Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Синтез АТФ митохондриями, индуцированный скачкообразным повышением рН

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Маленкова, Ирина Владимировна

Введение

Глава I. Концепции окислительного фосфорилирования обзор литературы)

Строение электронтранспортной цепи митохондрий.

Кинетика переноса электронов в митохондриях.10 Сопряжение экзергонических и эндергонических процессов.

Структура и-механизм действия АТФсинтетазы.

Теории окислительного фосфорилирования.

Хемиосмотическая теория.

Конформационные теории сопряжения окисления и фосфорилирования.

Глава 2. Материалы и методы.

Выделение митохондрий.

Определения коэффициента дыхательного контроля37 Определение содержания электронтранспортных цепей.

Определение количества АН в митохондриях радиоизотопным методом.

Определение количества АТФ по изменению содержания неорганического фосфата.

Методика изучения синтеза АТФ митохондриями при скачкообразном изменении рН.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 3. Влияние скачкообразного изменения рН на фосфо-рилирование в нативных митохондриях.

Глава 4. Индуцируемое быстрш изменением рН фосфорилирование в разобщенных митохондриях.

Обсуждение.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Синтез АТФ митохондриями, индуцированный скачкообразным повышением рН"

Пути утилизации энергии в клетке давно привлекают внимание ученых. Важную роль в этих процессах играют специальные органеллы клетки - митохондрии. В митохондриях осуществляются два взаимосвязанных процесса: окисление органических субстратов (НАДН, сукцината и других) молекулярным кислородом, катализируемое сложной полиферментной системой (электронтранспорт-ной цепью) и синтез АТФ АТФсинтетазой из АДФ и неорганического фосфата. АН является основным унифицированным источником энергии для многих клеточных процессов.

Энергия, выделяющаяся цри окислении субстратов дыхания, используется АТФсинтетазой для синтеза АТФ, содержащей т.н. макроэргическую связь. Поскольку оба этих процесса происходят с участием мембранносвязанных ферментов, синтез АТФ в митохондриях получил название мембранного (окислительного), в отличие от субстратного фосфорилирования. Изучение путей и механизмов трансформации энергии окисления субстратов в макроэргическую связь АТФ в окислительном фосфорилировании является актуальной проблемой современного этапа биоэнергетики. Несмотря на большой объем экспериментальных и теоретических исследований, выполненных в этом направлений, вопросы, связанные с механизмом действия АТФсинтетазы и с сопряжением энергодонорных окислительных процессов с энергоакцепторными процессами синтеза АТФ остаются по настоящее время невыясненными до конца.

В последнее время получили распространение три концепции окислительного фосфорилирования: хемиосмотическая концепция Митчелла [ I ] , конформационная концепция Бойера £ 2] и конфор-мационно-релаксационная концепция Блюменфельда .

В соответствии с наиболее распространенной 4 в настоящее время хемиосмотической теорией при переносе электрона от субстрата к кислороду по ЭТЦ происходит транслокация протонов через внутреннюю мембрану митохондрий, приводящая к образованию трансмембранного электрохимического потенциала протонов. Этот трансмембранный электрохимический потенциал, по мнению Митчелла, и является первичным макроэргом. Синтез АТФ в соответствии с этой концепцией осуществляется при прохождении протонов по градиенту концентрации. С этими представлениями согласуются ряд экспериментальных данных. Однако, в последнее время появился целый ряд экспериментальных результатов, неподдающихся объяснению в рамках концепции Митчелла (более подробно об этих результатах и о самой концепции смотри в главе I).

В концепции мембранного фосфорилирования Бойера важная 5 роль отводится конформационным изменениям в белках, расположенных в пунктах сопряжения окислительного фосфорилирования. В одном из последних вариантов конформационной теории, энергия, выделяющаяся при окислении субстрата, затрачивается на перевод синтезированной молекулы АТФ из связанного с ферментом состояния в свободное. Бойер полагает, что для АДФ и Фн, связанных с АТ&синтетазой равновесие реакции АДФ + Ф^*^ АТФ смещается.

XI вправо. А для перевода молекулы АТФ в раствор молекула фермента должна перейти в новое конформационное состояние, обладающее пониженным сродством к АТФ. Энергия, необходимая для перевода АТФсинтетазы в эту новую конформацию может передаваться ферменту либо при непосредственном взаимодействии с локализованным в пункте сопряжения компонентом ЭТЦ, изменяющим свою конформацию при окислительно-восстановительных переходах, либо опосредовано,путем конформационного изменения в мембране и возникновения градиента рН/>, б] .

Согласно конформационно-релаксационной концепции 6 , предложенной Блюменфельдом, энергия, освобождающаяся при переносе электрона от субстрата к кислороду запасается в форме .конформа-ционно-неравновесных состояний отдельных переносчиков,их комплексов с АТФсинтетазой или мембранв в целом (более подробно об этом см. гл.1).Образование АТФ осуществляется в процессе релаксации конформационно-неравновесной формы электронного переносчика-трансформатора связанного с АТФсинтетазой.Другими словами, на синтез АТФ используется энергия,выделяющаяся в ходе релаксации конформационно-неравновесной формы электронного переносчика. По мнению автора конформационно-неравновесные состояния АТФсинтетазы могут реализоваться не только при взаимодействии с работающей ЭТЦ,но и при достаточно быстром изменении таких факторов общего действия как температура,рН,диэлектрическая постоянная среды и т.д.

Цель настоящей работы заключалась в исследовании принципиальной возможности синтеза АТФ митохондриями при скачкообразном изменении рН.

Работа состоит из введения,четырех глав и выводов. В первой главе рассматриваются современные теории окислительного фосфорилирования.Методика эксперимента описана в главе второй.Экспериментальные результаты и их обсуждение содержатся в третьей и четвертой главах.В главе три приведены результаты экспериментов по исследованию влияния скачкообразного изменения рН на фосфорилирующую активность нативнох митохондрий. Показано,что при быстром повышении рН в фосфорилирующих митохондриях увеличивается выход АТФ.Повышение выхода АТФ наблгает-ся только в процессе изменения рН. Анализ результатов по действию ингибиторов электронного транспорта дыхательной цепи и АТФсинтетазы,а также значения исходного и конечного рН на величину наблюдаемого эффекта,показал, что увеличение синтеза АТФ, по-видимому, связано со структурными изменениями в олигомицин-чувствительном АТФ-синтетазном комплексе,которые возникают вследствие быстрой ионизации некоторых групп белка,инициируемой быстрым защелачиванием среды.Эти результаты получили подтверждение в экспериментах с митохондриями, в которых окислительное ф осфорилирование исходно разобщено старением или переморажи-ванием.

В главе 17 показано, что в разобщенных такими способами митохондриях, в присутствии субстратов фосфорилирования и сукцината, при быстром изменении рН от 5-7,5 до 8,3-10 синтезируется в пересчете на одну ЭТЦ до трех молекул АТФ. Для образования АТФ в систнме необходимо,чтобы в процессе изменения рН проходило через значение 8,0. Величина эффекта при этом не зависит от разницы между конечным и начальным рН,если рН превышает 0,7. На одном и том же образце митохондрий вышеописанный эксперимент может быть воспроизведен без существенных изменений в конечном результате много раз. Эти и другие факты свидетельствуют о том, что регистрируемый в эксперименте АТФ возникает вследствие срабатывания АТФ-синтетазного комплекса при быстром повышении рН, а не за счет диссоциации и выхода в раствор прочносвязанных с АТФсинтетазойт нуклеотидов. Опыты с различными субстратами (сукцинат ,НАДН, аскорбат+ТМПД ) и ингибиторами переноса электронов дыхательной цепи (ротенон,антимицин, СО) и изменением содержания кислорода в системе показали, что для эффективного действия АТФсинтетазы (при рН-ударе) в разобщенных митохондриях необходимо, чтобы ЭТЦ находилась в частично восстановленном состоянии. Это согласуется с полученными в работе результатами по влиянию редокс состояния ЭТЦ разобщенных митохондрий на их АТФазную активность. При этом электронный транспорт, по-видимому, не является обязательным.

- 10

КОНЦЕПЦИИ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО ФОСФОРИЛИРОВАНИЯ ( Обзор литературы) Строение электронтранспортной цепи митохондрий.

Окислительное фосфорилирование играет важную роль в биоэнергетике клетки.При окислительном фосфорилировании энергия окисления субстратов преобразуется в энергию ,так называемой, макроэргической связи АТФ,которая затем используется в различных энергоакцепторных процессах клетки. Ферменты окисления субстратов и фосфорилирования сосредоточены в митохондриях.

Строению митохондрий и механизму их функционирования посвящено большое количество работ. 7 8 Поэтому в данном обзоре мы лишь кратко остановимся на этом вопросе. Как известно, митохондрии представляют собой замкнутые везикулы,образованные липопротеиновыми структурами. Различают внешнюю и внутреннюю мембраны .Внешняя мембрана митохондрий проницаема для большинства низкомолекулярных соединений. Внутренняя мембрана проницаема только для очень ограниченного числа малых нейтральных. молекул и непроницаема для большинства заряженных ( Н, ОН ). £ 9,10,IIJ . Окисление субстратов кислородом осуществляется сложной полиферментной системой,электронтранспортной цепью,строение которой представлено на рис.1. ЭТЦ митохондрий представляет собой последовательность более или менее фиксированных структурно различных переносчиков электронов,расположенных в порядке увеличения их окислительно-восстановительных потенциалов. НАДНдегидрогеназа и сукцинатдегидрогеназа [*12,1з[) ,катализирующие перенос электронов от соответствующих субстратов на уби-хиноны представляют собой сложные субъединичные ферменты,содержащие железосерные центры и флавиновые коферменты.Убихинон

Ко"AtWMWftHOt^ Ф

ЖИРНЫХ кислот п ГпИЦЕРОП-^-Фп

Cvkivhhat -*Фп FeS т^т99

ЧчАСТКШОМО- 1|ЧЙСТвц1 рилировйния

Некоторые мжные ингибиторы

Некоторые не- j Фкэмологмчес- л кие субстраты v

TT<?R ротенон амитал пиерицидии А прогестерон

ЧчастокИ антиницин

FeS-C.-C —Cu,a,aj^02 4 /♦ ---

Феррицийнмд

ТМ1\Д нефериентА* | аскоРБВТ тивна учйстокб!

CN" СО n: рйстюримыи цигохро* с

Т Рис. I Схема электронтранспортной цепи митохондрий,

- 12 передает электроны в цепь,состоящую из цитохромов в, с 4 , с, a,aj и железосерного белка Риске (рис.1)£18,18Д9,20,21,22, 23,24,25,26,27,28,29,30,3l] . В иследованиях по структуре и функционированию ЭТЦ широко используются различные ингибиторы. В частности,применение ингибиторов в сочетании с оптической и ЭПР спектроскопией позволило выяснить последовательность переносчиков ЭТЦ и пункты сопряжения окислительного фосфорилирования £ 22,23] .

Кинетика переноса электронов в митохондриях.

На схеме I приведена кинетическая последовательность окисления переносчиков ЭТЦ в митохондриях при импульсной подаче кислорода к исходно анаэробным митохондриям (периоды полупревращения в окисленную форму оосчитываются от момента введения кислорода )[32,33J . мсек. 5 «1500 100 Л200 мсек С--СГ--Brjr---В£----Фпш п 5 . 100 100 ^ 300 л-)тт мсек. С----сг--------в------Фпш полупериоды времени электронного переноса между соседними переносчиками, инициируемого импульсной подачей кислорода к анаэробным митохондриям.)

Сопоставление кинетических данных по переносу электрона через ЭТЦ с другими фактами,относящимися к функционированию ЭТЦ и отдельных переносчиков,приводит к ряду противоречий. Например, как следует из схемы 1.,при переносе.; электронов от ЕАДН (сук-цината) к кислороду после цитохрома с процессы резко ускоряются. Это означает,что окисление цитохромов происходит значительно быстрее их восстановления ( 100 раз ) и,следовательно,в стационарном режиме они должны находиться в среднем в окисленном состоянии. В действительности же 15$ цитохромов находятся в восстановленном состоянии [ 32,33j . Это кажущееся противоречие, по-видимому, объясняется тем, что скррости электронного переноса между компонентами цитохромной системы в стационарном режиме отличаются от этих скоростей в условиях ,в которых бы- . ли получены данные ,приведенные на схеме 1,т.е. при взаимодействии кислорода с анаэробными митохондриями. Лузиков исоавторы С 34] ,исследуя стационарную кинетику электронного переноса в разобщенных СМЧ при разных концентрациях НАДН, обнаружили что константы скорости переноса электронов между соседними переносчикамиЭТЦ, вычисленные по уравнению Принсгейма, увеличиваются в 10-20 раз с ростом абсолютной скорости процесса ( в этих опытах скорость переноса электронов по цепи определялась скоростью поступления НДЦН»которую можно было регулировать). Для пары цитохром b-cj изменялась от 90 до 1000 сек. Для пар цитохром с-а и цитохром а-адот 25-33 до 500 сек."?

Зависимость констант скорости электронного переноса между отдельными компонентами ЭТЦ от скорости электронного потока авторы интерпретируют активацией цепи Г 34] . Время жизни активной формы электронных переносчиков составляло 6-10 мсек. [[34] . Возможны два объяснения этого явления. Варфоломеев и соавторы полагают,что эффект активации связан с тем,что константы скорости переноса электрона между отдельными компонентами ЭТЦ зависят от степени её окисленности [35J. Дело в том, что восстановление одного или нескольких ( но не всех) компонентов дыхательной цепи может приводить к изменению их конформадии,а следовательно,и взаимодействия с соседними окисленными электронными переносчиками. Это ,в свою очередь, повлияет на строение и свойства каждого переносчика и ЭТЦ в целом.

Другое возможное объяснение заключается в образовании при переносе электрона неравновесных форм переносчиков с измененой активностью f86,88,90,91J. Теоретически .процессы с участием электронтранспортных белков можно разбить на две стадии, одна из которых представляет собой быстрые локальные изменения химической и электронной структуры активного центра (индуцированные присоединением электрона или потерей электрона ) непосредственно сопровождающиеся колебательной релаксацией самого активного центра и его ближайшего окружения. Характерные времена этой стадии 0,1- I псек. Такие практически мгновенно реализующиеся изменения затрагивают только атомные группы активного центра, в то время как остальная часть белковой глобулы остается неизменной. Вместе с тем новому состоянию активного центра должна,в принципе, соответствовать иная разновесная конформация всего белка. Между отрелаксировавшей инеизменив-щейся частями макромолекулы возникает стерическое напряжение, которое снимается в ходе конфорационной релаксации. Релаксация к новой конформации после быстрых локальных изменений в активном центре ( вторая стадия) как правило, требует координированного разрыва и образования большого числа слабых связей и может длиться от нескольких десятков микросекунд до секунд.Таким образом после быстрого изменения химического состояния активного центра может возникнуть специфическое(ие) промежуточное^) ("возбужденные") состояние(ия), в которых локальные изменения и сопровождающая их колебательная релаксация б ли

- 15 жайшего окружения активного центра уже произошли (активный центр находится в новом локально кзазиравновесном состоянии), а конформация остальной части макромолекулы отличается от равновесной (на начальных стадиях конформационной релаксации она остается близкой к исходной). Очевидно, что время жизни таких интермедиатов будет определяться длительностью конформационных перестроек в молекуле белка. Естественно ожидать, что белковые макромолекулы в промежуточном конформационно-неравновесном состоянии могут существенно отличаться от соответствующих равновесных состояний по своим физическим и химическим характеристикам. Теоретически такая возможность была рассмотрена для случая цитохрома с Блюменфельдом и Чернавским / 86,90,102,116 /. Эти авторы пришли к заключению о принципиальной возможности возникновения при функционировании этого электронтранспортного белка промежуточных состояний с измененной активностью. Экспериментально образование нестабильных состояний было зарегис- . трировано при окислительно-восстановительных превращениях структурно и функционально различных металлсодержащих белков./24, 25,26,27,28,88/ В частностности было показано,что при восстановлении железосерных и гемсодержащих белков образуются промежуточные состояния,которые по своим спектральным характеристикам заметно отличаются от соответствующих равновесных форм. /86,87,88,89,90/ 91,95,102/. Релаксация неравновесных форм белков к равновесному состоянию,как цравило, описывается двух-трех стадийной мономолекулярной кинетикой с константой скорости -10^ I/сек. В работах /88,89,91/ было показано,что образующиеся при восстановлении неравновесные формы белков проявляют в окисли-, тельно-восстановительных процессах повышенную реакционную способность. Так ,например, константы скорости реакции окисления неравновесного ферроцитохрома пластоцианином и феррицианидом выше соответствующих значений констант для аналогичных процессов с участием равновесных форм белка в 3-20 раз. Еще большие величины этой разницы наблюдается в реакциях с участием неравновесных форм ферредоксина, пероксидазы, гемоглобина и миогло-бина [ 88, 96, I05J. На основании выше изложенного можно предположить [105] , что при достаточно большой абсолютной активности электронного транспорта конформационная релаксация отдельных переносчиков не успевает произойти за время между актами электронного переноса, и переносчики при этих условиях все время находятся в состоянии с повышенной реакционной способностью.

На кинетические параметры ЭТЦ митохондрий сильное влияние оказывают субстраты и продукты фосфорилирования. Добавление АДФ и Фн приводит к резкому увеличению скорости дыхания. Напротив, в присутствии АТФ скорость переноса электрона от субстрата дыхания к кислороду сильно замедляется, а на участках сукцинат-дегидрогеназа-НАДНдегидрогеназа и цитохром в - Cj, наблюдается обращение электронного потока. На основе тщательного анализа результатов экспериментов по влиянию субстратов дыхательной цепи и фосфорилирования Чане указал на пять возможных состояний митохондрий [22,23 J . в состоянии I, которое реализуется в отсутствие добавленных из вне субстратов дыхания и фосфорилирования, переносчики ЭТЦ частично восстановлены. Добавление АДФ переводит, митохондрии в состояние 2 (все переносчики становятся окисленными), а скорость дыхания лимитируется только количеством субстратов окисления. Если добавить теперь субстраты окисления, то митохондрии переходят в активное состояние, в котором переносчики снова становятся частично восстановленными, а скорость электронного транспорта определяется поступлением субстратов через внешнюю мембрану митохондрий и активностью фосфо-рилирующих ферментов. Когда значительная часть добавленного АДФ израсходуется (превратится в АТФ), возникает состояние дыхательного контроля (состояние 4), в котором скорость дыхания снова замедляется и лимитируется отношением АТФ/ДЦФ. В отсутствие кислорода митохондрии находятся в состоянии 5 (анаэробиоза) , в котором все переносчики восстановлены.

Влияние субстратов фосфорилирования на скорость дыхания отражает наличие сопряжения между процессами электронного транспорта и фосфорилирования.

Сопряжение экзергонических и эндергонических процессов.

Явление окислительного фосфорилирования было открыто Эн-гельгардтом в 1930 году [37] . Белицер и Цыбакова [38] выяснили соотношение между процессами окисления и фосфорилирования, т.е. отношение числа молекул этерифицированного неорганического фосфата к числу молекул кислорода (Р/0). При окислительном фосфорилировании энергия, освобождающаяся при переносе электрона от субстрата к кислороду трансформируется в энергию т.н. макроэргической связи АТФ, т.е. в мембранном фосфорилировании осуществляется сопряжение энергодонорной реакции окисления субстрата дыхания и энергоакцепторной реакции фосфорилирования ДЦФ. Интактные фосфорилирующие митохондрии в литературе еще называются сопряженными.

Донор ■— ?■

ДЦФ + 44 АТФ + HgO

G°»'(стандартное изменение свободной энергии при рН 7, P=cons* T=const , t =25°С, Inm Mg 2+) составляет 7,6 ккал/моль АТФ.

При окислении НАДН в сопряженных митохондриях на каждый атом поглощенного кислорода образуется три молекулы АТФ (Р/0 = 3), если же субстратом ЭТЦ служит сушщнат, то Р/0 = 2. В митохондриях фосфорилирование АДФ осуществляется с помощью сложного субъединичного ферментного комплекса - АТФсинтетазы (о структуре и функциях ее см. ниже). Суммарный процесс окислительного фосфорилирования можно записать следующими уравнениями:

НАДН + Н* + 1/2 02 --- НАД* + Н20 = 52,7 ккал/моль)

ЗАДФ + ЗФН---- ЗАТФ + 3HgO (ЛG<*= -21,9 ккал/моль).

То обстоятельство, что для НАДН и сушданата Р/0 ^ 2 означает, что прохождение электрона вдоль ЭТЦ может сопровождаться фос-форшшрованием АДФ в нескольких пунктах (т.н. пункты сопряжения) . Используя данные по влиянию перехода из состояния 4 в состояние 3 на степень окисления отдельных переносчиков электронного транспорта, по действию ингибиторов электронного транспорта и разобщителей окислительного фосфорилирования, Чане [22, 23J выдвинул гипотезу о локализации отдельных пунктов сопряжения в цепи электронного транспорта. Фосфорилирование АДФ происходит в трех пунктах (см. рис. 2), локализующихся на участке НАДН-флавопротеид, вдт. в - цит. Cj и на цитохром-оксидазе. В пунктах сопряжения наблюдается наиболее значительный перепад окислительно-восстановительного потенциала мещду переносчиками (рис. 3). Следует отметить, что для синтеза АТФ требуется прохождение через пункт сопряжения двух электронов

32].

Для характеристики фосфорилирующей активности митохондрий часто используется способность АДФ влиять на скорость дыхания. В качестве параметра используется величина отношения скорости дыхания в присутствии ДЦФ к скорости дыхания без него:

Ут f = К' так называемый, коэффициент дыхательного контроля. В неповрежденных митохондриях в отсутствие да скорость дыхания практически равна нулю. Однако, на практике при выделении митохондрий повреждаются и поэтому коэффициент дыхательного контроля не превышает 7.

Известно большое количество соединений, ингибирующих окислительное фосфорилирование. К ним относятся 2,4-динитрофенол, карбонилцианид^фенилгидразоны и антибиотики - валиномицин, грамицидин, нигерицин, олигомицин, ауровертин. Все ингибиторы окислительного фосфорилирования по их механизму действия можно разбить на три группы.

2,4-динитрофенол и карбоцианид^фенилгидразоны стимулируют транспорт электронов, но подавляют синтез АТФ (т.е. нарушают сопряжение). Это - так называемые, разобщители окислительного фосфорилирования L64, 82-84J .

Другой класс ингибиторов представлен антибиотиком валино-мицином, который также нарушает процесс фосфорилирования при активации дыхания. Соединения этого класса отличаются от 2,4--динитрофенола тем, что для проявления их разобщающего действия необходимо присутствие К+. Предполагается, что разобщающее действие двух указанных выше типов, в основном связано с их прото-нофорной или ионофорной активностью (более подробно об этом см. ниже) [ 43 ] .

В отличие от разобщителей окислительного фосфорилирования соединения третьего типа, в частности олигомицин, оказывают ингибирующее действие на мембраносвязанную АТФсинтетазу.

Структура и механизм действия АТФсинтетазы.

В энергопреобразующих мембранах синтез АТФ осуществляется специализированной ферментной системой - АИсинтетазным комплексом. Этот комплекс состоит, по крайней мере, из девяти различных полипептидов [83, 84] . Согласно современным представлениям в АТФсинтетазный комплекс входят две различные функциональные компоненты, так называемые, факторы 3?0 и (рис. 2). Фактор Fj-содержит каталитический центр, в котором осуществляется фосфори-лирование АДФ. Предполагается, что £0 функционирует как проводник протонов через мембрану к каталитическому центру 3?j. Гидрофобный фактор Г0 локализуется во внутренней митохондриальной мембране и состоит из трех субъединиц. Гц- присоединен к 3?0 (мол. вес 430 кД) с помощью ^ -субъединицы и, так называемого, олигомицин-чувствительного белка и выступает в митохондриальный матрикс. 5-j- легко может отделяться от мембраны при обработке мочевиной, хелаторными соединениями или созданием низкой ионной силы. Фактор 3?£ растворим в воде и имеет молекулярный вес 300-400 бд. Субъединичный состав Pj слабо зависит от источника выделения и имеет структуру, изображенную на рис. 2. О субъединичной структуре 3?j нет единого мнения, предполагается, что он может иметь структуру [ 84] у JJ^ £ (Рэкер) или оС3 j33 yS& (Козлов). По мнению Скулачева активный центр локализован на J3-субъединице. Изолированный Pj эффективно катализирует гидролиз, но не синтез АТФ. На АТФазную и синтетазную активность комплекса сильно влияет взаимное расположение факторов FQ и Pj, причем при неправильном присоединении-Pj к PQ фермент теряет чувствительность к действию олигомицина. Предполагается, что

Рис. 2. Схематическое изображение строения АТФазы митохондрий. ингибирующее действие олигомицина обусловлено тем, что он закрывает протонный канал фактора Т0.

Одним из основных и наименее понятных вопросов мембранного фосфорилирования является механизм сопряжения экзергонической реакции окисления субстратов дыхания с экзергонической реакцией синтеза AT£.

Теория окислительного фосфорилирования.

Первой была предложена, так называемая, химическая концепция окислительного фосфорилирования [22, 23, 39J . Б основе этой теории лежат те же предположения, что и в теории субстратного фосфорилирования, т.е. энергия запасается в форме ковалент-ной "высоко" энергетической связи между одним из переносчиков-трансформаторов (Т) и лигандом (I) неизвестной природы.

Ав+В0 + 1^А0 1+Бв

А0 I + X Ji А0 + X "I

X I + ^ X Ф + I л

X Ф + № X + АТФ

Ав + В0 + № + А0 + Вв + AT®

Многочисленные попытки зафиксировать и зарегистрировать промежуточные продукты А0~1, Х~1, Х~Р не увенчались успехом. Поэтому в последнее время все большее распространение получают физические концепции мембранного фосфорилирования.

Как реакция на неудачи химической теории мембранного фосфорилирования получила широкое распространение хемиосмотическая концепция, предложенная Митчеллом в 1961 году [i] . Хемиосмоти-ческую концепцию довольно трудно изложить подробно, так как детали этой концепции, впрочем как и всякой рабочей гипотезы, постоянно меняются в свете уточнения экспериментальных данных, поэтому здесь приведены только основные постулаты этой теории и некоторые касающиеся ее экспериментальные данные [I, 4, 40-49] .

Мембранное фосфорилирование согласно этой концепции осуществляется в замкнутых везикулах с низкой проницаемостью мембран для Н* и ОН"" (а также душ некоторых других ионов К+, На+ и т.д.). Перенос электронов по ЭТЦ сопровождается переносом протонов через внутреннюю митохондриальную мембрану (т.н. протонный насос). Этот процесс обеспечивается ассиметричным расположением переносчиков относительно обеих сторон мембраны (рис. 3). В случае митохондрий этот насос выкачивает протоны из матрикса во вневези-кулярное пространство. Транслокация протонов через мембрану вызывает возникновение градиента концентрации протонов. Результирующая разность электрохимических потенциалов протонов (по Митчеллу протонодвижущая сила Р) равен р я д ^ - 2А2„зр. Д рН и является, как бы, первичным "макроэргом". Как следует из выражения (I) ЭХП ионов водорода состоит из двух компонентов: электрической д ^ , обусловленной различным содержанием положительных и отрицательных зарядов по обе стороны мембраны (рис. 3) и осмотической (концентрационной), представленной разностью концентраций ионов Н* между отсекали, разделенными мембраной ( д рН). При митохондриальном окислении одной молекулы НАДН через мембрану переносится не менее 6 протонов (Н"У2е~ = H"Vo=6), в случае сукцината HVo = HV2e~ = 4. Синтез АТФ осуществляется при прохождении протонов по градиенту концентрации через ориентированный АТФсинтетазный комплекс. В соответствии с хемиосмо-тической концепцией на каждые два протона, прошедшие через АТФ-синтетазный комплекс синтезируется одна молекула АТФ. Учитывая,

Рис. 3. Схема окислительного фосфорилирования в митохондриях по хемиосмотической концепции. что дб* ( рН 7, t =25 С) для синтеза АТФ составляет 34,5КДж/моль /43/ и полагая,что для образования одной молекулы требуется прохождение через АТФсинтетазу двух протонов, можно считать,что необходимый градиент рН будет равен 35/ (2 5,7)= 3 ед. рН. Однако при степени фосфорилирования 10% градиент рН должен составлять 5 ед. рН. Экспериментально показано,что прохождение электронов по дыхательной цепи действительно индуцирует разность рН и, что искусственно созданный градиент рН ( по обе стороны мембраны) приводит к синтезу АТФ, но требуемого порядка величин в градиенте рН не наблюдалось. Вместе с тем, если мембрана заряжена без накопления избытка протонов в среде, то на мембране возникает потенциал,который может быть ш пользован для синтеза АТФ так же как и протонный градиент. Градиенту рН в Зед. рН будет эквивалентен мембранный потенциал д \/>z 0,177В. Изменение свободной энергии при прохождении сквозь мембрану моля ионов водорода выражается уравнением до =5,708 рН = 96,5 ду. кДж/моль. Суммарный эффект градиента рН и мембранного потенциала ( оба выражаются в вольтах) называют протонодвижущей силой р = А \1/ - 2+2-В1 д рН ( t=25?C; 2,3 НР*0,0592) т Р Р

Поскольку мембранный потенциал митохондрий как и хлоропластов непосредственно измерить очень трудно, этот постулат на наш взгляд не прошел еще необходимой проверки. Гипотеза Митчелла стимулировала постановку множества экспериментов. Ряд экспериментальных результатов согласуется с представлениями хемиосмотической концепции. Было установлено, что в энергопреобразующих мембранах на различных объектах при переносе электронов осуществляется трансмембранный перенос протонов.который обычно регистрируется по закислению или защелачиванию вневезикулярного пространства. Скулачевым и Либерманом с соавторами /50-56/ экспериментами с применением проникающих синтетических ионов было показано,что в фосфорилирующих митохондриях существует трансмембранный потенциал. В рамках хемиосмотической концепции находят простое объяснение разобщающее действие протонофо^ов и ионофоров, явление дыхательного контроля, влияние АТФ на редокс потенциал отдельных компонентов ЭТЦ и индуцированный АТФ ионннй транспорт в мембранах. Одним из основных экспериментальных доказательств концепции Митчелла считаются опыты по синтезу АТФ мембранным АТФ-синтетазным комплексом в условиях искусственно созданного градиента рН. В серии работ Ягендорфа и Юрайба было показано/57-59/ что при быстром увеличении рН ( от 4 до 8) в суспензии хлороп-ластов синтезируется до 50-80 мол. АТФ на каждый комплекс G-E4E. Процесс не требовал световой энергии, не зависел от активности редокс цепи и тормозился разобщителями. В подобных условиях Хин-кель / 60/ наблюдал синтез АТФ СМЧ. Максимальный выход (10 мол. АТФ на-Г-I) был при сочетании градиента рН с мембранным потенциалом. В ряде работ было продемонстрировано, что комплекс-Г-0 ---Г-1, встроенный в липосомы способен синтезировать АТФ при наложении д рН. В этих экспериментах д рН генерировали либо быстрым изменением рН среды, либо встроенным в эти липосомы бакте-риородопсином [61, 63] . Следует отметить, что эффективность индуцируемого д рН синтеза АТФ в таких системах увеличивается при наложении мембранного потенциала. В свете этих данных оказался несколько неожиданным результат, полученный Митчеллом [64] по синтезу АТФ митохондриями при быстром закислении среды. Для того, чтобы увеличить диапозон д рН, он предварительно выдерживал митохондрии при рН 9, а затем скачкообразно понижал рН до 4,2-3,9. При таком изменении рН синтез АТФ не превышал трех молекул АТФ на P-I. Оставаясь в рамках хемиосмотической концепции трудно понять почему эта работа не была повторена и сам Митчелл не ссылается на него. Следующее предположение этой теории состоит в обратимости процесса фосфорилирования. При гидролизе АТФ возникает трансмембранный градиент протонов. Кроме того известно, что энергия АТФ может быть использована для транспорта ионов через мембрану против градиента их концентрации [б5, 66J • В рамках этих представлений следовало бы ожидать синтеза АТФ при обращении ионных потоков. Действительно, синтез АТФ в митохондриях наблюдали не только в присутствии градиента протонов, но и при наложении градиента К+ или Са4^ Кокрелл £б5, 66J показал, что выход ионов К+ из митохондрий, инкубируемых в безкалиевой среде в присутствии валиномицина может быть сопряжен с фосфори-лированием ДЦФ. Этот результат был подтвержден Евтодиенко [б7] , который получил также указание на возможный синтез АТФ при выходе из митохондрий ионов С а44" по концентрационному градиенту. Синтез АТФ сопряженный с выходом К+ был подробно исследован Росси и Аццони [б8] , показавшими, что этот процесс характеризуется теми же свойствами, что и окислительное фосфорилирование, отличаясь от последнего лишь способом энергообеспечения. Было найдено, в частности, что выход К+ из митохондрий, подобно дыханию в состоянии 4, ускоряется добавкой АДФ и Фн. Разобщитель нигерицин и олигомицин тормозили процесс фосфорилирования.

В последние годы, однако, появился ряд новых экспериментальных данных, которые либо не согласуются с этой гипотезой (в ее первоначальном варианте), либо интерпретация их вызывает затруднение [б9-в2] . Рядом авторов было показано, что при окислительном фосфорилировании отсутствует корреляция между изменением и Д°*р .В частности, по данным Вильсона [бэ] изменение дрН от I до 0 при постоянном мембранном потенциале ( Л^ = 130 мВ) практически не влияет на фосфатный потенциал в митохондриях и на скорость дыхания. Уменьшение на 58$ в основном за счет изменения мембранного потенциала) приводит лишь только к небольшому уменьшению энергии, используемой для синтеза АТФ. Это согласуется также с данными Маршанского , который показал, что активность ЭТЦ и АТФсинтетазы не коррелирует с величиной мембранного потенциала. В ряде случаев в фос-форилирующих мембранах значение &JUH+ оказывается значительно меньше, чем это необходимо по хемиосмотическому механизму. Коул и Алим jvij описали систему окислительного фосфорилирования в надосадочной фракции из хемиавтотрофа т. Naveiius , которая не содержит мембранных структур и частиц, регистрируемых электронным микроскопированием. В этих системах фосфорилирование было сопряжено с окислением тиосульфата, сукцината и аскорбата кислородом (Р/0 = 0,96; 1,9; 0,76, соответственно). Образование AT® полностью подавлялось ДШ и производными фенилгидразона. Низкие концентрации олигомицина (0,5 мкг/мг б) также выключали фосфорилирование. Недавно Келлем р72] было показано, что в штамме такой эффективный разобщитель мембранного фосфорилирования как протонофор не влиял на их фосфоршшрующую активность. С друтой стороны по данным Ротенберга анестетик-хлороформ, который полностью ингибирует синтез АТФ в митохондриях печени крыс в концентрации I Ш, тем не менее не влияет на электрохимический трансмембранный потенциал протонов.

Конформационная теория сопряжения окисления и фосфорилирования.

В 1964 г. Бойер [8б] высказал предположение о том, что окисление и фосфорилирование в митохондриях могут быть сопряжены посредством конформадионных изменений фермента, участвующего в переносе электронов и/или энергии. Предполагалось, что энергия e'sh — jsi^. srsh e-^s ->■ ersh + atp cooh 4cooh nc0 cooh окисления затрачивается на создание напряженной конформадии фермента. Последующее возвращение в исходную конформацию сопровождается использованием накопленной энергии, для синтеза высокоэнергетического соединения, например, тиоэфира, образовавшегося в результате реакции между карбоксильной и сульфгидрильной группами фермента. Затем происходит перенос энергии на АДФ. С этими представлениями согласуются экспериментально обнаруженные структурные изменения отдельных компонентов дыхательной цепи, АТФсин-тетазы и митохондриальной мембраны в целом [2, 5, 85-92] . Идея относительно конформационного сопряжения синтеза АТФ и переноса электронов становится еще более привлекательной, если учесть, что АТФ используется в мышцах для совершения механической работы. В этом случае гидролиз АТФ сопряжен с относительным движением белковых компонентов в мышцах. Весьма резкое изменение формы митохондрий при переходе между сост. 4 и 3 навело Грина ^93J на мысль о том, что фосфорилирование неразделимо связано с кон-формационными изменениями в мембранных белках. Следует однако отметить, что в последние годы представления Бойера претерпели существенное изменение. В соответствии с одной из последних его концепций, в активном центре фермента АДФ и Фн могут соединяться спонтанно почти без притока энергии, однако образующийся АТФ прочно связан с ферментом и для его удаления требуется энергия. Эта энергия обеспечивается изменением конформации фермента (при этом фермент переходит в новое конформационное состояние с пони-женннм сродством к АТФ), вызываемым возникающим при электронном транспорте градиентом протонов £ 5, 94J •

Иной подход к проблеме мембранного фосфорилирования используется в конформационно-релаксационной концепции [з, 6, 88, 95-97] Блюменфельда. В соответствии с этой концепцией энергия, освобождающаяся при переносе электрона от субстрата к кислороду запасается в форме конформационно-неравновесных состояний электронных переносчиков-трансформаторов в пунктах сопряжения, их комплексов с АТФсинтетазой и/или мембраны в целом. Образование АН осуществляется в процессе релаксации конформационно-неравно-весной формы электронного переносчика-трансформатора, связанного с АТФсинтетазным комплексом. Рассмотрим более подробно этот механизм. В каждом пункте сопряжения осуществляются процессы, схематически изображенные на схеме

B1S м -1-у b~s М---b~s*m b2s М* -~i->-b2s м**--

IL^s м . Bi s м -исходное состояние переносчика-трансформатора В, мембраны М, АТФсинтетазы - g f

После присоединения электрона (быстрая стадия I) к металлу активного центра переносчика-трансформатора В быстро произойдет колебательная релаксация активного центра и близлежащих групп, но вся молекула переносчика Bj с восстановленным активным центром останется в исходном ("окисленном") конформационном состоянии, т.е. в результате присоединения электрона конформация переносчика не меняется, но становится неравновесной (B£s М). Bj медленно релаксирует к равновесному состоянию Щ (где конформация белковой глобулы В2 находится в равновесии с восстановленным активным центром). Релаксация неравновесной конформации переносчика в пункте сопряжения сопровождается образованием химической мак-роэргической связи в сопрягающем ферменте s , что приводит к изменению конформации этого белка (стадия 2). Новая конформация АТФсинтетазы s* вызывает соответствующий релаксационный процесс целого участка мембраны, новая конформация которого определяется в конечном счете состоянием переносчиков и образовавшимися первичными макроэргическими связями. Далее электрон быстро переносится на следующий акцептор (стадия 3), а мембрана, которая стала неравновесной в результате изменения АТФсинтетазы релакси рует к новой равновесной структуре М (стадия 4). В состоянии Bg3 М переносчик-трансформатор не может принять электрон от донора (поскольку соответствующие уровни не совпадают), а измененная структура мембраны затрудняет релаксацию В2—»-Bj. В отсутствии акцепторов энергии (субстратов фосфорилирования) состояние В2Л*медленно релаксирует с выделением тепла в исходное состояние (дыхательный контроль). Фосфорилирование АДФ снимает химическое напряжение ( s*~*s) и ускоряет релаксацию всей системы, замыкающей цикл (стадия 5). В рамках этих представлений регуляция дыхания и фосфорилирования в энергопреобразрщих мембранах объясняется следующим образом. Благодаря кооперативным свойствам мембраны, состояние отдельных переносчиков, а следовательно и их активность, и времена их релаксационных изменений взаимосвязаны. Исходное состояние переносчика-трансформатора перед рабочим ходом существенно неравновесно, а перепад энергии при его релаксации определяется не только его собственными характеристиками, но и состоянием целых участков мембраны, которое, в свою очередь, зависит от ситуации в других пунктах сопряжения данной ЭТЦ, а может быть и других ЭТЦ. Предполагается, что в правильно работающей фосфорилирующей мембране перепад энергии при релаксации В^В^ каждого переносчика-трансформатора к моменту его восстановления становится равным или превышает величину необходимую для синтеза одной молекулы АТФ. Стехиометрия процесса ( прохождение двух электронов через пункт сопряжения приводит к синтезу одной молекулы АТФ) выполняется только в среднем. Перенос электрона через всю ЭТЦ к Og приводит к образованию либо одной, либо двух молекул АТФ ( в среднем 1,5) в зависимости от мгновенного состояния ЭТЦ. По мнению Блюменфельда, в ситуации, когда конформация переносчиков и положение электронных уровней существенно неравновесны, бессмысленно пользоваться обычными термодинамическими функциями и, в частности, О-В потенциалами. Скорости отдельных сталий цикла и, следовательно, отношение концентраций окисленных и восстановленных форм переносчиков могут существенно зависеть от состояния мембраны.

Релаксация к равновесию может происходить не только путем изменения конформации макромолекулы, но и за счет изменения ее поверхностного заряда. Возникающая после переноса электрона конформация переносчика-трансформатора неравновесна не только геометрически, но и электрически. Если возможно достаточно быстрое изменение поверхностного заряда, то релаксация к равновесию возможна и без значительного изменения геометрии. Предполагается, что разобщители способны осуществлять быструю электрическую релаксацию переносчика-трансформатора и мембраны в целом, в присутствии разобщителей электронные уровни будут снижаться настолько быстро, что химические "макроэрги" не успевают возникнуть, а время переноса электронов через пункт сопряжения резко уменьшится. В последние годы в литературе /появились экспериментальные данные, подтверждающие представление об участии неравновесных форм белков, их комплексов и мембраны в целом в биоэнергетических процессах. Экспериментами с отдельными компонентами ЭТЦ было показано,что при их редокс превращениях возникают кон-формациокно-неравновесные состояния с измененными физическими и химическими свойствами. На наличие таких состоянии в функционирующей ЭТЦ митохондрий указывают вышеупомянутые результаты Лузикова и соавторов по активации электронного транспорта /34,35/ а также его данные по влиянию функционального состояния митохондрий на эффективность действия различных денатурирующих агентов / 35/. Было установлено, что функционирующие митохондрии более резистентны к денатурирующему действию нагревания и протеоли-тических ферментов по сравнению с полностью окисленной или полностью восстановленной формой митохондрий. В рамках этой концепции находят простое объяснение изменение редокс потенциалов и спектральных характеристик цитохромов в и химических свойств цитохромоксидазы при энергезации митохондрий / 13-21, 23-29, 88, 95-105/. Имеются также указания на участие в процессах мембранного фосфорилирования нестабильных форм АТФсинтетазы /104,107/. По данным Лузикова /34, 35/ в фосфорилирующих митохондриях увеличивается резистентность АТФсинтетазы по отношению к инакти-вирующему действию протеолитических ферментов и тепловой обработке. Наконец, недавно, методом низкотемпературной ЭПР-спектро-скопии было показано, что железосерный компонент НАДНдегидроге-назы митохондрий ( т. н. центр N-2), расположенный в первом пункте сопряжения, в интенсивно фосфорилирующих митохондриях находится преимущественно в неравновесном состоянии, в то время как в митохондриях с разобщенным окислительным фосфорилировани-ем все центры N-2 находятся практически в равновесном состоянии. [99] . Кроме того, Ониши и соавторы [Юб] показали, что в фосфорилирующих митохондриях изменяется окислительно-восстановительный потенциал центра Подобные результаты были получены и для других переносчиков-трансформаторов цитохрома в и цитохром-оксидазы, расположенных во 2 и 3 пунктах сопряжения [l00-I04j .

Из вышесказанного следует, что в основе конформационной и хемиосмотической концепции мембранного фосфорилирования лежат существенно различные физические принципы трансформации энергии. В первой, трансформация энергии, освобождающейся при переносе электрона в энергию "макроэргической" связи АТФ, осуществляется с помощью трансмембранного электрохимического потенциала. В конформационной теории этот процесс осуществляется с участием электронных переносчиков-трансформаторов в энергизованных кон-формационно-неравновесных состояниях.

Концепция Митчелла стимулировала постановку большого количества экспериментов и подверглась экспериментальной проверке. Многие экспериментальные данные находят удовлетворительное объяснение в рамках этой концепции. Однако, трудности, с которыми столкнулась эта концепция при интерпретации ряда данных (см. обзор стр. 27, 28) указывают на необходимость более осторожного к ней отношения. На наш взгляд физически не менее привлекательной является конформационно-релаксационная гипотеза, которая, однако является более феноменологической и еще не подверглась столь тщательной экспериментальной проверке. В связи с этим представлялось интересным исследовать возможность участия таких конформавдонно-неравновесных состояний в процессах мембранного фосфорилирования. По конформационно-релаксационной концепции требуемое конформационное изменение АТФсинтетазы можно в принципе инициировать и без участия переносчика-трансформатора, с помощью других возмущающих воздействий, например, скачкообразным изменением гидрофобных свойств окружения, температуры, ионной силы, рН [Ю7] .

Целью настоящей работы являлось изучение фосфорилирования митохондрий при скачкообразном повышении рН среды, т.е. в условиях, противоположных требуемым хемиосмотическим механизмом.

ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Выделение митохондрий.

Митохондрии из печени крыс (линии Ввстар) выделяли по несколько модифицированному методу, описанному в работе [ 108j .

У декантированных крыс извлекали печень и помещали в стакан с охлажденной ( t = 4-6°С) средой выделения, содержащей 0,25 М сахарозы, 0,03 М ТРИС HCI рН 7,4 и 0,001 М этилендиамин-тетрауксусной кислоты. Печень разрушали с помощью Френч-пресса. Измельченную печень гомогенизировали в среде выделения в течение 30-40 секунд в стеклянном гомогенизаторе с тефлоновым пестиком при t = 4-6°С, а затем центрифугировали на центрифуге Т-24 в течение 10 минут при 600 об/мин. При этом осаждаются ядра и клеточные мембраны. Надосадочную жидкость осторожно декантировали и центрифугировали в течение 15-20 минут при 6000 об/мин. Осадок митохондрий ресуспензировали с 1-2 мл среды инкубации, содержащей 0,25 М сахарозы, 0,03 М ТРИС HCIpH 7,4, 0,001 М ЭДТА в стеклянном гомогенизаторе. Последний процесс повторяли два раза и хранили при 0°С.

Качество выделения проверяли путем измерения дыхательного контроля (К). Величина К свежевыделенных препаратов митохондрий варьировала от 4-7.

Часть экспериментов была выполнена на митохондриях из сердца быка, любезно предоставленных М.Маршак (лаборатория Скулачева). Дыхательный контроль этих препаратов митохондрий К = I.

Для получения не фосфорилирующих митохондрий из печени крыс использовали два способа: I) замораживание и оттаивание, 2) выдерживание при 4°а в течение 2-7 дней. Результаты экспериментов не зависели от способа разобщения.

Определение белка в суспензии митохондрий проводили микро-биуретовым методом [l09] .

Концентрацию электронтранспортных цепей регистрировали спектрофотометрически.

Определение коэффициента дыхательного контроля.

Дыхательный контроль митохондрий измеряли полярографичес-ки с использованием кислородного элеатрода типа Кларка. Б типичном эксперименте к 3 мл среды инкубации.; добавляли 0,1 мл митохондриальной суспензии ( 1-7мг митохондриального белка ), затем через 3 минуты в эту суспензию вводили донор электронов дыхательной цепи и через некоторое время в эту суспензию добавляли 0,05 мл ( 4 Ю2М ) АДФ. Коэффициент дыхательного контроля определяли по отношению скоростей потребления кислорода в приv adp, сутствии АДФ и без него, й*--^—( а также по уменьшению скорости дыхания после исчерпания АДФ). См. рис. к

Определение содержания электронтранспортных цепей.

Содержание электронтранспортных цепей в препаратах митохондрий определяли спектрофотометрически на дифференциальном спектрофотометре ДСД-2 ( ЦКБ АМН СССР ) по методу / НО /, измеряя концентрацию цитохромов с, Cj ии а, аз . Концентрацию цитохромов определяли исходя из разностного спектра поглощения митохондрий ( восстановленные минус окисленные) в области полосы поглощения цитохромов. Митохондрии восстанавливали дитионитом ( 0,5 мг. / мл ). Окисленные митохондрии получали добавлением 0,1 iM К 3(011) 5 .Во всех экспериментах содержание митохондрий составляло 1-3 мг/мл. Длина оптического пути, измеnx

Рис. 4. Зависимость скорости поглощения кислорода от состояния митохондрий. ряемых растворов равнялась 8-9 мм. Концентрацию цитохромов ccj определяли по поглощению (ДА) при 552 нм , отсчитаному относительно прямой соединяющей в разностном спектре точки при двух опорных длинах волн при 540 и 572 ни, используя следующее уравнение где С - концентрация цитохромов в Ш,

ДА- поглощение в единицах оптической плотности цитохромов с Cj

К= 18,5 GwT^iitif- /- длина оптического пути в см . При расчете концентраций цитохромов а ад в качестве опорных длин волн использовали 590 нм и 620 нм, максимума 605 и принимали К= 14 . т т см rivl , рис 5 .

5~0Q S5D бОО нп

P.xc. 5. Разностный спектр ( восстановленные против окисленных) оптического поглощения митохондрий.

Определение количества АТФ в митохондриях радиоизотопным методом.

Содержание АТФ в образцах митохондрий определяли по модифицированному методу Коннея и соавторов / III /. Этот метод основан на реакции АТФ с радиоактивной глюкозой, катализируемой гексокиназой. та гексокиназа тл АТФ + / С / глюкоза ----------->• / С /-глюкозо-6-фосфат + АДФ .

Образующийся в реакции / ^С / - глюкозо-6-фосфат осаждали ацетатом Ва и количество его определяется радиометрическим методом.

В работе придерживались следующей схемы опыта по определению АТФ.

1. 20 мкл дрожжевой гексокиназы ( 10 мг/мл в 3,2 М растворе сульфата аммония , рН 6 ) с активностью 100 ед./ мг белка ("Koch-Light" ) растворяли в 800 мкл 0,05 М ТРИС HCI рН 8,4. Затем к этому раствору добавляли 100 мкл 0,01 М М CI2 и

10 мкл 10 мкКи радиоактивно меченной глюкозы. В этих экспериментах использовалась радиоактивная глюкоза фирмы" UWVR" ЧССР с удельной радиоактивностью 180 мКи/ммоль. Перед употреблением этот раствор хранили во льду .-раствор-1.

2. 5 мкл образца , содержащего 10"^ jq-i0 МОлей АТФ переносили на верхнюю стенку пластмассовой центрифужной пробирки Эппендорфа. Затем на другую сторону пробирки переносили 10 мкл, вышеописанного раствора -I, содержащего фермент и / ^С/ глюкозу. Две отдельные капли смешивали мгновенным ускоренном до 5000 g. в центрифуге и инкубировали при 37 С в течение 60 минут. В этих условиях реакция образования глюкозо-6-фосфа-та завершается за 30 минут. Образующийся / ^ С /-глюкозоj Гссуд-чрств^'ч " j | ЖЛЙС'ХЕНА ; f СССР J ! ч;.1. р. и. докидал

-6-фосфат осаздали ацетатом бария, предварительно добавив к этому раствору 20 мкл 1% раствора нерадиоактивного глю-козо-б-фосфата ( 1,5 мл 0,005 М раствора ацетата бария в 70$ этаноле ). Реагенты тщательно перемешивали и центрифугировали при 5 тыс. об./мин в течение 3 минут. Образовавшийся глю-козо-6-фосфат бария, содержащий / ^ С /-глюкозо-6-фосфат оставался прочносвязанным со стенкой пробирки. Супернатант после осаждения глюкозо-6-фосфата сливали и осадок осушали мягким поглотителем. Для удаления из осадка непрореагировавшей глюкозы к осадку добавляли 1,5 мл 75$ этанола и оставляли на 5 минут. Затем этанол сливали, осадок снова осушали и повторяли эту процедуру второй раз. После этого к осадку добавляли 50 мкл I ц HgS и выдерживали в течение 10 минут при 55 С, далее содержимое переливали в сцинтиляционный флакон, добавляя в него 20 мл сцинтилирующей жидкости. Количество образующегося / ^ С /-глюкозо-6-фосфата определяли по его радиоактивности на сцинтиляционном счётчике Мачк-П.

Б качестве сцинтилирующей жидкости использовали растворы дифенилоксазола и 1,4-ди-2/5 фенилоксазолилбензола в толуоле ( 5 г POP и 0,1 г РОРОР в I л толуола ) с абсолютным спиртом в пропорции 1:0,3.

На рис. 6 приведен график зависимости радиоактивности фиксируемого / ^ С /-глюкозо-6-фосфата ( Q ), ( Q - измеряется в количестве импульсов в минуту ) от исходной концентрации АН в образце. Как следует из рисунка минимальное количество АТФ,опретр деляемое с помощью этого метода составляет ICP^* молей АТФ ( в 5 мкл) в образце. Этот график зависимости Q от содержания АТФ линеен вплоть до 5 I0""-1-0 молей АТФ в образце , при более высоких

Рис. 6. Калибровочная кривая зависимости количества AT® от счета ( меченного глюкозо-6-фоофата) концентрациях АТФ зависимость Q от содержания АТФ выходит на плато. Ошибка в определении АТФ не превышала 10%.

Поскольку в наших экспериментах в основном измерялось АТФ синтезируемое в митохондриях в работе было изучено влияние митохондрий и способов их фиксации на градуировочную кривую. Было установлено, что используемые в работе реактивы для фиксации митохондрий ( трихлоруксусная кислота, ТРИС HCI и кислый метанол ) в пределах ошибки эксперименов не влияют на зависимость Q от содержания АТФ. Однако, экстрагируемые вместе с АТФ из митохондрий белки заметно влияют на градуировочную кривую (рис. 7). Б присутствии этих белков чувствительность измерения АТФ с помощью гексокиназно-го метода примерно в 1,5траза (рис. 7).

Основная часть образующейся в митохндриях при рН-ударе АТФ как правило локализуется внутри митохондриального матрикса, кроме того наличие АТФазной активности может приводить к частичному гидролизу синтезируемого АН. Поэтому дяя количественного определения АН в суспензии митохондрий необходимо разрушение митохондрий и ингибирование АТФазной активности.

Фиксацию митохондрий и экстракцию АТФ из них проводили тремя различными способами: обработкой кислым метанолом, трихлоруксус-ной кислотой, либо кипящим ТРИС с ЭДТА.

При обработке кислым метанолом из митохондрий экстрагируются липидн, а митохондриальные белки и АТФ выпадают в осадок. АТФ из осадка переводили в раствор добавлением 0,1 М NagCOg.

Фиксацию митохондрий и экстракцию АТФ проводили следующим дбразом. К 0,2 мл суспензии в среде выделения добавляли 15 мл доведенного до 0,1 М HCI, затем гомогенат центрифугировали при 15000 об/мин в течение 10 минут и супернатант удаляли. Осадок суспензи

Рис. 7. Калибровочная кривая зависимости количества АТФ от счета (после фиксации митохондрий и экстрагирования АТФ. ровали в 15 мя метанола • ( без кислоты) и повторно центрифугировали. Осадок суспензировали в I мл раствора ОД М NagCOg,содержащей 0,25 шМ ЭДТА. Осадок удаляли центрифугированием при тех же оборотах, а затем вышеуказанным способом измеряли содержание АТФ перешедшего в раствор.

К достоинствам этого метода следует отнести возможность получения синтезированного АТФ в небольших объемах с высокой концентрацией. Однако, этот метод не лишен недостатков. Соответствующими контрольными экспериментами было показано, что при то этом способе фиксации в метанол переходит до 10 молей АТФ, что в некоторых экспериментах составляло до 50$ от количества синтезируемого АН.

Добавление трихлоруксусной кислоты к суспензии митохондрий приводит к денатурации белков и их осаждению, же содержащаяся в митохондриях при этом переходит в раствор. При фиксации этим способом мы придерживались следующей процедуры. Препарат митохондрий смешивали с равным объёмом охлажденного до ОС 10$ раствора ТХУ, содержащей 4мМ ЭДТА. Эту смесь выдерживали в течение 3 минут при О3С, а затем ТХУ удаляли экстракцией этиловым эфиром. Экстракцию проводили добавлением к раствору удвоенного объёма диэтилового эфира и последующим интенсивным перемешиванием. Затем эфирная и водная фракции отделялись на делительной воронке. Эта операция повторялась 5-6 раз. Для удаления остаточного эфира из водного раствора АТ£ его продували аргоном в течение 3-5 минут. Из оставшейся после такой обработки суспензии, разрушенные митохондрии удаляли центрифугированием. К супернатанту добавляли пятикратный объём ТРИС HCI буфера с рН 8,4. Затем в этом растворе измеряли содержание

АТФ. Недостатками этого метода являются большая длительность процедуры фиксации и сильное разбавление АТФ, что затрудняло её количественное определение.

Наиболее просто и эффективно экстракция АТФ из митохондрий осуществляется с помощью кипящего ТРИСа. Кипячение в буфере вызывает свертывание белковой фракции митохондрий и выход АТФ в раствор.

Экстракцию АТФ из митохондрий кипящим буфером проводили следующим образом: к 0,2 мл суспензии митохондрий, подвергшейся рН-удару добавляли 0,8-1,3 мл кипящего ТРИСа рН 9,0, содержащего 4,5 ыМ ЭДТА, для ингибирования АТФазной и аденилаткиназ-ной реакций митохондрий в течении процедуры разрушения, так как

-t I

ЭДТА связывает Mg необходимый для этих реакций. Затем этот образец выдерживали в течение 2 минут при 99-100'ЯЗ. После охлаждения при 0"XJ образец центрифугировали и в супернатанте определяли содержание АН. Контрольными экспериментами было показано, что указанная процедура экстракции не приводит к неферментативному гидролизу АТФ.

Следует отметить, что все указанные методы фиксации митохондрий и экстракции AT® дают близкие результаты. В своей работе, с каждыми вновь выделенными препаратами митохондрий проводили все указанные методы фиксации митохондрий и экстракции АТФ а в дальнейшем работали с кипящим ТРИСом. Определение количества АТФ по изменению содержания неорганического фосфата.

В некоторых случаях за АТФ-синтетазной и АТЗазной реакциями митохондрий следили по изменению содержания неорганического фосфата. В этих экспериментах концентрация АДФ и неорганического фосфата при рН-скачке, индуцирующем синтез АТФ митохондриями, несколько отличались от тех, которые обычно использовались в экспериментах с ферментативным определением АТФ. Кон

-5 центрация неорганического фосфата не превышала 10 М, а АДФ 2 10"^ М. Митохондрии перед опытом тщательно отмывали от эндогенного неорганического фосфата. Фиксацию митохондрий проводили с помощью ТХУ и кипящего ТРИСа. После осаждения митохондрий количество синтезированного АТФ определяли по уменьшению содержания неорганического фосфата.

По увеличению содержания неорганического фосфата следили также за АТФазной активностью митохондрий. В этих экспериментах концентрация митохондрий составляла 0,1-1 мг белка/мл,а концентрация АТФ-1 Ш, Реакцию в этих пробах останавливали либо добавлением 10% раствора ТХУ с 2г/М ЭДТА ( см. стр. 45-46), либо добавлением кипящего ТРИСа. После охлаждения к этим образцам ( 1,5 мл ) добавляли 24% (вес/объем) серную кислоту и фрагменты митохондрий удаляли центрифугированием. Содержание фосфата в супернатанте определяли спектрофотометрически по методу, описанному в работе / 112/.

Сущность спектрофотометрического определения неорганического фосфата заключается в определении оптической плотности окрашенного продукта, образующегося при взаимодействии фосфата с молибдатом и малахитовым красителем.

Эксперимент проводили следующим образом. В опытах с синтезом АТФ к 1,6 мл образца добавляли 0,2 мл Ша^Ао 0^ ( О ДМ) и 0,2 мл малахитового красителя и через 30 минут определяли оптическое поглощение при 623 нм, используя калибровочную кривую, приведенную на рис.8. Для учета эндогенного фосфата аналогичные измерения проводили с митохондриями, не подвергавшимися скачко

Рис. 8. Калибровочная кривая зависимости количества неорганического фосфата от А ( =623 нм) образному изменению рН. Для определения АТФ из оптической плотности первого раствора вычитали оптическую плотность второго образца.

В экспериментах с АТФазой объём образца составлял 2,5 мл, к нему добавляли 0,2 мл Н2 S04 ( 24$ ) и 0,34 млИа^оО^ и 0,34 мл малахитового красителя и измеряли оптическую плотность при =623 нм. В качестве раствора сравнения использовали образцы митохондрий со всеми добавками, но зафиксированными до начала реакции(раствор митохондрий в среде инкубации с АТФ фиксировался а затем добавляли JfeCIg).

Было показано, что на градуировочную кривую не влияют способы фиксации митохондрий и экстракции неорганического фосфата.

Методика изучения синтеза АТФ митохондриями при скачкообразном изменении рН.

Типичный эксперимент по исследованию влияния скачкообразного изменения рН на синтез АТФ митохондриями проводили следующим образом. К 0,1 мл митохондриальной суспензии ( в некоторых случаях брался другой объём), обычно содержащей от 3 до 7 мг митохондриального бежа, в растворе 0,25 М сахарозы, 2М ЭДТА, 2ivM ТРИС HCI буфера с рН ( 5-7,8), необходимым для начального рН, добавляли равный объём раствора ( со всеми добавками, кроме митохондрий) с рН отличным от исходного ( подобранном в специальных: экспериментах на рН-метре, чтобы достичь необходимого рН с митохондриями). Добавляемый раствор содержал кислород,растворенный из воздуха при температуре 20> С. Начальное рН в этих экспериментах варьировали от 5 до 8,0, а конечное от 8,0 до 10. После быстрого смешения , образцы фиксировали приблизительно через I сек. от начала рН-удара, как описано выше и определяли содержание АТФ в образце.

Внесение кислорода в образец митохондрии приводит к интенсификации дыхания и в исходно фосфорилирующих митохондриях к нормальному синтезу АТФ, суммирующемуся с синтезом АТФ за счет рН-скачка.

Чтобы исключить эту неопределенность , к контрольному образцу в тех же условиях ( образцы содержали сукцинат, АДФ, фосфат в среде инкубации) добавляли среду с рН равным исходному рН суспензии митохондрий. Каждый опыт проводился на мито-хондриальных препаратах не менее 7 различных выделений митохондрий с различной исходной фо сформирующей активностью.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Г Л А В А 2

ВЛИЯНИЕ СКАЧКООБРАЗНОГО ИЗМЕНЕНИЯ рН НА ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ В

НАТИВНЫХ МИТОХОНДРИЯХ При добавлении к анаэробной суспензии нативных митохондрий (Д К =4-7) с исходным рН 7,4 (анаэробиоз достигался самими митохондриями при выдерживании их в плотной суспезии), содержащего кислород буферного сахарохного раствора с /i/аЭН, рН 12 ( конечное рН среды митохондрий составляло 9,6) за I сек. до фиксации митохондрий синтезируется около 0,6 нмолей АТФ на мг митохондриального белка. Количество, синтезируемого АТФ не зависит от того добавляли ли первоначально субстраты фосфорилирования в суспензию митохондрий или в буферный раствор. В аналогичных условиях, но при использовании буферного раствора с рН 7,4 синтез АТФ составлял 0,15 нмолей АТФ/мг белка. Таб.1.

Из проведенных экспериментальных данных видно, что в суспензии митохондрий, подвергшихся скачкообразному повышению рН наблюдается увеличение синтеза АТФ на 0,45 нмолей/мг белка. В пересчете на одну электронтранспортную цепь дополнительный к обычному синтезу в нативных митохондриях синтез АТФ, при скачкообразном повышении рН соответствует 2-3 молекулам АТФ.

Уменьшение конечного рН от 9,6 до 876 не влияет на количество дополнительно синтезируемого АТФ.

В таб.2 приведены данные по влиянию конечного рН на дополнительный синтез АТФ в нативных митохондриях.

Таблица I. Влияние скачкообразного повышения рН на синтез АТФ в нативных митохондриях.

Начальный рН Конечный рН Выход АТФ Ю"10молей на мг белка

7,4 7,4 1,5 ± 0,5

7,4 9,6 6,0 ± 2,1

9,6 9,6 1,5 ± 0,5

•7,4 9,6" 0,1 ± 0,03

В этих экспериментах АДФ добавляли через 30 секунд после скачкообразного повышения рН.

Таблица 2.

Влияние конечного рН на дополнительный синтез АТФ в нативных митохондриях рН начальный рН конечный АТФ нмоль/мг белка

7,4 7,4 7,4

9,6 8,5 8,0

Х± 35 0,45±0,13 0,44± 0,16 0,03± 0,01

Однако, придрН ниже 0,7 дополнительный синтез АТФ не наблюдается.

Изменение времени выдерживания образца от момента изменения рН до фиксации митохондрий от I сек. до 10 сек. приводило лишь к небольшому увеличению количества дополнительно синтезируемого АТФ.

Величина эффекта зависит от промежутка времени между моментом, соответствующим скачку рН и добавлением субстратов фосфорилирования. При введении субстратов фосфорилирования через

15 секунд после повышения рН количество дополнительно синтезируемого АТФ уменьшается в четыре- пять раз. Увеличение этого промежутка времени до 35 секунд приводит к падению дополнительно синтезируемого АТФ в 10-15 раз, т. е. практически до нуля.'

Изменение знака 6 рН ( в этих экспериментах рН суспензии митохондрий уменьшался от 9,6-9,0 до 7,4-5,0 ) не приводило к заметному синтезу АТФ ( смотри Таблицу 3 ).

Таблица 3

Влияние скачкообразного уменьшения рН на доп. синтез АТФ рН начальное рН конечное АТФ нмоль/мг белка х з£

5,0 5,0 0,00^0,05

9,6 9,6 0,05-0,05

9,6 5,0 0,02±0,06

9,0 9,0 0,10-0,07

6,0 6,0 0,05-0,07

9,0 6,0 0,0§i0,05

7,4 7,4 0,I0i0,07

9,6 7,4 0,07i0,07

Совокупность , полученных результатов показывает, что в фосфорилирующих митохондриях ( сост. 3) при быстром повышении рН среды (т.е. при знаке рН противоположном требуемому хе-миосмотической концепцией) наблюдается увеличение синтеза АТФ. Этот эффект имеет место только при условии, что в процессе изменения рН среды проходит через значение 8,3. Количество дополнительно синтезируемого АТФ не зависит отДрН ( при изменении от I до 4 ) и от времени между повышением рН и фиксацией митохондрий. С другой стороны дополнительный синтез АТФ снижался до нуля при добавлении к митохондриям субстратов фосфорилирования через 35 сек. после скачкообразного увеличения рН. При изменении знакаДрН наблюдаемый эффект исчезает.

На количество,синтезируемого дополнительно AT®,сильное влияние оказывают ингибиторы и разобщители окислительного фосфорилирования. В присутствии 2,5 мкмолей олигомицина на г белка полностью подавляется мембранное фосфорилирование АДФ. Это также свидетельствует о том , что наблюдаемое в наших экспериментах увеличение синтеза АН при повышении рН связано с работой АТФ-синтетазного комплекса.

Особый интерес представляют, полученные результаты по действию разобщителя окислительного фосфорилирования ФКФ. При концентрациях 0,2 мкмоля ФКФ на мг митохондриального белка ФКФ полностью разобщает окислительное фосфорилирование в нативных митохондриях при рН 7,4 и при рН 9,0, тем не менее при защелачи-вании суспензии митохондрий, содержащей ФКФ , наблюдается образование небольшого количества АТФ ( 0,15 нмоль/ мг белка ), составляющее примерно 30% от дополнительно синтезируемого АТФ при рН-ударе в фосфорилирующих митохондриях (т.е. без ФКФ, при рН-ударе ).

Синтез дополнительного количества АТФ при быстром повышении рН можно объяснить действием следующего ряда факторов.

1. Интенсификацией дыхания и окислительного фосфорилирования в процессе быстрого повышения рН.

2. Наличием небольшой фракции вывернутых ( подобно ультразвуковым субмитохондриальным частицам ) митохондрий, т. е. синт тез АТФ осуществляется по хемиосмотическому механизму.

3. Активацией аденилаткиназы.

4. Возникновением сопряжения во фракции митохондрий с исходно разобщенным окислительным фосфорилированием.

5. Кратковременным увеличением содержания эндогенных субстратов ( НАДН) в процессе изменения рН.

6. Катализом фосфорилирования АДФ АТФсинтетазой при скачкообразном повышении рН в рамках конформационных гипотез.

Известно, что конформация мембран, компонентов дыхательной цепи и АТФсинтетазы могут завиоеить от рН среды. Б частности, это подтверждается результатами измерений по зависимости скорости дыхания митохондрий от рН. Нами было установлено, что при увеличении рН от.7,4 до 9,6 скорость потребления кислорода нативными митохондриями в присутствии сукцината уменьшается в 1,2 раза. При изменении рН от 7,5 до 6,0 скорость дыхания уменьшается / 113/. Конформационные перестройки в мембранах и белках, как правило, являются сложными многостадийными процессами с высоким энтропийным барьером. Разумно предположить, что в процессе конформационных перестроек ( в митохондриях ), индуцированных быстрым повышением рН могут реализоваться относительно долгоживущие промежуточные состояния с измененной активностью. Подобные промежуточные формы, например, были зарегистрированы при индуцироваемых рН-ударом конформационных переходах в цитохроме с в растворе. Бремя жизни этих состояний варьировало от Юмсек. до нескольких секунд. Увеличение микровязкости в митохондриальных мембранах может приводить к увеличению, и иногда, весьма значительному, времени жизни таких конформационных состояний./ 88 /. Поэтому, наблюдаемый в эксперименте дополнительный синтез АТФ при скачкообразном повышении рН, в частности, можно объяснить возникновением относительно долгоживущих состояний митохондрий, характеризующихся более интенсивным окислительным фосфорилированием. Б рамках этих представлений находят простое объяснение зависимости количества избыточного АТФ от времени между рН-ударом и моментом добавления субстратов фосфорилирования. Увеличение временного интервала между рН-скачком и последующим добавлением субстратов фосфорилирования ( t ) должно приводить к уменьшению концентрации промежуточных форм митохондрий с повышенной активностью, а следовательно, и к изменению дополнительно синтезируемого АТФ ( q ). Анализ зависимости АТФ от t показывает, что время жизни такой промежуточной формы митохондрий составляет приблизительно 5-7 сек. Однако, в таком случае остается непонятным почему величина q слабо зависит от временного интервала между рН-ударом и фиксацией митохондрий. Казалось бы, что, если активная форма живет 5-7 секунд, то при увеличении этого интервала от I до 10 секунд синтез дополнительного АТФ должен измениться приблизительно в 3-4 раза. Реально в эксперименте это изменение не превышает 20-30%. Единственное возможное объяснение этого противоречия заключается в том, что субстраты фосфорилирования и сам акт фосфорилирования могут существенно ускорять релаксацию промежуточных форм митохондрий к конечному состоянию. Естественно было бы ожидать, что интенсификация фосфорилирования за счет рН-удара должна сопровождаться увеличением скорости дыхания митохондрий. К сожалению, этого эффекта нам обнаружить не удалось. Возможно, это связано с инерционностью, используемого для измерения скорости поглощения кислорода полярографической аппаратуры.

Другой механизм дополнительного синтеза АТФ предполагает образование эндогенных субстратов дыхания в процессе изменения рН за счет интенсификации работы цикла Кребса. Однако, следующие два факта полностью отвергают эту возможность. Во-первых, в отсутствии сукцината вообще не наблюдается никакого синтеза АТФ при рН-скачке. Кроме того, ингибитор дыхательной цепи, ро-тенон, который, как известно, действует на уровне убихинона предотвращает электронный перенос между НАДНдегидрогеназой и и убихиноном) и полностью подавляет перенос электрона от эндогенного НАДН к кислороду, в присутствии сукцината не влиял на количество дополнительно синтезируемого АТФ.

Наряду с активацией митохондрий увеличение синтеза АТФ при повышении рН можно объяснить наличием в препарате митохондрий небольшой фракции с "вывернутой" ориентацией внутренней мембраны. Б таких митохондриях при электронном переносе транслокация протонов должна осуществляться внутрь везикул. Тогда в условиях нашего эксперимента , т. е. при быстром повышении рН внешней среды в соответствии с хемиосмотической концепцией должен синтезироваться АТФ. Принципиальная возможность такого механизма следует из результатов работ Тайера и Хинкеля / 60 /. Этими авторами было показано, что в субмитохондриальных частицах, в которых, как известно, мембрана имеет противоположную митохондриям ориентацию, синтезируется до 10 молекул АТФ на каждый АТФ-синтетазный комплекс.

Для того чтобы проверить реализуемость этого механизма воспользовались тем обстоятельством, что в нативных митохондриях ЫАДНдегидрогеназа не дрступна для экзогогенного НАДН. В то время ка в "вывернутых" препаратах митохондрий НАДИ может свободно подходить к активному центру этого фермента. Поэтому при наличие "вывернутых" митохондрий в присутствии экзогенного НАДН следовало ожидать образования АТФ, хотя может быть и в небольших количествах ( которое определяется содержанием фракции "вывернутых" митохондрий). Было обнаружено, что при добавлении к используемым в работе препаратам митохондрий НАДН за время до десятков секунд уровень АТФ в пределах ошибки практически не изменялся. Отрицательный результат также был получен в аналогичных экспериментах с повышением рН ( Таб. 4).

Таблица 4

Фосфорилирование митохондрий в присутствии экзогенного НАДИ. ( 2 Ш НАДН, 5мг белка,митохондрии фиксировали через 10 секунд после добавления НАДН. К митохондриям НАДН добавляли вместе с субстратами фосфорилирования и рН-ударом). рН начальное рН конечное АТФ нмоль/ мг белка

Результаты экспериментов с НАДН показывают, что наблюдаемый дополнительный синтез АТФ нельзя объяснить наличием митохонд-рийс измененной ориентацией мембраны.

Б опытах данной работы использовались препараты митохондрий с дыхательным контролем от 3 до 7, т. е. всегда присутствует фракция митохондрий с разобщенным окислительным фосфо-рилированием. В принципе не исключено, что при повышении рН из-за конформационных перестроек в исходно нефосфорилирующих митохондриях временно восстанавливается сопряжение между процессами электронного транспорта и фосфорилирования. Дополнительный синтез АТФ при рН-ударе можно было бы объяснить также и этим обстоятельством. Однако, против такой возможности ( интерпретации) свидетельствует тот факт, что количество,дополнительно синтезируемого АТФ не изменяется при увеличении

7,4 9,0 7,4

7,4 9,0 9,0

X 3 S 0,0И0,01 0,01±0,01 o,oito,oi дыхательного контроля штохондрий от 3 до 7. Этот вывод также подтверждается совокупностью результатов по индуцируемому быстрым повышением рН синтезу АТФ разобщенными митохондриями, изложенных с следующей главе.

Известно, что митохондрии содержат значительное количество аденилаткиназы, которая катализирует реакцию превращения АДФ в АТФ. 10=1

АДФ + АДФ ---------> АТФ + АМФ

Б данной работы образование АТФ по аденилаткиназной реакции незначительно в присутствии АДФ в анаэробных условиях или в отсутствии сукцината за время эксперимента содержаниеАТФ в образце не изменяется. Однако, не исключено, что при скачкообразном повышении рН могут возникать короткоживущие более активные формы фермента, с образованием которых и связан дополнительный синтез АТФ. Следующие эксперименты показывают, что это не так. Если проводить повышение рН в митохондриях, содержащих АДФ, но лишенных неорганического фосфата, то АТФ вообще не образуется. Если бы наблюдаемый процесс был связан с аденилаткиназой, то в это.л эксперименте должен был бы регистрироваться синтез АТФ. Другим экспериментальным доказательством этого положения, являются результаты опытов по влиянию олигомицина на дополнительный синтез АТФ в митохондриях. Известно, что олигомицин является ингибитором только АТФсинтетазы, но не влияет на активность аденилаткиназы. То обстоятельство, что олигомицин полностью ингибирует образование АТФ свидетельствует о том, что синтез дополнительного АТФ связан с работой только мембраносвязанниго АТФ-синтетазного комплекса.

Полученные в работе данные по дополнительному синтезу АТФ при рН-ударе в принципе можно было бы объяснить в рамках кон-формационно-релаксационной концепции. В соответствии с этой концепцией при быстром повышении рН среды образуется относительно долгоживущее конформационно-неравновесное состояние АТФ-синтетазного комплекса ( или митохондриальной мембраны в целом), в ходе релаксации которого осуществляется фосфорилирование АДФ ( см. Обзор, стр. 34-35 ). Возникновению такого состояния способствуют: I.быстрая скорость ионизации белковых групп АТФ-син-тетазного комплекса ( или мембраны ) при скачкообразном повышении рН и 2. медленные конформационные перестройки в системе, сопровождающие её переход к новому равновесному состоянию. Схематически возможный механизм образования неравновесных состояний АТФсинтетазы при рН-скачке представлен на схеме. Схема образования неравновесных форм АТФсинтетазы (мембраны) при рН-скачке. сост.Ш 7,4сост. рН 9.0

В соответствии с этой схемой при быстром повышении рН с диф-фузионно-контролируемой константой скорости депротонируются все группы фермента ( или мембраны ) с рК 8,0, расположенные на внешней стороне мембраны. Очевидно, что новому зарядовому распределению молекулы должна соответствовать иная равновесная конформация ( см. схему). Однако, как известно, конформационные изменения в белке являются сложными многостадийными процессами с большим энтропийным барьером и поэтому, как правило, протекают значительно медленнее ионизации отдельных групп аминокислотных остатков. Поэтому сразу после скачка рН должно возникнуть новое промежуточное состояние, в котором поверхностные группы фермента и/или мембраны ионизованы, а его конформация осталась близкой к исходной (т.е. до изменения рН) (см. схему ). Время жизни этого промежуточного состояния определяется кинетикой его конформационных перестроек. Как уже отмечалось выше, фосфорилирование ДЦФ происходит в процессе релаксации такой конформационно-неравновесной формы фермента и/или мембраны ( более подробно см. обзор, стр. 34-35-95,96/;.),

Совокупность экспериментальных данных по дополнительному синтезу АТФ также находят свое объяснение в рамках другой кон-формационной гипотезы, предложенной Бойером. Можно предположить, что в процессе конформационных изменений мембраны, индуцированных быстрым повышением рН, возникает некоторое высоко-энергезованное промежуточное состояние , в котором реализуется "активная" по Бойеру форма АТФсинтетазы с повышенным сродством к АТФ. После диссоциации АТФ, фермент должен перейти в исходное состояние при условии, что промежуточная конформация мембраны при этом релаксирует к своему конечному состоянию. Однако, если скорость релаксации промежуточной формы мембраны существенно меньше скорости диссоциации комплекса фермент-продукт, то конформация АТФсинтетазы после выхода АТФ, из-за изме-ненног мембранного окружения может несколько отличаться от таковой в конечном состоянии.

В принципе, энергия, запасенная в форме конформационных изменений мембраны / М-Е/" может быть использована для последовательного синтеза не одной, а нескольких молекул АТФ. Возможно такой механизм дополнительного синтеза АТФ может реализоваться и в митохондриях, в которых отсутствует дыхание.

М-Е-К&-. + АДФ -£Н 7>4 >. --->• МЕ-АТФ РН ^ > н > Ф н

МЕ-АТФ)" —»» (М-Е)"" + АТФ —рН 9,0

Для выяснения механизма дополнительного синтеза АТФ при скачкообразном увеличении рН, на наш взгляд, важное значение имеют данные по влиянию ингибитора и разобщителей мембранного фосфорилирования. Эксперименты с олигомицином однозначно показали, что регистрируемый в экспериментах обычный и дополнительный синтез АТФ связаны с работой только мембранносвязанной АТФсинтетазы. Вместе с тем классический разобщитель окислительного фосфорилирования ФКФ по разному влияет на выход АТФ при постоянном и при скачкообразном увеличении рН. В присутствии 0,2 мкмолей ФКФ на грамм белка полностью подавляется окислительное фосфорилирование, в то время как дополнительный синтез АТФ уменьшается только на 40%. Это обстоятельство позволяет предположить, что увеличение синтезируемого АТФ при рН-ударе, по-видимому, связано не только с активацией митохондрий. Разное влияние ФКФ на окислительное фосфорилирование и дополнительный синтез АТФ также указывает на несколько иной механизм ингибирующего действия ФКФ в сравниваемых случаях и на некоторые различия в механизмах синтеза АТФ, индуцируемого окислением субстрата и увеличением рН.

При окислительном фосфорилировании ФКФ выступает, в основном, как классический разобщитель между процессами окисления субстрата и фосфорилировакием. С другой стороны, имеются указания, что ФКФ присоединяется к специфическому пептиду -суб-единицы АТФсинтетазы и вызывает конформационные перестройки этого фермента, приводящие к частичному ингибированию процесса фосфорилирования / 114-116/. По-видимому, именно этот механизм лежит в основе ингибирущего действия ФКФ на дополнительный синтез АТФ. Полученные данные по влиянию ФКФ на митохондриаль-ное фосфорилирование в условиях скачкообразного повышения рН делает более предпочтительным конформационную интерпретацию дополнительного синтеза АТФ, хотя полностью не исключают другой альтернативной возможности, связанной с интенсификацией окислительного фосфорилирования за счет активации митохондрий. В рамках конформационной гипотезы присоединение ФКФ к АТФсин-тетазе должно приводить к изменению её исходной конформации, а следовательно и к образованию состояния с пониженным сродством к АТФ. С позиции конформационной концепции действие ФКФ можно объяснить как его влиянием на структуру конформационно-неравновесного состояния, приводящего к изменению его активности, так и уменьшением времени жизни этого состояния в присутствии этого разобщителя окислительного фосфорилирования.

Из выше изложенного следует, что остаются в силе два возможных, но альтернативных объяснения дополнительного синтеза АТФ в фосфорилирующих митохондриях при скачкообразном повышении рН. В основе одного из них лежат представления об интенсификации окислительного фосфорилирования за счет индуцированного скачкообразным увеличением рН образования более активной формы митохондрий. В соответствии с другим объяснением при повышении рН возникает АТФсинтетаза (или мембрана) в конформаци-онно-неравновесном состоянии, в ходе релаксации которой происходит фосфорилирование ДВр. Хотя ряд имеющихся экспериментальных данных делают более предпочтительнее второе объяснение, тем не менее они не позволяют исключить возможность активирующего действия на митохондрии повышения рН.

К сожалению, решение этой дилеммы в случае нативных митохондрий связано с рядом трудностей, в том числе и методического характра.

Выяснению этого вопроса в значительной степени способствовали аналогичные исследования на митохондриях, исходно не фос-форилирующих.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЗДЕШЕ Г Л А В А 4

ИНДУЦИРУЕМОЕ БЫСТРЫМ ИЗМЕНЕННЫЕ рй ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ В РАЗОБЩЕННЫХ МИТОХОВДРИЯХ

В работе использовали разобщенные митохондрии, которые получали путем инкубации при температуре 0-2°С в течение 4-7 дней, либо путем повторного замораживания и оттаивания.

Экспериментальные результаты не зависели от способа разобщения [П7] . В работе было показано, что при старении митохондрий увеличивается содержание свободных жирных кислот, которые разобщают окисление и фосфорилирование. Следует; однако, отметить, что действие жирных кислот отличается от эффекта классических разобщителей одной важной особенностью. Такой разобщитель как олеиновая кислота наряду с собственно разобщающим действием, вызывает торможение транслокации адениннук-леотидов, ответственной за перенос АТФ и АДФ через митохондри-альную мембрану. Тем самым разобщение в присутствии не слишком высоких концентраций олеата, в отличие от разобщения синтетическими веществами-переносчиками протонного типа (ДШ), может происходить без активации расщепления АТФ, который становится недоступным для внутримитохондриальной АТФазы.

Нарушение функций митохондрий при перемораживании обусловлено частичным повреждением структурных элементов мембран, вызывающем значительные изменения в мембранной проницаемости и в работе ряда ферментов и систем, связанных с мембраной [ив] . Предполагается, что процедура замораживания и оттайвания может сопровождаться выходом наружу липолитических ферментов, которые вызывают химическую модификацию липидов и отдельных ферментов. Кроме того, изменению структурной организации мембран и ее проницаемости могут также способствовать пе-рекисное окисление липидов / 119/ и, образующиеся при действии фосфолипаз жирные кислоты. К сожалению, механизм повреждающего действия перемораживания на митохондрии остается невыясненным.

При быстром повышении рН от 7,4 до 9,0 в суспензии разобщенных таким способом митохондрий в присутствии сукцината и субстратов фосфорилирования образуется 0,5 нмолей АТФ на мг мито-хондриального белка, что в пересчете на одну электронтранспорт-ную цепь составляет 2,5 молекулы АТФ. Легко видеть, что количество , синтезируемого в ятих экспериментах АТФ по величине близко дополнительно синтезируемому АИФ в аналогичных опытах с нативными митохондриями.

На рис 9, 10 представлена зависимость количества синтезируемого АТФ,полученного при рН-скачке в двух постановках эксперимента. В первом случае при постоянном значении начального рН равного 6 варьировали конечное рН от 6,5 до 9,6 (рис. 9). При другой постановке опыта постоянным поддерживалось конечное рН на уровне 9.6 и изменялось исходное рН суспензии митохондрий (рис. 10). В других экспериментах изменяли конечное и начальное рН при постоянном градиенте рН (рис. II). Как следует из рис.9, при конечном рН ниже 7,8 АТФ не образуется. В этих опытах синтез АТФ наблюдается при конечном рН выше 8,5,причем при конечном рН ^ 8,5 выход АТФ практически не зависит от конечного рН. Из зависимости выхода АТФ от исходного значения рН (рис, 10) следует, что АИФ образуется только при рН началь

Рис. 9. Влияние конечного рН на синтез АТФ в разобщенных старением или перемораживанием митохондриях.

Рис. 10. Влияние начального рН на синтез АТФ в разобщенных старением или перемораживалием митохондриях. ьвТ9 ЭТЦ '

6,0

7,0

ВО

90 fO.O pU f>H

-i fH

Трлр^

Рис. II. Влияние сдвига интервала рН по шкале рН на синтез АТФ разобщенными митохондриями. ное ниже 7,8 ( см. также таб. 5).

Совокупность этих экспериментальных данных свидетельствует о том, что синтез АТФ разобщенными старением или перемора-живанием митохондриями наблюдается только в условиях, когда при быстром повышении рН его величина проходит значение 8,0. Это обстоятельство позволяет предположить, что исследуемый процесс связан с ионизацией отдельных групп фермента и/или мембраны, расположенных на внешней стороне внутренней митохонд-риальной мембраны.

Другим важным фактом является, то, что индуцируемый повышением рН синтез АТФ в разобщенных данным способом митохондриях в пределах ошибки эксперимента, не зависит от величины интервала рН, в диапозоне от 0,7 до 4, при условии, что в процессе изменения рН проходит значение 8,0 (рис. 12). При интервале рН меньше 0,7 выход АТФ резко падает (см. таб. 6).

Как и в случае нативных митохондрий время жизни, обладающего фосфорилирующей активностью, промежуточного состояния исходно нефосфорилирующих митохондрий, возникающее при скачкообразном повышении рН составляет 5-7 секунд ( рис. 13).

Индуцируемый быстрым повышением рН синтез АТФ разобщенными митохондриями полностью подавлялся 2,5мкмолями олигоми-цина на грамм митохондриального белка и частично на 60-70% 0,2 мкмолями ФКФ на г белка. Необходимо отметить, что обработка разобщенных митохондрий дигитонином, которая, как известно, разрушает преимущественно внешнюю мембрану митохондрий, практически не влияла на величину исследуемого эффекта. Вместе с тем, химическая модификация липидов внутренней мембраны митохондрий, возникающая под действием фосфолипаз, полностью

Таблица 5. Зависимость выхода АТФ при скачкообразном повышении рН от начального и конечного рН в разобщенных старением или переморажива-нием митохондриях. начальное рН конечное рН выход АТФмол./ЭТЦ

5,2 7,5 0

6,0 8,4 2,5

6,5 9,3 2,5

7,4 8,3 1,7

7,4 8,4 2,3

7,4 8,5 2,4

7,8 8,7 2,2

8,2 9,1 0

9,9 10,0 0

3,0 2.0 iO fKfrti г in—f—

A ptf a

2.Q

3,0

4,0

5,0

Рис. 12. Влияние дрН на синтез АН в разобщенных митохондриях

Таблица 6. Зависимость выхода Ш> при скачкообразном повышении рН от интервала дрН в разобщенных старением или перемораживанием митохондриях. начальное рН конечное рН дрН выход АТФ мол./ЭТЦ

7,8 8,3 0,5 0

7,8 8,5 0.7 2Д

7,4 8,3 0,9 1,7

7,4 8,5 1Д 2,4

6,0 8,4 2,4 2,4

6,5 9,3 2,8 2,5

6,0 9,0 3,0 2,5

5,6 9,6 4,0 2,5 fiT<P пмо/~/ь

Mi О.

Рис. 13. Влияние интервала времени между введением АДФиФФ и рН-ударом на синтез АТФ разобщенными митохондриями. ингибировала синтез АТФ при скачкообразном повышении рН среды митохондрий, разобщенных старением или перемораживанием.

Таким образом, легко видеть, что индуцируемый повышением рН синтез АТФ разобщенными штохондриями по многим параметрам подобен дополнительному синтезу АТФ нативными штохондриями в аналогичных условиях. Однако, синтез АТФ разобщенными старением или перемораживанием митохондриями наряду с причинами, рассмотренными в случае нативных митохондрий может быть сопряжен с действием еще ряда других факторов. К ним относятся:

1. Диссоциация прочносвязанных с АТФсинтетазой адениннуклеоти-дов.

2. Увеличение доступности в поврежденных митохондриях адени-латкиназы для АДФ.

3. Образование при старении или перемораживании митохондрий с измененной ориентацией мембраны.

4; Изменение ориентации АТФсинтетазы в разобщенных вышеуказанным способом митохондриях. 5. Возникновением кратковременного сопряжения между процессами окисления субстратов дыхания и фосфорилирования при скачкообразном повышении рН. Рассмотрим действие этих факторов более подробно. Известно, что с АТФсинтетазой прочносвязано 5-7 молекул адениннук-леотидов ( в том числе 2-3 молекулы АТФ)[84] . Не исключено, что образующаяся при быстром повышении рН промежуточная конформация АТФсинтетазы и/или мембраны обладает пониженным сродством к адениннуклеотидам. Это приводит к частичной диссоциации связанных нуклеотидов. В принципе этим можно было бы объяснить регистрируемое в опытах с разобщенными штохондриями образование АТФ ( см. схему ).

Е-------------------+ т>

1 I к АТФ АТФ К" —f— фиксация митохондрий

К ^К" Е + АТФ------*-Е

АТФ

Обратное связьшание АТФ с ферментом после его релаксации к новому равновесному состоянию митохондрий при данной постановке эксперимента предотвращается фиксацией митохондрий.

Возможно несколько путей проверки такой интерпретации. Одна из них заключается в проведении аналогичных экспериметов без одного ( или без обоих)§гбстратов фосфорилирования. Если гипотеза верна, то в отсутствии одного ( или обоих ) субстратов фосфорилирования при повышении рН суспензии разобщенных митохондрий следовало бы ожидать перехода связанного АТФ в раствор. В этих экспериментах было установлено, что в отсутствии одного из субстратов фосфорилирования, а тем более обоих, при скачкообразном повышении рН суспензии митохондрий АТФ не образуется. Однако, отрицательный результат не является ещё достаточным аргументом против такой интерпретации. Вполне возможно, что необходимая промежуточная форма фермента с пониженным сродством к нуклеотидам может реализоваться только в присутствии обоих субстратов фосфорилирования.

Другой способ проверки действенности этого механизма основан на проведении нескольких повторных рН-ударов на одном и том же образце митохондрий. В этих экспериментах после первичного защелачивания среды митохондрий, рН снова возвращали к исходному значению добалением небольшого объёма Шй HGI в в водном растворе сахарозы (или увеличивающимся объемом кислого буфера). Затем суспензия митохондрий снова подвергалась рН--удару. Эту процедуру мы повторяли до 7 раз. При большем количестве циклов из-за постепенного инактивирования митохондрий и понижения точности измерений при большом разбавлении наблюдалось снижение фосфорилирующей активности. Результаты этих экспериментов приведены в таблице 7. Легко видеть, что при каждом повторном скачке рН синтезируется 2-2,5 молекулы АТФ на электронтранспортную цепь. Всего за семь циклов образуется около 17 молекул АТФ в пересчете на I ЭТЦ, что значительно превышает количество црочносвязанного АТФ (2-3 молекулы АТФ).

При такой постановке эксперимента обязательно имеется стадия, связанная с последующим понижением рН от 8,5 до 7,4. В соответствии с хемиосмотической концепцией на этом этапе возможен синтез А®. Поэтому необходимо было проверить, вызвано ли увеличение выхода АТФ при повторении рН-ударов этим процессом. Было установлено, что если к суспензии митохондрий при рН 8,5 добавить субстраты фосфорилирования, а затем быстро понизить рН до 7,4 АН не образуется. Понижение рН в этих экспериментах до 4,0-6,0 не влияло на этот эффект (т. е. никакого синтеза АТФ не наблюдалось, даже если начальное рН было 9,6). Таким образом увеличение синтеза АТФ при повторении циклов скачкообразного повышения рН не связано с закислением среды.

Серия последних экспериментов свидетельствует также о том, что разобщенные старением или перемораживанием митохондрии не синтезируют АН при знаке рН-скачка, который требуется по хемиосмотической концепции.

Таблица 7. Выход АТФ при повторных рН-ударах на одном и том же образце митохондрий, разобщенных старением или перемораживанием. начальное рН конечное рН число рН-ударов Выход АТФ на ЭТЦ

7,4 8,5 I 2,4

7,4 8,5 3 6,0

7,4 8,5 4 10,0

7,4 8,5 7 17,0

Совокупность, полученных результатов однозначно указывает на то, что повышение, при увеличении рН, уровня регистрируемого АТФ обусловлено ферментативным фосфорилированием АДФ, а не диссоциацией прочносвязанных с ферментом молекул АТФ.

Выше уже отмечалось, что в отсутствии одного из субстратов фосфорилирования, в часности, неорганического фосфата при увеличении рН не наблюдается синтеза АТФ. Это обстоятельство позволяет исключить аденилаткиназный путь образования АТФ в суспензии разобщенных митохондрий при их защелачивании. Напомним, что аналогичный результат имел место и в случае на-тивных митохондрий.

Необходимо было также исключить ещё один возможный механизм синтеза АТФ, который уже обсуждался в связи с экспериментами на фосфорилирующих митохондриях, связанный с изменением ориентации внутренней митохондриальной мембраны при старении или перемораживании или при скачкообразном повышении рН. Как уже отмечалось выше в "вывернутых" митохондриях в условиях данного эксперимента, т.е. при быстром повышении рН, принципиально возможен синтез АТФ по хемиосмотическому механизму. Как и в предыдущем случае проверка основана на использовании экзогенного НАДН в качестве субстрата дыхания, поскольку только в митохондриях с "вывернутой" мембраной активный центр НАДНдегидрогеназы доступен для субстрата.

Было установлено, что добавление НАДН к разобщенным старением или перемораживанием митохондриям до рН-удара и после защелачивания среды не приводило к увеличению скорости потребления кислорода. Кроме того, в присутствии НАДН в качестве донора электронов при скачкообразном повышении рН суспензии разобщенных данным способом митохондрий не наблюдается образование АТФ. Эти результаты недвусмысленно показывают, что в используемых митохондриальных препаратах мембраны имеют "правильную" ориентацию и синтез АТФ нельзя объяснить с позиций хемиосмотической концепции.

Необходимым условием синтеза АТФ в разобщенных старением или перемораживанием митохондриях при увеличении рН является наличие сукцината. Вполне возможно, что при повышении рН в разобщенных митохондриях возникает кратковременное (5-10 сек) сопряжение между окислением и фосфорилированием. Это, например, может быть связано с возникновением некоторых промежуточных состояний мембраны в процессе конформационного перехода, индуцируемого изменением рН. Этому предположению также удовлетворяют экспериментальные данные по действию ингибитора ци-тохромоксидазы и анаэробиоза на индуцируемый Д рН синтез АТФ. Действительно, в присутствии окиси углерода, которая связывается с восстановленным цитохромом ад и тем самым ингибирует перенос электрона на молекулярный кислород, синтез АТФ в разобщенных митохондриях уменьшается до 0,06 нмолей АТФ/мг белка (0,3 молекулы АТФ/ЭТЦ). В анаэробных условиях, создаваемых продуванием суспензии разобщенных митохондрий аргоном, синтез АТФ уменьшается до 0,12-0,19 нмолей АТФ/мг белка (0,6-1 молекул АН/ЭТЦ). Однако, при удалении кислорода дитионитом АТФ вообще не образуется (см. таблицу 8). Вместе с тем этому предположению противоречат результаты опытов с антимицином А. Известно, что антимицин А ингибирует дыхательную цепь на уровне цитохрома в. Мы установили, что в присутствии I мкг антимицина

Таблица 8. Зависимость выхода АТФ при скачкообразном повышении рН от состояния электронтран-спортной цепи разобщенных старением или перемораживанием митохондрий. начальное рН конечное рН условия выход АТФ мол.ЗЭТЦ

7,4 8,7 °2 2,5

7,4 8,7 СО 0,3

7,4 8,7 Аргон 0,6-0,9

7,4 8,7 дитионит 0,0 синтез АТФ разобщенными митохондриями не только не уменьшался, но даже несколько увеличивался ( 10-15%). Б этих условиях по полярографическим измерениям митохондрии практически не потребляли кислорода. Отсюда следует, что разобщенные митохондрии при рН-ударе могут синтезировать АТФ в отсутствии дыхания, поэтому исследуемый эффект нельзя объяснить возникновением кратковременного сопряжения.

На основании этих данных можно заключить, что дополнительный синтез АТФ в фосфорилирующих митохондриях при быстром повышении рН, по-видимому, не связан с интенсификацией фосфорилирования за счет активации митохондрий, а осуществляется скорее всего по конфомационно-релаксационному механизму, т.е. при быстром повышении рН возникает, обладающее повышенной энергией конформационно-неравновесное состояние фермента и/или мембраны, в ходе релаксации которого и осуществляется элементарный акт фосфорилирования. Тогда остаются неясными функции сукцината и кислорода в данных экспериментах с разобщенными митохондриями при таком механизме фосфорилирования.

Роль кислорода в образовании АТФ в разобщенных старением или перемораживанием митохондриях в присутствии антимицина при повышении рН становится понятной в свете результатов, полученных Кондрашовой и Мироновой /121,120/.

Этими авторами было показано, что при добавлении АДФ к митохондриям наблюдается повышение активности пероксидазных систем и снижение количества перекисных соединений, а по мере исчерпания ДЦФ пероксидазная активность и концентрация перекисей возвращаются к исходному уровню. / 121,122/. Ингибиторы пероксидаз вызывают снижение сопряженности окислительного фосфосфорилирования, а добавление каталазы, проявляющей в физиологических условиях пероксидазную активность, повышает сопряжения дыхания и фосфорилирования. Авторы предположили, что пе-роксидазные реакции участвуют в синтезе богатых энергией соединений. Для осуществления пероксидазной реакции необходим кислород, инициирующий образование перекисей, в первую очередь, перекисей липидов ( жирных кислот). Это действие кислоро-дане связано с его основной функцией в биологическом окисле-нии-акцептированием электронов и водорода в дыхательной цепи и не чувствительно к цианиду. Обычно усиление перекисного окисления наблюдают при различных формах повреждения митохондрий, связанных с нарушением окислительного фосфорилирования. Однако, если учесть данные этих авторов, можно, преположить, что неакцепторная роль кислорода так же необходима для окислительного фосфорилирования.

В дальнейшем было показано /120,121/, что в митохондриях заингибированных цианидом при переносе электрона от сукцина-та к феррицианиду резко тормозится фосфорилирование АЩ> при удалении кислорода. В анаэробных условиях также наблюдается исчезновение энергетической регуляции транспорта электронов, ускорение восстановления феррицианида в присутствии АДФ и снижение скорости восстановления при исчерпании АДФ. Добавление : перекиси линолевой кислоты к анаэробным митохондриям, содержащим цианид приводило к восстановлению фосфорилирующей активности и энергетической регуляции транспорта электронов. Совокупность этих экспериментальных данных , свидетельствует о том, что для поддержания высокой фосфорилирующей активности необходим определенный уровень перекисей липидов. Для образования которых необходим молекулярный кислород.

Б свете этих экспериментальных данных необходимость кислорода при индуцированном изменением рИ синтезе АТФ в разобщенных и нативнх митохондриях можно объяснить важной ролью его неакцепторной функции. По-видимому, важная не только для поддержания энергетического сопряжения, но и для обеспечения высокой функциональной активности АТФ-синтетазного комплекса.

Влияние способа удаления кислорода ( продувание аргона или добавление дитионита ) на индуцированный рН-ударом синтез АТФ разобщенными старением или перемораживанием митохондриями, в частности, может быть объяснено более высоким содержанием остаточного кислорода в образцах продутых аргоном, чем в препаратах митохондрий, обработанных дитионитом. Концентрация этого остаточного кислорода может варьировать от ImkvI до 5 мкМ, но её, по-видимому, вполне достаточно для поддержания необходимого уровня перекисеи липидов.

Другим компонентом, необходимым для наблюдения исследуемого эффекта является субстрат дыхания. Действительно, как мы видели, синтез АТФ не наблюдается в отсутствии субстрата дыхания. В присутствии сукцината он достигает 0,5 нмолей АТФ на мг белка, а при использовании в качестве донора электронов системы аскорбат+тетрафенилендиамин, которая действует на уровне цитохрома с, синтез АТФ снюхается в два раза.

В ражсах конформационных концепций это объясняется тем, что для реализации нужного функционально-активного неравновесного состояния АТФсинтетазы и/или мембраны, возникающего при изменении рН необходимо строго определенное исходное состояние фермента, которое определяется состоянием митохондриалыюй мембраны. В свою очередь на исходную конформацию мембраны может влиять редокс состояние электронтранспортной цепи.См. таб. 9. По-видимому, наиболее благоприятная ситуация возникает только при определенном распределении степени восстановленности компонентов дыхательной цепи. Из полученных экспериментальных данных следует, что максимальный эффект наблюдается только, когда электронтранспортная цепь митохондрий находится в частично восстановленном состоянии. Это условие достигается в использовании сукцината в присутствии антимицина или кислорода и несколько меньшей степени при применении системы аскор-бат + тетраметилфенилендиамина в аэробной суспензии митохондрий. В полностью окисленных (без сукцината, но с кислородом) или в полностью восстановленных (в присутствии сукцината и СО) митохондриях при скачкообразном повышении рН образуется менее активная форма АТФсинтетазы (мембраны) с иной конформацией и поэтому эффективность фосфорилирования АДФ резко уменьшается. Эти положения подтверждаются рядом экспериментальных фактов £ 123, 124] . В основе одного из них лежит обнаруженное нами явление, связанное с влиянием субстратов дыхания на АТФазную активность разобщенных митохондрий. В этих экспериментах АТФазную активность митохондрий определяли по начальной скорости образования неорганического фосфата (более подробно см. методику эксперимента). Из данных, приведенных в таблице 10 следует, что добавление к суспензии разобщенных митохондрий 2 Ш сукцината приводит к уменьшению их АТФазной активности на 30%, причем величина эффекта не зависит от рН (таблица 10). Этот результат однозначно указывает на то, что окислительно-восстановительное состояние электронтранспортной цепи влияет

Таблица 9. Зависимость степени восстановленности переносчиков электронтранспортной цепи от состояния митохондрий•

Сост. уровень субстрата °2 ДЦФ скорость дыхания факт, лимит. степень восстановленност!

НАДН Фл. в ци с ТОХ] а эомь

I низкий + низк медл. да 90 21 17 7 0

2 0 + выс. медл. суб. 0 0 0 0 0

3 выс. + выс. •быстр. дых. цепь 53 20 16 6. 4

4 выс. + низ. медл. № 99 40 35 14 0

5 выс. 0 выс. 0 °2 ЮС ЮС iot) 1С 1

Таблица 10. Влияние субстатов дыхания на начальную скорость АТФазной активности разобщенных старением или перемораживанием митохондрий. сукцинат Ш РН начальная скорость гидролиза АН мбМ/мин

0 7*4 50 ± 6

2 7,4 35 ± 5

0 9,0 50± 4

2 9,0 35 ± 5

Опыты проводили с 1мМ АТФ, Ir/M MgOlg, концентрация бежа ОД- 0,5 мг/мл. на активность и, следовательно на структуру фермента, осуществляющего синтез и гидролиз АТФ. Поскольку в разобщенных митохондриях отсутствует непосредственная связь между окислительной и фосфорилирующей системами, можно полагать, что это влияние осуществляется через конформационные изменения мито-хондриальной мембраны, индуцированные редокс превращениями электронтранспортной цепи.

Этот вывод подтверждается независимыми измерениями Лузи-кова и соавторов [Зб] . Эти авторы показали, что инактивирую-щее действие протеолитических ферментов и липолитических ферментов на дыхательную цепь [34] и АТФазную активность [Зб] митохондрий сильно зависит от их дыхательной активности. Максимальной резистентностью по отношению к действию указанных агентов обладают митохондрии в состоянии активного дыхания. В полностью окисленной и полностью восстановленной форме (в присутствии сукцината в анаэробных условиях) митохондрии значительно сильнее подвержены инактивирующему действию протеолитических и липолитических ферментов.

Совокупность этих данных свидетельствует о том, что в окисленных и восстановленных митохондриях мембранные ферменты дыхательной цепи и фосфорилирования отличаются структурно и имеют не только разную конформацию, но и по разному расположены относительно мембраны. Отсюда следует, что функциональное состояние электронтранспортной цепи может отзывать влияние и, по-видимому, весьма существенное на конформацию ее белковых компонентов, jK отдельных групп мембранно-связанных белков и на относительную доступность последних по отношению к различным низкомолекулярным соединениям в водной фазе.

Наконец, имеются независимые данные, указывающие на то, что при быстром повышении рН возникает промежуточное состояние митохондрий с измененным распределением электронов между отделными компонентами электронтранспортной цепи. Ацци и Сан-тато [l22] показали, что в разностном спектре поглощения суспензии разобщенных митохондрий в присутствии сукцината при быстром увеличении рН от 6,5-7,5 до 8,5-9,5 наблюдается увеличение интенсивности полосы при 565 нм (и плеча 558 нм, отношение которых друг к другу равно 1,5), обусловленной восстановлением цитохрома в 566, Добавки антимицина усиливают и стабилизируют эффект. В присутствии кислорода за восстановлением цитохрома в 566 следует его частичное окисление, особенно быстрое в присутствии ФКФ.

ОБСУЖДЕНИЕ

Основной экспериментальный результат, полученный в работе, заключается в том, что при быстром повышении рН в нативных Фос-форилирующих митохондриях увеличивается синтез АТФ. В пересчете на одну электронтранспортную цепь величина дополнительно синтезируемого АТФ составляет 2,5-3 молекулы. Подобный эффект имеет место в разобщенных старением или перемораживанием митохондриях. Это явление наблюдается только при условии, что в процессе повышения рН проходит через значение 8,0-8,1. Величина эффекта не зависит от разности между конечным и исходным значением рН ( д рН = рН кон. - рН нач.) 0,7 ^ рН^ 4.

То обстоятельство, что олигомицин полностью подавляет индуцируемое повышением рН образование АТФ, указывает на то, что фосфорилирование АДФ осуществляется с участием мембранносвязал-ной АТФсинтетазы митохондрий.

Дополнительный синтез АТФ в нативных митохондриях и фосфорилирование АДФ в разобщенных сварением или перемораживанием митохондриях при скачкообразном повышении рН нальзя объяснить в рамках классической хемиосмотической концепции Митчелла, поскольку, во-первых, знак изменения рН противоположен, требуемому этим механизмом, во-вторых величина эффекта не зависит от рН в широком интервале.

Возможность возникновения митохондрий с измененной ориентацией мембраны полностью исключается экспериментами с экзогенным НАДН в качестве субстрата дыхательной цепи. Более того, даже при правильном знаке ДрН, т.е. при зачислении внешней среды ни в нативных, ни в разобщенных старением и перемораживалием митохондриях, образование АТФ не зарегистрировано. Это также согласуется с результатами Митчелла, полученными в аналогичных условиях [4] .

Слабое влияние ингибитора электронтранспортной цепи анти-мицина А на индуцируемое рН-скачком образование АТФ в разобщенных митохондриях свидетельствует о том, что исследуемый в данной работе синтез АТФ в разобщенных митохондриях и, по-видимому, в нативных митохондриях не связан с работой дыхательной цепи.

Полученные экспериментальные данные можно объяснить в рамках конформационных концепций. Одна из них, как уже отмечалось выше, предполагает возникновение в процессе конформацион-ных изменений мембраны, индуцируемых скачкообразным повышением рН, промежуточной АТФсинтетазы с пониженным сродством к АТФ [2] .На возникновение относительно долгоживущих (3-5 сек) промежуточных состояний митохондриальной мембраны при увеличении рН указывают также результаты независимых исследований |^88] . Ацци и Сантато было установлено, что в аналогичных условиях, т.е. после быстрого повышения рН суспензии разобщенных митохондрий наблюдается кратковременное увеличение степени вос-становленности цитохрома в 566 [l22j .

В соответствии с конформационной концепцией, фосфорилиро-вание АДФ в фермент-субстратном комплексе осуществляется почти самопроизвольно, и энергия, в основном, необходима для перевода АТФ из связанного состояния в свободное. По мнению Бойера [2] , это может реализоваться путем образования энергетически менее выгодной конформации комплекса фермент-продукт, обладающего пониженной константой связывания с АТФ, энергия, необходимая для отрыва АТФ, затрачивается на создание указанной конформации фермента. Вполне возможно, что именно такая ситуация и возникает при скачкообразном повышении рН. Однако, одно обстоятельство делает более предпочтительной конформационно--релаксационное объяснение исследуемого явления. Оно связано с тем, что в отсутствии АДФ как в исходно фосфорилирующих, так и разобщенных старением митохондриях повышение рН не приводит к отрыву АТФ, прочносвязанного с ферментом36. Как уже говорилось выше, при скачкообразном повышении рН в соответствии с концепцией Блюменфельда может возникать конформационно*- неравновесное состояние АТФсинтетазы (мембраны), в ходе релаксации которого осуществляется фосфорилирование АДФ. (Более подробно об этом см. обзор, стр. 30-35). При обоих интерпретациях источником энергии, обеспечивающим синтез АТФ при скачкообразном повышении рН является ионизация белковых групп. Несложный расчет показывает, что для синтеза трех молекул АТФ необходима ионизация 15-17 групп с рК 8,0-8,2.

К сожалению, имеющиеся в нашем распоряжении экспериментальй) Необходимо отметить, что этот результат полностью не отрицает интерпретацию этого явления в рамках концепции Бойера, поскольку промежуточная форма фермента может обладать пониженным сродством не ко всем связанным молекулам АТФ, а лишь к тем, которые образуются непосредственно при фосфорилировании АДФ и связаны с активным центром. Кроме того, присоединение ДЦФ может быть необходимым для создания соответствующей функционально активной промежуточной формы фермента, т.е. выполнять регуляторную функцию. ные данные не достаточны душ идентификации этих групп, но судя по величине рК ими могут быть Ид-группы лизина, которые обнаружены в некаталитическом центре АТФсинтетазы 125 .ж Н--группы гистидинов и s Н-группы цистеиновых остатков, которые также могут участвовать в пероксидазной активности митохондрий, которая как мы видели выше (стр. 84-86), по данным некоторых авторов, необходима для эффективного окислительного фосфорилирования.

Другая важная особенность механизма образования АТФ при быстром повышении рН суспензии митохондрий состоит в том, что функционально активное неравновесное состояние фермента фосфорилирования возникает только при определенной конформации мембраны, которая в свою очередь определяется редокс состоянием дыхательной цепи.

На основе анализа собственных и литературных данных по влиянию дыхательной активности митохондрий на их стабильность и АТФазную активность мы объяснили этот факт влиянием конфор-мационного состояния мембраны на исходную и конечную конформа-цию белков, подвергающихся ионизации при повышении рН, их расположение в мембране и доступность ионизируемых групп белков для Н* водной фазы.

Таким образом, полученные в работе экспериментальные данные довольно однозначно свидетельствуют о принципиальной возможности конформационного механизма фосфорилирования АДФ в митохондриях.

Можно думать, что механизм фосфорилирования, лежащий в основе обнаруженного явления или его отдельные элементы могут реализоваться в процессах окислительного фосфорилирования. Конечно, в реальных условиях не наблюдается скачков рН того же знака и величины, которые имели место в наших экспериментах. Однако, очевидно, что аналогичный эффект может быть получен путем соответствующего изменения jK тех же групп соответствующих белков. Модификация jK может осуществляться за счет кон-формационных изменений белков-трансформаторов в'процессе их функционирования, при конформационных изменениях мембран и возникновения электрического потенциала в процессах дыхания и т.д. [63, 88, 92] .

Возможная гипотетическая схема механизма синтеза АТФ, осуществляющегося цри скачкообразном повышении рН, представлена на рис. 14. В соответствии с этой схемой при каждом акте электронного переноса могут возникать промежуточные состояния компонентов электронтранспортной цепи с измененной конформацией (причина и механизм возникновения таких состояний подробно разобраны выше стр. 84-86). Там же приведены экспериментальные данные, подтверждающее их существование. Это может приводить к изменению структуры АТФсинтетазного комплекса, либо за счет непосредственного взаимодействия с переносчиком-трансформатором, либо опосредовано путем изменения мембранного окружения. В этом промежуточном состоянии АТФсинтетазы понижены рК и увеличена доступность, например, тех групп белка (или мембраны), которые подвергаются ионизации в наших экспериментах по рН--скачку. В свою очередь, ионизация этих групп может привести к возникновению тех функционально активных промежуточных состояний, которые наблюдались в наших экспериментах по скачкообразному повышению рН. Подчеркнем еще раз, что эта схема является совершенно гипотетичной и не претендует на большее. накрН 5,0-7,8 Т и

ДТФсинт- ьньо-ъе-^в.ч чо 1 ч Э т Ч fit iнач. f>H 5,0-7,8, Н+АйР. % конец./>Н 8.5 -9. ^ f> И коней. 8, S -9,6

ATP

Рис. 14. Гипотетическая скачкообразном схема механизма синтеза АТФ при повышении рН.

В заключении остановимся на причинах различного ингибиру-ющего действия ФКФ на фосфорилирование ДЦФ при рН-ударе и окислении субстратов. Как мы уже отмечали выше, в используемых в работе концентрациях ФКФ полностью ингибируется окислительное фосфорилирование, в то время как синтез АТФ, индуцируемый повышением рН, уменьшается на 70%, Возможная цричина различного действия ФКФ заключается в том, что при окислительном фосфорилировании ФКФ влияет не только на АТФсинтетазный комплекс, но и на механизм сопряжения окисления и фосфорилирования (имеется в виду, что ФКФ может влиять на состояние переносчиков-трансформаторов [П4] и их взаимодействие с АТФсинтетазой (в работе |lI5] было показано, что действие ФКФ зависит от функционального состояния митохондрий) и по классической схеме на протонную проводимость и возникающее в ходе окислительного фосфорилирования энергизованное состояние мембраны в целом.

Ингибирующее действие ФКФ на индуцируемый скачком рН синтез АТФ митохондриями объясняется тем, что ФКФ влияет на функциональную активность и время жизни промежуточного состояния АТФсинтетазного комплекса (или мембраны). Последнее обстоятельство подтверждается результатами независимых экспериментов. Выше мы упоминали, что при скачкообразном повышении рН и возникает нестабильное промежуточное состояние митохондрий с измененной степенью восстановленности цитохрома в и Cj. Релаксация к конечному состоянию заметно ускоряется в присутствии ФКФ,

ВЫВОДЫ

1. Изучено влияние скачкообразного изменения рН на фосфо-рилирующую активность нативных и разобщенных старением митохондрий из печени крыс и сердца быка.

2. Показано, что при быстром повышении рН в исходно фосфорилирующих митохондриях увеличивается выход АТФ. При обратном знаке изменения рН эффект не наблюдается.

3. В разобщенных старением или перемораживанием митохондриях при увеличении рН происходит фосфорилирование АДФ. Этот эффект наблюдается только при условии, что в процессе повышения рН проходит значение 7,8-8,3 и его величина не изменяется при увеличении разности между конечным и начальным рН от 0,7 до 4.

4. Индуцируемый повышением рН синтез АТФ в митохондриях полностью подавляется олигомицином и на 70% ингибируется ФКФ.

5. Ингибиторный анализ показал, что вызываемое изменением рН фосфорилирование АДФ не связано с работой дыхательной цепи, а, по-видимому, ■ обусловлено конформационными изменениями в мембране и в связанном с ней АТФсинтетазном комплексе при повышении рН среды.

6. Показано, что на величину эффекта оказывает сильное влияние редокс состояние электронтранспортной цепи и наличие кислорода, поддерживающего необходимый уровень перекисей липи-дов.

7. Показано, что редокс состояние дыхательной цепи влияет на АТФазную активность митохондрий.

8. Наблюдаемые явления интерпретируются в рамках конформационных концепций окислительного фосфорилирования.

В заключение считаю своим приятным долгом выразить искреннюю благодарность моему научному руководителю д.х.н. Р.М. Давыдову за постоянную помощь в работе, полезное обсуждение результатов,

Я глубоко признательна зав, лабораторией физической химии биополимеров ИХ§> АН СССР профессору Льву Александровичу Блюменфельду, проявившему большое внимание и интерес к моей работе на всех ее этапах. Благодарю также весь коллектив лаборатории за помощь и поддержку.

1.Mitchell P. Coupling of phosphorylation to electron and hydrogen transport by a chemiosmotic type of mechanism.-Nature, 1961,v.9,p.144-148.

2.Boyer P.D. A model for conformational coupling of membrane potential and proton translocation to ATP synthesis and active transport.-FEBS LETTERS,1975,v.58,p.1-8.

3.Блшенфельд Л.А. Проблемы биологической физики.Изд. Наука, Москва,1977.

4.Mitchell P. Chemiosmotic coupling in oxidative and photosyn-thetic phosphorylation.-Bodmin,G1inn Research,1966.

5. Boyer P.D. Coupling mechanism.Incapture,transmission,and use of energy.-Ann.Rev.Biochem.,1977,v.46,p.957-961.

6.Блюменфельд Л.А., Кольтовер В.К. Трансформация энергии и кон-формационные переходы в митохондриальных мембранах как релаксационные процессы.-Мол. биол. 1972,т.6,№ 2,стр.161-168.

7. Schnaitman C.,Greenawalt J.M. Enzymatic properties of the inner and outer membranes of rat liver mitochondria.-J. Cell. Biol.,1968,v.38,p.15S175

8. Harris R.A.,Penniston J.T.,Azai J.,Green D.E. The conformational basis of energy transformation in membrane system.II Correlation between conformational change and functional states.-Proc. Natl. Acad.Sci. USA,1968,v.59,p.830.

9. Racker E.,Horsman L.L. Partial resolution of enzyme catalyzing oxidative phosphorylation.XIII. Structure and function of submitоchondrial particles completely resolved with respect to coupling factori I.-J. Biol. Chem.;1967,v.242,p.2547-2553.

- 102 lO.Racker E.(ed.) Structure and function of membranes of mitochondria and chloroplasts, Reinhold Hew York,1969.

H.Chappell J.B. System for the transport of substanses into mitochondria. -Brit.Med. Bull, v.24,1968,p.150-158.

12.0hnishi T.,Ingleder M.J. An analysis of some thermodynamic properties of iron-sulfur center in site I of mitochondria. -Biochem. J.,1980,v.186,p.111-117.

13. Gutman M. Regulation of mitochondrial succinate dehydrogenase by substrate type activators.-Biochemistry,1977,v.16, H.14,p.3067-3072.

14. Харбури Г.А., Маркс P. Г. Цитохромы в ис в книге: Эйхгорн Г. Неорганическая биохимия. М., Мир, 1978, т. 2,стр.339-349

15. Adar P. ,Erecinska М. Spectral evidance for interaction between membrane-boundhemessresonanse raman spectra of mitochondrial cytochrome b-c complex as function redox potential.-PEBS LETTERS ,1977,v.80,H 1,p. 195-200.

16. Jagow G.W.,Schagger H.,Kolb H.J. Beef heart complex Ills isolation and characterization of heme b-carrying subunits. In Energy conservation Biol. Membranes.29. Colloq. Biol, Chsra^JCosbach-Baden,1978,Berlin e.a., p. 43-52.

17. Price R.C., Dutton P. L. Single and multiple turnover reaction in the ubiquinone-cytochrome b-c oxidoreductase of Rhodopseudomonas sphaeoides.-Biocim et Biophys. Acta,1977 v.462,К 3 ,p. 731-747.

18. Wilson D. P., Pairs K. A novel property of mitochondrial oxidative phosphorylation. -Biochem. Biophys. Res. Com. 1974,v. 56, N 3, p. 635-640.

20. Erecinska M. , Chanfie B. Studies on the electron transport chain at subzero temperature:electron transport at site III - Archiv. Biochem. Biophys. 1972, v.151, p. 304-315.

21. Chance B. ;Leigh J. S. Jr. Oxygen intermidiates and mixed valence states of cytochrome oxidase:infrared absorption difference spectra of compound A,P snd С of cytochrome oxidase and ogygen.-Proc. Hatl. Acad. Sci. USA,1977,v.74, p. 4777-4780.

22. Chance В.,Williams G. R. A metod for the localization of sites for oxidative phosphorylation.-Hature ,1955»v.176, p.250.

23. Chance В., Lee C. P., Ohnishi U.T. ,Higgens J. Electron transport and energy coupling. In; Electron transport and energy conservation., Adriatica editrice, Bary,1970, p.29

24. Van Buuren K. J., Van Gelder B. F., Muisers A. 0. -Biochemical and biophysical studies on cytochrome aa^ . - Biochim. et Biophys. Acta, 1972, v. 256, И 2, p. 243-257.

25. Kornblatt J. A. The interaction between cytochrome oxidase and cytochrome с that determine the conformation of the oxidized oxidase.-Can. J. Biochem., 1977, v. 55, JJ 4, P. 458464.

26. Kornblatt J. A. A new form of reduce cytochrome с oxidase . J. Biol. Chem. 1980,v. 255, И 15, p. 7225-7231.

27. Harmon J. S., Wikstrom M. K. F. The effect of mitochondrial energization on cytochrome с oxidase kinetics as measured at low temperature. -Biochim. et Biophys. Acta , 1978, v. 503, К 1, p. 56-77.

28. Wikstrom M. K. P. Proton pump coupling to cytochrome с oxidase in mitochondria. - Nature,1977,v. 266, И 5599,p. 271 -273

29. Linsay I. G.,Wllon D. P. Apparent adenosine triphosphate induce ligand change in cytochrome a^ of pigeon heart mitochondria.- Biochemistry 1972, v. 11, N 21,p. 4613-4620.

30. Riske J. S. Inhibitors of respiration at energy coupling site of respiratory chain.- Pharmac. Ther. VII,1980, Pergamon Press, p. 415-450.

31. Hatefi Y., Yage ID. Kinetics of cytochrome Ъ oxidation in antimycin-treated submitochondrial particles. - Biochemistry 1982, v.21, H 25,p. 66146618

32. Chance В., De Vault D., Legalais V.,Mela L., Jonetani T. Kinetics of electron transfer reaction in biological system. In:"Past reactions and primary processes in chemical kinetics". (5th Nobel Symposuim) Almqvist, Wilksell Stockholm 1967, p. 437

33. Chance В.,Lee 0. P., Ohnishi Т., Higgens J. Electron transport and energy coupling. In:"Electron transport and energy conservation". Adriatica editrice, Bary,1970,p. 29

34. Kupriyanov V. V., Pobochin A. S.,Lusikov V. I. Steady state kinetics of electron transfer through cytochrome chain of uncoupling submitochondrial particles. - Biochim. et Blophys. Acta 1977, v 462, N 1, p. 1-11.

35. Saks V. A. ,Kupriyanov V. V., Lusikov V. H. Some peculiarities of the steady-state kinetics of electron transfer in submitochondrial particles. A kinetic model based on the idea of activation on the respiratory chain induced by electron transfer. - Biocim. et Biophys. Acta 1972, v. 283, H 1, p. 42-53.

36. Березин И. В., Варфоломеев С.Д. Стационарная кинетика электронного транспорта в митохондриальной дыхательной цепи

Б кн.: Биокинетика. М, Наука, 1979, стр. 251-253.

37. Engelhardt W. A. Ortho- und Pyrophospat im aeroben und anae-roben Stoffwechael der Blutzellen. - Biochem. Z.,1930,v. 227, p. 16.

38. Белицер Б. А., Цыбакова E.T. 0 механизме фосфорилирования сопряженного с дыханием.-Биохимия, 1939, т. 4, стр. 516.

39. Slater Е. С. Mechanism of phosphorylation in the respiratory chain. - Nature 1953, v. 172,p. 975.

40. Mitchell P. Chemiosraotic coupling in oxidative and photo-synthetic phosphorylation.-Biol. Rev. 1966; v. 41; p. 445502.

41. Mitchell P.,Moy)le J. Respiration -driven proton translocation in rat liver mitochondria.-Biochem. J; 1967, v. 105, p. 1147-1162.

42. Mitchell P. Chemiosmotic Coupling and Energy Transduction Glynn Research, Ltd. Bodmin, 1968*

43. Mitchell P., Moyle J. Translocation of some anion,cations and acids in rat liver mitochondria.-Eur. J. Biochem. 1969, v. 9, p. 149-155.

44. Mitchell P. Membrane of cells and organelles. In; Proka-ryotic a nd Eukaryotic Cells. XX Symposia of the Society for General Microbiology, 1970, p. 211.

45. Mitchell P. Structure a nd function of the respiratory chain of mitochondria and bacteria.- In: Energy transduction in respiration and photophosphorylation.-Bary, Adriatica Editrice, 1971 .

46. Mitchell P. Protonmotive redox mechanism of the cytochrome b-c .j complex in the respiratory chains protonmotive ubiquinol cycle.- FEBS LETTERS ,1975,v. 56, p. 1-6

- 106

47. Mitchell P. Possible molecular mechanism of the protonmotive function of cyt. ochrome systems.-J. Theor. Biol. 1976, v. 62, p. 327-367.

48. Mitchell P. Vectorial chemistry and the molecular mechanism of chemiosmotic coupling: power transmission by proti-city.-Biochem. Soc. Trans. 1976, v. 4, p. 399-430.

49. Mitchell P. Oxidative phosphorylation and photophosphoryla-tion.- Ann. Rev. Biochem. 1977, v. 46, p. 996-1005.

50. Либерман E.A., Топалы В. П.,Цофина JI.M.,Ясайтис А.А.,Скула-чев В.П. Транспорт ионов и .электрический потенциал митохон-дриальных мембран.-Биохимия, т. 34, 1969,стр. 1083-1086.

51. Bakeeva L. Е., Grinius L. L. et al. Conversation of biome-mbrane-produced energy into electric form. II Intact mitochondria .-Biochim. et Biophys. Acta 1971, v. 234, p. 117.

52. Гритос Л.Л., Скулачев В.П. Генерация мембранного потенциала сопряженная с переносом водорода.-Биохимия,1971,т.36С.430-435

53. Кулене В.В.,Скулачев В.П.,Ясайтис А.А. Обнаружение мембран! ного потенциала митохондрий по изменению флуоресценции анилинонафталинсульфоната.-Биохимия,1971,т.36, стр.649-652

54. Skulachev V. P., Sharaf A. A., Liberman Е. A. Proton conductors in the respiratory chain and artificial membranes.-Nature 1967, v. 216, p. 718-719.

55. Skulachev V. P. , Jasaitis A. A.,Navickaite V. V.,Yaguzhin-sky L. S. Five types of uncouplers for oxidative phpsphory-lation.-PEBS ;/.:sSEJ?.; 1969, v. 17, p. 275-284.

56. Либерман E. A7, Топалы В.П. Проницаемость биомолекулярных фосфолипидных мембран для жирорастворимых ионов.-Биофизика 1969, т. 4, стр. 256-258.

57. Jagendorf A. T. Biochemistry of energy transformations during photosjthesis .-In:"Survey of Biological Progress N. Y; Acad. Press, 1962, p. 181.

58. Uribe E. G., Jagendorf A. T. Organic acid specificity for acid-induced ATP synthesis by isolated chloroplasts.-Plant Physiology, 1967, v. 42, p. 706-711.

59. Jagendorf A. '2. Acid-base^transition and phosphorylation by chloroplasts.-Federation Proceeding, 1967, v. 26, N 5, p. 1361-1369.

60. Thayer W. S.,Hinkle P. C. Kinetics of adenosine triphosphate synthesis in bovine heart submitochondrial particles.

J. Biol. Chem.,1975, v. 250, p. 5336-5342.

61. Гринюс Л. JI. Трансформация химической энергии в электрическую в биомембранах-,сопрягающих окисление и фосфорилирование. -ЗСанд. дисс., М., 1971.

62. RackLT Е. A new Look at mechanism in bioenergetics. Acad. Press , Inc. ,1976.

63. Grllber M.,R8gner M.,Samoray H. E. D., Hauska G. Field-driven ATP synthesis by chloroplast coupling factor complex reconstituted into liposomes.-FEBS LETTERS 1982, v. 145,

N 1, p. 35-40 .

64. Mitchell P., Moyle J. Proton - transport phosphorylation: some experimental test.-In* Biochemistry of mitochondria. 1967, London Acad. Press , p. 53.

65. Cockrell R. S. Energy conservation during valinomycin-sti-mulated К efflux from mitochondria.-Feder. Proc. 1968, v. 27, p. 528-532.

66. Cockrell R. S. , Harris E;J., Pressman В. C. Synthesis of ATP driven by a potassium gradient in mitochondria.-Nature 1967, v. 215, p. 1487-1488.

67. Щипакин В.Н., Евтодиенко Ю.В., Кудзина 1.Ю. Влияние ионов Са на реакции синтеза и распада богатых энергией соединений в митохондриях. - В сб. Митохондрии - М.: "Наука", 1969, с.79.

68. Rossi Е., Azzone G. P. The mechanism of ion translocation in mitochondria. Ill Coupling of К efflux with ATP synthesis. -Europ. J. Biochem.,1970, v. 12, p.319-326.

69. Wilson D. P., Ponnan H. G. Mitochondrial transmembrane pH and electrical gradient evalution of their energy relationships with respiratory rate and adenosine 5-triphosphate synthesis.-Biochemistry, 1982, v. 21, p. 1439-1444.

70.Красинская И. П., Маршанский В.Н. Изучение механизма подавления АТФ-синтетазной активности интактных митохондрий ингибиторами дыхательной цепи.-Тезисы I Всесоюз. биофизико-го съезда ,М., 1982, т.1,стр. 264.

71. Cole J, S., Aleem М. I. H. Oxidative phosphorylation in Thiobacillus novellus.-Biochem. Biophys. Res. Common., 1970, v. 38, p. 736-738.

72. Kell D. В., Hitchen D. D. Proton-coupling energy transduction by biological membrane.-Paraday Discussion 74/-74/23-Kell-1A, 1983.

73. Rottenberg H. Uncoupling of oxidative phosphorylation in rat liver mitochondria by genelal anesthetics.-Proc. Hatl. Acad. Sci. USA, 1983, v. 80, p. 3313-3317.

74.Tupper J. T. Mitochondrial membrane potential measure with microelectrodes: probable ionic basis.-Science, 1969, v. 166, p. 1539.

75. Rottenberg H., Grunwald Т., Avron M. Determination of pH in chloroplasts . I Distribution of^ C-methylamine.-Eur.

J. Biochem., 1972, v. 25, p. 24.

76. Avron M. Proton transport and photophosphorylation. In: "Book of Abstracts, VI. Intemat. Cong, on Photobiology".-Biochem.-21-25.08. 1972, IT 035.

77. Karlish S.J.D., Avron M. Relevance mechanism of energy-coupling in photophosphorylation.-Hature, 1967, v. 216, p. 1107.

78. Karlish S. J• D., Avron M. Energy transfer, inhibition, and ion movement in isolated chloroplasts.-Europ. J. Biochem., 1971, v. 30, p. 51-56.

79. Uicholls D. G. The influence of respiration and ATP hydrolysis on proton electrochemical gradient across the inner membrane of rat liver mitochondria as determined by ion distribution. -Europ. J. Biochem., 1974, v.;50,^p. 304-309.

80. Jonce P. D«, Westerhoff H. V. Proton-per-electron stoichio-metry of site of oxidative phosphorylation at higt protonmo-tive force is close 1.5.-Biochem. J., 1982, v, 204, p. 515523.

81. Rottenberg 0. H, Hon-equilibrium thermodynamics of energy conversion in bioenergetics.-Biochim. et Biophys. Acta, 1979, v. 549, p. 225-253.

82.Красинская И. П., Маршанский В. Н., Драгунова С. Ф., Ягужин-ский I. С. Синхронизация АТФ-синтетазы энергизованными митохондриями.-Биохимия, 1984, т. 49, стр. 87-92.

83. Senior А. Е. The mitochondrial ATPase.-In:"Membrane proteins in energy transduction". (Capaldi R. A. ed.) Marcel Deker,

1979, p. 233-278.

84. Chernyak В. V., Chernyak V. Y., Gladysheva T. B.,Kozhanova Z. E.,Kozlov I. A. Structural rearrangement in soluble mitochondrial ATPase.-Biochim. et Biophys. Acta, 1931, v. 635, p. 552-570.

85. Boyer P. D., Cross R. L., Momsen W. A new concept for energy coupling in oxidative phosphorylation based on a molecular explanation of the oxygen exchange reactions.-Proс. Natl. Acad. Sci. USA, 1973, v. 70, p. 2837-2839.

86. Boyer P. D. Carboxyl activation as possible common reaction in muscle contraction.-In:"oxidases and related redox sys-temes". N Y John Wiley, 1965, p. 994-998.

87. Slater E. C. The coupling between energy-yielding and energy-utilizing reaction in mitochondria.-Quart. Rev. Biophys. 1971, v. 4, p. 35-47 .

88. Давыдов P. M. Физико-химические свойства и функциональная . роль нестабильных форм металлсодержащих белков.-Дисс. Д. Х.Н. 1881, ИХФ АН СССР.

89. Козлов И. А., Черняк Б. К. Мембранный потенциал и синтез АТФ на сопрягающих мембранах.- Б: Успехи биологической химии. 1983, т. 24, стр. 65-82.

90. Cross R. L., Boyer P. D. Evidence for detection of AT32* bound at the coupling sites of mitochondrial oxidative phos-phorylation.-Biochem. Biophys. Res. Comm. 1873, v. 51, p. 56-59.

91. Cross R. L., Boyer P;D. The rapid labelling of adenosine triphosphate by •32P-labelled inorganic phosphate and the exchange of phosphate -oxygen as related conformatinal coupling in oxidative phosphorylation.-Biochemistry 1975,v.14, p. 392-398.

92. К Le Quoc, D Le Quoc, Gaudemes Y. Influence of -the energetic state of mitochondria on the inhibition of oxidative phosphorylation by N-ethylmaleimide.-Biochim. et Biophys. Acta 1979, v. 546, p. 356-364.

- Ill

93. Green D. E., Sungchul J, Transduction and structural principles of the mitochondrial transducing unit.-Proc. Uatl. Acad. Sci. 1973, v. 70, H 3, p. 904-908.

94. Boyer P. D. A model for conformational coupling of membrane potential and proton translocation to ATP synthesis and to active transport. PEBS LETTERS 1975, v. 58,p. 1-4.

95. Blumenfeld L. A. The physical aspects of energy transduction in biological systems.-Quart. Rev. of Biophys. 1978, v.11,

IT 3, p. 251-308.

96. Blumenfeld L. A. The physics of bioenergetics processes.-Springer -Verlag, 1983, N Y., Tokou .Berlin.

97. Gray B. P., Gonda I. The sliding filament model of muscle contraction.-J. Theor. Biolog. 1977, v. 69, N 2, p. 167-230.

98. Pecht I., Paraggi M. Electron transfer to ferricytochrome с reaction with hydrated electron and conformational changes involved.-Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1972, v. 62, IT 4, p. 902-906.

99. Blumenfeld L. A., Burbaev D. S.,Lebanidze A.V. ESR study of the structural nonequilibrium states of iron-sulfur centres of soluble pea ferredoxin,membranebound ferredoxin in bean chloroplasts and U—2 centre in mitochondria.-Studia biophysica,1977, v.63, U 2, p. 143-148.

100.Marbach G., Vignais P. M. A molecular mechanism of energy transduction at a cytochrome level.-J. Theor. Biol. 1975, v. 54,ИЗ, p. 335-343.

101. Erechinska M., Wilson D. P. Cytochrome с oxidase. A synopsis. -Arch. Biochim. Biothys. 1978, v. 188, N 1, p. 1-14.

102. Chance B. The nature of electron transfer and energy coupling reaction.-PEBS LETTERS 1972, v. 23, N1, p. 3-25.

ЮЗ, Lumry R. Conformational mechanism for free ehergy transduction in protein systems,old ideas and new facts.-Annal. Acad. Sci. N Y 1973, v. 248, p. 47-73.

104. Cartling В., Ehrenberg A.A. A molecular mechanism of the energetic coupling of sequence of electron transfer reactions to endergonic reaction.-Biophys. J.

105.Blumenfeld L.A., Davydov R. M. Chemical reactivity of metall-protein in conformationally out-of-equlibrium states.-Biochim. et Biophys. Acta 1979, v. 549, N 2, p. 255-280.

106. Ohnishi Т., IngLedew M. J. An analysis some thermodynamic properties of iron-sulfur centres in site I of mitochondria. -Biochem. J; 1980, v. 186, N1, p. 111-117.

107. L de Meis, Ines G. ATP synthesis by sarcoplasmatic retucu

2+ lum ATPase following Ca , pH, temperature and water activity jump.-J. Biol. Chem. 1982, v. 257, N 3, p. J289-1294.

108. Мосолова И. M., Горская И. А., Шольц К. Г., Котелышкова А. В. -в 'Методы современной биохимии", (ред. Котельникова А. В.) 1975, Наука, М., стр. 45-47.

109. Itzaki R. P., Gild D. М. A determination of protein content.-Anal. Biochem. 1964, v. 9, p. 401-410.

110. Мохова E. H. , Жигачева И.В. Концентрация цитохромов в митохондриях и гомогенате печени при адаптации к холоду.-В: Митохондрии. 1977, Наука, М.

111. Cooney D. A., Jayaran Н. N., Homan Е. R., Motley С. I. Simple radiomrtric method of determination ATP.-Anal. Biochem. 1974, v. 62, p. 157-165.

112. Anner В., Moosmayer K. Determination of P^content.-Anal. Biochem. 1975, v.65, p. 305-311.

113. Шарышев А» А., Красинская И. П., Ягужинский Л. С. О механизме эффекта Кребтри: влияние рН среды инкубации на скорость дыхания митохондрий.-Биохимия 1982, т. 47, в. 10, стр. 1738-1740.

114. Hanstein W. G., Hatefi J. Characterization and localization of mitochondrial uncoupling binding sites with an uncouple capable of photoaffinity labelling.-J. Biol. Chem. 1974, v. 249, p. 1356-1362.

115. Katre H. V., Wilson D. P. Interaction of uncoupler with the mitochondrial membrane: a high affinity binding sites.-Archiv. Biochem. Biophys. 1977, v. 184, p. 578-585.

116. Wang J. H., Copeland L. Chemical modification of mitochondria. Uncoupler, binding by mitochondria in different metobolic states.-Archiv. Biocem. Biophys. 1974, v. 162, p. 64-72.

117. Carafoli E., Gazzoti P. Loss and maintenance of energy-linked functions in aged mitochondria.- Biochem;Biophys. Res. Comm. 1970, v. 39, p. 5-8.

118. Лемешко В. В. " Сохранение функциональной активности митохондрий при глубоком замораживании.-В: Митохондрии ,Наука, М., 1977, стр. 5-II.

119. Скулачев В. П. Трансформация энергии в биомембранах. Наука М., 1972.

120. Кондрашова И. Н., Миронова Г. Д. Необходимость кислорода для фосфорилирования ДЦФ в условиях цианидного блока.-Биохимия , 1971, т. 36, в. 4, стр. 864-866.

121. Миронова Г.Д. О возможной функции пероксидаз в митохондриях В: Биофизика живой клетки. ,р. Франк Г. М. ,1973, Пущино, стр. 34-50.

122.Azzi A., Santato M. ATP and pH induced spectral changes of cytochrome Ъ in rat liver mitochondria.-Biochem» Biophys. Res. Comm. 1971, v. 45, N 4, p. 945-954. 123- Recktenwald D., Hess B. A slow conformation change , in the transient state kinetics of soluble ATPase of yeast mitochondria.-FEBS LETTERS 1977, v. 80, N 1, p. 187-189. 124. Brunori A. M., Colosimo A., Antonini A. et al; The functional properties of "pulsed"cytochrome с oxidase.-J. Biol.

Chem. 1979, v. 254, N 21, p. Ю769-Ю775.

125. Скулачев В.П., Козлов И. А. Протонные аденозинтрифосфатазы, Наука, М. , 1977.

126. Чернавская Н. М., Чернавский Д. С. Тунельный транспорт электронов в фотосинтезе.-М., МГУ, 1977.-175с., ил.