Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Связывание холестерина апопротеином Е и роль этого апобелка в транспорте холестерина

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Связывание холестерина апопротеином Е и роль этого апобелка в транспорте холестерина"

российская академия медицинских наук

научно-исследовательский институт

экспериментальной медицины

рге од На правах рукописи

3

БЕЛОВА Елена Владимировна

СВЯЗЫВАНИЕ ХОЛЕСТЕРИНА АПОПРОТЕИНОМ Е И РОЛЬ ЭТОГО АПОБЕЛКА В ТРАНСПОРТЕ ХОЛЕСТЕРИНА

Специальность: 03,00.04 — Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 1994

. Работа выполнена в отделе биохимии Научно-исследовательского института экспериментальной медицины РАМН (директор — академик РАМН Б. И. Ткаченко).

Научный руководитель: академик РАМН, профессор А. Н. Климов Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор В. С. Гуревич; доктор биологических наук М. А. Флеров

Ведущее учреждение: Санкт-Петербургский медицинский институт им. И. П. Павлова.

Защита диссертации состоится « . » . . . 1994 г.

в '< /2>с?» часов на заседании Специализированного совета (К 001.23.01.) при Научно-исследовательском институте экспериментальной медицины РАМН по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, 12.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИЭМ РАМН по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, 12.

Автореферат разослан « » . . . 1994 г.

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат биологических наук

О. Г. Куликова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТИ

Актуальность проблемы. В основа возникновения атвросклвро-тического процесса лежит нарушение липидного обмена, проявляющееся в повышении содержания атерогошшх и понижении содержания внтиатерогенных липопротеидов (ЛП) в плазме крови, в изменении структуры ЛП и активности ряда ферментов, регулирующих их обмен. В связи с этим выяснение состава и свойств ЛП и изучение их метаболизма явилось в последние года основным направлением научных исследований в области липидного обмена.

Одним из липидов, транспортируемых липопротеидами крови, является холестерин (ХС). Он служит обязательным компонентом плазматической мембраны и мембран клеточных органелл, является предшественником большого числа физиологически активных и необходимых для организма соединений, таких как кортикоидныо и половые гормоны, желчные кислота.

Вместе с тем еще со времен Н.Н.Аничкова известно, что накопление ХС в артериальной стенке лежит в основе атеросклероти-ческих поражений, а повышенный уровень ХС в плазме крови служит одним из факторов риска развития атеросклероза. Наличие perуля-торных клеточных механизмов синтеза ХС, захвата клетками богатых холестерином липопротеидных частиц при участии специфических рецепторов и удаления избыточного ХС с помощью липопротеидов высокой плотности (ЛПВП) оберегает клетку от накопления в ней этого стерина.

По мнению ряда исследователей определенную роль в поддержании гомеостаза ХС в клетке и вне ее может играть апопротеин Е (ano Е) (Творогова 'М.Г., Перова Н.В., 1986; Jiahley R.W., 1988). В пользу этого свидетельствует тот факт, что данный белок превалирует в богатых эфирами ХС липопротеидах (р-ЛПОШ и ЛПВПХС) и служит детерминантой, ответственной за поставку ХС в клетки липопротеидами через ano В, Е- и апогЕ рецепторы (МчМеу et al., 1984). Кроме того, ano Е-содерзшцие ЛП участвуют в транспорто ХС у пациентов с аОоталипопротеидвмивй (Blum et, al., 1933), у больных, страдавдих болезнью Танжера (Gibson et al., 1935), и у лиц с дефицитом лецитин:холесторииэцилтрансфоразы (Fielding et al., 1982).

Широкое распространение ano Е и наличио относительно

високого содержания апо E m-РНК во многих органах и тканях организма человека и животных предполагает также участие этого »шоболкн и локальном транспорте стероидных гормонов в дополнений и его роли в метаболизме ХС (Lin et al., 1966; Sehl о Icher et al., 1993).

Нельзя исключить, что апо Е может участвовать в транспорте 'ХС не только ii состава ЛП, но и при непосредственном связывании стярино шюоолком. Предположи«« об образовании комплексов белков с ХО dyjio сделано еще в 1934 г. И.А.Ремизовым, ио только исследования последних десяти лет убеждают, что ХС может взаимодействовать с белками непосредственно, а но только через фог-Тюлипиды (ФЛ). Показано связывание ХС мембранными белками ¡>;;>!Т}>оди'гри человека, лизосом и митохондрий печени крысы, каршиюмы Герона крысы, миелиновым белком Фолча (London et al., 1974; Kieppruif, Schubert, 19T9; Лелашвили H.Г. и соовт.. 1979; r/wiï.'utli, 1930). По аналогии с другими белками можно предположить, что и апонротеияы могут взаимодействовать с ХС без участия ФЛ. Некотороне факты свидетельствуют в пользу »того гг{«'Д11олси;пния. Обнаружено, что способность . ЛПВП солшсншкшровать кристаллы ХС уменьшается при про инкубации ЛПВП с трипсином, что указывает на вовлечение в данный процесс ононротоинов ЛПВП (Adams, Abdulla, 1978). Получены доказательства усиления ХС-акцептсрной фяшции ЛПВП в присутствии пио AI (Kllmov, 1983).

Цель и задачи исследования. Настоящая работа предусматривает изучение связывания ХС апепротоином Е и выяснение возможной роля «того »поселка в транспорто ХС.

Исходя из итого, были поставлены следуицие конкретные задачи:

I. Выделение гигонротвина Е в чистом виде и его характеристик.

?.. Изучение глпимодеПствия апо Е с холестерином в отсутствие ФЛ с использованием различных методических подходов.

д. выяснение природы белок-дипидного взаимодействии: роль отделы"»* химических групп и структурной организации япобелка и перина п данном процессе.

4. Исследование ХС-акцепторных свойств подЕракций ЛПВП, выделении* от лиц, г? различным уровнем u-холестериня (дисальфя- ■

липопротеидемиями), и выяснение возможной роли airo Е в захвате XG этими ЛП-частицами.

5. изучение способности ano Е захватывать ХС из ююто'пшг меморан и липопротеидов.

Научная новизна работы. В настоящей работе впервые показана способность ano Е взаимодействовать с ХС без участия ОЛ с образованием комплекса апопротеин-ХС. Установлено участив аргининовах остатков ano Е и гидрокслла ХС и показана важная роль гидрофобного взаимодействия апобелка с молекулой ХС при формировании данного комплекса.

.Выявлено важное значение структурной организации опоироте-инов для взаимодействия с ХС.

Изучение ХС-акцепторных свойств подфракций Л11ВП. выделенных от лиц с различным уровнем а-ХС, показало, что захват холестерина ЛПВП-частицами не связан с наличном апопротеина Е в их составе.

Впервые показано, что In vitro ano Е способен забирать не-эстерифицированный ХС (НЭХС) из мембран эритроцитов и ефиры ХС (ЭХО) из ЭХС-обогпщенных ЛПВП.

научно-практическая значимость работа. Представленные в. диссертации материалы вносят определенный вклад в фундаментальные исследования по изучению метаболизма и транспорта ЛП и ХС в организме человека и животных. Способность апопротеина Е связывать экзогенный ХС и ХС из мембран клеток и липопротеидов обеспечивает возможность участия данного белка в транспорте ХС между отдельными клетками и субклеточными компонентами внутри органов и тканей,, в процессе формирования ЛП-частиц, богатых ХС и его эфирами, в -транспорте ХС из клеточных мембран периферических тканей на ЛПВП, в транспорте ЭХС из а по Е-содертацих ЛПВП на ЛП более низких плотностей i/ри дефиците ЭХС-переносяшего белка' в плазме крови и других патологиях.

Полученные данные имеют такие определешгае значение и для практической медицины. В ходе работы осуществлена модификация методов выделения апопротеина Е, что позволяет сравнительно легко получить апобелок с достаточной степенью чистоты и использовать его в качестве маркера для дпфреренциалытой диагностики нарушений обмена ЛП, свойстветшх III и V тилям гииерли-пидемии. Результаты исследовани? углубляют имчтаиеся свпдщгая о

роли япощютеинов в метаболизме ХС и липопротеидов в норме и при литологии.и могут Сыть использованы при чтении курса лекций по лшшдному обмену.

На зашдту выносятся аюдумцие положения:

1. лпопротеин Е может взаимодействовать непосредственно с ХС о»?э участия ®Л с образованном комплекса апоболок-ХС.

2. в образовании комплекса ХС с апогготеином Е участвуют гушшдпиоше группы арпшщговых остатков белка, гидрокснл ХС, в такие имеет место гидрофобное взаимодействие апопротоина со стеринсм.

3. Апопротоин Е не оказывает стимулирующего действия на ХС-акцепторные свойства подсекций ЛПВП.

4. In vltro апопротеин Е захватывает неэстерифшщрованный ХО из мембран эритроцитов и ЭХС из ЛПВПд-частиц, обогащенных

&С«рами ХС.

ГЯ>:!Г)['.Уя_PÜ^SIУ состоялась на научном заседании отдела биохимии 1ШГ>м РАМН, 1эзз г. Результаты исследования долоаеш на: VI Международном, симпозиуме по атеросклерозу, Зап. Берлин, 1932 г.; IV Всесоюзном симпозиуме "Актуальные проблемы патогенеза атеросклероза", Ленинград, 1985 г.; V Всесоюзном биохимическом съезде, Киев, 1086 г.

'ЙОлнкпцть По томе диссортации опубликовано 9 работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на ~{9Ъ магашюниеннх. страницах; состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, собственных результатов и их обсуждения, заключения, виьодов и списка использованной латора-туры. Гппота ¡!лл»!стри1юрана !3 таблицами я 16 рисунками. Внб-лиог[1»»-ич«сккЯ указатель содержит 51 отечественных и 193 иностранных легочников.

С О ДЕРЯ А НЙЕ РйБОТН

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Об;">р литературы состоит из пяти разделов. Первый из mix иоспятоп ?ол»стерану, его структуре, свойствам и роли в развитии лтрр-опмерозп. РтороЛ и третьи разделы содержат облив представлении о ij'nruiiío-хпмнчо.скнх свойствах, апопротепновом составе п к»тигЧ>.пйз»л.« отдельных классов ЛП; особое внимание уделено ан-

-ь-

тиатврогенному классу Ml - ЛПВП, их холестерин-акцепторшм свойствам и роли в "обратном" транспорте ХС. В четвертом разделе оозора литературы коротко изложены имеющиеся на сегодняшний день сведения о дисальфалипоггротеидемиях. В пятом разделе дана характеристика апопротеина Е (синтез, структура, полиморфизм, свойства и т.д.) и рассматривается роль этого белка в организме.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Получение и характеристика апопротеина Е. В работе использовали ano F, выделенный из ЛПОНП сыворотки кропи здоровых доноров и кроликов (нормальных или с экспериментальной пшерхолестерив-емней). Пшерхолестеринемию у кроликов вызывали ежедневным введением через зонд 500 мг ХС в подсолнечном масле. В эксперимент брали животных с содержанием:ХС в плазме 500-1000 мг/дл.

Фракцию ЛПОНП выделяли методом препаративного ультрацентрифугирования (Havel et al., 1955). Делипидирование ЛПОНП осуществляли по разработанной нами методике, основанной на методах Shelburne и Quarford (1974) и Gldez и соавт. (1977).

Ало Е выделяли методом гольфильтрации белков ЛПОНП на колонке (1,4«35 см) с сефадексом G-I50 с повторной гельфильтрацией. В основу данной методики положены методы выделения апопротеина Е, использованные Bersot и соавт. (1970) и Utertnann (1975). При этом нами были подобраны условия, позволяющие максимально отделить ano Е от других япоггротогаюв, входящих в состав ЛПОНП. С этой целью долипидировашую Фракцию ЛПОНП растворяли в 0,2 М трис-ИС1 буфере, содержащем 2% Ю-Ка (pH 8,4), и затем диализовали в течешге 18 часов при 10°С против вышеуказанного буфера, с 0,1% DS-Na. Смесь полученных таким образом аиопротегаюв (не более 10 мг бежа) наносили на колонку с софадексом G-I50, уравновешенную 0,2 М трис-НС1 буфером с 0,1% IG-Na (pH 8,4), и элюировали тем же буфером со скоростью 9 мл/час. В собранных фракциях (по 3 мл элюпта) определяли белок, измеряя оптическую плотность на спектрофотометре СФ-26 при 230 т или по методу Лоури (Lowry et al., 1951). Для достижения большей очистки апопротеина Е при тех же условиях проводили повторную гельфильтрацив лшь

двух-трех фракций на высоте второго пика, соответствующего, по литературным денным, апопротеину Е (Beraot et al., 1970; Utennaim, 1975). Полученные после колонки проба с максимальным содержанием белка объединяли и даализовали против 0,01 М трио-HCl буфера с 0,001 М ЭДГА (pH 7,4) в течение трех суток с ежедневной сменой буфера. Этим достигалось максимальное удаленно DS-Na (его содержание в полученном препарате, определенное) по методу Walte et al. (1976), составляло по inrav.m дншшм 1,5-1,7% от общей массы белка).

Характеристику чистоты препарата и его идентификацию осуществляли методами двойной радиальной иммунодиффузии (Ouctitnrlony, 1953), диск-електрофореза в полиакриламидном геле с о М мочеыпюй выделенного наш апобелка и белковых компонентов ЛПОНП (Uterraann, 1975), а также определением содержания в штопротеине аргинина (Parblszewskl et al., 1972) и молекулярной массы этого белка методом гельфильтрации на колонке с сефздексом G-150 с использованием белков-свидетелей (трипсина, Mr 23.000; пепсина, Ыр 34.700; овальбумина, Mj, 45.ООО; бычьего альбумина, Ыг 66.000,4

Определение содержания сиаловых кислот в апо Е проводили высокочувствительным гюриодат-резорциновым методом (Туманова С.Ю., IP82).

Содержание фосфолипидов в апо Е определяли по методу Васьковского В.Е. и соавт. (Vankovsky et al., 1975).

Изучение связывания ХС апопротеююм Е. Обнаружение и выделение комплекса апо Е-холестерин проводили методом ультрацентрифуги-роввния в градиенте плотности КВг (Попов A.B. и соавт., 1975).

О связывании ХС апопротеином судили также на основании экстракции гоксаном свободного ХС (не связавшегося с белком) из среды, содержащей комплекс апобелок-ХС. Экстракции гексаном проводили дважды. В водной фазе определяли содержание свяэоыиегося с апо Е холестерина, используя "Монотост на холестерин" (Boehrlnger, Германия), и белка (Lowry et al., 1951).

Изменение вторичной структуры апо Е в присутствии ХС регистрировали путем снятия спектров дисперсии оптического вращения (ЛОВ) ряда образцов аиоболка (0,4-1,0 мг/мл) и бедка с ХС (0,02.-0,03 мг/мл) нн спектрополяриметро "Ferkln Elmer" Z4I-MC

(США) в тормостатируемой кварцевой кювете с длиной оптического пути 10 см и объемом I мл в диапазоне длин волн 310-550 нм, при комнатной температуре (22°С).

Изучение природы ХС-белкового взаимодействия. Абсорбционные спектры различных аминокислот (аргинина, лизина, гистадииа. фенилаланина, аланина, серина, пролила, триптофана, лейцина, н концентрации 0,4-I5«I0~s моль/мл), а также гуанидин-содержнщих соединений (гуанидина, матформина, в концентрации 0,Г-0,16«10~а моль/мл) в отутствие ХС и при его добавлении в пробу (7,7»10~8моль/мл) снимали на спектрофотометре Specorci UV VIS (Германия) в кювете толщиной I см, при температуре 22°С и 37°С. Измерение.проводилось против контрольной кюветы с ХС.

Денситометрию водных суспензий ноэстерифицировашюго ХС (1,3«10~7моль на 1,3 мл пробы) в лрисутствии ряда белков (ano Е, ano AI, гистона НЗ, трипсина, миоглобина, цитохрома с) проводили при комнатной температуре (22°С) на фотоколориметре (SGK-56 ПМ) при 400 нм в кювете толщиной 0,5 см. При этом были поставлены две серии экспериментов. В первой серии опытов содержание белков в пробе было эквимолярнкм и составляло 3,4»Ю-10 моль. Во второй серии опытов белки были взяты в количествах, эквимолярных по аргинину (1»10~8 моль).

Денситометрию водных суспензий неэстерифицированного ХС, метилового эфира ХС и холестана (1,3»10-7моль) в присутствии ano Е (0,9«10 ,моль) проводили в тех же условиях.

Гуанидиновыо группы аргининовых остатков ano Б (~2 мг) блокировали бисульфитом глиоксаля (10 мг) в 0,5 мл 0,5 М Na-бикарбонатного буфера, pH 9,2, в течение 1 часа при комнатной температуре.-Избыток бисульфита глиоксаля, мешающий определению аргинина в реакции Сакагучи (FarMszewskl F., et al., 19T2), удаляли пропусканием раствора белка Через колонку с се-фадексом G-25.

Изучение ХС-акцепторных свойств ЛПВП, выделенных от лиц с дислипопротеидемиями. Подфракции ЛПВП,, и ЛПВПд выделяли методом препаративного ультрарентрифугирования на центрифуге Splnco 12-65 В (Havel et. al.,. 1955). В полученных подфракциях ЛПВП определяли содержание ХС ("Монотест на холестерин", Boehrlnger, Гермлния) и белка (Lowry et al.,1951). В эксперименте использовали ЛПВП, выделенные от лиц с уровнем а-ХС, равным 35-70 мг/дл

(нормо-а-лилопротеидемия); с содержанием а-XC ниже 35 мг/д; (гшга-а-лшгапротоидемия) и с содержанием а-ХС выше 70 мг/д* (гилер-а~липопротеидемия). Содержание ТГ у доноров не превышала 200 мг/дл. Эритроциты получали из крови тех же пациентов.

Изучение ХС-акцопторной функции подГракций ЛПВП проводили в шшубационноя системе, состоящей из 2 мл "упакованных" эритроцитов и ЛПВП (1,25 мг по белку) при наличии или отсутствии в среце ano Е (0,35 мг). Проси инкубировали при с в течение 4-х часов с послодупцим центрифугированием при 1500 об/мин ЗС мин при 4°С для отделения эритроцитов. Эритроциты дважды промывали физиологическим раствором. Супернатанты использовали для выделения подфракций ЛПВП методом пропаратюшого ультрацентри-фугировшгия при 40000 об/мин, Ю°С, в течение 24 часов. В расчет принимали лишь результатыполученные при инкубации ЛПВП с вритрсцитами без видимого гемолиза последних.

Размеры частиц ЛПВП определяли методом корреляционной лазерной спектроскопии (Клюбии В.В., Носкин В.А., 1979). Измерение проводили при комнатной температуре; концентрация ЛП i растворе составляла 2 мг/мл по белку.

Для выяснения ХС-пкцепторноЯ способности апопротеина t ппоболок ипкусироппли с ЛПВП или эритроцитами. инкубацию ппо Е (»0,35 мг) с ЛПВП (Г.25 мг по белку), выделенными от лиц с нормальным уровнем а-ХС, проводили в 0,05 К трис-HCl буфоро (p¡: 7,}), содержашом 0,15 М Nací, при 37°с в течетга 4-х часов с посладущим ультрацентряругированием и определением в суперна-тшгго ХС н бедка. В экспериментах с эритроцитами к 2 мл "упакованных" клеток добавляли ario Е (0,3-0,5 мг) в 0,05 М трис-ИС] буфера, содержащем 0,15 М IJaCl. Смось инкубировали в течение 4-х часов и потом центрифушровзли при 1500 об/мин 30 мин дде отделения эритроцитов. Далее к 0,5 мл отмытых клеток добавлял» двойной объем О,ЭХ tin01 и полученную взвесь использовали ллг экстракции ХС изопропиловим спиртом по методу, аналогичному дл; анализа линидоп плазмы крови (Manual of Шюлиогу Operations: LIplil Research Clinic Program. Washington, 19T4). Содержание ХС в изонронаноловых экстрактах определяли на автоанализторе ЛА-5 фирмы "Техник.и" (США). Результаты выражали в мг/мл и одновременно рассчитывали на одну клетку (г«Ю~13) с использование?, для подсчота количества эритроцитов каморы Горяева.

Статистическую обработку результатов нсслвдиьанич проводили с применением параметрического критерии стыодоитп (Бессмг>рг -nufl B.C., 1967). Достоверность различия считали усчаношмнно!» при р<0,05. Обработку единичных результатов (серия из 3-х вно-периментов) проводили по Ашмарину И.П. и Воробьеву A.A. (Xí<fi2).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛКДОВАШИ И ИХ ОПСУЖДЕИНЕ

Выделенный из ЛНОНЛ плазма крови человека и калинов (пор ■ мальных и гиперхолоствринемичоских) белок был идентичен о/юпро теину Е, что установлено катодами электрофором в г«олиы<]\ч.-1 ехидном геле и дпобноЯ радиальной иммунодиФТуяии, им*л полечу ляриуп массу около 34.000 Da и содержал арпшии в количеств" 0,11 мг/мл белка (II* от общей молекулярной масс.:« пкгоюкисло1 белка). Содержание опаловых кислот з ano Е из лпокп anew крови человека и нормальных кроликов было равно 1,0-1,20 моль/моль белка, в ano Е, полученном от гипертодестпринонических кроли ков, - 2,08*0,11 моль/моль белка. Содержите фоофолмшдоп в run Е было незначительным и составляло всего лишь 2,0-2,5% от ноле кулярной массы белка, что соответствует I молекуле ФЛ на мода -кулу белка. Выше приведенные результаты согласуются с данным!' других исследователей (Shelburne, Quarfordt, 1У М; !Нпптяпп, 1975; Roth et al., 1977; Jain, Guarfordt» 1979; Lt'o pi al.. 1991 ).

Кзупаплв езягнеаиия нояастефяпц япгатротяяяом 8

Для подтверждения гипотезы о возможности прямого рроимо-дэПитпил хс с г,по к были использованы раздичшо м"тодичргкио подходы. Иря ультрпцонтриФугиропянии я градиент»? плотности крг наблядплось сниявтге гидрптлровлпноЯ плотности япо е с 1 ,?.я г/мл (дкя нптивного лавка) до 1 ,<"1 г/мл (в присутствии то), что пч1л°т«ш-гтву«?т о« обрчгювашго ж-иилгися nnonporpi'ii е-хо. роде ржание Сс-пня и хо в комп.тч'.т сыло тт и 0,04п<г),паз мг, г''ч!']»п1('тв"1!т)'о fрезультаты 9 шштуп), т.". ! иг б»>лкя сряпннял mi' стегч'иэ. что п пересчет»» «л мпяопгмчр -нуш f'accy зпо е составляет л Г молотчпу X(J ил одну молекулу гпо Оолкн-

Но данным экстракционного метода с использованием гексаш. для удаления ХС, но связавшегося о апопротеином, I мг ало Е свякнвал 0,393 мг ХС (результаты 10 опытов), что соответствует 34 калекулам ХС на молекулу апобелка.

Фирмирсваше комплекса ano Е-ХС происходило, в условиях наиго эксперимента, оез участия CWI, так как наличие всего лишь однся молекулы ФЛ па молекулу белка не могло обеспечить связывания 31-34 молекул ХС.

Еще одним доказательством взаимодействия ало Е с ХС было изменение колЯормяции белка в присутствии этого стерина при снятии спектров дисперсии оптического вращения (ДОВ) ряда образцов ппр Е. На рис. I в качестве примера представлены

Рис Л. Спектры дисперсии оптического вращения шю Е, выделенного из ЛПОНП плазмы крови гиперходйстяринемического кролика.

-600 .

I

ъ -

г—1

•soo

t|OU

АлоЕ'ХС Ano С

о,и об о,в i ,о «,2

результаты определения спектров ДОВ рпстворов алопротеина. Е, выделенного и лппнп плазмы крови гипорхолостериномических кроликов, в отсутствие и при ín.-nvnr.i в сродо УС. Согласно) дрннмм Sheclttcr и ülout (J?ÍU> ДОВ оелкор, вторичная структура

которых б основном определяется наличием о-спиралей и неупорядоченной конформации, хорошо описывается модифицированным дну -членним уравнением Друде, которое может быть графически представлено в виде прямой линии. Как видно из рис. I для нптивного ano Е не наблюдается линейной зависимости в координатах уравнения Друде, что указывает на присутствие в белке, помимо a-спиралей и неупорядоченного клубка, других упорядоченных структур: р-изгибов, параллельных и антипараллелышх р-структур. При добавлении ХС к ano Е данная зависимость величины [r*) (л.2-\2193/л2193 от ^22р5/(\2-л2225) становится линейной, что свидетельствует о разрушении р-структур в апобелке в результате взаимодействия ХС с ano Е.

И, наконец, дополнительным доказательством связывания ХС апопротеином Е является изменение оптической плотности суспензий ХС в присутствии апобелка. Использованный нами турбидимет-рический метод определения оптической плотности растворов ХС не является оригинальным. По уменьшению "мутности" суспензий липидов в присутствии апопротеинов при 320-600 нм судили о кинетике связывания апобелков с <М и ФЛ-ХС липоеомами многие авторы (Tall, Small, 1977; Fownall et al., 19T9; Van Tornout et al., 1980). В наших экспериментах оптическая плотность водных суспензия ХС составляла в среднем О,IIOiO,004 (результаты 34 опытов), при добавлении к раствору ХС (1,3«ю-7 моль в 1,3 мл) апопротеина Е (9,1«Ю~10 моль) оптическая плотность стерина снижалась до 0,030±0,001 (результаты 31 измерения). Уменьшение (на 73%) оптической плотности суспензий ХС при наличии в среде ano Е свидетельствует о лучшей растворимости ХС в присутствии белка и косвенно указывает на взаимодействие белка со стерином.

Следует заметить, что в вышеописанных опытах не было обнаружено существенных различий в способности связывать ХС у ano Е, выделенного из ЛНОНП плазмы крови человека, нормальных и ги-перхолестерянемических кроликов.

Установленный факт непосредственного взаимодействия ХС с ano Е без участия ФЛ позволил перейти к следующему этапу исследований - выяснению роли отдельных химических групп апобелка и ХС, а также структурной организации белка в данном процессе.

Иэучекио порода холестерин-белкового взеяиодйВетшм

Участие пргичиног-ых остатков апопротеина Е г связывашт ХС.

Известно, что арпшиновно остатки гистоновой Фракиии ИЗ (нзолироппшюй из тимуса теленка) и форлэнта глутаматдегидроге-назн участвует в связывании стороидных (кортикоидных и половых) гормотп, имевших сходную с ХС структуру (¡¡Somier, Walker, 1970; Титова Г.В., Клюева U.K., Г378).

Для выяснения роли аргтпшовых остатков ano Е при взаимодействии белка с ХС были поставлены окснеримента о блокированием гуянидиноннх групп пргшпшовнх остатков ano Е бисульфитом гли(.»«сп !|я.

Ультрацентркфушровянио в градиенте плотности KB г смеси, состояний из шюпротонна Е и ХО, с последу»адиы определением в комплексе содпржшшя белке и ХС показало, что I мг опо Е с за-блотцовпшшми аргининовнми остатками связывает 0,181 »0,011 мг ХС, тогда как J мг иомодиТ-кцированного апопротоина Е связывает 0,rs:)l»u,íKl мг ХО (рюзультпты 9 экспериментов). Умоньше1ше (почтя в Z раза) связывания ХС, шюболком при специфическом блокировании гушшдиновых групп болхп указывает на важную ¡юль aj>— гиниповых остатков ano Е в образовании комплекса апопротеин Е-хс.

.Участие арпшиновых остатков ппобелков во взаимодействии с ХС поД1плрад.'»)т также результаты оксперимонтоп по измерению оптические? шюпюети водных суспензий ХО в присутствии ппопротои-нов Л Г и Е и ряда других белков, взятых в »кгкмоляршх количеству, ?г> с рчпннч содержанием в них яргшглновнх остатков.

Как и иди i из толицч I, наибольшее уменьшение оптической платность- водны* суспензий ХС (нм 4С> ГШ) ичОшвдаяось в присут-CTBVii ппснрЧ'ишов Е и Л1 и momia !ПЗ, что свидетельствует о лучшем гвп:н»>!ншн вп'Х лелкоп с ХО и коррелирует с пыспкгм со-д^ржпт^м к них пргичиногнх остатков. в сравнении с ними кио-глоРии, трипсин и нитохром о, VM'ur.um олинячокое количество аргинина I-' остатка на матжулу бел ire). ум"ш шали оптическую п.пптм'чмь гуинмгч'п хс ит Z?x.

1!>уч'ч!ип сшпчрчпип ХС тот! ко белками, и:« взятыми в коли-чостъвт. зт:г;1?"олчрннх пс> урппп'иу (тпг'п.Я), показало. что Bill-

Таблица I

Связывание холестерина (1,3»1С~' моль з гтрссо) различными Салками, взятиш в эквимолярвнх

-ТП

количествах (3,-1-10 моль в пробе), но с рпзкшл содоргашюм арглЕгна

Мо; оку ".яркая Содесзвнио Содка число аьгинлновш Оптическая Уменьшение

6(2 ЛОК масса селхсв з псоОо, мкг остатков на молекулу плотность ггсобы СПТИЧ6СКС2

! Селка ггоа дооаалэкга ХС ПЛОТНОСТИ,2

* - л - - - 3,1110,СШ -

Г~=Г < -»

/

а::о £ С4ССС II 33 0,04 гС, £301 54

:Т0)

. г С5СС0 5.5 15 а,С5±0,С04 55

Г.1С гон :тзса 1В ■ э; 0.С£г0,С01 45

сгссо 7 7 2 Г7

.'ЛОС ГШ 17СС0 3.3 2 Г* ¿Л '^У"*"! 2?

:.гсе .5 С 124С0 4 ' О

Таб-яиль Z

Связывание холестерина (l,3»X0"' моль в просе) белками, взятыми в концентрациях, ссеспечяваггпгх эквимодярное содержание аргинина в проое С1»Ю~° моль!

Белок Содержание белка в пробе Оптическая плотность пробы при добавлэнии холестерина Умэкьибние оптической плотности, %

мкг моль»ГО~1С

Без белка - - 0,И±0,004 -

(25)*

ano Е 16,0 4,9 0,03*0,002 73

(20)

ano AI 21,5 7.7 0,04t0,004 64

(5)

гастон нз 11,2 6,3 0,05*0,002 55

(5)

миоглобин 81,4 47,9 0,0610,004 45

(5)

цитохром с 60,0 .48,4 0,06*0,002 45

(5)

ТрИПСИН 115.7 48,6 0,06±0,002 45

(5)

* в скобках - число опытов

более выраженное снижение оптической плотности суспензий хс ич Олюдается в присутствии опопротеинов Е и Д1: на 73* и соответственно, МиоглоОин, трипсин, цитохром с и гнетен Н-Ч при вывали ХС в меньшей степени. Высокое сродство ХС, к япопротеичпм Е и AT обусловлено, по-видимому, особештостями вторичной структуры апобелков, в частности наличием в них амЗипатных учвпткор со специфической локализацией заряженных остатков, обеспечиваю ■ щих лучшее взаимодействие апобелков с ХС.

С целью углубленного изучения роли гуанидиновых групп пр-гининовых остатков при связывании ХС белками была проведена серия опытов по определению спектров поглоиевия в ультри«!иолпто-вом свете разливших аминокислот и соединения в присутствии ХС. Согласно полученным данным, наибольшее смещение максимума поглощения в длинноволновую область спектра, а следовательно, и наибольшее взаимодействие с ХС в водной среде при нейтральном рН и t°--22°C, имеют соединения, в состав которых в ход л т гуени-динсвые группы (гуанидин, метформин, аргинин) и, в меньшей сте пени, соодштния с 6-аминогруппой (лизин) и имидазольиой группой (гистидин).

Более выраженное смещение максимума поглощения ылюпязпан-пых соединения отмечалось при 37°С.

•В качестве примерз на рисунке 2 приведены спектры поглогде--ния гуанидина и аргинина, имевдих смещошю максимума поглощения в присутствии ХС, и гидрофобной аминокислоты - аланина, у которой данного смещения нет.

Участие гидроксильной группы ХС во взаимодействии

Согласно литературным данным, в процессе взаимодействия ХО с различными белками, а также ХС-содержащих фосфолипидннх везикул с вргинин-содержшдим сегментом ano AI участвует гкдро ксильная группа ХС (London et al., 19Ti; Klappauí, Schubert, 1979; Fuküahlma et ni.,1981). Замена последней кетогруппой или перемещение ее из 3 • р в З-а-положениэ (зпихолестерин) поттжплб сродство стерина к белку. Нельзя исключить, исходя из этого, что и взаимодействие апопротеина Е с ХС также происходит при участия гидрокрила ХС. На это, в определенной мере, указывают результаты нчдгих экспериментов по измерению оптической плотное ти полных суспензий ХС. метилового рфирп и холпетпнп. отличаю-

Puc.z. СПЕКТРЫ ПСГЛСЩЕШЯ ГУАЩЛИКА, АРГИШНА И АЛА.В'НА. В БОДЖй СРЕДЕ ПРИ 22'С

0,3

С,7

0,5 0,5.

0,4

0,30,2.

0,1

О

105 £00

I- ГУАШЛИН £- ГУАЩфШ + ХС

215 км 185 200

1- АРГЛЙШ

2- АРГИНИН + ХС

ÜI5 нм

\

165 200

1- АЛАНИИ

2- АЯАВ1Н + ХС

215 нм

щегося от ХС отсутствием гидроксильноЯ группы у 3-го углеродного атома и двойной связи при 5-6-ом углеродных атомах, в присутствии ano Е. Так, ano Е оказывал вирааднннЯ и практически равный "просветляющий" эффект па суспензии ХС и метилового эфира ХС и, в значительно меньшой степени, на суспензии холос-тана: при добавлении епо Е оптическая плотность суспензия ХС снижалась с 0,11 до 0,03, т.е. на 73$; метилового &фмра ХС - с 0,12 до 0,04, т.е. на 67S; холостяка - с 0.03 до 0,05, т.е. на 38Ж (результаты 17-30 нкспориментов).

Эти данные указывают как на участие кислорода гидроксильной группы ХС в связывании с апобелком, так и на наличие гидрофобного взаимодействия между ano Е и стершими. Последнее может быть даже преобладаидим.

Таким образом, на основат/и вышеизложенных результатов можно предположить, что связывание ХС апогротешюм Е происходит как за счет взаимодействия кислорода гидроксильноЯ грушп сто-рина и гуанидиновой группы аргининовых остатков апоболка, с одной стороны, так я гидрофобных радикалов ХС и ano Е, с лругоД стороны, что обеспечивает образование более прочного комплекса бе 'ок-ХС.

Акцепция холестерина липопротоидаин шсокой плотности и .возмсашяя роль в этом процесса впспротеина н

Способность ano Е связывать ХС в отсутствие ФЛ вносит оп-ределошше коррективы в понимание механизмов сбразопания липо-протвидных частиц, транспорта ХС и его гфгров между липопрота--идами и отдельными органеллами клеток и тканой и т.д. ¡Гользл исключить тг;ижо, что данный белок, являясь составллшзй ЛПВП, участвует в ХС-акцепторной фушции последних.

Для изучения ХС-акцепторних свойств подфрзкциа ЛГОП, выделенных от лиц с различным уровнем а-ХС в плазме крови, и выяснения возможного участия ano Е в данном прсцоссе были проведены эксперименты с инкубацией подрршший ЛПВГЬ, и ЛПШ3 с эритроцитами, как источником ХС, при наличии или отсутствии ano Е в среде инкубации.

Как видно из рисунка 3, при инкубации с эритроцитами под-

Рис.3 Содержание ХС в подфракциях ЛПВП при их инкубации с эритроцитами и ano Е

фракциЯ ЛПВП, выделенных от лиц с нормальным уровнем а-ХС, наблюдалось достоверное увеличение содержания ХО только в ЛПВПд-частицах. В присутствии ano Е уровень ХС в плотности ЛПВПд возрастал еще в большая степени.

Исходя из этих данных, можно предположить, что у лип с нормо-а-липопротеидемиеЯ захват ХС из клеточных мембран осуществляется, главным образом, ЛПВПд-частицама, преозладагаими в спектре ЛПВП и обогащенными апопротеином AI (Денисенко А.Д. и соавт., 1981; Перова Н.В. и соавт.. ГЭ80; 1385)В литературе, однако, имеются данные о том, что спин-меченый ХС встраивается как в JmBILj, так и в ЛПВП3, выделенные из плазмы крови лиц с нормальным уровнем а~ХС (Рууге Э.К. и соавт., 1933). Поэтому нельзя с определенностью сказать, что в условиях 1л vivo под-фракция ЛПВП^ не будет обладать ХС-акцепторшми свойствами.

При инкубации эритроцитов с подфракциями ЛПВП, выделенными от лиц с пониженным уровнем а-ХС имелась тенденция к некоторому захвату ХС лишь частицами ЛЛВТЬ,. Апопротеин Е не влиял на этот процесс.

Как следует из литературы, при инкубации пто-о.-липопро-теидемическоЯ сыворотки с фибробластами, нагруженными ХС, отмечалось достоверное уменьшение доли подфракций ЛПВПЗЬ и ЛПВП3с и 'увеличение доли только подГрвкции ЛГВП2а- Доля частиц ЛПВПза и ЛПВП2Ь практически не изменялась (Шахов D.A. и соазт., ГЭ8Э; Сердюк А.П. и соавт., 1999, 1990). По мнению Шахова и соавт. (1989) существует определенный метаболический блок, пропятству-щий превращению частиц ЛПВПдд в ЛПВпръ, и последних в ЛПВП^. Это должно приводить к снижению ХС-акшпторной функции ЛПВП при гипо-а-холостеринемии.

Изучение ХС-акцепторных свойств ЛПВП, выделенных от лиц с высоким уровнем а-ХС, показало, что обе подфракции ЛПВП не акцептировали ХС из эритроцитов в условиях нашего эксперимента. Добавление ano в в среду инкубации но оказывало влияния на данный процесс. Следует также отметить, что в ряде экспериментов наблюдалась даже отдача ХС подфракциями ЛПЗП, выделешшми от лиц с гипер-а-липопротеидемией, на эритроциты.

Известно, что при птер-а-лшопротеидемии в плазме крови увеличивается концентрация общей фракции ЛПВП. главным образом за счет ЛТГОП-»чпстин. Перенасыщение ЛПВП холестерином долото

цриводить к понижению их способности акцептировать ХС (Денисенко А.Д. и соавт.. 1ЭЭ1; Перова Н.В. и соавт., 1980, 1985). Нельзя исключить, однако, и возможности потери фермента ЛХАТ при выделении субфракций ЛПВП методом последовательного ультрацентрифугирования, в результате чего ЛПВП-частицы утрачивают ХС-акцепторную способность.

Исходя из получешшх нами дашшх о захвате ХС из эритроцитов подФракцией ЛПВПд, выделенной от лиц с нормальным уровнем а-ХС, казалось целесообразным более детально изучить ХС-акцепторные свойства именно втой подфракции ЛПВП.

Выло показано, что возрастание ХС в ЛПВПд при инкубации отих ЛИ с эритроцитами происходило, главным образом, за счет неэстерифицированного ХС - на 39% (Табл. 3). Увеличение при атом радиуса ЛПВПд-частиц с 3,99 нм до 4,60 нм, обнаруженное методом корреляционной лазерной спектроскопии, свидетельствует о возможном превращении отих частиц в ЛПВГ^-подобныв частицы.

Добавление uno Е в среду инкубации способствует еще большему увеличению в плотности ЛПВПд содержания неэстерифицированного ХС (почти в 2 раза по»сравнению с контролем) и менее выраженному увеличению эфиров ХС (на 48%) (Табл.3). Однако, достоверного увеличения размера ЛПВПд частиц при этом не наблюдается, что свидетельствует об отсутствии превращения ЛПВПд в богатые ХС липопротеиды в условиях нашего эксперимента.

Нарастание содержания неэстерифицированного ХС и его эфиров. во фракции с плотностью ЛПВПд при инкубации ЛПВПд с эритроцитам и ano Е без увеличения размера частиц указывает на возможность связывания эфиров ХС ЛПВПд-частиц апопротеином Е с флотацией образующегося комплекса ario Е-ХС в плотности ЛПВПд и захватом липопротеидами высокой плотности дополнительных количеств ГОХС из меток.

Для подтверждения данного предположения были поставлены эксперименты с инкубацией ЛПВПд-частиц с ano Е. Было показано, что в присутствии белка наблюдается значительное'снижение содержания ЭХС в ЛПВПд-частицах. При этом уменьшение. размера частиц ЛПВПд наблюдалось лишь в том случае, когда отношение ЭХС/ГОХС в последних превышало 6,0* (Табл. 4).

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что ano Е способен забирать ЭХС из ЛПВПд-частиц, обогащенных

Таблица 3

Влияние апопротеина Е на захват ХС подфракцкями ЛПВПд при 4-х часовой инкубации апобвлка с лшюпратсид&ми и эритроцитами (результата 6 опытов)

Условия о:я1та Содержание ХС ьо фракции с плотностью ¡1=1,21 г/глл, изолированной после инкубации (¡¿г/мл) зхс/нэхс Концентрация Селкй в ЛПВПд (МГ/МЛ) Радиус ЛПвПд-частиц Нш (нм)

КЭХС эхе

0,03210,001 0,20110,018 6,90 1.47 3,9910,17

2. ЛПВПд у эритроциты 0,04710,001 р1<2<0,01 0,23810,017 п.л. 5,06 1,46 4,60±0,2Х

2. 'ЛНП3 эритроциты 0,06010,001 р1 2<.0,01 0,29710,013 р1>30.01 Р-, п Н.д. 4,55 1,59 4,1110,22

ТвОлица 4

Вштшв шюнротеина Е на содержание холестерина 'в ЛПВПд при 4 -х часовой инкубации белка с липопротеидами

Содержание холестерина Радиус

Условия N опита в 6=1,10-1,21 г/мл, иэолиро- ЭХС/НЭХС частиц

опыта ванной после инкубации (мг/мл) (нм)

НЭХС . эхе

ЛИЬПу I 0,076 0,328 . 4,3 4,33

2 0,065 0,398 6,1 3,82

а 0,054 0,374 6,9 3,97

0,06510,006 0,367*0,020

ЛШЗ!^ I 0,065 0,289 4,4 4,38

| апд Е 2 0,072 0,321 4,1> 3,30

3 0,055 0,300 5,5 3,37

0,06410,009 0,30310,009

н.д. р<0,.05

встерифицированным ХС.

Следует также заметить, что данный белок может захватывать НЭХО из мембран эритроцитов: при инкубации ano Б с притрошп >'чи содержание ХС в клетках уменьшалось с 0,980*0,06 до 0,Я20Н),05 мг/мл "упакованных" эритроцитов или с (I,19*0,12)«10"13 до (I,I3t0,09)«I0~13 г/клетка (результаты 4-х опытов). Одногф<'м'Ч! но в той же мере наблюдался прирост ХС в среде инкубации.

Захват ХС апопротеином Е из естественных источников (ЛИ или мембран клеток) свидетельствует о том, что этот airad лек мокат участвовать в транспорте ХС из клеток периферических тканой в "печень, между отдельными клетками различных органов п тканей, в акцепции ЭХС из ЛПВП-чэстиц при определенных условия*. - абеталипопротеидемии, дефиците ЭХС-пероносятего белка или я условиях перегруженности клеток эфирами ХС, выполнил таким образом, роль запасного шунта при различных нарушениях липидно го обмена.

ВЫВОДЫ

1. Апопротеии Е, выделенный из ЛПОШ плазмы крови человека и кролика, в условиях In vitro связывает холестерин с образованием комплекса апопротеин-холестерин.

2. Взаимодействовать с ХС способны и некоторые другие белки и даже, отдельные аминокислоты. Лпжную роль при втлм играют гуанидиновые группы и Б-пминогруппы атих соединетт, а таете вторичные структуры белков, в частности, амЦтатные а-сттрапн в молекуле апопротаинов.

3. Установлено важное значение арппшновях остатков шго-протеина Е, гидроксила холестерина, а тоете гидрофобных участков стерина и апобелкп во взаимодействии ХС с аиопротоююм Е. Предполагается, что формирование комплекса апопротеин Е-холестерин происходит за счет образования водородных тязей и (или) ион-дипольного взаимодействия между кислородом гил^хжсилв ХС и гувшийтновыми групп;»«! аргинином* остатков японротеинп, а также гидрофобного взаимодействия алифатической цепи хол°сторн-на с неполярными боковы:.П1 цепями аминокислот тюо«лка.

4. Изучение акцепции холестерина по^рукцияии ЛПРЦ и роди ппопротоина Б в этом процессе показало, что у лиц с нормгш-нпм

уровнем а-холестерина захват ХС из эритроцитов осуществляется нод1>ракцией ЛПВПд. Данный процесс сопровождается увеличением размера ЛПВПд-частиц■с превращением их в ЛПВГ^-подобные частицы. Подфракции ЛПЕП, выделенные от лиц с низким или высоким уровнем а-ХС, не способны забирать ХС из эритроцитов в условиях нашего эксперимента. Добавление апопротеина Е в среду инкубации ЛПВП с эритроцитами не влияло на ХС-вкцепторные свойства под-фракций ЛПВП, выделенных от лиц с различным уровнем а-ХС.

б. Показано, что впопротеин Е акцептирует неэстерифициро-вашшй ХС из эритроцитарних мембран и ЭХС из ЛГОПд-частиц, обогащенных эфирами ХС, с уменьшением размера последних.

Список основных работ, опубликованных по теме диссертации

1. Климов А.Н., Титова Г.В., Кожевникова К.А., Клюева H.H., Смирнова Е.В. (Белова Е.В.). Взаимодействие холестерина с полипептидами и аминокислотами // Биохимия.-1982.-т.47,N2,-С.226-232.

2. Kllmov A.N., Kozhevnlkova к.A., Klueva N.N., Smlrnova E.V. (Belova E.V.). The cholesterol-apoproteln E complex // 6th Intern. Symp. on Atherosclerosis, Berlin (West.), 1982, N476.

3. Климов А.Н., Кожевникова К.А., Клюева H.H. Смирнова Е.В. (Белова Е.В.), Комаров Е.В., Викторовский И.В., Белякова Ю.Г. Роль структурной организации апопротеина Е в связывании холестерина // Молек. биология.-1984.-т.18,N2.-С.404-409.

4. Климов А.Н., Кожевникова К:А., Клюева H.H., Белова Е.В., Денисенко А.Д. Взаимодействие полипептидов с холестерином // Во1ф. мед. химии.-1344.-т.30, вып.3.-С.86-90.

5. Носкин В.А., Шмелев Г.Е., Ломакин A.B., Петровэ-Маслакова Л.Г., Парфенова .Н.С., Белова Е.В., Климов А.Н. Конформационнуе изменения липопротеидов высокой плотности в процессе насыщения холестерином // Биополимеры и клетка.-1986.-т.2,N6.-С. 293-301. " : " :

6. Кожевникова К.А., Петрова-Маслакова Л.Г., Парфенова Н.С., Белова Е.В., Трюфанов В.Ф., Носкин В.А., Ваврин В.З. Акцепция холестерина липощютеидами высокой плотности у лиц

о дис-а-липогтротеидемией и возможная роль в этом процессе апопротешш Е // Еопр. мед. химии.- 198Э.-т.35,К4.-с.43-4в.

7. Кожевникова К.А., Гйтрова-Мослакова Л.Г., Боловл К.П., ПгрЗзшаа И.О.!. Юшим» й.й. Учясти« икяцжтн'л*« Я р

тр-аНС1!СГ:-ГЭ Е^крор ЯвлеСТ&рВИЙ // йф. 0ЯСГЛ"1. яурн.-1Р69. • 7.61, ГС, -С. 42-47',

8. ксж? Д.II,, Шг-яшове К.А.» Кго:»ва П.П., к.В. Сгягавшю аалтстс ршг?, '-2 /.I // Е:глс?,<пя.~ IГ02. -т. С7 з гаи. Л. -О„ г, К -б til .,

K1ÍDC7 л.З., ItosfiomíísoTO , Г'Гавта R.B., Celova S.T. Оп £йе of sAolesíej-ol irríeraotion wttfo apoilpoprotelns

í,¿ eral a // Ctiem. Jftya. oí Ltpida.-í.