Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Свойства митохондриальной NADH: убихинон оксидоредуктазы (комплекса I) в составе мембранных препаратов мозга

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Свойства митохондриальной NADH: убихинон оксидоредуктазы (комплекса I) в составе мембранных препаратов мозга"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В. ЛОМОНОСОВА

Биологический факультет

на правах рукописи

КАЛАШНИКОВ Денис Сергеевич

СВОЙСТВА МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ ^БН:УБИХИНОН ОКСИДОРЕДУКТАЗЫ (КОМПЛЕКСА I) В СОСТАВЕ МЕМБРАННЫХ ПРЕПАРАТОВ МОЗГА

03.01.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 2 МАЙ 2011

Москва-2011

4845565

Работа выполнена на кафедре биохимии биологического факультета Московского государственного университета имени М. В. Ломоносова.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Виноградов Андрей Дмитриевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Звягильская Рената Александровна

кандидат биологических наук, Берцова Юлия Васильевна

Ведущая организация:

Научный центр неврологии РАМН

Защита состоится 23 мая 2011 года в 15 часов 30 минут на заседании диссертационного совета Д 501.001.71 при Московском государственном университете имени М. В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, ГСП-1, Ленинские горы, Московский государственный университет имени М. В. Ломоносова, биологический факультет, большая биологическая аудитория (ББА).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета Московского государственного университета имени М. В. Ломоносова.

Автореферат разослан «_»_2011 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Медведева М.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Конечный этап запасания энергии при окислительном распаде питательных веществ в клетках млекопитающих происходит в митохондриях, где уровень КЛО*, необходимый для поддержания окислительного метаболизма, обеспечивается КАОН: убихинон оксидоредуктазой (дыхательным комплексом I). Митохондриальный комплекс I или его гомологи прокариот (МОН-1) катализируют окисление митохондриального или цитоплазматического МАОН убихиноном, сопровождающееся векторным переносом протонов через сопрягающую мембрану. Комплекс I митохондрий сердца крупного рогатого скота построен из 45 различных субъединиц и содержит, по меньшей мере, 9 индивидуальных редокс-кофакторов. Бактериальные опероны, кодирующие содержат

только 13-14 генов, и продукты их транскрипции гомологичны 14 «главным» субъединицам митохондриального комплекса I. Поскольку каталитические свойства митохондриального фермента и его прокариотических гомологов почти одинаковы, можно считать, что только 14 из 45 субъединиц фермента млекопитающих необходимы для катализа. Функции остальных, более чем 30 дополнительных субъединиц остаются неизвестными. Подавляющее большинство сведений о каталитических и регуляторных свойствах комплекса I млекопитающих получено при изучении очищенного фермента или различных препаратов митохондрий сердца крупного рогатого скота. В последние годы в литературе широко обсуждаются корреляции между возникновением и развитием некоторых нейродегенеративных заболеваний (болезни Паркинсона, Альцгеймера, ретинопатии) и дефектами функционирования комплекса I. В обсуждениях используются данные о свойствах фермента или ферментных

Список сокращений: Дцм+ - трансмембранный электрохимический градиент протонов, Ду - разность электрических потенциалов по обе стороны внутренней митохондриальной мембраны, FCCP - л-трифторметоксикарбонилцианидфенилгидразон, FMN -флавинмононуклеотид, HAR - гексааминорутений (III) хлорид, Qi - водорастворимый гомолог природного убихинона, содержащий 1 изопреноидный остаток в положении 5 1,4-бензохинонового кольца, БСА - бычий сывороточный альбумин, ДТТ — 1,4-дитиотреитол, ДТНБ - 5,5-дитио-бис-(2-нитробензойная кислота), СМЧ - субмитохондриальные частицы, М-СМЧ — субмитохондриальные частицы мозга, Мт-СМЧ — субмитохондриальные частицы мозга, полученные из «тяжелых» митохондрий, Мо-СМЧ — субмитохондриальные частицы мозга, полученные из суммарной фракции митохондрий, С-СМЧ - субмитохондриальные частицы сердца, СОД - супероксид-дисмутаза.

препаратов (митохондрии, субмитохондриальные фрагменты) сердечной мышцы. Неизвестно, существует ли тканевая или видовая специфичность комплекса I млекопитающих, отражающаяся в его каталитических или регуляторных свойствах. В нашей лаборатории показано существование двух медленно взаимопревращающихся форм комплекса I: активной (А) и деактивированной ф). Активация комплекса I требует затравочного медленного каталитического цикла. Активная форма деактивируется (А—переход) в условиях, когда каталитические обороты фермента невозможны (нет субстрата -ЫАБН или нет акцептора - окисленного убихинона) и этот переход имеет такой высокий активационный барьер, что его наблюдение в минутной шкале возможно только при температуре >30°С. Такое поведение фермента, по-видимому, обеспечивает регулирование суммарной скорости окислительного фосфорилирования в митохондриях. Показано, что переход от нормоксии к аноксии интактного изолированного сердца сопровождается синхронным переходом комплекса I из его активного состояния в деактивированное. Таким образом, явление, обнаруженное и проанализированное на простых объектах, удалось проследить в ряду: изолированный фермент - фермент в составе мембраны - фермент в интактных митохондриях - фермент в функционирующем органе. Если переход комплекса I из активного состояния в деактивированное имеет отношение к регулированию его каталитической активности, то разумно предположить, что в матриксе митохондрий присутствуют вещества-регуляторы, влияющие на скорости перехода и положение равновесия между активной и деактивированной формами фермента. Свободные жирные кислоты претендуют на роль одного из таких регуляторов. В нашей лаборатории, недавно было показано, что пальмитиновая кислота снижает скорость активации деактивированной формы фермента сердца, в концентрациях, существенно более низких, чем те, которые необходимы для ингибирования его активности.

Цель работы. Получить препараты митохондрий мозга, пригодные для изучения каталитических и регуляторных свойств митохондриальной ЫАОН:убихинон оксидоредуктазы (комплекса I) мозга и сравнить их со свойствами аналогичных препаратов сердца.

Для достижения этой цели требовалось решить следующие задачи: 1. Наладить метод, пригодный для получения митохондрий мозга в препаративных количествах; 2. Получить и охарактеризовать препарат «вывернутых» сопряженных субмитохондриальных частиц мозга (М-СМЧ); 3. Охарактеризовать основные свойства комплекса I мозга по сравнению с известными для фермента сердца; 4. Оценить влияние свободных жирных кислот и двухвалентных катионов на каталитические характеристики комплекса I мозга.

Научная новизна и практическое значение работы. Разработана процедура получения сопряженных инвертированных («inside-out») субмитохондриальных частиц мозга и охарактеризованы свойства комплекса I в составе такого препарата. Показано, что свойства комплекса I митохондрий мозга, в частности, параметры активации-деактивации, практически не отличаются от таковых препарата сердечной мышцы. Показано, что совместное действие Са2+ и свободных жирных кислот приводит к развивающемуся во времени ингибированию каталитической активности комплекса I в составе М-СМЧ, в условиях (высокие значения рН), которые могут, по-видимому, реализоваться в функционирующих митохондриях. Полученный препарат инвертированных субмитохондриальных частиц мозга может служить в качестве экспериментальной модели, пригодной для изучения дефектов комплекса I, связанных с различными патологическими состояниями (ишемическое повреждение, нейродегенеративные заболевания).

Апробация работы. Результаты работы были доложены на заседании кафедры биохимии биологического факультета МГУ, 16-ой Европейской Конференции по Биоэнергетике (The 16th European Bioenergetics Conference, Warsaw, 2010), XVII Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2010), 14-ой Международной Пущинской школе-конференции «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2010).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ, включая 2 статьи и 3 тезисов научных докладов.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 127 страницах, содежит 23 рисунка и 7 таблиц, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их

обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы.

5

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Митохондрии мозга получали способом, описанным Ли и сотр. [Lee et al., 1993], с модификациями, обусловленными использованием большого количества ткани. Принцип метода состоит в том, что измельченную ткань обрабатывают протеазой (субтилизином А), затем гомогенизируют. Обработка протеазой позволяет существенно увеличить выход митохондрий. Гомогенат фильтруют и центрифугируют. Полученный осадок отбрасывают, а из супенатанта центрифугированием осаждают митохонрии. Промывка полученного препарата средой, содержащей 0,25 М сахарозу и 10 мМ Трис-HCl (рН 7,8) позволяет разделить полученные митохондрии на две равные фракции. Нижний слой полученного в результате промывки осадка - «тяжелые» митохондрии - плотный и более темный, а верхний слой - «легкие» митохондрии - более светлый и рыхлый. «Легкие» и «тяжелые» митохондрии суспенировали отдельно, замораживали и хранили при температуре -20°С. В некоторых опытах СМЧ (см. ниже) получали из общей фракции митохондрий (без деления на «легкие» и «тяжелые»).

М-СМЧ получали способом, принятым в нашей лаборатории для препаратов из сердца быка [Kotlyar and Vinogradov, 1990]. Принцип метода заключается в обработке суспензии митохондрий ультразвуком, что приводит к образованию замкнутых инвертированных (inside-out) мембранных фрагментов. Полученный препарат хранили в жидком азоте.

Активацию и сопряжение М-СМЧ проводили способом, принятым в нашей лаборатории [Burbaev et al., 1989]. К суспензии добавляли малонат, конечная концентрация 1 мМ (для активации сукцинатдегидрогеназы вытеснением прочно связного оксалоацетата [Kotlyar and Vinogradov, 1984]) и олигомицин 0,5 мкг/мг белка (искусственное сопряжение блокированием протонных каналов Fo Fi-АТРазы [Lee and Ernster, 1966]). Суспензию инкубировали 30 мин при 30°С при хорошем перемешивании и разводили стандартной средой до конечной концентрации 0,5 мг/мл. К суспензии добавляли NADPH (1 мМ), инкубировали 1 ч при 25°С при постоянном перемешивании (для активации комплекса I [Burbaev et al., 1989]) и центрифугировали при 26 тыс. g (1 ч, 4°С). Осадки суспендировали в небольшом объеме 0,25 М сахарозы, содержащем 0,1 мМ малонат, разливали в ампулы и хранили в жидком азоте.

Деактивированные М-СМЧ получали прогреванием суспензии активных М-СМЧ 15-20 мин при 30°С.

Получение «препарата белков митохондриального матрикса». Суспензию митохондрий мозга крысы, полученных описанным выше способом, оттаивали, разводили холодной водой до концентрации 15 мг/мл и добавляли К+-ЭДТА до конечной концентрации 1 мМ. Суспензию насыщали аргоном, доводили рН 0,05 М раствором МШОН до 8,6 и озвучивали 5 раз по 30 сек с перерывами в 1 мин. Суспензию центрифугировали при 26 тыс. g 15 мин. Осадок отбрасывали, а супернатант центрифугировали при 200 тыс. g (1 час, б°С). К полученному супернатанту приливали '/ю часть от его объема 100 мМ Трис-НС1 (рН 7,5) доводили рН до 6,0 уксусной кислотой и центрифугировали 1 ч 200 тыс. £ (0°С). Измеряли объем полученного супернатанта и вносили концентрированный (1 М) раствор сахарозы до конечной концентрации 0,25 М и доводили рН полученного раствора до 7,4 добавлением 1М КОН.

Для получения препарата митохондрий, проницаемых для низкомолекулярных соединений [ОозНтзкауа е1 а1., 2003], суспензию митохондрий мозга крысы, полученных по описанной выше методике (30 мг/ мл), разбавляли (в 20 раз) средой, содержавшей 150 мМ сахарозу, 10 мМ НЕРЕБ, 0,5 мМ ЭГТА (рН 7,4) и БСА (1 мг/мл), добавляли аламетицин и Р^СЬ до конечной концентрации 40 мкг/мл и 2,5 мМ, соответственно. Смесь инкубировали 5 мин при комнатной температуре, разбавляли в 2,5 раза охлаждённой средой выделения, не содержащей аламетицина, М§СЬ и БСА и центрифугировали 15 мин при 30 тыс. g. Осадок суспендировали в минимальном объеме среды выделения, не содержащей БСА. Суспензию митохондрий хранили на льду. В ряде опытов аламетицин (20 мкг/мл) и М£СЬ (1 мМ) вносили непосредственно перед измерением активности.

Поглощение кислорода измеряли амперометрически (закрытый электрод Кларка) при комнатной температуре. Среда измерения активностей содержала 0,25 М сахарозу, 10 мМ КС1, 0,2 мМ ЭДТА, 5 мМ К+-фосфат (рН 7,4) и субстраты окисления: КАБН (1 мМ), при измерении КАБН-оксидазной, или сукцинат (10 мМ), при измерении сукцинат-оксидазной активностей. При измерении сукцинат-оксидазы СМЧ предварительно преинкубировали в присутствии 5 мМ сукцината (~5-10 мин), а среда измерения активностей дополнительно содержала ротенон (5 мкМ).

Содержание гема а определяли в солюбилизированных препаратах (5%-ный дезоксихолат калия (рН 8,5), 30 мин при 25°С). Равные объемы образцов (0,25 мл), содержащих 10-15 мг белка, добавляли в две кюветы с 0,1 М К+-фосфатным буфером (рН 7,0). После добавления в одну из кювет дитионита (гидросульфита Na) и перемешивания регистрировали дифференциальный спектр «восстановленный образец минус окисленный» в диапазоне 510-630 нм (спектрофотометр Cintra 20, GBC с интегрирующей сферой). Содержание гема а рассчитывали, как описано у Ли и сотр. [Lee et al., 1993] (коэффициент молярного поглощения Е605-6З0 = 24 • 103 М""1 см"1).

Количество комплекса I в препарате определяли титрованием NADH-оксидазной активности пиерицидином, ротеноном или NADH-OH после инкубации субмитохондриальных частиц (1 мг/мл) с ингибиторами в течение 15 мин при 25°С.

NADH оксидазную и NADH:aKnenTop редуктазные активности СМЧ измеряли фотометрически по убыли NADH (коэффициент молярного поглощения Ез4о = 6,22-103 М-1 см"1 или ез8о = 1,25-103 М-1 см"1) в стандартной среде при 25°С, содержащей NADH (100 мкМ), грамицидин D (0,2 мкг/мл) и БСА (2 мг/мл), реакцию начинали внесением СМЧ (20 мкг/мл). NADH:Qi-редуктазную активность измеряли в стандартной среде, содержавшей дополнительно Qi (80 мкМ) и миксотиазол (5 мкМ). При измерении NADHrHAR (III) редуктазной активности [Sled and Vinogradov, 1993] стандартная среда дополнительно содержала HAR, NADH и антимицин А (1 мкг/мл). Максимальную скорость NADH:HAR редуктазной реакции определяли по линейным анаморфозам михаэлисовских зависимостей, полученных при постоянной концентрации HAR (5 мМ) и различных концентрациях NADH или при постоянной концентрации NADH (1,2 мМ) и различных концентрациях HAR.

Аэробное сукцинат-зависимое восстановление NAD+ ("обратный перенос электронов), осуществляемое за счет работы сукцинат-оксидазы, регистрировали фотометрически по увеличению поглощения при 340 нм (спектрофотометр «Hitachi 557»), используя коэффициент молярного поглощения ез4о = 6,22-103 М"' см"1. Стандартная среда содержала дополнительно NAD+ (5 мМ) и сукцинат (5 мМ). При измерении аэробного обратного переноса электронов на феррицианид стандартная среда

дополнительно содержала феррицианид (1 мМ) и сукцинат (5 мМ). Реакцию регистрировали по уменьшению оптической плотности при 420 нм (£420 = 1,0 1 03 М-1 см"1), затем добавляли ротенон (5 мкМ). Скорость реакции рассчитывали как разницу между исходной активностью и активностью в присутствии ротенона.

Генерацию супероксида измеряли спектрофотометрически в стандартной среде при 550 нм по чувствительному к СОД (3 ед/мл в среде измерения) восстановлению 15 мкМ ацетилированного цитохрома с (£550 = 20-Ю3 М-1 см~') [Azzi et al., 1975] при30°С.

Белок определяли с биуретовым реактивом, используя БСА в качестве стандарта для построения калибровочной кривой.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

I. Субмитохондриальные фрагменты мозга

На предварительном этапе работы мы опробовали несколько опубликованных методов получения митохондрий мозга крысы. Главными критериями при выборе способа получения митохондрий были относительная простота и быстрота процедуры, позволяющей получить хорошо сопряженные препараты. Этим критериям лучше всего соответствовала процедура, описанная Lee и сотр. [Lee et al, 1993] (табл. 1). В дальнейшем мы пользовались указанным способом получения препаратов из мозга свиньи, не измеряя характеристик полученных митохондрий.

Таблица 1. Основные свойства митохондрий мозга крысы*

Удельная активность Реакция ,, , . , „, _(2-электрон-эквивалента в мин на мг белка) х|0'

малат/глутамат-оксидаза

дыхание в состоянии 4 0,005

дыхание в состоянии 3 0,04

ADP/O 2,6 су кци нат-о кс идаза

дыхание в состоянии 4 0,015 дыхание в состоянии 3 0,1 + FCCP** 0,2

_АРР/О_'_ 1,9

* Приведены результаты типичных экспериментов. Различия в значениях, полученных в

серии аналогичных опытов не привышал ± 20%.

** Оптимальную для стимуляции дыхания концентрацию РССР (0,32 мкМ) подбирали предварительно.

В табл. 2 приведены каталитические активности М-СМЧ. Для сравнения приведены также величины активностей, измеренные в нашей лаборатории в тех же условиях для СМЧ сердца быка и препарата Кейлина-Хартри - классического объекта изучения дыхательной цепи [Vinogradov and King, 1979]. Максимальные удельные NADH-оксидазные активности препаратов из мозга и сердца оказались примерно одинаковыми (0,82 против 1,0 мкмоль/мин на мг белка, для Мт-СМЧ и С-СМЧ, соответственно) для препаратов, полученных из «тяжелых» митохондрий мозга и сердца. NADH-оксидазные (функционирование полной дыхательной цепи) и ротенон-чувствительные NADH:xhhoh (Qi) редуктазные (функционирование собственно комплекса I) активности, также оказались примерно одинаковыми. Это означает, что лимитирующая стадия суммарной

Таблица 2. Каталитические активности субмитохондриальных фрагментов (30°С, рН 8,0)*

Реакции

Удельная активность (2-электрон-эквивалента в мин на мг белка) *106

препарат Кейлина-Хартри***

Мо-СМЧ Мт-СМЧ С(т)-СМЧ*

0,62

0,45

NADH оксидаза

— олигомицин, + грамицидин D + олигомицин + аламетицин****

Сукцинат оксидаза

- олигомицин, + грамицидин D + олигомицин

NADH:aKuenrop редуктазы NADH — Qi NADH ГАР Обратный перенос электронов

сукцинат —»NAD+ ^

сукцинат —» феррицианид детектируем Генерация О21

NADH -»О2 0,43 х10 ~3 0,46 х 1 о "3 + ротенон не 0,65 * 10 "3 0,68 ><10 сукцинат—>Ог определяли 0,53 *10"! 0,48 "10"' + ротенон__0,25 х10'3 0,16 хЮ"3

0,63

0,09 0,66

0,15 0,05

не

0,82

0,16 0,94

0,17 0,05

0,65 8,0

0,03 0,03

1,0

0,94

1,0 10,0

0,25

не

детектируем

не

определяли

* Приведены результаты типичных экспериментов. Различия в значениях, полученных в

серии аналогичных опытов не привышали ± 20%.

** Активности, измеренные при 25°C[Kotlyar and Vinogradov, 1990; Grivcnnikova and Vinogradov, 2006].

*** Измерено в 50 мМ К+-фосфатном буфере (рН 7,8) при 25°С [Vinogradov and King, 1979].

**** Конечная концентрация аламетицина и MgCh, соответственно 20 мкг/мл и 1 мМ.

10

полностью разобщенной NADH оксидазной реакции - восстановление свободного убихинона терминальным железо-серным кластером N2 и дыхание субмитохондриальных фрагментов в присутствии NADH количественно можно оценивать как каталитическую активность собственно комплекса I. Комплекс I катализировал окисление NADH искусственным акцептором -гексааминорутением (III) со скоростью, более чем в десять раз превышающей NADH-оксидазную реакцию. NADH.-гексааминорутений (Ш)-редуктазная реакция не чувствительна к ротенону и пиерицидину - специфическим ингибиторам восстановления убихинона комплексом I. Аламетицин только незначительно стимулировал NADH оксидазную активность М-СМЧ (табл. 2), что позволяет считать что -90% потенциально активного комплекса I доступно для NADH. Сукцинат оксидазная активность М-СМЧ оказалась существенно меньше, чем С-СМЧ или препарата Кейлина-Хартри. Нам не удалось измерить энергозависимое восстановление NAD+ (или феррицианида) сукцинатом (обратный перенос электронов) в М-СМЧ, полученных из суммарной фракции митохондрий мозга; препараты, полученные из «тяжелых» митохондрий мозга, катализировали эту реакцию с удельными активностями существенно (в 10 раз) меньшими, чем С-СМЧ (табл. 2).

В табл. 3 приведены результаты измерения содержания цитохромоксидазы и комплекса I в митохондриях и СМЧ, полученных из мозга и сердца. Содержание цитохромоксидазы в М-СМЧ существенно ниже, чем в С-СМЧ. Это может быть обусловлено как истинным различием в содержании фермента в препаратах из сердца и мозга, так и существенно большими примесями других мембран немитохондриального происхождения в М-СМЧ. Содержание комплекса I в Мт-СМЧ оценивали по остаточной активности, измеренной после титрования NADH-OH [Kotlyar et al., 2005] и двумя другими специфическими ингибиторами комплекса I: ротеноном и пиерицидином [Grivennikova et al., 2003]. Оно оказалось примерно вдвое меньшим, чем в препаратах из сердца. Существенное различие между препаратами из сердца и мозга обнаруживается при сравнении относительного содержания цитохромоксидазы и комплекса I (табл. 3). Данные о содержании комплекса I и его каталитических активностях позволяют оценить (сравнительно) числа оборотов фермента в полностью разобщенной NADH оксидазной реакции. Такая оценка дает величины 250 с 4 и 140 с (30°С, рН 8,0) для комплекса I в мембранах СМЧ мозга и сердца, соответственно. Это различие

указывает либо на существование тканеспецифичных изоформ комплекса I, либо, что более вероятно, на различия в фосфолипидном составе внутренней мембраны митохондрий мозга и сердца; известно, что каталитическая активность комплекса I зависит от фосфолипидов [Heron et al., 1977].

Таблица 3. Содержание компонентов дыхательной цепи в митохондриях и субмитохондриальных фрагментах различных животных

Объект, орган, препарат гем а, нмоль/мг белка (AA605-Í30, £ = 24-Ю3 М~' см" комплекс I* (титр ингибитора, нмоль/мг белка) гем а / комплекс I

Свинья

мозг

митохондрии

«суммарная фракция» 0,15

«легкие» 0,10

«тяжелые» 0,19

М-СМЧ

Мо-СМЧ 0,17

Мт-СМЧ 0,22 0,06 ~3,7

Крупный рогатый скот

сердце

митохондрии

«тяжелые» 0,64

С (Т)-СМЧ 0,65 0,12 -5,4

* Приведены результаты типичных экспериментов. Величины титров для ротенона,

пиерицидина [Grivcnnikova et al., 2003] и NADH-OH [Kotlyar et al., 2005; Grivcnnikova et al., 2007] совпадают с точностью ± 20%.

II. Медленные обратимые изменения каталитической активности

комплекса I в субмитохондриальных фрагментах мозга

Как было отмечено в разделе «Общая характеристика работы», необычное

свойство комплекса I сердца [Kotlyar and Vinogradov, 1990] - его существование

в виде двух медленно взаимопревращающихся форм: каталитически

активной (А) и каталитически неактивной - деактивированной (D). Медленный,

спонтанный переход из активного в деактивированное состояние происходит в

отсутствие одного из субстратов (NADH или окисленного убихинона). В

условиях, обеспечивающих каталитический оборот фермента, происходит его

активация. Скорость A/D-перехода сильно зависит от температуры, хорошо

заметная деактивация комплекса I сердца быка четко выражена только при

температуре свыше 30°С [Kotlyar and Vinogradov, 1990]. Переход комплекса I из

12

деактивированной в активную форму замедляется при высоких рН или в присутствии двухвалентных катионов, в частности Са2+ [Kotlyar et al., 1992]. D-форма фермента может быть необратимо модифицирована целым рядом SH-реагентов [Kotlyar et al., 1992; Gavrikova and Vinogradov, 1999; Gostimskaya et al., 2006], которые предотвращают оборот-зависимую активацию фермента, в то время как А-форма не чувствительна к их действию. Можно воспользоваться чувствительностью D-формы к SH-модификаторам (в частности, ДТНБ) для количественной оценки соотношения А- и D- форм фермента в любом препарате, содержащем комплекс I [Gostimskaya et al., 2006]: в условиях, когда SH-реагент быстро реагирует с D-формой, кинетика необратимого ингибирования двухфазна - доля быстрой фазы пропорциональна доле D-формы, а медленная фаза отражает кинетику деактивации фермента.

На рис. 1 показана зависимость остаточной активности NADH оксидазы М-СМЧ от времени инкубации препарата в присутствии ДТНБ при разных температурах. Полученные данные показывают, что: 1) примерно половина комплекса I в препарате находится в виде D-формы; 2) процесс деактивации сильно зависит от температуры (практически отсутствует при 25°С) и 3) как активная, так и деактивированная формы фермента в указанных условиях стабильны - ингибирование, вызванное реакцией с ДТНБ полностью обращается избытком дитиотреитола.

Рис. 1. Кинетика ингибирования NADH оксидазной активности Мо-СМЧ SH-реагентом (ДТНБ).

Мо-СМЧ вносили в среду, содержавшую 1 мМ ДТНБ, до конечного содержания 1 мг/мл и инкубировали при разных температурах (кривая 1 -25°С, кривая - 30°С, кривая 3 - 37°С) в течение указанного на абциссе времени. За 100% принимали активности, измеренные при указанных температурах (0,5; 0,6 и 0,74 мкмоль/мин на мг белка при 25°С, 30°С и 37°С, соответственно). Стрелкой показано внесение в среду инкубации 5 мМ ДТТ.

Процесс деактивации (медленная фаза ингибирования ДТНБ) примерно соответствует кинетике первого порядка (рис. 2), энергия активации составляет 230 кДж/моль (практически совпадает со значением ранее определенным для препаратов комплекса I сердца [Kotlyar and Vinogradov, 1990]).

Мо-СМЧ активировали инкубацией в присутствии ЫАОРН и прослеживали кинетику ингибирования при разных температурах так, как указано в подписи к рис. 1 (см. выше). Прямые 1, 2 и 3 - температура инкубации 25°С, 30°С и 37°С, соответственно. Значения констант скоростей реакций первого порядка: 0,02 мин-1; 0,1 мин"' и 0,4 мин"1 при 25°С, 30°С и 37°С, соответственно.

Рис. 2. Линейные анаморфозы кинетики ингибирования NADH оксидазной активности Мо-СМЧ БН-реагентом (ДТНБ).

о

5 10 15 20 время, мин

Так же, как было установлено для комплекса I митохондрий сердца, скорость активации фермента (длительность наблюдаемой лаг-фазы) в процессе реакции сильно зависит от рН (рис. 3), тогда как ЫАОН^1-редуктазная и ИАОН оксидазная активности А-формы оказываются постоянными в интервале рН 7-9.

Рис. 3. Кинетика NADH:Ql-peдyктaзнoй реакции активных и деактивированных Мо-СМЧ при разных рН (А) и линейные анаморфозы кинетики ^ОН:(31-редуктазной реакции деактивированных Мо-СМЧ (В).

Мо-СМЧ активировали инкубацией в присутствии ЫАОРН и прослеживали кинетику КАОН:(}1-редуктазной реакции при рН 7,0 (кривая 1). Мо-СМЧ деактивировали прогреванием 15 мин при 30°С, прослеживали кинетику КАОН^-редукгазной активности деактивированных Мо-СМЧ при двух различных рН: рН 7,0 (кривая 2) и рН 9,0 (кривая 3). Значения констант скоростей реакций первого порядка - 0,7 мин-1 (прямая 2) и 0,2 мин"1 (прямая 3).

Наши результаты показали, что существенных различий между свойствами полной дыхательной цепи и комплекса I в митохондриях нервной ткани и мышцы сердца нет. Различия, если они существуют, следует искать в

А

Б

смч

время, мин

механизмах, контролирующих активность комплекса I. Полученный препарат М-СМЧ вполне пригоден для таких поисков.

III. Ингибирование комплекса I в субмитохондриальных фрагментах мозга жирными кислотами: влияние Са2+

В настоящее время известно более двух десятков ингибиторов комплекса I, специфически блокирующих перенос электронов от терминального железо-серного центра N-2 к убихинону. Химические структуры этих ингибиторов настолько разнообразны, что сколько-нибудь оправданных выводов о строении участка их связывания сделать невозможно. Считают, что существует достаточно объемная гидрофобная полость, где связываются ротенон, пиерицидин, Тритон Х-100, катионные детергенты и пр. Свободные жирные кислоты также ингибируют комплекс I [Loskovich et al., 2005]. Было показано, что пальмитиовая кислота - ингибитор NADH: убихинон редуктазной реакции, катализируемой активной формой (А) комплекса I. Кроме того, пальмитиновая кислота специфически ингибирует активацию комплекса I (переход D—>А).

Содержание свободных жирных кислот в митохондриях (в частности мозга) может существенно увеличиваться в некоторых патологических состояниях (например, при аноксии с последующей реоксигенацией), поэтому их можно рассматривать в качестве факторов, способных нарушать функционирование дыхательной цепи.

Еще одним возможным регулятором активности комплекса I могут быть ионы Са2+ [Kotlyar et al., 1992]. В условиях in vitro дышащие митохондрии способны аккумулировать большие количества кальция, концентрация которого в митохондриальном матриксе зависит от многих факторов, таких как природа проникающего аниона, рН или присутствие нуклеотидов. Мы исследовали влияние свободных жирных кислот, а также ионов Са2+ на каталитическую активность комплекса I в инвертированных СМЧ мозга.

На рис. 4 А показано, что добавление высоких концентрации Са2+ к Мо-СМЧ при щелочном значении рН приводит к развивающемуся во времени ингибированию NADH-оксидазной активности. Такое торможение обращается при добавлении избытка ЭГТА (кривая 3). В таких условиях ингибирование сукцинат-оксидазной активности Мо-СМЧ не происходит (результаты не приведены), а остаточная NADH-оксидазная активность Мо-СМЧ полностью чувствительна к

15

ротенону. Таким образом, ингибирование ЫАОН-оксидазной активности Мо-СМЧ под действием Са2+ направлено на комплекс I. Катализируемое комплексом I восстановление искусственного акцептора электронов (НАЯ) было не чувствительно к Са2+, поэтому можно считать, что торможение направлено на участок связывания убихинона. Для увеличения КАОН-оксидазной активности Мо-СМЧ (связывание свободных жирных кислот), в реакционную смесь вносили БСА, который незначительно (на -20%) увеличивал КАБН-оксидазную активность. Оказалось, что БСА почти полностью предотвращает ингибирование КАОН-оксидазной активности Мо-СМЧ ионами Са2+(кривая 2). Этот результат указал на то, что ингибирование комплекса I под действием свободных жирных кислот [ЬозкхмсИ й а1., 2005] и Са2+ (рис. 4 А) взаимозависимо и это явление потребовало дальнейшего изучения. Можно было предложить два объяснения роли Са2+ в усилении ингибирующего действия жирных кислот. Согласно первому, Са2+ связываясь с комплексом I, увеличивает доступность (сродство) фермента для жирной кислоты. Другая возможность состояла в том, что наблюдаемое явление обусловлено взаимодействием: Са2+ - жирные кислоты - мембранные фосфолипиды. Если справедливо первое объяснение, то следовало ожидать, что Са2+ точно также, или сходным образом будет влиять на торможение активности

А Б

смч смч

1 1

Рис. 4. Влияние Са2+ на КАОН-оксидазную активность Мо-СМЧ.

А. 10 мМ СаСЬ и 15 мМ ЭГТА были добавлены, где указано, к Мо-СМЧ (10 мкг белка/мл), окисляющим 100 мкМ ИАРН в стандартной среде измерения оксидазной активности при рН 8,9 и 30°С. Кривая 1 - проба содержала БСА (2 мг/мл) без добавления Са2+; кривая 2 -Са2+ добавлен к пробе, содержащей БСА; кривая 3 - в среде нет БСА.

Б. Ингибирование ИАОН-оксидазной активности ротеноном в присутствии Са2+ (10 мМ). Ротенон (5• 10~8 М) добавлен к Мо-СМЧ (20 мкг белка/мл), окисляющим 100 мкМ ИАОН (рН 8,7; 30°С).

комплекса I другими, отличными от жирных кислот гидрофобными ингибиторами. На рис. 4 Б показано, что это не так: Са2+ не влиял ни на скорость торможения комплекса I ротеноном, ни на конечный уровень ингибирования.

Мы оценили рН-зависимость ингибирования МЛОН-оксидазной активности СМЧ под действием Са2+ (при некотором, по-видимому, постоянном уровне эндогенных свободных жирных кислот) (рис. 5). Как скорость Са2+-индуцированного ингибирования, так и остаточная ЫАОН-оксидазная активность сильно зависели от рН, с кажущейся рКа около 8,5 (рис. 5 А). Следует отметить, что величины остаточной КАЭН-оксидазной активности являются условными, а кривую рН-зависимости (рис. 5, Б) следует рассматривать только как ориентировочную, поскольку Са2+-зависимое ингибирование ЫАОН-оксидазной активности Мо-СМЧ развивается во времени.

А Б

Рис. 5. Зависимость альбумин-чувствительного торможения ^ОН-оксидазной активности Мо-СМЧ ионами Са2+ от рН.

А. Кривая регистрации NADH-oкcидaзнoй активности (концентрации КАЕ)Н и СаСЬ - 100 мкМ и 10 мМ, соответственно; 10 мкг белка Мо-СМЧ / мл, 30°С); значения рН указаны на кривых.

Б. Степень ингибирования дыхания, наблюдаемая через 10 мин после добавки Са2+, выраженная в процентах по отношению к контролю (без добавления Са2+). Контрольные значения (0,5 мкмоль окисленного ИАОН в мин на мг белка Мо-СМЧ) практически не зависели от рН.

На рис. 6 показано, что 10 мМ Са2+, в уменьшенном, по сравнению с рис. 1, временном диапазоне очень незначительно ингибирует NADH-оксидазную активность (рис. 6, кривая 1), так же как и пальмитат, который вызывает медленно развивающееся торможение (рис. 6, кривая 2). Когда к СМЧ, дышащим в присутствии пальмитиновой кислоты, по крайней мере, в течение 1 мин, был добавлен Са2+, наблюдалось почти мгновенное ингибирование МАЭН-оксидазной активности (рис. 6, кривая 3).

17

Если пальмитиновую кислоту вносили после добавления Са2+, то торможения не происходило (если жирные кислоты оказываются в растворе, содержащем Са2+, то образуется выпадающая в осадок нерастворимая соль и ингибирование не происходит.), и активность оставалась такой же, как в присутствии только Са2+ (рис. 6, кривые 4 и 1, соответственно). Результаты, представленные на рис. 6, показывают, что Са2+ значительно усиливает ингибирующее действие мембрано-связанных жирных кислот.

смч

ПЭЛЬМИТЗТ

Рис. 6. Ингибирование ^ОН-оксидазной активности Мо-СМЧ ионами Са2+ и пальмитиновой кислотой.

10 мМ СаСЬ и 50 мкМ пальмитат добавляли (где указано) к пробам Мо-СМЧ (10 мкг белка/мл), окисляющим 100 мкМ ЫАйН (рН 8,9; 30°С). Удельная активность Мо-СМЧ в отсутствие ингибиторов - 0,6 мкмоль/мин на мг белка.

Мы сравнили Са2+-зависимое ингибирование активности комплекса I в присутствии четырех других жирных кислот: лауриловой, миристиновой, стеариновой и пальмитолеиновой. Наиболее эффективным ингибитором оказалась пальмитиновая кислота (рис. 7).

И

? о-"' О"" О"8 о* о*

Рис. 7. Специфичность действия жирных кислот на Са2+-зависимое ингибирование NADH-oкcидaзнoй активности Мо-СМЧ.

Условия опыта, как на рис. 6 (кривая 3); остаточная активность измерена после добавления Са2+. Концентрация добавленных жирных кислот - 50 мкМ.

Несмотря на то, что приведенные выше данные показали синергизм ингибирующего действия Са2+ и свободных жирных кислот, они с трудом могли быть оценены количественно из-за того, что торможение развивается во времени. Чтобы преодолеть эту трудность, ингибирующий эффект Са2+ определяли в условиях, когда СМЧ инкубировали 30 мин (время, предположительно необходимое для уравновешивания реакционной смеси) в присутствии пальмитиновой кислоты и измеряли остаточную ЫАОН-оксидазную активность в присутствии возрастающей концентрации Са2+. В этом случае кажущееся сродство к Са2+ возрастало и полумаксимальное ингибирование происходило уже при 0,3 мМ Са2+. Дальнейшее увеличение времени инкубации (с жирными кислотами) не влияло на характер кривой титрования (рис. 8 А). Полумаксимальное ингибирование КАОН-оксидазной активности, при «равновесном» титровании пальмитиновой кислотой в присутствии высокой концентрации Са2+ (10 мМ) происходило при 0,5 мкмоль жирной кислоты на мг белка (рис. 8 Б).

А Б

Рис. 8. Титрование ингибирующего эффекта Са2+ (А) и пальмитата (Б) на ¡ЧАОН-оксидазную активность Мо-СМЧ.

.А. Мо-СМЧ преинкубировали 30 мин (рН 8,7; 22°С) в присутствии пальмитата (1 мкмоль на мг белка) и измеряли остаточную активность в присутствии указанной концентрации Са2+.

Б. Мо-СМЧ преинкубировали 30 мин (рН 8,7; 22°С) с указанной концентрацией пальмитата и измеряли остаточную ЫАОН-оксидазную активность в присутствии 1,5 мМ СаСЬ.

Ранее в нашей лаборатории было показано, что, с одной стороны, активация комплекса I замедляется при щелочных значениях рН и (или) в присутствии двухвалентных катионов [Ко^уаг е! а1., 1992], а с другой -блокируется пальмитиновой кислотой [Ьо5коу1сЬ е1 а1., 2005]. Сопоставление этих фактов с результатами, представленными выше, позволило предположить,

что влияние Са2+ и щелочных значений рН на Б—»А переход на самом деле обусловлено присутствием эндогенных жирных кислот в мембранах СМЧ. Мы подтвердили это предположение (рис. 9).

КАОН-оксидаза активированных Мо-СМЧ была не чувствительна к Са2+ (рис. 9, кривая 1). Деактивация комплекса I (преинкубация при 37°С) приводила к появлению лаг-фазы окисления ЫАБН (рис. 9 А, кривая 2), длительность которой существенно увеличивалась в присутствии Са2+ (рис. 9 А, кривая 3). В присутствии БСА (рис. 9 Б) картина существенно изменилась: Са2+ только незначительно увеличивал лаг-фазу при окислении ^'АБН деактивированным препаратом (рис. 9 Б, кривые 2 и 3).

А Б

смч смч

Рис. 9. Влияние альбумина на активацию деактивированной КАБН-оксидазы.

Мо-СМЧ (4 мг белка/мл) деактивировали преинкубацией при 37°С в течение 15 мин. Окисление ЫАПН при 30°С и начинали внесением 20 мкг белка Мо-СМЧ/мл. А - среда не содержала альбумина, Б - к среде добавлен БСА (2 мг/мл). Кривая: 1 - активированный препарат Мо-СМЧ, 2 - деактивированные СМЧ, 3 - в пробу добавлен 0,5 мМ СаСЬ.

IV. Влияние белков митохондриального матрикса на ингибирование NADH-оксидазной активности Мо-СМЧ пальмитиновой кислотой

Препараты СМЧ и интактных митохондрий отличаются тем, что активный нуклеотид-связывающий центр комплекса I в составе СМЧ ориентирован в окружающий раствор. В митохондриях периферическая часть комплекса I экспонирована в матрикс и находится в окружении «концентрированного» раствора белков матрикса. Такие белки могут, с одной стороны, взаимодействовать с комплексом I, влияя на его каталитическую активность, а, с другой стороны, могут связывать свободные жирные кислоты. Чтобы выяснить

может ли содержимое матрикса повлиять на характер ингибирования комплекса I под действием жирных кислот, мы оценили влияние белков матрикса митохондрий на ингибирование ЫАОН-оксидазной активности Мо-СМЧ под действием пальмитиновой кислоты.

Полученные результаты представлены на рис. 10. Добавление БСА (0,1-0,2 мг в мл, что соответствует возможному связыванию не менее 10 и 20 нмоль пальмитиновой кислоты) приводит к появлению отчетливой лаг-фазы на графике зависимости ингибирования комплекса I под действием жирной кислоты (кривые 2 и 3 на рис. 10, А), по сравнению с той же зависимостью в отсутствие БСА (кривая 1 на рис. 10, А). Характер зависимости, представленной на рис. 10, Б (кривые 2 и 3) свидетельствует о том, что белки митохондриального матрикса потенциально могут связывать свободные жирные кислоты и защищать комплекс I от ингибирования жирными кислотами.

А Б

Рис. 10. Влияние альбумина и белков митохондриального матрикса на торможение ]ЧАОН-оксидазной активности Мо-СМЧ пальмитиновой кислотой (рН 7,0; 25°С).

А. Ингибирование ЫАОН-оксидазной активности Мо-СМЧ (10 мкг/мл) под действием пальмитиновой кислоты в присутствии БСА. Кривая 1 - в отсутствии добавленного БСА (контроль), кривые 2 и 3 - в присутствии БСА (0,1 и 0,2 мг/мл, соответственно).

Б. Ингибирование ЫАОН-оксидазной активности Мо-СМЧ (10 мкг/мл) под действием пальмитиновой кислоты в присутствии белков митохондриального матрикса. Кривая 1 - в отсутствии белков митохондриального матрикса (контроль), кривые 2 и 3 - в присутствии белков митохондриального матрикса (0,05 и 0,25 мг/мл, соответственно).

За 100% принимали значение ЫАОН-оксидазной активности в отсутствии пальмитиновой кислоты. ЫАОН-оксидазная активность собственно «препарата белков митохондриального матрикса» отсутствовала.

выводы

1. Получены сопряженные СМЧ мозга и охарактеризованы основные свойства комплекса I в их составе.

2. Каталитические активности и параметры АЮ-перехода комплекса I в субмитохондриальных фрагментах мозга практически не отличаются от таковых, ранее описанных для препаратов сердца.

3. Торможение активации комплекса I ионами двухвалентных металлов при щелочных значениях рН обусловлено эндогенными жирными кислотами.

4. Ионы Са2+ рН-зависимо увеличивают скорость и степень ингибирования комплекса I эндогенными и добавленными жирными кислотами. В ряду проанализированных жирных кислот - пальмитиновая кислота наиболее эффективный ингибитор комплекса I.

5. Белки митохондриального матрикса частично защищают комплекс I от ингибирующего действия пальмитиновой кислоты.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Калашников Д.С., Гривенникова В.Г., Виноградов А.Д. (2011) Субмитохондриальные фрагменты митохондрий мозга: общие характеристики и каталитические свойства ЫАОН:убихинон оксидоредуктазы (комплекса I). Биохимия, 76, 253-263.

2. Калашников Д.С., Гривенникова В.Г., Виноградов А.Д. (2011) Ингибирование митохондриальной ЫАОН:убихинон оксидоредуктазы (комплекса I) мозга жирными кислотами: влияние Са2+. Биохимия, (принято к публикаций).

3. Калашников Д.С. (2010) NADH: убихинон оксидоредуктаза (комплекс I) из митохондрий мозга. XVII международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2010», секция «Биология», Тезисы докладов, Москва, МАКС Пресс, 52-53.

4. Калашников Д.С. (2010) МАОН:убихинон оксидоредуктаза (комплекс I) из митохондрий мозга свиньи. 14-я Пущинская международная школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века», Сборник тезисов, Пущино, 30.

5. Kalashnikov D.S., and Vinogradov A.D. (2010) NADH:ubiquinone oxidoreductase (complex I) of brain mitochondria. Biochim. Biophys. Acta , 1797, 16th European Bioenergetics Conference Short Reports, p. 17.

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (Гранты № 05-04-48809,06-04-48931, 08-04-00594,09-04-00505) и NIH Fogarty International Research grant 5R03TW007825.

Подписано в печать: 07.04.11

Объем: 1,5 усл.п.л. Тираж: 75 экз. Заказ № 783 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г. Москва, пр-т Вернадского,39 <495)363-7-8-90; дтаадме^еиш

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Калашников, Денис Сергеевич

список сокращений. введение:.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ:.

Комплекс вдыхательной цепи.

Морфология.

Препараты.

Номенклатура субъединиц.

Субъединичный состав комплекса 1.

Субъединицы, кодируемые митохондриальным геномом.

Субъединицы, кодируемые ядерным геномом.

Субъединичный состав комплекса I различных эукариот.

Редокс-компоненты.

О механизме трансформации энергии комплексом 1.

Структура комплекса I и его фрагментов.

Реакции, катализируемые комплексом 1.

КАБН-оксидазная реакция.

ИАВШубихинон-оксидоредуктазная реакция:.

КАБН:феррицианид-редуктазная реакция.

КАРНггексааминорутений (Ш)-редуктазная реакция.

Трансгидрогеназная реакция.

ЫАОШфумарат редуктазная реакция.

Генерация супероксид-радикал а.

Обратныйперенос электронов.

Ингибиторы.комплекса I.

Медленные обратимые изменения каталитической активности: активная и деактивированная формы.

Посттрансляционные модификации комплекса 1.

Фосфорилирование.

Глутатионилирование.

Об измерении активности комплекса I в интактных митохондриях

Некоторые физико-химические свойства жирных кислот.

Влияние жирных кислот на процессы, происходящие в митохондриях. 47 Влияние жирных кислот на каталитическую активность комплекса I.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Препаративные методы.

Получение митохондрий сердца крысы.

Получение митохондрий мозга крысы.

Получение «препарата белков митохондриального матрикса».

Получение препарата митохондрий мозга, проницаемых для низкомолекулярных соединений.

Получение митохондрий мозга свиньи.

Активация и деактивация субмитохондриальных частиц мозга.

Аналитические методы.

Измерение поглощения кислорода.

Измерение ЫАВН-оксидазной активности.

Измерение 1*Ш)Н:С)1-редуктазной активности.

Измерение КАБН:гексааминорутений (III)- редуктазной активности.

Обратный перенос электронов на поддерживаемый аэробным окислением сукцината.

Обратный перенос электронов на феррицианид, поддерживаемый аэробным окислением сукцината.

Генерация супероксид-радикала.

Определение содержания гема а в полученных препаратах.

Определение количества комплекса I в полученных препаратах.

Определение содержания белка в полученных препаратах.

Реактивы.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Митохондрии мозга.

Получение и свойства.

Влияние пальмитиновой кислоты на оксидазные активности.

Субмитохондриальные фрагменты мозга.

Получение и свойства.

Активная и деактивированная формы комплекса 1.

Ингибирование каталитической активности комплекса I жирными кислотами: влияние Са2+.

Влияние альбумина и белков митохондриального матрикса на торможение КАОН-оксидазной активности пальмитиновой кислотой.

ВЫВОДЫ.