1.3. Особенности строения микроциркуляторного русла сетчатки...............13

1.4. Роль сосудистых факторов в патогенезе ПВХРД................................23

1.4.1. Эндотелии-1............................................................................24

1.4.2. Оксид азота.............................................................................28

1.4.3. Сосудистый эндотелиальный фактор роста.....................................32

1.5. Роль генетических полиморфизмов в развитии ПВХРД........................35

1.6. Современные подходы к лечению ПВХРД.........................................37

Глава 2. Материалы и методы исследования...........................................40

2.1. Клиническая характеристика группы больных с ПВХРД.......................40

2.2. Клиническая характеристика группы контроля...................................42

2.3. Молекулярно-генетическое исследование для выявления полиморфизмов генов еЫОБ (С786Т), ЕОЫ1 (Ьуз198Азп), АОТ(Ме1235ТЬг) и УЕОБ (С634С)...43 2.3.1. Выделение ДНК........................................................................43

2.3.2. Постановка полимеразной цепной реакции (ПЦР)............................43

2.3.3. Детекция продуктов амплификации...............................................44

2.4. Иммуноферментный анализ (ИФА)..................................................45

2.4.1. Определение содержания эндотелина-1 и УЕОБ...............................45

2.4.2. Определение содержания оксида азота...........................................46

2.5. Статистическая обработка результатов.............................................46

Глава 3. Собственные исследования.....................................................48

3.1. Распространенность полиморфизмов генов ЕОЫ1 (Ьу8198Азп), еМЭ8 (С786Т), АвТ(Ме123 5ТЪг), УЕвРА (С634С) среди здоровых лиц и пациентов с ГТВХРД русской и бурятской национальностей.................48

3.1.1. Распространенность полиморфизма гена ЕО]ЧГ1 (Ъуз198А8п) среди здоровых лиц и пациентов с ГТВХРД русской и бурятской национальностей......................................................................48

3.1.2. Распространенность полиморфизма гена еЫОБ (С786Т) среди здоровых лиц и пациентов с ПВХРД русской и бурятской национальностей.........52

3.1.3. Распространенность полиморфизма гена УЕОБА (С634С) среди пациентов с ПВХРД русской и бурятской национальностей...............55

3.1.4. Распространенность полиморфизма гена АвТ (Ме1235ТЬг) среди здоровых лиц и больных с ПВХРД русской и бурятской национальностей......................................................................57

3.2. Распространенность полиморфизмов генов е!чЮ8(С786Т), ЕОШ (Ьу5198Ьуз), АСТ(Ме1235ТЬг) и УЕОРА(С634С) среди пациентов с различным течением ПВХРД русской и бурятской национальности.......60

3.3. Содержание эндотелина-1, метаболитов N0 и УЕОБ в плазме крови и слезной жидкости у больных с ПВХРД русской и бурятской национальностей........................................................................64

3.3.1. Содержание эндотелина-1 в плазме крови и слезной жидкости у больных с ПВХРД и здоровых лиц русской и бурятской национальностей.........65

3.3.2. Содержание метаболитов N0 (нитратов/нитритов) в плазме крови и слезной жидкости у пациентов с ПВХРД и здоровых лиц русской и бурятской национальности.........................................................67

3.3.3. Содержание VEGF в плазме крови и слезной жидкости у больных с ПВХРД и здоровых лиц русской и бурятской национальностей...........69

3.4. Содержание эндотелина-1, метаболитов NO и VEGF в плазме крови и слезной жидкости у больных и здоровых лиц русской и бурятской национальностей в зависимости от клинического проявления ПВХРД.....71

3.5. Содержание эндотелина-1, метаболитов NO и VEGF в плазме крови и слезной жидкости среди здоровых резидентов и пациентов с ПВХРД русской и бурятской национальностей в зависимости от генотипов........76

3.5.1. Содержание эндотелина-1 в плазме крови и слезной жидкости среди здоровых резидентов и пациентов с ПВХРД русской и бурятской национальностей в зависимости от генотипов...................................76

3.5.2. Содержание метаболитов NO в плазме крови и слезной жидкости среди здоровых резидентов и пациентов с ПВХРД русской и бурятской национальностей в зависимости от генотипов...................................79

3.5.3. Содержание VEGF в плазме крови и слезной жидкости среди здоровых резидентов и пациентов с ПВХРД русской и бурятской национальностей в зависимости от генотипов.............................................................82

3.6. Сочетания полиморфных вариантов генов eNOS (С786Т), EDN1 (Lysl98Asn), AGT (Met235Thr) и VEGF (C634G) в русской и бурятской этнических группах.....................................................................85

Глава 4. Обсуждение полученных результатов.......................................92

Выводы........................................................................................102

Список литературы..........................................................................105

Список сокращений:

АТФ - аденозинтрифосфат

АМФ - аденозинмонофосфат

В-ЭТ - большой эндотелии

Ген AGT - ген ангиотензиногена

Ген EDN1 - ген эндотелина-1

ГМК - гладкомышечные клетки

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РНК - рибонуклеиновая кислота

иРНК - информационная рибонуклеиновая кислота

мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота

ЛК - лазерная коагуляция

ПВХРД - периферические витреохориоретинальные дистрофии ПОЛ - перекисное окисление липидов ЭТ-1 - эндотелии-1

ЭПФ - эндотелин-превращающий фермент цГМФ - циклический гуанозинмонофосфат N0 - оксид азота

NOx - суммарное количество метаболитов оксида азота (нитратов/нитритов)

NOS - синтаза оксида азота

eNOS - эндотелиальная синтаза оксида азота

nNOS - нейрональная синтаза оксида азота

iNOS - индуцибельная синтаза оксида азота

HIF-1 - фактор, индуцируемый гипоксией

VEGF - сосудистый эндотелиальный фактор роста

VEGFR - рецептор сосудистого эндотелиального фактора роста

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Периферические витреохориоретинальные дистрофии (ПВХРД) - это группа заболеваний, которая характеризуется различными дегенеративными изменениями сетчатки крайних отделов глазного дна и встречается у пациентов с различными видами рефракции. ПВХРД обнаруживаются в общей популяции в 5-13% случаев [1,4, 141].

Наличие прогностически опасных видов ПВХРД является основной причиной развития отслойки сетчатки и, как следствие этого - снижения зрения. По данным литературы, ПВХРД встречаются в 90-96% у больных с отслойкой сетчатки [2, 103, 107, 140, 194, 200, 223]. Отслойка сетчатки остается в настоящее время значимой медико-социальной проблемой. Частота регматогенной отслойки сетчатки в общей популяции достигает 10-15 случаев на 100 тыс. населения, в 10% случаев она двухсторонняя [29, 141, 152, 185, 193, 194, 205, 206]. Большинство пациентов с данной патологией составляют люди трудоспособного возраста. Слепота, возникающая на фоне отслойки сетчатки, занимает 6-7 место среди всех возможных причин потери трудоспособности [121].

Возникновение дистрофий возможно в любом возрасте, с одинаковой вероятностью у мужчин и женщин [16, 17, 50, 64, 75]. Учитывая тот факт, что в ранней фазе ПВХРД протекает почти бессимптомно, выявление данного заболевания в большинстве случаев происходит на стадиях, сопровождающихся уже необратимыми изменениями сетчатки. Сложившаяся ситуация ставит вопрос о необходимости поиска молекулярно-генетических предикторов ранней диагностики ПВХРД. В настоящее время есть все основания относить ПВХРД к группе мультифакторных заболеваний, развивающихся на фоне нарушения сосудистой регуляции сетчатки. В то же время, вероятно, первичные генетические эффекты определяют особенности продукции молекул сосудистой регуляции и рецепторов к ним. К сожалению,

в наши дни молекулярно-генетические исследования не коснулись проблемы ПВХРД. Эти обстоятельства объясняют актуальность исследования полиморфизмов генов сосудистой регуляции при ПВХРД.

Цель исследования

Основной целью исследования является изучение генетического полиморфизма молекул сосудистой регуляции у больных с периферическими витреохориоретинальными дистрофиями и оценка их клинико-прогностического значения для развития заболевания в этническом аспекте.

Задачи исследования

1. Выявить и оценить частоту встречаемости аномальных аллельных вариантов генов ЕБЫ1 (Ьуз198А8п), еЖ)8 (С786Т), \HEGFA (С634С), АОТ (Ме1235ТЪг) и их сочетаний среди больных с ПВХРД и относительно здоровых резидентов русской и бурятской этнических групп.

2. Установить степень риска формирования ПВХРД у носителей аномальных аллельных вариантов ЕОЫ1 (Ьу8198Азп), е№Э8 (С786Т), УЕОРА (С634С), АвТ (Ме1235ТЬг) среди резидентов Забайкальского края.

3. Сравнить содержание эндотелина-1, метаболитов оксида азота и сосудистого эндотелиального фактора роста в слезной жидкости и плазме крови у пациентов с ПВХРД и здоровых лиц с учетом генотипов (ЬУ8198Абп), еЫОБ (С786Т), УЕвРА (С634С), АвТ (Ме1235ТЬг) и их комбинаций.

4. Оценить роль полиморфизма генов молекул сосудистой регуляции в развитии осложнений ПВХРД.

Научная новизна

Впервые обнаружено, что аллельные варианты eNOS (С786Т), AGT (Met235Thr), EDN1 (Lysl98Asn) предрасполагают к развитию ПВХРД, влияют на развитие осложнений заболевания в русской и бурятской этнических группах. Носители неблагоприятных аллельных вариантов генов eNOS (С786Т), AGT (Met235Thr) бурятской национальности имеют более высокий риск формирования ПВХРД по сравнению с таковыми русской национальности.

Впервые установлено, что уровень эндотелина-1 в слезной жидкости больных с ПВХРД обеих этнических групп увеличен по сравнению со здоровыми лицами. Содержание метаболитов NO в плазме крови пациентов с ПВХРД и здоровых лиц бурятской национальности выше по сравнению с аналогичными группами у русских, тогда как в слезной жидкости пациентов с ПВХРД русской и бурятской национальности их уровень ниже по сравнению с контрольной группой. У пациентов обеих национальностей заметно увеличивается содержание VEGF в слезной жидкости при развитии осложнений ПВХРД. Содержание VEGF в плазме крови пациентов русской национальности с ПВХРД, осложненными ретинальными разрывами, ниже в два раза по сравнению с контрольной группой. По мере развития осложнений ПВХРД в виде разрывов и отслойки сетчатки уровень эндотелина-1 повышается, а оксида азота снижается.

Впервые выявлено, что различные аллельные варианты и генотипы влияют на уровень молекул сосудистой регуляции в слезной жидкости. Наличие аллели Asn полиморфизма гена EDN1 (Lysl98Asn) обуславливает повышенное содержание эндотелина-1 в слезной жидкости здоровых и больных ПВХРД не зависимо от национальности. У обладателей генотипа Asn/Asn обнаруживается наиболее высокий уровень, генотипа Lys/Asn - средний и генотипа Lys/Lys - низкий уровень эндотелина-1 в слезной жидкости. Носительство аллели С у русских и аллели Т гена eNOS (С786Т) у бурят в

гомо- и гетерозиготоном состоянии определяет более высокое содержание метаболитов оксида азота в слезной жидкости здоровых и больных ПВХРД. Носительство аллели О полиморфизма гена УЕОРА (С634С) в гомо- и гетерозиготном состоянии способствует более высокой продукции ростового фактора у здоровых и больных ПВХРД независимо от национальности. У больных-носителей генотипа С/С и САЗ падает содержание УЕОБ в плазме крови.

Теоретическая и практическая значимость работы

В результате исследования получены новые данные о патогенезе ПВХРД, демонстрирующие роль генов молекул сосудистой регуляции е№Э8 (С786Т), АОТ (Ме1235ТЬг), ЕОМ (Ьу8198Азп) в механизмах развития заболевания. Носительство патологических аллелей оказывает влияние на продукцию молекул сосудистой регуляции и развитие осложнений ПВХРД среди представителей русской и бурятской этнических групп Забайкальского края.

Выявленные факты позволяют оценить риск заболевания ПВХРД в этническом аспекте и разработать новые методы прогнозирования и ранней диагностики заболевания среди резидентов русской и бурятской национальности. Полученные сведения о наличии полиморфизмов генов еЫ08 (С786Т), АвТ (Ме1235ТЪг), ЕБ№ (Ьуз198А8п) могут быть включены в генетический паспорт индивидуумов и использоваться для оценки риска развития ПВХРД.

Положения, выносимые на защиту:

1. Носители неблагоприятных аллельных вариантов генов еЖ)8 (С786Т) и ЕВЫ1(ЬуБ198Азп) русской национальности и ЕВ№(Ьуз198А8п), УЕОРА(С634С), АвТ (Ме1235ТЪг) бурятской национальности имеют более высокий риск развития ПВХРД. У пациентов с ПВХРД независимо от национальности встречаемость генотипа Абп/Азп гена ЕОЫ1 (Ьу8198Азп) выше при наличии осложнений. У бурят с отслойками

сетчатки отсутствуют нормальные генотипы генов ЕБШ(Ьу8198А8п), УЕОРА(С634С) и АОТ (Ме1235ТЬг). Распределение полиморфизмов генов еЫ08 (С786Т), АвТ (Ме1235ТЬг) у резидентов Забайкальского края имеет этнические особенности.

2. В слезной жидкости пациентов с ПВХРД русской и бурятской национальностей уровень эндотелина-1 увеличивался, а метаболитов оксида азота и сосудистого эндотелиального фактора роста снижался по сравнению с контрольной группой. Концентрация молекул сосудистой регуляции в слезной жидкости зависит от клинических проявлений ПВХРД.

3. Содержание эндотелина-1, метаболитов оксида азота и УЕвР в слезной жидкости у пациентов с ПВХРД зависит от полиморфизма генов (Ьуб198Абп), еШ8 (С786Т), АвТ (Ме1235ТЪг) и УБвРА (С6340) и их сочетаний, присутствует этнический компонент. Влияние полиморфизмов генов ЕБЫ1 (Ьу8198Азп), еЫ08 (С786Т), АСТ (Ме1235ТЬг) и УЕвРА (С634С) на развитие данной патологии носит этнический характер.

Внедрение результатов работы

Теоретические положения, раскрываемые в диссертации, внедрены в учебный процесс на кафедрах нормальной физиологии и офтальмологии ГБОУ ВПО «Читинская государственная медицинская академия».

Апробация работы

Результаты исследования доложены на Всероссийской научно-практической конференции с международным участием, посвященной 60-летию Читинской государственной медицинской академии «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» 16 октября 2013 года.

ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Периферические витреохориоретинальные дистрофии. Определение.

Классификация. Клиническая картина

Периферические витреохориоретинальные дистрофии (ПВХРД) - это группа заболеваний, которая характеризуется различными дегенеративными изменениями сетчатки крайних отделов глазного дна. Дистрофические процессы проявляться в сетчатке непосредственно у зубчатой линии, а также ближе к экваториальным отделам. Поражения такого рода обычно протекают как витреоретинальная патология, т. е. захватывают сетчатую оболочку, стекловидное тело и угрожают возникновением отслойки сетчатки [6, 90, 225]. ПВХРД и разрывы сетчатки обнаруживаются в общей популяции в 5-13% случаев [1, 4, 141].

По данным литературы, ПВХРД встречаются у больных с отслойкой сетчатки в 90-96% случаев [2, 103, 107, 140, 194, 200, 223]. Отслойка сетчатки остается в настоящее время значимой медико-социальной проблемой. Частота регматогенной отслойки сетчатки в общей популяции достигает 10-15 случаев на 100 тыс. населения, в 10% случаев она двухсторонняя [29, 141, 152, 185, 193, 194, 205, 206]. Слепота, возникающая на фоне отслойки сетчатки, занимает 2-3 место среди всех возможных причин потери трудоспособности [68, 69]. По данным других авторов, отслойка сетчатки в структуре первичной инвалидности занимает 6-7 ранговые места и составляет 4,5% [121].

Возникновение дистрофий возможно в любом возрасте, с одинаковой вероятностью у мужчин и женщин [16, 17, 50, 64, 75]. Прогностически опасные виды ПВХРД выявляются у 30-52% пациентов с миопиией, у 6-27% больных с гиперметропией, при эмметропии - в 4-21% и являются основной причиной отслойки сетчатки [2. 50, 60, 75, 86, 113, 135]. Наибольшая встречаемость решетчатой дистрофии сетчатки наблюдается у больных с миопической

рефракцией, и при этом, чем выше степень миопии, те�