Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Иммуноферментный анализ сывороточных апопротеинов А-I, В и Е в условиях стресса

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Иммуноферментный анализ сывороточных апопротеинов А-I, В и Е в условиях стресса"

N б ОД

Т С 1 Г5П

о ¿-.Па ..".Ч/- РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ ----------ИНСТИТУТ БИОХИМИИ

на правах рукописи

ПОТЕРЯЕВА ОЛЬГ/» НИКОАдЕРНА

УДК 577 112.656:616.153/078.3

ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ СЫВОРОТОЧНЫХ АПОПРОТЕИНОВ А-1, ВИЕВ УСЛОВИЯХ СТРЕССА

03. 00. 04. - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Новосибирск 1933

Работа выполнэна в лаборатории медицинской биотехнологии Института биохимии СО РАМН

Научные руководители - академик РАМН, профессор Л. Е. Панин доктор медицинских наук, профессор В. И. Феденков Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Т. А. Короленко кандидат биологических наук М. И. Душкин

Ведущая организация - Институт клинической кардиологии ВКНЦ РАМН

Защита диссертации состоится" тН1993 г. в 10 час на заседании специлизированного Ученого Совета К 001.37.01. Института биохимии СО РАМН по адресу: 630117 Новосибирск, ул. Академика Тимакова, 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии СО РАМН

Автореферат разослан "У" I* 1993 г.

Ь» &

Ученый секретарь

специализированного совета ^т.,

кандидат медицинских наук £' О^-г-^-С^Г'Г. Филатова

- 3 -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследований. Проблема адаптации при действии на организм субэкстремальных и экстремальных факторов является одной ив центральных в современной медико-биологической науке (Панин Л. Е., 1978; Казначеев EIL , 1980; Меерсон Ф. 3. , 1985).

Существенным моментом в сложной перестройке зндокрикно-метаболических вааимотношений при стрессе является изменение содержания в крови липопротеинов и их спектра. Известно, что взаимодействие и поглощение липопротеинов клетками определяются прежде всего входящими в их состав апопротеинами. Апопротеины обеспечивают транспорт холестерина С Климов А. Н. , 1980), рецеп-торное узнавание липопротеинов различными клетками (Brown, Goldstein. 1979; Van Berkel е. a , 1980), изменяют активность ряда внеклеточных (Fielding е. а., 1972; Dolfin, 198Б) и внутриклеточных ферментов (Панин Л.Е. , 1983; Панин Л. Е. и др. 1991).

Вопросы, касающиеся изучения апопротекнов в условиях напряжения организма, вплоть до настоящего времени оставались вне сферы внимания исследователей. Имеются единичные работы, в которых изучалось влияние голодания на продукцию апопротеинов у лабораторных животных (Davis е. а. , 198Б; Sherman, Weinberg 1988; Kim е. а. , 1989) или влияние непродолжительных физических упражнений на содержание апопротеинов в крови у людей (Krauss. 1977; Berge, а., 1986, Fol in е. а 1988; Lamon-fava 19881. Данных об изменении апопротеинового спектра крови при стрессе как у человека, так и животных в доступной нам литературе мы не встретили. До сих пор не изучены изменения апопротеинового спектра в восстановительный период после стресса. Недостаточно исследована роль липопротеинов, и тем более апопротеинов, в компенсаторных реакциях организма при длительном охлаждении.

исследований изучить особенности изменений содержания ano A-I, ano В и ano Е в сыворотке крови у человека и животных при действии на организм субэкстремальных и экстремальных факторов, провести сравнительный анализ этих изменений с изменениями липопротеидного спектра крови и определить их информативную значимость в системе адаптационной перестройки липидного обмена.

Для достижения этой цели были поставлены следующие аадачи:

1. Провести оптимизацию метода иммуноферментного определения апопротеинов, включая получение и идентификацию антигенов и антител, выбор рабочих режимов, способов обработки сыворотки и другого биологического материала для более полного выявления антигенных детерминант.

2. Выявить изменения в содержании апопротеинов A-I и В в крови у людей в условиях Крайнего Севера и Антарктиды с целью диагностики некоторых предпатологических состояний.

3. Изучить влияние интенсивной физической нагрузки на содержание апопротеинов А-I и В в сыворотке крови у мужчин и женщин в динамике длительных лыжных переходов в условиях высоких широт.

4. Изучить особенности изменений содержания апопротеинов A-I, В и Е в сыворотке крови крыс при действии на организм различных стрессовых факторов: холод, интенсивная физнагрузка, Еключая восстановительный период после нее.

5. Исследовать влияние адаптивных гормонов на синтез и секрецию алопротеина A-I гепатоцитами крыс в опытах in vitro.

Основные результаты исследования, их научная новизна.

Получены собственные антигены и антитела для тИФА апопротеинов А-I и В в биологических средах. Показана иммунохимичес-кая гетерогенность антигенов человека и крысы. Предложен новый способ химической обработки-сыворотки крови диметилсульфоксидом для более полного выявления антигенных детерминант аг.опротеина A-I (Авторское свидетельство N- 1737340).

Впервые выявлены особенности изменения в крови содержания апопротеинов А-1 и В у людей в условиях высоких широт. Показано, что пол влиянием неблагоприятных условий окружающей среды формируются Факторы риска ИБС (снижение ¡чпо А-I и увеличение алопротеина В, уменьшение отношения ano A-1/апо В). У полярников Антарктиды впервые выявлена гипоапопротеинемия. Обнаружено изменение почечного барьера, для которого характерно появл^ни.-апопротеинов A-I и В в моче. Экскреция апопротеинов усиливалась при физической нагрузке. Предложен способ количественной оценки этих нарушений по содержанию в моче белков с низкой Cano A-I) и

еысокой (ano В) молекулярной массой. Показано, что данный способ весьма информативен для оценки степени нарушения фильтрации и резбсорбцйи белков с различной молекулярной массой в почечных канальцах у больных с воспалительными заболеваниями почек.

Показано благоприятное влияние оптимального рациона по сравнению с углеводным на содержание ano Л-I и ano В б крови у людей, проживающих в условиях Заполярья. Острые воспалительные процессы являются важным обусловливающим фактором, влияющим гл содержание ало А-1 б крови.

Выявлена специфика изменений содержания ano А-1, В и Е я пнвопотк^ крови у крыс под влияй::::.: фпзиЧегкоЛ нагрузки и холи-лонпг" отрооса. сркдотольст'угацзл о раскол род; зтих апопротеи-нов в развитии компенсаторно-приспособительных реакций организма.

В опытах in vitro на культуре гепатоцитов впервые показано, что гидрокортизон повышал синтез и секрецию ano А-1. Инсулин не оказывал влияния на продукцию этого белка, тогда как гидрокортизон с инсулином, добавленные вместе, увеличивали ее практически в 2.5 раза. Впервые обнаружено наличие ano А-Т нм-мук^решггшшогти в хроматине гепатоцитов крыс. Содержание апс А- ' тр«ккркпционнс-активном хроматине и ядерном матрнкео «к:,, ьше, ч---м ^о фракциях суммарного и репрессированного хромат n:rt

Те еретическое значение работы заключается б изучении р-^г-л ¡"■чг!личных апопротеинов в развитии компенсаторно-приспособител* ных pea-кий оргакпэма при действии на него чрезвычайных ;.*у<яра-«игелей.

Пр"'.кт:г¡едкое значение работы состоит в оптвмигации метода tK'JA. который дает возможность количественно определять содержание апопротеинов AI. В и Е в биологическом материале, включая к;> >ы>. мочу, ткани и клетки. Высокая чувствительность г о

:.-ьоляет определять апопротешш при содержании их в проба< ''- .

Предложен новый способ химической обработки сыворотки крови. позволяющий одновременно определять количество апопротеинов А-I и В в одних и тех же разведениягсыворотки крови.

Ланнкй метод о успехом был применен нами дли оценки •••• -нния почечного барьера (фильтрации и р® абсорбции • 1

личной молекулярной массой! как у эдсровкх людей н

стресса, так и у больных с почечной патологией. Он позволяет обнаруживать их следовые количества, что особенно важно на ранних этапах развития почечной патологии. Определение алопротеи-нов в моче показывает, что в качестве критерия переносимости нагрузочных проб может быть использовано исследование содержания апопротеина A-I в моче.

Положения выдвигаемые на защиту: Г. Предложенный метод для иммуноферменгного определения апопро-теиков пригоден для количественной оценки последних в сыворотке крови, моче, клетках, субклеточных структурах и другом биологическом материале. Метод может использоваться для решения как теоретических, так и клинических задач.

2. У человека под влиянием с.убэкстремальных и экстремальных факторов высоких широт изменяется соотношение в крови ano A-I и ano В: увеличение последнего сопровождается сдвигом липопротеи-нового спектра в сторону атерогенных форм ЛПНП и ЛПОНП с одновременным снижением ano A-I. Физическая нагрузка в этих же условиях увеличивает содержание ano A-I.

3. Существует специфика изменений содержания апопротеинов A-I, В и Е в крови животных, зависящая от особенностей действия на организм чрезвычайных раздражителей и которая свидетельствует о разной роли их в системе адаптационных сдвигов организма.

4. Инсулин потенциирует э(№ект гидрокортизона, связанный с усилением продукции апопротеина A-I гепатоцитами крыс в условиях in \r!ilo.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на 50-й итоговой научной конференции молодых ученых"Актуальные проблемы теоретической и клинической медицины"(Новосибирск, 1909), Всесоюзной конФеренции"Здоровье человека в Сибири"(Новосибирск, 1989), X Всесоюзном симпозиуме"Структура и Функции клеточного ядра (Гродно, 1990), 52-й научной конференции молодых ученых (Новосибирск, 1991), Школе-конференции молодых ученых"Механизмы повреждения и регуляции восстановительных процессов (Новосибирск, I99Í).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ и получено авторское свидетельство № Г737340.

Объем работы. Диссертация написана на 179 страницах и состоит из введения,- литературного обзора, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения, выводов и списка использованной литературы (отечественных и иностранных источника!. Работа содержит 23 таблицы и 22 рисунка.

Диссертация выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ Института биохимии РАМН, номер государственной регистрации темы 056645.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования. Мы применили метод непрямого тИФА для количественного определения апопротеинов А-1 и В у доноров г. Новосибирска. Всего в группу вошли 41 человек (мужчины и женщины), в возрасте от 21 до 50 лет, без изменения ли-пидных показателей сыворотки крови.

Обследовали полярников Антарктиды - зимовочный состав 33-САЭ обсерватории Мирный ( 30 человек). Исследования проводились дважды: в начале рим'ьки (май - июнь) и после окончания I октябрь-н^я'Чч-''. В качестве дозированной физнагрузки использовали степургометрию. Изучали экскрецию апопротеинов с мочой в состоянии покоя и после дозированной Физической нагрузки.

Также были обследованы у участниц женского лыжного Антарктического перехода (группа "Метелица"!. Б условиях длительного трансарктического лыжного похода СССР Геверный Полюс - Канада обследовались 13 человек.

Для изучения особенностей изменения апопротеинов в сыво-ьлтк-- »•ьп-и у притлт.' населения яттол^-ьч обследовали 40 чело-ь^к. мужчин и женщин, жителей г. Норильска, в ьозрасте 18-49 лет с различными сроками ппрадг-'--;;:,! щ . Ч'Вере и 50 мужчин, в возрасте 18-19 лет. имеющих стал пребывания на Севере не более одного года. На последней группе изучались два рациона с предполагаемыми антистрессорными свойствами. До начала эксперимента все испытуемые получали углеводный рацион (6: ж: у - 10:26: 64. 4600 ккал). Затем добровольцы переводились на сбалансированные рационы: оптимальный ( 16: 40: 44 . 3800 ккал) и белково-липидный (20:50:30 . 3800 ккал). Оптимальный рацион разработан под руко-

водством JL Е. Панина для пришлого населения Азиатского Севера (Панин Л. Е. , 1983).

В условиях эксперимента на крысах изучали апопротеиновый состав крови при стрессе. В качестве модели острого стресса использовали физическую нагрузку и холод. Физическая нагрузка включала плавание в аквариуме в течение 3,5 ч с грузом, составляющим 4% от массы тела животных, при температуре воды 33 С. Не менее важным явилось изучение восстановительного периода после физнагрузки, продолжительность которого составляла 6 часов. Роль белкового синтеза в изменении содержания апопротеинов в восстановительный период оценивали с помощью актиномицина D I 0,5 мг/кг).

Влияние длительной холодовой адаптации на содержание апопротеинов A-I, В и Е в сыворотке крови изучали в модели Харта. Спектр апопротеинов в сыворотке крови определяли через 1, 5,10, 15.20 и 49 суток пребывания животных в камере при 5°С.

Применяя метод культивирования гепатоцитов, изучали влияние инсулина и гидрокортизона на продукция апопротеина A-I.

В работе испольаовали следующие методы:

Иммукоблоттинг (Tovey, 1987), двойная радиальная иммунодиф-фуэия (Ouchterlony, 1958), выделение иммунноглобулинов из сыворотки крови кролика (Фримель Г., 1987), гель-фильтрационная и ионообменная хроматография, электрофорез в ПААГ с додецилсуль-фатом натрия ( Laemmli, 1973), выделение липопротеинов сыворотки крови изоплотностным ультрацентрифугированием (Hatch, Lees, 1950), культивирование клеток печени (Seglen, 19731, выделение ядерных структур (Gottesfield, 1376), разделение липопротеинов в крови методом дискового электрофореза в ПААГ ( Поляков JL М. . Панин Л Е. , 1975).

Общий холестерин в сыворотке крови определяли по реакции Либермана-Бурхарда, (/-холестерин - по методу Плыл, триглицери-ды - с применением наборов фирмы "Лахема", ЧССР (Колб В. Г. . 1982) и белок - по методу Лоури (1951).

Твердофазный иммуноферментный анализ апопротеинов выпол-полняли методом непрямого тИФА (Lin, 1986).

В работе расчитывали коэффициет атерогенности ( ХС общий ХС ЛПВП/ ХС ЛПВП) и индекс Авагаро (Avagaro. 1980).

- 9 -

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Оптимизация метода тИФА для определения апопротеинов A-I

и В у человека и крысы Разработка метода включала получение и хроматографкчеекую очистку антигенов и антител, их идентификацию, выбор оптимальных рабочих режимов для используемых реагентов и конъюгатов, изучение влияния различных способов предварительной обработки сыворотки крови и другого биологического материала для более полного выявления антигенных детерминант A-I.

Апопротеины выделяли из соответствующих классов липопроте-инов методами хроматографии. Чистоту выделенных апопротеинов оценивали с помощью диск-электрофореза в ПААГ. Хроматографичес-ки очищенный ano A-I при электрофорезе мигрировал как гомогенный белок с молекулярной массой 28000 Да (рис.1). Особенностью выделения апопротеина В было использование додецилсульфата натрия во всех буферных системах для получения солюбилизированной формы. Ало В мигрировал в геле двойной полосой, в виде двух основных *юрм ало В -100 и ano В-48 (рис.2).

Для идентификации антител использовали реакции деойной радиальной иммунодиффуэии и иммуноблоттикг, по чувствительности значительно превосходящие метод Оухтерлони. На рис.3 видно, что антитела к ano А-1 человека (в центре) давали одну полосу преципитации с очищенным ano А-1 и с сывороткой крови человека. Отсутствовала преципитация с ano В, ЛПНП человека, с ВСЛ и сывороткой крови крыс. С помощью иммуноблоттинга показано, что с антителами к ano А- I человека взаимодействовал только ari. А-1 человека;рис. 4). Полученные результаты свидетельствуют об имму-нохимической гетерогенности ano A-I крысы и человека.

Известно, что без дополнительной обработки сыворотки толь ко 10* антигенных детерминант А-I доступны для взаимодействии антителами (Schonfeld. 1974). Для более полного выявления антигенных детерминант ano A-I, скрытых липидным окружением, нами было предложено несколько различных способов химической обработки сыворотки (рис.5). Наилучшие результаты получены с ек^—от кой. обработанной тетраметидмочевиной (ТММ) и диметилсу^!-

Рис. 1 Рис. 2

Рис.1 Электрофорез в ПААГ ano A-I. 1 - ano A-I; 2 - суммарные ano ЛПВП; 3 - низкомолекулярные белки-стандарты. Рис..2 Электрофорез в ПААГ ano В. 1 - ano В; 2 - ало Е; 3 - суммарные апо-ЛПБП.

1

tí р ю

5 з h

Рис. 3 Рис. 4

Рис.3 Определение специфичности антител с помощью двойной радиальной иммунодиффузии по Оухтерлони. В центре-антитела к ano A-I 1 - ano В человека; 2 - ЛПНП человека; 3 - БСА; 4 - сыворотка крови человека; 5 - ano А-1 человека; 6- сыворотка крови крыс. Рис.4 Выявление специфичности антител к апопротеину А-I с помощью иммуноблоттинга. 1 - низкомолекулярные белки-стандарты; 2 - суммарные ano ЛПВП; 3 - электрофоретический перенос ano-ЛПВП на нитроцеллюлозную бумагу. Обработка антителами к ano А- I. Окраска - 4-хлор-1-нафтолом.

94 кД)--С?кДа—-43кДа—- -ЗЗкДл— ■

L'OK Л ~~

1 2

^ 0.9

I :.-

Рис. 5 Кривые титрования цельней сыворотки, обработанной ДМСО( 11,

ТММ(2). диметилформамидом(З). фор-мамидомС41сыворотки без обрабст-

сидом (ДМС01. Оказалось, что обработка ДМСО не только не уступает методике с ТММ. но и имеет некоторые преимущества. В частности. добавление к сыворотке крови ТММ приводило к частичной денатурации ano В и снижало процент открытия ало В почти в два раза. Этого не происходило при обработке сыворотки ДМСО. Предлагаемый способ, расширяя арсенал мтояся» оценки апопротелнов. п.гзголяе-т опр^л-лять нпп А- ; и ano i.' в одних и тех же обр':. :;чх

ойзр«4 линиях ••ыьо,*угок. чт* упрощу г технику опр-деления .ш. i'.'Tí-üH'iL- .лвте ;-.:№>:■ о ¡-ид? гель от г-о ¡.737.Й40'-.

Обследование клинически здоровых людей (зимовочный состав •33 ОАЭ в обсерватории Мирный) показало, что у полярников уже в начала зимовки 'спустя два месяца после прибытия и Антарктиду1 отмечалось высокое содержание в крови триглицеридоп. общего ХС. а-ХО и высокое значение индекса атерогенности. В содержании апопротеина А-I мы не обнаружили достоверных различий, однако наблюдалось выраженное снижение ano В (табл. 1). в ходе пребывания б Антарктиде •.-•дл; «пнио сг-.щ.-го N"- v -,-.-п;.'7--к»-,вИ1 спектр сыворотки крови суг» i -i-.---" •■ - - • - -,;in->

ano A-I к концу зимовки снижалась на Лтлпны^иил лилл ,л«-наружено уменьшение содержания ano Г-. 11- .--. cw*. • • • '■ .'--то

'i'MMyüOvS'-pMcMTHHrt аналия содержания апопротеинов A- i и

? С|,!Б0ро7,.;е кгоьи v ЦеЛОрека б условиях высоких ¡вир

индекс Авагаро оставался на высоком уровне, превышая контрольное значение в 1,4 раза.

Увеличение холестерина, триглицеридов и снижение ano A-I формирует комплекс факторов, способствующих развитию атеросклероза. Однако, если процесс адаптации развивается благоприятно, то можно наблюдать увеличение холестерина, снижение ало В, нередко опережающее ano A-I и повышение индекса Авагаро.

Таблица 1_

Сопоставление средних величин содержания апопротеинов А-1, В и отдельных холестериновых фракций сыворотки .и доноров (г. Нэвосибирск) и полярников Антарктиды

NN "Показатели Новосибирск Полярники Антарктиды

в начале зимовки (май-июнь) в конце зимовки (октябрь-ноябрь)

1 Ало А-1, г/л 1,05+0,10 1,11+0,04 0,94+0,03**

2 Ало В, г/л 0,83+0,05 0,66+0,02* 0,56+0,02**

3 Ало А-1/апо В 1,22+0,04 1,70+0,08*** 1,61+0,10***

4 Общий холестерин,

ммоль/л 4,0+0,1 5,9+0,2*** 5,7+0,2***

5 а-холестерин,

ммоль/л 1,3+0,1 1,6+0,1*** 1,6+0,1***

6 индекс

атерогенности 2,2+0,2 2,9+0,4* 2,9+0,4*

Достоверность: здесь и далее *-Р<0,05, **-Р<0,01, ***-Р<0,001 по отношению к группе доноров.

В результате изменения гормональной регуляции у полярников Антарктиды развивается "диабет напряжения", для которого характерны снижение почечного барьера и появление сахара в моче (Панин Л Е. ,1983). Нами были предприняты попытки обнаружения апопротеинов в моче полярников. Для понимания полученных результатов анализировались образцы мочи доноров и больных с хронической почечной недостаточностью. Показало, что у здоровых

людей в моче отсутствовал апопротеин В, тогда как ano A-I выявлялся в небольших количествах практически всегда. Для сравнения следует отметить, что у больных с почечной патологией содержание ano А-I в моче в 117 раз превышало содержание данного белка в контрольной группе лиц. Ало В также обнаруживался в моче в значительных количествах (табл.2).

У полярников содержание ano А-1 в моче превышало в 16 раз контрольные величины как в начале, так и в конце зимовки. Дозированная физическая нагрузка приводила к дальнейшему увеличении ano А-I в моче на 76% в начале гимовкй и на Í7Z - в конце зимовки (табл. 3).

Таблица 2

Содержание алопротеина А-2 и В в моче доноров и больных с хронической почечной недостаточностью.

Обследуемые группы Ano А-I, мкг/л Ало В, мкг/л

Доноры (контроль) 33+3 отсутствует

Вольные 3848+211*** 1528+315***

Таблица 3

Содержание апопротеинов А-I и В в моче полярников Антарктиды в состоянии покоя и физнагрузки

В начале зимовки В конце зимовки

Апопротеины, покой физнагрузка покой физнагрузка

мкг/л 1 2 3 4

Ano А- I 534+57 938+118 572+75 851+99

Ano В 18+1 17+1 16+1 17+2

Достоверность: для ano А- I Р1-2<0,01, РЗ-4<0,05.

Исходное содержание апопротеина Б в моче у полярников было небольшим и не зависело от функционального состояния организма (покой или физнагруэка), а также времени пребывания в Антарктиде. Таким образом, увеличение в моче ano А-1 и появление ano В свидетельствует об изменении почечного барьера у полярников.

Выявлены изменения содержания апопротеинов в сыворотке крови у участниц антарктического лыжного перехода. При значительных физических нагрузках в условиях Антарктиды концентрация ano А-.1 увеличивалась к концу похода почти вдвое. Аналогичные изменения происходили и в содержании ало В (табл. 4). Во Еремл перехода в сыворотке крови лыжниц также увеличивалось содержание альбумина, мочевины и псевдохолинэстеразы (Гурьева, 1992), что, вероятно, связано с вовлечением основных Функций печени б адаптивные перестройки организма.

Таблица 4

Изменение содержания апопротеинов А-I и В в сыворотке крови у участниц антарктического лыжного перехода группьГ'Метелица"

Ятапы перехода Апопротеины ABC Д

Ало А- I, Г/л 1,27-tO.lO 1,20+0, 10 1, 66+0, Oí-*** 2,36+0,21*** АЛО В, г/Л 0,60+0,03 0,53+0,05 0,71+0,04 1,11+0,06*** Ano А- I/anoB 2,0G>_0, 18 2,26+0.19 3,07+0,24*** 2,00+0.20

Примечание: А -ст. Мирный, В -ст. Комсомольская. С -ст. Восток, Д - г. Москва.

Достоверность по отношению к показателям в точке А.

Длительный лыжный переход у мужчин приводил к снижению ЛПОНП, ЛПНП, ТГ, СЖК, общего ХС и увеличению ХС-ЛПВП (Панин Л Е. , Останина Л С. , 1991). Данные полученные нами подтверждают эти результаты, поскольку снижалось содержание апопротеина В -основного белка ЛПНП и ЛПОНП. Наблюдался сдвиг липопротеинового спектра сыворотки крови в сторону ЛПВП и увеличение апо А-1 (табл. 5). Нужно отметить, что концентрация апо А-1 у лыжников ¿о похода была выше по сравнению с-контрольной группой лиц на

Таблица 5

Влияние экстремальных факторов внешней среды и физических нагрузок на содержание апопротеинов .4-1 и В во время трансарктического лыжного перехода по марпруту СССР-Северный Полюс-Канада

Ano А-I, г/л Ano В, г/л Ano А-1/алоВ

Этапы пути

^ссрг Москва) 1,31+0,06 0,95+0,07 1,44+0,11

Диксон 1,43+0,04 0,96+0.06 1,51+0,09

i 1, S3+Q,Со*** 0,87+0,05 1,96+0,14**

z 1,64+0,08*** 0. 80+0,08* 2,19+0,21**

з 1,66+0,04*** 0,81+0,04* 2,05+0,13**

Канада( Оттава) 1,52+0,07* 0,84+0,04 1,87+0,11

Достоверность по отношению к показателям в Москве.

Таблица 6

Содержание апопротеина А- I и В в сыворотке крови у пришлого насед--ния Азиатского Севера

группы /

населения NN пол Ano A-I, г/л Ano В, г/л Ano А- I/апо В

Новосибирск 1 м 1.05+0,06 0,83+0,05 1,27+0,07

(41) о й- ж 1,06+0,06 0,87+0. 08 1,17+0,04

Норильск о м 1,02+0,05 1,03+0,04 1,04+0,07

( 40) 4 ж 0,98+0,05 0,91+0,06 1,13+0,07

Диксон 5 м 0,83+0,04 0,88+0,03 0,95+0,06

(50)

Достоверность: Р1-5<-0,001 Р1-3<0,001 Pl-3-0,05

Р1-5<0,01

25Z. Очевидно, это связано с длительными физическими тренировками, на что указывают другие авторы (Krauss, 1977; Berg, 1986).

Действие на организм комплекса неблагоприятных факторов климатогеографического и социального характера отражалось на содержании апопротеиков A-I и В в крови у жителей Заполярья (табл.6). Процесс адаптации в этих условиях характеризовался увеличением ало В, что, вероятно, связано с высоким содержанием ЛПНП 'и ЛПОНП. Высокое содержание ano В, низкий индекс Авагаро были особенно характерны для мужской группы населения г. Норильска.

Самое низкое содержание ano A-I наблюдалось в группе лиц с минимальным полярным стажем до 10 лет. В группе мужчин пос. Диксон обнаружено значительное снижение ano A-I при стаже пребывания в данном районе до одного года. В то не время содержание ало В ещэ не отличалось "т группы доноров (г. Новосибирск). В результате уменьшения ano A-I индекс Авагаро у них значительно снижался, свидетельствуя о неблагоприятном влиянии на организм человека первых месяцев пребывания на Севере (табл. 6). По данным Bugugnani е. а. (1988) такой индекс Авагаро отмечался у мужчин в группе больных в первые 24 часа после острого инфаркта миокарда.

Очень важно, что содержание апопротеинов в сыворотке крови можно изменять с помощью рационального питания. Проведенные ис-

Таблица 7

Содержание апопротеинов А-I и В в сыворотке крови мужчин поселка Диксон , находящихся на различных рационах

г-, РАЦИОНЫ

Апопротеины, г/л Углеводный Оптимальный Белково- липидный

Ano A-I 0,83+0,04 0,96+0,06 0,88+0,04

Ano В 0,89+0,03 0,71+0,14** 0,93+0,12

Ало А-1/апо В 0,95+0,06 1,35+0,10*** 1,04+0,09

Достоверность: ** - Р<0,01, ***- Р<0,001 по отношению к углеводной диете.

следования показали, что оптимальный рацион ке изменял липопро-теиновый спектр сыворотки крови, но при этом снижалась концентрация апо 6, несколько повышалось содержание ano А-1 и а л'дчителыю увеличивалось соотношение апо А-1/апо В, что укааы-рчет на °го антиатерогенные свойства (табл.7).

•:. Изменение содержания апопротеинов А-1, В и В ~ условиях эксперимента Опвчние в течение 3,5 часов приводило к повышению соде?-.-.ання а оьжсрстк-? крсзи ЛПВГТ-З на £57, и ало А-1 на 46Х (рис. 6). Количество ano Е после плавания увеличивалось в 1;5 раза. Из-

..■-J.-ТДО Í1 0 С^ДО Г] ~ В------ ^ ---- ~ . ~ . . . -w í/.^l/y.^T^CltlT'^lí ил nroirvim

*, ,; jiiibil, вва у ■■—"jar часть атто £ (^к^л0 'ai? > входит в состав ЛПВП (Eklund, Sjoblon, 1986). Апо В - основной белок ЛПОНП и ЛПНП. Его увеличение в сыворотке крови крыс после плавания составляло 47%, при этом относительное содержание JИЮНИ снижалось до 672. Предполагается, что увеличение апо 3 в сыворотке крови связано с синтезом его в печени и выходом в кровь в составе липопротеиновых частиц, с последующим их растеплением под действием липопротеиновой липазы.

"" ■ ■■ " - у - д j в/ во в'военя . в в'' в у я как гв" г1?^ " т", гс*

.в ав ~т--'ввс в ■ и К оставалось '- в- повьив^нним Евкасков в в г - ■ -

ai: тдро l-t .; т- ь Ь и l в оый^ротк^ крови крыс, вероятие, . 'ai;? а -" с вввоквй ск.срвстьв' синтеза Р., Е-содержа1",кх лкгогго •• -f:.n-y ¡'нт.'наиьнои мкзг>чксЗ работы. Па это указывают рорулц.татч ван-а- вров-дочных исследований (Панин Л. Е. , Шянекая КН.,

вш'пСптвр ДНК-завили .-ого синтеза FKK. актикомицин Д, окнжад; содержание апопротеинов А-I, В и Е в крови. Таким образом, опы-в акт:1»';мнцг.ном Л свидетельствуют о подавлении синтеза апоп-••••--(«н-з печени. было показано, что актиномиш'.н Д. вве-

денный за час до плавания, препятствовал индукции адаптивного синтеза других белков, в частности, глюкозо-6-фосфатдегидроге-нааы, йШ-карбоксикиназы, а также апо В, Е-содержащих липопрсте--в. I Ü чн'н Л. Ii. . Уаянсгая H.H. . 1987). Снижение апо А-1 и еох-••• •MWHHOIV» О''» держания апо 3 и Е в крови в ■ .•ct->ij- •иитгьный период говорит о разной функциональной роли

МКГ/Ш! Ш А-1

600

400

200

ЛПО В

А

1

+

ш

У/УЛ КОНТРОЛЬ | I аИЗНАГРУЗКА

ВОССТАНОВЛЕНИЕ

Ц АОТИНОМИЦИН д

АПО 2

I

Ш

XI

Рис. 6 ИЗМЕНЕНИЕ СОДЁР^АНИЯ АПОПРОТЕИНОВ В ШОРЗТКЕ КРОВИ КРаС 3 ВОССГАНОЗИТПЬНЫЯ ПЕРИОД ПОСЛЕ ФИЗИЧЕСКОЙ НАГРУ.-К;;

- 19 -

исследованных апопротеинов в организме при стрессе.

Изменение содержания апопротеинов в сыворотке крови в процессе компенсаторно-приспособительных реакций мы наблюдали при ¡солодовой адаптации в модели Харта. Концентрация ano Е возрастала на 15 и 16 день адаптации к холоду в 7 и 5 раз, соответственно. Содержание ano Е затем несколько снижалось и к концу 49 иуток оставалось выше контроля на 58% (табл.8).

Изменения содержания ano- В носили аналогичный характер, олько в отличие от ano Е, эти изменения были более умеренными, диаметрально противоположный характер носили изменения содержания апопротеина A-I. В процессе • адаптации к холоду происходило заметное его снижение (к Б дню до 72Х, к 10 дню - до 68%). Затем, на 15 сутки концентрация ano A-I возвращалась к норме, после чего вновь снижалась и к концу 49 суток несколько превышала норму.

Таблица 8

Изменение содержания апопротеинов A-I, В и Е в сыворотке крови крыс в процессе длительной холодовой адаптации

Дни Ano A-I, Ano В, Ano Е,

мкг/мл мкг/мл мкг/мл

к 405+13 122+10 125+7

1 434+23 105+16 134+20

5 293+28*** 221+20** 148+4*

10 274+28** 248+10*** 124+10

15 388+20 235+22*** 816+130***

16 306+12* 192+15** 612+120***

20 250+20*** 142+5 165+1Б*

49 469+28 172+6*** 197+10*

Примечание: к - контрольные животные, достоверность по отяошэ-: нию к контролю.

Изучение молекулярных механизмов действия горюнов, участвующих в стресс-реакциях, проводилось нами на культуре гепато-

цитов в опытах in vitro. Установлено, что скорость секреции ano A-I в культуре гепатоцитов составляет 1,94 нг на мг клеточного белка в час. Под действием гидрокортизона (100 нМ) скорость секреции ano A-I увеличивалась до 3,55 нг на мг белка в час. Это на 83% выше, чем в контроле. Инсулин (100 нМ) в аналогичных условиях не изменял синтеза и секреции ano А-I, однако в присутствии гидрокортизона приводил к дополнительному значительному увеличению продукции ano A-I до 5,3 нг на мг белка в чао, что составляет 265% по отношению к контролю.

Механизм гиперсекреции ano A-I гепатоцитами при совместном применении инсулина и гидрокортизона пока трудно понять. Впервые подобный эффект наблюдали Amatruda с сотр. (1983), изучая влияние инсулина и гидрокортизона на синтез липопротеинов в ге-патоцитах. Инсулин в данных условиях играл роль модулятора, по-тенциирующего эффект глюкокортикоидов.

Опыты с применением меченных по белку липопротеинов показали наличие радиоактивности в ядре ( Поляков Л. М. , Панин JLE. ,1991). ЛПВП в присутствии гидрокортизона и адреналина или только гидрокортизона повышали экспрессию генов в переживающих срезах печени крыс (Панин JL Е. и др., 1990). Этот эффект был назван кооперативным. Из полученных результатов следовало, что ЛПВП и адаптивные гормоны непосредственно принимают участие г поддержании хроматина в транскрипционно активном состоянии. Этс послужило предпосылкой для поиска основного4белка ЛПЕП, апопро-теина A-I, в составе ядерных структур гепатоцитов крыс с помощью иммунохимических методов.

Распределение ДКК по фракциям хроматина было следующим: е репрессированном хроматине не менее 80X, в транскрипционно активном хроматине - 11-15%, а в ядерном матриксе - 3-5%. Количественная оценка ano А-"1-иммунореактивности во фракциях хроматина осуществлялась с помощью тИФА. Оказалось, что содержание ало A-I (ало А-I-иммунореактивность) в суммарном хроматине составляло 60 нг на мг белка фракции, во фракции репрессированного хроматина 52 нг на мг белка фракции, в транскрипционно активном хроматике вдвое выше. Самой высокой она была в ядерном матриксе и составляла 110 нг на мг белка.

Дополнительная информация была получена с помощью иммуноб-

лоттинга. Оказалось,что в хроматине ядер гепатоцитов крыс присутствуют два белка иммунологичееки идентичных алопротеину A-Ir один из них с молекулярной массой 28 кДа, другой - с молекулярной массой около 14 кДа. Первый белок по электрофоретической подвижности соответствует ano А-I. Он присутствует во фракции тоанскрипционно активного хроматина и в ядерном матриксе. Второй, низкомолекулярный белок, имеющий антигенные детерминанты ano А-í, присутствует только в репрессированном хроматине. Роль этих белков в регуляции экспрессии генов остается неясной. Обнаружение высокой ало А-I-иммунореактивности в ядерном матриксе чрезвычайно важно, ибо сегодня последний рассматривается как место РНК-транскрипции или репликации ДНК.

ВЫВОДЫ

1. Предложенный нами метод химической обработки сыворотки крови диметилсульфоксидом приводит к полному раскрытию антигенных детерминант и позволяет одновременно определять содержание нпо А- ! и адо В в одних и тех же разведениях сыворотки.

?.. С помощью оптимизированного нами метода тИФА апопротеи-нов показана иммунохимическая гетерогенность апопротеинов человека и крысы.

3. Физическая нагрузка в условиях Арктики и Антарктиды, связанная с длительным лыжным переходом приводит к увеличению содержания ano А-I в сыворотке крови как у мужчин, так и у женщин. У физически тренированных людей содержание ano A-I в сыворотке крови выше как у мужчин, так и у женщин.

4. Процесс адаптации человека к комплексу субэкстремальных и экстремальных Факторов урбанизированного Севера характеризуется снижением в сыворотке крови содержания апопротеине. А-1 и уьеличением ano В.

5. У полярников Антарктиды в процессе адаптации к неблагоприятным факторам окружающей среды наблюдается увеличений концентрации в моче ano А-1 (м. м. 28 кДа! , усиливающееся при Физической нагрузке. При более глубоких изменениях почетной Фильтрации в моче появляется ало В (м. м. 500 кДа). Равная динамика изменения содержания ano А-1 и ano В в моче позволяет судить о степени повреждения почечного барьера.

6. Апопротеины играют разную роль в развитии компенсаторно--прйспособительных реакций организма при стрессе: интенсивная физическая нагрузка у крыс увеличивает в сыворотке крови содержание одновременно апопротеинов А-1, В и Е. В восстановительный период после нее содержание ano А-1 снижается, а ало В и ano Е остается повышенным. Введение актиномицина D позволяет сделать вывод, что повышение апопротеинов в сыворотке крови связано с индукцией их синтеза. ГЬд влиянием холода у крыс наблюдается снижение в сыворотке крови ano А-1, с одной стороны, и повышение ano В и Е, с другой.

7. Инсулин обладает потенциируицим по отношению к гидрокортизону действием, связанным с увеличением продукции ano А-1 гепатоцитами крыс в опытах in vitro.

8. Обнаружено наличие ало А-1 иммунореактивности в хроматине ядер гепатоцитов крыс. Во фракции транскрипционно активного хроматина и в ядерном матриксе содержание белка выше, чем в транскрипционно неактивном хроматине.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Потеряева О. Н. Получение и иммунохимическая идентификация человеческого апопротеина А-1 //Актуальные проблемы теоретической и клинической медицины: Tea. докл. 50-й науч. конф. молодых ученых. - Нэвосибирск, 1989. - С. 38

2. Потеряева О. Н. , Поляков JL М., Панин Л. Е. Иммунофермент-ный анализ апопротеинов А-1 и В в плазме крови человека // Здоровье человека в Сибири: Тез. докл. Всесоюз. конф.- Новосибирск, -1989. - С. 22-24. о

3. Поляков Л Ы. .Потеряева О. Е , Панин Л. Е. ,Загребельный С. Е , Феденков а И. Твердофазный иммуноферментный анализ апопротеина А-1 в сыворотке крови человека // Лаб. дело, - 1990.- N 6.-С. 1114.

4. Шляков Л. М. ,Кузьменко А. П. , Штернева О. Е , Скрыль Г. UL , Панин Л. Е. Апопротеин А- I-иммунореактивность во фракциях хроматина и ядерной матриксе гепатоцитов крыс // Структура и функции клеточного ядра: Тез. докл. X Всесоюз. симп. - Гродно, 1990.-С. 149.

5. Потеряева О. Е , Харьковский А. В. Влияние инсулина и гидрокортизона на синтез апопротеина А-1 в культуре гепатоцитов

Тез. докл. 52-й науч. конф. молодых ученых. - Новосибирск, 1991. С. 37.

6. Поляков Л. М. , Потеряева О. Е , Панин JL Е. Определение апопротеина A-I методом иммуноферментного анализа // Вопр. мед. химии, - 1991.- Т. 37, N 1. - С. 89-92

7. Потеряева О. Н. , Часовских М. И. , Розуменко А. А. Изменение липидного спектра сыворотки крови у полярников Антарктиды /Механизмы повреждения и регуляции восстановительных процессов: Те?, докл. III школы-конф. молодых ученых. - Новосибирск, 1991.-С. 64.

8. Поляков Л. М. , .Потеряева O.K. Панин Л. Е. Определение апопротеина В в сыворотке крови человека методом твердофазного иммуноферментного анализа //Лаб. дело,- 1991.- N 9,- С. 24-26.

9. Панин Л. Е. , Поляков Л. Ы. , Усынин И. Ф. , Кузьменко А. П. , Потеряева О. К Иммунохимическая идентификация апопротеина А-1 в хроматине ядер гепатоцитов крыс // Биополимеры и клетка.- 1992. Т-8, N 2. - С. 44-49.

10. Панин JL Е. , Поляков Л. М. , Кузьменко А. П. , Потеряева О. Н., Сжыль Г. !!1. Обнаружение апопротеия А- 1-иммунореактивности в хроматике ядер гепатоцитов крыс // Биохимия. - 1992. -Т. 67, N 6. С. 826-832

; 1. Поляков JL М. .Потеряева О. Е , Панин Л. Е. ,Загребельный С. Е Способ определения апопротеина А-1 в сыворотке крови// Авторское свидетельство N 1737340 от i Фе враля 1992 г.

З'\к . '¿2 . "л у . I.' О . 1 !гч . л . i, Ь . Бум. офс • Типография СО НАШ г.Новосибирск 1993