Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Гистерезисное поведение NADH: убихинон-оксидоредуктазы митохондрий сердца быка

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Гистерезисное поведение NADH: убихинон-оксидоредуктазы митохондрий сердца быка"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М. В. ЛОМОНОСОВА

Р Г Б ОД

На правах рукописи

МАКЛАШИНА Елена Олеговна

УДК 577.152.

ГИСТЕРЕЗИСНОЕ ПОВЕДЕНИЕ МОН: УБИХИНОН-ОКСИДОРЕДУКТАЗЫ МИТОХОНДРИЙ СЕРДЦА БЫКА

03.00.04 — биологическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва — 1994

Диссертационная работа выполнена на кафедре биохимии Биологического факультета МГУ

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор А. Д. Виноградов

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор В. Д. Самуилов кандидат биологических наук А. Ю. Андреев

Ведущая организация: Институт химической физики РАН.

Защита состоится «¿2 » 1994 года

в/Х^0 часов на заседании Специализированного биологического Совета Д.053.05.32 по присуждению ученой степени кандидата наук в Московском государственном университете им. М. В. Ломоносова по адресу: 119899, Воробьевы горы, МГУ, Биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан «,£/» ОКТ^р^ 1994 г.

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат биологических наук

10. Н. Лейкин

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. НАОН:убпхинон-оксидоредуктаза митохондрий (КФ 1.6.99.3) (комплекс I, первый пункт сопряжения) -фермент, поставляющий восстановительные эквиваленты от NADH в дыхательную цепь. Обратимый перенос двух электронов, осуществляемый комплексом I между NADH и убихиноном сопряжен с трансмембранным переносом 3-5 протонов из матрикса митохондрий в межмембранное пространство. МАОН:убихшюн-оксидоредуктаза чрезвычайно сложный и наименее изученный компонент внутренней мембраны митохондрий, состоящий из 42 различных полипептидов и связанных с ними фосфолипидов [Walker, 1992J. Структурная организация фермента, молекулярные механизмы функционирования и возможные способы его регулирования мало изучены.

Недавно в лаборатории А.Д. Виноградова был описан феномен медленных обратимых переходов между активной и неактивной формами комплекса I в составе субмитохондрнапьных частиц (СМЧ) [Kotlyar, Vinogradov. 1990]. Для перехода фермента из неактивного состояния в активное необходимо его восстановление NADH и последующее окисление хиноном. Этот переход замедляется в присутствии ионов двухвалентных металлов [Kotlyar et al, 1992] и (или) при защелачивании. Обратный переход в неактнвное состояние представляет собой спонтанный процесс, скорость которого сильно зависит от температуры. Ряд данных указывает на то, что активная и неактивная формы комплекса I отличаются не только по каталитическим свойствам, но и структурно. Однако, до настоящего времени нельзя утверждать, что гистерезисное поведение фермента в составе СМЧ обусловлено свойствами собственно комплекса I, поскольку необходимо иметь в виду, что существенную роль в этом может играть мембрана, в которую погружен фермент. Следует также учитывать возможность специфических взаимодействий между компонентами дыхательной цепи и другими интегральными белками мембраны, следствием которых и может быть сложное кинетическое поведение комплекса I.

Настоящая работа является продолжением серии исследований, посвященных изучению НАБН:убихинон-оксидоредуктази, проводимых на кафедре биохимии Биологического факультета МГУ. Ее актуальность определяется необходимостью разработки физико-химических ссноз" биологического катализа, в частности, прминительно к биоэнергетическим системам аэробной клетки.

Цель работы состояла: 1) в изучении гистерезисного поведения изолированного комплекса I и сравнении параметров обратимого перехода неактивный-активный фермент для очищенного комплекса I и фермента в составе мембраны; 2) в изучении роли акцептора электронов в реакциях, приводящих к активации фермента для изолированного препарата.

Научная новизна работы. Представленые экспериментальные данные показывают, что изолированный комплекс I способен к медленным обратимым переходам из неактивного состояния в активное с параметрами, мало отличающимися от таковых ранее описанных для фермента в составе полной дыхательной цепи. Получены результаты указывающие на то, что сродство неактивного комплекса I к убихинону в ходе реакции активации чрезвычайно высоко, а соотношение активной и неактивной форм фермента контролируется редокс состоянием хинона. Предложена гипотеза, согласно которой при функционировании фермента в стационарном активном состоянии часть свободной энергии реакции окисления ЫАОН убихиноном расходуется на поддержание термодинамически нестабильной конформации протон-транслоцирующей КАОН:убихинон-редуктазы.

Практическая значимость работы. Результаты, полученные в работе являются вкладом в фундаментальные представления о функционировании мембрано-связанных ферментов. Материалы диссертации используются в лекциях для студентов по биохимии. На основании работы предложено несколько демонстрационных задач для большого практикума по биоэнергетике на кафедре биохимии. В ходе выполнения работы разработаны простые методы получения активной и неактивной форм комплекса I в различных препаратах, что необходимо для достоверного измерения ферментативной активности и последующей интерпретации полученных результатов.

Апробация паботы. Результаты исследования были доложены на заседании кафедры биохимии Биологического факультета МГУ, на 2 Международной Конференции по биохимии и молекулярной биологии -ШВМВ - (1993, Бари, Италия), на российско-германтскоы симпозиуме молодых ученых (1994, Оснабрюк, Германия).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано А печатных работы.

Объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания методов и объектов исследования, изложения

полученных результатов, их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на стр. машинописного текста, включая 6 табл. и рис.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

СМЧ [Kotlyar, Vinogradov. 1990] и комплекс I [Hatefi, Rieske. 19671 получали из митохондрий сердца быка и хранили в жидком азоте. Хинолоксидаза bd-типа, выделенная из клеток суперпродуцирующего штамма G0102/pFHl01 Escherichia coli по методу, разработанному в лаборатории Тенниса [Miller, Gennis. 19S3], была любезно предоставлена И.А. Красносельской (Отдел биоэнергетики Института физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, МГУ).

Перед началом опытов препараты СМЧ и комплекса I размораживали; СМЧ разводили до концентрации 5 мг белка/ на мл средой, содержащей 20 мМ Tris-HCl (pH 8,5), 0,25 мМ сахарозу, 0,2 мМ ЭДТА, и бычьий сывороточный альбумин (БСА) (1 мг/мл); комплекс I разводили до концентрации 1 мг белка на мл средой, содержащей 20 мМ Tris-HCl (pH 8,5), 0,6 М сахарозу, 0,2 мМ ЭДТА, 1 мг азолектина на мл (смесь фосфолипидов). Оба препарата переводили в неактивное состояние инкубируя их 30 мин при 35°С.

NADH-оксидазную активность СМЧ регистрировали при 25°С (спектрофотометр Hitachi-557) в 2 мл стандартной среды, содержащей 20 мМ Tris-HCl (pH 8,5), 0,25 сахарозу, 0,2 мМ ЭДТА, БСА (2 мг/мл) и 100 мкМ NADH. Ь'Л0Н:0|-редуктазную активность СМЧ и комплекса I регистрировали в условиях, указанных выше, в присутствии 100 мкМ Q] и 2 мкМ антимицина А.

Долю активной формы комплекса I в различных препаратах фермента определяли по начальным скоростям NADH:Q; -редуктазных реакций, измеренных в присутствии 8 мМ MgCl2, стабилизирующего фермент в неактивном состоянии. Полностью активным считали фермент после его преинкубации в течении 1 мин с 100 мкМ Qi и 3 мкМ NADH.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Свойства активной и неактивной форм изолированного комплекса I

Мы показали, что изолированный из митохондриалыгой мембраны комплекс I также, как и фермент в составе СМЧ, имеет различное кинетическое поведение в ротенон-чувствительной NADK:Q ¡ргдуктазноГ; реакции в зависимости от условий, предшествующих измерению

КАШ (2 мкМ) } ме2+

КАОН

1 МШ1

ротеиои

Рис. 1. КАОН:0]-рсдуктазная аетивность комплекса I. Реакцию начинали добавлением 100 мкМ КАОН. Состав среды измерения и получение дсактивиропашюго комплекса I описаны в разделе "Методы исследования". Среда содержала фермент (5 мкг белка /мл) и 100 мкМ О). 2 мкМ ШОН добавляли для активации фермента (кривые 2 и 4), 3 мМ М£С)2 добавляли перед началом регистрации активности (кривые 3, 4 и 5). Стрелками показано внесение 4 мМ ЭДТА и 2 мкМ ротенона.

1 2 I, мин

2 3 !^С12. мМ

Рис. 2. Определение констаны скорости активации ротенон-чувствительной N АО Н: 0) -редуктаз ной реакции, катализируемой комплексом I. (а) - Лейная анаморфоза ротенон-чувствительных составляющих кривых 1 и 3 на рис 1 (за принимали схорости демонстрируемые кривыми 2 и 4, соответственно), (б) - Зависимость кажущейся константы скорости активашш (какаж) ротенон-чувстаггелыюй МлОН^-редуктазной реакции от концентрации МйС1.2

ферментативной активности. На рис.1 представлена регистрация КАОН:(31-редуктазнсш реакции, катализируемой изолированным комплексом 1. После 30 минутной инкубации при 35°С фермент катализирует ротенои-чувствительную КЛОН:0 [-редуктазггую реакцию с ярко выраженной лаг-фазой (кривая 1). Преинкубация такого фермента с 3 мкМ ^ОН и 100 мкМ С>[ перед началом измерений в течение 1-2 минут приводит к исчезновению лаг-фазы (кривая 2). Внесение в

среду измерения активности приводит к сильному увеличению продолжительности лаг-фазы (при этом начальная скорость ротенон-чувствительной составляющей реакции равна нулю, кривая 3) и практически не влияет на активность фермента, преинкубнрованного с 100 мкМ (31 и 3 мкМ КАОН (кривая 4). Уменьшение скорости активации фермента в присутствии ионов обратимо. Внесение избытка ЭДТА

в среду измерения активности во время медленной активации фермента снимает действие (кривая 5). Представленные результаты

показывают, что в присутствии ионов двухвалентных металлов суммарная ЫАВН:<31-редуктаза катализируется только частью молекул комплекса I, которая находится в активном состоянии. Таким образом, состояние фермента (долю активной формы) можно просто и надежно определять по начальным скоростям ротенон-чувствительной НАОН:<3 [ -редуктазкой реакции в присутствии ионов

Активация комплекса I в ходе ротенон-чувствительной КАОН.СЬ-редукгазной реакции как в присутствии, так и в отсутствие ионов подчиняется кинетике первого временного порядка (рис.2а). С помощью ионов двухвалентных металлов или Са2+) параметры этой

кинетики можно легко определить при обычной регистрации активности. На рис.2б показана зависимость кажущейся константы скорости активации от концентрации М{;2+, Экстраполяцией к нулевой концентрации можно определить величину константы скорости

первого порядка для процесса активации. Значения констант скорости активации определенное прямым (с небольшой точностью) и методами экстраполящии совпадают и в указанных условиях равны ~1 мин.

Рис. 3 показывает, что только неактивная форма изолированного комплекса I (кривая 3), проявляет высокую реактивность по отношению к Ы-этилмалеимиду. В присутствии ионоз скорость торможения

фермента ингибитором увеличивается (кривая 4), а активный фермент практически не чувствителен к Н-этилмалеимиду даже в присутствии ионов (кривые 1 и 2).

1.0

3

>

2

4

6 t, Mlffl

Рис. 3. ИнгиОирование М-этилмалеимидом (К-ЕМ) КАОН:(2[-редуктазной активности комплекса I. Состав среды измерения активности, получение активированного (кривые 1 и 3) и деактивированного (кривые 2 и 4) препарата комплекса I описаны в разделе "Методы исследования". Фермент (ОД мг белка/мл) инкубировали при 25° в стандартной среде, содержащей 40 мкМ Ы-ЕМ; 3 мМ \1gCl2 вносили перед добавлением Ы-ЕМ (кривые 2 и 4). Определяли начальную скорость ротенон-чувствительной ИАОН^-редуктазной реакщш в присутствии 5 мМ МсС1.2 100% соответствует активность фермента равная 1,6 мкмоль КАОН/мин на мг белка.

Результаты опытов, представленные на рис.1, показали, что неактивный фермент медленно переходит в активное состояние в условиях, когда в среде инкубации присутствуют оба субстрата реакции: хинон (Qj) и NADH. Ни NADH, ни хинон сами по себе, а также продукты реакции - NAD+ и хинол не вызывают активации фермента. Как активный так и неактивный катализирует ротенон-нечувствительную КАОН:феррицианид-редуктазную реакцию с одинаковыми скоростями.

Изолированный комплекс I весьма стабилен в активном состоянии долгое время при низкой температуре (по крайней мере 5 часов при 0°С).

Таблица I, Параметры медленных переходов для изолированного комплекса I и фермента в составе СМЧ (рН 8,5, 25°С).

Параметры

СМЧ

комплекс I

процесса деактивации (кДж/моль) процесса активации (кДж/моль) Константа скорости активации N АИН: 01 - ре ду ктаз ы (мшг')

мМ (торможение активации) рКа (рН зависимость активации)

270

8,1

1,1

1,2

245 170

1,0 0,9

8,0

При увеличении температуры скорость спонтанной деактивации* резко возрастает. При 30°С время, за которое происходит деактивация половины фермента составляет 15 мин и на эту величину не оказывает влияние добавление в среду инкубации NAD+ (0,5 мМ), Qj (100 мкМ), QjH2 (40 мкМ) или MgCl2(5 мМ). Скорость деактивации остается постоянной при изменении рН в интервале 7,0-9,0.

В таблице I суммированы определенные нами параметры медленных изменений каталитической активности комплекса I.

♦Мы не смогли подобрать подходящего русского термина для процесса, который при дальнейшем изложении будет называться деактивацией. Деактивацией (в отличие от общепринятого "инактивация") мы будем называть необратимую (термодинамически) потерю каталитической активности фермента, которая может быть полностью восстановлена в результате обработки "ииактивированного" белка. Примененный нами термин обозначает процесс близкий по значению к термину "денатурация", в тех случаях, когда структуру белка можно полностью восстановить (ренатурировать).

Сравнение параметров для процесса активации и деактивации изолированного комплекса I и фермента в составе СМЧ позволяет считать что: 1) изолированный по методу Хатефи и соавт. фермент сохраняет не только каталитические (ротенон-чувствительная редуктазная активность), но и регуляторные (способность к медленным обратимым изменениям ферментативной активности) свойства; 2) медленные переходы из активного в неактивное (и обратно) состояние, свойство, присущее собственно ферменту, а не обусловлено его взаимодействием с фосфолидипидным бислоем мембраны или каким-либо компонентом полной дыхательной цепи.

Комплекс I способен многократно переходить из одного состояния в другое и сохранять при этом как параметры переходов, так и свойства, присущие каждой из форм фермента. Очень высокий энергетический барьер г.' рехода, а также различная чувствительность двух форм фермента к М-этилмалеимиду (табл. I, рис.3) свидетельствует о значительных структурных (конформационных) различиях между ними.

Полученные ранее данные и результаты нашей работы позволяют предложить феноменологическую схему процесса:

Только активная форма фермента (Н • Е) катализирует быструю стационарную реакцию окисления ЫАОН хиноном, чувствительную х ротенону и сопряженную с трансмембранным переносом протонов (цикл 1). В условиях, когда комплекс I прекращает катализировать реакцию (например, из-за отсутствия одного из субстратов), фермент, независимо

от степени восстановленное™ редокс-компонептов, спонтанно переходит в неактивное состояние (H-i'O в необратимой реакции (2). На скорость этой реакции не влияют ни KADH, ни хинон, ни ионы двухвалентных металлов и единственным фактором, сильно влияющим на kj, оказывается температура. Для возвращения фермента в активное состояние необходимо его восстановление субстратом (NADH) и последующее окисление добавленным или эндогенным хиноном. Формально это означает, что реакция (3) (активация комплекса I) сопровождается, по крайней мере одним медленным "оборотом" фермента, в реакции, "продуктом" которой (кроме NAD+ и хинола) является его активная форма. Очевидно, что лаг-фаза в кинетике перехода может быть обусловлена либо медленным связыванием субстрата реакции (хинона), либо медленным переходом восстановленного фермента в активное состояние.

Разность окислительно-восстановительных потенциалов между парами NADH/NAD+ и хинол/хинон составляет величину более чем достаточную для синтеза АТР в стационарной реакции сопряжения (1). Комбинация же реакций (3) и (2) может также рассматриваться как реакция энергетического сопряжения, в которой свободная энергия окислительно-восстановительной реакции запасается в виде "богатой энергией" конформации фермента. Следует ожидать, что при физиологической температуре теплокровных животных

функционирование первого пункта сопряжения сопровождается медленным футильным циклом.

Кажущаяся константа скорости активации неактивного комплекса Ьависит от рН и ионов двухвалентных металлов. В процесс активации вовлечена группа с рК и только протонированный фермент (Н • Е*) способен к переходу в активное состояние. Депротонированный фермент (»Е*) взаимодействует с двухвалентными катионами и стабилизируется в неактивном состоянии. Сравнение наших результатов, с полученными ранее, свидетельствует о том, что Mg2+ и Са2+ обладают примерно одинаковым сродством к неактивному комплексу I. Значение рК группы, протонирование которой необходимо для активации, и высокая чувствительность неактивной формы фермента к N-этилмалеимиду позволяют предполагать, что остаток цистеина одного из полипептидов комплекса вовлечен в обратимый переход фермента.

у (о), (%)

100

50

20

40

60 (ЫмкМ)

Рис. 4. Зависимость скорости МЛОН^рреяуктазной реакции комплекса I (V) и доли активного фермента (Ы) от концентрации <3[. Кривая I - К'АВН^-рсдуктазная активность активированного фермента (за 100% принимали активность равную 2 мкмоль КЛОН/мни на мг белка). Кривая 2 -деактивированный фермент (5 мкг белка/мл) инкубировали 4 мин при 26° в среде, содержащей 100 мкМ МЛОН и указанные на рис. концентращш С^. Определяли долю активного фермента по начальным скоростям ротенон-чувствительной ЫАОН;<3|-редуетазной реакции, измеренной в присутствии 100 мкМ С>1 и 100 мкМ Ь'АОН (конечные концентрации) и 5 мМ М£С1-2

2. Влияние добавленного хинона на переход изолированного комплекса I из неактивною состояния в активное.

Комплекс I не способен активироваться в присутствии Ь'АОН. Добавление 100 мкМ 01 в среду измерения приводит к полной активации фермента примерно за одну минуту (рН 8,5, 26°С). Использование изолированного комплекса I позволяет произвольно менять концентрацию хинона - акцептора, необходимого для активации фермента, что очень трудно сделать, используя СМЧ. Рис.4 (кривая 1) показывает зависимость скорости ротенон-чувствитсльной редуктазной реакции, катализируемой полностью активным препаратом

комплекса I, от концентрации добавленного акцептора. Величина кажущейся Кт для Qi, определенная по линеаризованной Михаэлисовской зависимости равна 35 мкМ. Кривая 2 описывает зависимость доли неактивного фермента, перешедшего в активное состояние за постоянное время (4 мин) в тех же условиях, от концентрации добавленного Qj. Полученная зависимость также оказывается простой гиперболой с кажущейся Кт для Qj, равной 3 мкМ. Если принять, что кривая 2 отражает зависимость скорости перехода фермента в активное состояние от концентрации акцептора, то полученный результат указывает на различие центров связывания хинона, участвующих в собственно каталитическом акте (кривая I) и в процессе активации фермента (кривая 2).

3. Активация изолированного комплекса I в ходе NADH.mroxpou с-редуктазной реакции.

Известно, что препарат комплекса I, полученный по методу Хатефи и сотр., содержит примерно 0,1 моль убихинол:цитохром с- редуктазы (комплекс III) и 2-4 моль убихинона на 1 моль FMN [Hatefi, Rieske. 1967); благодаря этому изолированный комплекс Г способен катализировать NADH:iuiroxpoM с-редуктазную реакцию, чувстви- тельную к миксотиазолу и антимицину.

На рис. 5 приведены данные о ЫАЕ)Н:(21-редуктазной реакции, катализируемой изолированным комплексом I после преинкубации фермента в условиях протекания (или отсутствия) NADH:nnroxpoM с-редуктазной реакции. В левой части рисунка показано, что неактивный комплекс I катализирует NADH:mwoxpoM с -редуктазную реакцию с выраженной лаг-фазой (кривая 1), после которой устанавливается постоянная скорость восстановления цитохрома с, составляющая примерно 10% от максимальной скорости, ротенон-чувствительной NADH'.Qi-редуктазной реакции. Цитохром с-редуктазная реакция, как и следовало ожидать, блокируется антимицином А (кривая 2). Через 4 минуты после начала реакции в кювету вносили MgCl2, антимицин А (кривая 1), меняли длину волны регистрирующего прибора (334,5 нм, поглощение восстановленного NADH в изобестической точке для цитохрома с) и оценивали степень активации фермента, регистрируя окисление NADH добавленным Qi (кривые Г и 2' в правой части рисунка соответствуют кривым 1 и 2 в левой части). Полученные результаты показывают, что около 70% неактивного комплекса I переходит в

NADH: mrroxpом с - редуктаза

NADH: Q| - рсдуыгаза

MsCi2

антпмншш А

Qi

а550 0,01

Е

Рис. 5. NADH.Qj -рсдуктазная активность комплекса I, индуцированная NADH: щггохром с - редуктазной -реакцией. Объяснение приведено в тексте. Среда измерения содержала 100 мкМ NADH и 30 мкМ цитохром с ; кривые 1 и 2 - в отсутствие и в присутствии 2 мкМ антимицина А, соответственно. Стрелками показано внесение комплекса I (Е, 5 мкг белка/мл), 8 мМ MgCb, 2 мкМ акгимицина А, 100 мкМ Qi, 2 мкМ ротенона. Кривая 3 в правой части рисунка показывает активность комплекса 1 после одномннутной преинкубащш в кювете с 100 мкМ Qf и 2 мкМ NADH в присутствии цитохрома с и антимицина А. Стрелкой показано енссснис 100 мкМ NADH.

активное состояние в ходе реакции окисления NADH цитохромом с (через эндогенный убихинон и примесный, составляющий -1/10 молярную долю, комплекс III).

4. Активация комплекса I в NADH-оксидазных реакциях.

Для того, чтобы иметь возможность варьировать степень восстановленности эндогенного убихинона в ходе активации комплекса I, мы воспользовались хинол-регенерирующей системой: хинолоксидазой (ХО) из Escherichia coli.

Хинолоксидаза мембран £. coli относится к оксидазам bd-типа и

и

представляет собой димер с молекулярной массой около 100 kDa, содержащий два гема типа b и один гем d. Фермент катализирует окисление убихинола-8 или его низкомолекулярных гомологов кислородом [Kita et al, 1984]. Мы реконструировали N ADН - окси даз ну ю систему из изолированного неактивного комплекса I из сердца быка и хинолоксидазы из R coli. Реакция окисления NADH кислородом, катализируемая этой системой (в присутствии добавленного Qj), была полностью чувствительна к ротенону и не ингибировалась ни антимицином А, ни миксотназолом. На рис. 6 показана регистрация NADH-оксидазной и NADH.Qi-редуктазной реакций, катализируемых реконструированной системой. Скорость окисления NADH зависела от количества добавленной хинолоксидазы. Окисление NADH в такой системе происходит с отчетливой лаг-фазой, длительность которой при

Аг

А340 0.02

L

NADH

1 мии

Рис. 6. NADH-оксидазная реакция, катализируемая митохондриальным

коплексом I и хинолоксидазой Я coli. Реконструкция NADH-оксидазы из митохоидриалыгого коплекса 1 и хинолоксидазы Е. coli и условия измерения см. "Методы исследования". NADH-оксидазную реакцию проводили в присутствии 2 мкМ антимицина А и 1 мкМ миксотиазола. Реакцию инициировали добавлением 100 мкМ NADH, регистрировали стационарную скорость в течении 4 мин, после чего. вносили S мМ MgCb и 100 мкМ Qi .Конечная концентрация комплекса I в среде измерения - 5 мкг белка/мл. Кривые 1 и 2 -концентрация ХО при реконструкции 10 и 100 мкг белка/ад соответственно.

1 MgCI2 Q2

О- 5

V (■/(%)

ХО, мкг/ мл V, мкмоль NADH/ мин мг

Рис. 7. Определение доли комплекса I, активированного ^ОН-оксидазной реакцией в реконструированной системе. Регистрацию NADH-oкcидaз)Ioй и ЫАОН:01-рсетазной реакций проводили как на рис.6, (а) - Зависимость скорости ИАОН-оксидазной реакции (кривая !) и N^011:0)-редтазной реакции в присутствии 100 мкМ (кривая 2) от количества хинолоксидазы (ХО) в реконструированной системе. (б) - Зависимость доли активного комплекса 1 (Ы) от величины стационарной скорости окисления ^ОН.

всех использованных концентрациях хинолоксидазы не превышала времени, необходимого для активации изолированного комплекса I в присутствии насыщающих концентраций Qj (-1 мин). После активации реакция протекала с постоянной скоростью в течение, по крайней мере, 10 мин. Последующее измерение начальной скорости ротенон-чувствительной NADH:Qi-peflyKTa3Hofi реакции в присутствии ионов Mg2+, позволяет определить долю активной формы комплекса I [Kotlyar, Vinogradov. 1990. стр. настоящего реферата]. Торможение ионами Mg2+ NADH-оксидазной реакции связано с ингибированием хинолоксидазы, что было показано нами в отдельных контрольных опытах.

На рис.7 (а) показана зависимость стационарной скорости NADH-оксидазной реакции, катализируемой реконструированной системой, от количества хинолоксидазы. Эта зависимость представляет собой кривую с насыщением (кривая 1). Постоянство скоростей окисления NADH в присутствии добавленного Qj показывает, что хинолоксидаза сама по себе не влияет на каталитическую активность активированного комплекса I (кривая 2). Зависимость доли активной формы комплекса I от стационарной скорости окисления NADH в системе, содержащей

различные концентрации хинолоксидазы представлена на рис.7 (б). Полученные результаты указывают на то, что два параметра: стационарная скорость КАБН-оксидазной реакции и доля активной формы комплекса I, зависят от соотношения окисленной и восстановленной форм убихинона. Если первое достаточно тривиально, то второе представляется необычным явлением, требующим, на наш взгляд, детального изучения.

Для того, чтобы проверить наблюдается ли это необычное явление при функционировании полной дыхательной цепи, мы провели опыты, по существу аналогичные представленным на рис.7, используя СМЧ. На

а

0,5

X

О $

1,0

0,1 0,5

V, мкмоль NADH/ мин мг

10

15

NaNj, мМ '

Рис. 8. Влияние №N3 на NADH-оксидазную активность СМЧ. Реакщда начинали внесением 100 мкМ NADH. Регистрировали стационарную скорость окисления NADH субмитохондриальными частицами (20 мкг белка/мл) в присутствии №N3 в течении 4 мин, затем вносили 2 мкМ антимицин А, 8 мМ MgCl2 и псле внесения 100 мкМ Qi ргистрировали начальную скорость ротенон-чувствительной NAD H:Q 1 -редтазкой реакции, (а) - Зависимость стационарной скорости NADH оксидазной реакции от концентрации №N3, (б) -Зависимость доли активного комплекса I (N) от величины стационарной скорости окисления NADH.

рис.8 (а) показана зависимость стационарной скорости окисления NADH субмитохондриальными частицами от концентрации NaN3- обратимого ингибитора цитохромоксидазы, позволяющего варьировать степень воссгановленности убихинонг. Окисление NADH деактивированными СМЧ проходило с лаг-фазой, после чего наблюдалась длительная стационарная фаза реакции. Как и в случае с хинолоксидазой в качестве хинон-регенерирующей системы, доля активного комплекса I в СМЧ оказалась зависящей от стационарной скорости окисления NADH. Видно, что при полном блокировании дыхательной цепи комплекс I активируется за счет убихинона примерно на 30%, а зависимость доли активированного комплекса I от стационарной скорости окисления NADH представляет собой кривую с насыщением - рис. 8 (б).

Таким образом, с помощью двух систем реокисления хинола (рис. 7 и 8) мы показали, что соотношение между активной и неактивной формами комплекса I в стационарном состоянии контролируется редокс-состоянием хинона. Этот факт представляется удивительным, так как в условиях проведения опытов фермент долго сохраняет свое активное состояние (по крайней мере 10 мин); при этом на скорость его спонтанного перехода в неактивное состояние не влияют ни присутствие NADH, ни восстановленный убихинон.

Простейшая на наш взгляд качественная гипотеза, объясняющая олученные результаты, может быть сформулирована следующим образом. Восстановленный хинон с высоким сродством связывается в центре, где происходит связывание окисленного хинона, приводящего к активации фермента. Так как даже при насыщающих этот центр количествах окисленного хинона переход комплекса I в активное состояние происходит достаточно медленно (~1 мин), существенное замедление процесса активации фермента хинолом приведет к тому, что даже на больших временах в системе активный/неактивный фермент не устанавливается равновесия. " Количественные оценки такой интерпретации требуют дальнейших исследовании.

Выполнение работы финансировалось Российским Фондом Фундаментальых исследований (грант N 93-04-20214), Национальным ннситутом здоровья США (NIH Fogarty International Research Collaborative grant NIH R03 TW00140-01A2) и прохраммой 'Университеты России".

выводы

1. Изолированный из митохондрий сердца быка комплекс I существует в двух формах: активной и неактивной. Параметры обратимых переходов фермента из одного состояния в другое качественно и количественно сходны для изолированного комплекса I и фермента в составе СМЧ.

2. Предложена схема, описывающая гистерезисное поведение комплекса I, согласно которой часть свободной энергии окисления NADH убихиноном в дыхательной цепи используется на поддержание каталитически активной конформации фермента. ■

3. Сродство хинона к неактивному комплексу I в реакции активации фермента существенно выше, чем кажущееся значение Кт для Qj в КА£)Н:0[-редуктазной реакции.

4. Почти полный (-70%) переход неактивного изолированного комплекса I в активное состояние может достигаться за счет эндогенного убихинона, регенерируемого малой (-1/10) молярной долей комплекса III.

5. Соотношение, активной и неактивной форм комплекса I при функционировании реконструированной или нативной NADH оксидазы в стационарном состоянии зависит от редокс состояния хинона-акцептора.

6. Существует, по-крайней мере три функции убихинон-связывающих центров комплекса I: 1) участие в быстрой ротенон-чувствительной реакции, катализируемой ферментом; 2) участие в предстационарном обороте, приводящем к переходу комплекса I в активное состояние; 3) регулирование перехода фермента из неактивного состояния в активное в ходе КАОН:хинон-редуктазной реакции соотношением хинон/хинол.

ПЕРЕЧЕНЬ ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Маклашина Е.О., Следь В.Д., Виноградов А.Д. Гистерезисное поведение комплекса I митохондрий сердца быка: кинетичесие и термодинамические параметры медленного обратимого перехода из неактивного в активное состояние. Биохимия. 1994. Т. 59. вып. 7. С. 946-957.

2. Маклашина Е.О., Виноградов А.Д. Участие хинона акцептора в переходе комплекса I из неактивного состояния в активное. Биохимия. 1994. Т. 59. вып. 11. С. 1638-1645.

3. A.D. Vinogradov, V.D. Sied, Е.О. Maklashina, D.Sh. Burbaev and I.A. Moroz. Mechanism and control of ubiquinone reduetion at Couplins site I of the respiratory chain. (1991) Biol. Chem. Hoppe-Seyler. v.372. p.553.

4. E.O. Maklashina and A.D. Vinogradov. The slow active/inactive transition on the mitochondrial NADH:Ubiquinone reduetase. Abstract in "The 2nd IUBMB Conf. in Biochemistry of Cell Membrane" (1993). Bari. Italy. p. 222.

rflW"''