Молекулярно-генетическое исследование эссенциальной гипертензии: полиморфизм и транскрипционная активность генов воспалительного ответа

Матвеева, Валерия Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярно-генетическое исследование эссенциальной гипертензии: полиморфизм и транскрипционная активность генов воспалительного ответа
ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетическое исследование эссенциальной гипертензии: полиморфизм и транскрипционная активность генов воспалительного ответа"

005019821

На правах рукописи

МАТВЕЕВА ВАЛЕРИЯ АЛЕКСАНДРОВНА

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ЭССЕНЦИАЛЬНОЙ ГИПЕРТЕНЗИИ: ПОЛИМОРФИЗМ И ТРАНСКРИПЦИОННАЯ АКТИВНОСТЬ ГЕНОВ ВОСПАЛИТЕЛЬНОГО ОТВЕТА

03.02.07 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

о ■ Г- о ^Г'П

2 ..шг' ли

Уфа-2012

005019821

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук (ИБГ УНЦ РАН)

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор

Мустафина Ольга Евгеньевна

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор

Карамова Ирина Марсиловна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор, ведущий научный сотрудник лаборатории молекулярной генетики человека ИБГ УНЦ РАН

Хидиятова Ирина Михайловна

доктор медицинских наук, профессор.

Петрин Александр Николаевич

заведующий лабораторией медицинских генетических технологий ГБОУ ВПО Московский государственный медико-стоматологический университет МЗ

Ведущая организация: ГБОУ ВПО Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита диссертации состоится апреля 2012 г. в «_» часов на заседании

Объединенного диссертационного совета ДМ 002.113.01 при ИБГ УНЦ РАН по адресу: 450054, Уфа, просп. Октября, 71. ИБГ УНЦ РАН

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Уфимского научного центра РАН (Уфа, просп. Октября, 71), с авторефератом - на сайте ВАК РФ и на сайте ИБГ УНЦ РАН: www.ibg.anrb.ru/dissov.html e-mail: molgen@anrb.ru

Автореферат разослан "cMt ¿¿,2012г.

Ученый секретарь диссертационного совета

С. М. Бикбулатова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Эссенциальная гипертензия (ЭГ)-широко распространенное хронически протекающее многофакторное полигенное заболевание с длительным латентным периодом развития и тяжелыми клиническими осложнениями. Основным проявлением ЭГ является синдром артериальной гипертонии - стойкого повышения артериального давления (АД) от 140/90 мм.рт.ст. и выше. Как этиологический фактор коронарных, цереброваскулярных и реноваскулярных заболеваний, ЭГ представляет собой одну из основных причин заболеваемости, инвалидизации и смертности населения. ЭГ признана пандемией в большинстве стран мира, в том числе и в России, где распространенность этого заболевания составляет 39.2% среди мужчин и 41.1% среди женщин. [Гогин, 2004].

Несмотря на длительную историю изучения ЭГ, обширные клинические и клинико-физиологические изыскания, этиология этого заболевания во многом остается неясной. Одним из приоритетных направлений дальнейшего поиска является исследование молекулярно-генетическнх основ ЭГ. Опубликовано значительное число работ, посвященных этой проблеме. Поиск генов ЭГ основывается на разработанных для многофакторных признаков и заболеваний стратегиях, которые включают в себя анализ ассоциаций с заболеванием полиморфных локусов генов-кандидатов, исследования на модельных объектах, изучение редких моногенных форм заболевания, полногеномные ассоциативные исследования (GWAS - Genome-wide association study), мета-анализ по совокупности результатов многих независимо проведенных исследований [Hunt, 2010]. Не утратил своей актуальности и подход, основанный на выборе генов-кандидатов в соответствие с существующими концепциями о физиологических механизмах контроля АД, этиологии и патофизиологии ЭГ.

Не менее 150 генов можно предположительно отнести к генам-кандидатам ЭГ [http://cmbi.bjmu.edu.cn/genome/candidates/candidates.html]. Прежде всего, к ним причисляют гены, кодирующие белки ренин-ангиотензиновой и калликреин-кининовой систем, белки, обеспечивающие поддержание сосудистого тонуса и структуры сосудов, белки-рецепторы адренергической системы, ферменты метаболизма стероидных гормонов, белки, контролирующие водно-солевой гомеостаз. Итоги ассоциативных исследований противоречивы. Было обнаружено, что характер ассоциаций имеет возрастные, тендерные, этнические, расовые особенности. По всей видимости, большое число аллелей с низкой пенетрантностью вовлечено в предрасположенность к ЭГ. Факторы окружающей среды и образа жизни могут влиять на пенетрантность генетических факторов риска ЭГ'.

В связи с результатами экспериментальных исследований и клинических наблюдений все большее внимание обращается на потенциальную роль системного воспалительного ответа в развитии ЭГ [Hermann, Ruschitzka, 2009]. Также и по итогам исследований дифференциальной экспрессии генов в клетках периферической крови больных ЭГ с использованием ДНК-чипов обоснована в общих чертах роль воспаления и генов воспалительного ответа в развитии заболевания [Korkor, 2011]. Поэтом)' гены воспалительного ответа можно отнести к потенциальным генам-кандидатам ЭГ. Анализ полиморфизма и экспрессии генов воспалительного ответа при ЭГ представляет значительный интерес, что и определило цель данного исследования.

Цель работы - оценить значимость полиморфизма ряда генов воспалительного ответа в развитии эссенциальной гипертензии. Были поставлены следующие задачи:

1. Провести анализ ассоциаций с эссенциальной гипертензией полиморфных локусов генов воспалительного ответа:

CCL2 (-2518A>G, -5796 А>Т, 5357 С>Т, 704(14)I/D),

CD40LG (3005ОТ),

CXCR3 (-3328А>С),

CXCR4 (16270Т),

SELL (L193F),

SELE(3832Т>С),

SELP (S331N);

TNFRSF1A (36G>A);

NFKB1 (28081564 Т>А);

С ASP I ( 8770Т);

FAS (-670 A>G).

2. Провести анализ межгенных взаимодействий аллельных вариантов анализируемых генов-кандидатов эссенциальной гипертензии.

3. Провести сравнительный анализ уровня транскрипционной активности генов хемокинов CCL2 и CD40LG в лейкоцитах периферической крови в контрольной группе и группе больных эссенциальной гипертензией.

4. Провести анализ ассоциаций полиморфных локусов генов CCL2 и CD40LG с уровнем транскрипционной активности этих генов в лейкоцитах периферической крови.

5. Провести анализ ассоциаций полиморфных локусов генов CCL2 и CD40LG с клинико-лабораторными показателями у больных эссенциальной гипертензией.

14-ю полиморфными локусами генов воспалительного ответа (CCL2, CD40LG, CXCR3, CXCR4, SELL, SELE, SELP, TNFRSF1A, NFKB1, CASP1 и FAS'), исследование уровня транскрипционной активности (ТА) генов хемокинов CCL2 и CD40LG у больных ЭГ, анализ ассоциаций полиморфных локусов генов CCL2 и CD40LG с уровнем ТА этих генов и некоторыми клинико-лабораторными показателями при ЭГ. Впервые показана значимость полиморфизма генов CCL2 и TNFRSF1A как факторов риска развития ЭГ. Установлено, что эффекты взаимодействий аллельных вариантов генов CCL2 (53570Т), SELE (L193F) и гена CXCR3 (-3328А>С) вносят вклад в формирование молекулярно-генетических основ ЭГ. У больных ЭГ повышена ТА гена CD40LG. Впервые показано, что полиморфизм генов CD40LG и CCL2 имеет значение в формировании эндогенных факторов риска ЭГ: полиморфный локус 30050Т (rs715762) гена CD40LG ассоциирован с показателем функциональной активности системы свертывания крови - активированным временем рекальцификации плазмы, полиморфный локус 704(14)I/D (rs3917887) гена CCL2 ассоциирован с ТА этого гена в лейкоцитах периферической крови у больных ЭГ, полиморфный локус 53570Т (rs991804) гена CCL2 ассоциирован с количеством тромбоцитов в крови больных ЭГ.

Научно-практическая значимость работы. Результаты проведенного исследования вносят вклад в развитие представлений о молекулярно-генетических основах ЭГ. Они могут послужить основой для последующих исследований по генетике ЭГ, для развития концепции о роли системного воспалительного ответа в этиопатогенезе заболевания. Результаты исследования также могут быть использованы при чтении спецкурсов по генетике на факультетах биологического и медицинского профиля в университетах и других ВУЗах.

Апробация работы. Основные положения диссертации были представлены на российских и международных конференциях: XII Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Фундаментальная наука и клиническая медицина» (Санкт-Петербург, 2009), 3-й и 4-й Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины» (Ростов-на-Дону, 2009, 2011), Всероссийской конференции, посвященной 10-летию кафедры генетики БГПУ им. М.Акмуллы, приуроченной к ежегодным Вавиловским чтениям «Инновационные и молекулярно-генетические исследования живых систем» (Уфа, 2009), Всероссийской заочной научно-практической конференции «Актуальные вопросы физиологии, психофизиологии и психологии» (Уфа, 2009), Российской конференции с международным участием «Молекулярные основы клинической медицины - возможное и реальное» (Санкт-Петербург, 2010), Научно-практической конференции с международным участием «Клиническая

иммунология, иммуногенетика - междисциплинарные проблемы» (Ташкент, 2010), VI съезде Российского общества медицинских генетиков (Ростов-на-Дону, 2010), XVIII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2011» (Москва, 2011), II Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Медико-биологические аспекты мультифакторной патологии» (Курск, 2011), Европейской конференции по генетике человека (European Human Genetics Conference, Amsterdam, 2011), 21-м Европейском конгрессе по гипертензии (21-st European Meeting on Hypertension, Milan, 2011).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 2 статьи в журналах из перечня ВАК и международной базы цитирования (PubMed). В виде тезисов и статей в материалах международных и российских конференций опубликовано 14 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 188 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов исследования, обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 300 ссылок (17 отечественных и 283 зарубежных работ). Диссертация иллюстрирована 16 рисунками, 40 таблицами и дополнена приложением (30 стр., 27 таблиц).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы исследования. Выборка больных была сформирована из 217 не состоящих в родстве пациентов (мужчины в возрасте 22-60 лет, средний возраст 40.96±6.26 лет, татары по этнической принадлежности), проходивших обследование в ГУЗ «Республиканский кардиологический диспансер» (РКД, г. Уфа). Всем пациентам был поставлен клинический диагноз ЭГ. Диагноз ЭГ устанавливался по результатам клинико-инструментального и клинико-лабораторного обследования квалифицированными врачами отделения артериальной гипертензии РКД в соответствии с рекомендациями ВОЗ и экспертов Российского медицинского общества по артериальной гипертонии и Всероссийского научного общества кардиологов (2007). В исследование не включались больные с выраженными локальными проявлениями атеросклероза, сахарным диабетом, выраженными сопутствующими заболеваниями почек, легких, желудочно-кишечного тракта, печени, больные с заболеваниями крови и нарушением обмена веществ. В группу сравнения были отобраны 243 относительно здоровых индивида (мужчины в возрасте 25-60 лет, средний возраст 34.6±7.05 лет, татары по этнической принадлежности), не состоящих в родстве, без признаков сердечно-сосудистых и других хронических

заболеваний в медицинском анамнезе. Все участники дали информированное добровольное согласие на проведение биомедицинских исследований.

Методы исследования. ДНК выделяли из 10 мл периферической крови методом фенольно-хлороформной экстракции [Mathew, 1984]. Генотипирование полиморфных локусов исследуемых генов проводили методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК (ПЦР) и рестрикционным анализом с последующим электрофорезом фрагментов ДНК в 7% полиакриламидном или 1-2% агарозном геле, окрашиванием гелей раствором этидия бромида (1%) и визуализацией с помощью видсогсль-документирующей системы («Vilber Lourmat»). Подбор праймеров и рестриктаз осуществляли с помощью базы данных NCBI (http://www.ncbi.nlm.gov/SNP) и пакета программ DNASTAR V.5.O. Выделение тотальной РНК из цельной венозной крови (6 мл) производили фиколльно-тризольным методом. Очистку РНК от примесей геномной ДНК осуществляли с помощью коммерческого набора реактивов фирмы «Fermentas» и соответствующего протокола. Выделенную РНК обрабатывали ДНКазой I, свободной от РНКазы ("Sigma"). Наличие в образце Pi Ж примесей ДНК определяли с помощью ПЦР с праймерами к гену домашнего хозяйства GAPDH, а в качестве матрицы использовали препарат РНК. Количество матрицы РНК (в нг/мкл) оценивали на спектрофотометре «NanoDrop 1000» («Technologies»). Качество препаратов РНК оценивали по соотношению оптических плотностей А260/А280 и электрофорезом в 1%-ном агарозном геле по соотношению количества 28S и 18S рРНК (Sambrook et al., 2001). Комплементарную ДНК (кДНК) получали из тотальной РНК реакцией обратной транскрипции с использованием коммерческого набора «RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit» и в соответствии с протоколом фирмы-изготовителя («Fermentas»). Количественный анализ транскрипционной активности генов CCL2 и CD40LG проводили методом ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) на амплификаторе «¡Cycler iQ™ Real-Time PCR Detection System» («BioRad»), использовали праймеры фирмы производителя (РРН00192Е и РРН00259В, соответственно, «SuperArray Bioscience Corporation»). В качестве референсного гена был выбран ген бета-2-микроглобулина (B2AI).

Статистическую обработку полученных результатов выполняли с использованием пакета прикладных программ Statistica for Windows 5.0 (Stat-Soft), SPSS v. 13.0, Haploview v.4.2 и MDR (Multifactor Dimensionality Reduction, www.epistasis.org/mdr.html, http.V/wmv.multifactordimensionalityreduction.org/) и компьютерной программы RxC (ROW x Columns) по алгоритму, описанному Roff D.A. [Roff, 1989]. Силу ассоциаций оценивали в значениях показателя отношения шансов (OR - odds ratio). Для оценки неравновесия по сцеплению пары

полиморфных локусов использовали показатель D', рассчитанный с помощью программы Haploview v.4.2. Определение частот гаплотипов и тестирование различий в распределении частот гаплотипов между группами больных и здоровых индивидов осуществляли также с помощью программы Haploview v.4.2. Для оценки относительного содержания мРНК использовали метод AACt [Livak, 2001]. При анализе ассоциаций полиморфных локусов с уровнем транскрипционной активности генов в лейкоцитах периферической крови, клинико-лабораторными показателями использовали непараметрические методы статистического анализа.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Анализ ассоциаций полиморфных локусов генов воспалительного ответа с эссенциалыюй гипертензисй

Анализ ассоциаций полиморфных локусов -5796А>Т, -2518A>G, 53S70T и 704(14)I/D гена CCL2 с эссенциалыюй гипертензией

Роль хемокина CCL2 (или моноцитарного хемоаттрактантного белка 1, МСР-1) в этиопатогенезе ЭГ может быть обусловлена тем, что он проявляет сильную хемотаксическую активность по отношению к моноцитам и Т-лимфоцитам, является промотором миграции циркулирующих лимфоцитов из плазмы крови в ткани и очаги воспаления, одновременно влияя на их активацию и прилипание к сосудистой стенке. Этот хемокин может быть вовлечен в воспаление сосудистой стенки и развитие эндотелиальной дисфункции [Coll В, 2007].

Нами проведен анализ ассоциаций с ЭГ полиморфных локусов -5796А>Т (rs 1860190), -2518A>G (rsl024611), 5357С>Т (rs991804) и 704(14)Ю (rs3917887) гена CCL2. Обнаружено, что в группе больных ЭГ отмечается достоверное увеличение частоты генотипа 5357*Т/*Т (14.29% против 7.82% в контрольной группе, р=0.035, OR=1.96, CI0r: 1.07-3.58). Анализ ассоциаций с учетом возраста манифестации заболевания показал, что в группе больных с манифестацией заболевания в возрасте до 46 лет в отличие от соответствующей контрольной группы повышена частота генотипа 5357*Т/*Т (14.62% и 5.26%, соответственно, р=0.005, OR 3.08, C10R: 1.386.86), тогда, как между группами лиц в возрасте 46 лет и старше статистически значимых различий не прослеживается. При попарном сравнении по частотам аллелей и генотипов полиморфных локусов -2518A>G, -5796А>Т и 704(14)I/D гена CCL2 между группами больных и здоровых индивидов не выявлено статистически значимых различий.

В группе больных ЭГ и в контрольной группе наблюдается неравновесие по сцеплению между анализируемыми полиморфными локусами гена CCL2 (рис. 1). В

результате проведенного анализа в выборках обнаружено 12 из 16 возможных гаплотипов (табл. !). В группе больных ЭГ повышена частота гаплотипа СС12*А*0*Б*Т (20.4% против 13.9% в контрольной группе, у?=6.662, р=0.009. ОРЫ .57, С10к:1.04-2.36).

Рис. 1. Графическое представление структуры неравновесия по сцеплению между полиморфными локусами гена СС12

Примечание: в верхней части рисунка показана локализация БЫР в гене ССЬ2. Черными линиями выделены гаплотипические блоки; в ячейках представлены значения коэффициента неравновесия по сцеплению £>'. Различные оттенки цвета отображают силу неравновесия по сцеплению между 5'А'Р.

Таблица 1

Распределение частот гаплотипов полиморфных локусов гена ССЬ2 в группе больных эссенциальной гипертензяей и в контрольной группе

-5796А>Т Ло О л ку( | ■ч-о Г\ л и "о Частота гаплотипа, % Р

Гаплотип Контроль Больные

*Т*А*1*С 49.8 48.4 0.712

*А*0*0*Т 13.4 20.5 0.009

*А*А*1*С 9.5 10.1 0.773

*А*А*Б*Т 7.6 5.2 0.194

3.1 2.9 0.855

*Т*А*Б*Т 2.6 2.2 0.736

*А*0*РТ 2.7 1.9 0.519

1.3 2.8 0.153

*А*А*Б*С 2.3 1.5 0.435

*Х*А*1*Т 2.1 1.1 0.260

1.9 1.2 0.484

*А*А*1*Т 1.3 0.9 0.585

Анализ литературных данных показал, что из многих полиморфных локусов гена CCL2 функциональная значимость выяснена для локуса -2518A>G (rsl024611). Этот локус ассоциирован с содержанием хемокипа CCL2 и С-реактивного белка в плазме крови; у носителей гомозиготного по аллелю CCL2-2518* G генотипа содержание данного белка и С- реактивного белка в крови повышено, причем такого рода различия отмечены как у здоровых индивидов, так и у пациентов с ИБС и ЭГ [Rovin, 1999; Tabara, 2003; Ка-Ро Tse, 2007; Bucova, 2009; Wang, 2011]. Относительно функциональной значимости других полиморфных локусов гена CCL2 сведения весьма ограничены. Статистически значимая и независимая от факторов риска сердечно-сосудистой патологии ассоциация полиморфного локуса -2518A>G (rs!024611) гена CCL2 выявлена в популяции жителей Туниса; предрасполагающим к развитию ЭГ является аллель CCL2-2518*G (OR = 1.46, CI0R:1.11-1.91, р=0.004) [Jemaa, 2009]. Согласно результатам другого исследования, у носителей аллеля CCL2-2518*G отмечены более высокие показатели САД и ДАД, чем у носителей аллеля CCL2-2518*А [Penz, 2010]. Согласно результатам проведенного нами исследования, полиморфный локус -2518A>G вносит вклад в развитие ЭГ, но его эффект обнаруживается только при гаплотипическом анализе; аллель CCL2-2518*G входит в гаплотип CCL2*A*G*D*T, предрасполагающий к развитию ЭГ. В связи со сказанным выше следует, что полученные нами данные соответствуют результатам других исследований.

Таким образом, в результате проведенного исследования обнаружена ассоциация с ЭГ полиморфного локуса 5357С>Т (rs991804) в отдельности и гаплотипа CCL2*A*G*D*Tпо четырем полиморфным локусам -5796А>Т (rsl860190), -2518A>G (rsl024611), 704(14)I/D (rs3917887) и 5357C>T гена CCL2. На этом основании можно заключить, что полиморфизм гена CCL2 вносит вклад в развитие ЭГ.

Анализ ассоциаций полиморфного локуса 30050Т гена CD40LG с эссенциальной гипертензией

Среди возможных механизмов влияния хемокинов на развитие ЭГ рассматривают активацию системы гемостаза и вазоконстрикцию, воспаление, деградацию матрикса, которые развиваются в результате взаимодействия хемокинов с их рецепторами [Schonbeck, Libby, 2001]. С участием сигнальной системы CD40-CD40L может развиваться вазоконстрикция, диерегуляция артериального давления в результате гипоксии, увеличения коагуаляционного потенциала крови, воспаления.

Ген CD40LG картирован на хромосоме X (Xq26). Соответственно такой локализации у мужчин он представлен одной копией. Результаты генотипирования по

полиморфному локусу 3005С>Т (rs715762) гена CD40LG показали, что в выборке мужчин группы сравнения, татар по этнической принадлежности, доля носителей аллеля CD40LG3Q05*C составила 93%, а носителей аллеля СП40ШШ5*1 - 7%. Статистически значимых различий по частотам гемизигот между группой больных ЭГ и группой сравнения не выявлено (94.47% и 5.53% против 91.77% и 8.23%, соответственно, р=0.276). Также не найдено ассоциаций с заболеванием при анализе полученных данных с учетом таких факторов как возраст манифестации заболевания, табакокурение, ожирение. В то же время замечено, что в группе пациентов с отягощенным по сердечно-сосудистой патологии семейным анамнезом частота гемизигот по аллелю CD40LG35W*T выше, чем в группе пациентов с благополучным анамнезом (9.62% против 2.17% соответственно, р=0,037). После введения поправки на множественность сравнений эти различия становились статистически не значимыми (р=0.13).

Анализ ассоциаций полиморфного локуса -3328А>С гена CXCR3 с эссенциальпой гипертензией

Роль рецептора CXCR3 в контроле физиологических функций кровеносных сосудов и регулировании артериального давления остается неясной. Отсутствие данного хемокинового рецептора, как показали результаты эксперимента с трансгенными мышами (СхсгЗ-/-), может1 привести к повышению АД. Полагают, что CXCR3 является важным в развитии спазма сосудов и ЭГ: возможно, его влияние реализуется через изменение экспрессии рецептора типа 1 к ангиотензиногепу [Hsu, 2009]. Вклад полиморфизма гена CXCR3 (Xql3.1) в молекулярно-генетическую структуру сердечно-сосудистых заболеваний не исследован. Также и в популяпионном плане полиморфизм гена CXCR3 мало изучен.

Нами проведен анализ ассоциаций с ЭГ полиморфного локуса -3328А>С (rs3091305) гена CXCR3 и получены следующие данные. В группе сравнения частоты аллелей CXCR3-3328*С и CXCR3-3328*А составили 54.73% и 45.27%, а в группе больных ЭГ - 58.53% и 41.47% соответственно; существенных различий между группами не выявлено. На основании полученных данных следует признать, что полиморфный локус -3328А>С гена CXCR3 не ассоциирован с ЭГ.

Анализ ассоциаций полиморфного локуса 16270Т гена CXCR4 с эссенциалъной гипертензией

Хемокиновый рецептор CXCR4 может вносить вклад в патофизиологию ЭГ. В пользу этой точки зрения свидетельствуют результаты ряда исследований. В частности было показано, что у больных ЭГ происходит снижение уровня экспрессии

гена CXCR4, вследствие этого может развиваться один из ключевых механизмов повреждения сосудистой стенки при ЭГ, который состоит в повышении адгезии к эндотелию и миграции в сосудистую стенку естественных киллеров и цитотоксических Т-лимфоцитов [Тимофеева, 2007].

Нами для анализа ассоциаций с ЭГ был выбран полиморфный локус 1627С>Т (rs2471859) гена CXCR4. В контрольной группе частоты обнаружения генотипов CXCR4 1627*Т/*Т, CXCR4 1627*Т/*С и CXCR4 1627*С/*С составили 64.14%, 33.33% и 2.53%, аллелей CXCR4 1627*1 и CXCR4 \6П*С - 80.8% и 19.2% соответственно. Сопоставление по частотам генотипов и аллелей групп больных ЭГ и здоровых лиц показало, что между ними нет различий. Следовательно, полиморфный локус 1627Т>С гена CXCR4 не ассоциирован с ЭГ у этнических татар. Поскольку было обнаружено изменение уровня экспрессии гена CXCR4 в клетках периферической крови при ЭГ [Тимофеева, 2007], представляет интерес дальнейший поиск функционально значимых полиморфных локусов этого гена.

Анализ ассоциаций полиморфных локусов генов SELL(L193F), SELE (3832Т>С), SELP (S331N) с эссенциальной гипертеюией

Взаимоотношения между молекулами адгезии и АД отличаются для разных молекул адгезии, изменяются в зависимости от возраста и тендерных особенностей, модифицируются менопаузой. В целом роль молекул адгезии в регуляции АД остается неясной [Miller, 2004]. В то же время возрастание уровня экспрессии молекул адгезии и их лигандов при ЭГ относится к той категории фактов, которые подтверждают точку зрения о вкладе воспаления сосудистой стенки в патофизиологию этого заболевания [Glowinska, 2005; Shalia, 2009]. Селектины Е, Р и L - молекулы клеточной адгезии, которые обеспечивают взаимодействие клеток крови с клетками эндотелия сосудов в физиологических и патофизиологических процессах и могут быть маркерами повреждения сосудистой стенки при ЭГ. У больных ЭГ содержание селектина Е в плазме крови повышено [Sanada, 2005; Hjelstuen, 2007]. Содержание селектина Р в плазме крови коррелирует с уровнем АД, возрастом, величиной показателя ИМТ и концентрацией фибриногена [Lip, 1995; Koyama, 2003; Preston, 2007]. В ответ на гипертензивную терапию происходит снижение уровня растворимого слектина Р [Sanada, 2005].

Нами проведен анализ ассоциаций с ЭГ полиморфных локусов L193F (rs3177980, 665С>Т или синоним - rsll31498, g.9358T>C, F206L в домене подобному эпидермалыгому фактору роста) гена SELL, 3832С>Т (rs2076059) гена SELE, S331N

(1087G>A, rs6131) гена SELF. В контрольной группе частоты генотипов S£I£193*F/*F, SELL№*F/*L и ¿'ШЛ 93*I./*L составили 66.8%, 29.88% и 3.32%, частоты аллелей SELL193*? и SELIA93*L - 81.74% и 18.26% соответственно; генотипы SELE 3833*С/*С, SELE 3833*С/*Т и SELE 3833*Т/*Т выявлены в 37.86%, 40.33% и 21.81%, аллели SELE 3833*С, SELE 3833*Т в 58.02% и 41.98% случаев; генотипы SELPm*S/*S, SELP 331 *S/*N и SELF 331*N/*N обнаружены у 63.79%, 29.63% и 6.58%, аллели SELF 331*S и SELP 331*N у 78.6% и 21.4% индивидов. При попарном сравнении по частотам генотипов и аллелей полиморфных локусов генов SELL, SELE и SELP статистически значимых различий между контрольной группой и группой больных ЭГ не найдено.

Гены SELL, SELE и SELP локализованы в кластере (160 kb) на длинном плече хромосомы 1 (Iq24-q25) и тесно сцеплены с геном фактора коагуляции V (F5); горячая точка рекомбинации присутствует внутри гена SELP. Был проведен анализ неравновесия по сцеплению и гаплотипический анализ аллельных вариантов генов SELL, SELE и SELP. В результате было идентифицировано восемь гаплотипов, частоты обнаружения которых в контрольной группе и группе больных ЭГ не отличались.

Таким образом, анализируемы полиморфные локусы генов SELL, SELE и SELP не ассоциированы с ЭГ.

Анализ ассоциаций полиморфного локуса 28081564Т>А гена NFKB1 с эссенциалыюй гипертензией

Транскрипционный фактор NFkB - эволюционно консервативный медиатор воспаления [Ghosh, 1999]. NFkB особенно важен в развитии васкулярного воспаления, так как он регулирует экспрессию генов цитокинов (CCL2, RANTES, 1L6, CD40), селектинов, FAS, AGT, NOS3 и ряда других в клетках эндотелия [Liu-Mares, 2007; Park, 2007; Camici, 2009]. В исследованиях на модельных объектах наблюдали нарушения регуляции nfkb-сигналинга в тканях при развитии гипертонии [Camici, 2009].

Нами проведен анализ ассоциаций полиморфного локуса 28081564Т>А (rs4648110) гена NFKB1 с ЭГ. В контрольной группе частоты аллелей NFKB 1*1 и NFKB1*А составили 78.6% и 21.4%, генотипов NFKB1*Т/*Т, NFKB1*T!*A и NFKB1*А/*А - 63.79%, 29.63% и 6.58%. Не вьивлено различий по частотам генотипов и аллелей между группой больных ЭГ и группой здоровых индивидов. Следовательно, данный полиморфный локус гена NFKB] не ассоциирован с ЭГ.

Анализ ассоциаций полиморфноголокуса -8770Тгена CASP1 с эссенциальной гипертензией

Субстратами провоспалительной каспазы 1 являются молекулы (IL-Iß, IL 18 и другие), вовлеченные в ретуляцшо функций эндотелия сосудов, апоптоз, воспаление и атерогенез [Shen, 2010]. Содержание каспазы 1 в крови оценивается как предиктор смерти у пациентов с ИБС [Blankenberg, 2006]. Функциональная значимость полиморфных локусов гена CASP1 в детерминации уровня активности каспазы 1 и в развитии ИБС, ИМ и ЭГ остается малоизученной.

В данном исследовании проведено генотипирование по полиморфному локусу -877С>Т (rs481736) гена CASPJ. В контрольной группе частоты обнаружения генотипов CASP1-877*T/*T, CASP1-877*T/*C и CASPI-$77*C/*C составили 1.99%, 32.45% и 65.56%, аллелей CASP1 877*Т и CASPI-877*С - 18.21% и 81.79%. Распределение частот генотипов и аллелей в группе больных ЭГ соответствовало таковому в контрольной группе. На основании полученных данных следует признать, что полиморфный локус 877С>Т гена CASP1 не ассоциирован с ЭГ.

Анализ ассоциаций полиморфного локуса 36A>G гена TNFRSF1A с эссенциальной гипертензией

Рецептор типа 1 к TNF-a может активировать NFkB, опосредовать апоптоз и функционировать как регулятор воспаления [Wajant, Scheurich., 2011]. Полиморфный локус +36A>G (rs767455) ассоциирован с уровнем экспрессии гена TNFRSF1A; у носителей генотипа +36*G/*G повышено содержание ингибитора активатора плазминогена 1 [Mavri, 2007].

У этнических татар группы сравнения частоты аллелей TNFRSF1A 36*А и TNFRSF1A 36*G составили 60.38% и 39.62%, частоты генотипов TNFRSF1A 36*А/*А, TNFRSF1A 36*A/*G и TNFRSF1A 36*G/*G - 36.79%, 47.17% и 16.04% соответственно. Сравнительный анализ групп пациентов с ЭГ и здоровых индивидов показал, что между ними наблюдаются различия по распределению частот аллелей (%2=4.57, Р=0.045) и генотипов на уровне тенденции (/2 =5.40, Р=0.066). В группе больных ЭГ повышены частоты генотипа TNFRSF1A 36*G/*G (28.3% против 16.4% в контрольной группе, р=0.026) и аллеля TNFRSF1A 36*G (49.06% против 39.62%, р=0.033) и понижена частота аллеля TNFRSF1A 36*А (50.94% против 60.38%, р=0.033). Результаты анализа ассоциаций полиморфного локуса +36A>G гена TNFRSF1A с учетом ИМТ показали, что генотип TNFRSF1A 36*G/*G обнаруживается с большей частотой в группе больных ЭГ с ожирением (48.88%), чем в группах больных с избыточной (27.27%, р=0.07) или нормальной массой тела (12.82%, р=0.003). Статистически значимые различия обнаруживаются между группой

больных с ожирением и контрольной группой по частоте генотипа TNFRSF1A 36*G/*G (р=0.0007), и по частотам аллелей (р=0.0016). Следовательно, полиморфный локуе +36A>G гена TNFRSF1A ассоциирован с ЭГ; относительные шансы заболевания повышены у носителей генотипа *G/*G с ожирением (OR=4.62, C10R: 1.94-10.99).

Анализ ассоциаций полиморфного локуса -670A>G гена FAS с эссенциальной гипертензией

Повышенный уровень апоптоза наблюдали в эксперименте с модельными гипертензивньши животными [Suematsu, 2002]. Роль этого феномена в различных моделях гипертензии и у больных ЭГ остается неясной. FAS вовлечен в сигналипг апоптоза и воспаления.

Полиморфный локуе -670A>G (rsl800682) гена FAS локализован внутри сайта связывания факторов транскрипции Spl, STAT1 и, по-видимому, может влиять на экспрессию гена FAS.

В группе сравнения частоты аллелей FAS-670*A и FAS-670*G составляют 50.42% и 49.58%, частоты генотипов FAS~610*AJ*A, FAS~670*A/*G и FAS~670*G/*G - 27.73%, 45.38% и 26.89% соответственно. При сопоставлении по частотам генотипов и аллелей контрольной группы с группой больных ЭГ между ними не выявлено различий. Таким образом, полиморфный локуе -670A>G гена FAS не ассоциирован с ЭГ.

Анализ гаметического неравновесия по сцеплению и анализ межгенных взаимодействий аллельных вариантов аналгаирумых генов-кандидатов эссенциальной гипертензии

Большое значение для понимания молекулярно-генетических основ многофакторного заболевания имеет информация о структуре паттернов гаметического неравновесия по сцеплению атлельных вариантов генов, о межгенных взаимодействиях. Как показал анализ результатов исследования, между контрольными группами и группами больных ЭГ наблюдаются различия по структуре паттернов гаметического неравновесия по сцеплению аллельных вариантов анализируемых генов. В контрольной группе прослеживается неравновесное сцепление между аллельными вариантами генов NFKB1 и SELE (р<0.001), NFKB1 и SELF' (pcO.OOl), NFKB1 и SELL (р<0.001), FAS и SELP (р=0.033), FAS и SELL (р=0.029), SELL и TNFRSF1A (р=0.002), SELE и SELP (р=0.022), SELE и SELL (р<0.001). В группе больных ЭГ наблюдается неравновесное сцепление между

аллельными вариантами генов NFKB1 и TNFRSF1A (р=0.001), NFKB1 и FAS (pcO.OOl), FAS и TNFRSFIA (р<0.001), SELE и SELF (р=0.010), SELE и SELL (р=0.005). Неравновесное сцепление локусов. наблюдаемое в контрольной группе и группе больных ЭГ, может свидетельствовать в пользу гипотезы об отборе некоторых аллелей разных генов в сочетании друг с другом, об "адаптивном преимуществе" одних или "уязвимости" с риском развития сердечно-сосудистой патологии других паттернов неравновесия по сцеплению.

Анализ межгенных взаимодействий был выполнен с помощью непараметрической программы MDR, в которой используется подход редукции размерных величин [Ritchie. 2001; Lou, 2007]. Были проанализированы энтропийные функции каждой пары анализируемых полиморфных локусов.

Как следует из полученных данных, наибольшие показатели информационной ценности даёт взаимодействие аллельных вариантов генов SELE и CXCR3 (рис. 2). Исходя из этого, можно говорить о синергизме эффектов генов SELE и CXCR3 в развитии ЭГ. С использованием методов логистической регрессии и мультифакторной пространственной редукции была построена модель с наибольшим потенциалом предикиии риска развитая заболевания (табл. 2).

:SELL(L193F)|

Рис. 2. Графическое отображение результатов анализа взаимодействий между аллельными вариантами генов при эссенциальной гипертензии.

Примечание: на вершинах многогранника представлена информационная ценность каждого маркера в отдельности, на ребрах - информационная ценность взаимодействия пары маркеров.

Таблица 2

Коэффициенты множественной логистической регрессии и их статистическая оценка

Предиктор в Р OR CIoR

CxCR3+SELE *А+*С/С 0.04 <0.001 1.04 0.797-1.36

*А+*С/Т -0.550 0.58 j 0.44-0.75

*А+*Т/Т 0.51 1.67 1.22-2.27

*с+*с/с -0.04 0.961 0.74-1.26

*с+*с/т 0.550 1.73 1.334-2.25

*с+*т/т -0.510 0.6 0.44-0.819

CCL2 (5357С>Т) *с/с -0.345 0.001 0.708 0.5-1.01

*с/т -0.635 0.53 0.37-0.76

*т/т 0.98 2.66 1.58-4.48

Константа 0.131 0.282 1.14

Примечание. В - коэффициент логистической регрессии (0<В<1 - регрессия; В<0 - детерминация); OR (odds ratio) - экспонеш/иальный коэффициент (отношение шансов); CIqr-95% доверительный интервал для OR; р-уровень значимости.

Анализ уровня транскрипционной активности генов хемокинов СБ40ЬО и ССЬ2 в лейкоцитах периферической крови у больных эссенцнальнон гипертензией

Функции клеток циркулирующей крови реализуются не только в кровотоке, по и в периферийных тканях. Реакция клеток крови на факторы различной природы, их взаимодействие с эндотелием, миграция через сосудистую стенку является важным в инициации и развитии физиологических и патофизиологических процессов в разных тканях и в организме в целом.

Оценка дифференциальной экспрессии генов в клетках крови в норме и при патологии важна для раскрытия механизмов развития заболевания, а также для поиска генов-кандидатов заболевания. Транскриптом клеток крови у больных ЭГ практически не изучен.

Согласно результатам проведенного исследования, в группе больных ЭГ по сравнению с контрольной группой выше относительное количество мРНК гена С040Ю. Возрастание количества транскриптов гена С040Ш свидетельствует о повышении его транскрипционной активности. Транскрипционная активность гена СС12 остается без изменений (табл. 3,4).

Таблица 3

Выборочные статистики эмпирических вариационных рядов значений относительного содержания мРНК генов С040Ш и СС12 в лейкоцитах периферической крови у здоровых и больных эссенннальной гипертензией лиц

Ген Группа N X ^min ^шах Ме Q25 Q75

CD40LG Контроль 17 0.96 0.26 3.25 0.74 0.60 1.09

Больные ЭГ 24 7.64 0.51 34.92 2.00 1.16 7.53

CCL2 Контроль 17 2.29 0.07 9.53 0.80 0.21 3.94

Больные ЭГ 23 2.24 0.09 12.00 0.77 0.20 3.27

Примечание: х - среднеарифметическое значение, xmi„ и хтах - минимальное и максимальное значения, N - численность группы, Ме - медиана (или 50% квартиль), 025 и Q75 -25% и 75% квартили.

Таблица 4

Результаты сравнительного анализа относительного содержания мРНК генов СВ40Ш и ССХ2 в лейкоцитах периферической крови у здоровых и больных эссенциальной

гипертензией лиц

Ген Тест df Р

CD40LG Н 15,54 1 0.0001

t 11,26 1 0.0008

CCL2 Н 0.009 1 0.92

t 0.102 1 0.75

Примечание: Н - критерий Краскела—Уоллиса, ^ - критерий при сравнена медиан (медианный тест), -число степеней свободы, р-уровень значимости

В контрольной группе не выявлено корреляций между ТА генов СВ4()Ю и СС12 (коэффициент ранговой корреляции Спирмана, Я, составил -0.03, р=0.90). В отличие от этого, в группе больных ЭГ наблюдается положительная корреляция между ТА гена С 1)40ГО и ТА гена ССП (К= 0.53, р=0.013).

Полученные результаты свидетельствуют о том, что у больных ЭГ активирована сигнальная система рецептор СГМО-лиганд СП40 (С040-С040Ь).

Анализ ассоциаций полиморфных локусов генов хемокинов CD40LG и CCL2 с транскрипционной акт ивностью этих генов в лейкоцитах периферической крови и некоторыми клинико-лабораторными показателями у больных эссенциальной гипертензией

Анализ ассоциаций полиморфных локусов генов CD40LG и CCL2 с ТА этих генов в лейкоцитах периферической крови и некоторыми клинико-лаборагорными показателями проводили с помощью непараметрических методов статистического анализа (Kruskal-Wallis ANOVA by Ranks).

TA B*D/*D

Рис. 3. Уровень относительной транскрипционной активности гена ССХ2 в лейкоцитах периферической крови у носителей разных генотипов по полиморфному локусу 704(14)1/0 гена СС12.

Обнаружено, что полиморфный локус 3005С>Т гена СВ40Ш не ассоциирован с уровнем ТА этого гена в лейкоцитах периферической крови ни в контрольной группе, ни в группе больных ЭТ. В то же время в группе больных ЭГ прослеживается ассоциация полиморфного локуса 3005С>Т гена С040Ш с таким показателем, как активированное время рекальцификации плазмы крови (р=0.001). Укорочение ативированного времени рекальцификации плазмы свидетельствует о гиперкоагуляции. У носителей генотипа С040Ш3005*С/*С по сравнению с носителями генотипа С 1)40 101005*Т/*Т ниже значения АВР (58.3 и 292.3 сек, соответственно), а следовательно выше риск развития тромбов. Эти наблюдения косвенно свидетельствуют в пользу возможной функциональной значимости полиморфизма 3005С>Т гена СБ40Ш в формировании эндогенных факторов риска сердечно-сосудистой патологии.

Установлено, что из всех анализируемых полиморфных локусов гена ССЬ2 полиморфный локус 704(14)1/1) ассоциирован с уровнем ТА гена СС12 в лейкоцитах

периферической крови в группе больных ЭГ ("/2=7.88, р=0.019, Н=7.59, р=0.022). При этом ТА гена ССЬ2 сравнительно выше у гомозигот по делеции, чем у гетерозигот и гомозигот по инсерции в группе больных ЭГ (у~ 4.07. р=0.043,11=7.29, р=0.007) и в контрольной группе (х2=4.00, р=0.045, Н=3.57, р=0.059) (рис. 3). Не выявлено статистически значимого влияния полиморфного локуса 5357С>Т гена ССЬ2 на уровень ТА этого гена в лейкоцитах периферической крови в контрольной группе и группе больных. В то же время наблюдается ассоциация полиморфного локуса 5357С>Т с количеством тромбоцитов (р=0.046), а на уровне заметной тенденции - с количеством лимфоцитов (р=0.093). При этом выражены различия между группами лиц с генотипами СС1.2 5357*17*1 и СС12 5357*С/*С по количеству тромбоцитов (240.70 и 156.83, р=0.030).

ВЫВОДЫ

1. Полиморфизм гена СС12 вносит вклад в структуру наследственной предрасположенности к ЭГ. Генотип С(Х2 5357*Т/*Т и гаплотип СС12*Л*0*Г>*Т по полиморфным локусам -5796А>Т, -2518А>Сх, 704(14)1/0 и 5357С>Т (ге1860190, ^1024611, ге3917887 и гэ991804) предрасполагают к развитию эссенциальной гипертензии.

2. Полиморфный локус 53570Т (гк991804) гена СС1.2 ассоциирован с количеством тромбоцитов в крови больных ЭГ; у носителей генотипа СС12 5357*Т/*Т количество тромбоцитов выше, чем у носителей других генотипов.

3. Полиморфный локус ге767455 (+36А>0) гена ТМРН$!ЧЛ ассоциирован с эссенциальной гипертензией; у носителей генотипа TNI~RSF / ,- Н 3 6 * О/ * О повышены шансы развития этого заболевания.

4. У больных эссенциальной гипертензией транскрипционная активность гена СВ40Ш в лейкоцитах периферической крови увеличена, транскрипционная активность гена ССЫ не изменяется.

5. Полиморфный локус 3005С>Т (гы715762) гена С04010 не ассоциирован с уровнем транскрипционной активности этого гена в лейкоцитах периферической крови и с эссенциальной гипертензией, но ассоциирован с показателем функциональной активности системы свертывания крови - активированным временем рекальцификации плазмы; у носителей генотипа С040Ш3005*С/*С по сравнению с носителями генотипа СШ(Ш33005*Т/*Т ниже значения этого показателя а, следовательно, выше риск образования тромбов.

6. Полиморфный локус 704(14)I/D (rs3917887) гена CCL2 ассоциирован с транскрипционной активностью этого гена в лейкоцитах периферической крови у больных эссенциалыюй гипертензией; транскрипционная активность гена CCL2 выше у гомозигот по делеции, чем у гетерозигот и гомозигот по инсерции.

6. Не выявлено ассоциаций полиморфных локусов генов CXCR3 (-3328А>С, rs3091305), CXCR4 (1627С>Т, rs2471859), SELL (L193F, rs3177980), SELE (3832T>C, rs2076059), SELF (S331N, rs6131), NFKB1 (28081564T>A, rs4648110), CASP1 (-877C>T, rs481736) и FAS (-670 A>G, rsl 800682) с эссенциальной гипертензией.

7. В структуру наследственной предрасположенности к эссенциалыюй гипертензии вносят вклад эффекты взаимодействий аллельных вариантов генов CCL2 (53570Т), SELE (L193F) и гена CXCR3 (-3328А>С).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Насибуллин Т.Р., Белоногова В.А., Туктарова И.А., Карамова И.М., Мустафина O.E. Роль полиморфных маркеров гена CCL2 в формировании наследственной предрасположенности к эссенциальной гипертензии // Генетика. - 2011. - Т.7, №9. -С. 1262-1266.

2. Белоногова В.А., Насибуллин Т.Р., Туктарова И.А.. Карамова И.М., Мустафина O.E. Гаплотипический анализ гена CCL2 у больных эссенциальной гипертензией // Молекулярная диагностика. Сб. трудов. - 2010. - Т.З. - С. 17-18.

3. Насибуллин Т.Р., Белоногова В.А., Эрдман В.В., Туктарова И.А., Николаева И.Е, Гареева JI.H., Карамова И.М., Мустафина O.E. Роль полиморфных маркеров воспаления в формировании наследственной предрасположенности к эссенциальной гипертензии // Цитокины и воспаление. - 2011. - Т. 10, №3. - С. 4650.

4. Белоногова В.А., Тимашева Я.Р., Насибуллин Т.Р., Туктарова И.А., Мустафина O.E. Ассоциация инсерционно-делеционного (I/D) полиморфизма гена CCL2 с эссенциальной гипертензией // Материалы III Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины». Ростов-на-Дону. - 2009. - С. 152-154.

5. Белоногова В.А., Тимашева Я.Р., Насибуллин Т.Р., Мустафина O.E. Ассоциация полиморфизма -511Т>С гена интерлейкина 1 бета с эссенциальной гипертензией // Материалы XII Всероссийской медико-биологической конференции молодых

исследователей «Фундаментальная наука и клиническая медицина». Санкт-Петербург. - 2009. - С. 43-44.

6. Белоногова В.А., Тимашева Я.Р., Насибуллин Т.Р., Мустафина O.E. Ассоциация инсерционно-делеционого полиморфизма гена CCL2 с эссенпиальной гипертензией //Труды Всероссийской конференции, посвященной 10-летию кафедры генетики БГПУ им. М. Акмуллы, приуроченной к ежегодным Вавиловским чтениям «Инновационные и молекулярно-генетические исследования живых систем». Уфа. - 2009. - С. 23-26.

7. Белоногова В.А., Насибуллин Т.Р., Туктарова И.А., Мустафина O.E. I/D полиморфизм гена CCL2 и риск эссенциальной гипертензии в популяции татар // Материалы Всероссийской заочной научно-практической конференции «Актуальные вопросы физиологии, психофизиологии и психологии». Уфа. - 2009. - С. 9-13.

8. Белоногова В.А., Тимашева Я.Р., Насибуллин Т.Р., Туктарова И.А., Мустафина O.E. Участие гена CCL2 в развитии эссенциальной гипертензии // Медицинская генетика. Материалы VI съезда Российского общества медицинских генетиков. Ростов-на-Дону. - 2010. - С. 21.

9. Белоногова В.А., Насибуллин Т.Р., Туктарова И.А., Карамова И.М., Мустафина O.E. Гаплотипический анализ гена CCL2 у больных эссенциальной гипертензией // Клинико-лабораторный консилиум. Материалы Российской конференции с международным участием «Молекулярные основы клинической медицины -возможное и реальное». Санкт-Петербург. - 2010. №2. - С. 149.

10. Белоногова В.А., Насибуллин Т.Р., Туктарова И.А., Карамова И.М., Мустафина O.E. Ассоциация полиморфных маркеров гена CCL2 с эссенциальной гипертензией // Материалы научно-практической конференции с международным участием «Клиническая иммунология, иммуногенетика - междисциплинарные проблемы». Ташкент. - 2010. - С. 35-36.

11. Белоногова В.А., Насибуллин Т.Р. Роль полиморфных маркеров генов факторов воспаления в формировании наследственной предрасположенности к эссенциальной гипертензии // Материалы XVIII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2011». Москва. - 2011. - С. 53.

12. Белоногова В.А., Насибуллин. Т.Р., Туктарова И.А., Николаева И.Е., Карамова И.М., Мустафина O.E. Ассоциация полиморфного локуса 3005С>Т гена CD40L с

эссенциалыюй гипертензией // Материалы II Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Медико-биологические аспекты мультифакторной патологии». Курск. - 2011. - С. 32-33.

13. Тимашева Я. Р., Матвеева В. А., Насибуллин Т. Р., Мустафнна О. Е. Полиморфизм генов цитокиновой сети и предрасположенность к эссенциалыюй гипертензии // Биомика - наука XXI века. Материалы школы-семинара молодых ученых УНЦ РАН и Волго-Уральского по физико-химической и биотехнологии. Уфа. - 2007. -С. 123-124.

14. Belonogova V.A., Nasibullin T. R., Tuktarova I.A., Mustafina О. E. Haplotype analysis of MCP-1/CCL2 with Essential Hypertension in Tatars from Russia // European Journal of Human Genetics. European Human Genetics Conference. Amsterdam. - 2011. - V. 14.-P. 134.

15. Belonogova V.A, Timasheva Y.R., Tuktarova I.A., Nasibullin T.R., Mustafina O.E. Association between the insertion-deletion polymorphism in the Сhemoattractant Protein-1 gene and Essential Hypertension // 21-st European Meeting on Hypertension. Milan.-2011.-P. 262.

16. Матвеева B.A., Насибуллин T.P., Туктарова И.А., Мустафина O.E. Роль хемокинов CCL2 и CD40LG в воспалении при эссенциальной гипертензии // Материалы IV Международной конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины». Ростов-на-Дону. - 2011. - С. 99-100.

Список сокращений и условных обозначений

АВР активированное время рекальцификации плазмы крови

АД артериальное давление

ДАД диастолическое артериальное давление

ИБС ишемическая болезнь сердца

ИМ инфаркт миокарда

ИМТ индекс массы тела

САД систолическое артериальное давление

ТА транскрипционная активность гена

ЭГ эссенциальная гипертензия

CASP1 ген каспазы 1

CCL2 ген хемокина ССЬ2 (или моноцитарного хемоаттрактантного белка)

CD40LG ген СГ)40-лиганда

CXCR3 ген хемокинового рецептора 3 C-X-C семейства

CXCR4 ген хемокинового рецептора 4 С-Х-С семейства

FAS ген таена 6 суперсемейства рецептора фактора некроза опухоли

MDR Multifactor Dimensionality Reduction

NFKB1 ген субъединицы ядерного фактора транскрипции каппа бета 1

SELE ген селектина Е

SELL ген селектина L

SELF ген селектина Р

SNP single-nucleotide polymorphism - однонуклеотидный полиморфизм

TNF-a фактор некроза опухолей альфа

TNFRSF1A ген рецептора первого типа фактора некроза опухолей

CIoR 95% confidence interval - 95% доверительный интервал для OR

df число степеней свободы

H критерий Краскела—Уоллиса

OR odds ratio - соотношение шансов

МАТВЕЕВА ВАЛЕРИЯ АЛЕКСАНДРОВНА

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Подписано в печать 27.03.12 г. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать ризографическая. Тираж 100 экз. Заказ 642. Гарнитура «ТнпезКе\у11отап». Отпечатано в типографии «ПЕЧАТНЫЙ ДОМЪ» ИП ВЕРКО. Объем 1,2 п.л. Уфа, Карла Маркса 12 корп. 4, т/ф: 27-27-600, 27-29-123

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Матвеева, Валерия Александровна, Уфа

0 1 гг-6!№Ь

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ ИНСТИТУТ БИОХИМИИ И ГЕНЕТИКИ УФИМСКОГО НАУЧНОГО ЦЕНТРА РАН

На правах рукописи

Матвеева Валерия Александровна

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

ЭССЕНЦИАЛЬНОЙ ГИПЕРТЕНЗИИ: ПОЛИМОРФИЗМ И ТРАНСКРИПЦИОННАЯ АКТИВНОСТЬ ГЕНОВ ВОСПАЛИТЕЛЬНОГО ОТВЕТА

03.02.07 - генетика

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: д.б.н., проф. O.E. Мустафина Научный консультант: д.м.н., проф. И.М. Карамова

УФА-2012

ВВЕДЕНИЕ..........................................................................................................................................7-11

Глава 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Современная концепция этиологии эссенциальной гипертензии

как полигенного многофакторного заболевания................................................12-18

1.2 Роль воспаления в развитии эссенциальной гипертензии..................18-22

1.3 Гены воспалительного ответа - гены-кандидаты эссенциальной гипертензии..........................................................................................................................................................................................22

1.3.1 Гены хемокинов (CCL2, CXCR3, CXCR4, CD40L)..............................22-32

1.3.2 Гены молекул клеточной адгезии (SELE, SELP, SELL)..................32-36

1.3.3 Ген субъединицы ядерного фактора транскрипции каппа

бета 1 СNFKB1)....................................................................................................................................................................................36-39

1.3.4 Ген каспазы 1 (CASP1)....................................................................................................39-40

1.3.5 Ген члена 1А суперсемейства рецептора фактора некроза

опухоли (TNFRSF1A)........................................................................................................................41 -42

1.3.6 Ген члена 6 суперсемейства рецептора фактора некроза

опухоли (FAS)....................................................................................................................................42-43

1.4 Транскриптомные исследования клеток периферической крови

больных эссенциальной гипертензией............................................................................44-46

Глава 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ...............

2.1 Характеристика исследуемых групп........................................................................47-48

2.2 Основные молекулярно-генетические методы

2.2.1 Выделение геномной ДНК из периферической венозной крови человека......................................................................................................................................................48-49

2.2.2 Полимеразная цепная реакции синтеза ДНК и рестрикционный анализ................................................................................................................49-52

2.2.3 Выделение тотальной РНК из лейкоцитов периферической

крови человека........................................................................................................................................52-53

2.2.4 Синтез первой цепи комплементарной ДНК с одноцепочечной РНК-матрицы реакцией обратной транскрипции................................................54-56

2.2.5 Совмещенная с обратной транскрипцией количественная полимеразная цепная реакция в режиме реального времени........... 56-59

2.3 Электрофорез................................................................. 60

2.4 Статистическая обработка результатов исследования............... 60-62

Глава 3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Анализ ассоциаций полиморфных локусов генов воспалительного ответа с эссенциальнй гипертензией.................. 63

3.1.1 Анализ ассоциаций полиморфных локусов rs 1860190, rs 1024611, rs991804, rs3917887 гена CCL2 с эссенциальной гипертензией..................................................................... 64-75

3.1.2 Анализ ассоциаций полиморфного локуса rs715762 гена

CD40LG с эссенциальной гипертензией.................................... 75-77

3.1.3 Анализ ассоциаций полиморфного локуса rs3091305 гена

CXCR3 с эссенциальной гипертензией..................................... 77-79

3.1.4 Анализ ассоциаций полиморфного локуса rs2471859 гена

CXCR4 с эссенциальной гипертензией...................................... 79-80

3.1.5 Анализ ассоциаций полиморфного локуса rs3177980 гена

SELL с эссенциальной гипертензией......................................... 81-83

3.1.6 Анализ ассоциаций полиморфного локуса rs2076059 гена

SELE с эссенциальной гипертензией......................................... 83-86

3.1.7 Анализ ассоциаций полиморфного локуса rs6131 гена SELP с эссенциальной гипертензией.................................................. 86-89

3.1.8 Анализ ассоциаций полиморфного локуса rs4648110 гена

NFKB1 с эссенциальной гипертензией................................................. 90-91

3.1.9 Анализ ассоциаций полиморфного локуса rs481736 гена

CASP1 с эссенциальной гипертензией........................................ 91-93

3.1.10 Анализ ассоциаций полиморфного локуса rs767455 гена TNFRSF1A с эссенциальной гипертензией........................................ 93-96

3.1.11 Анализ ассоциаций полиморфного локуса rs 1800682 гена

FAS с эссенциальной гипертензией....................................................................................................96-98

3.1.12 Анализ гаметического неравновесия по сцеплению и анализ межгенных взаимодействий аллельных вариантов анализирумых генов-кандидатов эссенциальной гипертензии........................................................98-101

3.2 Анализ уровня транскрипционной активности генов хемокинов CD40L и CCL2 в лейкоцитах периферической крови у больных эссенциальной гипертензией................................................... 102-109

3.3 Анализ ассоциаций полиморфных локусов генов хемокинов CD40LG и CCL2 с транскрипционной активностью этих генов и некоторыми клинико-лабораторными показателями у больных

эссенциальной гипертензией..................................................................................................110-117

ЗАКЛЮЧЕНИЕ....................................................................................................................................118-124

ВЫВОДЫ................................................................................................................................................125-126

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ

ЛИТЕРАТУРЫ......................................................................................................................................127-158

ПРИЛОЖЕНИЕ....................................................................................................................................159-188

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИИ

АГ

АВР

АД

ДАД

ИБС

ИМ

имт

лпнп

оим

ОТ-ПЦР-РВ

п.о.

ПДРФ

ПЦР

РАС САД

ссз

ТА

хс

ЭнК

эг

CASP1 CCL2

CD40LG

CXCR3

- артериальная гипертензия

- активированное время рекальцификации плазмы крови

- артериальное давление

- диастолическое артериальное давление

- ишемическая болезнь сердца

- инфаркт миокарда

- индекс массы тела

- липопротеиды низкой плотности

- острый инфаркт миокарда

- обратная транскрипция - полимеразная цепная реакция в режиме реального времени

- пар оснований

- полиморфизм длины рестрикционных фрагментов

- полимеразная цепная реакция

- ренин-ангиотензиновая система систолическое артериальное давление

- сердечно-сосудистые заболевания транскрипционная активность гена

- холестерин

- эндотелиальные клетки

- эссенциальная гипертензия

- ген каспазы 1 (caspase 1)

- ген хемокина CCL2 (chemokine С-С motif ligand 2) или моноцитарного хемоаттрактантного белка ( MCP-1- monocyte chemoattractant protein 1)

- ген С040-лиганда (CD40 ligand - tumor necrosis factor ligand superfamily, member 5)

- ген хемокинового рецептора 3 С-Х-С семейства (chemokine С-Х-С motif receptor 3 - Mig receptor)

CXCR4 - ген хемокинового рецептора 4 С-Х-С семейства (chemokine С-

Х-С motif receptor 4) FAS - ген члена 6 суперсемейства рецептора фактора некроза

опухоли (tumor necrosis factor receptor superfamily member 6) IL интерлейкин (interleukin)

MDR - Multifactor Dimensionality Reduction

NFKB1 - ген ДНК-связывающей субъединицы ядерного фактора

транскрипции каппа бета 1 (nuclear factor kappa-B DNA binding subunit)

SELE - ген селектина E (selectin E)

SELL - ген селектина L (selectin L)

SELP - ген селектина P (selectin P)

SNP - single-nucleotide polymorphism - однонуклеотидный

полиморфизм

TNF-a - фактор некроза опухолей альфа (tumor necrosis factor alpha)

TNFRSF1A - ген члена 1А суперсемейства рецептора фактора некроза

опухоли (tumor necrosis factor receptor superfamily, member 1 A) CI - 95% confidence interval - 95% доверительный интервал

df - число степеней свободы

H - критерий Краскела—Уоллиса

N - Объем выборки

OR - odds ratio - соотношение шансов

ВВЕДЕНИЕ

Глобальной задачей нашего времени является борьба с пандемией многофакторных заболеваний. В связи с результатами анализа молекулярно-генетических основ патологических состояний открываются широкие перспективы для разработки и внедрения в медицину, медицинскую диагностику инновационных подходов, основанных на современных методах молекулярной биологии.

Эссенциальная гипертензия (ЭГ) признана пандемией в большинстве стран мира, в том числе и в России, где распространенность этого заболевания составляет 39.2% среди мужчин и 41.1% среди женщин. Как этиологический фактор коронарных, цереброваскулярных и реноваскулярных заболеваний, ЭГ представляет собой одну из основных причин заболеваемости, инвалидизации и смертности населения.

ЭГ - многофакторное полигенное заболевание, основным проявлением которого является синдром артериальной гипертонии (АГ). В целом ЭГ характеризуют как сложный комплекс взаимосвязанных гемодинамических, метаболических и нейрогуморальных нарушений. Полагают, что множество средовых экзо- и эндогенных факторов (возраст, пол, повышенное потребление поваренной соли, злоупотребление алкоголем, гиподинамия, ожирение, состояние активности симпато-адреналовой и ренин-ангиотензиновой систем и прочие), наследственная предрасположенность способствуют развитию ЭГ [Кобалава Ж.Д., Котовская Ю.В., 2000; Оганов Р.Г., Фомина И.Г., 2006]. Взаимосвязь разных патогенетических механизмов развития ЭГ отражена в мозаичной теории Пейджа. Однако и эта концепция не является окончательной. Признают, что, несмотря на продолжительность исследований данного заболевания, обширные клинические и клинико-физиологические исследования, этиология ЭГ остается неизвестной.

Как и другие многофакторные заболевания, ЭГ характеризуются неполной пенетрантностью, полигенным характером наследования, генетической гетерогенностью, сильным влиянием факторов среды. Результаты близнецовых исследований показывают, что существует высокая конкордантность по уровню АД и заболеваемости ЭГ среди монозиготных близнецов. Наличие родственника первой степени родства, страдающего ЭГ, повышает риск заболевания в 2-5 раз. Семейная история выявляется у 20-40% больных. Индивидуальные различия в уровне АД как минимум на 50%) связаны с наследственностью [Shih Р.В., 0"Connor D.T., 2008].

Молекулярно-генетические основы ЭГ интенсивно исследуются и опубликовано значительное число работ, посвященных этой проблеме. Поиск генов ЭГ основывается на разработанных для многофакторных признаков и заболеваний стратегиях, которые включают в себя анализ ассоциаций с заболеванием полиморфных локусов генов-кандидатов, исследования на модельных объектах, изучение редких моногенных форм гипертонии, полногеномные исследования (GWAS - Genome-wide association study), мета-анализ по совокупности результатов многих независимо проведенных исследований [Cambien F., Tiret L., 2007]. В последнее десятилетие достигнуты большие успехи в определении генетических основ моногенных форм АГ, однако они составляют лишь небольшую часть всех случаев заболевания.

Не менее 150 генов можно предположительно отнести к генам-кандидатам ЭГ [http://cmbi.bjmu.edu.cn/genome/candidates/candidates.html]. Прежде всего, к ним относят гены, кодирующие белки ренин-ангиотензиновой и калликреин-кининовой систем (ангиотензиноген, ангиотензин-превращающий фермент, ренин и другие); белки, обеспечивающие поддержание сосудистого тонуса (эндотелины, синтазы оксида азота, компоненты кальциевых каналов), структуры сосудов (эластин, фибриллин, коллаген-связываюший белок); рецепторы адренергической системы (например, дофамина); продукты метаболизма стероидных гормонов (11-гидроксилазы, 17-а-гидроксилазы и др.), водно-солевого гомеостаза

(аквапорины, рецепторы вазопрессинов, ионные каналы). Результаты ассоциативных исследований противоречивы. Было обнаружено, что характер ассоциаций имеет возрастные, тендерные, этнические, расовые особенности. По всей видимости, большое число аллелей с низкой пенетрантностью вовлечено в предрасположенность к ЭГ. Факторы окружающей среды и образа жизни могут влиять на пенетрантность генетических факторов риска ЭГ.

В итоге мета-анализа результатов глобальных полногеномных исследований ЭГ были обозначены взаимодействующие сигнальные пути этиопатогенеза ЭГ. Это дофаминовый сигналинг, РКА-, PGE2- и сАМР-сигналинг, сигнальные пути альфа- и бета адренэргическогих рецепторов (GRIA4, GRIN2A, GABRB3, ADCYP5, GNAS, РРРЗСА, PRKAR2B), сигналинг при межклеточных взаимодеиствиях (ITAG3, COL4A2, CLDN14, ACTN2, CTNNA3, MAGI1), сигналинг фактора ингибирования миграции макрофагов.

В связи с результатами экспериментальных исследований и клинических наблюдений все большее внимание обращается на потенциальную роль системного воспалительного ответа в развитии ЭГ [Hermann М., Ruschitzka F., 2009]. Также и по итогам исследований дифференциальной экспрессии генов в клетках периферической крови больных ЭГ с использованием ДНК-чипов обоснована в общих чертах роль воспаления и генов воспалительного ответа в развитии заболевания [Korkor М.Т. et al., 2011]. Поэтому гены воспалительного ответа можно отнести к потенциальным генам-кандидатам ЭГ. Анализ полиморфизма и экспрессии генов воспалительного ответа при ЭГ представляет значительный интерес, что и определило цель данного исследования.

Цель работы - оценить значимость полиморфизма ряда генов воспалительного ответа в развитии эссенциальной гипертензии.

Были поставлены следующие задачи: 1. Провести анализ ассоциаций с эссенциальной гипертензией полиморфных локусов генов воспалительного ответа:

CCL2 (-2518A>G, -5796 А>Т, 5357 С>Т, 704(14)I/D),

CD40LG (30050Т), CXCR3 (-3328А>С), CXCR4 (16270Т), SELL( L193F), SELE (3832T>C), SELP( S331N); TNFRSF1A (36G>A); NFKB1 (28081564 T>A); CASP1 (-8770T); FAS (-670 A>G).

Научная новизна исследования. Впервые на однородной по этнической и тендерной принадлежности выборке (мужчины татарской этнической принадлежности, проживающие в Республике Башкортостан) проведено комплексное исследование молекулярно-генетических основ ЭГ: анализ ассоциаций заболевания с 14-ю полиморфными локусами генов воспалительного ответа (CCL2, CD40LG, CXCR3, CXCR4, SELL, SELE, SELP, TNFRSF1A, NFKB1, CASP1 и FAS), исследование уровня транскрипционной активности (ТА) генов хемокинов CCL2 и CD40LG у больных ЭГ, анализ ассоциаций полиморфных локусов генов CCL2 и CD40LG с уровнем ТА этих

генов и некоторыми клинико-лабораторными показателями при ЭГ. Впервые показана значимость полиморфизма генов ССЬ2 и ТЫРКБПА как факторов риска развития ЭГ. Установлено, что эффекты взаимодействий аллельных вариантов генов ССЬ2 (5357С>Т), БЕЬЕ (Ы93Г) и гена СХСЯЗ (-3328А>С) вносят вклад в формирование молекулярно-генетических основ ЭГ. У больных ЭГ повышена ТА гена С040Ш. Впервые показано, что полиморфизм генов С040Ю и ССЫ имеет значение в формировании эндогенных факторов риска ЭГ: полиморфный локус 30050Т (Ъ715762) гена С040Ю ассоциирован с показателем функциональной активности системы свертывания крови -активированным временем рекальцификации плазмы, полиморфный локус 704(14)1Я) (гб39 17887) гена ССЬ2 ассоциирован с ТА этого гена в лейкоцитах периферической крови у больных ЭГ, полиморфный локус 5357С>Т (^991804) гена ССЬ2 ассоциирован с количеством тромбоцитов в крови больных ЭГ.

Глава 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Современная концепция этиологии эссенциальной гипертензии как полигенного многофакторного заболевания

За последнее десятилетие во взглядах на этиологию и патогенез эссенциальной гипертензии (ЭГ) произошли значительные изменения. Традиционно ЭГ рассматривается как болезнь хронически повышенного артериального давления (АД). Основным проявлением ЭГ является артериальная гипертония (АГ), не связанная с наличием патологических процессов, при которых повышение АД обусловлено известными, в современных условиях часто устраняемыми причинами (симптоматические артериальные гипертензии) [Кушаковский М.С., 2002]. В настоящее время ее характеризуют как сложный комплекс взаимосвязанных гемодинамических, метаболических и нейрогуморальных нарушений. Полагают, что множество средовых экзо- и эндогенных факторов (возраст, пол, повышенное потребление поваренной соли, злоупотребление алкоголем, гиподинамия, ожирение, состояние активности симпато-адреналовой и ренин-ангиотензиновой систем и другие) и наследственная предрасположенность способствует развитию ЭГ [Кобалава Ж.Д., Котовская Ю.В., 2000; Оганов Р.Г., Фомина И.Г., 2006]. Взаим�

Информация о работе

Матвеева, Валерия Александровна
кандидата биологических наук
Уфа, 2012
ВАК 03.02.07

Диссертация

Молекулярно-генетическое исследование эссенциальной гипертензии: полиморфизм и транскрипционная активность генов воспалительного ответа - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы