Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Липопротеид(а) и полиморфизм апобелка(а) как факторы риска атеросклероза и его осложнений
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия
Автореферат диссертации по теме "Липопротеид(а) и полиморфизм апобелка(а) как факторы риска атеросклероза и его осложнений"
На правах рукописи
Афанасьева Ольга Ильинична
ЛИПОПРОТЕИД(а) И ПОЛИМОРФИЗМ АПОБЕЛКА(а) КАК ФАКТОРЫ РИСКА АТЕРОСКЛЕРОЗА И ЕГО ОСЛОЖНЕНИЙ
03.01.04. - Биохимия 14.01.05. - Кардиология
4852144
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
МОСКВА-2011
1 8 АВГ 2011
4852144
Работа выполнена в лаборатории проблем атеросклероза института экспериментальной кардиологии и отделе проблем атеросклероза института клинической кардиологии ФГУ РК НПК МЗ и СР РФ.
Научный консультант: доктор биологических наук, профессор, Покровский Сергей Николаевич
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор Ланкин Вадим Зиновьевич
доктор медицинских наук,
профессор Денисенко Александр Дорофеевич
доктор медицинских наук, профессор Аронов Давид Меерович
Ведущая организация:
Факультет фундаментальной медицины Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова.
Защита состоится «14» сентября 2011 года в 13.30 на заседании специализированного совета Д 208.073.01 по присуждению ученой степени доктора наук при РКНПК МЗ и СР РФ (121552, Москва, 3-я Черепковская ул., д. 15а).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ РКНПК МЗ и СР РФ. Автореферат разослан » 2011 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, д.м.н.
В.Е.Синицын
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.
Актуальность проблемы. Атеросклероз рассматривается как полигенное заболевание, связанное с хроническим очаговым поражением крупных и средних артерий вследствие отложения и накопления в интиме артерий атерогенных липопротеидов. В результате в сосудистой стенке происходят структурно-клеточные изменения, которые и приводят к образованию атеросклеротических бляшек. Атеросклероз является основной причиной сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ), лидирующих в структуре смертности и нетрудоспособности населения, как в России, так и за рубежом. Согласно липидной гипотезе патогенеза атеросклероза, высокий уровень холестерина атерогенных липопротеидов, приводит к возникновению и развитию атеросклеротического поражения артериального русла. Дислипопротеидемия является ключевым модифицируемым фактором риска возникновения и развития атеросклеротических поражений в разных сосудистых бассейнах. Несмотря на успехи современной медикаментозной терапии, более чем у половины больных ишемической болезнью сердца (ИБС) сохраняется высокий остаточный риск сердечно-сосудистых осложнений (ССО) [Chapman M.J. et al, 2010]. Поиск и определение роли новых факторов риска возникновения и развития атеросклероза с целью предотвращения ССО является актуальной задачей современной биологии и медицины.
Липопротеид(а) [Лп(а)] входит в состав семейства апоВюо - содержащих липопротеидов. Это сложный надмолекулярный комплекс, состоящий из ЛНП-подобной частицы, в которой молекула белка апоВ100 связана дисульфидной связью с молекулой апобелка(а) [апо(а)]. Белок Апо(а) встречается только у человека и высших приматов и обладает высокой степенью гомологии первичной структуры с молекулой плазминогена [McLean J.W. et al, 1987]. Подобно молекуле плазминогена, апо(а) состоит из крингл-доменов, но в апо(а) имеются только сигнальный и неактивный протеазный домены, V крингл, а также множество повторов IV крингла. Ген апо(а) кодирует 10 различных типов IV крингла (К. IV), отличающихся аминокислотной последовательностью. Количество повторов IV крингла 2-го типа (К IV2) варьирует от 3 до 40, остальные типы К IV присутствуют в молекуле апо(а) в единственном числе [Koschinsky M.L. et al, 1990].
Лп(а) был открыт в 1963 году [K.Berg, 1963], однако его физиологическая роль, а также возможные механизмы участия в атеротромбогенезе, до сих пор остаются неясными. Благодаря особенностям своей структуры, Лп(а) может являться связующим звеном в процессах атеро- и тромбогенеза. Также не решен вопрос о патогенетической значимости этого липопротеида и не найдены способы его эффективной коррекции. Наличие полиморфизма Лп(а), генетическая детерминированность и значимые этнические различия в распределении Лп(а), а также остающийся открытым вопрос о роли Лп(а) как причинного фактора риска атеросклероза определяют актуальность изучения роли изоформ апо(а) в развитии атеросклероза и ИБС, в сравнении с классическими факторами риска и концентрацией Лп(а) [Erque S. et al, 2010]. Вместе с тем, разработка методов эффективной коррекции уровня Лп(а)
1
позволит оценить роль частицы Лп(а) в развитии атеросклеротических поражений и улучшить прогноз больных ИБС. Согласно Консенсусу экспертов Европейского общества по атеросклерозу, «дальнейшие усилия на международном уровне должны быть направлены на оценку в различных этнических группах атеротромботического риска, обусловленного частицей Лп(а) с одной стороны, и апо(а), с другой стороны» [Nordestgaard B.G. et al, 2010]. Наша работа посвящена решению этой актуальной проблемы - изучению роли Лп(а) и полиморфизма апо(а) как новых факторов риска атеросклероза и разработке методов коррекции повышенной концентрации Лп(а).
Целью работы явилось определение значимости концентрации Лп(а) и полиморфизма апобелка(а) как независимых факторов риска атеросклероза и его осложнений.
Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:
1. Разработать препаративные методы выделения Лп(а) из плазмы крови человека и специфических антител к Лп(а).
2. На основе полученных препаратов разработать методы определения концентрации Лп(а) и изоформ апо(а).
3. Изучить распределение изоформ апо(а) и концентрации Лп(а) у здоровых доноров и больных с ССЗ.
4. Исследовать связь Лп(а) с традиционными факторами риска атеросклероза.
5. Оценить влияние полиморфизма апо(а) и концентрации Лп(а) на прогноз больных ИБС.
6. Разработать технологию синтеза иммуносорбента для процедур Лп(а) афереза.
7. Оценить безопасность, специфичность и эффективность Лп(а) афереза с использованием созданного иммуносорбента для лечения больных ИБС с повышенной концентрацией Лп(а).
Научная новизна: В результате работы впервые: 1) определена значимость полиморфизма апо(а) в возникновении атеросклероза различных локализаций независимо от других факторов риска и концентрации Лп(а), что позволяет говорить о достоверно большей атерогенности частиц Лп(а), содержащих низкомолекулярные (НМ) изоформы апо(а); 2) Показана связь НМ изоформ апо(а) и концентрации Лп(а) с развитием окклюзий аутовенозных шунтов после операций реваскуляризации миокарда, а также прогностическая значимость концентрации Лп(а) и изоформ апо(а) у больных ИБС; 3) В экспериментах in vitro и исследованиях ex vivo проведено сравнение различных систем для удаления Лп(а) из плазмы крови человека экстракорпоральными методами; 4) описан алгоритм, позволяющий оптимизировать проведение процедур терапевтического афереза липидов в зависимости от индивидуального липидного профиля пациента.
Разработаны новые оригинальные методы снижения концентрации Лп(а) в плазме крови человека с использованием сорбционных технологий и показана их клиническая эффективность. Созданный иммуносорбент к Лп(а) обладает высокой сорбционной емкостью и способен удалять Лп(а), не оказывая влияния
на другие компоненты плазмы крови человека.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Разработана методологическая платформа для: 1.1. выделения препаративных количеств Лп(а); 1.2. получения высокоспецифических поликлональных антител к Лп(а); 1.3. определения концентрации Лп(а) и изоформ апо(а) в плазме или сыворотке крови человека; 1.4. Создан лабораторный прототип отечественной тест-системы для определения концентрации Лп(а) с высокой чувствительностью и воспроизводимостью тестов.
2. Подтверждена обратная связь между концентрацией Лп(а) и размером изоформы апо(а). Показано, что концентрация Лп(а)>30 мг/дл и НМ изоформы апо(а) встречаются более чем у 40% больных с атеросклеротическими поражениями различных сосудистых бассейнов.
3. Полиморфизм апо(а) определяет участие Лп(а) в процессе атерогенеза, независимо от других факторов риска и концентрации Лп(а), а также определяет преждевременное развитие ИБС.
4. НМ изоформы апо(а) определяют наличие, тяжесть и распространенность атеросклеротических поражений в коронарных, сонных, периферических артериях, а также развитие мультифокального атеросклероза, независимо от других факторов риска и концентрации Лп(а).
5. Показана независимая от других факторов риска связь НМ изоформ апо(а) и концентрации Лп(а) с неблагоприятным прогнозом у больных ИБС и развитием окклюзий аутовенозных шунтов после операции реваскуляризации миокарда.
6. На основе разработанного иммуносорбента с ПкАт к Лп(а) создан уникальный эффективный, специфичный и безопасный метод коррекции Лп(а).
Научно-практическая значимость работы. Показана большая атерогенность частиц Лп(а), содержащих НМ изоформы апо(а). Наличие НМ изоформ апо(а) является фактором риска атеросклероза коронарных, сонных и артерий нижних конечностей, независимо от других факторов риска и концентрации Лп(а). Определена значимость полиморфизма апо(а) и концентрации Лп(а) для развития ИБС у лиц молодого и среднего возраста.
Показана достоверная связь повышенного уровня Лп(а) с риском развития различных клинических форм атеросклеротических поражений, а также с риском окклюзии венозных шунтов после проведения операции аорто-коронарного шунтирования. Создан лабораторный прототип отечественной тест-системы для определения концентрации Лп(а) в плазме/сыворотке крови человека. Разработана технология синтеза высокоспецифичного иммуносорбента для удаления Лп(а). С использованием указанной технологии создан уникальный продукт - колонки Лп(а) Липопак для процедур Лп(а) афереза. Колонки успешно прошли клинические испытания как в России, так и за рубежом. Иммуносорбционные колонки Лп(а) Липопак® рекомендованы к применению и используются в лечебно-профилактических учреждениях России и стран Европейского сообщества для специфического удаления Лп(а) из плазмы крови человека при лечении больных ИБС с повышенной
концентрацией Лп(а) (регистрационное удостоверение № ФСР 2009/05784 и ЕС Certificate №№ 08006 lQS/NB/a и 080367 CN/NB).
Разработанные методики определения концентрации Лп(а) и изоформ апо(а) в плазме и сыворотке крови внедрены в научно-практическую работу ФГУ РКНПК МЗ CP и РФ. Препаративные методы выделения Лп(а) и специфических антител к Лп(а) используются при производстве колонок Лп(а) Липопак®.
Апробация работы: По материалам диссертации опубликовано 103 печатных работы, из них 72 в рецензируемых отечественных и зарубежных журналах. Различные разделы работы с 1993 года были широко представлены и обсуждены на многих отечественных и международных симпозиумах, конференциях и конгрессах, в том числе: Симпозиуме «Липопротеиды и атеросклероз» (Санкт-Петербург 1995); Российском национальном конгрессе кардиологов (Санкт-Петербург 2002, Москва 2006, 2009, 2010); 4, И, 13 конференциях Московского Общества гемафереза (Москва 1996,2003, 2005); 1 Всероссийской конференции по проблемам атеросклероза (Москва 1999); II Конгрессе ассоциации кардиологов СНГ (Бишкек 1999); Симпозиуме «Экспериментальные и клинические проблемы атеросклероза» ассоциации кардиологов СНГ (Москва 2000); 8 Всероссийском съезде сердечно-сосудистых хирургов (Москва 2002); Конференции «Терапевтический аферез - итоги и перспективы» (Санкт-Петербург 2003); Научно-практической конференции «Актуальные вопросы экстракорпоральной терапии» (Москва 2007); X, XI, XII XIII, XV International Symposium on Atherosclerosis (Монреаль 1994, Париж 1997, Стокгольм 2000, Киото 2003, Бостон 2009); 73-76,78 Конгрессах European Atherosclerosis Society (Утрехт 1995, Зальцбург 2002, Прага 2005, Хельсинки 2007, Гамбург 2010, Гетеборг 2011); 5,7 Int. Symposium Multiple Risk Factors in Cardiological Disease (Венеция, 1999, 2008); International Congresson Heart Disease (Вашингтон 1999); 10,11,12,13 и объединенном с DGTI Конгрессах European Society for Haemapheresis (Вена 1995, Дижон 1997, Мапьмо 1999, Рива дел Гарда 2001, Прага 2003, Дюссельдорф 2008), 9 Dresden Lipid Symposium (Дрезден 1997); 22 Конгрессе European Society for Artificial Organs (Вена 1995); International Society for Apheresis (Киото 1996, Саарбрукен 1999, Нэшвилл 2003, Росток 2005, Вена 2011); XIII, XIV Int. Symposium on Drugs Affecting Lipid Metabolism (Флоренция 1998, Нью-Йорк 2001); 5,6,7,9 Конгрессах World Apheresis Association (Хьюстон 1994, Флоренция 1996, Париж 2002, Майями 2004), объединенном конгрессе WAA-ISFA (Буйное-Айрес 2009).
Апробация докторской диссертации состоялась на заседании Ученого Совета института экспериментальной кардиологии ФГУ РКНПК МЗ и CP РФ 12 апреля 2011 г.
Структура работы: диссертация изложена на 296 стр., содержит 49 таблиц и 73 рисунка и состоит из восьми разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка цитированной литературы и приложения.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Выделение липопротеидов (ЛП) и Лп(а) плазмы крови человека проводили по модифицированной методике, основанной на дифференциальном ультрацентрифугировании в ступенчатом градиенте плотности нейтральной соли бромида натрия [Афанасьева О.И. и соавт., 1992].
Иммунизация животных-доноров для получения антител (Ат) включала первичную иммунизацию увеличивающейся дозой антигена с последующими реиммунизациями. Для получения моноспецифических Ат к Лп(а) антисыворотку истощали на сорбенте с иммобилизованными липопротеидами низкой плотности (ЛНП) [Адамова И.Ю. и соавт., 1990], контролируя эффективность истощения по содержанию Ат против апоВШо методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА).
Аффинные сорбенты с иммобилизованными на агарозную матрицу ЛП и Ат получали согласно описанному ранее способу [Афанасьева О.И. и соавт., 1991, 1993, Pokrovsky S.N. et al, 1992].
Чистоту белковых препаратов и Лп(а) тестировали методами электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) в денатурирующих условиях, в геле агарозы, иммуноэлектрофорезом, и радиальной иммунодиффузией. Специфичность выделенных Ат исследовали методами: ИФА, иммуноблотинга, двойной радиальной иммунодиффузии.
Концентрацию общего холестерина (ОХС), ХС ЛНП, ХС липопротеидов высокой плотности (ЛВП), триглицеридов (ТГ)), а также апобелков AI и Вюо, определяли ферментативным и иммунотурбидиметрическим методами с использованием коммерческих наборов «Biocon» и «Boehringer Mannheim» (Германия), Витал Диагностик (Россия), а также методом, разработанным в нашей лаборатории.
Показатели фибринолиза у больных были измерены методом ИФА с использованием наборов компании «Technoclone» (Австрия) в лаборатории клинических проблем атеротромбоза (рук. проф. Панченко Е.П.).
В исследование клинической значимости полиморфизма апо(а) и концентрации Лп(а) в развитии атеросклероза были включены 100 здоровых доноров и 817 пациентов в возрасте от 21 до 84 лет, которые прошли стационарное или амбулаторное обследование в отделе проблем атеросклероза НИИ клинической кардиологии им. А.Л. Мясникова (рук. член. корр. РАМН, проф. Кухарчук В.В.) с 1993 по 2010 г, и имеющие данные инструментальных исследований коронарных и/или сонных и/или артерий нижних конечностей.
Из исследования исключались больные с наличием острого инфаркта миокарда (ИМ) или с нестабильной стенокардией; перенесшие оперативные вмешательства менее чем за 1 месяц до исследования; с выраженной дисфункцией печени, почек и щитовидной железы; хронической сердечной недостаточностью III-IV функционального класса (ФК) согласно классификации NYHA. Кроме того, исключали больных, которые в момент исследования принимали гормональные препараты, некоторые липотропные средства (никотиновая кислота, фибраты, омега-3-ненасыщенные жирные
кислоты) и больных, которым проводили экстракорпоральные методы лечения, ввиду их возможного влияния на уровень Jln(a).
Коронароангиография (КАГ) была выполнена у 562 больных. Ультразвуковое дуплексное сканирование сонных артерий (CA) было проведено 584 пациентам, сосудов нижних конечностей (НК) - 588 пациентам (отдел новых методов диагностики и исследований, рук. проф. Рогоза А.Н.). Инвазивные процедуры выполнялись в лаборатории рентгенологии и ангиологии (рук. проф. Савченко А.П.) и лаборатории рентгено-эндоваскулярных методов лечения (рук. проф. Самко А.Н.).
Коронарный атеросклероз верифицировали при наличии стеноза >50% по диаметру в одной или более магистральных артерий. Тяжесть поражения выражали в количестве сосудов, имеющих гемодинамически значимые (>50%) стенозы. Степень уменьшения просвета 15 основных сегментов КА рассчитывали в соответствии с рекомендациями Американской Ассоциации Сердца. Распространенность атеросклеротического поражения КА выражали как индекс стенозов, рассчитанный как сумма баллов по 15 сегментам. Толщина комплекса интима-медия (ТИМ) общих сонных артерий считалась нормальной в диапазоне 0,9-1,3 мм. Атеросклеротические бляшки диагностировали при выявлении утолщения стенки сосуда более 20%. Гемодинамически значимым считалось уменьшение просвета сосуда на 50% и более. Диагноз перемежающая хромота (ПХ) I-III стадии по классификации Фонтена ставился при наличии клиники ПХ, подтвержденной положительным результатом тредмил-теста и ультразвуковой допплерографией сосудов НК.
Изучение связи Лп(а) с окклюзией аутовенозных шунтов было проведено совместно с отделом сердечно-сосудистой хирургии (рук. - акад. РАМН, проф. Акчурин P.C.) на группе 102 мужчин в возрасте от 28 до 68 лет (52,3 ± 8,6) с ИБС после операции КШ и с появлением болевых симптомов в течении первого года после операции (среднее время 5,3 ± 3,0 месяцев). Критерии исключения были аналогичны описанным выше. Всем больным была выполнена шунтография методом электронно-лучевой томографии в отделе томографии (рук. акад. РАМН, проф. Терновой С.К.)
В исследование клинической эффективности Лп(а) афереза были включены больные ИБС, верифицированной данными КАГ, уровнем Лп(а) более 60 мг/дл, ОХС не более 6,5 ммоль/л, ХС ЛНП не более 4,1 ммоль/л. Процедуры Лп(а) афереза проводили в отделе гемодиализа и плазмафереза (рук. - член, корр. РАМН, проф. Кухарчук В.В.), в клинике ОБП УДП РФ (рук. к.м.н. Чебышев A.A.) и отделении кардиологии с центром экстракорпоральных методов лечения клиники МЕДСИ (рук. - проф. Коновалов Г.А.), а также в клинике Люденшайда (Германия).
Статистическая обработка данных осуществлялась с помощью пакетов прикладных статистических программ STATISTICA v.8.0 и Med Cale 9.3.1.0. При сравнении показателей между группами использовали критерий t Стьюдента или Вилкоксона. Для сравнения частотных данных в группах применяли критерий %2 Пирсона и точный критерий Фишера. Корреляционный анализ по Спирмену и Пирсену, а также множественный регрессионный анализ
6
использовали при изучении связи между исследуемыми параметрами. Для сравнения значимости влияния различных факторов риска на течение атеросклероза рассчитывали отношение шансов (ОШ) и 95% доверительный интервал (ДИ). Метод кривых операционных характеристик использовали для определения порогового уровня Лп(а) и изоформ апо(а) как диагностических показателей наличия атеросклероза различных сосудистых бассейнов. При анализе выживаемости применяли метод Каплана-Мейера; лог-ранговый тест использовали при сравнении кривых. Пороговый уровень статистической значимости был принят <0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
Глава 1. Разработка препаративных методов выделения Лп(а) и получения антител к Лп(а).
1.1. Разработка методов выделения Jln(a). В нашей работе препарат Лп(а) использовался в качестве: - антигена для иммунизации животных-доноров; - лиганда для приготовления аффинных колонок; - калибратора при разработке методов количественного определения Лп(а).
Исследование флотации Лп(а) показало, что наличие апо(а) сдвигает границы плавучей плотности Лп(а) в интервал, перекрывающий диапазоны флотации частиц ЛВП и ЛНП. Также незначительное количество апо(а) присутствует в свободном виде в плотности более 1,21 г/см3 и во фракции липопротеидов очень низкой плотности (ЛОНП). Нами был модифицирован метод, ступенчатого дифференциального ультрацентрифугирования плазмы крови человека в градиенте нейтральной соли NaBr. Далее были разработаны методы с использованием аффинной хроматографии, позволившие снять ограничения по количеству получаемых препаратов [Афанасьева О.И. и соавт., 1992]. Наиболее перспективным для выделения препаративных количеств Лп(а) являлся метод аффинной хроматографии на иммуносорбенте, специфичном к Лп(а) [Афанасьева О.И. и соавт. 1991].
Такой способ был лишен недостатков (низкий выход и длительность), присущих методам, ультрацентрифугирования и гель-фильтрации, и позволял варьировать количество выделяемого препарата в зависимости от поставленных задач. Характеристика выделенных препаратов показала, что образцы Лп(а), получаемые как методом двухступенчатого ультрацентрифугирования с последующей гель-фильтрацией, так и при помощи аффинной хроматографии, представляют собой высокоочищенные препараты Лп(а), обладающие характерной для этой частицы электрофоретической подвижностью и практически не содержат примесей ЛП других классов и белков плазмы крови человека.
1.2. Разработка препаративных методов получения специфических антител барана к Jln(a) человека. Особенности структуры апо(а) и частицы Лп(а), такие как высокая гомология апо(а) с плазминогеном, конформационные изменения в апо(а) при восстановлении дисульфидных связей внутри крингловых структур при использовании SH реагентов, наличие в частице Лп(а) двух апобелков - апоВюо и апо(а), связанных между собой ковалентной
дисульфидной связью по остаткам цистеинов [Brunner С. et al, 1993, Callow M.J. et al, 1995], определяли основные направления в выборе методов получения специфических Ат к Лп(а).
В качестве антигена для получения антисыворотки использовали препарат Лп(а), выделенный методом двухступенчатого ультрацентрифугирования в градиенте нейтральной соли NaBr с последующей гель-фильтрацией. В результате получали антисыворотку, специфичную к двум апобелкам - апо(а) и апоВюо-
Для выделения Ат, специфичных к Лп(а), были разработаны и апробированы 4 метода: 1 - выделение фракции иммуноглобулинов из истощенной антисыворотки сульфатным фракционированием с последующей ионно-обменной хроматографией [Адамова И.Ю. и соавт., 1990], 2 - только сульфатным фракционированием, 3 - аффинной хроматографией на сорбенте с иммобилизованными Лп(а) (рис. 1) и 4 - аффинной хроматографией на сорбенте с иммобилизованными антиидиотипическими Ат к Лп(а).
Три метода получения специфических Ат к Лп(а) основаны на выделении Ат из сыворотки, истощенной по Ат к апоВюо на сорбенте с иммобилизованными ЛНП, полученными из плазмы пациентов, не содержащих Лп(а). Ряд авторов для истощения антисыворотки проводят преципитацию Ат, добавляя 0,5 - 1,0 мг белка ЛНП на 1 мл антисыворотки 6-кратно [Alberts J.J. et.al., 1974]. Предложенное нами использование аффинной хроматографии на ЛНП-агарозе было предпочтительнее, поскольку позволяло избежать постоянного выделения препаративных количеств ЛНП, не содержащих примеси Лп(а) за счет многократного использования аффинного сорбента [Адамова И.Ю. и соавт., 1990]. Полное истощение антисыворотки по Ат к апоВюо в пределах чувствительности ИФА достигалось после проведения 6 циклов аффинной хроматографии на ЛНП-агарозе.
Метод 1. Сульфатное фракционирование и ионообменная хроматография позволяли получить высокоочищенный препарат иммуноглобулинов G (IgG) с выходом не более 70% и имел незначительные ограничения по количеству получаемого препарата Ат за счет стадии ионно-обменной хроматографии. Метод 2 доказал возможность получения очищенных препаратов Ат барана с использованием только двухступенчатого фракционирования насыщенным раствором сульфата аммония. Такая схема выделения Ат полностью снимала любые ограничения для масштабирования процесса получения Ат, сохраняя высокое качество выделяемых препаратов. Единственным недостатком было присутствие в препарате неспецифических иммуноглобулинов барана. Удельное содержание специфических Ат к Лп(а) варьировалось от 30 до 50%, в зависимости от серии сыворотки и индивидуальных особенностей иммунного ответа животного — донора.
Метод 3. Аффинная хроматография истощенной по Ат к апоВюо антисыворотки или сульфатной фракции на сорбенте с иммобилизованным Лп(а), позволила получить высокоочищенный препарат моноспецифических Ат (рис. 16 и 1в).
Аитисыворотка против Лл{а}
Антитела против Лл(а)
Заборкрови и
получение
знташворотки
Антисыворотка
против Лп(в) и апов1в()
МкД й7Щ «чд
Концаиграци* ¡gG (м«г/мя&
Рисунок 1 - (а) Схема выделения, разработанная для получения препаративных количеств специфических Ат к Лп(а) и (б) характеристика Ат. а - основные стадии выделения специфических Ат к Jln(a). б - кривые титрования препарата Ат методом ИФА. На плашки иммобилизованы Лп(а) - 5 мкг в лунку. ЛНП - 1 мкг белка апоВюо и плазманоген по 5 мкг белка в лунку, в - электрофореграмма препарата Ат против Лп(а). Электрофорез в денатурирующих условиях. Линейный градиент 5-15% ПААГ. 1%SDS, в лунку внесено 10 мкг белка в условиях восстановления дисульфидных связей. I- препарат Ат, 2- белки-маркеры.
Хроматография на Лnía} агарозе
11
Истощение «а ЛНП агарозе
« г
100 10 1 ОД «,01 0,00i
Изменение иммунореактивности апо(а) вследствие конформационных изменений за счет восстановления внутрицепочечных дисульфидных связей в крингловых доменах при обработке БН-реагентами ограничивало использование апо(а) в качестве антигена. Свойство антиидиотипических антител воспроизводить антигенные детерминанты исходных антигенов было положено в основу разработки одностадийного препаративного метода выделения специфических Ат к апо(а) с использованием антиидиотипических Ат (метод 4). Антиидиотипические Ат барана к апо(а) человека, были получены иммунизацией животного-донора высокоочищенным препаратом моноспецифических Ат к Лп(а) и имитировали антигенные детерминанты апо(а) по данным ИФА с МкАт к Лп(а). Основным преимуществом выделения Ат на колонке с антиидиотипическими Ат являлось отсутствие стадии истощения антисыворотки по антителам к апоВюо-
Сравнение методов 1, 3 и 4 показало, что выход анти-Лп(а) Ат из 1 мл сыворотки составил 2,5±1,0, 0,5±0,2 и 0,3±0,1 мг белка, соответственно.
Удельная активность таких Ат, рассчитанная как отношение величины оптического сигнала в ИФА (o.e. А492) к количеству белка (мг), варьировала в несколько раз. Максимальная иммунохимическая активность регистрировалась у Ат, полученных методом аффинной хроматографии на сорбенте с иммобилизованными Лп(а) (рис^).____ ____________
контроль
препарат
Рисунок 2 - Удельная активность различных препаратов антител к Лп(а). препарат 1 -получен аффинной хроматографией истощенной антисыворотки на Лп(а)-агарозе — (метод 3), препарат 2 — методом сульфатного фракционирования истощенной антисыворотки с последующей ионообменной хроматографией (.метод 1). препарат 3 -аффинной хроматографией антисыворотки на сорбенте с иммобилизованными анти-идиотипическими Ат к Лп(а) (метод 4), отрицательный контроль - ¡¿й барана, не подвергавшегося иммунизации, выделенного методом сульфатного фракционирования.
Таким образом, были разработаны несколько препаративных методов для получения высокоспецифичных Ат к Лп(а) не обладающих перекрестным взаимодействием с апобелками В№о и А1, а также другими компонентами плазмы крови человека.
Вывод: разработаны оригинальные препаративные методы выделения высокоочищенных Лп(а) и моноспецифическга поликлональных (Пк) антител барана против Лп(а) человека.
Глава 2. Разработка методов определения концентрации Лп(а) и изоформ апо(а) в плазме или сыворотке крови человека.
2.1. Разработка методов определения концентрации Лп(а) в плазме и сыворотке крови человека. С использованием Пк Ат к Лп(а), а также моноклональных (Мк) Ат к апоВюо были разработаны три метода количественного определения Лп(а): метод радиальной иммунодиффузии по Манчини (РИД), и два метода ИФА (рис.3).
Характеристики воспроизводимости (таб.1) и линейности методов РИД и ИФА, показали, что метод ИФА позволяет с более высокой точностью и
воспроизводимостью измерять концентрацию Лп(а) в интервале от 2 до 180 мг/дл.
Рисунок 3 - Схема твердофазного ИФЛ для количественного определения Jltt(a) в плазме или
сыворотке крови человека.
(а) - на плашке в качестве сорбирующих ПкАт к Jln(a). в качестве проявляющих - МкАт к апоВюо, конъюгиро-ванные с пероксида-зой; (б) - на плашке в качестве сорбирующих и проявляющих Am - моноспецифические ПкАт к Jln(a).
Наличие различного количества идентичных эпитопов в молекулах апо(а) в зависимости от количества повторов К IV?, составляют основную сложность при разработке методов с использованием МкАт [Marcovina S. et al, 1995]. ПкАт, в силу многообразия Ат к различным эпитопам, менее чувствительны к гетерогенности апо(а). Для проверки чувствительности разработанного «сэндвич»-ИФА с ПкАт к размеру апо(а) изоформ использовали в качестве проявляющих Ат - МкАт к апоВюо (рис. За). Данный метод позволяет определять только апо(а), входящий в состав липопротеидной частицы Лп(а), и практически не чувствителен к различиям в количестве повторов К IV2 апо(а). Регрессионный анализ двух методов ИФА (табл.2) показал, что чувствительность разработанного метода к размерам изоформ апо(а) не превышает погрешности метода.
Важно иметь ввиду, что в зависимости от фирмы-производителя диагностикума, условий хранения стандартов в диагностическом наборе и принципа, используемого в иммунологическом методе, результаты определения концентрации Лп(а) в одних и тех же образцах могут варьировать в очень широком диапазоне. Процесс стандартизации референсных образцов для методов количественного определения Лп(а) ведется в мировой практике с 2000 года [Marcovina S. et al, 2000]. Для приготовления калибровочных образцов мы использовали препарат Jln(a), содержащий несколько изоформ апо(а). Первоначально в качестве референсного материала был использован стандарт Лп(а) фирмы «Иммуно» (Австрия), затем стандартный препарат фирмы «Technoclone», Австрия, одобренный Международной Федерацией Клинической Химии. Сравнительный анализ разработанных методов, как между собой, так и с рядом коммерчески доступных и лабораторных наборов для количественного определения Лп(а), позволил сделать вывод о высокой точности и воспроизводимости получаемых данных (табл. 2).
Лп(а)
t/jM»m)fiwtwtf ПкАт к Лп(а)
Таблица 1 Точность и воспроизводимость разработанных методов РИД и ИФА.
РИД ИФА
Номер образца Концентрация Лп(а), мг/мл Коэффициент вариации,% Номер образца Концентрация Лп(а), мг/мл Коэффициент вариации,%
Внутри плашки (1=3) Внутри плашки (п=6)
1 11,2 ± 1,4 12,5 5 5,7 ±0,18 3,2
2 38,6 ±2,3 5,9 6 52,6 ±2,20 4,3
3 55.6 ±3.5 6,2 7 101,3 ±3,40 3,3
4 115,6 + 4,0 3,5 8 189,5 ±13,2 7,0
Между опытами (п=37) Между опытами (п=9)
1 11,2 ±3,5 31,5 5 5,4 + 0,79 14,7
2 40,8 ± 7,9 19,3 6 50,3 ± 4,70 9,3
3 56,8 ± 9,2 16,2 7 110,2 ±8,59 7,8
4 111,1 ± 12,9 11,6 8 177,5 ± 18,20 10,3
п=количество опытов (в каждом опыте образцы измерены в трех параллелях).
Таблица 2 Сравнение разработанного оригинального метода «сэндвич» ИФА с ПкАт к
Аналог, использованный для сравнения (разработчик/ производитель) Проявляющие и детектирующие антитела Уравнение регрессии Коэффициент корреляции (95%ДИ),р
1 РИД (лаб. прототип) ПкАт барана против Лп(а) человека у=0,4+0,96х 0,98 (0,97-0,98), р<0,005
2 ИФА (лаб. прототип) ПкАт барана против Лп(а) человека и МкАт мыши против апоВюо у = 4,84+0,89х 0,93 (0,89-0,96) р<0,0001
3 ИФА (Институт генетики человека, Инсбрук, Австрия) ПкАт кролика против Лп(а) и МкАт мыши против апо(а) у=-2,8+0,95х. 0,98 (0,95-0,99), р<0,0001
4 ИФА «TintEIisa Lp(a)»,«Biopool», Швеция ПкАт козы и МкАт мыши против Лп(а) у=3,8+1,00х, 0,99 (0,96-0,99), р<0,005
5 ИФА «Progen Biotechnik GmbH», Германия ПкАт и Fab фрагменты ПкАт козы против Лп(а) у=7,4+0,79х 0,93 (0,89-0,96), р<0,0001
2.2. Разработка метода фенотипирования апо(а). За основу была взята методика, основанная на электрофоретическом разделении Jln(a) плазмы крови человека, предложенная проф. Utermann [Utermann G. et al, 1987].
Совместная работа с институтом генетики Университета г. Инсбрук позволила провести фенотипирование ряда образцов, которые были использованы в качестве референсных для последующей разработки собственного метода. В отличии от описанного метода [Kraft Н. et al, 1988] в качестве детектирующих Ат были использованы аффинно-очищенные ПкАт барана к апо(а) человека, коныогированные с пероксидазой. Сравнение
результатов иммуноблотинга с использованием аффинно-очищеннных ПкАт и предоставленных проф. Шегтапп МкАт 1А2 (Университет г.Инсбрук, Австрия), показало преимущество ПкАт для фенотипирования апо(а). Чувствительность метода составляла 4 мг/дл Лп(а). Для проведения последующих исследований, проводилось дихотомическое деление изоформ апо(а) на низко- и высокомолекулярные. К низкомолекулярным изоформам относили апо(а) с подвижностью Б2 и более, к высокомолекулярным (ВМ) - с подвижностью 83 и менее (рис. 4 а). Пациентов с наличием хотя бы одной НМ изоформы относили в группу с НМ изоформами апо(а).
Таким образом был модифицирован и впервые внедрен в научно-практическую деятельность лаборатории метод фенотипирования апо(а) (рис. 46), позволивший определять изоформы апо(а) в плазме (сыворотке) крови человека с высокой чувствительностью и воспроизводимостью. Сопоставление классификаций по подвижности, количеству повторов К 1У2 и молекулярной массе апо(а) приведено на рисунке 4 в.
5453-
51-
Изоформа (пьяежт&ъ) Количество павторов К4г МУУ (кДа)
? <13 <400
8 14-1 в -«3
31 17-19 -520
32 20-32 -580
33 23-35 -640
34 28-30 »тда
** ЗЙЧ % * «А 'щ Ш \ % £,3,
НШ £ . ...„,
б
Рисунок 4 - Фенотипирование апо(а) методом 5Д5 электрофореза е ПААГе с последующим иммуноблотингом. Разделяющий гель 6.6%, в качестве детектирующих Ат использованы аффинно-очищенные ПкАт барана к апо(а) человека, коньюгированные с пероксидазой. (а) — классификация изоформ апо(а) по электрофоретической подвижности,
(б) — типичный пример фенотипирования образцов плазмы крови пациентов с ИБС,
(в) — сопоставление классификации изоформ по подвижности, количеству повторов КIV.> и молекулярной массе апо(а).
Вывод: Разработаны методы, позволяющие с высокой точностью и воспроизводимостью определять концентрацию Лп(а) и изоформы апо(а).
Глава 3. Распределение изоформ апо(а) и концентрации Лп(а) у здоровых доноров и больных ССЗ.
Для исследования значимости Лп(а) и полиморфизма апо(а) было проведено определение концентрации Лп(а) и фенотипирование апо(а) у 100 здоровых доноров и 817 обследованных пациентов, у 717 из которых был верифицирован атеросклероз хотя бы в одном из трех сосудистых бассейнов - коронарном, каротидном или периферическом. Исследование концентрации Лп(а) у больных атеросклерозом (п=717) и здоровых доноров (п=100) показало, что более чем у 70% здоровых доноров уровень Лп(а) не превышал принятую верхнюю границу нормы - 30 мг/дл [НормоЛп(а)], тогда как концентрация свыше 30 мг/дл -[ГиперЛп(а)] достоверно чаще встречалась у пациентов с атеросклеротическими поражениями (рис. 5)
Фенотипирование образцов сыворотки здоровых доноров, больных ССЗ с атеросклерозом показало, что НМ изоформы апо(а) в 60% случаев встречались у больных, имеющих атеросклеротическое поражение различных сосудистых бассейнов. Только ВМ изоформы апо(а) встречались более чем у 70% здоровых доноров и пациентов без атеросклероза. Не было обнаружено достоверных различий в распределении концентрации Лп(а) и изоформ апо(а) у мужчин и женщин в исследуемой группе пациентов. Коэффициент корреляции между размером мажорной изоформы апо(а) и концентрацией Лп(а) в плазме варьировал от -0,54 до -0,58 р<0,0001, независимо от наличия или отсутствия атеросклероза.
%
О 20 40 ВО 00 »0 120 1+0 1« № 250 I Ж ® 88 88 5Ю Ш Ш Ж Ш9 200
Концентрация Лп(а) мг/дл а б
Рисунок 5 - Распределение концентрации Лп(а) у (а) здоровых доноров (п=100) и (б) дольных с атеросклерозом (п=717). Пунктирная линия показывает кривую нормального распределения концентрации Лп(а).
Вывод: Повышенная концентрация Лп(а) и НМ изоформы апо(а) встречаются в два раза чаще у больных с верифицированным атеросклерозом, чем у здоровых лиц и больных ССЗ без документированного атеросклероза.
Глава 4. Связь полиморфизма апо(а) и концентрации Лп(а) с атеросклерозом различных локализаций.
В общей группе обследованных больных, включенных в исследование, максимальная связь с манифестацией атеросклероза хотя бы в одном из сосудистых бассейнов была обнаружена для НМ изоформ апо(а) (ОШ=3,2 (95% ДИ 1,8-5,6), р<0,0001), по сравнению с концентрацией Лп(а) (ОШ=2,9 (1,6-5,5) р<0,0001), мужским полом (ОШ=2,6 (1,6-4,1), р<0,0001), нарушением липидного обмена (ОШ=1,8 (1,0-3,0), р<0,005) и другими факторами риска. Проведенный корреляционный анализ показал отсутствие связи как концентрации Лп(а), так и полиморфизма апо(а) с классическими факторами риска атеросклероза и показателями липидного спектра.
Для определения связи полиморфизма апо(а) с атеросклерозом, вне зависимости от концентрации Лп(а), все больные были разделены на 4 группы в соответствии с концентрацией Лп(а) - НормоЛп(а) и ГиперЛп(а) и мажорной экспрессируемой изоформой апо(а) - ВМ и НМ апо(а). Больные (п=104), у которых ввиду низкого уровня или отсутствия апо(а) невозможно было определить изоформу апо(а), не включались в исследование. Между группами не было достоверных различий в распределении других факторов риска и показателей липидного спектра (табл.3). Необходимо подчеркнуть, что различия в концентрации ХС ЛНП после расчета коррегированного уровня ХС ЛНП (ХС ЛНПкорр), учитывающего ХС, входящий в состав Лп(а), нивелировались.
Таблица 3 Характеристика обследованных пациентов в зависимости от концентрации Jln(a) и изоформ апо(а) ._____
Лп(а) Группа 1 Группа 2 Группа 3 Группа 4
^"\долиморфизм Показатель НормоЛп(а) и ГиперЛп(а) и НормоЛп(а) и ГиперЛп(а) и
ВМ апо(а) ВМ апо(а) НМ апо(а) НМ апо(а)
Кол-во пациентов п=287 п=101 п=71 п=253
Пол (% м) 194 (68%) 73 (72%) 54 (76%) 187 (74%)
Возраст, лет 55,0±10,0 55,0±10,3 56,3±9,9 53,3±9,0*
АГ 155 (54%) 54 (53%) 42(59%) 149(59%)
Курение 122 (42%) 50 (50%) 37 (52%) 126 (50%)
Ожирение 80 (28%) 18 (18%) 11 (15%) 53 (21%)
Семейный анамнез 97 (34%) 38 (38%) 29(41%) 107 (42%)
Сахарный диабет 41 (14%) 11 (11%) 6 (8%) 18(7%)
Гиперлипидемия 237 (83%) 84 (83%) 64(90%) 213 (84%)
ОХС, ммоль/л 6,3±1,4 6,4±1,3 6,7±1,3* 6,6±1,4*
ТГ, ммоль/л 2,2±1,2 2,1±0,9 2.3±1,1 2,1±1.0
ХС ЛВП, ммоль/л 1,3±0,4 1,3±0,4 1.2±0,3 1,2±0,3
ХС ЛНП, ммоль/л 4,1±1,2 4,3±1,3 4,3±1,2 4.5±1.2*
ХС ЛНПкорр, ммоль/л 4,0±1,2 3,9±1,3 4,2±1.2 3,8±1,2
Фибриноген, г/л 3,4±1,0 3.8±1,1* 2,8±0.8* 3,3±0.9
* р< 0,05 в сравнении с группой I.
Анализ степени выраженности атеросклеротических поражений в группах больных показал, что поражения двух и трех сосудистых бассейнов достоверно
чаще встречались в группе больных с НМ изоформами апо(а) на фоне ГиперЛп(а), чем у больных с ВМ изоформами апо(а) и НормоЛп(а) (43 и 55% в сравнении с 30 и 12%, р=0,005, соответственно). У больных с ССЗ, но без верифицированного атеросклеротического поражения сосудистых бассейнов в 67% случаях наблюдалось сочетание НормоЛп(а) и ВМ изоформ апо(а).
ИБС в группе больных с ГиперЛп(а) и НМ изоформами апо(а) (группа 4) диагностировалась в среднем на 4 года раньше, чем у пациентов с ВМ апо(а), как у мужчин, так и у женщин. Доля больных с ИБС в возрасте до 45 лет была в два раза выше в группе пациентов с НМ изоформами апо(а) и ГиперЛп(а), чем у
больных с ВМ изоформами апо(а) и НормоЛп(а) (рис. 6).
Рисунок 6-Доля больных с у которых диагноз ИБС был поставлен в возрасте до 45 лет в зависимости от концентрации Лп(а) и полиморфизма апо(а). Статистический критерий /2=8.23. р=0,037.
4.1. Связь Лп(а) с атеросклерозом коронарных артерий. Больных с данными КАГ было проанализировано 562, из них у 59 пациентов выявлено отсутствие коронарного атеросклероза. НМ изоформы апо(а), так же как и ГиперЛп(а), встречались у половины больных с документированным атеросклерозом коронарных артерий (49% и 47%, соответственно).
В ходе проведенного корреляционного анализа по Спирмену показана прямая связь между концентрацией Лп(а) (г=0,13, р<0,005 и г=0,15, р<0,005), наличием НМ изоформ апо(а) (г=0,22, р<0,0001 и г=0,16, р<0,0001) и сочетанием ГиперЛп(а) и НМ изоформ апо(а) (г=0,21, р<0,0001 и г=0,18, р<0,0001) со степенью выраженности коронарного атеросклероза, оцениваемого по количеству магистральных артерий, имеющих гемодинамически значимые стенозы, и по индексу стенозов [Gensini et al, 1978], соответственно. Анализ данных КАГ в группах больных, стратифицированных в соответствии с концентрацией Лп(а) и полиморфизмом апо(а) (табл.3), показал, что поражения КА встречаются в три раза чаще в группе 3 у больных с НМ изоформами апо(а) и нормальной концентрацией Лп(а) (рис.7).
По данным множественного регрессионного анализа концентрация Лп(а) без включения в анализ фенотипа апо(а) (Р=0,17, р<0,005) является независимым предиктором наличия и тяжести атеросклеротического поражения КА наряду с
НормоЛп(а) ГиперЛп(а) НормоЛп(а) ГиперЛп(а)
полом (Р=0,23, р<0,001), возрастом (Р=0,17, р<0,005), наследственной предрасположенностью (р=0,14, р<0,05) и гиперлипидемией (Р=0,10, р<0,05).
Рисунок 7 - Отношение шансов атеросклероза коронарных
артерий в группах больных в зависимости от концентрации Лп(а) и фенотипа апо(а). Группы больных соответствовали: 1 — ВМ апо(а) и НормоЛп(а). 2 - ВМ апо(а) и Гипер Лп(а), НМ апо(а) и НормоЛп(а), 3 - НМ апо(а) и ГиперЛп(а).
При включении в статистическую модель
фенотипа апо(а) с поправкой на традиционные факторы риска только НМ изоформы апо(а) (Р=0,20, р<0,001) наряду с гиперлипидемией (Р=0,20, р<0,0001) и полом (Р=0,14, р<0,05), но не концентрация Лп(а), оказывались независимыми факторами риска атеросклероза КА. Фактор наследственной предрасположенности теряет свою значимость как предиктор тяжести поражения КА при включении в модель множественной регрессии фенотипа апо(а). Наличие у пациента НМ изоформ апо(а) (Р=0,22, р<0,0001) в большей степени, чем ГиперЛп(а) (Р=0,14, р<0,05) наряду с полом (Р=0,22, р<0,0001) являлись независимым предиктором распространенности атеросклеротических поражений КА, выраженной в индексе стенозов. При этом у включенных больных доля НМ изоформ апо(а) и частота ГиперЛп(а) увеличивалась пропорционально распространенности поражения (рис.8).
Окклюзии КА также были связаны с наличием у больных НМ изоформ апо(а) на фоне ГиперЛп(а) ОШ=1,82 (1,08-3,06), р<0,05, при этом только НМ апо(а) являлись значимым предиктором наличия окклюзий (р=0,19, р<0,001). Таким образом, установлена значимая, независимая от традиционных факторов риска, связь Лп(а) с коронарным атеросклерозом у обследованных больных при наличии НМ изоформ апо(а).
Рисунок 8 - Встречаемость НМ изоформ апо(а) и повышенной концентрации Лп(а) в подгруппах больных, стратифицированных в зависимости от распространенности атеросклеротических поражений коронарных артерий, выраженной в индексе стенозов (х = 20.3 р<0.0005 для НМ изоформ апо(а), и '/=22.0 р<0,0005 для ГиперЛп(а))
4
X
I X га 3
ш ъ X
и ю о о ю 2
с с >
1
0 5 10 15
Отношение шансов
75
70
* 65 к
О 60 О 0-10
га 55
е- 50
и со
45 40
110-20 I >20
ГиперЛп(а) НМ апо(а)
Был проведен анализ связи Лп(а) с ангиографически подтвержденным коронарным атеросклерозом и тяжестью ИБС в подгруппе больных без нарушения липидного обмена (п=96). Показано, что концентрация Лп(а) и фенотип апо(а) достоверно ассоциируются с поражением магистральных артерий и выраженностью ИБС (табл. 5). Многофакторный регрессионный анализ продемонстрировал, что только наличие НМ изоформ апо(а) (Р=0,42, р=0,002) являлось предиктором поражения коронарных артерий в группе обследованных больных без гиперхолестеринемии, концентрация Лп(а), как фактор риска, теряла значимость при введении в модель фенотипа апо(а) (Р=0,31,р=0,281).
Таблица 4 Корреляционный анализ по Спирмену связи поражения коронарных артерий, ИМ в анамнезе и тяжести ИБС с классическими факторами риска в подгруппе больных без нарушения липидного обмена (п=96)._
ИБС Показатель Функциональный класс стенокардии ИМ в анамнезе Тяжесть коронарного атеросклероза по кол-ву пораженных артерий
Пол 0.24* 0,35** -0.05
Возраст 0.11 -0.19 0.05
Курение 0,27 0.40 0.11
Артериальная гипертония 0.24 -0,09 0,05
Сахарный диабет 2 типа 0,01 -0,03 0,08
Лп(а) > 30 мг/дл 0,23* 0,30* 0,35*
Концентрация Лп(а) 0.35* 0,25* 0,34*
НМ апо(а) 0.37* 0.32* 0.42*
НМ апо(а) и ГиперЛп(а) 0,38* 0,33* 0,40*
*р<0,005.** р<0.001
4.2. Полиморфизм апо(а) и осложнения коронарного атеросклероза. В общей группе обследованных, пациенты с ГиперЛп(а) переносили ИМ в 2,5 раза чаще, чем больные с НормоЛп(а) (0111=2,46 (1,86-3,29) р<0,0001). Присутствие НМ изоформ апо(а) вне зависимости от концентрации Лп(а) было достоверно связано с наличием ИМ в анамнезе - 0111=3,02 (1,77-5,16), р<0,0001 при НормоЛп(а) и 0111=3,36 (2,36-4,78), р<0,0001 при ГиперЛп(а) (рис. 9)
х 4 л X Z Я * 3 " О X ч: з 0J I ^ Л и к. ® о2 - О VO Ь с с Й- 1 4 ,-•-1 ■-•-1 '-•-1
1 * 2 3 4 5 6 Отношение шансов
Рисунок 9 - Отношение шансов ИМ в анамнезе в группах обследованных больных, стратифицированных в зависимости от концентрации Jln(a) и изоформы апо(а). Группы дольных
соответствовали: 1 — ВМ апо(а) и НормоЛп(а), 2 - ВМ апо(а) и Гипер Лп(а), НМ апо(а) и НормоЛп(а). 3 -НМапо(а) и ГиперЛп(а).
По данным множественного регрессионного анализа НМ фенотип апо(а) ((3=0,20, р<0,005) и ГиперЛп(а) ((3=0,20, р<0,005) являлись предикторами ИМ в анамнезе наряду с такими классическими факторами риска как пол ([3=0,29, р<0,0001) и курение (0=0,30, р<0,0001).
Связь НМ изоформ апо(а) с количеством перенесенных ИМ у больных молодого возраста (I квартиль распределения - младше 48 лет) была достоверно более выражена (г-0,25, р<0,0001), чем у больных в возрасте после 60 лет (IV квартиль распределения - после 61 года) (г=0,14, р<0,05). Подобные результаты были получены и в отношении выраженности стенокардии (г=0,41, р<0,0001 и г=0,20, р<0,01, соответственно).
По всей видимости, прямая связь наличия в анамнезе ИМ с концентрацией Лп(а) реализуется за счет тромбогенного потенциала Лп(а), обусловленного высокой гомологией первичных структур молекул апо(а) и плазминогена. Для изучения различия во взаимодействии Лп(а) с лизином в зависимости от изоформы апо(а), нами был разработан метод ИФА с использованием L-лизина и ПкАт к Лп(а). В опытах in vitro было показано, что лизин-связывающая способность Лп(а) в плазме крови незначительно зависит от изоформы апо(а), однако коррелирует с концентрацией Лп(а) (г=0,69, р<0,0001). У 164 мужчин, страдающих ИБС (средний возраст 54,7±6,3 лет), концентрация Лп(а) демонстрировала связь с концентрацией комплекса тканевого активатора плазминогена - ингибитора активатора плазминогена-1 (ТАП-ИАП-1) (г=0,16, р=0,05). Также отмечена достоверная корреляция между концентрацией комплекса плазмин-антиплазмин (ПАП) с концентрацией Лп(а) (г=0,20, р<0,05), размером изоформы апо(а) (г=0,21, р<0,05), наличием НМ изоформ апо(а) (г=0,27, р<0,05), и сочетанием повышенной концентрации Лп(а) и НМ изоформ апо(а). Множественный регрессионный анализ подтвердил наличие незначительной независимой и достоверной связи концентрации Лп(а) с концентрацией ПАП (0=0,20 р<0,05) и ТАП-ИАП-1 (0=0,16 р<0,05), вне зависимости от изоформы апо(а). Полученные данные позволили предположить, что концентрация Лп(а) в большей степени, чем полиморфизм апо(а) может рассматриваться как фактор риска возникновения и развития атеротромботических осложнений атеросклероза.
4.3. Связь Лп(а) с атеросклерозом сонных артерий. Атеросклероз сонных артерий в обследованной группе был выявлен у 527 пациентов. Стратификация больных в соответствии с тяжестью поражения сонных артерий в подгруппы с увеличением ТИМ, стенозами от 20 до 50%, и более 50% показали, что только гемодинамически значимые поражения СА (более 50%) связаны с достоверным увеличением концентрации Лп(а), а также с наличием НМ изоформ апо(а) (рис. 10).
Результаты однофакторного и многофакторного регрессионного анализа демонстрировали связь концентрации Лп(а) и возраста с наличием и тяжестью атеросклеротического поражения сонных артерий у обследованных пациентов.
Рисунок 10 Концентрация Jlit(a) и наличие НМ изоформ апо(а) в зависимости от тяжести поражения сонных артерии. Данные по
концентрации Лп(а) представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего. Различия были
статистически значимы только в группе с
поражением СА более 50%, как относительно группы с увеличением ТИМ (р<0.00001), так и с поражением артерий от 20 до 50% (р=0,0001). Достоверность различий для наличия НМ апо(а) х2 =10.45 р=0,005.
Учитывая, что большинство больных имели документированное изменение коронарных артерий, а также полученные данные о связи НМ апо(а) с коронарным атеросклерозом, была выделена для анализа подгруппа пациентов без признаков поражения коронарных артерий и ИБС (п=160). Обращает на себя внимание, что в данной подгруппе не встречалось гемодинамически значимых поражений СА (более 50% стенозов). При проведении корреляционного анализа была показана прямая связь тяжести поражений СА с возрастом (г=0,29, р<0,0001) и обратная с фенотипом апо(а) (г=-0,19, р<0,05), т.е. наличие НМ апо(а) было связано с начальными атеросклеротическими изменениями СА у больных без ИБС.
Можно предположить, что наличие НМ апо(а) является фактором, определяющим субклинический атеросклероз в СА, и способствует прогрессированию коронарного атеросклероза. Полученные результаты обратной связи НМ изоформ апо(а) с развитием атеросклероза в СА в группе больных без ИБС подтверждают значимость НМ апо(а) как предиктора раннего атеросклеротического поражения.
4.4. Связь Лп(а) с поражением периферических артерий. Поражение артерий нижних конечностей (НК) и перемежающая хромота (ПХ) различной степени тяжести была диагностирована у 37 пациентов (7 женщин и 30 мужчин, возраст 59,9±8,3). Большинство больных (32, 89%) имели ИБС и поражение СА, у 24 (67%) в анамнезе был ИМ. Группу контроля составили больные без атеросклероза, а также больные с атеросклерозом, но без поражения сосудов НК (546 человек).
Отношение шансов для больных с ПХ, имеющих НМ апо(а), было в среднем в 3 раза выше относительно больных с ВМ и НормоЛп(а), как при нормальной концентрации Лп(а), так и при повышенной (ОШ=3,30 (1,15-9,44) и 2,70 (1,206,07), соответственно, р<0,05). Наличие ВМ апо(а) при повышенной
концентрации Jln(a) достоверно не увеличивало риск периферического атеросклероза (0111=1,41 (0,43-4,57), р>0,05).
4.5.Связь Лп(а) с мультифокальным атеросклерозом у больных ИБС. Для исследования влияния Лп(а) на поражение всех трех сосудистых бассейнов из общей группы обследованных больных были выделены подгруппа (п=198) с документально подтвержденным сочетанным поражением коронарного и каротидного сосудистых бассейнов и подгруппа с поражением всех трех сосудистых бассейнов (п=22). Подгруппы больных были сопоставимы по основным факторам риска, но среди больных с мультифокальным атеросклерозом было несколько больше курящих пациентов (82% и 56%, р=0,068). ГиперЛп(а) отмечалась незначительно чаще у больных с мультифокальным атеросклерозом - 55% и 41% (р=0,189). НМ апо(а) встречались у 73% больных с поражением всех трех сосудистых бассейнов, в отличие от больных с поражением только коронарного и каротидного бассейнов - 42% (р<0,05). По данным корреляционного анализа поражение сосудов нижних конечностей было связано наряду с курением (г=0,20 р<0,05) с наличие НМ апо(а) (г=0,17 р<0,05) и размером изформы апо(а) (г=0,20 р<0,05). В модели множественной регрессии при введении поправки на пол. возраст, курение и концентрацию Лп(а) только курение ((3=0,20, р=0,0003) и полиморфизм апо(а) ((3=0,19, р=0,01) оказались независимо связаны с поражением сосудов НК. При анализе, проведенном в подгруппе курящих больных, только размер изоформы апо(а) был связан с наличием атеросклеротического процесса во всех трех сосудистых бассейнах ((3=0,27, р<0,001).
Анализ связи полиморфизма апо(а) в группах пациентов, стратифицированных по возрасту, показал, что наличие НМ апо(а) наиболее тесно связано с развитием мультифокального атеросклероза именно в молодом возрасте (г=0,41, р<0,0001 для больных моложе 50 лет). Доля пациентов с НМ апо(а) увеличивается обратно пропорционально возрасту больных с мультифокальным атеросклерозом, достигая максимума у больных моложе 50 лет (рис. 11).
Рисунок 1} - Частота встречаемости НМ изоформ апо(а) у больных с мультифокальным атеросклерозом в
различных возрастных группах, (достоверность различий /2 = 17,9 р<0,0005).
<50 5IMS »60
В нашем исследовании средний возраст больных составил 55 лет, что на 1015 лет меньше возраста, при котором выявляется наибольшая распространенность мультифокального атеросклероза [Чернявский A.M. 2006].
По данным многофакторного анализа в подгруппе больных до 55 лет НМ апо(а) (Р=0,28, р<0,01) являлись более значимым фактором риска периферического атеросклероза, чем курение (р=0,22, р=0,067). В старшей возрастной группе (>55 лет) значимость НМ апо(а) (Р=0,11, р>0,1) как фактора риска мультифокального атеросклероза по сравнению с курением (Р=0,19, р<0,05) нивелировалась. Полученные нами результаты согласуются с данными, описанными итальянскими учеными, не обнаружившими достоверной связи концентрации Лп(а) с ПХ у больных старше 65 лет (средний возраст 74±6 легг) [Pantoni L. et al, 2001]. Таким образом, было показано, что наличие НМ апо(а) связано с атеросклеротическим поражением всех трех сосудистых бассейнов в исследуемой группе больных ИБС.
Вывод: присутствие НМ изоформ апо(а) независимо от традиционных факторов риска, а также концентрации JJn(a), связано с наличием и тяжестью поражений коронарных, сонных и периферических артерий, и развитием мультифокального атеросклероза у больных ИБС, особенно в молодом и среднем возрасте.
Глава 5. Исследование влияния полиморфизма апо(а) и концентрации Лп(а) на прогноз больных ИБС.
5.1. Jln(a) и полиморфизм апо(а) у больных после операции аорто-коронарного шунтирования (АКШ). Окклюзия аутовенозных шунтов, особенно в первые 12 месяцев, представляет одну из основных осложнений операции реваскуляризации миокарда. В исследование были включены 102 мужчины после операции АКШ. Окклюзии одного или более аутовенозных шунтов были обнаружены у 66 пациентов. Больные в группах с проходимыми и окклюзированными аутовенозными шунтами не отличались по традиционным факторам риска и показателям липидного спектра. В группе с проходимыми аутовенозными шунтами было больше больных, получающих лекарственную гиполипидемическую терапию статинами в послеоперационном периоде (15 (42%) и 12 (18%), р<0,05). Уровень Лп(а) был достоверно выше в группе больных с окклюзированными в течение первого года аутовенозными шунтами и составлял 42±41 мг/дл и 24±29 мг/дл (р<0,001), соответственно.
Количество пациентов с окклюзированными аутовенозными шунтами было выше при ГиперЛп(а), чем в группе с НормоЛп(а) (82% и 54%, соответственно р<0,01). Не было обнаружено значимых различий в концентрации Лп(а) при сравнении групп с различным числом окклюзированных аутовенозных шунтов. Однако наблюдалось нарастание частоты НМ изоформ апо(а) при увеличении количества пораженных трансплантатов (рис. 12).
Анализ групп в соответствии с изоформами апо(а) и концентрацией Лп(а) показал, что в группе больных с поражением трех и более венозных анастомозов 40% имели сочетание НМ апо(а) и ГиперЛп(а). Напротив, у 73% больных с ВМ апо(а) и ГиперЛп(а) было отмечено поражение одного или двух
22
шунтов. По данным множественного регрессионного анализа с поправкой на возраст и показатели липидного спектра только НМ апо(а) ((3=0,30, р<0,05), особенно в сочетании с ГиперЛп(а) ((3=0,41, р<0,005), были связаны с поражением венозных анастомозов.
Рисунок 12 - Встречаемость НМ изоформ апо(а) в подгруппах вольных,
стратифицированных по количеству окклюзированных аутовенозных шунтов в первые 12 месяцев после операции. Статистическая значимость различий х2 = 16,9 р<0,001).
Следовательно, ГиперЛп(а) и НМ изоформы апо(а) являются факторами риска окклюзий аутовенозных шунтов, а также тяжести поражения венозных анастомозов, особенно в первый год после операции реваскуляризации миокарда.
5.2. Влияние концентрации Лп(а) и полиморфизма апо(а) на прогноз дольных ИБС. 289 пациентов (82% мужчин, средний возраст 52,5±8,4 лет) из общей группы обследованных больных наблюдались в течение 12-180 мес (в среднем 69±33 мес), что позволило оценить влияние концентрации Лп(а) и полиморфизма апо(а) на прогноз течения ИБС.
206 пациентов (71%) исходно имели тяжелое течение стенокардии, соответствующее 3-4 функциональному классу. За время наблюдения ИМ перенесли 28 пациентов (¡0%), смертельные исходы были зарегистрированы у 49 человек (17%). Прогрессия стенокардии была отмечена у 72 человек (25%), стентирование в связи с прогрессией ИБС и/или рестенозом ранее установленных стентов было проведено 74 (26%) больным. По результатам корреляционного анализа, как концентрация Лп(а) (г=0,29, р<0,0001), так и наличие НМ изоформ апо(а) (г=0,22, р<0,0001), связаны с развитием коронарных событий, наряду с полом (г=0,24, р<0,0001), курением (г=0,19, р<0,001) и исходной распространенностью атеросклероза (г=0,19, р<0,01), выраженного в количестве пораженных сосудистых бассейнов. Связь с концентрацией ХС ЛНП нивелировалась после пересчета ХС ЛНПкорр.
В группе больных с НМ изоформами апо(а) нежелательные коронарные события встречались достоверно чаще, чем у больных с ВМ апо(а) (р<0,005). Относительный риск возникновения коронарных событий у пациентов с НМ изоформами апо(а) был в 1,5 раза выше, чем у больных с ВМ апо(а) ОР=1,55 (1,17-2,06), р<0,05. Однако, по данным множественного регрессионного
ч
о ч
0 1 2 3 и более
Кол-во окклюзированных шунтов
анализа с поправкой на традиционные факторы риска только пол ([3=0,24, р<0,0001) и концентрация Лп(а) ((3=0,25, р<0,0005) являлись предикторами коронарных событий у больных ИБС. При введении поправки на концентрацию Лп(а), присутствие НМ изоформ апо(а) теряло свою значимость как прогностический фактор (Р=0,03, р>0,05). Регулярный прием статинов позволял достоверно уменьшить вероятность коронарных событий (Р=-0,14, р<0,05). Также отмечено ухудшение прогноза ИБС (р< 0,05) в группах больных с НМ апо(а) (рис. 13).
Время (мес)
•» ВМ (п=101) НМ (п=136)
Рисунок 13 - Кривые выживаемости Каплана-Мейера в группах больных с НМ и ВМ апо(а). Конечная точка — коронарная смерть, результаты лог-рангового теста = 5,7, р=0,019.
Относительный риск (ОР) смертельного исхода в результате ИБС у больных с НМ апо(а) был достоверно, но незначительно выше, чем у больных с ВМ апо(а) (ОР=1,14 (1,06-1,28), р<0,05). Подобное наблюдение было сделано в отношении риска развития нефатального ИМ (ОР=1,09 (1,01-1,19), р<0,05).
Связь НМ апо(а) с развитием нефатального ИМ в исследованной группе больных, теряла свою значимость при введении в математическую модель концентрации Лп(а), что согласовывалось с данными, полученными нами в ретроспективном исследовании.
Разделение больных на четыре группы в зависимости от концентрации Лп(а) и изоформы апо(а) (табл. 5.) показало отсутствие достоверных отличий в факторах риска ИБС и исходном статусе пациентов.
У больных в группах с повышенной концентрацией Лп(а) и/или НМ апо(а) достоверно чаще отмечались нефатальный ИМ, операции по реваскуляризации миокарда, прогрессия ИБС, выражающаяся в нарастании тяжести стенокардии, смертельные исходы ИБС, а также достоверно увеличивалась частота любых коронарных осложнений (табл.5.).
Таблица 5 Характеристика больных ССЗ, стратифицированных в зависимости от концентрации Лп(а) и изоформы апо(а).
Лп(а) Показатель Группа 1 Группа 2 Группа 3 Группа 4 Р
Нормо Лп(а) и ВМ апо(а) ГиперЛп(а) и ВМ апо(а) Нормо Лп(а) и НМ апо(а) ГиперЛп(а) и НМ апо(а)
Кол-во пациентовл 66 35 29 107
В анамнезе
Пол (% муж) 51 (77%) 30 (86%) 23 (79%) 93 (87%) >0,1
Возраст, лет 53,0±8,8 52,6±9,4 54,6±9,1 51,3±8,2
Артериальная гипертония 40 (61%) 21 (60%) 18(62%) 64 (60%) >0.1
Курение 17 (26%) 10 (28%) 6(21%) 42 (39%) >0.1
Ожирение 19 (29%) 8 (23%) 4(14%) 21 (20%) >0,1
Семейный анамнез 18 (27%) 11 (31%) 14 (48%) 39 (36%) >0,05
Сахарный диабет 10(15%) 6(17%) 2 (7%) 7 (7%) >0,05
Гиперлипидемия 64 (97%) 33 (94%) 29(100%) 96 (90%) >0,1
ОХС, ммоль/л 6,4±1,0 6,7±1,4 6,7±1,2 6.6±1,2
ТГ, ммоль/л 2,1±0,8 2,3±1,0 2,4±1,2 2,1±1,0
ХС ЛВП, ммоль/л 1,3±0,4 1,2±0,3 1.1±0.2 1,2±0,3
ХС ЛНП. ммоль/л 4,7±1,0 5,0±1,2 4,7±1,2 4,7±1.1
ХС ЛНПкорр, ммоль/л 4.6±1.0 4.6±1.2 4,6±1,2 4,0±1.1*
Фибриноген, г/л 3,2±0,9 3,1±0,8 3,1±0,8 1,940.5**
Лп(а), мг/дл 14±7 55±21 15±7 83±43**
3-х сосудистое поражение 26 (39%) 9 (26%) 17(58%) 52 (49%) <0,005
Стентирование в анамнезе 18(27%) 11 (31%) 6(21%) 25 (23%) >0,1
КШ в анамнезе 22 (33%) 9 (26%) 12 (41%) 36 (34%) >0,1
Клинические события за время наблюдения
Повторная КАГ 17(26%) 10(28%) 8 (28%) 46 (43%) >0,1
Смерть от ИБС 7(11%) 6(17%) 9(31%) 22 (21%) <0,05
Нефатальный ИМ 2 (3%) 3 (8%) 2 (7%) 17(16%) <0,05
Операция КШ 4 (6%) 1 (3%) 4(14%) 15 (14%) <0,05
Прогрессия стенокардии 8(12%) 16 (46%) 3(10%) 30 (28%) <0,0005
Коронарные события 22 (33%) 24 (68%) 14 (48%) 72 (67%) <0,0005
Прием статинов 34 (52%) 21 (60%) 9(31%) 66 (62%) <0,01
*р<0,0005, **р<0,0001 в сравнении с группой 1.
л 52 пациента с «нулевым» фенотипом апо(а) не включали в исследование.
Вывод: Повышенная концентрация Лп(а) и низкомолекулярный фенотип апо(а) достоверно связаны с отрицательным прогнозом течения заболевания у больных ИБС.
Глава 6. Разработка методов коррекции повышенной концентрации Лп(а).
6.1. Снижение Лп(а) медикаментозными методами. В 1990 году М.ЯаЛ и Ь.РоиПг^ выдвинули гипотезу, согласно которой накопление Лп(а) в субэндотелии является защитным механизмом и направлено на укрепление стенки сосуда. На возможность использования больших доз витамина С для
воздействия на липиды крови в целях лечения и профилактики атеросклероза еще в 1960 году указывал А.Л.Мясников [Мясников АЛ., 1960]. Совместно с отделом проблем атеросклероза было проведено 12-недельное исследование влияния аскорбиновой кислоты и лизина, а также их комбинации на уровень Jln(a) у 40 больных ИБС с повышенной концентрацией Лп(а). Больные были рандомизированы в четыре группы по 10 человек в каждой, отличающиеся схемой и дозами принимаемых препаратов. В результате лечения уровень Лп(а) снизился на 14% после увеличения суточной дозы аскорбиновой кислоты с 6 до 12 г. Изолированное применение лизина и его сочетания с большими дозами витамина С не влияло на уровень Лп(а). Полученные нами на ограниченном контингенте больных данные не подтверждали гипотезу о возможном влиянии больших доз аскорбиновой кислоты, лизина и их сочетания на уровень Лп(а) у больных ИБС. Изучение возможности снижения Лп(а) с применением гормональной заместительной терапии у женщин с ИБС, подтвержденной КАГ (возраст 52±4 г.) показало, что прием препаратов, содержащих по 2 мг эстрадиол валерата и 1 мг ципротерона ацетата по 10 дней ежемесячно приводил к снижению уровня Лп(а) на 14%, за 6 месяцев - на 25%. Наиболее эффективным методом медикаментозной коррекции Лп(а) у больных с ИБС являлась терапия высокими дозами никотиновой кислоты замедленного высвобождения. При проведении 24-недельного, открытого, рандомизированного, контролируемого клинического исследования у мужчин до 60 лет с ИБС, получавших никотиновую кислоту, отмечено достоверное снижение уровня Лп(а) с 84±40 до 67±25 мг/дл к 6 неделям терапии (р<0,01) и до 65±37 мг/дл к 6 месяцам (-23%, р<0,01). Прием статинов не оказал влияния на уровень Лп(а).
6.2. Снижение Лп(а) методами терапевтического афереза. Структурное сходство части Лп(а) и ЛНП, связанное с присутствием в составе частицы Лп(а) апоВюо позволяет рассматривать существующие методы ЛНП афереза как возможный способ снижения концентрации Лп(а). Исследование динамики уровня Лп(а) при проведении процедур ЛНП афереза показали, что среднее снижение концентрации Лп(а) практически не зависит от вида используемой системы для ЛНП афереза и варьируется от 43 до 59%, что подтверждалось в ряде других работ [Thompson G. 2003, Bambauer R. et al 2001, Keller C. 2007].
Дальнейшие исследования по сравнению Лп(а) связывающей способности сорбентов для ЛНП афереза в одинаковых условиях in vitro, показали, что эффективность сорбции Лп(а) для сорбентов, специфичных к ЛНП в 6 раз уступала разработанному нами сорбенту с ПкАт к Лп(а) (Лп(а) Липопак®) для Лп(а) афереза (рис.14). Сорбент на основе фракции IgG, содержащих ПкАт барана к Лп(а) человека, выделенных согласно методу 1 (глава 1), был синтезирован в 1989 году. Иммуносорбент обладал высокой специфичностью, сорбционной емкостью и стабильностью в ряду хроматографий [Афанасьева О.И. и соавт., 1991, 1993, Pokrovsky S. et al 1991]. Одним из недостатков такого сорбента являлось использование в качестве лиганда не специфических Ат, а
фракции суммарных иммуноглобулинов, что приводило к необходимости иммобилизовать на сорбент большое количество белка (10-12 мг белка/ мл геля), а также определяло сложность стандартизации сорбционной емкости сорбента.
Рисунок 14 - Эффективность удаления Лп(а) на различных сорбентах для афереза липидов, выраженная как коэффициент распределения Лп(а). Коэффициент распределения равен отношению концентраг^ии Лп(а), связавшегося с сорбентом (мг/мл геля) к концентрации Лп(а) в плазме (мг/мл) после проведения хроматографии. Условия проведения хроматографии были унифицированы для всех сорбентов.
Разработанный метод выделения препаративных количеств Jln(a) с использованием аффинной хроматографии позволил синтезировать сорбент с иммобилизованными Лп(а) и выделить высокоспецифичные ПкАт барана к Лп(а) (метод 3). В результате был получен сорбент, соизмеримый по сорбционной емкости Лп(а), но содержащий в 5 раз меньше иммобилизованного лиганда. Удельная Лп(а) связывающая активность разработанного сорбента в пересчете на один мг иммобилизованных антител составляла 1,5±0,8 и 0,4±0,1 мг Лп(а), соответственно. Оптимизированные условия элюции 0,2 М глициновым буфером с пониженной ионной силой, обеспечивали стабильность иммуносорбента в ряду 50 хроматографических циклов, что позволяло использовать колонки многократно.
Ограниченные клинические испытания иммуносорбента для удаления Лп(а) методом иммуносорбции в системе экстракорпорального кровообращения были начаты в институте клинической кардиологии КНЦ РАМН в конце 1990 года [Сусеков A.B. и соавт., 1993]. Созданные нами колонки прошли клиническую апробацию как у нас в стране, так и за рубежом: в университетской клинике г.Регенсбурга, немецком центре Гемафереза г. Кельна, институте очистки крови г. Бад-Хомбург и клинике Люденшайда, Германия, а также в Госпитале Хаммерсмит, г. Лондон. Совместно с городской клиникой г. Люденшайда, (Германия) нами были проведены испытания колонок Лп(а) Липопак. Критерии включения пациентов и методы ведения процедуры Лп(а) афереза были унифицированы. Характеристика 7 больных, включенных в исследование в
27
Германии и России приведена в таблице 6.
Таблица 6 Характеристика больных, включенных в исследование.
Параметр Пациенты
Л.Н. З.Е. Ф.И. КВ. К.Н. K.F. K.R.
Пол/возраст м/38 м/53 м/52 м/58 м/54 ж/45 м/42
Кол-во пораженных КА 3 3 3 3 3 2 3
ИМ - - 2 1 1 3 2
Операции реваскуляризации нет нет нет 3 ЧКВ 3 АКШ нет ЧКВ
Лп(а), мг/дл 100 90 90 47 147 160 134
Фенотип апо(а) НМ НМ НМ НМ НМ НМ НМ
ОХС, мг/дл 230 210 217 200 221 180 157
ХС-ЛВП, мг/дл 38 45 34 52 44 35 30
ХС-ЛНП, мг/дл 160 140 140 134 119 110 87
ХС-ЛНП корр*. мг/дл 130 113 ИЗ 116 75 62 47
Однократное проведение Лп(а) афереза на колонках Лп(а) Липопак приводило к снижению Лп(а) на 70-80%, изменение ОХС соответствовало количеству ХС, входящего в состав Лп(а), тогда как другие показатели липидов практически не изменялись. Процедуры иммуносорбции проводили с интервалом в 7 дней, исходя из данных восстановления концентрации Лп(а) после проведения процедуры Лп(а) афереза (рис. 15 и 16).
0 10 20 30 40 50 60
Количество процедур Лп(а) аферез
а б
Рисунок 15 - Динамика липидного профиля и Лп(а) при проведении одной процедуры и длительного курса процедур Лп(а) афереза. (а) - динамика липидов и Лп(а) при проведении одной прог/едуры Лп(а) афереза пациенту Ф.И. (ФГУ РКНПК, Москва), данные представлены как среднее±стандартная ошибка среднего для концентрации до и после каждой из S0 процедур Лп(а) афереза. (б) - динамика Лп(а) при проведении курса Лп(а) афереза пациенту К.Н. (Германия). Приведены кривые концентрации Лп(а) до и после процедур Лп(а) афереза. Линией обозначена динамика концентрации Лп(а) до процедур.
За 11 лет наблюдения было проведено более 1200 процедур в клиниках Москвы и Люденшайда. При проведении длительного курса Лп(а) афереза не было отмечено значимых отклонений в биохимических показателях, следовательно удаление Лп(а) не приводило к каким-либо детектируемым изменениям в параметрах гомеостаза. Длительное удаление Лп(а) из организма человека не оказывало влияния на углеводный, жировой и белковый обмены, систему свертывания крови. Расчет константы фракционной скорости катаболизма в соответствии с формулой, предложенной Armstrong V.W. et.al. (1989), показал, что у трех пациентов скорость восстановления Лп(а) после удаления достоверно снижалась при проведении длительного курса Лп(а) афереза (рис. 16). Вероятно, что подобное замедление синтеза Лп(а) приводило к снижению концентрации Лп(а) до 39% от исходного уровня у двух из 7 пациентов. Также было отмечено незначительное увеличение ЛВП. Подобные результаты воздействия специфического Лп(а) афереза на липидный спектр у 2 больных с изолированно-повышенным Лп(а) были опубликованы и в других независимых исследованиях [Bambauer R, 2002].
(сутки)
Рисунок 16 - Динамика восстановления уровня Лп(а) в плазме крови поаге его удаления в процедуре Лп(а) афереза (пациент Ф.И.).(а)-после 1-ой процедуры Лп(а) афереза; (б)-после 40-ой процедуры Лп(а) афереза. С/Сисх — отношение конг^нтрации Лп(а) в момент времени (С) к исходной концентрации до процедуры (С исх).
Проведение курса Лп(а) афереза очень тяжелым больным ИБС (см. табл.6) уже через полгода приводило к существенному улучшению клинического состояния: уменьшению приступов стенокардии в среднем в три раза, а также к увеличению толерантности к физической нагрузке по данным велоэргометрии. Данные повторной КАГ, проведенной через 1-1,5 года трем пациентам показали стабилизацию и частичную регрессию атеросклеротических бляшек у двух больных. За время наблюдения пациентов, находящихся на Лп(а) аферезе от 3 до 11 лет, не было отмечено новых случаев острых коронарных событий (рис. 17). Снижение количества приступов стенокардии при проведении Лп(а) афереза было отмечено у всех больных, как в нашем исследовании, так и в клиниках Германии и Англии [Ulrich H et al 1998, Thompson G et al. 1994, Baumbauer R. et al, 2003].
Рисунок 17 — Динамика коронарных событий у больных находящихся на длительном курсе специфического Лп(а) афереза. Время наблюдения 3-11 лет. Данные приведены для 7 пациентов как отношение суммарного количества нежелательных коронарных событий к количеству пациентов, находящихся в исследовании. КС - все коронарные события, ИМ — инфаркт миокарда, ЧКВ — чрескожное коронарное вмешательство, АКШ — операция аортокоронарного шунтирования.
Наши данные подтверждаются результатами наблюдения за 120 больными с повышенной концентрацией Лп(а), показавшими, что применение ЛНП афереза на фоне оптимальной гиполипидемической медикаментозной терапии, при снижении концентрации Лп(а) в среднем на 60-70%, снижает любые коронарные события на 80-90%, относительно периода, когда больные получали только медикаментозную терапию [Jaeger B.R. et al, 2009].
Нами также показано, что проведение Лп(а) афереза в течении 6 месяцев приводит к более выраженной регрессии и стабилизации атеросклероза в сонных артериях у больных ИБС с повышенной концентрацией Лп(а) на фоне терапии статинами, относительно контрольной группы больных, находящихся только на оптимальном медикаментозном лечении (88% и 42%, р=0,006, соответственно).
Полученные результаты, а также имеющиеся литературные данные, позволяют сделать вывод, что разработанный нами уникальный метод Лп(а) афереза, специфически и высокоэффективно снижающий концентрацию Лп(а), позволяет достичь: стабилизации имеющихся, предотвращения образования новых, а в некоторых случаях и регрессии атеросклеротических поражений.
Улучшение клинического состояния больных ИБС и отсутствие прогрессирования атеросклероза на фоне процедур Лп(а) афереза, можно рассматривать как доказательство участия Лп(а) в атерогенезе.
На основе данных по характеристике сорбентов была разработана кинетическая модель, позволяющая рассчитывать эффективность удаления Лп(а) при проведении процедур терапевтического афереза с учетом индивидуальных параметров пациента, таких как объем циркулирующей плазмы, исходный уровень Лп(а) и ХС ЛНП, скорость плазмотока и характеристик иммуносорбционных колонок. Расчеты, проведенные с использованием данной модели, подтвердили ограниченную эффективность существующих на сегодняшний день одноразовых систем для ЛНП афереза для удаления Лп(а) больным с гиперЛп(а) (Лп(а) свыше 80 мг/дл). Напротив, использование иммуносорбентов позволяет снять ограничения с
эффективности процедуры афереза за счет использования двух колонок (рис.18). Были сформулированы и предложены критерии оптимального проведения процедуры для лечения пациентов с нарушением липидного обмена резистентным к лекарственной терапии: 1) специфический Лп(а) аферез, 2) ЛНП аферез и 3) сочетанный аферез липидов с использованием двух типов иммуносорбционных колонок, специфичных к ЛНП и к Лп(а). Дизайн проведения процедуры 1 и 3 предложен нами впервые в мировой практике.
Вывод: прог/едура Лп(а) афереза с использованием разработанного илтуносорбента с ПкАт к Лп(а) - уникальный метод для безопасного, специфического и высокоэффективного снижения концентрации Лп(а). Полученные результаты позволяют считать, что Лп(а) принимает непосредственное участие в атерогенезе.
Лп(а) участвует в возникновении и развитии атеросклеротических поражений различных сосудистых бассейнов. Лп(а) и низкомолекулярные изоформы апобелка(а) могут рассматриваться как независимые факторы риска атеросклероза и ИБС. Лп(а) играет особо важную роль у больных ИБС молодого и среднего возраста. Для такой категории больных целесообразно проведение процедур Лп(а) афереза для снижения вероятности возникновения острых коронарных событий.
1. Разработаны препаративные методы выделения высокоочищенного препарата Лп(а) из плазмы крови человека и получения моноспецифических поликлональных Ат барана против Лп(а) человека.
2. Разработан иммуноферментный метод, позволяющий с высокой точностью и воспроизводимостью определять концентрацию Лп(а) в плазме/сыворотке крови человека. На основе полученных моноспецифичных
Рисунок 18 - Схема процедуры JJn(a) афереза липидов с использованием колонок Лп(а) Липопак.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
ВЫВОДЫ.
поликлональных антител разработан метод фенотипирования апо(а), основанный на разделении апо(а) по электрофоретической подвижности в SDS-полиакриламидном геле с последующим иммуноблотингом.
3. Повышенная концентрация Лп(а) (более 30 мг/дл) и низкомолекулярные изоформы апо(а) встречаются в 1,5-2 раза чаще у больных с атеросклеротическим поражением различных сосудистых бассейнов, чем у здоровых доноров и больных без признаков атеросклероза. Более, чем у 40% больных ИБС встречается концентрация Лп(а) > 30 мг/дл и низкомолекулярные изоформы апо(а).
4. Низкомолекулярные изоформы апо(а) являются независимым предиктором наличия, тяжести и распространенности атеросклеротического поражения коронарных, сонных, периферических артерий и мультифокального атеросклероза у больных ИБС. Отношение шансов атеросклероза коронарных, сонных и периферических артерий в 3-6 раз выше у больных с повышенной концентрацией Лп(а) и низкомолекулярными изоформами апо(а), чем у больных с высокомолекулярными изоформами апо(а).
5. Наиболее значимая связь Лп(а) и, особенно, полиморфизма апо(а) с атеросклеротическими поражениями и ИБС отмечена у больных молодого и среднего возраста.
6. Повышенная концентрация Лп(а) и наличие низкомолекулярных изоформ апо(а) связаны с:
- неблагоприятным прогнозом течения ИБС;
- развитием осложнений после операции реваскуляризации миокарда.
7. Разработана технология синтеза иммуносорбента, позволяющего с высокой специфичностью и эффективностью удалять Лп(а) из плазмы крови человека.
8. Лп(а) аферез является уникальным, специфичным, безопасным и эффективным методом коррекции уровня Лп(а). Проведение курса Лп(а) афереза больным с повышенной концентрацией Лп(а) позволяет достичь положительного клинического результата, выраженного в стабилизации течения ИБС.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.
1. Концентрацию Лп(а) необходимо определять наравне с рутинными показателями липидного спектра, при обследовании пациентов в отделениях кардиологических, неврологических и сердечно-сосудистой хирургии.
2. Определение фенотипа апо(а) у людей с отягощенным семейным анамнезом по ССЗ позволит улучшить стратификацию риска развития ИБС.
3. Необходимо рассматривать повышенную концентрацию Лп(а) как показатель нарушения липидного обмена и включить данную категорию в существующие классификации гиперлипидемий.
4. При расчете ХС ЛНП, в образцах с повышенным содержанием Лп(а), необходимо учитывать концентрацию Лп(а) и рассчитывать данный показатель в соответствии с модифицированной формулой Фридвальда.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.
Статьи:
1. Сусеков A.B., Афанасьева О.И., Адамова И.Ю., Лякишев A.A., Кухарчук В.В., Покровский С.Н. Применение иммуносорбента для селективного снижения уровня липопротеида (а) у больных с коронарным атеросклерозом// Кардиология. - 1993. - Т.32. -Лг. 11-12. - С. 52-56. ВАК'
2. Pokrovsky S., Susekov A., Afanasieva О., Adamova I., Lyakishev A., Kukharchuk V. Extracorporeal immunoadsorption for the specific removal of lipoprotein (a) (Lp(a) apheresis): preliminary clinical data// Chemistry and Physics of Lipids.- 1994. - 67/68. - P. 323-330. S6/"
3. Афанасьева О.И., Адамова И.Ю., Беневоленская Г.Ф., Покровский С.Н. Иммуноферментный метод определения липопротеида (а).// Бюллетень экспериментачьной биологии и медицины,-1995. -Лг 10. - С. 398-401. ВАк
4. Pokrovsky S N., Sussekov A.V., Adamova I.Yu., Afanasieva O.I., Benevolenskaya G.F., Konovalov G.A., Kukharchuk V.V. Development of Immunosorbents for apoB-Containing Lipoproteins Apheresis. //Artificial Organs.-1995. - V.19.-N.6.-P. 500-505.!F''719
5. Ежов M.B., Афанасьева О.И., Кононова О.И., Миронова И.Ю., Лякишев A.A., Покровский С.Н. Влияют ли аскорбиновая кислота, лизин и их сочетание на уровень липопротеида(а) у больных ИБС?// Кардиология,-1996- Лг 9,-С.31-33. ВАК
6. Ежов MB., Афанасьева О.И., Беневоленская Г.Ф., Савченко А.П., Лякишев A.A., Покровский С.Н. Липопротеид(а) как биохимический маркер коронарного атеросклероза.// Тер. Архив. -1997,- Т. 69- Лг 9,-Р.31-35. "АК
7. Pokrovsky S., Sussekov A., Afanasieva О., Adamova I., Kukharchuk V.. Lp(a)-apheresis. What we can say today// Japanese Journal ofApheresis. -1997. - V.16. -Лг l.—P. 72-77.w~lm
8. Ежов M.B., Афанасьева О.И., Лякишев A.A., Покровский С.Н. Связь фенотипа апобелка(а) с наличием ишемической болезни сердца у мужчин в молодом возрасте.// Кардиология. -1999. -Лг 4. - С. 12-15. ВАК
9. Илыша Л.Н., Афанасьева О.И., Беневоленская Г.Ф., Синицин В.Е., Савченко А.П., Королев C.B., Покровский С.Н., Акчурнн P.C. Связь уровня Лп(а) с проходимостью шунтов в течении первого года после операции коронарного шунтирования.// Кардиология. -1999. - Т. 39. -Лг 10. -Р. 7-14. ВАК
10. Ильина Л.Н., Афанасьева О.И., Ежов М.В., Беневоленская Г.Ф., Акчурин P.C., Покровский С.Н. Динамика липидного спектра крови в течение первых двух месяцев после операции коронарного шунтирования.// Ангиология и сосудистая хирургия. - 1999. -ЛгЗ.-С. 15-18. ВАк
11. Ежов М.В., Афанасьева О.И., Беневоленская Г.Ф., Савченко А.П., Балахонова Т.В., Лякишев A.A., Покровский С.Н. Связь липопротеида(а) и фенотипа апобелка (а) с атеросклерозом коронарных и сонных артерий у мужчин с ишемической болезнью сердца.// Тер. архив,-2000. -Лг 1. - С.28-32. ВАк
12. Бритарева В.В., Афанасьева О.И., Добровольский А.Б., Титаева Е.В., Карпов Ю.А., Покровский С.Н. Липопротеид(а) и ишемическая болезнь сердца у больных гипертонической болезнью. // Кардиология. - 2002. - Т. 42. Лг. 5. С. 4-8. ВАК
13. Козлов С.Г., Доценко Ю.В., Санкова A.B., Лякишев A.A., Творогова М.Г., Афанасьева О.И., Титов В.Н., Покровский С.Н., Наумов В.Г. Динамика показателей липидного обмена под влиянием заместительной гормональной терапии у женщин в постменопаузе с сахарным диабетом 2-го типа. // Кардиология,-2002 - Т. 42. -Лг7.~С. 47-52. ЙЛК
14. Бритарева В В., Афанасьева О.И., Добровольский А.Б., Ежов М.В., Титаева Е.В., Карпов Ю.А., Покровский С.Н. Липопротеид(а) и изоформы апо(а) у больных с перемежающейся хромотой.// Тер. архив.-2002. -Лг 12. С. 49-52.1,АК
4 здесь и далее так обозначены публикации в журнаюх, входящих в Перечень ВАК. ** здесь и дачее приведен импакт-фактор //!■) журнала, в котором опубликована работа.
15. Чернядьева И.Ф., Н.С.Лопата, О.И. Афанасьева, С.Н.Покровский, В.В.Кухарчук. Динамика соотношения уровней аполипопротеина(а) и липидов плазмы крови человека при взаимодействии с поликлональными антителами барана к липопротеиду(а) // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины 2002,- Т. 133.- №4. -С.354-356. ВАК
16. Pokrovsky S.N., Ezhov M.V., Il'ina L.N., Afanasieva O.I., Sinitsyn V.Y., Shiriaev A.A., Akchurin R.S. Association of lipoprotein(a) excess with early vein graft occlusions in undergoing coronary bypass surgery.// The Journal ofThoraric and Cardiovascular Surgery.-2003,- Vol. 126,-№4,-P. 1071-1075.1F'lm
17. Арабидзе Г.Г., Афанасьева О.И., Афанасьева М.И., Маметов К.А., Скрябина Е.О., Инанеишвили И.Г. Связь липопротеида(а) и аполипопротеина Вюо как факторов риска с развитием инфаркта тющп&ЛМедицина критических состояний,- 2005- №3.- С.20-23.
18. Теблоев К.И., Арабидзе Г.Г., Полякова О.В., Афанасьева О.И., Афанасьева М.И., Скрябина Е.О. Роль липопротеида(а) и аполипопротеина В-100 в развитии ишемической болезни сердца.//Российский кардиологический журнал,- 2005,-Ns5.- с.20-23. мк
19. Арабидзе Г.Г., Скрябина Е.О., Инанеишвили И.Г., Афанасьева О.И. Роль повышения уровней липопротеида (а) и аполипопротеина В-100 у больных ишемической болезнью сердца и их взаимосвязь с содержанием холестерина и триглицеридов.// Кардиоваскулярная терапия и профилактика. - 2006. - Т. 5. -Ne 5. - С. 14-20. еАК
20. Алтынова Е.В., Афанасьева О.И., Болдырев А.Г., Потокин И.Л., Соколов А.А., Афанасьева М.И., Покровский С.Н. Гемосорбенты для удаления атерогенных липопротеидов (in vitro сравнение).// Эфферентная терапия - 2006 - Т. 12..-№4,- С. 3-14.
ВАК
21. Афанасьева О.И., Алтынова Е.В., Болдырев А.Г., Соколов А.А., Адамова И.Ю., Покровский С.Н. Сравнение эффективности и специфичности различных сорбентов для афереза липопротеидов низкой плотности.// Бюллетень экспериментальной биологии и медицины,-2006.- Т. 142.-N° 5,- Р.532-536. ВАК
22. Афанасьева О.И., Алтынова Е.В., Кузнецова Ю.В., Болдырев А.Г., Соколов А.А., Потокин И.Л., Адамова И.Ю., Покровский С.Н. Иммуногемосорбенты для перфузии цельной крови (синтез и характеристика).// Эфферентная терапия,- 2006,- Т. 12,- Ns4-С. 15-20. ВАК
23. Ежов М.В., Трухачева Е.П., Афанасьева О.И., Афанасьева М.И., Камбегова А.А., Лякишев А.А., Покровский С.Н.Связь липопротеида(а) и гомоцистеина с коронарным атеросклерозом у мужчин молодого и среднего возрастов.// Кардиоваскулярная терапия и профилактика. - 2008. -№5. -С. 10-15.
24. Ежов М.В., Афанасьева О.И., Камбегова А.А., Афанасьева М.И., Трухачева Е.П., Наумов В.Г., Покровский С.Н. Роль факторов риска атеросклероза в развитии ишемической болезни сердца у мужчин молодого возраста.// Тер. архив,- 2009,- Ns.5. С.50-53. ВАК
25. Афанасьева О.И., Ежов М.В., Афанасьева М.И., Сафарова М.С., Берестецкая Ю.В., Покровский С.Н. Связь низкомолекулярного фенотипа апобелка(а) и концентрации липопротеида(а) с мультифокальным атеросклерозом у больных ишемической болезнью сердца.//Рациональная Фармакотерапия в Кардиологии,- 2010,- Т. 6,- № 4,- С. 474-480.
26. Афанасьева О.И., Ежов М.В., Сафарова М.С., Афанасьева М.И., Адамова И.Ю., Покровский С.Н.Полиморфизм липопротеида(а) как фактор риска коронарного и каротидного атеросклероза и их осложнений у женщин.// Кардиоваскулярная терапия и профилактика,- 2010. - Т. 9,-№ 6. - С. 10-16. ÉAK
27. Ежов М.В., Матчин Ю.Г., Сафарова М.С., Соболева Д.И., Афанасьева О.И., Покровский С.Н. Связь высокого уровня липопротеида(а) с проходимостью коронарных артерий в течение первого года после чрескожных коронарных вмешательств.// Клиницист,- 2011,-№1,-С. 18-24. Л4А
28. Афанасьева О.И. Коррекция повышенного уровня липопротеида(а) методами терапевтического афереза.//Вестник «МЕДСИ». -2011. -№10. - С.28-36.
29. Ежов М.В., Сафарова М.С., Афанасьева О.И., Ильина Л.Н., Лякишев А.А., Покровский С.Н. Высокий уровень липопротеида (а) как предиктор неблагоприятного прогноза в отдаленные сроки после операции коронарного шунтирования.// Кардиология 2011. -Ksl. - С. 18-23. йАК
30. Сафарова М.С., Трухачева Е.П., Ежов М.В., Афанасьева О.И., Афанасьева М.И., Трипотень М.И., Лякишев А.А., Покровский С.Н. Плейотропные эффекты никотиновой кислоты у мужчин с ишемической болезнью сердца и высоким уровнем липопротеида(а).// Кардиология. - 2011,- №5,- С. 9 - 16. ВЛК
Тезисы:
31. Pokrovsky S.N., Adamova I.Yu., Afanasieva O.I., Susekov A.V., Kukharchuk V.V. Dynamic of Lp(a) level during long-term Lp(a) aphcrcsisJIAbslracI book of European Atherosclerosis Society Congress, Jerusalem, Israel - 1993,- P.124.
32. Покровский C.H., Сусеков А. В., Адамова И. Ю .Афанасьева О. И., Беневоленская Г. Ф., Кухарчук В. В. Иммуносорбенты для удаления атерогенных аполипопротеин В-содержащих липопротеидов в процедуре экстракорпорального кровообращения// Тезисы Симпозиума «Липопротеиды и атеросклероз» ИЭМ РАМН, Санкт-Петербург. - 1995. -С.85.
33. Ежов М.В., Афанасьева О.М., Кононова О.И., Миронова И.Ю., Лякишев А.А., Покровский С.Н. Влияние аскорбиновой кислоты, лизина и их сочетания на уровень липопротеида(а) у больных ИБС ИМатериалы 1 Конгресса «Человек и лекарство», Москва. -1995.-С.48
34. Ezhov M.V., Sussekov A.V., Afanasieva O.I., Kononova O.I., Mironova I.Yu., Lyakishev A.A., Pokrovsky S.N. The effect of ascorbic acid and lysine on high plasma Lp(a) level in patients with coronary heart disease: a single-blind randomized controlled study.// Abstract book of 12 International Symposium on Drugs Affecting Lipid Metabolism. Houston, USA. - 1995. -P.42
35. Rostapshova T.V., Schurigina N.P., Yarovaya Y.B., Afanasieva O.I., Pokrovsky S.N., Kukharchuk V.V. Model analysis of different hypotheses of lipoprotein(a) influx rate into plasma in vivo studies.// Atherosclerosis. - 1995. -V. 115. - C. S87. ""
36. Sussekov A., Afanasieva O., Adamova I., Kukharchuk V., Neuvvirth C., Deanfield J., Celermajer D., Thompson G., Pokrovsky S.. Lp(a) apheresis in the treatment of CHD patients.// The International J. of Artificial Organs. -1995- V.18.-№>. 8.-P.420.
37. Яровая E. Б., Сусеков А. В., Афанасьева О. И., Покровский С. Н., Кухарчук В. В. Оценка метаболических параметров липопротеида (а) на фоне длительного курса Лп(а) афереза// Материалы 4 Конференции Московского общества гемафереза, Москва. - 1996. - С.57.
38. Pokrovsky S., Sussekov A., Afanasieva О., Adamova I., Kukharchuk V. Lp(a)-apheresis. What we can say today.// Japanese Journal of Apheresis.- 1996 - V. 15 Supplement.- s24. IF'l m
39. Pokrovsky S.N., Afanasieva O.I., Adamova I.Yu., Benevolenskaya G.F., Sussekov A.V., Kukharchuk V.V."Lp(a) Lipopak" - new unique material for specific removal of lipoprotein(a).// Abstract book of World Apheresis Association 6ih International Congress. Florence. Italy.- 1996. - P.106
40. Ежов M B., Афанасьева О.И., Лякишев A.A., Покровский С.Н. Липопротеид(а) как фактор риска, коррелирующий с выраженностью коронарного атеросклероза.// Материалы I Конгресса ассоциации кардиологов стран СНГ, Москва. - 1997. - С.60.
41. Afanasieva O.I., Ezhov M.V., Benevolenskaya G.F., Savchenko A.P., Lyakishev A.A., Pokrovsky S.N. Apolipoprotein(a) phenotype as a predictor of occlusions in coronary arteries.// Atherosclerosis. - 1997. - V.I34. -N.l-2. -P. 136. ,l~"s"
42. Ezhov M.V., Afanasieva O.I., Benevolenskaya G.F., Balakhonova T.V., Lyakishev A.A., Pokrovsky S.N. Relation of lipoprotein(a) concentration and apolipoprotein(a) phenotypes to the
presence and severity of carotid atherosclerosis.// Atherosclerosis. - 1997. - V.134. - N.l-2. -P. 140.,F-4 '30
43. Pokrovsky S.N., Sussekov A.V., Afanasieva O.I., Adamova I.Yu., Kukharchuk V.V. Lp(a) apheresis new approach for specific Lp(a) lowering// Atherosclerosis. -1997. - V. 134. - N. 1-2. -P. 147.1F~1'50
44. Pokrovsky S.N., Vlasova E.Ye., Il'ina L.N., Afanasieva O.I., Shiryaev A.A.. Agapov A.A., Akchurin R.S.. Lp(a) as a possible marker for vien graft stenosis after coronary artery bypass surgery//Atherosclerosis.-1997. - V.134.-N.l-2.-P.166.,F""5"
45. Yarovaya E.B., Sussekov A.V., Afanasieva O.I., Pokrovsky S.N., Kukharchuk V.V. Effect of repeated Lp(a) apheresis on metabolic parameters of lipoprotein(a)// Atherosclerosis. - 1997. -V.134.- N.l-2. -P.152.'F-4m
46. Ezhov M.V., Afanasieva O.I., Benevolenskaya G.F., Lyakishev A.A., Pokrovsky S.N. The relationship between lipoprotein(a), apolipoprotein(a) isoforms and coronary atherosclerosis// Abstract book of 9" International Dresden Symposium on Lipoproteins and Atherosclerosis, Dresden, Germany. -1997. - P. 90.
47. Yarovaya E.B., Sussekov A.V., Afanasieva O.I., Pokrovsky S.N., Kukharchuk V.V. Model fitting to study Lp(a) kinetics in vivo using Lp(a) apheresis results// Abstract book of 9lh International Dresden Symposium on Lipoproteins and Atherosclerosis. Dresden. Germany. -1997. -P.77.
48. Ezhov M.V., Lyakishev A.A., Afanasieva O.I., Benevolenskaya G.F., Polevaja T.Yu., Pokrovsky S.N. Association of apolipoprotein(a) phenotype with premature coronary heart disease in menIIEur. Heart J. - 1998. -Ns 19. -Suppl. -P. 347. ,F-,M46
49. Ezhov M.V., Afanasieva O.I., Benevolenskaya G.F., Pokrovsky S.N. Lipoprotein(a) abnormalities in coronary heart disease patients.// Abstract book of 13th International Symposium on Drugs Affecting Lipid Metabolism, Florence, Italy. -1998. - P. 30.
50. Акчурин P. С., Ильина JI. H., Синицин В. E., Савченко А. П., Афанасьева О. И., Беневоленская Г. Ф., Покровский С. Н. Влияние Лп(а) и других показателей липидного спектра крови на проходимость шунтов в течении 1 года после операции коронарного шунтирования.// Материалы 1 Всероссийской конференции по проблемам атеросклероза, Москва, 1999. С. 173.
51. Ежов М.В., Афанасьева О.И., Лякишев А.А., Беневоленская Г.Ф., Савченко А.П., Покровский С.Н. Липопротеид(а) как фактор риска коронарного атеросклероза.// Материалы 1 Всероссийской конференции по проблемам атеросклероза, Москва. — 1999. - С. 66.
52. Покровский С.Н., Афанасьева О.И., Адамова И.Ю., Ежов М.В., Ильина Л.Н., Арабидзе Гр.Г. (мл.), Акчурин Р.С. Липопротеид(а) и развитие атеросклеротических поражений в коронарных и сонных артериях// Центрально-азиатский медицинский журнал. - 1999. -Т. V. приложение. - С. 29.
53. Ezhov M.V., Afanasieva O.I., Benevolenskaya G.F., Pokrovsky S.N.. Lipoprotein(a) in coronary heart disease patients: is there a need to lower it?// Cardiovasc. Drugs and Therapy. -1999. - V. 13. -Ns I.- P. 10. ,F-3m
54. Ezhov M.V., Lyakishev A.A., Afanasieva O.I., Benevolenskaya G.F., Pokrovsky S.N. Association of apolipoprotein(a) phenotypes with history of myocardial infarction in young men.// The Journal of Heart Disease. -1999. - V.I. Ns 1. -P. 122.
55. Il'ina L.N., Afanasieva O.I., Ezhov M.V., Benevolenskaya G.F., Akchurin R.S., Pokrovsky S.N. Changes in plasma lipid profile during the first two months after coronary artery bypass surgery .H The Journal of Heart Disease. -1999. - V.l.-Ns.l- P.203.
56. Pokrovsky S., Afanasieva O., Adamova 1., Benevolenskaya G., Sussekov A., Kukharchuk V. Lp(a)-apheresis new approach for the lipoprotein(a) lowering in severe CHD patients.// Transfusion Science-1999. -V. 2l.-Ni3.-P.219. ,F',M3
57. Ezhov M.V., Lyakishev A.A., Afanasieva O.I., Benevolenskaya G.F., Balakhonova T.V., Pokrovsky S.N. Carotid atherosclerosis in coronary heart disease patients: association with
lipoprotein(a) level and apolipoprotein(a) phenotypes.// Abstract book of 5'h InternationaI Symposium on Multiple Risk factors in Cardiovascular Disease, Venice, Italy. - 1999. - P. 90.
58. Dotsenko J.V., Ezhov M.V., Afanasieva O.I., Lyakishev A.A., Naumov V.G., Pokrovsky S.N. Effect of hormonal replacement therapy on Lipoprotein(a) level in postmenopausal women with coronary heart disease.// Abstract book of 5lh International Symposium on Multiple Risk factors in Cardiovascular Disease, Venice, Italy. - 1999. - PAS.
59. Arabidze G. G. Jr., Ezhov M. V., Afanasieva O.I., Benevolenskaya G. F., Pokrovsky S. N.. Trend to higher lipoprotein(a) levels in men with acute coronary syndromes.// Abstract book of 5lh International Symposium on Multiple Risk factors in Cardiovascular Disease, Venice, Italy. -I999.-P.87.
60. Pokrovsky S., Afanasieva O, Adamova I., Benevolenskaya G., Sussekov A., Kukharchuk V. Lipoprotein(a) extracorporeal elimination by immunoadsorption - new tool for the treatment of severe CHD patients.// Abstract book of the 5th Internationa! Symposium Multiple Risk Factors in Cardiological Disease: Global Assement and Intervention. Venice, Italy. - ¡999. - P.90.
61. Il'ina L.N., Afanasieva O.I., Ezhov M.V., Adamova I.Yu., Sinitsin V.E., Savchenko A.P., Korolev S.V., Akchurin R.S., Pokrovsky S.N. Association of lipoprotein(a) level with the patency of grafts during the first year after coronary artery bypass surgery.// Abstract book of 5'h Int. Symposium on Multiple Risk factors in Cardiovascular Disease, Venice. Italy. - 1999. -P.89.
62. Акчурин P C., Ильина JI.H., Афанасьева О.И., Беневоленская Г.Ф., Синицин B E., Покровский С.Н. Лп(а) как фактор риска окклюзирования аутовенозных шунтов в течении первого года после операции коронарного шунтирования.// Материалы Симпозиума «Экспериментальные и клинические проблемы атеросклероза» Ассоциации кардиологов СНГ, Москва. -2000,- С.1.
63. Pokrovsky S., Afanasieva О., Adamova I., Benevolenskaya G., Sussekov A., Straube R, Kukharchuk V. Lipoprotein (a) extracorporeal elimination by specific immunoadsorption for the treatment of CHD patients.// Atherosclerosis. - 2000,- V. 151,-Ms1. - P.249.№W ш
64. Pokrovsky S., Adamova I,, Afanasieva O., Borberg H. Comparison of two system for LDL-apheresis: immunoadsorption and hole blood perfusion.// Atherosclerosis. - 2000,- V. 15 ].-№!. - P. 284-285. IF-4 nu
65. Ezhov M.V., Afanasieva O.I., Benevolenskaya G.F., Balakhonova T.V., Lyakishev A.A., Pokrovsky S.N. Carotid atherosclerosis and lipoprotein(a) in coronary heart disease patients.// Atherosclerosis. - 2000- У.151.-Ш.-P.160. )F'luo
66. Pokrovsky S., Il'ina L., Ezhov M.. Afanasieva O., Sinitsin V., Savchenko A., Korolev S., Akchurin R. Lipoprotein(a) and patency of the grafts after coronary bypass surgery.// Atherosclerosis. -2000,- V.151.-№. -P.249-250.,hu ,s"
67. Ezhov M., Afanasieva O., Adamova I., Benevolenskaya G., Savchenko A., Lyakishev A., Pokrovsky S. Lipoprotein(a) level predicts myocardial infarction in young men.// Atherosclerosis. -2000,- V.I51,-№1. -P.304. IF~"M
68. Бритарева В В., Афанасьева О.И., Афанасьева М.И., Добровольский А.Б., Покровский С.Н., Карпов Ю.А. Связь липопротеида(а) с наличием ишемической болезни сердца у больных с эссенциальной гипертонией.// Материалы 2 международной научно-практической конференции «Наука и образование в XXI веке», Москва. - 2001. - С.50.
69. Коновалов Г.А., Чебышев А.Н., Смольников B.C., Адамова И.Ю., Афанасьева О.И., Кипор С.Г., Покровский С.Н. Аферез липидов с использованием колонок "ЛНП-Липопак" и "Лп(а)-Липопак" в лечении больных ИБС с нарушениями липидного обмена// Материалы первого объединенного конгресса "Актуальные проблемы экстракорпорального очищения крови, нефрологии и гемафереза" Москва. - 2002. - С. 164-165.
70. Ежов М.В., Матчин Ю.Г., Афанасьева О.И., Савченко А.П., Полевая Т.Ю., Наумов В.Г., Покровский С.Н. Связь липопротеида(а) с ангиографическим рестенозом после
коронарного стентирования// Материалы Российского национального конгресса кардиологов, Санкт-Петербург. - 2002. - С. 133.
71. Afanasieva O.L., Kukharchuk V.V., Konovalov G.A., Chebyshev A.N., Porkovsky S.N. Lp(a) apheresis - new approach in the therapeutic apheresis technology.// Abstract book of 9lh Congress of the World Apheresis Association, France, Paris. - 2002.-P.66
72. Ezhov M.V., Matchin Y.G., Savchenko A.P., Afanasieva O.I., Polevaya T.Y., Naumov V.G., Pokrovsky S.N. Lipoprotein(a) is associated with angiographic restenosis after coronary stenting.//Atherosclerosis.-2002.- У.З.-Ж2.-Р. ¡06. ,F""S0
73. Адамова И.Ю., Афанасьева О.И., Кузнецова Ю.В., Коновалов Г.А., Покровский С.Н. Эффективность удаления патогенных компонентов в процедурах иммуносорбции.// Эфферентная терапия,- 2003.- N.9.-№1. -С. 51. ВАК
74. Афанасьева О.И., Адамова И.Ю., Сусеков А.В., Кухарчук В.В., Покровский С.Н. Специфический аферез липопротеида(а) - новый подход к лечению больных с тяжелыми формами атеросклероза.// Эфферентная терапия - 2003,- N.9.-N°l. - С.52. ВЛК
75. Кипор С.Г., Афанасьева О.И., Адамова И.Ю. Разработка и производство иммуносорбционных колонок для терапевтического афереза. Обеспечение безопасности.// Эфферентная терапия-2003,-N.9.-Nil.-С. 89-90. к
76. Ежов М.В., Афанасьева О.И., Чернина Г.В., Афанасьева М.И., Наумов В.Г., Покровский С.Н. Гомоцистеин у больных ИБС молодого возраста.// Кардиоваскулярная терапия и профилактика.-2003,- Т.2.-МЗ,- С. 115. ВАК
11. Pokrovsky S., Straube R., Afanasieva О., Adamova /., Sussekov A., Kukharchuk V. Lipoprotein(a) apheresis by specific immunoadsorption is the single way for effective treatment of severe CHD patients with elevated Lp(a) level// Ther Apher & Dial. - 2003.- V. 7,- N°. 5. -
78. Ezhov M.V., Lyakishev A.A., Afanasieva M.I., Afanasieva O.I., Naumov V.G., Pokrovsky S.N. Homocysteine and premature coronary heart disease.// Atherosclerosis (Suppl).- 2003,-V.4.-NS.2.-P. 122-123 Ьцля
19. Pokrovsky S., Straube R., Afanasieva O., Kukharchuk V. Lipoprotein(a) apheresis is the unique method for treatment of severe CHD patients// Atherosclerosis (Suppl). - 2003- V. 4,- №2. -p.292.lF-4 4"
80. Арабидзе Г.Г., Ипатов А.И., Афанасьева О.И., Афанасьева М.И., Скрябина Е.О. Исследование показателей липидного профиля, липопротеида(а), аполипопротеида В100 у больных инфарктом миокарда с различной локализацией и глубиной поражения// Кардиоваскулярная терапия и профилактика.-2005,- T4.-N°S2.-С.21.ВАк
81. Pokrovsky S.N., Il'ina L.N., Afanasieva O.I., Ezhov M.V., Sinitsyn V.Y., Akchurin R.S. Association of elevated Lp(a) with early vein graft occlusions after CABG.// Abstracts of 75 EAS Congress, Prague.- 2005,-P. 24.
82. Pokrovsky S., Straube R., Afanasieva O., Kukharchuk V., Konovalov G. Lp(a) apheresis for the treatment of severe CHD patients with Lp(a) hyperlipidemia.// Ther Apher Dial.- 2005.- V. 9.-№. 5,-P. 40.1F', N0
83. Афанасьева О.И., Ильина Л.Н., Ежов M.B., Афанасьева М.И., Беневоленская Г.Ф., Акчурин P.C., Покровский С.Н. Влияние уровня Лп (а) и фенотипа апо (а) на клиническое состояние больных после операции реваскуляризации миокарда.// Кардиоваскулярная терапия и профилактика - 2006,-Т.5.-№6,- С. 32. ВАК
84. Ежов М.В., Камбегова А.А., Афанасьева О.И., Наумов В.Г., Лякишев А.А., Покровский С.Н.Связь липопротеида (а) и низкомолекулярного фенотипа апобелка(а) с атеросклерозом коронарных артерий в молодом возрасте.// Кардиоваскулярная терапия и профилактика- 2006,-T.5.-Ns6.-С. 138. ВАК
85. Афанасьева О.И., Адамова И.Ю., Дмитриева О.А., Афанасьева М.И., Кипор С.Г., Коновалов Г.А., Покровский С.Н.Аферез липидов - эффективный способ лечния больных с тяжелыми формами сердечно-сосудистых заболеваний.// Материалы научно-
практической конференции "Актуальные вопросы экстракорпоральной терапии". Москва. - 2007. - С.81-82.
86. Ilyina L.N., Afanasieva O.I., Ezhov M.V., Afanasieva M.I., Sinitsyn V.E., Akchurin R.S., Pokrovsky S.N. Lp(a) andapo(a) phenotype and with patency of vein graft in patients after CABG .11 Atherosclerosis (Suppl). - 2007. - V. 8. -Ns 1. -P. 35A. ,!"4№
87. Ezhov M.V., Lyakishev A.A., Afanasieva O.I., Afanasieva M.I., Kukharchuk V.V., Pokrovsky S.N. High lipoprotein(a) and low-molecular weight apo(a) phenotypes predispose to coronary occlusions// Atherosclerosis (Suppl). -2007. - V. 8. -Ns 1. -P. 150A. 15
88. Afanasieva O.I., Ezhov M.V., Lyakishev A.A., Afanasieva M.I., Kukharchuk V.V., Pokrovsky S.N. Lipoprotein(a) and apo(a) phenotypes are associated with carotid atherosclerosis in younger coronary heart disease patients// Atherosclerosis (Suppl). - 2007. - V. 8. - Ns 1. - P.
35A^.93S
89. Pokrovsky S.N., Adamova I.Y., Afanasieva O.I., Kipor S.G., Konovalov G.A., Kukharchuk V.V. LDL and Lp(a) apheresis for the treatment of severe lipid abnormalities.// Atherosclerosis (Suppl). - 2007. - V. 8.-Ns 1,- P. 186.1F~'m
90. Ezhov M.V., Afanasieva O.I., Trukhacheva E.P., Lyakishev A.A., Pokrovsky S.N. Risk factors associated with coronary atherosclerosis in young men// Abstract book of 7th International Symposium on "Multiple risk factors in cardiovascular diseases - Prevention and Intervention - Heath Policy" Venice, Italy.- 2008- P. 78.
91. Ежов M.B., Доценко Ю.В., Афанасьева О.И., Матчин Ю.Г., Афанасьева М.И., Лякишев А.А., Покровский С.Н.Связь повышенного уровня липопротеида(а) с рестенозом и прогрессированием атеросклероза после чрезкожных коронарных вмешательств// Кардиоваскулярная терапия и профилактика. - 2009 - Т.8.-Ns S6.-С. 112-113. ВАК
92. Pokrovsky S.N., Afanasieva O.I., Ezov M.V., Adamova I.Yu., Kipor S.G., Konovalov G.A.
Specific Lp(a) Apheresis. Whom, When and How?.// Ther Apher Dial.- 2009,- V. 13,- Ns 1.-
p ц iF-i.ois
93. Ezhov M.V., Matchin Y.G., Afanasieva O.I., Afanasieva M.I., Docenko J.V., Lyakishev A.A., Pokrovsky S.N. Association of lipoprotein(a) with clinical events after percutaneous coronary intervention.// Atherosclerosis (Suppl). -2009. - V. - 10. -Ns 2. P. 984A s"
94. Pokrovsky S.N., Afanasieva O.I., Ezhov M.V., Adamova I. Yu., Konovalov G.A., Kipor S.G. Specific Lp(a) apheresis by "Lp(a) Lipopak"® columns - unique approach for effective Lp(a) elimination.// Atherosclerosis (Suppl). - 2009. -V.-10,- Ns 2. P. 1339. 'F~' S22
95. Трухачева Е.П., Ежов M B., Титов В Н., Афанасьева О.И., Афанасьева М.И., Лякишев А.А., Покровский С.Н.Влияние терапии никотиновой кислотой и аторвастатином на уровень секреторной фосфолипазы А2 у мужчин с ишемической болезнью сердца и повышенным уровнем липопротеида(а)// Материалы XVII Конгресса «Человек и Лекарство». - 2010. - С. 274.
96. Афанасьева О.И., Ежов М.В., Афанасьева М.И., Сафарова М.С., Соболева Д.И., Лякишев А.А., Покровский С.Н. Полиморфизм липопротеида(а) как фактор риска коронарного атеросклероза и его осложнений у женщин.// Материалы Конгресса ВНОК, Москва. -2010.
97. Сафарова М.С., Ежов М.В., Афанасьева О.И., Ильина Л.Н., Покровский С.Н. Липопротеид(а) как предиктор неблагоприятного прогноза в отдаленные срою! после операции коронарного шунтирования.// Бюллетень НЦССХ «Сердечно-сосудистые заболевания». -2010. -Ns. 11.-С.71. ВАК
98. Ezhov М., Afanasieva О., Lyakishev A., Afanasieva М., Akchurin R., Pokrovsky S. High Lipoprotein(a) level is associated with poor long-term prognosis after coronary artery bypass grafting Л Atherosclerosis (Suppl).-2010-V.l l.-Ns 2,-P.48. !F~4 m
99. Safarova M., Ezhov M., Afanasieva O., Lyakishev A., Pokrovsky S. Association of elevated lipoprotein(a) level with premature coronary heart diseases in man and women.// Atherosclerosis (Suppl).-2010,- V.l l.-Ns 2,- P.48. IF~"M
100. Trukhacheva E, Ezhov M., Titov V., Afanasieva O., Afanasieva M., Lyakishev A.,. Kukharchuk V., Pokrovsky S. Effect of niacin with atorvastatin on secretory phospholipase A2 in men with coronary heart disease and lipoprotein(a) excess.// Atherosclerosis (Suppl).-2010.-V.ll.-№2.-P.l78.l1'-4m6
101. Safarova M., Ezhov M., Afanasieva O., Balakhonova Т., Adamova I., Konovalov G., Pokrovsky S. Specific Lp(a) apheresis for carotid atherosclerosis stabilization in CHD patients with elevated Lp(a) levelsII Atherosclerosis (Suppl). 2011.-N. 12. - P. 66.
102. Safarova M., Trukhacheva E., Ezhov M., Afanasieva O., Tripoten M., Pokrovsky S. Pleiotropic effects of niacin therapy in addition to atorvastatin in coronary heart disease patients with elevated lipoprotein(a) levels// Atherosclerosis(Suppl.) 2011. - N. 12. - P. 69.
103. Ezhov M., Safarova M., Afanasieva O., Lyakishev A., Pokrovsky S. Lipoprotein(a) is an independent risk factor for recurrent coronary events in CHD patients.// Atherosclerosis Suppl. 2011. -N. 12. -P. 108.
СПИСОК ОБОЗНАЧЕНИЙ И СОКРАЩЕНИЙ
АГ - артериальная гипертония Апо(а)- апобелок(а) АпоВюо - апобелокВюо Ат — антитела
ВМ апо(а) - высокомолекулярные
изоформы апобелка(а)
ГиперЛп(а) - Гиперлипопротеиде-
мия(а) (30 мг/дл и более)
ДИ - доверительный интервал
ИАП-1 - ингибитор активатора
плазминогена 1 типа
ИБС - ишемическая болезнь сердца
ИМ - инфаркт миокарда
ИФА - иммуноферментный анализ
К1У2 - IV крингл типа 2
КА - коронарные артерии
КАГ — коронарная ангиография
КШ - коронарное шунтирование
ЛВП — липопротеиды высокой
плотности
ЛНП — липопротеиды низкой плотности
ЛОНП - липопротеиды очень низкой
плотности
ЛП - липопротеиды
Лп(а) - липопротеид(а)
МкАт - моноклональные антитела
НормоЛп(а) - нормальный уровень
Лп(а) (менее 30 мг/дл)
НК - нижние конечности
НМ апо(а) - низкомолекулярные
изоформы апобелка(а)
ОР - относительный риск
ОХС - общий холестерин
ОШ - отношение шансов
ПААГ — полиакриламидный гель
ПАП - комплекс плазмин-
антиплазмин
ПкАт- поликлональные антитела
ПХ - перемежающая хромота
РИД - радиальная иммунодиффузия
СА - сонные артерии
ССЗ - сердечно-сосудистые
заболевания
ССО - сердечно-сосудистые осложнения
ТАП-ИАП - комплекс тканевой
активатор плазминогена/ ингибитор
активатора плазминогена 1 типа
ТГ - триглицериды
ТИМ — толщина комплекса интима-
медиа
ХС ЛВП - холестерин липопротеидов высокой плотности ХС ЛНП - холестерин липопротеидов низкой плотности ФК - функциональный класс -иммуноглобулины класса в
Подписано в печать 26.07.2011 г. Тираж 150 экз. Заказ №556 Отпечатано в типографии ООО «Литера А» г. Москва, ул. Цветной бульвар, д. 32/4 Тел. (495) 785-92-72
Содержание диссертации, доктора биологических наук, Афанасьева, Ольга Ильинична
Список сокращений.
I ВВЕДЕНИЕ.
II ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
1. Открытие и первые годы изучения Лп(а).
2. Структура и полиморфизм Лп(а) и апобелка(а).
3. Предполагаемый метаболизм апо(а).
4. Возможная физиологическая и патофизиологическая роль
Лп(а).
5. Лп(а) как фактор риска атеросклероза.
6. Концентрация Лп(а), полиморфизм апо(а) и коронарный атеросклероз.
7. Лп(а) и атеросклероз сонных артерий.
8. Связь Лп(а) и изоформ апо(а) с атеросклерозом артерий нижних конечностей.
9. Методы количественного определения концентрации Лп(а) как потенциальный источник противоречий результатов клинических исследований.
10. Методы коррекции уровня Лп(а).
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.
III МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
1. Выделение липопротеидов.
2. Получение антител.
3. Синтез аффинных сорбентов.
4. Определение сорбционной емкости иммуносорбентов.
5. Анализ чистоты и специфичности белков.101.
6. Методы определения концентрации белков и липидов.
7. Клинические исследования.
8. Проведение процедур терапевтического, афереза.с использованием колонок Лп(а) Липопак.
9. Статистические методы.
IV РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
1. Разработка препаративных методов выделения Лп(а) и получения антител к Лп(а).
1.1. Разработка методов выделения Лп(а).
1.2. Разработка препаративных методов получения специфических антител барана к Лп(а) человека.
2. Разработка методов определения концентрации Лп(а) и изоформ апо(а) в плазме или сыворотке крови человека.
2.1. Разработка методов определения концентрации Лп(а) в плазме и сыворотке крови человека.
2.2. Разработка метода фенотипирования апобелка(а).
3. Распределение изоформ апо(а) и концентрации Лп(а) у здоровых доноров и больных сердечно-сосудистыми заболеваниями.
4. Связь полиморфизма апобелка(а) и концентрации Лп(а) с атеросклерозом различных локализаций.
4.1. Связь Лп(а) с атеросклерозом коронарных артерий.
4.2. Полиморфизм апо(а) и осложнения коронарного атеросклероза.
4.3. Связь Лп(а) с атеросклерозом сонных артерий.
4.4. Связь Лп(а) с поражением периферических артерий.199"
4.5. Связь Лп(а) с мультифокальным атеросклерозом.
5. Исследование влияния полиморфизма апобелка(а) и концентрации Лп(а) на прогноз больных ИБС.
5.1. Лп(а) и полиморфизм апо(а) у больных после операции аорто-коронарного шунтирования.
5.2. Влияние концентрации Лп(а) и полиморфизма апо(а) на прогноз больных ИБС.
6. Разработка методов коррекции повышенной концентрации
Лп(а).
6.1. Снижение Лп(а) медикаментозными методами.
6.2. Снижение Лп(а) методами терапевтического афереза.
Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Афанасьева, Ольга Ильинична
VI. ВЫВОДЫ.
1. Разработаны препаративные методы выделения высокоочищенного препарата Лп(а) из плазмы крови человека и получения моноспецифических поликлональных Ат барана против Лп(а) человека.
2. Разработан иммуноферментный метод, позволяющий с высокой точностью и воспроизводимостью определять концентрацию Лп(а) в плазме/сыворотке крови человека. На основе полученных моноспецифичных поликлональных антител разработан метод фенотипирования апо(а), основанный на разделении апо(а) по электрофоретической подвижности в ЯЭЗ-полиакриламидном геле с последующим иммуноблотингом.
3. Повышенная концентрация Лп(а) (более 30 мг/дл) и низкомолекулярные изоформы апо(а) встречаются в 1,5-2 раза чаще у больных с атеросклеротическим поражением различных сосудистых бассейнов, чем у здоровых доноров и больных без признаков атеросклероза. Более, чем у 40% больных ИБС встречается концентрация Лп(а) > 30 мг/дл и низкомолекулярные изоформы апо(а) .
4. Низкомолекулярные изоформы апо(а) являются независимым предиктором наличия, тяжести и распространенности атеросклеротического поражения коронарных, сонных, периферических артерий и мультифокального атеросклероза, у больных ИБС. Отношение шансов атеросклероза коронарных, сонных, и периферических артерий в 3-6 раз выше у больных с повышенной концентрацией Jln(a) и низкомолекулярными изоформами апо(а), чем у больных с высокомолекулярными изоформами!апо(а).
5. Наиболее значимая связь Лп(а) и, особенно, полиморфизма апо(а) с атеросклеротическими поражениями и ИБС отмечена у больных молодого и среднего возраста.
6. Повышенная концентрация Лп(а) и наличие низкомолекулярных изоформ апо(а) связаны с:
- неблагоприятным прогнозом течения«ИБС;
- развитием осложнений после операции реваскуляризации миокарда.
7. Разработана технология синтеза иммуносорбента, позволяющего с высокой специфичностью и эффективностью удалять Лп(а)' из плазмы крови человека.
8. Лп(а) аферез является уникальным, специфичным, безопасным и эффективным методом коррекции уровня Лп(а). Проведение курса Лп(а) афереза больным с повышенной концентрацией Лп(а) позволяет достичь положительного клинического результата, выраженного в стабилизации течения ИБС.
-
Афанасьева, Ольга Ильинична
-
доктора биологических наук
-
Москва, 2011
-
ВАК 03.01.04
- Механизмы атерогенной модификации липопротеидов низкой плотности карбонильными соединениями
- Связывание холестерина апопротеином Е и роль этого апобелка в транспорте холестерина
- Структурные основы регуляции метаболизма липопротеинов плазмы крови человека при нормо- и гипертриглицеридемии
- Влияние липопротеидов на сигнальные и транскрипционные системы клеток крови и сосудистой стенки
- Роль липид-белковых взаимодействий в атерогенных перестройках плазменных липопротеидов низкой плотности
