Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение реакций преобразования энергии в NADH: убихинон-оксидоредуктазах митохондрий и прокариот

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ушакова, Александра Владимировна

СОДЕРЖАНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Организация дыхательной цепи.

Строение Комплекса 1.

Комплекс I митохондрий эукариот.

Комплекс I прокариот.

Пространственная организация Комплекса 1.

Каталитические активности Комплекса 1.

Нечувствительные к ротенону активности Комплекса 1.

КАВН:феррицианид-редуктазная реакция.

МАВН:гексааминорутений-редуктазная реакция.

Генерация супероксид-аниона Комплексом 1.

Трансгидрогеназная реакция.

Чувствительные к ротенону активности Комплекса 1.

Энергонезависимые реакции Комплекса I.

Разобщенная ИАОН-оксидазная реакция.

КАВН:убихинон-редуктазная реакция.

Энергозависимые реакции Комплекса 1.

АТР-поддерживаемая реакция обратного переноса электронов.

Сукцинат-поддерживаемая реакция обратного переноса электронов

Гистерезисное поведение Комплекса 1.

Очищенные препараты Комплекса 1.

Ингибиторы Комплекса I.

Ингибиторы, действующие по нуклеотид-связывающим центрам Комплекса I.

Ингибиторы, действующие по хинон-связывающему центру Комплекса I

Механизм электрохимического сопряжения в Комплексе 1.

Определение стехиометрического коэфициента п (Н*/2е) для Комплекса I митохондрий эукариот и бактерий.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Препаративные методы.

Получение митохондрий сердца быка.

Получение субмитохондриальных частиц из митохондрий сердца быка.

Получение активированных и деактивированных субмитохондриальных частиц.

Выращивание бактерий Рагасоссш ёетЫАсат.

Получение препарата суббактериальных частиц Рагасоссш ЛепИпАсат.

Аналитические методы.

Определение белка.

Измерение активности ферментов дыхательной цепи.

Измерение МАЭН-оксидазной активности. а) Полярографическое определение ЫАОН-оксидазной активности. б) Спектрофотометрическое определение КАОН-оксидазной активности.

Измерение сукцинат-оксидазной активности.

Измерение реакций окисления ИАОН различными искусственными акцепторами электронов. а) Измеренине КАОН:(}гредуктазной активности. б) Измерение КАОН:феррицианид-редуктазной активности. в) Измерение КАОН:гексааминорутений-редуктазной активности.

Измерение скорости обратного переноса электронов. а) Аэробное восстановление NAD+ сукцинатом. б) Аэробное восстановление феррицианида сукцинатом.

Измерение активности протон-транслоцирующей трансгидрогеназы в составе СМЧ. а) Измерение ЫАОРН->АРАВ+-трансгидрогеназной активности СМЧ б) Измерение АРАОН-^ЧАБР+-трансгидрогеназной активности СМЧ

Регистрация протон-транслоцирующей активности и окисления NADH

Регистрация мембранного потенциала СМЧ.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Амфифильные ингибиторы Комплекса 1.

Влияние Тритона Х-100 наТЧАОН:акцептор-редуктазные активности, катализируемые Комплексом I в составе СМЧ.

Влияние Тритона Х-100 на ингибирование Комплекса I ротеноном.

Влияние Тритона Х-100 на процессы активации/деактивации Комплекса

Влияние Тритона Х-100 на обратный перенос электронов.

Влияние лаурил сульфата натрия на различные активности СМЧ.

Влияние Тритона Х-100 и лаурил сульфата натрия на активности суббактериальных частиц P. denitrificans.

Транслокация протонов NDH-1 в составе СБЧ бактерии P. denitrificans.

Активация протон-транслоцирующей активности Комплекса I СБЧ

P. denitrificans.

Определение коэфициента п (Н+/2ё) для N ADI1 : у б и х и но н-ре ду ктаз н о й реакции СБЧ.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

Амфифильные ингибиторы Комплекса 1.

Транслокация протонов бактериальным Комплексом 1.

ВЫВОДЫ.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Ушакова, Александра Владимировна

1. Тритон Х-100 специфически и обратимо ингибирует Комплекс I в составе СМЧ митохондрий сердца быка. Тритон Х-100 избирательно действует на прямую и обратную реакции, катализируемые Комплексом I в составе СМЧ. Константы ингибирования K i для прямой и обратной реакций составляют 10 и 50 мкМ, соответственно.2. Действие Тритона Х-100 на Комплекс I аналогично действию другого ингибитора - ротенона. Тритон Х-100 и ротенон конкурируют за место связывания с Комплексом I.3. Лаурил сульфат натрия специфически ингибирует Комплекс I в составе СМЧ митохондрий сердца быка. Лаурил сульфат избирательно действует на прямую и обратную реакции, катализируемые Комплексом 1 в составе

4. Подобраны условия для измерения протон-транслоцирующей активности Комплекса I в составе суббактериальных частиц Р. denitrificans. Для максимальной протон-транслоцирующей активности необходимо присутствие в среде измерения ионов Mg^"^, и «активация» суббактериальных частиц сопряженным окислением N A D H или сукцината.5. Определен стехиометрический коэффициент для протон транслоцирующего КАОНгхинон-редуктазного участка дыхательной цепи Р. denitrificans, равный 4 протонам на одну молекулу окисленного В ы р а ж а ю г л у б о к у ю благодарность А н д р е ю Д м и т р и е в и ч у В и н о г р а д о в у за п р е д л о ж е н н у ю тему и научное р у к о в о д с т в о . Б л а г о д а р ю В е р у Г е о р г и е в н у Гривенникову за н е о ц е н и м у ю п о м о щ ь в работе . Б л а г о д а р ю Э л е о н о р у В л а д и м и р о в н у Г а в р и к о в у за п о м о щ ь в р а б о т е с бактериями . Б л а г о д а р ю всех коллег из н а ш е й л а б о р а т о р и и з а п о д д е р ж к у и т е п л у ю а т м о с ф е р у в лаборатории .Выполнение работы финансировалось Российским фондом фундак4ентальных исследований (гранты 99-04-48082 и 02-04-48679), программой «Ведущие нуачные школы» (грант № 00-15-97798), шведской Королевской академией наук (грант 12557) и Fogarly Inlernalioiial Research Collaboration Award (FIRCA) Grant 1 R03 TW06041.