Фосфорилирование белков митохондрий мозга крысы

Крестинина, Ольга Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Фосфорилирование белков митохондрий мозга крысы
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Фосфорилирование белков митохондрий мозга крысы"

На правах рукописи

КРЕСТИНИНА ОЛЬГА ВЛАДИМИРОВНА

ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ БЕЛКОВ МИТОХОНДРИЙ МОЗГА

КРЫСЫ

03.00.02,- Биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино 2005

Работа выполнена в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН

Научный руководитель:

кандидат биологических наук Азарашвили

Тамара Сергеевна

Научный консультант:

доктор биологических наук, проф. Евтодиенко Юрий

Владимирович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Косенко Елена

Александровна

доктор биологических наук, проф. ЯгужиНский Лев

Сергеевич

Ведущая организация: Институт биофизики клетки РАН, Пущино.

Защита диссертации состоится «¿V» Ссч^-ьл. 2005 г. в / 3 3 а Часов на заседании Диссертационного совета Д002.093.01 в

Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН по Адресу: 142290, г. Пущино Московской области, ИТЭБ РАН

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИТЭБ РАН Автореферат разослан « ^ $ » ^005 г.

Учёный секретарь Диссертационного совета Кандидат физико-математических наук

Ланина Надежда Фёдоровна

¿Lo^ry? 7-е б>

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Обратимое фосфорилирование/дефосфорилирование ферментов-мишеней, мембранных рецепторов, ионных каналов и других компонентов клеток является ключевым процессом в системе внутриклеточной сигнализации, ответственной за регуляцию различных клеточных функций. Реакции фосфорилирования/дефосфорилирования ► белков катализируются протеинкиназами и протеинфосфатазами и в

большинстве случаев осуществляются по аминокислотным остаткам серина, треонина и тирозина.

В настоящее время общепринято, что обратимое фосфорилирование белков, наблюдаемое как в клетках прокариот, так и эукариот являющихся эволюционными предшественниками митохондрий, контролирует механизмы, регулирующие ряд таких клеточных функций, как преобразование веществ в гликолизе и цикле Кребса, передача генетической информации (транскрипция и трансляция), клеточное деление, мембранный транспорт, передача сигналов в клетке и др. Сведения о регуляции функций митохондрий путём фосфорилирования /дефосфорилирования белков весьма ограничены. За последние 20 лет обнаружены и детально изучены фосфорилирование нескольких дегидрогеназ цикла Кребса, локализованных в митохондриальном матриксе, и показана соответствующая регуляция активности дегидрогеназ ионами Са2+ как вторичными мессенджерами посредством зависимого от протеинкиназ фосфорилирования (Bradford and Yeaman, 1986; Denton and McCormack, 1990; Hansford, 1994; Nichols and Denton, 1995; Rutter et al., 1998). Однако до последнего времени остаётся неясным регулируют ли мессенджеры процессы преобразования энергии в мембранах митохондрий. Следует отметить, что в митохондриях обнаружены и идентифицированы различные сАМР-зависимые и -независимые протеинкиназы и показано, что эндогенные протеинкиназы могут фосфорилировать ряд мембраносвязанных белков в митохондриях. В митохрндриях сердца и фосфобелок с молекулярной массой 18 кДа идентифицирован как субъединица комплекса I, фосфобелок с м.м. 17 кДа - как субъединица цитохрома-с-оксидазы; показана также ассоциация фосфобелка 42 кДа с митохондриальными ферментными комплексами I, III, IV и V (Sardanelli et al., 1995; Papa et al., 1996; Steenaart and Shore, 1997). В предыдущих исследованиях в нашей лаборатории фосфорилированный пептид с молекулярной массой 3.5 кДа был идентифицирован как субъединица с F0F|-ATPa3bi. Однако остаётся неясным, как осуществляется регуляция фосфорилирования /дефосфорилирования мембраносвязанных митохондриальных белков и каким образом эта регуляция влияет на функции митохондрий.

РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА С. Петербург

а»<Тк

В связи с вышеизложенным, представляется актуальным исследование фосфорилирования митохондриальных белков с целью возможного выявления новых фосфопептидов, выяснения их локализации в митохондриях и механизмов фосфорилирования/дефосфорилирования, а также выяснение вопроса каким образом

фосфорилирование/дефосфорилирование мембраносвязанных белков связано с регуляцией функций митохондрий. Цель и основные задачи исследования.

Целью данного исследования было выявление новых мембраносвязанных '< фосфобелков в митохондриях мозга, исследование факторов, регулирующих их фосфорилирование/дефосфорилирование, а также выяснение возможности регуляции функций митохондрий путём фосфорилирования/дефосфорилирования вновь обнаруженных фосфобелков.

В соответствии с поставленной целью были определены следующие задачи:

1. Выявление спектра фосфорилированных полипептидов в митохондриях мозга.

2. Демонстрация возможности регуляции фосфорилирования /дефосфорилирования белков митохондрий ионами Са2+ как вторичным мессенджером.

3. Исследование корреляции открывания/закрывания Са2+-индуцированной поры (РТР) с фосфорилированием /дефосфорилированием найденных белков.

4. Выявление видов протеинкиназ, фосфорилирующих белки в митохондриях мозга, с помощью ингибиторного анализа. Доказательство участия протеинкиназы А (РКА) и протеинкиназы С (РКС) в фосфорилировании белков митохондрий.

5. Идентификация Са, кальмодулин - зависимой протеинфосфатазы РР2В (кальцинейрин) как протеинфосфатазы, участвующей в дефосфорилировании белков митохондрий.

6. Исследование возможной регуляции функционирования РТР посредством периферического бензодиазепинового рецептора (РВЯ) и фосфорилирования белков в митохондриях мозга.

Научная новизна.

Впервые в митохондриях мозга обнаружены полипептиды с молекулярными массами 17 и 21 кДа, РТР-селективный белок с молекулярной массой 43 кДа, а также низкомолекулярный фосфопептид, молекулярная масса которого определена равной 3.5 кДа, по электрофоретической подвижности в полиакриламидном геле. Показано, что фосфорилирование полипептидов модулируется кальцием в области физиологических концентраций. Была установлена корреляция между процессами открывания неспецифической Са-зависимой, циклоспорин А-

чувствительной поры и фосфорилированием, вновь обнаруженных белков.

Показано, что кальмидазолий и циклоспорин A (CysA), ингибиторы протеи нфосфатазы РР2В (капьцинейрина) повышают уровень фосфорилирования 17 и 3.5 кДа белков. Методом Вестерн блота впервые продемонстрировано присутствие кальцинейрина в митохондриях мозга. Сделано заключение, что это протеинфосфатаза возможно принимает участие в регуляции функционирования РТР путём дефосфорилирования ^ специфических порообразующих белков. Обнаружено модулирующее действие лиганда PBR РКП 195 на фосфорилирование белков митохондрий мозга и показана зависимость действия лигандов PBR от состояния РТР. Сделано предположение, что функционирование РТР регулируется посредством протеинкиназ (РКА, РКС) и протеинфосфатазы (РР2В). Научно-практическая ценность.

Выявление новых фосфорилированных белков митохондрий мозга и наличие корреляции между уровнем фосфорилирования и индукцией неселективной митохондриальной поры позволяет предположить существование нового механизма регуляции РТР, индукция которой считается одной из начальных стадий апоптоза и других нейрональных патологий, связанных с дисфункцией митохондрий. Обнаружение PBR-модулированного фосфорилирования открывает новые возможности в понимании таких процессов как транспорт холестерина и протопорфирина в митохондрии, что является важным для понимания развития патологий, связанных с нарушением этих процессов. Апробация работы.

Материалы диссертации были представлены на международной конференции «Митохондрии в патологии» (Пушено 2001), на конференции «От современной фундаментальной биологии к новым наукоёмким технологиям» (Пущино, 2001), на международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация (Пущино, 200?), на конференции «Мир синапса: молекулярная основа, патология и лекарственные достижения» (Франция, 2004). Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 2 печатных работы и 5 тезисов.

Структура диссертации.

Диссертация изложена на_страницах машинописного текста и

состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения,

выводов и списка литературы (_ ссылок). Диссертация

иллюстрирована_рисунками.

МЕТОДЫ

Разработка метода фосфорилирования митохондриальных белков: Для обнаружения ранее неизвестных фосфорилируемых полипептидов был использован модифицированный нами метод фосфорилирования белков митохондрий. В отличие от методики, используемой другими исследователями (Ferrari et al., 1990; Sardanelli et al., 1995) концентрация ATP составляла 300-500 цМ. Использованная нами концентрация ATP является близкой к концентрации АТР внутри интактных митохондрий и обеспечивает высокую скорость фосфорилирования белков. '¡

Митохондрии преинкубировали в изотонической среде в различных функциональных состояниях. В случае необходимости в среду инкубации дополнительно добавляли исследуемые реагенты. Для регистрации фосфорилирования белков отбирали 20 цл суспензии митохондрий и добавляли 2 цл смеси ([у- 32Р]АТР + немеченая АТР) так, чтобы общая концентрация АТР составляла 300-500 цМ, а проба содержала 5-7 мКи [у- 32Р]АТР. Через 3 минуты инкубации реакцию фосфорилирования останавливали добавлением 20 |дл солюбилизирующего раствора, содержащего 0.35 М Tris (рН 7.8), 10%-ный глицерин, 15%-ный SDS, 25%-ный Р-меркаптоэтанол. Пробы выдерживали в кипящей бане в течение 3 мин. Стандартные методы:

Выделение несинаптических митохондрий мозга крыс линии Вистар проводили методом стандартного центрифугирования с очисткой в градиенте плотностей фикола. (Lai and Clark, 1979). Для разделения митохондриальных пептидов применяли электрофорез в ПААГ, в присутствии SDS в системе Лэммли (Laemmli, 1970). 15% концентрацию разделяющего ПААГ использовали для лучшего разделения низкомолекулярных полипептидов. Для получения радиоавтографов гели экспонировали 3-4- дня на рентгеновской плёнке Kodak X-Omat AR-5 (Sigma, США). Оптическую плотность рентгеновских плёнок в зоне локализации [у- 32Р]-меченых белков определяли с помощью сканирующего денситометра фирмы «BioRad». Функциональное состояние митохондрий оценивали с помощью ТРР+-чувствительного электрода (Kamo et al., 1989). Митохондрии (2 мг белка/мл среды) инкубировали при комнатной температуре в изотонической среде, содержащей 10 мМ Tris-HCL (рН 7.4), 100 мМ KCL, 2 мМ КН2Р04, 5 мМ сукцинат калия и ротенон (2 цг/мл). Са1+-ЕГТА- буферы были приготовлены по методу Бера и др. (Bera et al., 1995).

Иллюстрации: на авторадиограммах показаны результаты типичных экспериментов, на диаграммах представлены средние данные из Зх экспериментов.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Гл.1. Са2+-зависимое фосфорилирование митохондрий мозга.

1.1 Спектр фосфобелков и относительные уровни включения 32Р. На рис. 1 (А) представлено распределение фосфорилированных белков после их разделения методом электрофореза в ПААГ. В результате экспериментов были обнаружены 32Р-содержащие белки с м.м. 65, 43, 21, 17 и 3.5 кДа, отличающиеся по уровню включения 32Р.

Рис 1. Распределение фосфобелков митохондрий мозга в ЗОБ-РАСЕ.

А: авторадиограмма фосфорилированных белков. Слева указана локализация белков- маркеров Б Относительные уровни включения ИР в белки.

На рис. 1Б показана относительная степень включения 32Р в обнаруженные фосфорилируемые белки в интактных митохондриях мозга. Содержание 3 Р в 3.5 и 17 кДа пептидах составляет 36% и 24%, от общего ассимилированного радиоактивного фосфата, а 21, 43, 65 кДа полипептиды включали 6, 20 и 14% радиоактивного фосфата, соответственно.

Следует отметить, что в митохондриях мозга ранее наблюдали фосфобелки с молекулярными массами 32 и 42 кДа, идентифицированные как автофосфорилирующиеся субъединицы сукцинил-Коа-синтетазы, фосфорилирующиеся при инкубации митохондрий в присутствии [у- Р]АТР, а другие фосфопептиды не были обнаружены. (Steiner and Smith, 1981). Белки с молекулярными массами 17, 21 и 43 кДа в настоящее время не идентифицированы. В митохондриях мозга, также как и в митохондриях печени методом Вестерн блота с использованием антител к субъединице с фосфорилированный пептид с молекулярной массой 3.5 кДа был идентифицирован как субъединица с F0FrATPa3bi. 1.2. Фосфорилирование белков в митохондриях в условиях индукции РТР.

На рис 2 показано изменение мембранного потенциала и фосфорилирование низкомолекулярных полипептидов (от 3.5 до 21 кДа) при различных функциональных состояниях митохондрий.

J /*

«кота

12 3 4 5 6 7 8

Рис.2 Фосфорилирование белков в митохондриях мозга при Са2+-индуцируемом открывании РТР, в присутствии ЭГТА и СССР

А. Изменение Дч/т при пороговой нагрузки Саг* и добавлении СССР Стрелками отмечены добавления Са2+ (50 цМ), СССР (1 цМ), СуяА (1 цМ) и ЭГТА (100 цМ). Точками отмечены времена отбора суспензии митохондрий для дальнейшей инкубации с [у-"Р]АТР Б: Авторадиограмма фосфорилированных белков в условиях РТР и падении Дут. 1-интактные митохондрии, 2- Са2+ (50цМ), 3- РТР, 4- в присутствии СувА, 5- в присутствии СувА + Са2* (100 цМ), б- в присутствии СузА + Са2++ СССР, 7- в присутствии ЭГТА, 8- в присутствии ЭГТА+СССР.

На рис 2А показано изменение мембранного потенциала при нагрузке митохондрий Са2+ и разобщение окислительного фосфорилирования. Как видно, необратимое падение мембранного потенциала происходит при нагрузке Са (50цМ, двумя добавками), вследствие индукции поры. В присутствии циклоспорина А (СувА), специфического блокатора РТР, деполяризация мембраны не наблюдается, что указывает на причастность этого процесса к открыванию поры.

Параллельное исследование фосфорилирования белков в этих условиях показано на рис. 2Б. Индукция открывания поры сопровождается сильным ингибированием включения меченого фосфата в пептид с м.м. 3.5 кДа (точки 2 и 3 в сравнении с точкой 1). Таким образом, открывание РТР коррелирует с ослаблением включения меченого фосфата в этот пептид. С другой стороны, уровни фосфорилирования 17 и 21 кДа пептидов заметно увеличивались в этих условиях (см. точки 1 и 3). Следует отметить, что в присутствии СувА степень фосфорилирования пептидов с м.м. 17, 21 и 3.5 кДа была незначительно выше, чем в контроле (сравнение точек 1 и 4). Добавление СССР, разобщителя окислительного фосфорилирования к митохондриям, обработанным циклоспорином А и Са2+, вызывает падение мембранного потенциала

(точка 6). При СССР - индуцированной деполяризации наблюдали увеличение уровня фосфорилирования в 17 и 21 кДа (точки 5 и 6), фосфорилирование же 3.5 кДа пептида при этом сильно не изменялось. Добавление СССР к ЭГТА - обработанным митохондриям приводило к некоторому увеличению уровней фосфорилирования 17, 21 кДа белков (сравнение точек 7 и 8). Полученные данные указывают, что фосфорилирование/дефосфорилирование обнаруженных нами белков зависит от Са2+ и, кроме того, указывают на взаимосвязь функционирования РТР с процессами фосфорилирования/ дефосфорилирования анализируемых фосфобелков. 1.3 Влияние физиологических концентраций Са2+ на фосфорилирование белков в митохондриях мозга крысы.

Так как кальций является одним из ключевых внутриклеточных мессенджеров, вовлекаемых в регуляцию фосфорилирования белков, мы исследовали действие свободного кальция на уровни фосфорилирования белков, обнаруженных нами в митохондриях мозга крысы. Было изучено действие кальция в физиологических концентрациях - от Ю-8 М, типичной для состояния покоя, до 10"6 М, которая может быть обнаружена в активированных клетках (Лейкин, Новгородов, 1971). Митохондрии мозга преинкубировали в Са2+ - ЭГТА буферах, для того чтобы уравновесить вне- и внутримитохондриальные концентрации кальция и поддерживать его определённую концентрацию, а затем инкубировали с [у-32Р]АТР в течение 3-х минут. На рис.3 показана динамика включения 32Р в полипептиды с м.м. 3.5, 17 кДа в зависимости от концентрации Са2+.

17кДа

3.5 кДа

1*7 М

Ра*!. М

Рис 3 Влияние физиологических концентраций Са2* на фосфорилирование белков в митохондриях мозга. Уровни включения ,2Р в полипептиды с м м 3 5 и 17 кДа

Как видно из рисунка фосфорилирование низкомолекулярного пептида с м.м. 3.5 кДа ослабляется при повышении концентрации Са2+ в суспензии митохондрий. Самый низкий уровень фосфорилирования наблюдался при 3 цМ концентрации Са2+, а самый высокий уровень - при 0.01 рМ Са2+.

Противоположное действие кальция на степень включения меченого фосфата было обнаружено для полипептида с м.м. 17 кДа, минимальный уровень фосфорилирования был зафиксирован при 0.01 цМ, а максимальный уровень - при 1-3 цМ Са2+. Резкое увеличение степени включения 32Р имело место при 0.1 цМ-1 цМ концентрациях Са2+. Полученные данные свидетельствуют о том, что физиологические концентрации Са2+ способны модулировать фосфорилирование 3.5 и 17 кДа белков.

Гл. 2. Идентификация протеинкиназ и протеинфосфатаз, участвующих в фосфорилировании/дефосфорилировании белков митохондрий мозга в условиях РТР.

2.1 Идентификация протеинфосфатазы РР2В в митохондриях мозга. Циклоспорин А в комплексе с циклофилином является специфическим ингибитором кальцинейрина (Са2+-стимулируемой серинтреониновой протеинфосфатазы РР2В). Кальцинейрин - это единственная фосфатаза, которая непосредственно активируется кальцием (Swanson et al., 1992). Литературные данные о наличии в митохондриях мозга кальцинейрина отсутствуют, однако показано, что кальцинейрин связывается с митохондриальной мембраной в присутствии белков семейства Вс1-2 (Hemenway and Heitman, 1999; Wang et al., 1999). Кроме того, в митохондриях найдено несколько кальмодулин-связывающих белков (Gazotti et al., 1984). В связи с этим нами были предприняты попытки по выявлению кальцинейрина в митохондриях с помощью иммунохимического анализа.

Рис.4 Иммуноблот для митохондрий мозга после разделения белков в ЯЭЗ-ПААГ с последующим перенесением на мембрану методом Вестерн-блоттинга с использованием поликлональных антител к каталитической (60 кДа) и регуляторной (19 кДа) субъединицам кальцинейрина.

I - митохондрии мозга: 2 - внешняя мембрана митохондрий. 3

внутренняя мембрана митохондрий

24 ЩЦЁ

in -цМ

1* qfolmnim б

Ы,

На рисунке 4 представлены данные Вестерн-блоттинга по обнаружению кальцинейрина. Митохондрии (1), препараты внешней (2) и внутренней (3) мембран подвергались разделению в БОБ-ПААГ с последующим переносом белков на мембрану. Для проведения иммунохимического анализа использовали поликлональные коммерческие антитела к каталитической субъединице (субъединица А с м.м. 60 кДа) и к регуляторной субъединице (субъединица Б с м.м. 19 кДа). Видно, что обе субъединицы кальцинейрина имеются во внешней и во внутренней мембранах митохондрий. Поскольку РТР формируется во внутренней мембране митохондрий, наиболее интересно было выявление локализации кальцинейрина во внутренней митохондриальной мембране. Полученные результаты впервые показывают присутствие кальцинейрина как во внутренней, так и во внешней мембране, и это указывает на возможное участие протеинфосфатазы в регуляции РТР. 2.2. Идентификация протеинкиназ. участвующих в фосфорилировании. Поскольку нами была обнаружена взаимосвязь индукции РТР с изменением уровней фосфорилирования/дефосфорилирования анализируемых белков, было логичным проведения экспериментов по изучению эффекта ингибиторов РК на фосфорилирование белков митохондрий в условиях индукции РТР. На рисунке 5 представлена авторадиограмма белков митохондрий, меченых в условиях индукции РТР в присутствии специфического ингибитора протеинкиназы А Н-89.

Рис 5. Влияние ингибитора протеинкиназы А Н-89 на фосфорилиро-вание белков митохон-дрий мозга в условиях индукции РТР А' Авторадиограмма фосфори»фован>к белков в условиях открытой поры, 2- в присутствии 100 нМ Н-89 в условиях индукции РТР

Б относительные уре-вни фосфорилирования белков с м м 35, 17 и 43 кДа

Из рисунка видно, что в присутствии ингибитора РКА Н-89 (100 нМ) происходит сильное снижение уровней фосфорилирования в полипептидах с м.м. 17 и 43 кДа и незначительное снижение фосфорилирования в пептиде 3.5 кДа. На основе полученных

результатов мы предположили, что в фосфорилировании пептидов 3.5, 17,43 кДа принимает участие РКА.

Чтобы выяснить, принимает ли Са-зависимая РКС участие в фосфорилировании митохондриальных белков в условиях индукции РТР, мы использовали ингибиторы этой РКС стауроспорин, во 6976 и ОР 109203 X

Стауроспорин является ингибитором многих изоферментов РКС. На рисунке 6 показано изменение уровней фосфорилирования анализируемых полипептидов в присутствии 1 цМ стауроспорина. В присутствии этого ингибитора наблюдается заметное ослабление включения меченого фосфата в полипептиды с м.м. 43 кДа и 3.5 к Да и очень сильное ослабление включения в полипептид с м.м. 17 кДа, что указывает на возможное участие РКС в процессе фосфорилирования.

41-»

17-» ИМ»

1.5

■и»

'17 М* ¡"Иф

Рис 6 Эффект ингибитора протеинкиназы С стауроспорина

А' Авторадиограмма фосфорилированных белков в условиях открытой поры, 2- в присутствии I цМ стауроспорина в условиях индукции РТР

Б' относительные уровни фосфорилирования белков с м.м. 3.5, 17 и 43 кДа в присутствии I цМ стауроспорина, в условиях открытой поры.

Для выявление разновидностей РКС, участвующих в фосфорилировании этих белков, мы проверили влияние специфических ингибиторов РКС во 6976 (ингибитора Са-зависимой РКС) и вР 109203 X (ингибитор РКС смешанного типа) при одинаковых концентрациях. На рисунке 7 представлена авторадиограмма меченых белков в условиях индукции РТР (1) и в присутствии специфических ингибиторов РКС (2-Оо 6976, 3-ОР 109203 X) после разделения в ПААГ.

¡■м> )<«Д* I

1с=зэ 17

' ттт 41 >д* ||||

во ОР

Рис 7 Влияние ингибиторов протеинкиназы С во 6976 и ОЯ 109203 X А' Авторадиограмма фосфорилированных белков

I- в условиях открытой поры, 2- в присутствии 1 цМ Со 6976 в условиях индукции РТР, 3- в присутствии 1 цМ бИ 109203 X

Б' относительные уровни фосфорилирования белков с м м 3 5,17 и 43 кДа 1- митохондрии в присутствии 1 цМ Со 6976, 2- митохондрии в присутствии 1цМ ОР 109203 X

Как видно из рисунка, найденный эффект ингибиторов аналогичен эффекту, наблюдаемому в случае со стауроспорином. Полученные данные позволяют предположить включение РКС в фосфорилирование обнаруженных белков.

Гл. 3. Роль периферического бензодиазепинового рецептора (PBR) в фосфорилировании белков и открывании РТР.

3.1 Влияние лигандов PBR РКП 195 и Ro 5-4864 на фосфорилирование белков в интактных митохондриях.

Представляет особый интерес изучение роли PBR в этом комплексе. В результате фармакологических исследований PBR обнаружен во внешней мембране митохондрий как места связывания его лигандов PKI 1195 и Ro 5-4864. (McEnery et al., 1992). Константы связывания этих лигандов лежат в области наномолярных концентраций.

кД>

1рМ 1|М

При очистке PBR была выявлена его солокализация с VDAC и ANT. Функционирование PBR и его роль в различных патологических состояниях давно и широко изучается, однако механизм действия PBR в митохондриях до настоящего времени не выяснен (Papadopoulos et al., 1989, 1993, 1997). Поэтому, в дальнейших экспериментах мы выяснили роль PBR в фосфорилировании митохондриальных белков с помощью его лигандов.

Для этого митохондрии мозга преинкубировапи в присутствии лигандов в течение 3 минут при комнатной температуре и подвергали фосфорилированию в присутствии [у-32Р]АТР.

« 100

III

pk111ss (|im|

0.01 0.1 1 <0

ftoS-MM(iiM) - 0.01 0.1

■3.51» I 3 17ВД.

Рис 8 Влияние различных концентраций PKI 1195 и Ro 5-4864 на уровни фосфорилирования белков в интактных митохондриях А относительные уровни фосфорилирования белков с м м 17 и 3 5 кДа при различных концентрациях PKI 1195; 1 - 0 (контроль), 2-0 01 цМ, 3-01 цМ, 4 - I цМ, 5 - 50 цМ Б. относительные уровни фосфорилирования белков с м.м. 17 и 3 5 кДа при различных концентрациях Ro 5-4864, 1 - 0 (контроль), 2 -0.01 цМ, 3-0.01 цМ, 4 - 1 цМ, 5 - 50 цМ

Диаграмма 8А отражает изменение уровней фосфорилирования белков в присутствии различных концентраций РКП 195. Видно, что уровень фосфорилирования изучаемых белков повышается при увеличении концентрации РК11195 от 0.01 цМ до 0.1 цМ, а дальнейшее повышение концентрации лиганда приводит к ослаблению включения 32Р в полипептиды, которое, возможно, является следствием неспецифического действия РКП 195 на индукциию РТР. Тем не менее, уровни фосфорилирования отмеченных полипептидов под действием микромолярных концентраций РКП 195 были выше, чем в контрольном образце.

На рисунке 8Б показаны изменения уровней фосфорилирования белков с м.м. 17 и 3.5 кДа в присутствии 0.01 цМ - 50 цМ Ro 5-4864. Из рисунка видно, что Ro 5-4864 в наномолярных концентрациях (0.01 и 0.1 цМ) не оказывает влияния на уровень фосфорилирования, как это наблюдается в случае с РК11195, в то время как 1цМ-50цМ концентрации Ro 5-4864 стимулируют фосфорилирование пептидов с м.м. 17 и 3.5 кДа.

3.2 Действие PKI 1195 на фосфорилирование белков митохондрий в условиях открывания поры.

Поскольку PBR солокализован с VDAC и ANT и, по-видимому, является компонентом РТР в митохондриях (Gavish et al., 1999; Casellas et al., 2002; McEnery et al., 1992) мы попытались выяснить, может ли РКП 195 воздействовать на фосфорилирование белков в митохондриях мозга в условиях возникновения РТР. Открывание РТР индуцировали добавлением порогового количества Са2+, как мы описывали ранее. На рисунке 9А показана авторадиограмма фосфорилированных белков митохондрий мозга после их нагрузки кальцием и митохондрий, нагруженных Са2+ в присутствии 0.1 цМ PKI 1195.

кДа

41 щт

17 —►

" — to mm

1 г

Рис 9 Влияние PKI 1195 на фосфорилирование митохондриальных белков в условиях РТР А' авторадиограмма

1 - митохондрии в условиях открытой поры,

2 - митохондрии в условиях открытой поры в присутствии 0 I цМ PKI 1195

Б относительные уровни фосфорилирования белков с м м 3 5, 17 и 43 кДа в митохондриях, инкубируемых в присутствии различных концентраций РКШ95 в условиях открытой поры,

1 - относительные уровни включения 1гР в белки митохондрий в условиях открытой поры,

2 - уровни фосфорилирования белков с м м 3 5, 17 и 43 кДа в митохондриях в условиях открытой поры в присутствии 0 01 рМ PKI 1195

3 - уровни фосфорилирования 3 5, 17 и 43 кДа белков в митохондриях в условиях открытой поры в присутствии 0 1 цМ РКП 195

Как показано на рисунке, после пороговой нагрузки Са2+ степень фосфорилирования пептида 3.5 кДа уменьшалась, подобно тому, как это наблюдали при изучении фосфорилирования низкомолекулярного пептида в митохондриях печени в условиях открытой поры (Azarashvily et al., 2000). Представляет особый интерес тот факт, что в наших экспериментах на митохондриях мозга был обнаружен высокий уровень фосфорилирование пептида с м.м. 43 кДа, который был нами назван РТР-селективный фосфобелок. Было выяснено, что при действии РКП 195

S- 300 I

.1.1.1

фосфорилирование пептидов с м.м. 17 и 3.5 кДа в условиях РТР существенно не изменяется. Вместе с тем, в условиях открытой поры наномолярные концентрации РКП 195 значительно уменьшают уровень фосфорилирования 43 кДа РТР-селективного пептида с м.м.43 кДа. Относительные уровни фосфорилирования митхондриапьных белков при воздействии различных концентраций PKI 1195 отражены на рисунке 9Б. 3.3. Действие РКП 195 на фосфорилирование белков в присутствии Са2+ в области физиологических концентраций.

В следующих экспериментах мы исследовали влияние РКП 195 на фосфорилирование белков митохондрий в присутствии физиологических концентраций Са2+.

Са!', M """ РК11195 -

■ м>в>|

3 17«!

Рис. 10 Относительные уровни фосфорилирования при физиологических концентрациях Са2*.

Добавления РК!I195 обозначены знаком

Фосфорилирование митохондрий проводили в Са/ЭГТА-буферах, концентрацию Са2+ поддерживали в физиологических концентрациях 10'8 M и 1С6 М. На рисунке 10 показаны относительные уровни фосфорилирования в присутствии PKIII95 при этих концентрациях Са2+.

Как показано на рисунке фосфорилирование 3.5 и 17 кДа пептидов в присутствии 0.01 цМ Са2+ незначительно усиливается. При увеличении концентрации Са2+ до 0.3 цМ фосфорилирование 3.5 кДа пептида ослабляется, а включение 32Р в пептид 17 кДа усиливается. Наличие 0.1 цМ РКП 195 и 0.3 цМ Са2+ приводит к увеличению степени включения 2Р как в пептид 3.5 кДа, так и в пептид 17 кДа. Таким образом, лиганд PBR, PKI 1195, обладает способностью модулировать фосфорилирование этих полипептидов, и это фосфорилирование контролируется Са2+ как вторичным мессенджером.

3.4 Совместное действие РКП 195 капьмидазолия и стауроспорина на фосфорилирование белков в митохондриях мозга.

Было исследовано влияние ингибиторов РКС и кальмидазолия (CrnZ), антагониста калмодулина, на уровень фосфорилирования, модулируемого лигандом PBR, PKI 1195.

На рисунке 11 представлена диаграмма, отражающая эффект этих ингибиторов в присутствии 100 нМ РКП 195. Видно, что стауроспорин сильно подавляет РКП 195- индуцированное фосфорилирование пептида с м.м. 17 кДа. Противоположный эффект был выявлен при фосфорилировании митохондриальных белков при одновременном присутствии РКП 195 и CmZ. Видно, что РКП 195 и CmZ стимулируют фосфорилирование. При совместном воздействии этот эффект усиливается.

■ иф 3 17IW

■ и «д.

Il II

РКП 195 - + CmZ + +

Staurosporine - - +

Рис. 11 Действие стауроспорина и капмидазолия в присутствии РКП 195 на фосфорилирование белков Добавки соединений указаны знаком «+»

Полученные результаты позволяют предположить, что РВЯ-модулируемое фосфорилирование регулируется РКС и, возможно, протеинфосфатазой РР2В.

В результате проведённых экспериментов обнаружены новые фосфобелки, фосфорилирование которых модулируется физиологическими концентрациями Са2+. Фосфорилирование полипептидов 3.5, 17 и 43 кДа коррелирует со степенью открывания РТР в митохондриях мозга, что указывает на взаимосвязь фосфорилирования пептидов с функционированием РТР. Ингибиторы РКС, РКА и РР2В изменяют уровень фосфорилирования обнаруженных белков в интактных митохондриях и в условиях РТР, что указывает на возможную их причастность к функционированию РТР. Обнаружено, что лиганд РВЯ, РКП 195, способен модулировать Са2+-зависимое фосфорилирование белков 3.5, 17 кДа в интактных митохондриях, но его действие не проявляется при открывании РТР. Таким образом, функцией РВЯ как рецептора и как компонента РТР является, возможно, модуляция

фосфорилирования компонентов РТР, катализируемого протеинкиназами (РКС и РКА) и протеинфосфатазой кальцинейрином.

ВЫВОДЫ:

1. В митохондриях мозга крыс обнаружены неизвестные ранее и не идентифицированные фосфобелки с м.м. 67, 43, 21, 17 кДа, а также 3.5 кДа полипептид, идентифицированный как субъединица с FoFi-АТРазы.

2. Обнаружено, что фосфорилирование белков в митохондриях мозга модулируется кальцием как вторичным мессенджером.

3. Выявлена корреляция между процессами открывания неспецифической Са-зависимой, циклоспорин А-чувствительной поры и фосфорилированием, вновь обнаруженных белков.

4. С помощью ингибиторного анализа показано, что фосфорилирование полипептидов 3.5, 17, 21 и 43 кДа, осуществляется протеинкиназой А и протеинкиназой С

5. Показано, что кальмидазолий, циклоспорин А, ингибиторы протеинфосфатазы РР2В (капьцинейрина), повышают уровень фосфорилирования белков 3.5 и 17 кДа. Методом Вестерн блота впервые продемонстрировано присутствие капьцинейрина в митохондриях мозга. Сделано предположение, что эта протеинфосфатаза принимает участие в регуляции функционирования РТР путём дефосфорилирования белков, вовлекаемых в регуляцию РТР.

6. Обнаружено модулирующее действие лиганда PBR, РКП 195 на фосфорилирование белков в митохондриях мозга. Показано, что PBR-модулируемое фосфорилирование зависит от концентрации Са2+, изменяется под действием ингибиторов РКС, РКА и РР2В.

7. Сделано заключение, что функционирование PBR, как рецептора и как компонента РТР, регулируется, возможно, протеинкиназами (РКА, РКС) и протеинфосфатазой (РР2В). Сделано предположение, что РТР- и PBR- регулируемое фосфорилирование/дефосфорилирование белков может служить элементом сигнальной системы клеток и митохондрий.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Saris N.-E. L., Krestinina O.V., Azarashvili T.S., Odinokova I.V., Tyynela J., Evtodienko Yu.V. Regulation of ATP synthase by Ca2+ and Mg2+ dependent phosphorylation of subunit c. Advances in Magnesium Research: NOtrition and Health, pp. 101-106,2001.

2. Azarashvili T.S., Krestinina O.V., Odinokova I.V., Evtodienko Yu.V., Reiser G. Physiological Ca2+ level and Ca2+ -induced Permeability Transition Pore control protein phosphorylation in rat brain mitochondria. Cell Calcium, 2003, 34,253-259.

3. Крестинина O.B., Азарашвили T.C., Одинокова И.В., Евтодиенко Ю.В. Роль субъединицы с F0F|ATPa3bi в липофусцинозе. «Митохондрии в патологии». Пущино, 2001, с. 217-219.

4. Азарашвили Т.С., Одинокова И.В., Крестинина О.В., Гаджиева С.Ш., Евтодиенко Ю.В. Новые свойства субъединицы с F0F|ATPa3bi. «От современной фундаментальной биологии к новым наукоёмким технологиям» Пущино, 24-26 октября, 2001,с. 35-36.

5. Azarashvili T.S., Odinokova I.V., Krestinina O.V., Evtodienko Yu.V. Effect prooxidants on phosphorylation of 3.5 kDa peptide of rat liver mitochondria. Abstract and Program book Mockow Meeting. July, 2001, p.13.

6. Krestinina O.V., Azarashvili T.S., Odinokova I.V., Evtodienko Yu.V. Reiser G. Protein phosphorylation in rat brain mitochondria modulated by calsium as a second messendger. Международная конференция «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» Пущино, 2003, с.286-288.

7. Krestinina O.V., Azarashvili T.S., Grachew D.E., Evtodienko Yu.V. Reiser G. Calsium modulated protein phosphorylation in rat brain mitochondria. Conference «The world of the synapse: molecular basis, pathologies and drug discovery», December 9-10, France, 2004, p.56.

Научное издание Автореферат О.В.Крестининой

Налоговая льгота - общероссийский классификатор продукции (Ж-005-93. том 2. 953000- книги и брошюры

Подписано в печать 15 03.05 г Заказ 10164Р Тираж 100 экз Усл.печл 1,0

Отпечатано с оригинала-макета в Объединенном научно-техническом издательстве Путинского научного центра РАН

142290. г Пущино Московской обл . проспект Науки, 3 ОНТИ

РНБ Русский фонд

2005-4 45426

2427

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Крестинина, Ольга Владимировна

ВВЕДЕНИЕ

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1. Фосфорилирование белков как основная система передачи сигнала

1.1.1. Исторические аспекты белкового фосфорилированыя.

1.1.2. Протеинкиназы

1.1.3. Протеинфосфатазы

1.1.4. Калъцинейрин (РР2В)

1.2. Обнаружение фосфобелков в митохондриях мозга и регуляция их функции

1.2.1. Попытки идентификации белков из различных типов тканей

1.2.2. Фосфобелки, обнаруженные в митохондриях мозга

1.2.3. Permeability transition роге (РТР)

1.3. Периферический бензодиазепиновый рецептор

1.3.1. Локализация и структура PBR; белки, связанные с PBR.

1.3.2. Предполагаемые функции PBR

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Фосфорилирование белков в митохондриях мозга крысы в различных функциональных состояниях.

3.1.1. Спектр фосфобелков и относительные уровни включения 32Р.

3.1.2. Фосфорилирование белков в митхондриях в условиях индукции РТР.

3.1.3. Влияние физиологических концентраций Са на фосфорилирование белков в митохондриях мозга.

3.2. Действие ингибиторов протеинкиназ и протеинфосфатаз на фосфорилирование белков в митохондриях.

3.2.1. Влияние калъмидазолия и Н-8 на фосфорилирование белков в митохондриях.

3.2.2. Идентификация протеинфосфатазы РР2В в митохондриях мозга.

3.2.3. Идентификация протеинкиназ, участвующих в фосфорилированщ.

3.3. Влияние высокоаффинных лигандов периферического бензодиазепинового рецептора на фосфорилирование белков в митохондриях мозга.

3.3.1. Влияние РКП 195 и Ко 5-4864 на фосфорилирование белков в митохондриях мозга и функции митохондрий.

3.3.2. Действие РК11195 в условиях открывания поры.

3.3.3. Совместное действие РКП 195, стауроспорина и калъмидазолия в митохондриях мозга. 79 ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Фосфорилирование белков митохондрий мозга крысы"

Осуществляемое посредством киназ фосфорилирование мембранных рецепторов, ионных каналов и других факторов является ключевым событием во внутриклеточной сигнализации, ответственной за регуляцию различных ферментных систем и многих клеточных функций. Из многих типов посттрансляционных ковалентных модификаций белков, которые происходят в клетках, относительно немногие обратимы в физиологических условиях. Одним из таких типов обратной модификации является фосфорилирование/дефосфорилирование, которое в большинстве случаев осуществляется по аминокислотным остаткам серина, треонина и тирозина.

Фосфорилирование/дефосфорилирование является почти универсальным механизмом для регулирования функций белков, которые проявляют ферментативную активность, но также и белков, вовлечённых во многие другие биологические процессы. В настоящее время общепринято, что обратимое фосфорилирование белков, наблюдаемое как в клетках прокариот, так и эукариот, контролирует механизмы, регулирующие ряд таких биохимических функций, как распад гликогена и преобразование- веществ в цикле Кребса, транскрипция гена, трансляция белка, мембранный транспорт, передача сигналов в клетке и др. Обратимое фосфорилирование катализируют протеинкиназы и протеинфосфатазы.

Известно, что регуляция функций митохондрий может осуществляться путём фосфорилирования/дефосфорилирования белков, участвующих в процессах преобразования энергии. За последние 20 лет обнаружены и детально изучено фосфорилирование нескольких дегидрогеназ цикла Кребса, локализованных в митохондриальном матриксе, и соответствующая регуляция активности дегидрогеназ ионами Са2+ как вторичными мессенджерами посредством зависимого от протеинкиназ фосфорилирования (Yeaman and Bradford, 1988; Denton and McCormack, 1990; Hansford, 1994; Nichols and Denton, 1995). В митохондриях животных клеток обнаружены и идентифицированы различные сАМР-зависимые и -независимые протеинкиназы. Эндогенные протеинкиназы могут фосфорилировать ряд мембрано-связанных белков в матриксе митохондрий. За исключением хорошо изученной роли протеинкиназ в регуляции функций митохондрий на уровне пируватдегидрогеназы и дегидрогеназы 2-кетокислот с разветвлённой цепью, роль фосфорилирования белков в митохондриях мало изучена. Тем не менее, показано, что белки, фосфорилируемые протеинкиназами, тесно связаны с комплексами дыхательной цепи. Фосфобелок с молекулярной массой (м.м.) 18 кДа идентифицирован как субъединица комплекса I, фосфобелок с м.м. 17 кДа - как субъединица цитохрома-«с»-оксидазы; показана также ассоциация фосфобелка 42 кДа с митохондриальными ферментными комплексами I, III, IV и V (Sardanelli et al., 1995; Papa et al., 1996; Steenaart and Shore, 1997). Однако остаётся неясным, как осуществляется регуляция фосфорилирования/дефосфорилирования мембраносвязанных митохондриальных белков и каким образом эта регуляция влияет на функции митохондрий.

В связи с вышеизложенным, представляется актуальным исследование фосфорилирования митохондриальных белков с целью возможного выявления новых фосфопептидов, выяснения их локализации в митохондриях, транспорта ионов кальция и выяснения, каким образом регулируются функции митохондрий.

Целью данного исследования было выявление новых мембраносвязанных фосфопептидов в митохондриях мозга и факторов, регулирующих их фосфорилирование/дефосфорилирование, а также выяснение возможности регуляции функций митохондрий путём фосфорилирования/дефосфорилирования вновь обнаруженных белков. В соответствии с поставленной целью были определены следующие задачи:

1. Вывление спектра фосфорилированных полипептидов в митохондриях мозга.

2. Демонстрация возможности регуляции фосфорилирования/ дефосфорилирования белков в митохондриях ионами Са2+ как вторичным мессенджером.

3. Исследование корреляции открывания/закрывания Са2+ индуцированной поры (РТР) с фосфорилированием/ дефосфорилированием найденных белков.

4. Выявление вида протеинкиназ, фосфорилирующих белки в митохондриях мозга, с помощью ингибиторного анализа. Доказательство участия протеинкиназы А и протеинкиназы С в фосфорилировании белков митохондрий.

5. Идентификация Са, кальмодулин-зависимой протеинфосфатазы РР2В (кальцинейрина) как протеинфосфатазы, участвующей в дефосфорилировании белков в митохондриях.

Научная новизна

Впервые в митохондриях мозга обнаружены фосфорилированные полипептиды с м.м. 17 и 21 кДа, РТР-селективный белок с м.м 43 кДа, а также низкомолекулярный фосфопептид, молекулярная масса которого определена равной 3.5 кДа по элекотофоретической подвижности в полиакриламидном геле. Показано, что фосфорилирование полипептидов модулируется ионами кальция в области физиологических концентраций. Была установлена корреляция между процессами открывания неспецифической Са-зависимой, циклоспорин А-чувствительной поры в митохондриальной мембране и фосфорилированием вновь обнаруженных белков.

Научно-практическая ценность.

Выявление фосфорилированных белков митохондрий мозга и изменение уровня фосфорилирования во время функционирования неселективной митохондриальной поры позволяет предположить существование нового механизма регуляции РТР, открывание которой считается одним из начальных стадий апоптоза и других нейрональных патологий, связанных с дисфункцией митохондрий. Обнаружение РВЯ-модулированного фосфорилирования открывает новые возможности в понимании таких процессов как транспорт холестерина и протопорфирина в митохондрии, что является важным для понимания развития патологий, связанных с нарушением этих процессов.

1 .ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Крестинина, Ольга Владимировна

выводы

1. В митохондриях мозга крыс обнаружены неизвестные ранее, не идентифицированные фосфобелки с м.м. 67, 43, 21, 17 кДа, а также 3.5 к Да полипептид, идентифицированный как субъединица с РоРрАТРазы.

3. Была выявлена корреляция между процессами открывания неспецифической Са-зависимой, циклоспорин А — чувствительной поры и фосфорилированием, вновь обнаруженных белков.

4. Посредством ингибиторного анализа показано, что фосфорилирование 3.5, 17 и 43 кДа полипептидов, очевидно, осуществляется РКА и РКС.

5. Показано, что кальмидазолий и циклоспорин А ингибиторы протеинфосфатазы РР2В (кальцинейрина) повышают уровень фосфорилирования 3.5 и 17 кДа белков. Методом Вестерн блота продемонстрировано присутствие кальцинейрина в митохондриях мозга. Сделано предположение, что эта протеинфосфатаза принимает участие в регуляции функционирования РТР путём дефосфорилирования пор-специфических белков.

6. Обнаружено модулирующее действие лиганда РВИ. РКП 195 на фосфорилирование белков митохондрий мозга. Показано, что РВ11-модулируемое фосфорилирование зависит от концентрации Са2+, изменяется под действием ингибиторов РКС, РКА и РР2В.

7. Сделано предположение, что функционирование РВЯ как рецептора и как компонента РТР возможно регулируется активностями протеинкиназ (РКА, РКС)/протеинфосфатазы (РР2В). Сделано предположение, что РТР- и РВ11- регулируемое фосфорилирование/ дефосфорилирование белков может служить элементом сигнальной системы клеток и митохондрий.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

В данной работе мы впервые показали, что в митохондриях мозга обнаружены новые ранее неизвестные и неидентифицированные фосфобелки с м.м. 65,43, 29, 23, 17 и 3.5 кДа.

Следует отметить, что в митохондриях мозга ранее наблюдали фосфобелки с молекулярными массами 32 и 42 кДа, фосфорилирующиеся при инкубации митохондрий в присутствии [у-Р]АТР, а другие фосфопептиды не были обнаружены и исследованы. Для обнаружения ранее неизвестных фосфорилируемых полипептидов мы использовали стандартный метод фосфорилирования белков митохондрий (Ferrari et al., 1990; Sardanelli et al., 1995), усовершенствованный в нашей лаборатории. В частности, концентрация добавляемой к пробам АТР была приближена к внутримитохондриальной концентрации. Этот метод обеспечил высокую скорость включения радиоактивного фосфата в белки и позволил наблюдать фосфорилирование полипептидов с низкой молекулярной массой. Благодаря использованию этого метода концентрация АТР была приближена к внутримитохондриальной концентрации АТР, в связи с этим и была достигнута высокая скорость включения Р из АТР в полипептиды.

Был обнаружен низкомолекулярный 3.5 кДа пептид, который способен включать 32Р из [у-32Р]АТР. Этот фосфопептид был найден во внутренней мембране митохондрий и идентифицирован с помощью методов иммунопреципитации и Вестерн блоттинга как фосфорилированная форма субъединицы с F0FrATPa3bi.

Мы исследовали также влияние различных функциональных состояний митохондрий, в частности РТР на фосфорилирование обнаруженных фосфопептидов. Открытие во внутренней мембране неселективных Са-чувствительных пор является одной из важных функций митохондрий, поскольку формирование таких пор рассматривается как ключевая стадия в развитии многих нейродегенеративных заболеваний. Феномен РТР интенсивно изучается многие годы в основном в митохондриях печени и сердца. Процесс открывания РТР в митохондриях мозга изучен не так подробно, хотя исследуется в последние годы довольно интенсивно. В своих исследованиях мы показали, что митохондрии мозга проявляют стабильность к повышенному содержанию Са2+ и это свойство не позволяет с лёгкостью индуцировать открывание РТР в митохондриях мозга (Козепко е1 а1., 2000, 2001). Кроме того, до настоящего времени отсутствовали данные по корреляции открывания РТР и процесса фосфорилирования, зависимого от активности протеинкиназ. Полученные данные демонстрируют чёткую корреляцию между этими процессами.

Так как Са2+ является одним из ключевых внутриклеточных мессенджеров, вовлекаемых в регуляцию фосфорилирования белков, проводились исследования по выявлению действия свободного кальция на уровни фосфорилирования белков, обнаруженных нами в митохондриях мозга. Было изучено действия Са в физиологичбеских концентрациях от 10"8, типичной для состояния покоя, до 10"6, которая обнаруживается в активированных клетках. Наши результаты показали, что фосфорилирование, зависимое от активности протеинкиназ регулируется физиологическими концентрациями ионов Са2+, т.е. фосфорилирование белков митохондрий мозга подвержено регуляции Са2+ как вторичных мессенджером.

Известно, что циклоспорин А в комплексе с циклофилином является специфическим ингибитором кальцинейрина, Са-стимулируемой серинтреониновой протеинфосфатазы РР2В. Из литературных данных известно, что эта единственная фосфатаза, которая непосредственно активируется кальцием (Swanson et al., 1992). В связи с этим мы предприняли попытку идентификации кальцинейрина в митохондриях мозга, в их внутренней и внешней мембранах. Полученные результаты показывают присутствие кальцинейрина в мембранах митохондрий и указывают на его возможное участие в регуляции функционирования РТР.

Был проведён ингибиторный анализ с целью выявления видов протеинкиназ, участвующих в фосфорилировании исследуемых полипептидов. Было установлено, что РКА и РКС причастны к фосфорилированию обнаруженных белков. Ингибиторы РКС, РКА и РР2В влияли на уровень фосфорилирования обнаруженных белков в интактных митохондриях и в условиях РТР, что указало на возможную их причастность к функционированию РТР.

Согласно современным представлениям РТР - это мультибелковый комплекс, формирующийся в контактных участках митохондрий ассоциацией потенциал-зависимого анионного канала (VDAC) и периферического бензодиазепинового рецептора внешней мембраны митохондрий и адениннуклеотид-транслоказой (ANT) внутренней мембраны митохондрий. Следует обратить внимание, что в настоящее время остаётся непонятым и интенсивно изучается вопрос о существовании одной поры в нескольких функциональных состояниях или о существовании нескольких поркомплексов, либо CsA-чувствительных, либо CsA-нечувствительных. В наших экспериментах мы исследовали CsA-чувствительную пору. Из полученных данных следует, что лиганд PBR РКП 195 способен модулировать Са2+зависимое фосфорилирование 3.5, 17 кДа белков в интактных митохондриях, но его действие не проявлялось при открывании РТР. Представляет особый интерес причастность PBR к феномену РТР. Дело в том, что PBR обнаружен во внешней мембране митохондрий как места связывания его лигандов РКП 195 и Ro 5-4864. При очистке PBR было выявлено, что он колокализован с VDAC и ANT. Было сделано предположение, что комплекс этих белков отражает функциональный комплекс с PBR. Функционирование PBR, его роль в различных патологических состояниях давно и широко изучается. Таким образом, нами было впервые обнаружено, что PBR модулирует фосфорилирование белков в митохондриях мозга.

PBR - индуцированное фосфорилирование происходит при контрольном уровне Са2+ как вторичного мессенджера и, вероятно, действует через способность РКП 195 стимулировать фосфорилирование белков в митохондриях мозга в зависимости от

Л L концентрации Са в инкубационной среде.

Кроме того, мы проверили действие лиганда PBR PKI 1195 совместно с кальмидазолием (CmZ)H стауроспорином, рассматриваемое в условиях РТР. В результате полученных данных было обнаружено стимулирование фосфорилирования полипептидов с м.м. 3.5 и 17 кДа при совместном действии РКП 195 и CmZ в условиях открытой поры. Эта стимуляция в присутствии CmZ согласуется с активацией кальцинейрина.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Крестинина, Ольга Владимировна, Пущино

1. Зоров Д.Б. Митохондриальный транспорт нуклеиновых кислот. Участие бензодиазепинового рецептора // Биохимия, 1996, 61 (7), 1320-1332.

2. Ливанова Н.Б. К проблеме специфичности протеинфосфокиназы печени крыс // Вопр.мед.химии., 1962, 8, 429-431.

3. Adam PA and Haynes R. Control of Hepatic Mitochondrial C02 Fixation by Glucagon, Epinephrine, and Cortisol // J.Biol.Chem., 1969, 144, 64446450.

4. Alexander DR., Hexham JM., Crumpton MJ. The association of type 1, type 2A and type 2B phosphatases with the human T lymphocyte plasma membrane // Biochem J., 1988, 256, 885-892.

5. Alemany S., Cohen P. Phosphorylase a is an allosteric inhibitor of the glycogen and microsomal forms of rat hepatic protein phosphatase-1 // FEB S.Lett., 1986, 198, 194-202. •

6. Anholt RRH., Pedersen PL., De Souza EB., Snyder SH. The peripheral-type benzodiazepine receptor; localization to the mitochondrial outer membrane // J.Bio. Chem., 1986b, 261,576-583.

7. Alessi D., MacDougall L.K., Sola M.M., Ikebe M., Cohen P. The control of protein phosphatase-1 by iphospholi subunits. The major myosin phosphatase in avian smooth muscle is a novel form of protein phosphatase-1 II Eur. J.Biochem., 1992,210, 1023-1035.

8. Anholt RRH., De Souza EB., Oster-Granite ML., Snyder SH. Peripheral-type benzodiazepine receptors: Autoradiographic localization in whole-body sections of neonatal rats // J.Pharmacol.Exp.Ther., 1985, 233, 517526.

9. Antony F.A., Winkler M.A., Edwards H.H., Cheung W.Y., Quantitative subcellular localization of calmodulin-dependent phosphatase in chick forebrain // J.Neurosci., 1988, 8, 1245-1253.

10. Asai A., Qui J-H., Narita Y., Chi S., Saito N., Shinoura N., Hamada H., Kuchino Y., Kirino T. High level calcineurin activity predisposes neuronal cells to apoptose // JBiol.Chem., 1999, 274, 34450-34458.

11. Azarashvily T. S., Tyynela J., Baumann M., Evtodienko Y. V. and SarisI

12. N. E. Ca -modulated phosphorylation of a low-molecular-mass polypeptide in rat liver mitochondria: evidence that it is identical with subunit c of FoFi-ATPase // Biochem.Biophys.Res.Commun., 2000, 270, 741-744.

13. Backer J.M., Arcoleo J.P. and Weinstein I.B. Protein phosphorylation in isolated mitochondria and effects of protein kinase C // FEBS Lett., 1986, 200(1), 161-164.

14. Barford D., Das AK., Egloff MP. The structure and mechanism of protein phosphatases: insights into catalysis and Dhospholip // Ann.Rev.Biohys.Biomol.Struct., 1998, 27, 133-164.

15. Basile AS., Skolnick P. Subcellular localization of "peripheral-type" binding sites for benzodiazepines in rat brain // J.Neurochem., 1986, 46, 305-308.

16. Beavo J.A., Hansen R.S., Harrison S.A., Hurwitz R.L., Martins T.J., Mumby M.C. Identification and properties of cyclic nucleotide phosphodiesterases // Mol Cell Endocrinol., 1982, 28(3):387-410.

17. Benavides J., Cornu P., Dennis T., Dubois A., Hauw J.-J., Mackenzie ET., Sazdovich V., Scatton B. Imaging of human brain lesions with an site radioligand//Annals.Nneurol., 1988, 24, 708-712.

18. Bernardi P., Colonna R., Constantini P., Eriksson O., Fontaine E., Ichas F., Massari S., Nicolli A., Petronilli V., Scorrano L. The Mitochondrial permeability transition // Co/actors, 1998, 8, 273-281.

19. Bernassau JM., Reversat JL., Ferrara P., Caput D., Le Fur G. A 3D model of the peripheral benzodiazepine receptor and its implication in intra mitochontrial cholesterol transport II J.Mol.Graphics., 1993, 11, 236-244.

20. Bera A.K., Ghosh S., and Das S. Mitochondrial VDAC can be phosphorylated by cyclic AMP-dependent protein kinase // Biochem. Biophys. Res. Commun1995, 209, 213-217.

21. Bialojan C., Takai A. Inhibitory effect of a marine-sponge toxin, okadaic acid, on proteinphosphatase // Biochem. J., 1988, 256, 283-290.

22. Bollen M., Stalmans. The structure, role and regulation of type 1 protein phosphatases // Crit. Rev.Biochem.Mol.BioL, 1992, 27, 227-281.

23. Bradford A.P., Yeaman S.J. Mitochondrial protein kinases and phosphatases II Adv.Prot.Phosphatases, 1986, III, 73-106.

24. Bosser R., Aligue R., Guerini D., Agell N., Carafoli E., Bachs O. Calmodulin can modulate protein phosphorylation in rat liver cells nuclei // J Biol.Chem., 1993,268, 15477-15483.

25. Black KL., Ikezaki K., Toga AW. Imaging of brain tumors using periphereal benzodiazepine receptor ligands // J.Neurosurgery., 1989, 71, 113-118.

26. Blahos IIJ., Whalin ME., Krueger KE. Identification and purification of a 10 kDa protein associated with mitochondrial benzodiazepine receptors // J.Biol. Chem., 1995, 270, 20285-20291.

27. Broekemeier K.M., Dempsey M.E., Pfeiffer D.R. Cyclosporin A is a potent inhibitor of the inner membrane permeability transition in liver mitochondria // J. Biol. Chem., 1989, 264, 7826-7830.

28. Brustovetsky N., and Klingenberg M. Mitochondrial ADP/ATP carrier can be reversibly converted into a large chennal by Ca // Biochemistry, 1996, 35(26), 8483-8488.

29. Burgess J.W., and Yamada E.W. cAMP-dependent protein kinase isozymes with preference for histone H2B as substrate in mitochondria of bovine heart//Biochem. Cell. Biol., 1987, 65(2), 137-143.

30. Burnett G., Kennedy EP. The enzymatic phosphorylation of protein // J.Biol.Chem., 1954, 211(2), 969-980.

31. Buttini M., Limonta M., Boddeke H. Distribution of calcineurin A isoenzyme mRNAs in rat thymus and kidney // Histochem J., 1995, 27, 291-299.

32. Canat X., Carayon P., Bouaboula M., Cahard D., Shire D., Roque C., Le Fur G., Casellas P. Distribution profile and properties of peripheral type benzodiazepine receptors on human hemopoetic cells // Life.Sci., 1992, 52, 107-118.

33. Carayon P., Portier M., Dussossoy D., Bord A., Petitpretre G., Canat X., Le Fur G. and Casellas P. Involvement of peripheral benzodiazepine receptors in the protection of hematopoietic cells against oxygen radical damage // Blood 1996, 87, 3170-3178.

34. Carballo M., Marquez G., Conde M., Martin-Nieto J., Monteseirin J., Conde J., Pintado E., Sobrino F. Characterization of calcineurin in human neutrophils // J Biol.Chem., 1999, 274, 93-100.

35. Castedo M., Perfettini J. L. and Kroemer G. Mitochondrial apoptosis and the peripheral benzodiazepine receptor: a novel target for viral and pharmacological manipulation///. Exp. Med. 2002, 196, 1121-1125.

36. Chandrasekaran K and Jayaraman J. Effect of cyclic AMP on the biogenesis of cytochrome oxidase in yeast // FEBS Lett., 1978, 87, 52-54.

37. Chantler PD. Calcium-dependent association of a protein complex with the lymphocyte plasma membrane: probable identity with calmodulin-calcineurin // J. Cell.Biol., 1985, 101,207-216.

38. Choi M/S., Cook B.A. Calmidazolium is a potent stimulator of steroidogenesis via mechanisms not involving cyclic AMP, calcium or protein synthesis // Biochem.J., 1992, 281, 291-296.

39. Casellas P., Galiegue S. and Basile A. S. Peripheral benzodiazepine receptors and mitochondrial function // Neurochem. Int. 2002, 40, 475486.

40. Chen J., Martin BL., Brautigan DL. Regulation of protein serine-threonine phosphatase type-2A by tyrosine phosphorylation // Science., 1992, 257, 1261-1264.

41. Clari G., Pinna LA and Moret V. Comparative study of mitochondrial and cytosol protein kinase activities // Biochim. Biophys. Acta, 1976, 451, 484490.

42. Clipstone NA, Florentino DF and Crabtree GR. Molecular analysis of the interaction of calcineurin with drug-immunophilin complex // J Biol Chem, 1994, 269: 26431-26437.

43. Coghlan V.M., Perrino B.A., Howard M., Langeberg L.K., Hicks J.B., Gallatin W.M., Scott J.D. Association of protein kinase A and protein phosphatase 2B with a common anchoring protein // Science, 1995, 267, 108-111.

44. Cohen P. The structure and regulation of protein phospatases // Annu.Rev.Biochem., 1989, 58: 453-508.

45. Colledge M. and Scott JD. AKAPs: from |phospholi to function // Trends. Cell.Biol, 1999, 9,216-221.

46. Corbin JD and Lincoln TM // Adv.Cyclic.Nucleotide.Res., 1978, 9, 159.

47. Cori G.T., and Cori C.F. The enzymatic conversion of phosphorylase a to bllJBC .,1945, 158,321-322.

48. Cori G.T., and Green A.A. Crystalline muscle phosphorylase.il. prosthetic group HJBC, 1943, 151,31-38.

49. Crompton M., Ellinger H., Costi A. Inhibition by) phospholipid A of Ca2+-dependent pore in heart mitochondria activated by inorganic phosphate and oxidative stress // Biochem.J., 1988, 255, 357-360.

50. Da Silva LP., Lindahl M., Lundin M., Baltscheffsky H. Protein phosphorylation by inorganic pyrophosphate in yeast mitochondria // Biochem.Biophys.Res.Commun., 1991, 178 (3), 1359-1364.

51. De Bias AC., Wang Y., Sorensen R., and Mahler HR. Protein phosphorylation in synaptic membrane regulated by adenosine 3': 5'-monophospate: Regional and subcellular distribution of the endogenous substrates HJ. Neurochem., 1979, 33, 647-659.

52. De Lorenzo RJ and Freedman SD. Calcium dependent neurotransmitter release and protein phosphorylation in synaptic vesicles // Biochem. Biophys. Res. Commun., 1978, 80, 183-192.

53. De Lorenzo RJ. Calcium-dependent phosphorylation of specific synoptosomal function protein: Possible role of phosphoproteins in modulating neurotransmitter release // Biochem.Biophys.Res.Commun 1976,71,590-597.

54. De Souza EB., Anholt RRH., Murphy KMM., Snyder SH., Kuhar MJ. Peripheral-type benzodiazepine receptor in endocrine organs: Autoradiographic localization in rat pituitary, adrenal, and testis // Endocrinology., 1985, 116, 567-573.

55. Delia Fazia MA., Servillo G and Sassone-Corsi P. Cyclic AMP Dhospholi and cellular proliferation: regulation of CREB and CREM // FEBS Lett., 1997,410, 22-24.

56. Dehmel G., Bossmann K. Microradiographic study of secondary caries at filling margins in human teeth, in vivo and in vitro // Dtsch Zahnarztl, 1978, 33(3):225-7.

57. Donella-Deana A, Brunati AM, Marchiori F, Borin G, Marin O, Pinna LA. Different specificities of spleen tyrosine protein kinases for synthetic peptide substrates II Eur.J.Biochem. 1990, 194(3):773-7

58. Denton R.M., Randle P.J., and Martin B.R. Stimulation by calcium ions of piruvate dehydrogenase phosphate phosphatase // Biochem.J., 1972, 128(1), 161-163.

59. Denton R.M., McCormack J.G. Ca as a second messenger within mitochondria of the heart and other tissues II Annu.Rev.Physiol., 1990, 52, 451-466.

60. Ducis I, Norenberg L.O., Norenberg M.D. Effect of ammonium chloride on the astrocyte benzodiazepine receptor // Brain Res., 1989, 493 (2), 362365.

61. Favre B., Zolnierowicz S., Turowski P., Hemmings BA. The catalytic subunit of protein phosphatase 2A is carboxyl-methylated in vivo // J.Biol. Chem, 1994, 269, 16311-16317.

62. Ferrari S., Moret V., and Siliprandi N. Protein phosphorylation in rat liver mitochondria II Mol. And Cell.Biochem., 1990, 97, 9-16.

63. Ferreira A., Kincaid R., Kosik K.S. Calcineurin is associated with the cytoskeleton of cultured neurons and has a role in the acquisition of polarity II Mol.Biol.Cell., 1993,4, 1225-1238.

64. Fischer R., Schmitt M., Bode J. G. and Haussinger D. Expression of the peripheral-type benzodiazepine receptor and apoptosis induction in hepatic stellate cells// Gastroenterol., 2001, 120, 1212-1226.

65. Fisher E.H., and Krebs E.G. Conversion of phosphorylase b to phosphorylase a in muscle // JBC., 1955, 216, 121-132.

66. Flockerzi V., Speichermann N. and Hofmann F. A guanosine 3':5'-monophosphate-dependent protein kinase from bovine heart muscle. Purification and phosphorylation of histone I and lib // JBC., 1978, 253, 3395.

67. Francis SH, Colbran JL, McAllister-Lucas LM, Corbin JD Zinc interactions and conserved motifs of the cGMP-binding cGMP-specific phosphodiesterase suggest that it is a zinc hydrolase II J.Biol.Chem., 1994, 269(36), 22477-80.

68. Friedman D.L. and Larner J.Sdudies on UDPG-Alpha-glucan transglucosylase III interconversion of two forms of muscle UDPG-Alpha-glucan transglucosylase III by a phosphorylation reaction sequence // Biochemistry, 2, 669-675.

69. Furuke K., Shiraishi M., Mostowski H.S., Bloom E.T. Fas ligand induction in human NK cells is regulated by through a calcineurin-nuclear factors of activated T cell-dependent pathway // J.Immunol., 1999, 162, 1988-1993.

70. Gaglirdino J.J., Krinks M.N., Gaglirdino E.E. Identification of the calmodulin-regulated protein phosphatase, calcineurin, in rat pancreatic islets // Biochem.Biophys.Acta, 1991, 1091,370-373.

71. Galiegue S., Tinel N., and Casellas P. The peripheral benzodiazepine receptor: a promising therapeutic drug target // Curr.Med.Chem., 2003, 10(16), 1563-1572.

72. Garnier M., Dimchev AB., Boujrad N., Price JM., Musto NA., Papadopoulos V. In vitro reconstitution of a functional peripheral-type benzodiazepine receptor from mouse Leydig tumor cells // Mol.Pharmacol, 1994, 45, 201-211.

73. Gavish M., Bachman I., Shoukrun R., Katz Y., Veenman L., Weisinger G. and Weizman A. Enigma of the peripheral benzodiazepine receptor // Pharmacol. Rev., 1999, 51, 629-650.

74. Gazzotti P., Gloor M., Carafoli E. Calmodulin binding proteins in rat liver mitochondria // BBRC., 1984, 119 (1), 343-351.

75. Genestier L., Dearden-Badet M.T., Bonnefoy-Berard N., Lizard G., Revillard J.P. Cyclosporin A and FK506 inhibit activation-induced cell death in the murine WEHI-231 B cell line // CelUmmunol., 1994, 155, 283-291.

76. Goto S., Ushino Y. Immunostaining for calcineurin, a Ca27calmodulin-regulated protein phosphatase, in the diagnostic tumor pathology // Brain. Tumor.Pathol., 1995, 12, 23-30.

77. Guerini D., Krinks M.N., Sikela J.M., Hahn W.E., Klee C.B. Isolation and• 2+ •sequence of a cDNA clone for human calcineurin B, the Ca -bindingj isubunit of the Ca /calmodulin-stimulated protein phosphatase // DNA, 1989, 8, 675-682.

78. Guerini D., Montell C., Klee C.B. Molecular cloning and characterization of the genes encoding the two subunits of Drosophila melanogaster calcineurin // J.Biol.Chem., 1992, 267, 22542-22549.

79. Guerini D and Klee CB. Structural diversity of calcineurin, a Ca2+ and calmodulin-stimulated protein phosphatase // Adv.Protein.Phosphatases., 1991,6,391-410.

80. Hamasur B., and Glaser E. Plant mitochondrial F0F1-ATP syntase. Identification of the individual subunits and properties of the purified spinach leaf mitochondrial ATP synthase // Eur.J.Biochem'., 1992, 205(1), 409-416.

81. Hanley R.M., Dedman J.R., Shenolikar S. Identification of high-affinity calmodulin-binding proteins in rat liver // Am.J.Physiol.Cell.Physiol., 1987, 252, C272-C284.

82. Hansford R.G. Physiological role of mitochondrial Ca2+ transport // J.Bioenerg.Biomembr., 1994, 26(5), 495-508.

83. Hashimoto E., and Yamamura H. Comparison of substrate recognition by protein kinase C (type III) between rat liver cytosolic and particulate fractions // Int.J.Biochem., 1990, 22(4), 405-410.

84. Hashimoto Y., King M.M., Soderling T.R. Regulatory interactions of calmodulin-binding proteins: phosphorylation of calcineurin by autophosphorylated Ca27calmodulin-dependent protein kinase II // Proc.Natl AcadSci USA., 1988, 85, 7001-7005.

85. Hashimoto Y., Soderling T.R. Regulation of calcineurin by phosphorylation. Identification of the regulatory site phosphorylated by

86. Harper JF., Cheung WY., Wallace RW., Huang HL., Levine AL., Steiner AL. Localozation of calmodulin in rat tissue // PNAS. USA., 1980, 77, 366370.

87. Henriksson T., and Jergil B. Protein kinase activity and endogenous phosphorylation in subfractions of rat liver mitochondria // Biochim.Biophys.Acta, 1979, 588(3), 380-391.

88. Hemenway CS., Heitman J. Calcineurin. Structure, function, and inhibition // Cell.Biochem.Biophys., 1999, 30 (1), 115-151.

89. Hershkowitz M. Influence of calcium on phosphorylation of a synaptosomal protein//Biochem.Biphys.Acta., 1978, 542, 274-283.

90. Hirsch JD., Beyer CF., Malkowitz L., Beer B., Blume AJ. Mitochondrial benzodiazepine receptors mediate inhibition of mitochondrial respiratory control // Mol.Pharmacol., 1989,35, 157-163.

91. Hubbard W/A., Cohen P. On target with a new mechanism for the regulation of protein phosphorylation // Trends.Biochem.Sci., 1993, 18, 172-177.

92. Hughes W.A., and Denton R.M. Incorporation of 32Pi into pyruvate dehydrogenase phosphate in mitochondria from control and insulin-treated adipose tissue //Nature, 1976, 264, 471-473.

93. Highes W.A., Halestrap A.P. The regulation of branched-chain 2-oxo acid dehydrogenase of liver, kidney and heart by phosphorylation // Biochem.J., 1981, 196(2), 459-469.

94. Husi H, Luyten MA, and Zurini MGM. Mapping of the immunophilin-immunosuppressant site of interaction on calcineurin // J.Biol.Chem., 1994,269:14199-14204.

95. Hutson S.M., Berkich D., Williams G.D., LaNoue K.F., Briggs R.W. 31P NMR visibility and characterization of rat liver mitochondrial matrix adenine nucleotides I ¡Biochemistry, 1989, 28(10), 4325-4332.

96. Issinger O.G. Casein kinases: pleiotropic mediators of cellular regulation // Pharmacol.Ther., 1993, 59(1), 1-30.

97. Itzhak Y., Baker L. and Norenberg M. D. Characterization of the peripheral-type benzodiazepine receptors in cultured astrocytes: evidence for multiplicity // Glia ., 1993, 9, 211-218.

98. Johnson EM., Maeno H., and Greengard P. Phosphorylation of endogenous protein protein of rat brain by cyclic adenosine 3',5'-monoposphate-dependent protein kinase // J.Biol.Chem., 1971, 246, 77317739.

99. Jiang H., Xiong F., Kong S., Ogawa T., Kobayasi M., Liu J.O. Distinct tissue and cellular distribution of two major isoforms of calcineurin // Mol Immunol, 1997, 34, 663-669.

100. Kelly PT., Cotman CW., and Largen M. Cyclic AMP-stimulated protein kinases at brain synaptic junctions // J.Biol.Chem., 1979, 254, 1564-1575.

101. Kikkawa U., Takai Y., Minakuchi R., Inohara S and Nishizuka Y. Calcium-activated, |p hospholipids-dependent protein kinase from rat brain. Subcellular distribution, purification, and properties // JBC, 1982, 257, 13341-13348.

102. Kincaid R.L. The role of calcineurin in immune system responses // J.Allergy.Clin.Immunol, 1995, 95, 1170-1177.

103. Kincaid R.L., Takayama H., Billingsley M.L., Sitkovsky M.V. Differential expression of calmodulin-binding proteins in B, T lymphocytes and thymocytes // Nature, 1987,330, 176-178.

104. King M.M., Huang C.Y. The calmodulin-dependent activation and deactivation of the phosphoprotein phosphatase, calcineurin, and the effect of nucleotides, pyrophosphate, and divalent metal ions // J.Biol.Chem., 1984, 259, 8847-8856.

105. Kinnally K.W., Zorov D.B., Antonenko Y.N., Snyder S.H., McEnery M.W., and Tedeschi H. Mitochondrial benzodiazepine receptor linked to inner membrane ion channels by nanomolar actions of ligands // Proc. Natl.Acad.Sci.USA, 1993,90(4), 1374-1378.

106. Kinnally K.W., Lohret TA., Campo ML., Mannella CA. Perspectives on the mitochondrial multiple conductance channel // J.Bioenerg.Biomembr., 1996, 28, 115-23.

107. Kishimoto A., Takai Y., Mori T., Kikkawa U. and Nishizuka Y, Activation of calcium and j p hospholipids-dependent protein kinase by diacylglycerol, its possible relation to phosphatidylinositol turnover // JBC., 1980, 255, 2273-2276.

108. Kitagawa M., Mukai H., and Ono Y. Molecular cloning and characterization of a novel mitochondrial phosphoprotein. MIPP65', from rat liver //Exp.Cell.Res., 1997, 235, 71-78.

109. Kitagawa Y., Racker E. Purification and characterization of two protein kinases from bovine heart mitochondrial membrane // J.Biol.Chem., 1982, 257(8), 4547-4551.

110. Klee C.B., Crouch T.H., Krinks M.N. calcineurin: a calcium-calmodulin-binding protein of the nervous system // Proc.Natl.Acad.Sci USA, 1979,76,6270-6273.

111. Klee C.B., Krinks M.N., Manalan A.S., Draetta G.F., Newton D.L. Control of calcineurin protein phosphatase activity // Adv. Protein. Phosphatases, 1985, 1, 135-146.

112. Klee CB and Krinks MH. Purification of cyclic 3',5'-nucleotide phosphodiesterase inhibitory protein by affinity chromatography on activator protein coupled to Sepharose // Biochemistry., 1978, 17: 120-126.

113. Klee C.B., Ren H., Wang X. Regulation of the calmodulin-stimulated protein phosphatase calcineurin II J.Biol.Chem., 1998, 273, 13367-13370.

114. Krebs E.G., Graves D.J. and Fisher E.H. Factors Affecting the Activity of Muscle Phosphorylase b Kinase IIJBC, 1959, 234, 2867- 2873

115. Kosenko E., Kaminsky Yu., Stavrovskaya I., Felipo V. Alteration of mitochondrial calcium homeostasis by ammonia-induced activation of NMDA receptors in rat nrain in vivo // Brain Res., 2000, 880,139-146.

116. Kosenko E., Venediktova N., Kaminsky Yu., Montoliu K., Felipo V. Preparation and handling of brain mitochondria useful to study uptake and release of calcium II Brain.Res.Protocol, 2001, 7, 248-254.

117. Krebs E.G. Protein kinases // Curr.Top.Cell.Regul., 1972, 5, 99-133.

118. Krebs E.G. The phosphorylation of proteins: a major mechanism for biological regulation// Trans. Biochem, Soc., 1985, 13, 813-820.

119. Krebs EG. The growth of research on protein phosphorylation // Trends Biochem. Sei., 1994, 19, 439-447.

120. Krinks MN., Manalan AS., Klee CB. Calcineurin: a brain-specific isozyme of protein phosphatase-2B // Federation.Proc., 1985, 44, 707a.

121. Kroemer G., Reed JC. Mitochondrial control of cell death // Nature.Med., 2000, 6, 513-519.

122. Kristal BS., Dubinsky JM. Mitochondrial permeability transition in the central nervous system: induction by calcium cycling-dependent and -independent pathways // J.Neurochemistry., 1997, 69, 524-538.

123. Krueger BK., Forn J., and Greengard P. Depolarization-induced phosphorylation of specific proteins, mediated by calcium ion influx in rat brain synaptosomes II J.Biol. Chem. 1977, 252, 2764-2773.

124. Kruger KE., Papadopoulos V. Peripheral-type benzodiazepine receptors mediate transpocation cholesterol from outer to inner membranes in adrenocortical cells II J.Biol.Chem., 1990, 265, 15015-15022.

125. Kruger KE. Molecular and functional properties of benzodiazepine receptors II Biochem.Biophys.Acta., 1995, 1241,453-70.

126. Kuo J.F. and Greengard P. An Adenosine 3',5'-Monophosphate-dependent Protein Kinase from Escherichia coli // JBC., 1069, 244, 34173419.

127. Kuo JF., Andersson RGG., Wise BC., Mackerlova L., Salomonsson I., Brackett NL., Katoh N., Shoji M. and Wrenn RW // PNAS, 1980, 77, 7039-7043.

128. Kuno T., Mukai H., Ito A., Chang C-D., Kishima K., Saito N., Tanaka C. Distinct cellular expression of calcineurin Ad and Ap in rat brain // J.Neurochemistry, 1992, 58, 1643-1651.

129. Kuret J., Bell H., Cohen P. Identification of high levels of protein phosphatase-1 in rat liver nuclei // FEBS.Lett., 1986, 203, 197-202

130. Laemmli U. Cleavage of structure proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 //Nature, 1970, 227, 680-685.

131. Lai JCK., Walsh JM., Dennis SC., and Clark JB. Synaptic and nori-synaptic mitochodria from rat brain: Isolation and characterization // J.Neurochem., 1977, 28, 625-631.

132. Lawen A., Baker MA., Malik S. Apoptosis and redox homeostasis: on a possible Dhospholi of action of Bcl-2 // Protoplasma, 205, 10-20, 1998.

133. Le Quoc K. and Le Quoc D. Involvement of the ADP/ATP carrier in calcium-induced perturbations of the mitochondria inner membrane permeability: impotance of the nucleotide binding site // Arch.Biochem. Biophys., 1988, 265, 249-257.

134. Le Quoc K. and Le Quoc D. Critical role of sulfhydryl groups in mitochondrial inner membrane structure // J.Biol.Chem., 1985, 260, 74227428.

135. Li W., Handschumacher RE. Igentification of two calcineurin IB-binding proteins: tubulin and heat shock protein 60 // BBA, 2002, 1599, 72-81.

136. Lincoln TM., Dills WL and Corbin JD. Purification and subunit composition of guanosine 3':5'-monophosphate-dependent protein kinase from bovine lung // JBC., 1977, 252, 4269.

137. Lowry O.H., Rosenbrough N.J., Farra A.L., Randall R.J. Protein measurement with the folin phenol reagents /IJ.Biol.Chem., 1951, 193(2), 265-275.

138. Lui J., Li H., and Papandopoulos V. PAP7, a PBR/PKA-Rialpha-associated protein: a new element in the relay of the hormonal induction of steroidogenesis // J.Steroid.Biochem.Mol.Biol, 2003, 85(2-5), 275-283.

139. Manalan A.S., Klee C.B. Activation of calcineurin by limited proteolysis. // PNAS.USA, 1983, 80, 4291-4295.

140. Martensen TM., Martin BM., Kincaid RL. Identification of the site on calcineurin phosphorylated by Ca /CaM-dependent kinase II:modification of the CaM-binding domain // Biochemistry., 1989, 28, 92439247.

141. Massari S. and Azzone G.F. The equivalent pore radius of intact and damaged mitochondria and the mechanism of active shrinkage // Biochem.Biophys.Acta, 1972, 283, 23-29.

142. McGeer EG., Singh EA., McGeer PL. Peripheral-type benzodiazepine binding in Alzheimer disease // Alzheimer.Dis.Assoc.Disord., 1988, 2, 331-336.

143. McKnight GS., Clegg CH., Uhler MD., Chrivia JC., Cadd GG., Correl LA. And Otten AD // Ree.Prog.Hormone.Res., 1988, 44, 307-335.

144. Merat DL and Cheung WY. Calmodulin-dependent protein phosphatase: isolation of subunits and reconstitution to holoenzyme // Methods.Enzymol., 1987, 139:79-87.

145. Messmer K., Reynolds GP. Increased peripheral benzodiazepine binding sites in the brain of patients with Huntington's disease // Neurosci.Lett., 1998, 241, 53-56.

146. Moricami A., Aliso K., Asashi T., Nakamura K. The 8'-subunit of higher plant six-subunit mitochondrial FpATPase is homologous to the 8-subunit of animal mitochondrial FrATPase // JBC., 1992, 267, 72-76.

147. Miyamoto K., Matsui H., Tomizawa K., Kuwata Y., Itano T., Tokuda M., Hatase O. In situ localization of rat testis-specific calcineurin Bsubunit isoform pi in the developing rat tastis // Biochem.Biophys.Res.Commun., 1994, 203, 1275-1283.

148. Mumby MC, Walter G. Protein serine/threonine phosphatases: structure, regulation and functions in cell growth // Physiol.Rev., 1993, 73, 673-699.

149. Natarajan K., Ness J., Wooge CH., Janovick JA., Conn PM. Specific identification and subcellular localization of three calmodulin-binding proteins in the rat gonadotrope: spectrin, caldesmon, and calcineurin // Biol Reprod., 1991, 44, 43-52.

150. Newton AC., Jonson JE. Protein kinase C: paradigm for regulation of protein function by two membrane-targeting modules // Biochim.Biophys.Acta., 1998, 1376, 155-72.

151. Neidle A., van den Berg CJ., and Grynbaum A. The heterogeneity of rat brain mitochondria isolated on continuos sucrose gradients // J.Neurochem., 1969, 16, 225-234.

152. Nishizuka Y. Protein kinase C and lipid signaling for sustained cellular responses // FASEB.J., 1995, 9, 484-96.

153. Ng M. and Matus A. Protein phosphorylation in isolated plasma membranes and postsynaptic junctional structures from brain Ghospho // Neuroscience, 1979, 4, 169-180.

154. Nichols B.J., Denton R.M. Towards the molecular basis for the regulation of mitochondrial dehydrogenases by calcium ions // Mol. Cell.Biochem., 1995, 149/150, 203-212.

155. Nishizuka Y. Intracellular signaling by hydrolysis of phospholipids and avtivation of protein kinase C // Science., 1992, 258, 609-14.

156. Nishizuka Y. The role of protein kinase C in cell surface signal transduction and tumour promotion // Nature., 1984, 308(5961), 693-698.

157. Nimmo HG. And Cohen P. Normal control of protein phosphorylation // Adv. Cyclic.Nucleotide.Res., 1977, 8, 146.

158. Novgorodov S.A., Gudz T.I., Brierly G.R., and Pfeiffer D.R. Magnesium ion modulates the sensitivity of the mitochondrial permeability pore to Dhospholipid A and ADP // Arch.Biochem.Biophys., 1994,311,219-228.

159. O'Berine GB., Woods MJ., Williams DC. Two sucellular locations for peripheral-type benzodiazepine acceptors in rat liver // Eur.J.Biochem., 1990, 188, 131-138.

160. Odessey R. Direct evidence for the inactivation of branched-chain oxo-acid dehydrogenase by enzyme phosphorylation // FEBS.Lett., 1980, 121(2), 306-308.

161. Olson JMM., Ciliax BJ., Mancini WR., Young AB. Presence of peripheral-type benzodiazepine binding sites on human erythrocyte membranes II Eur. J.Pharmacol., 1988, 152,47-53.

162. Pallen CJ., Wang JH. A multifunctional calmodulin-stimulated phosphatasq II Arch.Biochem.Biophys., 1985, 237, 281-291.

163. Palmer D.N., Bayliss S.L., Westlake V.J. Batten disease and the ATP synthase subunit c turnover pathway: raising antibodies to subunit c II Am. J.Med.Genet., 57 (2), 1995,260-265.

164. Park C. H., Carboni E., Wood P. L. and Gee K. W. Characterization of peripheral benzodiazepine type sites in a cultured murine BV-2 microglial cell line // Glia., 1996, 16,65-70.

165. Parola A. L., Yamamura H. I. and Laird H. E., 3rd. Peripheral-type benzodiazepine receptors // Life Sci., 1993,52, 1329-1342.

166. Papa S., Sardanelli A.M., Scacco S., and Technikova-Dobrova Z. cAMP-dependent protein kinase and phosphoproteins in mammalian mitochondria. An extension of the cAMP-mediated intracellular signal transduction II FEBS Lett., 1999, 444(2-3), 245-249.

167. Papadopoulos V., Brown AS., Hall PF. Isolation and characterization ofcalcineurin from adrenal cell cytoskeleton: identification of substrates ofi

168. Ca -calmodulin-dependent phosphatase activity // Mol.Cell.Endocrinol., 1989, 63, 23-38.

169. Papadopoulos V., Brown AS., Hall PF. Calcium-calmodulin-dependent phosphorylation of cytoskeletal proteins from adrenal cell // Mol.Cell.Endocrinol., 1990, 74, 109-123.

170. Papadopoulos V. Peripheral-type benzodiazepine/diazepam binding inhibitor receptor: Biologocal role in steroidogenic cell function // Endocr.Rev., 1993, 14, 222-240.

171. Parker PJ., Stabel S. and Waterfield MD. Purification to homogeneity of protein kinase C from bovine brain—identity with the phorbol ester receptor // EMBO.J, 3, 953-959, 1984.

172. Pawson T., Scott JD. Signaling through scaffold, anchoring, and adaptor proteins //Science, 1997, 278, 2075-2080.

173. Petronilli V., Cola C., Bernardi P. Modulation of the mitochondrial □hospholipid A- sensitive permeability transition pore // J.Biol.Chem., 1993,268, 1011-1016.

174. Perrino BA., Ng LY., Soderling TR. Calcium regulation of calcineurin phosphatase activity by its B subunit and calmodulin // J.Biol.Chem., 1995, 270, 340-346.

175. Pujol MJ., Bosser R., Vendrell M., Serratosa J., Bachs O. Nuclear calmodulin-binding proteins in rat neurons // J.Neurochem1993, 60, 1422-1428.

176. Rieter TA., Abraham RT., Choi M., Rusnak F. Redox regulation of calcineurin in T-lymphocytes // J.Biol.Inorg.Chem., 1999, 4, 632-644.

177. Riond J., Mattei MG., Kaghad M., Dumont X., Guillemot JC., Le Fur G., Caput D., Ferrara P. Molecular cloning and chromosomal localization of a human peripheral-type benzodiazepine receptor // Eur.J.Biochem., 1991, 195,305-311.

178. Rose S.P. and Heald P.J. A phosphoprotein phosphatase from ox brain UBiochemJ., 1961, 81, 343-358.

179. Rosen OM., Rangel-Aldao R. and Erlichman J. Soluble cyclic AMP-dependent protein kinases: review of the enzyme isolated from bovine cardiac muscle // Curr.Top.Cell.Regul, 1977, 12, 39.

180. Rubin CS. A kinase anchor proteins and the interacellular targeting of signals carried by cyclic AMP // Biochem.Biophys.Acta, 1994, 1224, 467479.

181. Rubin CS., Rangel-Aldao R., Sarkar D., Erlichman J., and Fleischer N. Characterization and compatison of membrane-associated and cytosolic cAMP-dependent protein kinases /IJ.Biol.Chem., 1979, 254, 3797-3805.

182. Ruff MR., Pert CB., Weber RJ., Wahl LM., Wahl SM., Paul SM. Benzodiazepine receptors-mediated Chemotaxis of human monocytes // Science (Wash DC)., 1985, 229, 1281-1283.

183. Rusnak F., Mertz P. Calcineurin: form and function // Physiol.Rev., 2000, 80 (4), 1483-1521.

184. Sardanelli A.M., Technikova-Dobrova Z., Scacco S.C., Speranza F., and Papa S. Characterization of proteins phosphorylated by the cAMP-dependent protein kinase of bovine heart mitochondria // FEBS Lett., 1995, 377(3), 470-474.

185. Sardanelli A.M., Technikova-Dobrova Z., Speranza F., Mazzocca A., Scacco S., and Papa S. Topology of the mitochondrial cAMP-dependent protein kinase and its substrates II FEBSLett., 1996, 396(2-3), 276-278.

186. Sarrouilhe D., and Baudry M. Evidence of true protein kinase CKII activity in mitochondria and its spermine-mediated translocation to inner membrane // Cell.Mol. Biol., 1996,42(2), 189-197.

187. Schatzman RC., Raynor RL., Fritz RB. And Kuo.JF. Purification to homogeneity, characterization and monoclonal antibodies of □hospholipids-sensitive Ca -dependent protein kinase from spleen HBJ, 1983,209,435-443.

188. Schwoch G., Trinczek B., and Bode C. Localization of catalytic and regulatory subunits of cyclic AMP-dependent protein kinases in mitochondria from various rat tissues // Biochem.J. 1990, 270(1), 181-188.

189. Scott JD., McCartney S. Localization of A-kinase through anchoring proteins // Mol.Endocrinol., 1994, 8, 5-11.

190. Shibasaki F., Price ER., Milan D., McKeon F. Role of kinases and the phosphatase calcineurin in the nuclear shutting of transcription factor NF-AT4 IINature, 1996, 382, 370-373.

191. Sikkink RCM, Haddy A, MacKelvie S, Mertz P, Litwiller R, and Rusnak F. Calcineurin subunit interactions: mapping the calcineurin B binding domain on calcineurin A // Biochemistry., 1995, 34: 8348-8356.

192. Sprengel R., Werner P., Seeburg PH., Mukhin AG., Santi MR., Grayson DR., Guidotti A., Krueger KE. Molecular cloning and expression of cDNA encoging a peripheral-type benzodiazepine receptor // J.Biol. Chem., 1989, 264, 20415-20421.

193. Stalmans W., De Wulf H., Hers H.G. The control of liver glycogen synthetase phosphatase by phosphorylase // Eur.J.Biochem., 1971, 18, 582-587.

194. Steenaart N. A. and Shore G. C. Mitochondrial cytochrome c oxidase subunit IV is phosphorylated by an endogenous kinase // FEBS Lett., 1997, 415,294-298.

195. Steiner AW., Smith RA. Endogenous protein phosphorylation in rat brain mitochondria: occurrence of a novel ATP-dependent form of the autophosphorylated enzyme succinyl-CoA synthetase // J.Neurochemistry, 1981, 37(3), 582-593.

196. Strack S., Wadzinski BE., Ebner FF., Localization of the calcium/calmodulin-dependent protein phosphatase, calcineurin, in the hindbrain and spinal cord of the rat // J.Comp.Neurol., 1996, 375, 66-76.

197. Stralfors P., Hiraga A., Cohen P. The protein phosphatases involved in cellular regulation. Purification and Dhospholipids't'on of the glycogen-bound form of protein phosphatase-1 from rabbit skeletal muscle // Eur.J.Biochem., 1985, 149, 295-303.

198. Struglics A., Fredlund K.M., Moller I.M., and Allen J.F. Two subunits of the FoFj-ATPase are phosphorylated in the inner mitochondrial membrane // Biochem. Biophys. Res. Commun., 1998, 243(3), 664-648.

199. Struglis A., Fredlund K.M., Konstantinov Y.M., Allen J.F., and Moller I.M. Protein phosphorylation/dephosphorylation in the inner membrane of potato tuber mitochondria// FEBS Lett., 2000, 475(3), 213-217.

200. Su Q., Zhao M., Weber E., Eugster H-P., Ryffel B. Distribution and activity of calcineurin in rat tissues. Evidence for post-transcriptional regulation of testis-specific calcineurin B // Eur.J.Biochem., 1995, 230, 469-474.

201. Sugden PH., Holladay LA., Reimann EM. And Corbin JD Purification and characterization of the catalytic subunit of adenosine 3':5'-cyclic monophosphate-dependent protein kinase from bovine liver // BJ, 1976, 159, 409.

202. Swanson SK., Born T., Zydowsky LD., Cho H., Chang HY., Walsh., Rusnak. Cyclosporin-mediated inhibition of bovine calcineurin by cyclophilin A and // PNAS. USA., 1992, 89 (9), 3741-3745.

203. Tallant E.A., Brumley L.M., Wallace R.W. Activation of a calmodulinIdependent phosphatase by a Ca -dependent protease // Biochemistry, 1988, 27, 2205-2211.

204. Takai Y., Kishimoto A., Kikkawa U., Mori T. and Nishizuka Y Unsaturated diacylglycerol as a possible messenger for the activation of calcium-activated, Dhospholipids-dependent protein kinase system // BBRS, 1979,91, 1218-1224.

205. Tanveer A., Virji S., Andreeva L., Totty NF., Hsuan JJ., Ward JM., Crompton M. Involvement of cyclophilin D in the activation of a mitochondrial pore by Ca and oxidant stress // Eur.J.Biochem., 1996, 15, 166-172.

206. Tash J.S., Krinks M., Patel J., Means R.L., Klee C.B., Means AR. Identification, characterization, and functional correlation of calmodulin-dependent protein phosphatase in sperm /IJ.Cell.Biol., 1988, 106, 16251633.

207. Tapley P.M. and Murray A.W. Platelet Ca2+-activated, Dhospholipids-dependent protein kinase: evidence for proteolytic activation of the enzyme in cells treated with phospholipase CI // BBRC, 1984, 118, 835841.

208. Technikova-Dobrova Z., Sardanelli A.M., and Papa S. Phosphorylation of mitochondrial proteins in bovine heart. Characterization of kinases and substrares // FEBSLett., 1993, 322(1), 51-55.

209. Technikova-Dobrova Z., Sardanelli A.M., Stanca M.R., and Papa S. *> cAMP-dependent protein phosphorylation in mitochondria of bovine heart

210. FEBS Lett., 1994,350(2-3), 187-191.

211. Tuazon P.T., Traugh J.A. Casien kinase I and II multipotential serin protein kinases: structure, function, and regulation // Adv.Second.Messenger.Phosphoproteirt.Res., 1991,23, 123-64.

212. Tumlin JA. Expression and function of calcineurin in mammalian nephron: physiological roles, receptor signaling, and ion transport // Am. J. Kidney.Dis., 1997, 30, 884-895.

213. Tumlin JA., Someren JT., Swanson CE., Lea JP. Expression of calcineurin activity and a-subunit isoforms in specific segments of the rat nephron II Am.Physiol.Renal.Fluid.Electrolyte.PhysioL, 1995, 269, F5581. F563.

214. Tung HYL. Phosphorylation of the calmodulin-dependent protein phosphatase by protein kinase C // Biochem.Biophys.Res.Commun., 1986,138,783-788.

215. Uchida T and Filburn CR. Affinity chromatography of protein kinase C-phorbol ester receptor on polyacrylamide-immobilized phosphatidylserine // JBC, 1984, 259, 12311-12314.

216. Ueda T. and Greengard P. Adenosine 3': 5'-monophosphate-regolated phosphoprotein system of neuronal membranes // J.Biol.Chem., 1977, 252, 5155-5163.

217. Vardanis A. Protein kinase activity at the inner membrane of mammalian mitochondria // J.Biol.Chem., 1977, 252, 807-813.

218. Velick SF. And Wicks LF., , The amino acid composition of phosphorylase IIJBC., 1951, 190, 741-751.

219. Verma A., Nye J. S. and Snyder S. H. Porphyrins are endogenous ligands for the mitochondrial (peripheral-type) benzodiazepine receptor // Proc.Natl.Acad.Sci.USA , 1987, 84,2256-2260.

220. Wallace RW, Lynch TJ, Tallant EA, and Cheung WY. Purification and characterization of an ingibitor protein of brain adenylate cyclase and cyclic nucleotide phosphodiesterase // J.Biol.Chem., 1978, 254: 377-382.

221. Wallace RW, Tallant EA., McManusMC. Human platelet calmodulin-binding proteins: identification and Ca -dependent proteolysis upon platelet activation. // Biochemistry., 1987, 26, 2766-2773.

222. Walsh D.A., Perkins J.P. and Krebs E.G., An Adenosine 3',5'-Monophosphate-dependant Protein Kinase from Rabbit Skeletal Muscle 1 II JBC., 1968, 243, 3763-3765.

223. Wang JKT., Morgan JI., Spector S. Benzodiazepines that bind at peripheral sites inhibit cell proliferation // PNAS, 1984, 81, 753-756.

224. Wang JH and Desai R. A brain protein and its effect on the Ca and protein modulator-activated cyclic nucleotide phosphodiesterase // Biochem.Biophys.Res.Commun., 1976, 72: 926-932.

225. Wang X., Culotta VC., Klee CB. Superoxide dismutase protects calcineurin from inactivation // Nature., 1996, 383, 434-437.

226. Wang HG., Pathan N., Ethell IM., Krajewski S., Yamaguchi Y., Shibasaki F., McKeon F., Bodo T., Franke TF., Reed JC. Ca2+-inducedapoptosis through calcineurin dephosphorylation of BAD // Science, 1999, 284 (5412), 339-343.

227. Watanabe Y, Perrino B.A, Chang B.H, and Soderling T.R. Identification in the calcineurin A subunit of the domain that binds the regulatory B subunit // J.Biol.Chem 1995, 270: 456-460.

228. Watterson D.M and Vanaman T.C. Affinity chromatography purification of a cyclic nucleotide phosphodiesterase using immobilized modulator protein, a troponin C-like protein from brain IIBiochem.Biophys.Res.Commun, 1976, 73: 40-46.

229. Weller M. and Rodnight R. Protein kinese activity in membrane preparations from ox brain. Stimulation of intrinsic activity by adenosine 3': 5'-cyclic monophosphate //Biochem.J., 1973, 132, 483-492. <

230. Wera S., Bollen M., Stalmans W. Purification and characterization of the glycogen-bound protein phosphatase from rat liver // JBC., 1991, 266, 339-345.

231. Wera S, Hemmings B.A. Serine/threonine protein phosphatases // Biochem.J., 1995, 311, 17-29.

232. Whalin M. E., Boujrad N., Papadopoulos V. and Krueger K. E. Studies on the phosphorylation of the 18 kDa mitochondrial benzodiazepine receptor protein H J.Recept.Res. 1994, 14,217-228.

233. Wise B.C., Raynor R.L and Kuo J.F., Phospholipid-sensitive Ca -dependent protein kinase from heart. II. Substrate specificity and inhibition by various agents II JBC 1982, 257, 8481-8488.

234. Wolvetang E.J., Larm J.A., Moutsoulas P., Lawen A. Apoptosis induced by inhibitors of the plasma membrane NADH-oxidase involves Bcl-2 and calcineurin// Cell.Growth.Differ., 1996, 7, 1315-1325.

235. Wright R.M., Simpson S.L. and Lanoil B.D. Identification of a low specificity, oxygen, heme, and growth phase regulated DNA bindingactivity in Saccharomyces cerevisiae // Biochem. Byophys. Res. Commun., 1995,214, 1051-1059.

236. Yamamura H., Inoure Y., Shimomura R. and Nishizuka Y Similarity and pleiotropic actions of adenosine 3',5'-monophosphate-dependent protein kinases from mammalian tissues // BBRC, 1972, 46, 589.

237. Yeman SJ., Cook KG., Bradford SM., Jones SM. Analysis of phosphorylation sites on branch-chain 2-keto acid dehydrogenase complex II Methods Enzymol, 1988, 166, 10-14.

238. Yu L., Golbeck J., Yao J., Rusnak F. Spectroscopic and enzymatic characterization of the activity site dinuclear metal center of calcineurin: implications for a mechanistic role // Biochemistry., 1997, 36, 1072710734.

239. Yu L., Haddy A., Rusnak F. Evidance that calcineurin accommodates an active site binuclear metal center // J.Am.Chem.Soc., 1995, 117, 1014710148.

240. Zoratti M. and Szabo I. The mitochondrial permeability transition // Biochim. Biophys.Acta., 1995, 1241, 139-176.

241. Zorov D.B. Mitochondrial transport of nucleic acids. Participation of the benzodiazepine receptor // Biokhimiia., 1996, 61(7)., 1320-1332.

242. Zisterer D. M. and Williams D. C. Calmidazolium and other imidazole compounds affect steroidogenesis in Yl' cells: lack of involvement of the peripheral-type benzodiazepine receptor // J.Steroid.Biochem.Mol.BioI. 1997, 60, 189-195.

243. Zhao S., Lee EY. A protein phosphatase-1-binding motif identified by the panning of a radom peptide display library // J.Biol. Chem., 1997, 272, 28368-28372.

244. Zhao Y., Tozawa Y., Iseki R., Mukai M., Iwata M. calcineurin activation protects T cells from glucocorticoid-induced apoptosis // J.Immunol., 1995, 154, 6346-6354.1. БЛАГОДАРНОСТЬ

245. С чувством глубокой признательности выражаю благодарность руководителю моей работы Азарашвили Тамаре Сергеевне и научному консультанту Евтодиенко Юрию Владимировичу за чуткое отношение, руководство и помощь в работе.

Информация о работе

Крестинина, Ольга Владимировна
кандидата биологических наук
Пущино, 2005
ВАК 03.00.02

Диссертация

Фосфорилирование белков митохондрий мозга крысы - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы