Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль белкового компонента сывороточных липопротеинов (апопротеинов) в регуляции окислительного фосфорилирования в митохондриях печени крыс в условиях стресса

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Роль белкового компонента сывороточных липопротеинов (апопротеинов) в регуляции окислительного фосфорилирования в митохондриях печени крыс в условиях стресса"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ ИНСТИТУТ БИОХИМИИ ■

на правах рукописи

Добронравова Ольга Валерьевна

РОЛЬ БЕЛКОВОГО КОМПОНЕНТА СЫВОРОТОЧНЫХ ЛИПОПРОТЕИШВ

(АПОПРОТЕИНОВ) В РЕГУЛЯЦИИ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО ФООХОРИЛИРО-ВАНИЯ В МИТОХОНДРИЯХ ПЕЧЕНИ КРЫС В УСЛОВИЯХ СТРЕССА 03. 00. 04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Новосибирск-1993

I

Г

- г -

Работа выполнена в лаборатории молекулярной биологии клетки

ИБ СО РАМН

Научный руководитель - член-корреспондент РАМН, профессор Л. Е. Панин

Официальные оппонента- доктор медицинских наук, профессор Грек О. Р. кандидат биологических наук """" Шабалина И. Г.

Ведущая организация - НИИ общей патологии и патофизиологии РАМН

Защита состоится "_"_ 1993 г. в _часов

на заседании Ученого Совета К 001.37.01 ИБ СО РАМН по адресу: 53011? Новосибирск, ул. Акад. Тимакова, 2 С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии СО РАМН

Автореферат разослан "_" _ 1993 г.

Ученый секретарь

специализированного Ученого Совета

кандидат медицинских наук Г- Филатова

- 3 -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Все процессы, происходящие в организма как в обычных условиях, так и при его функциональном напряжении, зависят от энергетического статуса организма, поэтому проблема изучения энергетического обмена, в первую очередь работы митохондриального аппарата, в меняющихся условиях внешней среди давно привлекает пристальное внимание исследователей. Тем не менее, данные литературы о характере перестроек, претерпеваемых митохондриями, весьма разноречивы. Это касается как структурных изменений органелл ( Брустовецкий а Н. и др., 1988, 1990; Мак et al, 1983), так и состояния окислительного фосфорилирова-ния (Кондрашова M. Н., Григоренко Е. R ,1981; Кузьменко Д. И. ,1982; Ferreira & Gil, 1984).

Первым.комплексом реакций, отвечающих на стрессорный раздражитель, является изменение гормонального статуса организма, активный выброс в кровоток так называемых гормонов стресса, которые опосредованно влияют на функциональное состояние митохондрий (Titheradge & Сооге, 1976; Chan et al, 1979; Halestrap et al, 1980). Уже сейчас исследователями выявлен целый ряд соединений, которые играют важную роль е регуляции окислительного фосфорилирования в митохондриях на стадии их функциональной перестройки (Steinar et al, 1986; Csost et al, 198"). Показано, что в условиях стресса происходит активация окисления липидов ( Скудачев Е Е , 1972), энергетический обмен б организме переключается с "углеводного" типа на "жировой" (Панин Л. Е. , 1978, 1983;Quck S Trayhurt, 1990). Возросший в последнее время интерес к липопротеинам крови (ЛП) позволяет по-новому взглянуть на многие аспекты данного процесса, которые ранее были не совсем ясны. Длительное время считали, что основная, если не единственная, функция ЛП - это транспорт триглицеридов и холестерина в организме ( Havel, 1978). Однако, данные последних лет свидетельствуют о том, что ЛП участвуют в регуляции гликолиза и гли-конеогенеза, они способны влиять на стероидогенез и многие другие процессы, происходящие в клетке (Третьякова Т.Д. , Поляков Л.М., 1979; Панин Л. Е., Колосова И. Е. , 1985; Ghiselli et al, 1981). Показано, что проникая в клетки, ЛП способны взаимодействовать со многими клеточными органеллами, изменяя их структур-

ные и функциональные свойства ( Панин Л.Е., Поляков Л.М., 1981; ВасЬоПс еЬ а1, 1978). Основная роль в этих взаимодействиях отводится их белковой части - апопротеинам (Панин и др., 1982).

Эти данные позволяют предположить существование неизвестной ранее липопротеиновой регуляции работы митохондриального аппарата клетки в условиях адаптивной перестройки энергетического обмена под воздействием стрессирующих организм факторов.

Цель исследования: изучить регуляторные эффекты липопротеи-нов сыворотки крови и их белковых компонентов в митохондриях печени крыс при действии на них чрезвычайных раздражителей.

В связи с этим перед нами стояли следующие задачи:

1. Выявить особенности окислительных процессов в митохондриях печени при действии на организм различных типов стрессирующих факторов (физическая нагрузка, иммобилизация, холод, влияние бактериальных полисахаридов).

2. Оценить эффективность использования различных субстратов в окислительном фосфорилировании митохондрий печени крыс в ходе адаптации животных к холоду.

3. Изучить изменение содержания ЛП-фракций в сыворотке крови животных при различных моделях стресса

4. Исследовать влияние отдельных апопротеинов на окислительные и мембранные процессы митохондрий печени крыс.

Научная новизна В процессе решения поставленных задач выяснилось, что характер изменений окислительного фосфорилироЕа-ния в митохондриях печени крыс зависит от типа и выраженности воздействия внешнего фактора на организм. Использование основных субстратов как поставщиков электронов для дыхательной цепи позволило выявить наиболее предпочтительные из них для каждого типа воздействия.

Впервые показана фазовость изменений процессов окислительного фосфорилирования в митохондриях печени крыс и содержания различных фракций ЛП в сыворотке крови в динамике длительной адаптации к холоду.

Впервые показано, что апопротеины ЛПОНП (апоЛГОНП) оказывают влияние на процессы окислительного фосфорилирования и проницаемость мембран митохондрий печени крыс. В отличие от апопротеинов Л11ВП данные белки увеличивают протонную и калиевую

- —------ — - Б -

проницаемость внутренней мембраны, не оказывая влияние ка проницаемость сахарозы. Характер влияния апопротеинов семейства С на окислительное фосфорилирование зависит от дозы, они оказывают активирующее влияние на Fo.Fl-АТФазу митохондрий (Мх) печени крыс. Сравнение влияния апо С и ало Е на функционирование Мх впервые позволило заключить, что действие суммарных алоЛПСНП на митохондриалъвые процессы является результирующей величиной эффектов апопротеинов, входящих в их состаь.

Теоретическое и практическое значение. Диссертация представляет собой исследование биохимических механизмов перестройки работы митохондриального -аппарата под воздействием стрессирующих факторов и носит преимущественно теоретический характер. Представленные результаты имеют важное значение для молекулярной биоэнергетики , так как полученные впервые данные о существовании ЛП-зависимой регуляции активности митохондрий печени, позволяют глубже понять механизм изменения энергетического обмена.

Положения, выдвигаемые на защиту.-

1. Ответная реакция митохондрий ка воздействие субзкстрема.пьнь'х и экстремальных факторов среды носит фазовый характер и зависит от длительности и степени воздействия.

2. Алопротеины семейства С и Е способны влиять на функциональное состояние митохондрий, характер влияния зависит от дозы апопротеина.

3. Алопротеины семейства с оказывают активирующее влияние ч?. Ро,П-АТФ-азу митохондрий печени крыс.

4. Влияние апоЛПОНП на функционирование митохондрий зависит от эффектов всех апопротеинов, входящие в их состав.

Апробация работы. Основные положения и выводы диссертации доложены на Региональной конференции молодых ученых "Актуальнее вопросы патофизиологии" (Новосибирск, 1985); на Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы и регуляция энергетического обмена" (Пущино, 1986); научно-технической конференции молодых ученых "Здоровье человека в Сибири" (Красноярск, 1986); IV Всесоюзном съезде патофизиологов (Кишинев, 1989); Всесоюзной конференции, посвященной памяти профессора А. Д. Слонима (Новосибирск, 1990); Constituent Congress International Society for

- 6 -

Pathophysiology (Москва, 1991).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ.

Объем работы. Диссертация написана на 165 страницах машинописного текста и состоит из введения, литературного обзора, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения, выводов и списка использованной литературы ( ui> отечественных и иностранных источников).

Работа содержит таблицы и 3 рисунков.

Диссертация выполнена в соответствии с основным планом научно-исследовательских работ Института биохимии СО РАМН по проблеме "Изучить механизмы липопротеидной регуляции внутриклеточного метаболизма при стрессе с целью разработки и коррекции процессов адаптации и восстановления", N государственной регистрации 01. 8. 90 056 645.

Материалы и методы исследования.

Работа выполнена на крысах-самцах линии Вистар массой 150 -200 г. Все животные содержались в условиях вивария на обычном лабораторном рационе.

В качестве моделей стрессорных воздействий были выбраны следующее состояния: физическая нагрузка, иммобилизация, акклиматизация к холоду и стимуляция системы мононуклеарных фагоцитов продигиозаном. Данный набор моделей был обусловлен не только стремлением выявить неспецифические изменения , но и особенности ответной реакции организма при различных типах воздействия на него, отличающихся прежде всего уровнем энергозатрат, необходимых для формирования резистентности организма.

1. Физическая нагрузка двух видов:

а однократное плавание крыс в течение 3.5 часов с грузом, составляющим 4Z от массы тела при температуре воды 35*-37"С. Такая нагрузка приводит к состоянию утомления (Кондаленко а В. и др., 1976).

б. бег на тредбане до утомления со скоростью 20 м/мин. Бег с такой скоростью в течение 90 мин для крыс является истощающей нагрузкой (Lew et al, 1985;Begum et al, 1986).

2. Иммобилизацию по методу, разработанному Kvetnansky (1970), осуществляли путем фиксации крыс на специальном столике.

3. Холодовая адаптация по Харту (1960). Животные находились в индивидуальных металлических клетках при температуре 5''+ 1°С. В помещении поддерживался световой режим 12:12 час. Контрольные животные содержались в таких же клетках при комнатной температуре. Животные для исследования забивались методом декалитации через 1, 5, 10, 15, 16 и 20 суток пребывания на холоде.

4. Стимуляция системы мононуклеарных фагоцитов (СЫ£>). Про-дигиозан вводили внутрибрюшинно в дозе 0,25 мкг/г массы тела животного за 24 часа до исследования.

Приведенные в таблицах цифры являются средним значением от 6-14 экспериментов.

In vitro изучали действие апопротеинов на окислительное фосфорилирование и проницаемость внутренней мембраны митохондрий. Дозы апопротеинов выбирали в соответствии с их процентным содержанием в липопротеинах, основываясь на проведенных ранее исследованиях (Кузьменко, 1982).

В работе использовались следующие методы:

1. Получение изолированных митохондрий из печени крыс (М.Н. Кондрашова и др. ,1981).

2. Полярографическое изучение функциональной активности митохондрий Chance & Williams, 1956).

3. Выделение липопротеидов сыворотки крови методом изоплот-ностного центрифугирования ( Havel et al, 1955).

4. Определение белка по Лоури (Lowry et. al. , 1951).

5. Измерение объема митохондрий под влиянием апопротеинов (Lehninger, 1959).

6. Определение активности Fo,Fl-ATí^-азы (К. Ф. 3. 6.1. 3) изолированных митохондрий печени крыс (Кондрашова М. Е , 1965; Кра-синская И. II, Ягужинский Л. С. , 1976).

7. Определение липопротеинового спектра сыворотки крови (Маграчева Е. Я , 1973; Поляков Л. М. , Панин Л. Е. , 1975).

S. Определение суммарной фракции ЛПОНП и ЛПНП (Климов А. Е и др. , 1966).

9. Изучение катиоикой проницаемости внутренней мембраны митохондрий (Braerley, 1970; Braerley & Stoner, 1970).

Результаты обработаны методами вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента (Лакин, 1990).

- 8 -

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУВДЕНИЕ 1. Изменение окислительного фосфоршшрования в митохондриях печени и липопротеинового спектра сыворотки крови при действии на организм стрессорных факторов.

Механизмы регуляции, обеспечивающие перестройку энергетического обмена в организме в условиях действия на него чрезвычайных раздражителей представляют особый интерес, так как от них в первую очередь зависит формирование неспецифической резистентности. Митохондрии печени в числе первых цитоструктур включаются в адаптивный ответ , при этом в них происходят сложные структурно-функциональные изменения: меняется фосфэлипидный состав мембран Мх (Ка1оГоиЬ1з, 1984; Райеуа-ОопшсМеуа et а1, 1986),'увеличивается образование макроэргов (Мандрик К. А. и др., 1986) и так далее.

Нами было показано на нескольких моделях непродолжительных стрессовых воздействий ( 4-х часовая иммобилизация, плавание с грузом, бег в тредбане), что в Мх печени крыс различно окисля-.ются субстраты углеводной и липидной природы.

Оказалось, что эффективность окисления сукцината при иммо-билизационном стрессе снижается. Это получило свое отражение в некотором падении скорости в метаболическом состоянии 3 (МС-3) и коэффициента АДФ/О . В то же время иммобидизационный стресс на 267. повышал скорость фосфоршшрования митохондрий в сравнении с контролем при окислении пальмитоидкарнитина, в основном за счет увеличения скорости в МО 3 (Табл. 1). Однако в силу значительного разброса данных выявленные изменения оказались недостоверными.

В условиях иммобилизации животных происходил сдвиг ЛП-спектра крови в сторону увеличения ЛПВП. Наблюдалось снижение процентного содержания ЛПОНП, а также увеличение процентного содержания ЛПНП и ЛПВП-2. Это свидетельствует о значительной активации липопротеинлипазы, способствующей усилению использования липидов на энергетические нужды организма, обеспечивает дополнительный приток свободных жирных кислот в ткани с целью их дальнейшего окисления.

Считается , что снижение содержания ЛПОНП в сыворотке крови происходит за счет значительного потребления их работающими

Таблица 1.

Влияние различных типов стресса на окислительное фосфорилиро-вание митохондрий печени крыс ( М + т ).

сукц. гл. -мал. падьмит.

ИММОБИЛИЗАЦИЯ

Дыхат. контроль 3,33+ 0,34 * 2,60+ 0,40

по Чансу ! 3,32+ 0,27 4,19+ 1,17

Скорость 99,05+18,29 59,12+13,17

з МС-3 I 78,57+ 6,39 82,04+11,49

ЛДФ/О 1,48+ 0,06 2,51+ 0,14

I 1,29+ 0,06* 2,25+ 0,10

Скорость 143,00+22,09 144,74+27,83

фосфорилиров. I 102,72+11,26 181,94+24,21

БЕГ В ТРЕДБАНЕ

Дыхат. контроль 2,29+ 0,11 1,89+ 0,06 2,08+ 0,18

по Чансу I 2,51+ 0,36 1,76+ 0,11 2,30+ 0,28

Скорость 8,5,69+ 3,78 34,41+ 1,29 45,45+10,17

в МС-3 1 98,14+ 7,03 31,88+ 3,28 58,01+ 5,51

АДФ/О 1,59+ 0,14 2,54+ 0,19 2,06+ 0,07

1 1,38+ 0,12 1,96+ 0,29 1,95+ 0,15

Скорость 135,76+12,14 86,92+ 6,49 90,72+17,72

фосфорилиров. I 135,44+15,71 56,74+ 6,60* 113,02+13,23

ПЛАВАНИЕ

Дыхат. контроль 2,70+ 0,14 3,23+ 0,51 1,93+ 0,08

по Чансу I 2,59+ 0,10 3,09+ 0,28 2,26+ 0,08*

Скорость 63,75+ 7,71 44,01+ 6,72 33,20+ 8,15

В МС-3 I 92,61+10,29* 52,85+ 5,88 33,21+ 5,68

АДФ/О 1,93+ 0,06 2,56+ 0,23 2,35+ 0,14

I 1,87+ 0,10 2,66+ 0,18 2,43+ 0,15

Скорость 108,68+18,98 114,76+20,71 71,68+18,86

фосфорилиров. I 167,42+12,12* 139,53+14,46 79,13+12,32

Примечание: 1-контроль; П-опыт. *-Р<0,05-по отношению к контролю

мышцами, при этом окисление подавляющего количества жирных кислот, входящих в состав ЛПОНП, может происходить без предварительного поступления их в пул свободных жирных кислот плазмы (Wolfe & Durkot, 1985). Однако, в условиях иммобилизации нет достаточных предпосылок для потребления ЛПОНП мышцами, тогда как потребление их другими тканями и органами, например, печенью, возможно.

Таким образом, проявление регуляторного действия апоЛПОНП в Мх , если оно реально существует, в условиях иммобилизации мы вправе ожидать именно в печени. В условиях активно работающих мышц ( бег в тредбане, плавание) регуляторный эффект апоЛПОНП в большей степени должен проявлятся в сократительных тканях, т.е. в мышцах. При этом более активный сдвиг ЛП-спектра крови в сторону увеличения ЛПВП (Панин Л.Е., 1978) может отражатся и на ■регуляторном действии апоЛП крови. Для выяснения этого были поставлены эксперименты с плававшими и бегавшими животными.

Несмотря на то, что любой стресс характеризуется повышением активности гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой и симпато-ад-реналовой систем, метаболические сдвиги в одной и той же ткани, в данном случае в печени, могут проявлятся по-разному. Подобные явления были описаны ранее как "эффект метаболического обусловливания" (Панин Л. Е., 1983), природа которого может быть разной. Мы полагаем, что в данном случае она определяется значительным повышением активности мышечной ткани при физической нагрузке.

В условиях бега животных на тредбане удалось обнаружить достоверное снижение скорости фосфорилирования Мх в случае использования НАД-зависимого субстрата (пируват - малат). Окисление ФАД-зависимого субстрата (сукцинат) практически не изменялось (Табл. 1). Прослеживалась тенденция к повышению скорости фосфорилирования при окислении пальмитоилкарнитина. Поскольку в этот период не наблюдалось ярко выраженного преимущества окисления сукцината Мх печени крыс, можно предположить, что начальный этап стрессового воздействия на организм уже пройден (Конд-рашова М. Е , Григоренко Е. В., 1981), а состояние резистентности в этой модели не сопровождается глубокими изменениями системы окислительного фосфорилирования.

......- ------------- ------------------- - и -

Плавание крыс при комфортной температуре воды приводило к увеличению скорости фосфорилирования митохондрий при окислении сукцината на 54% (Табл. 1). Это происходило за счет повышения скорости сопряженного окисления (МС-З). Коэффициент АДФ/О в данном случае практически не изменялся. Существенных изменений в дыхательном контроле мы в данном случае не наблюдали, но этот показатель достоверно повышался при окислении пальмитоилкарни-тина на 17% за счет некоторого снижения скорости в Ш-4, скорость дыхания Мх в МС-3 не изменялась, прирост скорости фосфорилирования практически отсутствовал. Увеличение дыхательного контроля на пальмитоилкарнитине свидетельствует о том, что мы имеем дело с хорошо сопряженными Мх. Данные результаты качественно отличаются от тех, которые были получены нами при иммобилизации животных.

Ранее было показано, что интенсивная физическая нагрузка увеличивала процентное содержание ЛПВП в основном за счет ЖТВП-2. Это явилось следствием увеличении старости липолиза ТГ -богатых ДПОНП. Одновременно снижались концентрации ТГ, ЛПНП ч, соответственно, ЛШНП в сыворотке крови (Панин Л. Е. , Останика Л С. , 1991). В наших экспериментах выяснилось, что изменения ЛП -спектра крови крыс после плавания крыс в течение 3.5 часов характеризовались снижением процентного еодер.глния ЛПОНП , как и при иммобилизационном стрессе, но увеличение содержания фракции ЛПВП-2 не наблюдалось. Однако,увеличение продолжительности плавания до 5 часов, как было показано Л. С. Останиной (1989)," приводит к достоверному возрастанию содержания фракции ЛПВП в сыворотке крови опытных животных.

Показано, что интенсивная физическая нагрузка сопровождается усилением потребления кислорода работающими мышцами, увеличивается скорость поглощения кислорода митохондриями в различных метаболических состояниях (Курнлев В. А. , Мельничук В. п. , 1988). При этом растет кислородный долг и в организме возникает состояние функциональной гипоксии. Кроме того, в ряде работ указывается на то, что адаптация к физическим нагрузкам повышает резистентность организма к гипоксии, а воздействие гипоксии увеличивает степень физической тренированности (Haft et al, ie?8) uoicre ft Fi-emint, lees).

Оказалось, что пребывание животных в условиях гипоксической гипоксии ("высота" 8 200 м, 2 часа) не привело к существенным изменениям в ЛП спектре сыворотки крови ни низко-,ни высокоустойчивых к гипоксии крыс. Достоверной была лишь разница в содержании фракции ЛПБП-З у интактных крыс , различающихся уровнем устойчивости к данному воздействию. В связи с этим, мы полагаем, что эффект метаболической обусловленности при физической нагрузке связан с повышением мышечной активности, а не с развитием функциональной гипоксии.

При изучении влияния бактериального полисахарида продигио-зана на функционирование митохондрий наши данные не выявили его действия на окислительное фосфорилирование как интактных, так и плававших крыс. Более того, изменения функционального состояния животных (покой - физическая нагрузка - восстановление после нее ), как показали наши результаты, играют более важную роль в перестройке дыхательной цепи Их печени крыс , чем факт введения продигиозана. Вероятно, механизм действия продигиозана прямо не затрагивает Мх аппарат печени.

Снижение содержания ЛПЕП-3 в сыворотке крови под влиянием продигиозана связывается с поглощением их СМФ вместе со стероидными гормонами, что необходимо для реализации кооперативного эффекта, направленного на усиление биосинтеза белка в печени. Однако, в данной модели это не отразилось на функциональном состоянии митохондриального аппарата.

Полученные нами результаты показали, что нельзя говорить о стереотипном ответе митохондриального аппарата печени в условиях стресса. Он очень специфичен и зависит от характера стрес-сорного воздействия на организм. Даже разные типы физической нагрузки вызывали различия в эффективности использования субстратов окисления, что видно из результатов, полученных нами после бега и плавания животных. Очевидно, весьма значительную роль играет в этих условиях эмоциональный компонент воздействия, характер теплообмена. С точки зрения представлений Се лье (1972) о стрессе во всех состояниях развивались неспецифические реакции, связанные с повышением активности гипоталамо-гипофиза-рно-надпочечниковой и симпато-адреналовой систем. Но влияние обусловливающих факторов изменяет характер метаболического от-

вета периферических тканей и с.

литературе нет данных по дина»,.

митохондрий на длительное стрессовое ъ.

шие исследования были направлены на анализ-».. с*\£сС' .»о,

в Мх печени крыс в динамике адаптации организма' ¡с-В.

дели Харта.

Выявленные изменения в окислении трех использованных "нам,., субстратов были сопоставимы в динамике адаптации к холоду , отличаясь лишь выраженностью эффекта. Уже через сутки пребывания животных при 5°С отмечалось снижение скоростей дыхания Мх печени во всех метаболических состояниях. Снижался также и коэффициент АДФ/О (Табл. 2). Это соответственно приводило к падению скорости фосфорилировзния на 73% при окислении сукцината.на 76Х - при окислении глутамата - малата и па 75% - при окислении пальмитоилкарнитина . К пятому дню содержания крыс при пониженной температуре эти изменения почти исчезали и значения всех показателей, исключая скорость разобщенного дыхания при окислении сукцината, приближались к соответствующим значениям параметров контрольных крыс. В случае же сукцината скорость дыхания Мх после добавления разобщителя значительно превышала контрольную.

Известно, что при длительной адаптации крыс к холоду через 7-10 дней устанавливается постоянный повышенный уровень теплопродукции, холодовая дрожь достигает минимума (Kart, 1960). К этому времени мы вновь наблюдали снижение дыхательного ¡сонтроля и скоростей дыхания на всех субстратах, кроме скорости разоб-щеннсго дыхания на сукцинате. Скорость фосфорчлирования иг всех трех субстратах значительно снижалась.

fia 15 сутки наблюдаемая нами ситуация была аналогична 5-м суткам. Практически все скорости дыхания Мх приближались к контрольным значениям, однако, АДФ/и и скорость фосфорилирова-ния оставались низкими. Несмотря на то, что за счет повышения скорости в МС-3 скорость фосфорчлирования возрастала по сравнению с 10-ми сутками, по отношению к контролю она была достоверно ниже, продолжало снижаться отношение АДФ/О.

Измерение ректальной температуры подопытных крыс показало что с интервале 15-16 суток происходит значительное повышение температуры ядра тела . Это говорит о том, что в этот период

Таблица 2.

.щии к холоду на параметры окислительного фосфори-^ования митохондрий печени крыс ( М + т ).

Мч

V (Ш 3)

АДФ/О

СФ

Субстрат окисления - сукцинат

К 2,65+0,18 54,84+4,12 1,88+0,07 103,28+9,65

1 1,61+0,Ой*** 26,37+ 2,60*** 1,05+0,11*** 28,05+ 4,80***

5 2,51+0,36 57,98+10,06 1,57+0,16 93,18+20,75

10 1,66+0,18** 33,72+ 2,76** 1,24+0,30 43,61+10,25**

15 2,22+0,15 56,63+ 6,09 1,11+0,08*** 62,06+ 4,87**

16 1,47+0,23**' 33,37+6,31** 0,85+0,30* 32,58+11,88** 20 1,34+0,08*** 38,62+ 5,68* 1,15+0,05*** 45,17+ 8,58**

Субстрат окисления - глутамат-малат

К 2,89+0,50 39,75+6,05 2,44+0,25 100,54+20,08

1 1,59+0,08* 15,30+1,04** 1,59+0,20* 24,10+ 3,09**

5 3,05+0,47 42,69+6,44 2,62+0,21 117,09+23,68

10 1,70+0,25 20,51+2,15* 1,78+0,40 39,69+ 9,12*

15 1,92+0,17 33,50+2,75 1,58+0,14* 53,10+ 7,41

16 1,40+0,28* 21,87+4,72* 0,82+0,47* 23,14+14,02*

20 1,60+0,10* 25,83+4,73 2,18+0,21 56,83+12,31

Субстрат окисления - пальмитоилкарнитин

К 1,65+0,08 28,69+ 4,31 2,11+0,24 58,05+ 5,87

1 1,29+0,06** 12,75+ 0,78** 1,12+0,11** 14,36+ 1,61***

5 1,89+0,28 29,04+ 4,52 1,95+0,44 62,32+19,52

10 1,27+0,21 16,36+ 2,55* 0,60+0,39** 13,90+10,15**

15 1,62+0,09 25,99+ 2,32 1,25+0,08** 32,32+ 3,29**

16 1,10+0,10** 15,14+ 3,67* 0,32+0,32** 7,00+ 7,00***

20 1,06+0,06*** 16,00+ 2,70* 0,23+0,23*** 4,51+ 4,51***

Примечание: ДКч-дыхательный контроль по Чансу; У(МС 3)-скорость в МС 3; СФ-скорость фосфорилирования. Достоверные отличия от ко-нттеля: *~Р<0,05; **-Р<0,01; *** - Р < 0,001.

происходит увеличение теплопродукции в связи с изменением энергетического обмена. Поэтому ми решили, что будет целесообразно исследовать состояние Мх печени крыс на 16 сутки адаптации животных к холоду.

Показано, что на всех трех субстратах наблюдалось резкое снижение дыхательного контроля и продолжалось падение значений АДФ/О и скорости фосфорилирования на глутамате-малате и пальми-тоилкарнитине. При окислении пальмитоилкарнитина разобщение дыхания и фосфорилирования било практически полним (Табл. 2). На 20 сутки несколько повнязлксь значения АДФ/О и скорости фосфорилирования на сукцинате и глутамате-малате. Показатели окисления пальмитоилкарнитина особых изменений по отношению к показателям 15 суток не выявили.

В случае всех трех используемых субстратов окисления в 1, 10, 16 и 20 дни пребывания животных при пониженной температуре снижение дыхательного контроля по Чансу в основном было обусловлено снижением скорости активного фосфорилирования в МС-3. Это сопровождалось снижением коэффициента АДФ/О, что свидетельствует об угнетении фосфорилирующей системы. Следовательно, мы наблюдали в эти сроки ингибирование процессов окислительного фосфорилирования в митохондриях печени.

Колебательный характер изменения дыхательных характеристик '.^тохондриального аппарата печени , по-видимому, связан с активизацией различных адаптивных процессов в организме, изменяющих его работу. Если через сутки пребывания животных на холоде изменения показателей окислительного фосфорилирования на всех трех субстратах носили однонаправленный характер и могли быть объяснены неспецифической реакцией организма на острый стресс, то на 5 и 15 сутки обрашдет на себя внимание увеличение по сравнению с контролем скорости разобщенного дыхания только на сукцинате , что может свидетельствовать об усилении его роли на ранних этапах адаптации к холоду по сравнению с другими субстратами.

Колебательные изменения были нами выявлены и при изучении спектра ЛП сыворотки крови (Табл. 3). На 5 сутки в сыворотке крови возрастало относительное содержание ЛПОНП и ЛПВП-З, 'но снижалось содержание ЛПВП-2. Содержание суммарной фракции ЛПНП

и ЛПОНП оставалось неизменным. Это свидетельствует об увеличении синтеза ЛПОНП и трансформации их в ЛПВП-3. Известно, что к этому моменту адаптации к холоду активизируются липолитические ферменты жировой ткани, печени и крови (Galton, 1975). Все это создает необходимые условия для усиления рабсты митохондриаль-ного аппарата к 5 суткам воздействия пониженной температуры и предпосылки для его перестройки в дальнейшем.

Таблица 3

Изменение спектра сывороточных липопротеинов при адаптации к холоду (М + ш).

Дни ЛПВПЗ (%) ЛПВП2 (Z) ЛПНП (%) ЛПОНП (%)

к 53,54+2,32 29,42+1,28 15,87+3,21 1,17+0,28

1 52,06+3,38 38,72+4,02* 8,01+1,50* 1,21+0,36

5 65,42+3,00* 15,63+1,91*** 13,19+1,13 5,76+0,88**

10 56,82+3,10 20,13+2,06** 16,89+2,44 6,16+1,33**

15 56,10+2,46 20,51+1,88** 19,18+1,40 4,21+1,04*-

16 59,82+3,38 17,57+1,85*** 17,23+2,15 5,38+1,89*

20 55,36+4,98 26,46+2,53 14,49+2,45 3,69+1,34

Примечание: достоверные отличия от контроля: *-Р<0,05; **-Р<0,01;

*** - Р < 0,001.

Содержание суммарно;* *г акции ЛПНП и ЛПОНП к 15 суткам адаптации к холоду возрастало и оставалось повышенным в дальнейшем. Наибольшие изменения связаны с фракцией ЛПВП -2 и ЛПОНП. Содержание последних в сыворотке крови возрастало, достигая максимума к 10-м суткам, к 20-м суткам оно снижалось,не достигая, однако, контрольного уровня. Процентное содержание фракции Л1Ш1-2 несколько возрастало к 1 суткам охлаждения животных и более чем в два раза снижалось на 5 сутки. К 20-м суткам количество их в крови приблизилось к контролю.

Интенсификация лилидного обмена относится к начальному периоду адаптации (Хаскин В. В., 1984). Если животные уже достаточно адаптированы к пониженной температуре, обмен липидов остается на достаточно высоком уровне, выше контрольного, но ниже, чем в остром стрессе. Это согласуется с полученными нами

ь

________________ -- — -17-

данными.

Адаптация к холоду приводит к фазовым изменениям в процессах окислительного фосфорилирования и, соответственно, в разные периоды изменяется эффективность использования митохондриям!! различных субстратов окисления. Согласно данным литературы, главным источником энергии при данном воздействии становятся .тарные кислоты . фи их окислении электроны в дыхательную цепь передаются на уровне убкхинона (Ко<3) или цитохрома Ь, что ускоряет окисление. Важней транспортной формой жирных кислот в организме являются ЛП, в первую очередь ЛПОНП, белковый компонент которых (апопротеины), очевидно вносит свой вклад в изменение функциональной активности Мх при адаптации к холоду, фи других стрессовых состояниях (например, интенсивная мышечная нагрузка) регуляторную роль играют , вероятно, ЛПБП. Структурный компонент их - апопротеины, обладая коферментными свойствами , может играть важную роль в механизме переключения энергетического обмена с углеводного типа на липидный.

Выяснению особенностей действия различных апопротеинов на Мх печени крыс посвящена следующая глава данной работы.

2. Влияние апопротеинов на показатели функционирования мито-хондриального аппарата

Пусковым механизмом в перестройке энергетического обмена в условиях стресса являются адаптивные гормоны - глюкокортикоиды, катехоламины и др. ( Панин Л.Е., 1978). Однако однозначно утверждать о существовании конкретного механизма влияния этих гормонов на Мх невозможно. Разумно предположить существование какого-то промежуточного звена, дополнительного к действию адаптивных гормонов, которое изменяет функциональное состояние Мх в условиях стресса. Таким звеном в регуляции могут быть, апопротеины, наделенные кофе рентными свойствами.

Добавление в среду инкубации апо С в дозе 3 мкг/мг Мх белка приводило к снижению дыхательного контроля на трек используемых субстратах (Табл.4). Значение ЛДФ'О достоверно снижалось только при окислении пальмитоилкарнитити Скорость потребления кислорода при добавлении риаоокщтели была также ниже: на 24Х при окислении сукцинита и ппльмнтомдюцтитмип, на 10Х при окислении

глутамата с малатом. При окислении глутамага - йалата достоверно повышалась скорость дыхания в четвертом метаболическом состоянии. Это свидетельствует о наблюдаемом нами эффекте разобщения, чего мы не регистрировали на более высокой дозе.

Таблица 4.

Влияние ало С на показатели окислительного фосфэрилирования Мх печени интактных крыс (М + т).

сукц. гл. -мал. паль мит.

Апс С (3 мкг/мг 1 iх белка)

Дыхат. контроль I 2,27+ 0,23 2,26+0,20 1,65+ 0,08

по Чансу I 1,43+ 0,15* 1,71+0,21** 1,25+ 0,07**

Скорость 1 99,73+15,59 55,88+5,62 38,68+ 5,66

в МС-3 I 62,61+ 9,42* 51,91+6,24 30,01+ 3,95

Скорость I 45,11+8,00 24,83+1,59 23,42+ 2,84

в МС-4 I 45,37+ 8,12 30,44+1,74** 24,48+3,52

АДФ/0 I 1,40+ 0,17 2,47+0,18 2,02+ 0,26

I 1,12+0,30 2,27+0,15 1,28+ 0,35*

Скорость I 131,18+16,88 139,20+20,43 74,46+ 7,72

ф-^сфорилиров. I 75,20+23,82 120,49+19,79 37,46+11,57*

Ало С (6 мкг/мг Мх белка)

Дыхат. контроль I 2,21+0,20 2,26+ 0,20 1,63+ 0,07

по Чансу I 1,14+0,07** 1,57+0,23** 1,00***

Скорость I 93,88+14,01 55,88+ 5,62 38,44+ 4,65

в МС-3 I 42,44+ 5,90** 44,29+ 5,09* 26,04+ 3,69*

Скорость I 43,34+ 6,77 24,33+ 1,59 23,37+ 2,32

в МС-4 I 37,95+ 5,50 ^3,69+ 2,31 26,04+ 3,69

АДФ/0 I 1,39+0,14 2,47+ 0,18 2,03+ 0,21 ■

I 0,67+ 0,30 2,10+ 0,58 0,00

Скорость I 123,74+15,66 139,20+20,43 74,27+ 6,31

фосфорилиров. I ' 29,17+15,39**104,23+29,29 0,00

Примечание: достоверные отличия от контроля: *-Р<0,05; **-Р<0,01; *** - р < 0,001. 1-контроль, II-опыт.

______ _________ - 19 -

"После увеличения дозы ano С в два раза - 5 мкг/мг Мх белка -при использовании всех трех субстратов мы обнаружили снижение дыхательного контроля как и в первом случае, но при окислении пальмитоилкарнитина этот параметр был равен i, так как добавление в кювету АДФ не приводило к увеличению скорости потребления кислорода, значение АДФ/О равнялось 0. Инкубация № с ano С во всех трех случаях не вызывала изменения скорости дыхания в контролируемом четвертом состоянии. Более нкегсие по сравнению с контроле:.: скорости «{оефоридфуиарго дыхания приводили к некото-nfvy снижению отношения АДФ/0 при окислении сукцината и глутамата с малатом (Табл. 4). Отличительной особенностью окисления Мх пальмитоилкарнитина в присутствии ano С явилось снижение скорости фосфорнлирования до нулевого уровня. Скорость разобщенного дыхания Мх после добавления в кювету ano С была ниже на 52% при окислении сукциката, на 37% - глутамата с малатом и на 30% - пальмитоилкарнитина.

Использование аскорбатч х TMí-7? показало, что скорость скис-•*зная лаипего субстрата г-г игу-рчялась под воздействием добав-~<шш& апопротеинов. Очевидно, действие ano С на процессы окислительного фсс^орилкрованкя Ш реализуется на участке до иитохрома с.

Содержанке ano Е в ЛПОНП несколько больше, чем ало С. Инкубация «х с ano Е (G мкг/мг Мх белка) не приводила к изменению дыхательного контроля или скоростей дыхания. С уменьшением дозы ano Е г- два раза наблюдалось увеличение скорости активного дыхания, наиболее выраженное при окислении глутамата с малатом.

Таким образом. эффект ЛПОНП, как и суммарных апоЛПОНП. нельзя связывать с действием какого-либо одного апопротеика, поскольку ano с и ало Е , входящие в состав апоЛПОНП, оказывали совершенно различное действие на окислительное фосфорилирование митохондрий. Если ano Е (3 мкг/мг Мх белка) стимулировал скорость активного дыхания в МС 3, то влияние ano С было более сложным, от разобщающего действия на низкой дозе до полного ин-гибирования на более высокой. Очевидно, что их суммарный эффект-ЯЕЛяется некоторой результирующей величиной.

При изучении влияния ano С на активность Fo.Fl -АТФ-азы мы получили результаты, которые показали значительный активирующий

эффект данного апопротеина. Ало С на 36% и 75% , соответственно дозе, стимулировали активность фермента (Табл. 5).

Таблица 5

Влияние ало С на активность Ро,Р1-АТФ-азы митохондрий печени крыс (М + т).

Апопро- Доза П Активность

теин (мшг/мг Мх белка) (мкмоль Рн / мг Мх бедка)

- 5 0,471 + 0,05

Апо С 7,5 5 0,641 + 0,04*

Апо С 15 • 5 0,824 + 0,07**

Примечание: достоверные отличия от контроля: *-Р<0,05; **-Р<0,01.

АТФ-азный комплекс способен не только синтезировать,но и гидролизовать АТФ, что приводит к генерации на сопрягающих мембранах(Mitchell, 1974). Наши данные о ингибиторном влиянии апо С (6 мкг/мг Мх белка) на систему окислительного фосфорилирования позволяет предполагать, что увеличение активности Fo.Fl -АТФазы связано именно с восстановлением потенциала на внутренней митохондриальной мембране.

Изучение влияцие апоЛПОНП и апоЛПВП на протонную проницаемость внутренней мембраны митохондрий печени крыс показало,что преинкубация Ых в отсутствии апопротеинов не оказывала заметного влияния на скорость изменения оптической плотности органелл (Рис. 1, кривые 1 и 2). Преинкубация Мх в присутствии апоЛПВП ( кривая 3 ) приводила к уменьшению начальной скорости сокращения Мх в ответ на энергизацию мембраны еукцинатом (V2) по сравнению с контролем (кривая 2). Начальная скорость набухания органелл под влиянием разобщителя (V4) оставалась практически неизменной ( Рис. 1, кривые 2 и 3). Иная картина наблюдалась в случае преинкубации Мх в присутствии апоЛПОНП ( кривая 4 ). V2 уменьшалась в ешэ большей степени при добавлении апоЛПОНП и заметно возрастала скорость V4 . Амплитуда набухания оргенелл в .ответ на добавление разобщителя (ХКФ) (кривая 4) увеличивалась на 28% по сравнению с контролем (кривая 2), что не было харак-

терно для апоЛПВП. Существенно уменьшалась также величина У5.

Результаты данной серии экспериментов указывают на увеличение проницаемости внутренней мембраны Мх для протонов под влиянием апоЛПОНП, но не апоЛПВП Величина У2, существенно уменьшалась под действием апоЛПОНП, в меньшей степени - под действием апоЛПВП. Это согласуется с ранее полученными данными о различиях в действии данных фракций апопротеинов на биоэнергетику Мх.

Так же нами были получены результаты, свидетельствующие о различном влиянии апоЛПОНП и апоЛПВП на проницаемость внутренней мембраны Мх для ясное калия: начальная скорость снижения оптического поглощения суспензии орган»-лл, инициированная внесенном воияинсмицина, заметно увеличивалась только в случае пре-инкубпцни Мх с апоЛПОНП , ни не с апоЛПВП : 11,7+1,3 и 8,0 £ О,г,, в контроле - 9,2 + 0,6 дАМб-10-г0Е/мин мг белка.

Преинкубация Мх с апоиротеинами в среде, содержащей сахарозу. не вызывала изменения оптического поглощения суспензии на

«X

I

Рис.1. Влияние апопротеинов на изменение оптического поглощения Мх. 1-Мх без пре инкубации; 2-преинкуба-ция без апопротеинов; 3-преинкуба-

иия с апоЛПВП (22мкг/мг Мх белка); 4-преинкубация с апоЛПОНП(22мкг/мг Мх белка/. Стрелками обозначены моменты внесения Мх и добавок. VI-У5-скорости изменения оптического поглощения суспензии Мх в соответствующие фазы процесса. В-амплитуда набухания оргэлелл в ответ на до -

■з оавление разобщителя, рассчитанная по начальной скорости снижения оптического поглощу аия. Представлены 4 результаты семи экспериментов.

- 22 -

протяжении всего времени эксперимента.

АпоЛПОНП способны снижать потенциал на внутренней мембране Мх (Панин Л.Е. и др. ,1991) , что позволяет объяснить приведенные выше данные о влиянии данного класса соединений на энергетику Мх. Снижение потенциала может быть обусловлено образованием поры определенного размера, обеспечивающей проводимость для катионов, но не пропускающей низкомолекулярные незаряженные вещества, например, сахарозу. На мембранах липосом было показано, что в присутствии плазмы крови увеличивается проницаемость мембраны (Лось Г. R и др. ,1985). Авторы предполагают образование в мембранах динамических дефектов или пор определенного размера, возникающих благодаря встраиванию белков в фосфолипид-ную матрицу липосом. Посредством перебора сывороточных белков они сделали вывод, что это белки липопротеинов.

В наших исследованиях участие в формировании таких каналов под влиянием апоЛПОНП или ano С подтверждается одновременным снижением ДК, АДФ/О и скорости фосфорилирования. Мы полагаем, что основой ингибирующего действия ало С может быть, вероятно, взаимодействие его с комплексами белков, образующими пункты сопряжения в дыхательной цепи . Известно, что многие из них могут в определенных условиях функционировать как пора

Повышение скорости дыхания митохондрий в четвертом метаболическом состоянии под влиянием ano Е согласуется с фактами, представленными в работе Beisiegel et al (1988) . Эти авторы показали, что внутренняя мембрана митохондрий печени имеет вы-сокоафинные места связывания для ano Е. Hamilton R.L. с сотр. (1990), изучая локализацию ano Е в гепатоцитах , обнаружили меченные ano Е в митохондриях.

ВЫВОДЫ

1. Различные экстремальные воздействия на организм приводят к изменению окислительных процессов в митохондриях печени и ли-попротеиновых спектров в сыворотке крови крыс. Характер данных изменений зависит от степени воздействия.

2. В процессе длительной адаптации к холоду происходят фазовые изменения окислительного фосфорилирования в митохондриях печени крыс и в содержании различных фракций липопротеинов в

- 23 -

сыворотке крови. •

3. Суммарные апоЛГОНП, в отличие от апоЛПВП, увеличивают протонную и калиевую проницаемость- внутренней мембраны митохондрий, не оказывая влияния на проницаемость по отношению к сахарозе.

4. Характер влияния ano С на окислительное фосфорилирование в митохондриях печени крыс зависит от дозы: в дозе 3 мкг ало С на мг Мх белка при окислении НАД-зависимого субстрата повышалась скорость дыхания в четвертом метаболическом состоянии;что свидетельствует о наблюдаемом эффекте разобщения; увеличение дозы ano С до 6 мкг/мг Мх белка на всех трех изучаемых субстратах (сукцинат, глутамат-малат, пальмитоилкарнитин) приводило к ингибированию окислительного- фосфорилирования.

5. Ano С оказывают активирующее влияние на Fo, Fl-АТФ-азу митохондрий печени крыс.

6. Ano Е (3 мкг/мг Мх белка) стимулируют скорость активного дыхания в метаболическом состоянии 3 при окисление НАД-зависимых субстратов.

7. Действие апоЛПОНП является результирующей величиной »эффектов апопротеинов, входящих в их состав.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации:

1. Добронравова О. Е Структурно-функциональные .измнения митохондрий печени крыс в условиях напряжения организма и влияния на-них сывороточных апопротеинов //Актуальные вопросы патофизиологии: Тез. докл. региональной школы мол. ученых.- Новосибирск, 1985.- С. 24-25.

2. Панин Л. Е., Добронравова О. В. , Колпаков А. Р. Влияние апопротеинов на функциональные параметры митохондрий печени крыс // Мзлекулярные механизмы и регуляция энергетического обмена : Тез. Всес. Симп. - Пущино, 1986. - С. 88.

3. Добронравова О. В. Изменение функционального состояния митохондрий печени крыс при физической нагрузке и в восстановительный период под влиянием продигиозана //Здоровье человека в Сибири: Тез. докл. научно-техн. конф. мол-." ученых. - Красноярск, 1986.- С. 75-77.

4. Добронравова О. К Изменения в дыхательной цепи и структуре митохондрий печени крыс при действии апопротеинов // В сб.: Мэлодые ученые-медики - науке и практическому здравоохранению. - Нэвосибирск, 1989. - С.. 35-36.

5. Добронравова О. К , Колпаков А. Р. Природа адаптационных изменений митохондриального аппарата печени в экстремальных состояниях // Нарушение механизмов регуляции и их коррекция: Тез. 4 Всес. Съезда патофиз. - Кишинев, 1989. - С. 663.

6. Панин Л. Е., Колпаков А. Р., Добронравова О. В., Поляков Л. Ы. К механизму влияния апопротеинов на структурно-функциональные свойства митохондрий // Там же. - С. 626.

7. Колосова Е Г., Колпаков А. Р., Добронравова 0. Е Физико-химические характеристики мембран и фосфорилирующзя активность митохондрий в динамике холодового воздействия // Система терморегуляции при адаптации организма к факторам среды; Тез. Всес. Конф. памяти проф. А. Д. Слонима. - Новосибирск, 1990. - С. 81-82.

8. Панин Л. Е., Нузьменко Д. И., Колпаков А. Р., Колосова Е Г., Добронравова 0. В. Влияние апопротеинов липопротеинов очень низкой и высокой плотности на катионную проницаемость и потенциал внутренней мембраны митохондрий печени крыс // Биомембрана - 1991. - Т. 8, N 7. - С. 743-748.

9. PaninL. Е., Kolpakov A. R., Dobronravova О. V, , Kolosova N. a Oxidative phosphorylation and lipid peroxidation in liver in cold adaptation // Abstracts of Const. Congr. Intern. Soicety forPathoph.- Moscow, 1991.- P. 261.

10. Панин JL E., Колпаков A. P., Колосова E Г. , Добронравова О. E Функции митохондрий печени в динамике холодовой адаптации // В кн. Проблемы терморегуляции и температурной адаптации. Новосибирск, 1992.- С. 74-82.

.Зак Л .Тир. 100 .Печ .л Л, 5 .Бум. otfc. Тип .СО РАМН г.Новосибирск.1993