Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНОГО ПОЛИПЕПТИДА В МИТОХОНДРИЯХ, ЕГО ИДЕНТИФИКАЦИЯ И УЧАСТИЕ В РЕГУЛЯЦИИ ФУНКЦИЙ МИТОХОНДРИЙ.

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНОГО ПОЛИПЕПТИДА В МИТОХОНДРИЯХ, ЕГО ИДЕНТИФИКАЦИЯ И УЧАСТИЕ В РЕГУЛЯЦИИ ФУНКЦИЙ МИТОХОНДРИЙ."

т

На правах рукописи

ОДИНОКОВА ИРИНА ВЛАДИМИРОВНА

Фосфорилирование низкомолекулярного полипептида в митохондриях, его идентификация и участие в регуляции функций митохондрий.

03.00.02 - Биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущина - 2003

Работа выполнена в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН

Научные руководители: доктор биологических наук, проф. кандидат биологических наук

Евтодиенко Ю.В. Азарашвили Т.С.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, проф.

доктор биологических наук, проф.

Маевский Е.Н. Ягужинский Л.С.

Ведущая организация: Институт фундаментальных проблем биологии РАН, Пущино

Защита диссертации состоится «2/ » 200^ •

часов на заседании Диссертационного совета ; Д-002 -Я Институте теоретической и экспериментальной биофизики ' адресу: 142290, г. Пущино Московской области, ИТЭБ РАН

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИТЭЕ "

Автореферат разослан « £ » ЛЄ/^ає/^ 2003 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета Д-002,093.01 Кандидат физико-математических наук

Ланина Н.Ф.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Обратимое фосфорилирование белков является одной из основных посттрансляционных модификаций, ответственных за регуляцию различных видов клеточной активности системой вторичных мессенджеров. Как правило, Са + или сАМР как вторичные мессенджеры изменяют активность протеи нкиназ (ПК) или гтротеинфосфатаз (ПФ), которые в свою очередь поддерживают фосфор!иирован не ферментов-мишеней на определенном уровне. Согласно данным Tomaska, каждый третий белок в эукариотических клетках подвержен обратимому фосфо-рилированию (Tomaska, 2000), Фосфорилирование белка-мишени ведет к конформационной перестройке н соответствующим изменениям его ферментативной активности или взаимодействия с другими клеточными компонентами.

Данные о фосфорилировании митохондриальиых белков и о регуляции функций митохондрий системой вторичных мессенджеров крайне ограничены. За последние 20 лет обнаружено и детально щучено фосфорилирование нескольких дегидрогеназ цикла Кребса, локализованных в митохондриальном матриксе, и соответствующая регуляция активности дегидрогеназ ионами Са24" как вторичными мессенджерами посредством ПК-зависим о IX) фосфорилирования (Bradford and Yeaman, 1986; Denton and McCormack, 1990; Hansford, 1994; Nichols and Denton, 1995; Rutter et al., 1998). Однако до последнего времени отсутствовали какие-либо определенные данные и представления о возможности ПК- и ПФ-зависнмой регуляции таких ключевых процессов митохондрий, как синтез АТР, перенос электронов по дыхательной цепи и транспорт ионов непосредственно через внутреннюю митохоидриальную мембрану. К настоящему времени показано, что ряд белков, фосфорилируемых протеинкиназами, тесно связан с комплексами дыхательной цепи. Фосфобелок с молекулярной массой 18 кДа из митохондрий бычьего сердца идентифицирован как субъединица комплекса I, а фосфобелок 17 кДа — как субъеднница цитохром-«о>-оксидазы; показана также ассоциация 42 кДа фосфобелка с комплексами I, Ш, IV и V митохондрий (Sardanefli et al., 1995; Papa et at., 1996; Steenaart and Shore, 1997). Однако, остается неясным, каким образом фос фор или ровани е/дефос фор ил про ванне мембраносвязанных митохондриальиых белков влияет на функции митохондрий. В целом можно констатировать, что вопрос о возможности регуляции трансформации энергии во внутренней митохондриальной мембране системой вторичных мессенджеров в настоящее время остается открытым.

В связи с вышеизложенным, представляется актуальным исследование фосфорилирования митохондриальных белков с целью возможного выявления новых фосфопептпдов, выяснения их локализации в митохондриях и участия в процессах синтеза АТР и транспорта ионов калышя. Эти исследования позволят выяснить, подвержены ли системы преобразования энергни во внутренней митохондриальной мембране ПК-зависимой регуляции системой вторичных мессенджеров. Цель и основные задачи исследования.

Целью данной работы являлось выявление новых мембраносвязанных фосфопептпдов в митохондриях, исследование факторов, регулирующих

их фосфорилироеание, и выяснение возможности регуляции функций митохондрий путем фосфорилирования/дефосфорилирования этих пептидов,

В соответствии с поставленной целью были определены следующие задачи*.

1. Обнаружение новых фосфорилированных полипептндов в митохондриальной мембране и выявление оптимальных условий для их

Фосфорилирования.

Идентификация вновь обнаруженных фосфорилированных полипептидов и выявление их принадлежности к функциональным системам митохондрий.

3. Демонстрация возможности регуляции фосфорилирования/дефосфо-рилгаования полипептидов ионами Са * как вторичными мессенджерами.

4. Выявление вида протеинкиназ/протеинфосфатаз, осуществляющих фосфорилирование/де фос фор илирование обнаруженных полипептидов.

5. Изучение корреляции уровня фосфорилирования найденных полипептидов с основными параметрами митохондрий; скоростью окислительного фосфорилирования, транспортом Са , мембранным потенциалом и проницаемостью митохондриальных мембран. Научная новизна.

Впервые во внутренней мембране митохондрий обнаружен низкомолекулярный фосфопептид, молекулярная масса которого была определена равной 3.5 кДа согласно его электрофоретической подвижности в полиакрил амид ном геле. Методом им му но преципитации и Вестерн-блоттинга полипептид был идентифицирован как неизвестная ранее фос фор ил и ро ва н ная форма субъединицы «с» FoFi-АТРазы митохондрий и был назван как иммунореактивный к субъединице «с» полипептид (ИРАСП), Установлено, что фосфоршшрование/дефос форилирование ИРАСП модулируется Са в пределах физиологических концентраций, и этот процесс коррелирует с изменением синтеза/гвдролиза АТР FoFi-АТРазоЙ митохондрий. Таким образом, в настоящей работе впервые получены данные, свидетельствующие о возможности регуляции процессов преобразования энергии во внутренней мембране митохондрий системой вторичных мессе нджеров путем обратимого фосфорилирования ИРАСП. Показано, что фосфорилирование ИРАСП активируется бутирил-сАМР, что свидетельствует о том, что фосфорилирование ИРАСП осуществляется сАМР-зависимой ПКА. Установлена взаимосвязь дефосфорилирования ИРАСП с открытием неселективной Са +-индуцируемои, циклоспорин А-чувствительной поры во внутренней мембране митохондрий (тРТР). Найдено, что ИРАСП в дефосфорилированной форме стимулирует открытие тРТР и вызывает увеличение проводимости бислойных липидных мембран (БЛМ) путем формирования в них одиночных каналов проводимости. Научно-практическая ценность.

Обнаружение фосфорилированнои формы субъединицы «с» FoFi-АТРазы открывает возможность регуляции энергопродукции в клетках и митохондриях внешними стимулами (гормонами и др.) путем передачи сигнала с плазматической мембраны клетки посредством каскада вторичных мессенджеров непосредственно на FoFi-АТРазу. Кроме того, участие ИРАСП в регуляции или формировании неселективной митохондриальной поры расширяет представления о строении и функционировании шРТР, открытие которой считается одной из основных стадий развития апоптоза и некроза - явлений, контролирующих морфогенез и регенерацию, а также возникновение разлнчньйс заболеваний и патологии.

Апробация работы.

Материалы диссертации были представлены на 2-ом международном коллоквиуме «Митохондрии и миопатии» (Галле, Германия, 2000), на международной конференции «Митохондрии, клетки и активные формы кислорода» (Пущино, 2000), на 6-ом Европейском Симпозиуме «Са-связывающие белки в нормальных и трансформированных клетках» (Париж, Франция, 2000), на конференции «Митохондрии в патологии» (Пущино, 2001), на конференции «От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям» (Пущино, 2001), на 12-ом международном симпозиуме "Са-связывающне белки и функция кальция в норме и патологии" (Италия, 2002), на международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2003). Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ. Структура диссертации.

Диссертация изложена на _ страницах машинописного текста и

состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения,

выводов и списка цитируемой литературы (_ссылок). Диссертация

иллюстрирована_рисунками.

МЕТОДЫ

Разработка метода фосфорилнровання митохондриалъных белков: Для обнаружения ранее неизвестных фосфорипируемых полипептидов был использован специально модифицированный нами метод фосфорипирования белков митохондрий. В отличие от общепринятой методики (Ferrari et а!., 1990; Sardanelli et al., 1995) в наших экспериментах была использована смесь [у- Р]АТР + немеченая АТР, при этом обшая концентрация АТР составляла 0.5-1 мМ, а проба содержала 5-7 мКи [у- Р]АТР. Использованная нами концентрация АТР является более физиологичной, близкой к концентрации АТР внутри интактных митохондрий и обеспечивает высокую скорость фосфорилнровання. Митохондрии пре инкубировал и в изотонической среде в различных функциональных состояниях. В случае необходимости в среду инкубации дополнительно добавляли требуемые реагенты, действие которых на фосфорилирование мнтохондриальных пептидов в данный момент исследовалось, такие как Ca/EGTA-буферы, ингибиторы ПК/ПФ и т.д. Для регистрации фосфорилирования белков отбирали 50 рл суспензии митохондрий и добавляли 5 цл смеси ([у- PJATP + немеченая АТР). Через 5 минут инкубации при постоянном перемешивании суспензии митохондрии реакцию останавливали добавлением 15 |хл солю-бшшзирукицего раствора, содержащего 0.35 М Tris (рН 7.8), 10%-ный глицерин, 15%-ный SDS, 25%-ный р-меркаптоэтанол. Затем пробы выдерживали в кипящей бане в течение 3 мин. Стандартные методы:

Выделение митохондрий печени крыс линии Вистар проводили методом стандартного центрифугирования (Евтодиенко, 1979). Для разделения мнтохондрнальньи пептидов применяли денатурирующий электрофорез по методу Лэммли (LaemmH, 1970), причем концентрация разделяющего ПААГ составляла 15% для лучшего разделения низкомолекулярных полипептидов, поскольку фосфорилирование белков с молекулярными массами, лежащими в этой области, не было к настоящему времени достаточно хорошо изучено. Для получения радиоавтографов гели экспонировали 3-4 дня на рентгеновской пленке Kodak X-Omat AR-5 (Sigma, США). Отттическую плотность рентге-

новских пленок в зоне локализации [у- PJ-меченых белков определяли с помощью сканирующего денситометра СД-1М (Жиромский и др., 1978). Идентификацию 3,5 кДа лолилептида с субъединицей «с» FjFi-АТРазы проводили методом В естер н-блотпш га. Для иммуноблота белки с ПААГ-электрофореза переносили на мембрану из ноливинилдифлуорида (PVDF). Мембрану инкубировали с полигональными антителами к субьединице «о> {Palmer et al., 1995). Взаимодействие антител к субьединиие «с» с белками выявляли с помощью последующей инкубации PVDF-мембраны со вторичными антителами, связанными с пероксидазой, и дальнейшей хемилюмилесцентной детекцией. Функциональное состояние митохондрий оценивали с помощью ТРР+-и 02-чувствительных электродов (Kamo et al., 1989). Митохондрии (I мг белка/мл среды) инкубировали при комнатной температуре в изотонической среде, содержащей 50 мМ сахарозу, 5 мМ HÉPES (рН 7.4), 100 мМ КС1 и 5 мМ сукцинат калия, кроме того, в среду вносили ротенон (2 цг/мл) и олигомищш (4 рг/мл).

Скорости окислительного фосфорнлирования и гидролиза АТР

определяли с помощью Н -селективного электрода по скорости потребления Н+ после добавления ADP или по скорости освобождения Н\ индуцированного трихлорметоксикарбонилцианидфеннлгидразоном (СССР), принимая стехиометркческий коэффициент в обеих реакциях равным единице (Malmsirom and Carafoli, 1977),

Скорость окислительного фосфорилирования оценивали по времени циклического изменения разности электрических потенциалов (дум) (после добавления АТР), измеренной по распределению ТРР . Активность ff-АТРазы определяли спектоофотометрически по окислению NADH (Cinton and Pedersen, 3979) с А TP-регенерирующей системой (Pullman et а)., 1966). Среда инкубации (3 мл) в этом случае содержала 100 мМ К.С1, 1 мМ MgCl2, 4 мМ КН2Р04, 5 мМ HEPES (рН 7,4), 2 мМ KCN, 1,5 мМ фосфоеколпируват, 0,3 мМ NADH, 20 ед. пируваткиназы, 30 ед. лактзтдеп¡дро геназы и митохондрии (Í мг белка на I мл). Реакцию начинали добавлением АТР (2 мМ).

Са +-ЕСТА-буферы были приготовлены по методу Бера и др. (Вега et al.,

Бнслойные липндные мембраны (БЛМ) формировали из 1-2% раствора соевого азолектина в н-гептане на отверстии диаметром 0.35-U.4 мм в перегородке двухкамерной тефлоновой ячейки, Электрические характеристики мембран измеряли в режиме фиксации потенциала по методу, описанному Mueller и др. (Mueller et al„ 1964). Иллюстрации: на авторадиограммах показаны результаты типичных экспериментов, на диаграммах представлены средние данные из Зх экспериментов.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1.1. Спектр фосфобелков и относительные уровни включениял Р. На рис. 1Wпредставлены распределение белков митохондрий~печени в ПААГ после завершения электрофореза и локализация Р-сддержащих белков, выявляемых лосле инкубации митохондрий с [у- Р]АТР. В условиях наших экспериментов "основными Р-содержащими белками являются полипептиды с молекулярной массой 43-44 и 19-20 кДа, а также низкомолекуляркый полипегггид с молекулярной массой 3.5 кДа, имеющий относительно высокое содержание Р. Относительные уровни включения Р в обнаруженные фос формируемые белки показаны на рис. 1 (Б). В условиях наших экспериментов содержание Р в 3.5 кДа пептиде составляло около 75% от обшего количества ассимилированного радиоактивного фосфата, а 19-20 кДа и 43-44 подипептиды включали

20.! кса —

43.0 ко« .

Рис. I, А: 1,4-еысокомолекулярные(слева)ннкзкомолекулярные(а1рам)белковые маркеры; 2 - гель, окрашенный Coomassie Brilliant Blue R-250; 3 - радиоавтограф "P-меченных белков. Б: Относительные уровни включения НР в мнтохондриалыше белки,

порядка 10 и 15 % "Р, соответственно. В предшествующих публикациях других авторов было показано существование в митохондриях близких по молекулярной массе фосфорилированных белков с Мг 44-47 кДа и 17 кДа (Backer et al., 19So; Ferrari et al., 1990), однако не сообщалось о существовании в митохондриях фосфобелка с молекулярной массой 3.5 кДа. Это обусловлено, на наш взгляд, ограничениями методов, используемых этими исследователями, не позволяющими обнаруживать низкомолекулярные пептида.

Следует отметить, что добавление [у-Р]АТР к предварительно солюбилизиоованным препаратам митохондрий не приводит к появлению Р-меченых белков, в том числе не обнаруживается и 3.5 кДа фосфопептид. Это свидетельствует об отсутствии непосредственного взаимодействия (связывания) [у- Р]АТР с белками в присутствии детергента.

1.2. Влияние EGTA, нагрузки ,иСа и СССР на фосфоридирование 3.5 кДа петттида.

В связи с тем, что 3.5 кДа полипептид является компонентом митохондрий, включающим основное количество Р, и этот компонент ранее не был обнаружен и изучен, мы исследовали, как различные состояния митохондрий могут влиять на фосфорилирование/ дефосфорилирование 3.5 кДа полкпептида. Митохондрии инкубировали в присутствии субстрата окисления при умеренной нагрузке Са , а также в условиях низкого и высокого мембранного потенциала. Как показано на рис. 2 (А), добавление небольшого количества Са (20 нмолъ на 1 мг митохондриального белка), не вызывающего открытие неселективных пор во внутренней митохонлоиальной мембоане.

наоборот, связывание следов Са при ..

уменьшает включение Р. Также сильное подавление включения Р наблюдается при диссипации мембранного потенциала в результате доЭавления СССР. Добавление к суспензии митохондрий блокатора АТР/АОР-транслоказы - карбоксиатрактнлозида - приводит к заметному снижению включения Р в 3.5 кДа полипептид. Это свидетельствует о

приводит к увеличению включения

том, что по меньшей мере частично фосфоршшрование 3.5 кДа полипептида происходит со стороны матрикса, Существенное увеличение включения Р в 3.5 кДа происходит в присутствии бутирил-сАМР, что говорит о фосфорилировании данного полипептида с помошью сАМР-зависимой ПК.

Рис. 2. Влияние условий инкубации на фосфорилнрованке (А) и дефосфорклирояание (Б). 3.5 кДа полнлетпида; 1 - исходный препарат (контроль), 2-50 цМ Са1*, 3-5 (іМ трихлорметоксикарбонилцианидфенилгидразон (СССР), 4-5 цМ карбокснатрактилозид, 5- 10 рМ бутнрил- сАМР, 6-70 цМ ЕвТА, 7 - дополнительный контроль - препарат, зафиксированный сразу же после отделения метки. За условную единицу приията интенсивность включения ЗІР в 3,5 кДа пептид в контрольном препарате.

В связи с тем, что уровень фосфоршшрования белков зависит от активности ПК и ПФ, было изучено влияние условий инкубации митохондрий на дефосфорилирование 3.5 кДа полипептида. Интактные митохондрии инкубировали с [у- PJATP, а затем отделяли от меченой АТР центрифугированием, после чего митохондрии инкубировали в отсутствие меченой АТР в различных условиях в течение 5 минут, когда и происходило ^ефосфорилшоваиие. На рис. 2 (Б) показано, что в присутствии Са содержание Р в 3,5 кДа пептиде несколько снижается, а при связывании примесного Са в среде инкубации посредством EGTA, наоборот, увеличивается, т,е. ионы Са необходимы для дефосфориппровашея 3.5 кДа полипептида. Снижение мембранного потенциала а результате добавления СССР практически не влияет на содержание J? в 3.5 кДа пептиде при инкубации митохондрий в отсутствие [у- Р]АТР, что говорит о том, что мембранный потенциал оказывает влияние на фосфоршшрование 3.5 кДа полипептида протеинкиназами.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что фосфоршшрование 5.5 кДа полипептида снижается при падении мембранного потенциала, что может быть связано с потенциалзависимым изменением состояния полипептида либо с внутримитохондриальным перераспределением протеи нкиназ (Sarrouilbe and Baudry, 1996).

Умеренная нагрузка Са- увеличивает как фосфорилирование, так и дефосфорилирование 3.5 кДа полипептида, а хелатирование ионов Са2"" в среде инкубации посредством ЕО'ГА подавляет его фосфорилирование, что указывает на возможную активацию ионами Са как протеинкиназы, так и проте и нфос ф атазы 3.5 кДа полипептида.

Гл. 2. Очистка и идентификация 3.5 кДа фосфопептида. 2.1. Определение локализации фосфопептида а митохондриях. Известно, что замораживание/размораживание митохондрий приводит к разрушению митохондриальных мембран, а последующее центрифугирование суспензии митохондрий позволяет отделить «растворимые» белки, локализованные в матриксе и в межмембранном пространстве, от мембраносвязанных белков.

Рис. 3. Распределение 3.5 кДа і юли пептида между мембранной и ((растворимой» фракциями митохондрий;

А - схема фракционирования митохондрий (цифрами у камни номера препаратов, использованных для фосфорилирования 3,5 кДа полипептида),

Б - интенсивность включения ''Р в 3.5кДа полипептид в соответствующих препаратах ([• 6). За условную единицу принята интенсивность включения "Р в 3.5 кДа полипептнд в контрольном препарате (I).

В связи с этим интактные митохондрии инкубировали в присутствии [у- Р)АТР, затем быстро охлаждали до +4°С и отделяли от [у- *Р]АТР центрифугированием. Ресуспсндированные митохондрии дважды замораживали/размораживали и затем фракционировали согласно схеме, представленной на рис. 3 (А). Аликвоты каждой фракции подвергали электрофорезу в ПААГ, и уровень включения в 3.5 кДа фосфопептид оценивали, как описано в Методах. Как показано на рисунке 3 (Б), после отделения митохондрий от [у- Р]АТР наблюдается незначительное повышение включения Р в 3.5 кДа фосфопептид. Это может быть

А

инкубация митохондрий в присутствии [у-зїР]А'ГР, 5 мин

Б

супернатант осадок

1 2 3 4 5 6 номер препарата

результатом фосфорнпирования в процессе центрифугирования и ресуспендирования митохондрий. Замораживание/размораживание митохондрий практически не влияет на содержание Р в фосфопептиде. После центрифугирования замороженной/размороженной суспензии митохондрия более 90% 3.5 кДа пептида обнаруживается в осадке, содержащем мембраны митохондрий, и лишь весьма незначительное количество - в супернатанте. Таким образом, можно утверждать, что 3.5 кДа фосфопептид прочно связан с мембранами митохондрий. Следует отметить, что в отдельных экспериментах 3.5 кДа пептид был обнаружен нами в частично очищенных препаратах алигомицин-чувствительной АТРазы, изолированной из митохондрий печени крыс согласно методу, описанному Евтодиенко (Евтодиенко, 1979). Ранее не сообщалось о существовании в мкгохондриальной мембране подобного фосфорили-руемого полипептвда. Однако, в митохондриях были обнаружены низкомолекулярные, гидрофобные, локализованные в мембранной фракции пептиды, как Са "-транспортирующий полипептид (3.0 кДа), выделенный Иенг и Шамо (leng and Shamoo, 1980), и субъединица «с» F0FrАТРазы, молекулярная масса которой в результате аномального поведения при электрофорезе была оценена равной 3.5 кДа (Feamley et al., 1990). В связи с этим была предпринята попытка выделения 3,5 кДа фосфопептида из митохондрий в условиях, которые характерны для выделения гидрофобных мембраносвязанных пептидов, в частности субъединицы «с» F„F гАТРазы.

2.2. Выделение и очистка 3.5 кДа фосфопептида.

Для получения 3.5 кДа фосфопептида митохондрии, фосфорилированные в присутствии [у- PJATP, экстрагировали смесью хлороформ/метанол (хл/м), после чего различные фракции экстракта высушивали, ресуспендировали в солюбилизирущем растворе и подвергали электрофорезу в ПААГ и последующей радиоавтографии. На рис.4 (А) представлены автографы фосфорилированных митохондрий (1), а также хлороформной фазы экстракта (2) и белкового осадка (3),

А Б

Рис. 4. Радиоавтограф" фосфорилированных митохондрий и 3.5 кДа полипегтгида после зкстршши смесью хлороформ/метанол в различных фракциях.

А - после экстракции митохондрий смесью хлороформ/метанол (1-3); Б - после вторичной экстракции хлороформной фракции (4-6) (объяснение ем, в тексте).

который в процессе экстракции не перешел в раствор хлороформ/ метанола. Из рисунка видно, что основная часть 3.5 кДа полипептвда находится в хлороформной фракции, причем других пептидов, включающих Р, в ней не наблюдается, и только незначительное количество 3.5 полипепептида остается в нерастворимом белковом осадке. Для дополнительной очистки фосфопептида хлороформную фазу экстракта подвергли вторичной экстракции. Рис. 4 (Б) показывает, что ни в одной из фракций не содержится иных фосфопептидов, кроме 3.5 кДа полипептида, который, как и на предыдущей стадии очистки, сосредотачивается в органической фазе (4), а в фазе метанол/Н20 (5) и в осадке из раствора на границе раздела фаз (6) содержится лишь в следовых количествах.

Эти данные позволяют утверждать, что 3.5 кДа фосфопептнд полностью экстрапр»уется из митохондрий в тех же условиях, что и субъединица «с»

2.3.' Идентификация 3.5 кДа пептида как полипептида, иммунореактивного к антителам к субъединице «с» FflFr-ATPa3bi. Представленные выше данные о локализации 3.5 кДа полипептида и условиях его выделения и очистки подтверждают наше предположение о том, что данный пептид, возможно, является субъединицей «с» F0Fp АТРазы. Дальнейшая идентификация данного полипептида осуществлялась методом Вестерн-блоттинга, как описано в Методах. В качестве контроля использовалась субъединица «с» из липофусциновых гранул мозга овец, любезно предоставленная проф. Д. Палмером (Lincoln University, New Zealand).

Рве. 5. Иммуноблот 3,5 кДа полнпеггтида с антителами к субъедннице «с» FjFi-АТРазы. 1 - митохондрии, 2 - 3.5 кДа пол и пептид, элюнрованный с ПААГ после электрофореза, 3 - субъединица «с» из липофусциновых гранул.

Как видно из рисунка 5, как 3.5 кДа полипептид из мнтохонирий (1), так и он же, очищенный с помощью препаративного электрофореза (2), реагируют с антителами к субъединице «с» Р^-АТРазы. Эти результаты также подтверждают наше предположение о том, что фосфорилиро-ванный 3.5 кДа полипептид из внутренней митохондриальной мембраны, очевидно, является фосфорилированной формой субъединицы «с». Однако, поскольку определение последовательности аминокислот для 3.5 кДа полипептида не было проведено, мы не вправе называть его субъединицей «с», поэтому для обозначения данного полипептида в дальнейшем будет использоваться название «иммунореактнвный к антителам к суоъединице «с» полкпептид (ИРАСП)».

Гл. 3. Фосфорилирование ИРАСП к активность Р,ГгАТРазы.

3.1. Влияние ионов Са * на окислительное фосфорилирование и активность F^Fj-АТРазы.

Как показано на рис. 6 (А), добавление ADP к митохондриям в присутствии фосфата приводит к синтезу АТР сопровождающемуся потреблением ионов Н. Последующее добавление СССР вызывает гидролиз образовавшейся АТР и освобождение ионов водорода. Предварительная аккумуляция митохондриями 50 рМ Са + приводит к

значительному снижению скорости окислительного фосфоршпірования; время, необходимое для фосфорилировдния добавленной ADP, увеличивается почти вдвое. Аккумуляция Са в митохондриях вызывает также заметное снижение скорости гидролиза АТР, индуцируемого СССР. Торможение окислительного фосфорилирования ионами Са видно и по изменению мембранного потенциала: предварительная нагрузка митохондрий ионами Са приводит к снижению амплитуды

EGTA ADP

A DP

JTPP^M ^

0-3. .

1.0 1J

Рис 6. Влияние ионов Со'4, на изменение концентрации ионов 1Г* в среде (А) и трансмембранного потенциала (¿Тм) в митохондриях (Б). Среда инкубации: 200 мМ маннит, 50 мМ КС1, 2 мМ НЕРЕ5 (рН 7,4), 2 мМ КН1Р04> 5 мМ сукиииагг, 3 цМ роте нон. Добавки: митохондрии (2 мг белка/1 мл), 120 цМ АБР, 0,5 цМ СССР, 50 цМ СаС|г, 50 цМ ЕОТА. Цифры у кривых — скорости потреблення/осво-бождешя ионов 1Г (нг-атом /мин на 1 мг белка); и ¿1г • время фосфорилирования добавленной ДСР в отсутствие и в присутствии Са1*.

д¥м в ответ на добавку ADP, а время фосфорилирования добавленной ADP существенно увеличивается (Рис. 6, Б).

Так как аккумуляция небольших количеств Са влияла на фосфорилирование ИРАСП, то мы определили зависимость этого эффекта в физиологическом диапазоне концентраций Са * (5x10-5x10' М) с использованием Ca-EGTA-буферов (рис. 7) в условиях, где проявляется действие Са + как вторичного мессенджера. При низкой концентрации свободного Са в среде инкубации, равной 5x10 -5x10 М (концентрации, характерные дня клеток в состоянии покоя), наблюдается относительно низкая скорость окислительного

?!осфорнлирования, принятая за 100%. Повышение свободного Са до х10"-10' М (концентрация, характерная для возбужденных клеток) приводит к заметному увеличению скорости синтеза АТР. При дальнейшем повышении [Са Ч до уровня 5x10 М происходит выраженное угнетение окислительного фосфорилирования. Аналогичная зависимость от концентрации Са + также имеет место при измерении АТРазной активности митохондрий. Как снижение, так и увеличение концентрации Са в среде приводит к заметному снижению АТРазной активности. Таким образом, из полученных результатов можно заключить, что ионы Са + при увеличении их концентрации до 5x10* М активируют как синтез, так и гидролиз АТР, что указывает на то, что регуляции подвергается непосредственно АТР-синтетазный комплекс. Кроме того,

Рис. 7. Зависимость скоростей синтеза и гидролиза АТР в митохондриях от концентрации Са1*;

1 - скорость окислительного фосфорилирования, измеренная как показано на рис. 7;

2 • АТРазиая акгииность, измеренная с регенерирующей системой. За 100% приюты активности в присутствии 5х 10"* М Са1*. Условия инкубации см, в разделе Методы.

подтвержден ранее описанный (Лейкин, Виноградов, 1971) выраженный ингибирующн й эффект Са на окислительное фосфорилирование м АТРазкую активность митохондрий при увеличении концентрации Са до 5x10* М. Биологический смысл этого процесса не вполне ясен, но можно предположить, что угнетение ионами Са АТРазной активности может предотвращать футильный гидролиз АТР при деэнергизации митохондрий и открытии неселективных пор во внутренней митохо ндриальной мембране,

3.2. Влияние физиологических концентраций Са на фосфорилирование/ дефосфорилирование ИРАСП'

Отчетливое влияние Са на систему окислительного фосфорилирования может быть связано с Са +-зависимой актнвациеи/ингибнрованлем локализованных в митохондриях протеинкиназ и/или протеинфосфатаз с последующим фосфорилированием/дефосфорилированием компонентов F0Fi-ATPa3bi, ответственных за синтез/гидролиз АТР. Обнаруженный нами 3.5 кда полипептид (или ИРАСП), по всей вероятности, имеет отношение к АТРазной системе, и ранее мы наблюдали зависимость фосфорилирования ИРАСП от присутствия Са . В связи с этрм мы изучили действие физиологических концентраций Са на фосфорилирование ИРАСП. Для этого митохондрии инкубировали в среде, содержащей [у- PJATP в Ca-EGT А-бу фере, и после инкубации белки разделяли методом гель-электрофореза. Как показано на рис. 8 (кривая 1), при низкой концентрации Са (10" М) уровень фосфорили-

Йівания ИРАСП в несколько раз выше, чем при [Са:+] 5хГ0"-10 М. альнейшее увеличение концентрации Са до 5x10 М в Ca-EGTA-буфере или добавление Са к митохондриям в концентрации Ю М вызывает повышение уровня фосфорилирования ИРАСП. Снижение уровня фосфюрнлирования ИРАСП при повышении концентрации ионов Са от 10 до 10* М можно объяснить двумя причинами -ннгибированием протеинкиназ или активацией протеинфосфатаз. Для того, чтобы найти, какой из ферментов ответственен за наблюдаемый эффект, мы отделяли митохондрии от [у- Р1АТР центрифугированием и инкубировали митохондрии, содержащие Р-меченые фосфопротеины в отсутствие АТР в Ca-HGTA буферах. Как показано на рисунке 8 (кривая 2), количество Р, в ИРАСП снижалось при повышении концентрации Са от 10 до Ю М. Это означает, что именно активация ионами Са протеинфосфатаз является причиной дефосфоршіирования ИРАСП. Небольшое влияние Са * на активность протеинфосфатаз наблюдалось

Рис,

8,

Зависимость

І во

о. №

в ф

І «

10*

—

ю-'

10*

10а

включения Р в ИРАСП от

концентрации Са":

1 • уровень фосфорклирова» нкя пептида в присутствии АТР;

2 - уровень фосформирования пептида, сохраняющийся при инкубации митохондрий в отсутствие [у-нР]АТР. За 100% принят уровень фосфорклирования в присутствии Ю4 МСа1*.

[Са2*], М

при высоких концентрациях Са (10' -10" М). Полученные результаты покрывают, что механизм активирующего и ннгибирующего действия Са может быть опосредован прежде всего Са '-зависимой модуляцией активности протеинфосфатазы при низких концентрациях Са (10-К)'2+М^^,^во^можно, протеинкиказы в области высоких концентраций

Следует отметить, что как в матриксе, так и во внутренней мембране митохондрий обнаружены ПК и ПФ различного типа, в том числе и Са -активируемая протеинкиназа С (Реагп1еу й а!., 1990). Логично предположить, что именно эти ферменты регулируют фосфорилирование ИРАСП, химическая модификация (фосфорилирование) которого существенна для активности Р0РгАТРазы митохондрий.

0.05

а

V 03 Ё

ол 1.0

Са!" Са>. ссср

I М п

••ч —«* / 4 —1

3

І.5

о.

8

I 0,5

0.0

і

X

І

І

Рис. 9. Влияние открытия тРТР на фосфорилирование ИРАСП. А - изменения при нагрузке Са1* или добавлении СССР (добавки: Са1* (200 Су;А (1 ЦМ), СССР (0.5 пМ); Б-средкий уровень фосфорилироаания ИРАСП в ал и квотах 1-5 (за единицу принят уровень фосфорклирования ИРАСП в контроле).

Гл. 4. Фосфорнлирование ИРАСП и открытие тРТР,

4.1. Дефосфорилирование ИРАСП при открытии тРТР и падении мембранного потенциала.

Открытие во внутренней митохондриальной мембране неселективных Са-чувствительных пор, именуемых тРТР, является одной важных функций митохондрий. .Для того, чтобы изучить влияние открытия тРТР На фосфорнлирование ИРАСП, митохондрии инкубировали в различных условиях при пороговой нагрузке Са , которая индуцировала открытие шРТР в присутствии и в отсутствие CysA.

Контроль за митохондриальным потенциалом осуществлялся с помощью ТРР -электрода. В точках, указанных на рис. 9 (А), отбирали алшвоты митохондрий и подвергали их фосфорилпрованию, как описано в Методах. Как показано на рис. 10 (А), при пороговоЙ.нагрузке Са имеет место диссипация мембранного потенциала, a CysA — специфический ингибитор тРТР — способен предотвращать падение потенциала. Как видно из рисунка 9 (Б), после Са -индуцированного открытия тРТР включение Р в ИРАСП сильно уменьшалось, а после такой же нагрузки Са , но в присутствии CysA, включение меченого фосфата наоборот несколько увеличивалось. Очень низкий уровень включения Р в ИРАСП наблюдался также после падения мембранного потенциала, индуцированного СССР, который может способствовать открытию шРТР. Следует отметить, что CysA является специфическим ингибитором протеинфосфатазы РР2В (кальцинейрина). Таким образом, можно предположить, что наблюдаемое снижение уровня фосфорилировання ИРАСП при открытии тРТР является результатом повышения уровня дефосфорилировання данного лолипептида, и CysA может ингибировать этот процесс. Известно, что CysA блокирует открытие тРТР вследствие устойчивого связывания с митохондриальным белком — циклофилином (Nicolii et.al., 19961 а формирующийся комплекс является в свою очередь ингибитором фосфатазной активности кальцинейрина (Papageorgiu et al, 1994, Rusnak and Mertz, 2000). На основании полученных результатов, показывающих, что Са -индуцированное и СузА-чувствительное дефосфорилирование ИРАСП происходит при открытии шРТР, мы сделали заключение, что этот процесс может быть связан с циклофилином и, возможно, ингибируется кальцинейрином. 4,2 Влияние ИРАСП на процесс открытия неселективной митохондриальной поры.

Нами было исследовано влияние изолированного препарата ИРАСП, а также антител к субъединице «с», добавленных к митохондриям, на процесс открытия шРТР и < фосфорнлирование ИРАСП в митохондриальной мембране. Как видно из рис, 10 (А), и контрольном эксперименте тРТР открывалась после двух добавок Са (критическая нагрузка около 150 ¡1М). После преинкубации митохондриальной суспензии с 10 ил ИРАСП (10 рл ИРАСП соответствовали препарату, полученному из1б дг митрхондриального белка) для индукции шРТР было достаточно 30 ¡iM Са . Также в этих условиях наблюдали сильное снижение фосфорилировання ИРАСП в митохондриальной мембране (рис. 10, А). Инкубация митохондрий с антителами к субъединице «с», которые, предположительно, могут связывать эндогенную субъединицу «с», приводила к увеличению критической нагрузки Са и практически не оказывала влияния на фосфорнлирование полипептида. Следует заметить, что в описанном эксперименте использовали дефосфорнлированную форму ИРАСП, фосфорилнрованную форму также тестировали, н ее действие на проницаемость митохондриальной мембраны было существенно меньшим.

•■S ■ 1.* .

; uj

С г.0

I

£ 1.5

Л

і-«

ї

і 0.3 ■

контроль преннкубация преннкубаїшя с AT

с ИРАСП к субъединяце «с»

Сі1*

й*

0.0

1

Я

ҐЛ

I

Рис. 10, Влияние ИРАСП на процесс открытия тРТР.

Изолированны« митохондрии преинкубиро-вали 1.5 ч, при +4°С в отсутствии каких либо добавок (контроль), а также в присутствии 10 цл ИРАСП, выделенного из митохондрий печени крыс и очищенного методом препаративного электрофореза. Точки 1, 2 - контроль; точки 3,4 - превнкубшн» с ИРАСП, точки 5, 6 -преиикубаыия в присутствии антител к субьеди-кице «с».

А - изменение мембранного потенциала при Са1^ нагрузке Оя добавка Са - 30 цМ, 2я добавка - 120 цМ); і і

£ - уровень фосфорили-рования ИРАСП в образцах 1-6.

Полученные данные позволяют предположить, что способность Mg-ATP закрывать неселективную мигохондриальную пору, показанная ранее в нашей лаборатории (Evtodienko, 2000), может быть объяснена фосфорилированием субъединицы «с» митохондриальной АТРазы. Хорошо известно, что открытие тРТР сопровождается набуханием митохондрий. Нами было показано, что добавление ИРАСП к суспензии митохондрий вызывает их набухание, зависимое от концентрации добавленного пептида.

Таким образом, обнаруженное нами почти полное дефосфорилирование ИРАСП при открытии тРТР может играть^ существенную роль в формировании пассивных неселективных или ЬГ-специфических ионных каналов во внутренней митохондриальной мембране. Это может происходить как в результате прямой модификации IT-каналов FoFr АТРазы, в которой принимает участие суоъединица «с», так и в результате изменения взаимодействия субъединицы «с» с другими суоьединицами секторов Fo и Fi.

Мы предполагаем, что фосфорилированная форма субъединицы «с» принимает участие в «активном» или «сопряженном» транспорте ионов W через FoFrАТР-синтетазу, что приводит к синтезу ATP, а дефосфорилированная форма субъединицы «с» участвует в «пассивном» (((бесполезном») транспорте ионов, при котором происходит разобщение Fo и Fj секторов АТР-синтетазы. 4 3. Влияние ИРАСП на проводимость БЛМ.

Нами была проверена способность ИРАСП формировать каналы в искусственных бислойкых мембранах (БЛМ). Были получены две формы пептида: фосфорилированная форма (препарат с преобладающим количеством фосфорилированного ИРАСП, полученный методом препаративного электрофореза из митохондрий, фосфорилированных в присутствии MgATP) и дефосфорилированная форма (препарат с преобладающим количеством дефосфорилнрованной формы,

1С рЛ

1-й

Рис. П. Изменение проводимое™ БЛМ при добавлении а среду - 20 мкл препарата ИРАСП.

А • каналы с быстрой кинетикой, образующиеся в присутствии препарата фосформированного ИРАСП; Б - каналы с медленной кинетикой, образующиеся в присутствии препарата дефосформированного полипептнда.

Рис. 12. Одиночные ионные каналы, зарегистрированные при добавлении ~5 мкл препарата ИРАСП, А - Ьиг£ы1ке каналы, образующиеся в присутствии препарата фосфорилирован-иого ИРАСП; Б - каналы с относительно медленной кинетикой, образующиеся в присутствии препарата дефосфорнлиро-ванного ИРАСП,

полеченный тем же методом из митохондрий, в которых была открыта РТР при добавлении соответствующей концентрации Са ). Электрофоретически очищенный препарат ИРАСП при добавлении с одной стороны бислоя вызывал увеличение проводимости БЛМ на 2-3 порядка. Рост проводимости обуславливался образованием в мембране ионных каналов, характеризующихся различной величиной амплитуды проводимости и кинетикой перехода между состояниями (рис. II)- При использовании меньших концентраций ИРАСП удалось зарегистрировать одиночные ионные каналы с амплитудой 15-2000 р£ (рис. 12). Каналы с быстрой кинетикой переключения между открытым и закрытым состояниями (12, А) наблюдались при использовании фосфорили-рованной формы ИРАСП. В присутствии дефосфорилированной формы ИРАСП возникали более устойчивые каналы с медленной кинетикой, которые практически не переходили в закрытое состояние (рис. 12, Б.). Следует заметить, что возникновение каналов с быстрой и медленной кинетикой было характерно для обеих форм препарата, однако при добавлении дефосфорилированной формы ИРАСП наличие каналов с «быстрой» кинетикой регистрировали в 27% случаев от общего числа

наблюдений, в то время как в случае с фосфорилированиой формой субъединицы «с» - в 43%.

Кроме того, распределение каналов по проводимости имело в случае препаратов фосфорилированиой субъединицы «с» выраженный сдвиг в область менее проводящих состояний по сравнению с дефосфорилированной формой субъединицы «с», что подтверждается смещением амплитуд с - 190 рЭ (для дефосфорилированной формы) до -80 р5 для фосфорилированнон формы. Результаты, полученные на БЛМ, показывают, что фосфорилированне ИРАСП: 1) увеличивает чувствительность каналов к потенциалу, 2) уменьшает время жизни канала в открытом состоянии, 3) уменьшает среднюю проводимость канала в 2,4 раза.

ВЫВОДЫ:

1. Впервые обнаружено преимущественное фосфорилированне низкомолекулярного (3.5 кДа) полипептида в митохондриях печени крыс. Показано, что 3.5 кДа полипептид включает около 75% Р из [у- Р]АТР от общего количества радиоактивного фосфата Р-меченых белков митохондрий.

2. Установлено, что 3.5 кДа полипептид родственен или идентичен субъединице «с» Р„РгАТРазы митохондрий. Этот вывод был сделан на основашш сходства молекулярных масс и специфического взаимодействия данного полипептида с антителами к субъединице «с», показанного с помощью метода Бестерн-блоттинг. 3,5 кДа полипептид был назван пептидом, иммунореактивным к антителам к субъединице «с» (ИРАСП).

3. Обнаружено, что уровень фосфорилирования ИРАСП зависит от концентрации ионов Са * в пределах физиологических концентраций (10"-10 М), Продемонстрировано влияние ингибиторов протеинкиназ/ протеиифосфатаз на уровень фосфорилирования ИРАСП. Сделано заключение о том, что фосфорилирование/дефосфорилнрование ИРАСП в митохондриях регулируется Са как вторичным мессенДжером посредством Са -зависимых протеинкиназ а протеинфосфатаз,

4. Исследована биологическая значимость фосфорилирования ИРАСП. Показана корреляция между уровнем фосфорилирования ИРАСП и скоростью окислительного фосфорилирования в митохондриях. При измененини концентрации свободного Са + от 10 до Ю М наблюдалось частичное дефос формирование ИРАСП и повышение скорости синтеза

5. Выдвинута идея о том, что при активации клеток внешними стимулами рост внутриклеточного Са ведет к активации окислительного фосфорилирования в результате дефосфорнлирования ИРАСП во внутренней мигохондриальной мембране в дополнение к общеизвестной активации ионами Са+ ферментов цикла Кребса в матриксе митохондрий.

6. Показана корреляция открытия неселективных, Са +-индуцируемых пор (тРТР) во внутренней митохондриальной мембране и уровня фосфорилирования ИРАСП. Полное дефосфорнлирование ИРАСП, наблюдаемое при открытии тРТР, предотвращалось циклоспорином А -селективным ингибитором шРТР. Обнаружено, что изолированная дефосфорилированная форма ИРАСП способна значительно повышать проницаемость мембран митохондрий и искусственных фосфодипидных мембран. Предложена гипотеза, согласно которой дефосфорилированная форма ИРАСП может принимать участие в формировании шРТР.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Азарашвили Т.С.,' Одинокова И.В., Евтодиенко Ю.В, Фосфорилироваиие низкомолекулярного полипептида в митохондриях печени и зависимость его фосфорилирования от функционального состояния митохондрий, Биохимия, 1999, 64, с. 668-673,

2. Евтодиенко Ю.В., Азарашвили Т.С., Теплова В.В„ Одинокова И.В., Сарис. Н.-Э. Регуляция ионами кальция окислительного фосфорилирования во внутренней мембране митохондрий печени крысы. Биохимия, 2000,65, с. 42т4б.

3. Azarashvili T.S., Tyynela J., Odinokova I.V., Grigoijev P.A., Baumann M., Evtodienko Yu.V, and Saris N.-E. Phosphorylation of a peptide related to subunit с of the FoFl-ATPase/ATP synthase and relationship to permeability transition pore opening in mitochondria. J. Bioenerg. Biomembr., 2002,34(4), 279-284.

4. Odinokova I.V., Azarashvily T.S., Evtodienko Yu.V. Participating of 3.5 kDa inner membrane mitochondrial phosphopeptide in mitochondrial PTP opening. 2nd Colloquium on Mitochondria and Myopathies in Halle/Saale, March 31 - April 2,2000. Hurop. J. of Med. Res., vol. 5 (1), p. 130.

5. Одинокова И.В., Азарашвили T.C., Тюнелла Я., Бауманн М., Евтодиенко Ю.В., Сарис Н.-Э. С а2+-модулируемое фосфорилироваиие 3.5 кДа пептида митохондрий печени крысы. Международная конференция «Митохондрии, клетки и активные формы кислорода», Пущино, 6-9 тоня, 2000, с. 1134-115.

6. Azarashvili Т., Odinokova I., Evtodienko Yu. Ca2+-modulated phosphorylation of low molecular mass polypeptide of mitochondria and its correlation with ATP synthesis/hydrolisis. 6 Eur. Symp. on Ca-binding proteins in normal and transformed cells. Paris, France, June 14-17,2000, p. 9.

7. Крестинина O.B., Азарашвили T.C., Одинокова И.В., Евтодиенко Ю.В. Роль субъединицы с FoFi-АТРазы в липофусцинозе. «Митохондрии в патологии». Пущино, 2001, с, 217-219.

8. Т.С. Азарашвили, И.В. Одинокова, О.В. Крестинина, С.Ш. Гаджиева, Ю.В. Евтодиенко. Новые свойства субъединицы «с» FoFj-АТРазы. «От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям», Пущино, 24-26 октября, 2001, с. 35-36.

9. Azarashyvili Т., Odinokova I., Teplova V., Tyynela J., Baumann M., Evtodienko Yu., Saris N.-E. "F0Fi-ATPase as a new Ca-regulated system in mitochondria. XII International Symposium on Calcium Binding Protein and Calcium Function in Health and Desease, Cavalese, January 29(b- -Febr,3'b, 2002, Italy, p. 46. ,

10. И,В. Одинокова, Т.С, Азарашвили, В.И. Терновский, А.Г, Бакунц, Ю.В. Евтодиенко, Н.-Э. Сарис. Саг+-зависимое фосфорилирование/дефос-форилирование субъединицы «с» F0FrATPa3bi и ее участие в регуляции проницаемости мембран митохондрий, Международная конференция «Рецепция и внутриклеточная сигнализация», Пущино, 16-18 июня 2003, с. 265-267.

»20 958

Научно« издание Автореферат И .В.Одиноковой

Налоговая льгота- общероссийский классификатор продукции ОК-М5-93, том 2; 953000 - книги и брошюры

13.11.2003г. 3. 9933Р. Т. 100экз. Усл. печ. л, (,0.

Отпечатано с оригикала-макета в Объединенном научно-техническом издательстве ПНЦ РАН

142290, г. Пущи но Московской обл., проспект Науки, 3. ОНТИ,