Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сравнительное изучение Na+-транслоцирующих NADH:хинон оксидоредуктаз из Vibrio harveyi, Klebsiella pneumoniae и Azotobacter vinelandii

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Сравнительное изучение Na+-транслоцирующих NADH:хинон оксидоредуктаз из Vibrio harveyi, Klebsiella pneumoniae и Azotobacter vinelandii"

На правах рукописи

ФАДЕЕВА МАРИЯ СЕРГЕЕВНА

СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ^+-ТРАНСЛОЦИРУЮ1ЦИХ NADH:ХИНОН-ОКСИДОРЕДУКТАЗ ИЗ Vibrio harveyi, Klebsiella pneumoniae И Azotobacter vmelandn

03 00 04-Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 3 MAP 2008

Москва - 2008

003165306

Работа выполнена в отделе Молекулярной энергетики микроорганизмов НИИ физико-химической биологии им А Н Белозерского Московского Государственного Университета им М В Ломоносова

Научный руководитель доктор биологических наук,

Александр Валерьевич Богачев

Официальные'онпоненты доктор биологических наук,

профессор Рената Александровна Звягильская

кандидат биологических наук, доцент Вера Георгиевна Гривенникова

Ведущая организация ФГУН "ГосНИИгенетика"

Защита состоится "31 "марта 2008 г. в "15ч ЗОмин" часов на заседании Диссертационного совета Д 501.001 71 при Московском Государственном Университете имени М В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские юры, МГУ, Ьи0л01ический факультет, аудитория ББА.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета

МГУ

Автореферат разослан

2008 г

Ученый секретарь

Диссертационного совета

Медведева М В

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Многие морские и патогенные микроорганизмы содержат уникальный фермент - натрий-транслоцирующую NADH-хинон-оксидоредуктазу (Na+-NQR), который генерирует на цитоплазматической мембране бактерий первичный электрохимический потенциал ионов натрия Этот белок представляет значительный интерес для биоэнергетики, поскольку его сопря1ающим ионом является Na+, а не протон Кроме того, Na+-NQR широко распространен среди патогенных микроорганизмов, что делает исследование этого фермента актуальным и с медицинской точки зрения При изучении Vibrio cholerae была обнаружена взаимосвязь между уровнем мембранного натриевого потенциала, который является следствием работы фермента, и продукцией факторов вирулентности Поэтому Na+-NQR можно рассматривать как вероятную мишень для создания новых лекарственных препаратов для лечения или предотвращения многих инфекционных заболеваний

Несмотря на интенсивные исследования Na+-NQR, исследователи еще очень далеки от полного понимания механизма его функционирования Более того, все имеющиеся на настоящий момент данные о каталитических свойствах этого белка были получены при изучении Na+-NQR из эволюционно очень близких друг к другу организмов - V alginolyticus, V harveyi и V cholerae При этом абсолютно ничего не известно о свойствах Na -NQR из других микроорганизмов, хотя подобная информация была бы исключительно полезна как для понимания физиологической роли фермента в бактериальной клетке, так и для выявления общих структурных характеристик и закономерностей функционирования Na+-NQR Цели исследования Исходя из выше изложенного, основной целью работы являлось сравнительное изучение свойств натрий-транслоцирующих NADH хинон-оксидоредуктаз из микроорганизмов, обитающих в различных экологических нишах Особое внимание было уделено определению физиологической роли Na+-NQR, сравнительному изучению кинетических параметров данных ферментов, а также анализу роли их консервативных аминокислотных остатков в функционировании белка

Научная новизна В настоящей работе впервые было изучено влияние гаких параметров окружающей среды, как концентрации ионов натрия и разобщителя, значений рН среды роста, а также типа субстрата в присутствии и отсутствии кислорода на экспрессию nqr оперонов V harveyi и

*Список сокращений ДМСО - диметилсульфоксид, К3 - менадион (витамин К3) К„ - константа Мичаэлиса ОНФГ - о-нитрофенич-р-О-галактозид, СБЧ - с^ббакгериальные частицы, TMAO - триметит N-оксид, ЭПР — электронный парамагнитным резонанс СССР - л*-хлоркарбонилцианид фенилгидразон DM - и-додецил мальтозид, dNADH - восстановленный никотннамидгипоксантин динуклсотид, HQNO - 2-н-гептап-4-гидроксихинолин N-оксид Q - убихинон, QH2 - убихинол, Q, - 2,3-димстокси-5-метил-б-изонренил-1,4-бензохинон, NDH-1 - бактериальная Н+-транслоцирующая NADH хинон-оксидоредуктаза гомолог митохондриалыюю Комплекса I, NDH-2 - бактериальная несопряженная NADH хинон-оксидоредуктаза, Na*-NQR - №ч-транслоцирующая NADH хинон-оксидорсдуктаза

Klebsiella pneumoniae Впервые были исследованы каталитические свойства NV-NQR и влияние ингибиторов на данные ферменты из К pneumoniae и Azotobacter vinelandu в сравнении с хорошо исследованным ферментом из V harveyi Определены 4 консервативных остатка цистеина, расположенные внутри трансмембранных а-спиралей, и показана необходимость этих остатков для правильной сборки и функционирования Na+-NQR

Практическая значимость работы Полученные данные о регуляции экспрессии генов, кодирующих Na+-NQR, у различных бактерий Исследование штаммов микроорганизмов, мутантных по этим генам, позволяет приблизиться к пониманию физиологической роли данных ферментов в клетках бактерий Показано, что значение Км по сопрягающему иону у Na-NQR коррелирует с концентрацией ионов натрия в экологической нише микроорганизма - источника фермента Сравнительный анализ геномов исследованных микроорганизмов выявил консервативные остатки, необходимые для функционирования NV-NQR

Апробация работы Результаты работы были доложены на заседании кафедры биохимии биологического факультета МГУ и на биоэнер1 етическом семинаре НИИ ФХБ им А Н Белозерского МГУ, а также на конференции «Ломоносов-2005» (Москва 2005), на XIV Европейской биоэнергетической конференции (Москва, Россия, 2006) и на 32м Конгрессе Федерации Европейских Биохимических Сообществ (Австрия, Вена, 2007) Публикации По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ Структура диссертации Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов, их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы Объем работы составляет 90 страниц, содержит 27 рисунков и 11 таблиц Список литературы включает 91 источник

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Материалы и методы

Штамм V harveyi дикого типа был получен из музея кафедры микробиологии МГУ Штамм К pneumoniae 204 (дикий тип) был получен из коллекции Института стандартизации и контроля биомедицинских препаратов им Л А Тарасевича Непатогенный штамм V cholerae 0395N1-toxТ lacZ был получен от др Хасе Штамм A vinelandu AEIV (дикий тип) был любезно предоставлен проф Нуньес Остальные штаммы были получены в ходе данной работы Использованные в данной работе штаммы V harveyi, V cholerae, К pneumoniae и A vinelandu и плазмиды описаны в табл 1

Получение штаммов с нарушенным синтезом генов и nqrA .lacZ штамма К pneumoniae Фрагменты генов амплифицировали методом ПЦР с Taq полимеразой и соответствующими праймерами Амплифицированные фрагменты клонировали в вектор pGEM-T, где в клонированный фрагмент

вставчяли кассету устойчивости к канамицину, и отбирали конструкцию с одинаковым направлением транскрипции фрагмента гена и кассеты устойчивости Фрагменты «мутируемый ген Km» из плазмиды субклонировали в суицидальный вектор pKNOCK-Tc Полученные плазмиды переносили в клетки с помощью конъюгации с использованием штамма Е coli SMlO/.pir в качестве донора С помощью селекции отбирали клон с инактивацией нужного гена за счет события двойного кроссинговера (чувствительный к тетрациклину) Правильность локализации мутации в хромосоме V harveyi проверяли с помощью ПЦР-анализа Сайт-направленный мутагенез. В качестве матрицы для мутагенеза использовали плазмиду pBADnqr4, несущую полный «gr-оперон из V harveyi под контролем арабинозного промотера [Bogachev et al, 2006] Для внесения каждой мутации конструировали пару соответствующих праймеров (последовательность прямого праймера для каждой пары приведена в табл 1) Для облегчения идентификации мутированных плазмид в три пары праймеров были внесены дополнительные сайты рестрикции Мутагенез осуществляли с помощью набора "QuikChange II XL" (Stratagene) Мутантные плазмиды идентифицировали с помощью рестрикционного анализа или посредством секвенирования ДНК Полученные плазмиды вносили в клетки V cholerae 0395N1 toxT lacZ AnqrA-V с помощью электропорации

Таблица 1 Использованные в данной работе бактериальные штаммы, _плазмиды и праймеры (для сайт-направленного мутагенеза)

Ш гаммы Фенотип Ссылки или источник

MiiKpoopai шимов получения

V harveyi R3 Дикий тип, Rf** получен в работы ходе данной

(' haixeyi R3A10 R3, nqi А Кш, KmKRfK получен в работы ходе данной

V harveyi NDKm34 R3, ndh Km, Km" Rf1' получен в работы ходе данной

V haneyiMTAI2I R3 areb Km, Rf", Km" получен в работы ходе данной

V cholerae 0395N1 Непаюгенныи штамм дикого [Barquera et al , 2002J

toxT lacZ типа, SmR

V cholerae 0395N1 Дnqi, SmR [Barquera et al , 2002]

lox Г lacL Anq/ A-b

К pneumoniae R150 Дикий тип, Rf14 [Bogachev 2004] and Bertsova,

К pneumoniae LZ102 R150 nqr IacZ, Rf", Km" получен в работы ходе данной

A. pneumoniae KND038 R150, nuoB Cm ndh Amp, Cm" ApR Rf получен в работы ходе данной

A vmelandu AEIV Дикий тип [Nunez et al, 2008]

A vinelandu DN165 ndh QTc, Ril* I'cR [Bertsova et al ,2001]

A vinelandu GG4 nqrE Tn5, SpK [Nuñez et al 2008]

Е coli SmlOXpir thi thr leu lonA lac Y supE recA RP4-2-7 с Mu, KmR [Miller & Mekalanos, 1988]

Плазмнды Описание Ссылки или источник получения

pUC19 Век гор для клонирования, Арк Fermentas

pGEM-T Вектор дня клонирования продуктов ПЦР, ApR Promega

pMobZl pUC19 Ф(пдгh-lacL) ori'T, ApR получена в работы ходе данной

pKNOCK-Tc Мобилизуемый суицидальный вектор, 1 cR (Alexeyev 1999)

pBADnqr4 pBAD с ядт-оиероном V harveyi, ApR [Bogachev et al, 2006]

pD_C29A pBAD с и^г-опероном V harveyi с заменой Cys29Ala в субъединице NqrD, ApR получена в работы ходе данной

pDCllll pBAD с n^r-опероном V harveyi с заменой Cysl 1211e в субъединице NqrD, ApR получена в работы ходе данной

pEC26G pBAD с лдг-опероном V harveyi с заменой Cys26Gly в субъединице NqrE, ApR получена в работы ходе данной

pE Cl20G pBAD с nqr-опероном V harveyi с заменой Cysl20Gly в субъединице NqrE, ApR получена в работы ходе данной

Праймер Последовательность

DC29A dir 5 '-GCTGCAGGTTCTTGGTGTAgcTTCTGCTCT TGCAGTAAC

DC 1121 dir S ■-GGTCTTA TCA TCA CGAA TatTA TCGTAA TG GGTCGTGCTGAAGC

EC26G_dir 5 '-GCACTGTCTTTCTTCClAGGTATGgGTACc I TCCTTGt CGTA TC

EC120G dir 5 '-CTGATCACAGTAAACgGcGCcATCTTCG GTGGTG

Выращивание V. harveyi и V. cholerae. Клетки V harveyi и V cholerae выращивали на качалке при 32°С и 250 об /мин в среде FM [Fadeeva et al, 2007] 30 г/л NaCl, 0,75 г/л КС1, 1 г/л (NH^SC^, 1,2 г/л MgS04, 0,05% дрожжевой экстракт, 50 мМ трис-HCl (рН 8,0), 0,4% глицерин и 0,5 мМ КН2РС>4 (для опытов с минимальной средой вместо глицерина добавляли 50 мМ сукцинат) Для измерения р-галактозидазной активности клетки растили до середины экспоненциальной фазы роста Для получения суббактериальных частиц клетки выращивали в течение 12-14 часов

Выращивание клеток К. pneumoniae проводили при 37°С и 250 об /мин в богатой среде LB или минеральной среде М9 Для измерения (3-галактозидазной активности клетки растили до середины экспоненциальной фазы роста Для получения суббактериальных частиц клетки выращивали в течение 12-14 часов

Выращивание клеток A. vinelandu проводили в модифицированной среде Бурка BSN [D'Mello et al, 1994] Клетки выращивали на качалке при 250 об/мин и температуре 32°С Дня получения суббактериальных частиц клетки растили в течение 12-14 часов

Выделение Na+-NQR. Стандартный препарат Na+-NQR из клеток из V harveyi получали, как описано в [Zhou et al, 1999] Рекомбинантный препарат Na+-NQR получали с помощью аффинной хроматографии на Ni-NTA агарозе Суббактериальные частицы получали, пропуская осажденные и промытые бактериальные клетки через пресс Френча (16000 psi) Неразрушенные клетки и крупные обломки осаждали, центрифугируя гомогенат 10 мин при 20000g Осадок отбрасывали, а супернатант повторно центрифугировали в течение 90 мин при 200 000 g Осадок суспендировали в той же среде и гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе Поттера

ЭПР-спектроскония. Измерение ЭПР-спектров проводили на спектрометрах ESP-300 (Bruker) и Е-109Е (Varían) при частоте модуляции 100 кГц Температура образца поддерживалась с помощью гелиевого криостата ESR 900 и контроллера температуры ITC4 (Oxford Instruments), либо с помощью азотного криостата Количественная оценка ЭПР-сигналов проводилась с помощью двойного интегрирования спектров, полученных при ненасыщающих мощностях, с использованием Си2+-ЭДТА в качестве стандарта

Концентрацию белка измеряли "бицинхониновым методом", как описано в [Smith et al, 1985], используя бычий сывороточный альбумин в качестве стандарта

Концентрацию натрия определяли с помощью пламенной фотометрии

Измерение Р-галактозидазной активности проводили, как описано в [Bogachev et al, 1995], используя в качестве субстрата о-нитрофенил-p-D-галактозид (ОНФГ) Концентрацию образовавшегося о-нитрофенола определяли по поглощению при 420 им

Регистрацию окисления NADH, NADPH и dNADH проводили на спектрофотометре Hitachi-557 по изменению оптического поглощения при 340 им при температуре 30°С Для расчетов использовали коэффициент молярной 1КСТИНКЦИИ £340 = 6,22х103 М"' см" Окисление пиридиндинуклеотидов проводили в среде, содержавшей 20 мМ HEPES-Трис, 5 мМ MgS04, 100 мМ КС1, 50 мМ NaCl (рН 8 0) Концентрация восстановленных пиридиндинуклеотидов была равна 150 мкМ

Определение различных металлов в препаратах Na+-NQR проводили с помощью масс-спектрометрического анализа на масс-спектрофотометре Agilent 7500С ICP-MS

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Регуляция экспрессии оперонов, кодирующих Ка'-транслопирующую NADH хинон-оксидоредуктазу у V harveyi и К pneumoniae

Целью данной части нашей работы являлось изучение зависимости экспрессии оперонов nqr морской бактерии V harveyi и энтеробактерии К pneumoniae от концентрации ионов натрия, разобщителя, значения pH среды роста, а также типа субстрата в присутствии и отсутствие кислорода

В клетках V harveyi дикого типа активность собственной ß-галактозидазы не детектировалась при всех использованных условиях выращивания этой бактерии В клетках К pneumoniae дикого типа активность ß-галактозидазы могла быть обнаружена только при наличии в среде роста лактозы в качестве основного источника углерода В присутствии лактозы данная активность была равна ~1 Е/мг белка (мкмоль расщепленного ОНФГ в минуту на мг белка), в то время как в отсутствие лактозы наблюдаемая активность была меньше, чем 0,001 Е Это позволяет для изучения экспрессии ядг-оперонов измерять ß-галактозидазные активности клеток V harveyi и К pneumoniae, несущих конструкции, которые содержат ген lacZ из Е coli под контролем промоторов оперонов nqr В случае V harveyi lacZ был слит с геном nqr А этой бактерии, и данная конструкция Ф{пцгА-1асТ) была внесена в клетки V harveyi на плазмиде pMobZl В случае К pneumoniae ген галактозидазы был слит с опероном nqr этого микроорганизма, и данная конструкция была внесена на хромосомальную ДНК (штамм К pneumoniae LZ 102) Так как об экспрессии nqr оперонов V harveyi и К pneumoniae мы судили по косвенному параметру - значению ß-галактозидазных активностей, то проводилась проверка, насколько эти активности соответствуют действительной экспрессии изучаемых генов Для этого параллельно были измерены ß-галактозидазные активности клеток V harveyi/pMobZl и К pneumoniae LZ 102, выращенных при различных условиях, а также dNADH-оксидазные активности (специфическая активность Na+-NQR) СБЧ, выделенных из этих же клеток Во всех исследованных случаях наблюдалась строгая корреляция между значениями ß-галактозидазных активностей и специфическими активностями Na+-NQR, что указывает на точность отображения активностями ß-галактозидазы степени экспрессии nqr оперонов изучаемых штаммов бактерий Зависимость экспрессии nqr-онеронов V. harveyi и К. pneumoniae от фазы роста этих микроорганизмов.

Как видно на рис 1А, экспрессия конструкции nqr A lacZ в клетках V harveyi/pMobZl практически не меняется в ходе роста данной бактерии Она максимальна в ранней логарифмической фазе роста и лишь незначительно понижается в поздней логарифмической фазе и в раннем стационаре В случае К pneumoniae LZ 102 экспрессия nqr lacZ минимальна в ранней логарифмической фазе роста и значительно повышается в стационарной фазе (рис 1Б) В дальнейшем для изучения влияния различных факторов на

экспрессию nqr клетки V. harveyi и К. pneumoniae отбирались в середине логарифмической фазы роста.

0 12 3 4 5 3 0123456789

Время, час ВремЯ! час

Рисунок 1. Зависимость (З-галактозидазной активиости V. harveyi R3/pMob7,l (А) и К. pneumoniae LZ102 (Б) от фазы роста этих микроорганизмов. Сплошной линией показано увеличение во времени оптической плотности культуры при 600 нм, пунктирной линией -изменение (З-галактозидазной активности во время роста культуры. Здесь и далее 1 F, fl-галактозидазной активности соответствует 1 мкмоль расщепленного ОНФГ в минуту.

Зависимость экспрессии nqr-oneponoe V. harveyi и К. pneumoniae от концентрации ионов натрия, значений рН среды роста и от присутствия в ней протонофора СССР.

Большинство микроорганизмов, обладающих Na'-NQR, относятся к морским или патогенным бактериям, т.е. они обитают в среде с высокой концентрацией Na . В то же время известно, что живые организмы поддерживают низкую внутриклеточную концентрацию ионов натрия. Поэтому вполне вероятно, что основной функцией Na+-NQR является поддержание низкой внутриклеточной концентрации Na+. Для проверки этого предположения мы изучили влияние концентрации ионов натрия в ростовой среде на экспрессию nqr оперонов V. harveyi и К. pneumoniae.

Было обнаружено, что экспрессия nqrk V. harveyi практически не зависит от концентрации NaCl в среде роста. В то же время, экспрессия nqr оперона К. pneumoniae повышается при увеличении концентрации Na' от 0 до 150 мМ. Однако необходимо отметить, что данный эффект крайне незначителен и не превышает 1,5-кратного предела.

Высказывались предположения, что Na+-NQR в клетках бактерий может выполнять защитную роль в условиях низкой AJiu на сопрягающей мембране, например при щелочных значениях рН или в присутствии протонофора [Skulachev, 1989]. Для проверки этой гипотезы была исследована экспрессия идг-оперонов V. harveyi и К. pneumoniae при различных значениях рН ростовой среды и в присутствии различных концентраций разобщителя СССР. Нами были использованы такие значения рН и концентрации СССР, при которых наблюдался стабильный рост бактериальных культур. По результатам исследования, V. harveyi был чуть

более устойчив к щелочным значениям рН, тогда как К. pneumoniae способна переносить большую концентрацию разобщителя в среде роста.

Оказалось, что изменение значений рН ростовой среды практически не оказывало влияния на степень экспрессии nqr-генов как V. harveyi, так и К pneumoniae. Также не было отмечено какой-либо индукции генов nqr при различных концентрациях разобщителя СССР.

Зависимость экспрессии nqr-oneponoe V. harveyi и К. pneumoniae от типа используемого субстрата при росте этих микроорганизмов.

Экспрессия генов различных компонентов бактериальных дыхательных цепей часто зависит от типа используемых при росте источников углерода и энергии, поэтому мы определили влияние некоторых субстратов на степень экспрессии nqr генов (рис. 2).

Рисунок 2. Зависимость ß-гадактозидазной активности клеток У. harveyi R3/pMobZl (А) и К. pneumoniae LZ 102 (Б) от типа используемого субстрата.

В качестве субстратов для обоих микроорганизмов были взяты глюкоза, мальтоза, сахароза, глицерин, маннитол, ацетат, цитрат и сукцинат. Как видно на рис. 2, у обеих бактерий экспрессия nqr ниже при росте на таких «богатых» субстратах, как глюкоза, мальтоза или сахароза, по сравнению с ростом клеток на таких "бедных" субстратах, как сукцинат или ацетат. Такая зависимость обычно объясняется тем, что в первом случае клетка получает достаточно энергии за счет гликолиза, тогда как на бедных субстратах основным источником АТР является окислительное фосфорилирование, т.е. в этом случае необходимо активное функционирование дыхательной цепи. Данная зависимость экспрессии оперонов nqr у V. harveyi и К. pneumoniae от источника углерода является типичной для ферментов бактериальных дыхательных цепей [Park et al., 1995; Bongaerts et al., 1995; van der Rest et al., 2000]. Также примечательно, что экспрессия оперонов nqr в клетках V. harveyi и К. pneumoniae, выращенных на мальтозе или сахарозе, практически не отличается от экспрессии в клетках, выросших на глюкозе. Этот результат указывает, что экспрессия оперонов nqr этих бактерий не находится под контролем катаболитной репрессии.

Зависимость экспрессии nqr-oneponoe V. harveyi и К. pneumoniae от используемых акцепторов электронов дыхательной цепи.

Далее мы изучали влияние различных акцепторов электронов

дыхательной цепи на экспрессию оперона nqr. Для этих целей бактерий растили в анаэробиозе с различными акцепторами электронов (фумарат, ТМАО и нитрат для V. harveyi [Proctor and Gunsalus, 2000]; фумарат, TMAO, DMSO и нитрат для К. pneumoniae) или в присутствии кислорода. Наблюдалась исключительно мощная репрессия nqrA V. harveyi в анаэробных условиях (рис. ЗА) Так, экспрессия nqrA V. harveyi в присутствии 02 была почти в 200 раз выше, чем в анаэробиозе при отсутствии акцепторов электронов. При добавлении фумарата, ТМАО и нитрата были получены промежуточные значения экспрессии nqrA V. harveyi, которые зависели от окислительно-восстановительного потенциала добавленного акцептора (чем выше редокс-потенциал акцептора, тем выше экспрессия изучаемых генов).

В случае клеток К. pneumoniae также наблюдалась репрессия nqr генов при анаэробных условиях роста (рис. ЗБ). Однако, по сравнению с V. harveyi, данная репрессия носила менее выраженный характер, и она не зависела от присутствия в ростовой среде субстратов для анаэробного дыхания этого микроорганизма.

Исследование влияния инактивации гена arcB V. harveyi па экспрессию nqr оперона этого микроорганизма.

По характеру зависимости экспрессии nqr генов V. harveyi от потенциала акцептора электронов дыхательной цепи можно было предположить, что данный оперон находится под контролем регуляторной системы Arc А В [Manukhov et al., 2000; Georgellis et al., 2001; Malpica et al., 2006]. Ранее на данной бактерии никогда не проводили исследования этой регуляторной системы. В частично прочитанном геноме V. harveyi с помощью программы BLAST были обнаружены два гена с высокой степенью гомологии к генам arch и агсВ из Е. coli. В геноме К. pneumoniae гены, гомологичные генам агсА и агсВ из Е. coli, отсутствовали. Этот факт может объяснять отсутствие зависимости экспрессии nqr оперона от редокс потенциала акцептора электрона при анаэробном росте данной бактерии.

Для проверки предположения об участии регуляторной системы АгсАВ в анаэробной репрессии nqr генов у V. harveyi был получен мутантный

Рисунок 3. Зависимость ß-галактозидазной

активности клеток V. harveyi R3/pMobZl (А) и К. pneumoniae LZ 102 (Bj от типа используемых акцепторов электронов дыхательной цепи.

штамм V. harveyi MFA121 с нарушенным синтезом этого белка. Известно, что индукция хинолоксидазы bd-типа Е. coli в микроаэробных условиях роста осуществляется за счет функционирования Агс-системы. Поэтому, для проверки полученного нами штамма V. harveyi MFA121 была исследована индукция цитохрома bd этой бактерии при микроаэробных условиях роста. Как видно на рис. 4, разностный (восстановленный минус окисленный) спектр СБЧ, полученных из клеток мутантного штамма V. harveyi MFA121, в отличие от СБЧ из клеток дикого типа не содержит характерных для цитохрома bd пиков при 595 и 630 нм и провала при 650 нм. Таким образом, инактивация клонированного нами гена приводит к нарушению индукции хинолоксидазы М-типа в микроаэробных условиях роста. Данный результат доказывает, что мутация была внесена именно в ген arcB V. harveyi, а также функциональную активность Агс-системы в клетках этой бактерии.

Рисунок 4. Разностные (восстановленные дитионигом минус окисленные воздухом) спектры СБЧ, полученных из V. harveyi дикого типа и мутантного штамма MFA121 (я/-сВ::Кт). Клетки растили в микроаэробных условиях, спектры нормированы на концентрацию белка 5 мг/мл.

На полученном нами штамме была также изучена регуляция экспрессии nqr-генов в зависимости от типа используемого клетками конечного акцептора электронов для дыхательной цепи. Было показано, что инактивация АгсАВ системы не сказывается на характере анаэробной репрессии nqr генов V. harveyi. Поэтому можно сделать вывод, что Агс-система не участвует в регуляции экспрессии nqr оперона у этого микроорганизма.

Каталитические свойства натрий-транслоцирующих NADH:xhhoh-оксидоредуктаз из V. harveyi, К. pneumoniae и A. vinelandii

Известно, что дыхательная цепь V. harveyi наряду с Na'-NQR содержит также дополнительную NADH-дегидрогеназу NDH-2 типа [Hayashi et al.. 1992], а в дыхательной цепи К. pneumoniae и A. vinelandii кроме Na'-NQR функционируют также ферменты как NDH-1, так и NDH-2 типа [Bcrtsova & Bogachev, 2004; Nunez et al., 2008]. В ходе данной работы нами был получен штамм V. harveyi с инактивированным ферментом NDH-2 типа (NDlvm34), а также штамм К. pneumoniae с инактивированными генами ферментов как NDH-1, так и NDH-2 типа (KND038). Таким образом, СБЧ из этих штаммов окисляют NADH исключительно за счет активности соответствующих Na'-NQR, что делает их удобной моделью для исследования каталитических свойс тв данных ферментов.

Дл и на волны, им

В случае А уте1апс1и мы использовали полученный ранее штамм ОМ 165, не содержащий фермента типа N011-2 [ВеЛвоуэ е1 а1, 2001] В клетках данного штамма присутствуют две различные ЫАОН-дегидрогеназы (ИОН-1 и Ма'-^Я) Как видно на рис 5, (ШАБН-оксидазная активность СБЧ из штамма А \nnelandu дикого типа лишь частично чувствительна к действию роллиниастатина (специфического ингибитора ферментов типа N011-1) В тоже время, сШАОН-оксидазная активность СБЧ из штамма А уте1апс1п с инактивированным Иа'-Т^СЖ полностью чувствительна к этому ингибитору Это свидетельствует о том, что у А щпе1ап<111 использованные низкие концентрации роллиниастатина избирательно подавляют сШАСН-оксидазную активность ЫОН-1 и не влияют на сМАОН-оксидазную активность Таким образом, для измерения специфической

активности Ыа^-ЫрЯ на СБЧ из А тпе\апйи ОТМ165 все измерения скоростей окисления пиридиндинуклеотидов проводили в присутствии 4 мкМ роллиниастатина

Рисунок 5 Зависимость сМАОН-оксидазной активности штамма А \nnelandn АЕ1У (дикии тип) (•), мутангною штамма Л vmeland¡l в04, не содержащего Ыа'-ЫС^ (в) и ревертанта по Ка^С^Л \melcmdii СЫН (А) от концентрации роллиниастатина

Специфичность Na+-NQR из V. harveyi, К. pneumoniae и A. vmelandu по отношению к различным восстановленным пиридиндинуклеотидам.

Известно, что Na+-NQR из различных вибрионов окисляют как NADH, так и dNADH, но не способны с измеримыми скоростями окислять NADPH [Bourne & Rich, 1992, Zhou et al, 1999] Как видно из табл 2, аналогичная картина наблюдалась и для Na+-NQR из К pneumoniae и A vinelandn, т е все исследованные в данной работе ферменты типа Na+-NQR обладают сходной субстратной специфичностью по отношению к пиридиндинуклеотидам Таблица 2 NADH-, dNADH- и NADPH-оксидазные активности Na+-NQR, измеренные на СБЧ полученных из разных бактерий Значения активности даны в мкмоль окисленного (d)NAD(P)H в минуту на мг белка

Источник СБЧ активность

NADH dNADH NADPH

V harveyi 0,8 0,9 <0,005

К pneumoniae 0,24 0,26 <0,003

A vmelandu 1,1 1,2 <0,005

ролпиниастатин, мкМ

Зависимость активности Na+-NQR из различных микроорганизмов от концентрации ионов натрия.

Na+-NQR абсолютно специфична по отношению к Na+, и в отсутствии этого иона не способна к восстановлению хинона [Hayashi et al, 2001, Bogachev & Verkhovsky, 2005] Известно, что при физиологических условиях (т е при высоких значениях ионной силы) величина Км по натрию для этого фермента = 3 мМ Однако данные значения Км определялись лишь для Na+-NQR из различных морских вибрионов [Unemoto et al, 1977, Bogachev et al, 2001] или из патогенной бактерии Haemophilus influenzae [Hayashi et al, 1996J, те для микроорганизмов, живущих при высокой концентрации Na+ В то же время, энтеробактерия К pneumoniae и, особенно, почвенная бактерия A vinelandu обитают в условиях, при которых концентрация Na+ может быть очень низкой Поэтому было интересно сравнить значения KMNa для Na*-NQR из всех трех рассматриваемых микроорганизмов

Как видно на рис 6, зависимость активностей Na'-NQR из всех исследованных бактерий от концентрации ионов натрия представляет собой гиперболу Величина кажущейся KMNa для Na+-NQR из V harveyi составляла 2,7 мМ В го же время, значение кажущейся KMNa у Na+-NQR из К pneumoniae снижается до 0,67 мМ, a Na*-NQR из A vinelandu обладает наибольшим сродством к этому иону с кажущимся Км ~ 0,1 мМ Таким образом, наблюдается корреляция между величиной кажущейся KMNa и концентрацией Na' в характерной для каждого микроорганизма среде обитания, т е Na+-NQR из трех изученных бактерий адаптирована к соответствующим условиям функционирования in vivo

Рисунок 6 Зависимость активности Na+-NQR из V harveyi (•), К pneumoniae (■), и Л \inelandu (Ж) от концентрации ионов натрия Максимальные значения активности (100%) преде швлены в таблице 2

Ингибироваиие Na+-NQR из V. harveyi, К. pneumoniae и A vinelandu под действием HQNO

Одним из наиболее часто применяемых ингибиторов Na+-NQR является HQNO Несмотря на то, что это соединение способно ингибировать многие хинон-оксидоредуктазы, Na+-NQR из различных вибрионов чувствительна к очень низким концентрациям HQNO, что позволяет использовать данное вещество в качестве специфического ингибитора этого класса ферментов [Tokuda & Unemoto, 1984, Zhou et al , 1999, Barquera et al, 2002] В соответствии с полученными ранее данными, субмикромолярные

концентрации HQNO ингибировали Na+-NQR из V harveyi (I0 5 = 0,13 мкМ, рис 7) Na+-NQR из К pneumoniae также чувствительна к низким концентрациям HQNO, хотя у данного фермента сродство к этому ингибитору несколько хуже (105 = 0,55 мкМ) В то же время, в присутствии роллиниастатина NADH-оксидазная активность СБЧ из A vinelandn DN165 ингибировалась лишь в микромолярной области концентраций HQNO (рис 7) Те же концентрации HQNO ингибировали NADH-оксидазную активность СБЧ из A vinelandn штамма GG4, не содержащего фермента типа Na+-NQR (данные не представлены) Таким образом, Na+-NQR из A vinelandn, в отличие от ферментов этого типа из V hatveyi и К pneumoniae, устойчива к действию низких концентраций HQNO

Ипгибировапие Na+-NQR из V. harveyi, К. pneumoniae и A vinelandn ионами серебра и N-этилмалеимидом

Известно, что Na+-NQR из V alginolyticus чувствительна к субмикромолярным концентрациям Ag+ [Asano et al, 1985], а так же к некоторым другим ионам тяжелых металлов [Bourne & Rich, 1992] В соответствии с этим, как видно на рис 8, NADH-оксидазная активность СБЧ из V harveyi NDKm34 (Andh) полностью подавляется при добавлении 1 мкМ Ag' В то же время, NADH-оксидазная активность СБЧ из V harveyi R3A10 (Дnqr) полностью устойчива к этой концентрации ионов серебра В использованных нами экспериментальных условиях Na+-NQR из V harveyi ингибировался под действием Ag+ с кажущейся Io 5 ~ 0,1 мкМ

В то же время, активность Na+-NQR из A vinelandn намного менее чувствительна к действию ионов серебра Добавление 1 мкМ Ag* приводило лишь к частичному и очень медленному подавлению соответствующей NADH-оксидазной активности (см рис 8) Как видно на рис 8, Na+-NQR из К pneumoniae оказалась полностью устойчивой к действию этого ингибитора

Аналогичные результаты были получены и при изучении действия модификатора SH-групп - N-этитмалеимида (NEM) активность Na+-NQR из V harveyi быстро подавлялась в присутствии 5 мМ N-этилмалеимида (NEM) В гоже время, 5 мМ NEM ингибировал Na+-NQR из A vinelandn очень

Рисунок 7 Влияние HQNO на активности Na+-NQR из V harveyi (•), К pneumoniae (■) и А vinelandn (А)

[HQNO], мкМ

Рисунок 8 Ингибирование ионам] Ag+ NADH-оксидазньг

активностей на (а) СБЧ полученных из V harveyi R3A1i (Anqr), (б) СБЧ, полученных из \ harveyi NDKm34 (Дndh), (г) СБЧ полученных из К pneumonia KND038 (Лпио A ndh), или (в) СБЧ полученных из A vmelandu DN16 (Дndh), к которым был добавле! роллиниастатин Добавки AgNO 1 мкМ

медленно и лишь частично, и это соединение не оказывало действия на фермент из К pneumoniae

Ингибирование Na+-NQR из V. harveyi, К. pneumoniae и A. vinelandii под действием дифештиодониума.

Известно, что дифенилиодониум (DPI) способен ингибировать различные флавин-содержащие оксидоредуктазы за счет ковалентной модификации изоаллоксазинового кольца флавиновой простетической группы Данная модификация DPI происходит лишь с восстановленной, но не с окисленной формой флавина

Действие DPI на Na+-NQR никогда ранее не изучалось Нами показано, что хинон-редуктазная активность Na+-NQR из V harveyi быстро ингибируется в присутствии 50 мкМ DPI Этот ингибитор сходным образом инактивировал также Na+-NQR из К pneumoniae и A vmelandu Для более подробного изучения действия DPI на Na+-NQR нами использовались СБЧ из

V harveyi, а также очищенный препарат этого белка

Известно, что Na+-NQR содержит по крайней мере три различных флавиновых простетических группы - нековалентно связанный FAD в NADH-дегидрогеназном участке белка (в субъединице NqrF), а также два ковалентно связанных остатка FMN (в субъединицах NqrB и NqrC) [Hayashi et al, 2001, Bogachev & Verkhovsky, 2005] Поэтому было важно установить, какой из этих флавинов подвержен модификации под действием DPI Как видно на рис 9, скорость инактивации NADH-оксидазной активности СБЧ из

V harveyi NDKm34 (Andh) линейно зависит от концентрации DPI с константой скорости ингибирования равной 420 М'1 сек*1 В то же время, NADH-дегидрогеназная активность этих же СБЧ ингибируется в присутствии DPI значительно медленнее, с константой скорости ингибирования, равной лишь 80 М'1 сек"1 Эти данные могут указывать на то, что основное место действия DPI расположено после NADH-дегидрогеназного участка этого белка Однако, соотношение NADH-дегидрогеназной и хинон-редуктазной активностей Na+-NQR не изменялось во времени при инкубации фермента в присутствии NADH и дифенилиодониума, то есть в этом случае происходила одновременная параллельная инактивация обеих этих активностей (см рис

9) Эги данные означают, что место действия дифенилиодониума локализовано в NADH-дегидрогеназном участке Na+-NQR, а различие констант скоростей инактивации NADH-дегидрогеназной и хинон-редуктазной активностей Na+-NQR связано лишь с различным стационарным уровнем восстановленности этого фермента при катализе данных активностей Таким образом, по-видимому, основной мишенью для DPI в Na+-NQR является нековалентно связанный FAD Это хорошо согласуется с тем, что данный кофактор принимает электроны непосредственно с NADH, т е он должен быть хорошо доступен к водной фазе

Также были исследованы ЭПР-спектры модифицированных дифенилиодониумом препаратов Na+-NQR Показано, что полная инактивация ферментативных активностей Na+-NQR под действием DPI не приводит к изменению величины радикальных сигналов как в окисленном, так и в восстановленном дитионитом ферменте (данные не представлены) Таким образом, дифенилиодониум, по-видимому, не способен к модификации ковалентно связанных остатков FMN

Рисунок 9 Ишибирование активностей Na+-NQR из V harveyi под действием DPI (Л) Зависимость скорости ингибирования NADH-оксидазной (■), и NADH-дегидрогеназнои (•") активности Na+-NQR от концентрации DPI (Б) NADH-оксидазпая и NADH К3 оксидоредуктазная активности СБЧ из V harveyi NDKm34 Добавки К3, 50 мкМ, DPI, 50 мкМ Изменения оптической плотности, вызванные добавкой Кз, вычит&ти для большей наглядности Значения показывают специфические активности Na+-NQR в нмоль окисленною NADH в мин на mi белка

Сайт-направленный мутагенез консервативных остатков цистенна в субъединицах NqrD и NqrE №+-транслоцнрующей NADH:xuhoh-окендоредуктазы

Анализ первичных последовательностей субъединиц ¡Sa-траниюцирующих NADH хинон-оксидоредуктаз и родственных им белков.

Субъединица NqrF NQR-комплекса из V harveyi содержит 8 остатков цистеина Известно, что четыре из них (Cys-69, Cys-75, Cys-78 и Cys-110) вовлечены в формирование 2Fe-2S кластера [Barquera et al , 2004] Из оставшихся четырех остатков цистеина лишь один (Cys-377) является консервативным и присутствует во всех известных последовательностях

субъединиц NqrF Так как данная субъединица ответственна лишь за натрий-независимую NADH-дегидрогеназную функцию фермента [Turk et al, 2004, Barquera et al, 2004], мы далее не исследовали роль этого консервативного цистеинового остагка Субъединицы NqrA, NqrB и NqrC Na'-NQR-комплекса из V harveyi содержат 5, 2 и 1 остаток цистеина, соответственно Однако все они не являются консервативными и отсутствуют у многих представителей этого класса ферментов В тоже время, субъединицы NqrD и NqrE содержат по два абсолютно консервативных остатка цистеина (Cys-29 и Cys-112 в субъединице NqrD, Cys-26 и Cys-120 в субъединице NqrE) Более того, данные остатки присутствуют также и в последовательностях всех известных на сегодняшний день гомологичных NQR ферментативных комплексах, например, в субъединицах RnfE и RnfA комплекса RNF из различных бактерий, а также в субъединицах МА0662 и МА0663 натрий-зависимой ферредоксин метанофеназин-оксидоредуктазы из археи Methanosarcina aceíivorans

Согласно полученным топологическим моделям субъединиц RnfE и RnfA [Saaf et al, 1999], а также субъединиц NqrD и NqrE [Duffy & Barquera, 2006], все четыре консервативных остатка цистеина этих белков расположены внутри грансмембранных a-спиралей, Таким образом, in vivo в пространственной структуре белкового комплекса они могут занимать соседнее положение и оказаться способными к связыванию какого-то иона металла или к образованию дисульфидных мостиков

Анализ содержания ионов металлов в Na-транслоцирующей NADH:xunoH-0KcudopedyKma3e из V harveyi

В ходе данной работы было проведено исследование содержания ионов металлов в различных препаратах Na'-NQR из V harveyi с помощью масс-спектрометрического анализа В соответствии с тем, что Na+-NQR содержит 2Fe-2S кластер в качестве простетической группы, в различных препаратах этого белка определялось большое количество железа (650-780 нг Fe на мг белка), что соответствует 2,5-3,0 атомам железа на один Naf-NQR-комплекс Все остальные исследованные металлы (Со, Ni, Cr, Zn, Ti, Cd, Mn, Mo, Ag, W, V, Se) присутствовали в Na+-NQR в крайне низких количествах (< 0,05 атома металла на один NV-NQR-комплекс)

Известно, что в состав Fe-S кластера Na+-NQR входят два атома железа [Turk et al, 2004, Barquera et al, 2004], в то время как в данной работе определялось присутствие 2,5-3,0 атомов железа на один комплекс Na+-NQR Таким образом, Na+-NQR теоретически может содержать дополнительную простетическую группу, содержащую один атом железа, наподобие Fe-S центра рубредоксина Данный центр в окисленном состоянии обладает характерным спектром ЭПР с основным ромбическим сигналом при g-4,3, а также линиями при g~-9 [Peisach et al, 1971]

ЭПР спектр окисленного препарата Na+-NQR наряду с радикальным сигналом при g=2,00 также содержит ромбический сигнал в области g=4,3 (но не в области g=9, данные не представлены) Однако концентрация спина

в этом сигнале была значительно меньше, чем в радикальном сигнале (для приведенного спектра с соотношением меньшим, чем 1 10, концентрацию спина в радикальном сигнале определяли при мощности 10 мкВт) Также данное соотношение варьировало для различных препаратов белка Эти данные позволяют нам описать сигнал с g=4,3 как примесное железо (junk iron), и, таким образом, заключить, что Na+-NQR содержит лишь одну металл-содержащую простетическую группу - 2Fe-2S кластер Сайт-направленный мутагенез консервативных остатков цистеина в субъединицах NqrD и NqrE Na1 -тран ело цирую шей NADH:xuhoh-оксидоредуктазы us V. harveyi

Для проверки функциональной роли четырех консервативных остатков цистеина в субъединицах NqrD и NqrE была проведена сайт-специфическая замена этих остатков В дыхательной цепи морских вибрионов присутствуют две различные NADH хинон-оксидоредуктазы -NQR и NDH-2 [Hayashi et al, 1992, Fadeeva et al, 2007] Известно, что различные №+-транслоцирующие NADH хинон-оксидоредуктазы способны окислять как NADH, так и его аналог — dNADH, в то время как несопряженные NADH-дегидрогеназы (NDH-2) окисляют только NADH (но не dNADH) [Bertsova & Bogachev, 2004] Таким образом, dNADH-оксидазную и dNADH К3-оксидоредуктазную активности СБЧ из бактерий рода Vibrio можно использовать для определения хинон-редуктазной и NADH-дегидрогеназной активностей Na+-NQR, соответственно

Как видно из табл 3, СБЧ из V cholerae дикого типа катализируют dNADH К3-оксидоредуктазную и dNADH-оксидазную реакции, причем последняя активность стимулируется ионами натрия и полностью чувствительна к специфическому ингибитору Na'-NQR - HQNO Соотношение dNADH К3-оксидоредуктазной и dNADH-оксидазной активностей составляло приблизительно 1,8 1 В то же время, мутантный штамм V cholerae, не содержащий генов идт-оперона, уже не был способен к окислению dNADH при сохранении нормальной NADH-оксидазной активности Введение в данный штамм плазмиды pBADnqr4, несущей шесть генов /zqr-оперона из V harveyi приводило к частичному восстановлению dNADH Кз-оксидоредуктазной активности, а также №+-зависимой и HQNO-чувствительной dNADH-оксидазной активности Так как идт-оперон на плазмиде pBADnqr4 находится под контролем арабинозного промотера, то добавление L-арабинозы к ростовой среде приводило к значительному увеличению dNADH К3-оксидоредуктазной и dNADH-оксидазной активностей Однако, в этом случае соотношение данных активностей было уже очень высоким (9,2 1), что указывает на то, что сверхэкспрессия nqr-оперона приводит лишь к частичной правильной сборке изучаемого ферментативного комплекса

Как видно из табл 3, СБЧ из Anqr штамма V cholerae с плазмидами pD_C29A, pD Cl 121, pE_C26G или pE_C120G, несущими идг-опероны V harveyi с мутированными остатками цистеина (Cys-29 и Cys-112 в

субъединице ИцгО, СуБ-26 и Су5-120 в субъединице ЫягЕ, соответственно) способны к осуществлению ёК'АОН К3-оксидоредуктазной активности, но не сПЧАОН-оксидазной активности Выращивание этих штаммов в присутствии Ь-арабинозы приводило к значительному увеличению ¿ИАБН К5-оксидоредуктазной активности Также после индукции Ь-арабинозой наблюдалась и небольшая сМАОН-оксидазная активность Однако, как видно из табл 3, эта активность не стимулировалась ионами натрия и не подавлялась в присутствии Н(^0 Таким образом, замены консервативных остатков цистеина в субъединицах ИцгО и ^гЕ приводят к нарушению Ка'-зависимой и HQNO-чyвcтвитeльнoй хинон-редуктазной активности фермента, не затрагивая его способности к взаимодействию с (с1)КтАЕ>Н и К3

В качестве отрицательного контроля можно рассмотреть полученных нами мутантов, у которых была проведена сайт-специфическая замена консервативных остатков Е1430 и N3890 в субъединице К^гВ Скорости окисления NADH и сШАПН суббактериальными частицами, выделенными из полученных мутантов, и стимуляция аЫАОН-оксидазной активности ионами натрия были идентичными скоростям, полученным на штамме V сИокгае кпцг/ рВАВгцг4 Эти результаты означают, что данные остатки не являются критическими при функционировании фермента

Таблица 3 Скорости окисления NADH и dNADH суббактериальными частицами, выделенными из различных штаммов V cholerae_

Штамм dNADH-оксидаза Активности1 dNADH K3-оксидоредуктаза NADH-оксидаза Соотношение'

V cholerae дикий тип 1,9 (+)*(+)** 3 5 2,5 1 8

V cholerae Anqr 0 0,008 0 56 -

Без добавления арабинозы

V cholerae Anqr/ рВ \Dnqr4 0,018 (+)♦(+)** 0,045 2,0 2,5

V cholerae Anqr/ pD_C29A 0 0,055 1,7 -

V cholei ae Anqr/ pD С1121 0 0,10 0,83 -

V cholerae Anqr/ pE C26G 0 0,095 0 42 -

V cholerae Anqr/ pE_C¡20G 0 0,11 0,70 -

С добавлением арабинозы

V cholcrae Anqr/ pB ADnqr4 0,59 (+)»(+)« 5,4 1,8 9,2

V cholerae Anqr/ pD_C29 A 0,013 (-)*(-)** 2,8 0,70 -

V cholerae Anqr/ pD_C112I 0,019 (-)*(-)*" 3,1 0 67 -

V cholerae Anqr/pE_C26G 0,017 (-)*(-)" 3,1 0,65 -

V cholcrae Anqr/ pE C120G 0,042 (-)*(-)»• 5,1 1,0 -

* стимуляция активности ионами нагрия ** чувствительность активности к 1 К^'О (4 мкМ)

'значения активностей предел авчены в мкмо 1ь окисленного (с1)МЛ1Л 1 за 1 мин на I мг белка Соотношение сМАОН К3-оксидоредуктазной и <1\\ЛГ)| ¡-оьсилазной активностей

Характеризация выделенных препаратов N0*-транслоцируннцей 1^АТ)Н:хиион-оксидоредуктазы с заменами консервативных остатков цистеина в субъединицах NqrD и ЩгЕ

С помощью аффинной хроматографии препараты Ка+-Ж.Ж V катеуп (как дикого типа, так и мутантных по консервативным остаткам цистеина белков) были выделены из СБЧ соответствующих клеток V с!ю1егае,

20

выращенных как в присутствии, так и в отсутствии L-арабинозы. В соответствии с полученными ранее результатами [Nakayama et al., 2000; Barquera al., 2002], Na'-NQR дикого типа содержал ковалентно связанные флавины. Как видно на рис, 10, ЭПР-спектры данного белка выявляют присутствие в нем двух радикальных сигналов от разных флавосемихинонов (один в окисленном, другой в восстановленном препарате), а также линии от 2Fe-2S кластера. Важно отметить, что при выращивании клеток V. cholerae / pBADnqr4 в присутствии арабинозы, в выделенном белке соотношение концентраций спина в сигналах от 2Fe-2S кластера и радикала было » 1, т.е. наблюдался избыток Fe-S кластера по отношению к флавосемихинонам. Данных факт подтверждает сделанное выше заключение о том, что Na'-NQR приводит лишь к частичной правильной сборке

Рисунок 10. ЭПР спектры препарата Na'-NQR с заменой Cysll2Ile в субъсдинице NqrD (а) в сравнении с препаратом Na*-NQR дикого типа (Ь). (А) - окисленные препараты, (Б) -восстановленные дитионитом

препараты. Условия ЭПР: частота -9,414 ГТц; мощность - 100 мкВт, температура образца - 45 К; амплитуда модуляции - 6,7 Гаусс. Спектры нормированы на концентрацию белка 5 мг на I мл.

данного ферментативного комплекса.

\ 1«

—^J > / \

\ F У/

М ш и и гное IIÚ1IE, Гауе

М агнишое nuae. Га> с

При выращивании клеток V. cholerae в присутствии L-арабинозы, выделенные мутантные препараты Na+-NQR содержали ковалентно связанные флавины, однако в количествах, заметно меньших по сравнению с белком дикого типа. В то же время, эти препараты не демонстрировали радикальных ЭПР-сигналов ни в окисленном, ни в восстановленном состоянии, и из ЭПР-видимых простетических групп в них детектировался только сигнал от 2Fe-2S кластера (рис. 10). Таким образом, замена консервативных остатков цистеина в субъединицах NqrD и NqrE сопровождается потерей возможности ковалентно связанных флавинов Na'-NQR стабилизировать флавосемихинонное состояние, т.е. приводит к неправильной сборке ферментативного комплекса.

В препаратах Na*-NQR, содержащих замены консервативных остатков цистеина субъединиц NqrD и NqrE, выделенных из неиндуцированных клеток V. cholerae (выращенных в отсутствии L-арабинозы), ковалентно связанные флавины не детектировались. Более того, в этих препаратах наблюдалось пониженное содержание субъединиц NqrB и NqrC. То есть, данные замены также приводят и к значительному ускорению деградации изучаемого белка.

Совокупность полученных данных позволяет заключить, что изученные консервативные остатки цистеина субъединиц NqrD и NqrE необходимы для осуществления №+-зависимой активности Na+-NQR Однако на сегодняшний день невозможно установить, связано ли это с участием данных остатков в формировании дополнительной редокс-активной простетической группы Na+-NQR или с их ролью в процессе сборки и стабильности этою ферментативного комплекса Таким образом, необходимы дальнейшие работы для выявления роли консервативных цистеиновых остатков Na -NQR в электронном транспорте и транслокации ионов натрия

ОБСУЖДЕНИЕ

До настоящего времени остается неясной физиологическая функция Na+-NQR, а именно причина появления у некоторых микроорганизмов первичных натриевых помп, в то время как у большинства других бактерий натриевый потенциал формируется за счет вторичных процессов (Na+/H+-антипортеров) В данной работе мы решили исследовать влияние различных факторов на регуляцию экспрессии генов Na+-NQR морской бактерии V harveyi и энтеробактерии К pneumoniae и, таким образом, проверить различные гипотезы о физиологической роли Na+-NQR

Считается, что метаболизм прокариот в основном регулируется на уровне экспрессии генов, то есть соответствующие белки синтезируются только в тех условиях, при которых они необходимы для жизнедеятельности клегки Поэтому изучение зависимости экспрессии гена, кодирующего какой-то белок, от условий окружающей среды может помочь в понимании физиологической роли данного белка в бактериальной клетке В данной работе проведено исследование зависимости экспрессии и^г-оперона V harveyi от условий роста этого микроорганизма Показано, что такие параметры как концентрация NaCl, значение pH и присутствие разобщителя в ростовой среде практически не оказывают влияния на экспрессию изучаемых генов В то же время экспрессия nqr V harveyi в значительном степени зависит от того, какой субстрат используется этой бактерией в качестве основного источника энергии Особенно сильное влияние на экспрессию nqr V harveyi оказывает доступность акцепторов электронов для дыхательной цепи и значения их окислительно-восстановительных потенциалов Подобный характер регуляции типичен для генов, кодирующих компоненты бактериальных электрон-транспортных цепей Таким образом, по-видимому, основной функцией Na -NQR у V harveyi является запасание энергии при окислении NADH дыхательной цепью У большинства бактерий данная функция выполняется не Na+-NQR, а протон-транслоцирующей NADH хинон-оксидоредуктазой (NDH-1) Интересно отметить, чго характер регуляции экспрессии генов NDH-1 у Е coli [Bongaerts et al, 1995] очень похож на описанные в данной работе условия индукции/репрессии Na+-NQR

у V harveyt, что также может указывать на сходные функции, выполняемые этими двумя ферментами

Иными словами, нам не удалось найти каких-то специфических условий индукции Na'-NQR, отличающих этот фермент от других NADH хинон оксидоредуктаз дыхательных цепей прокариот Возможно, это связано с тем, что Na+-NQR является единственным энергозапасающим ферментом NADH-дегидрогеназного участка дыхательной цепи этой бактерии, что может ограничивать его регуляцию при различных условиях роста Поэтому в качестве второго объекта наших исследований мы использовали энтеробактерию К pneumoniae, так как дыхательная цепь этого микроорганизма содержит представителей всех трех основных типов NADH хинон-оксидоредуктаз - NaJ-NQR, NDH-1 и NDH-2 [Bertsova & Bogachev, 2004] Однако, регуляция экспрессии идг-оперона К pneumoniae в общих чертах оказалась весьма сходной с таковой у V harveyi

Наибольшее влияние на экспрессию nqi обоих исследованных микроорганизмов оказывала доступность акцепторов электронов для дыхательной цепи Характер анаэробной репрессии nqrA V harveyi указывал на возможное участие в этом процессе регуляторной Агс-системы, поэтому в геноме V harveyt был найден и инактивирован ген, гомологичный гену arcli из Е coli Оказалось, что инактивация рецепторного белка АгсВ этого микроорганизма никак не сказывалась на экспрессии изучаемого гена Таким образом, данная анаэробная репрессия nqr осуществляется за счет активности какой-то другой, еще не установленной регуляторной системы, идентификация которой должна быть предметом дальнейших работ

Также интересно отметить, что концентрации NaCl, использованные для обеих бактерий, заметно отличались Морская бактерия V harveyi способна расти при очень высоких концентрациях NaCl (вплоть до 1М), но не переносит уменьшения концентрации ионов натрия ниже 150 мМ Другие соли, например, КС1, не могут заменить эффекта хлористого натрия В тоже время энтеробактерия К pneumoniae способна расти при очень низких концентрациях натрия (вплоть до микромолярных значений, присутствующих в других компонентах среды в качестве примесей), но практически останавливала рост при концентрации этого иона выше 300 мМ

Исторически сложилось так, что все данные о структурных и кинетических характеристиках Na+-NQR были получены на ферментах из V alginolyticus, V harveyi и V cholerae, которые эволюционно очень близки друг к другу, и данные о свойствах одного фермента, по-видимому можно отнести и к Na+-NQR из двух других бактерий Однако не ясно, насколько отличаются друг от друга свойства Na'-NQR (например, Км по натрию) из более эволюционно отдаленных микроорганизмов, обитающих в различных экологических нишах с сильно отнимающимися концентрациями натрия в среде обитания

Поэтому па следующем этапом нашего исследования был проведен сравнительный анализ каталитических свойств Na+-NQR из морской

бактерии V harveyi, энтеробактерии К pneumoniae и почвенного микроорганизма A vinelandn Было показано, что сродство ферментов к ионам натрия увеличивается в ряду V harveyi, К pneumoniae и A vinelandn Так, самое низкое сродство (Км= 2,7 мМ) к Na+ характерно для Na+-NQR, выделенного из бактерии V harveyi, обитающей в среде с концентрацией этого иона, равной 0,5 М Сродство фермента из энтеробактерии К pneumoniae заметно выше - Км=0,67 мМ Еще выше сродство к ионам натрия у Na+-NQR, выделенного из почвенной бактерии A vinelandi (Км=0,1 мМ)

Также показано, что ферменты из различных бактерий значительно различаются по чувствительности к ингибиторам Так, NaT-NQR из А vinelandn практически не чувствителен к HQNO, a Na'-NQR из К pneumoniae полностью устойчив к действию Ag+ и NEM Ранее было показано, что и такой высокоаффинный ингибитор Na+-NQR из V harveyi как корормицин не оказывает действия на гомологичный фермент из Н influenzae [Hayashi et al, 2002] Все исследованные ферменты типа Na'-NQR оказались чувствительны к DPI, который ковалентно модифицирует FAD на субъединице NqrF, при этом модификации FMN, принадлежащих субъединицам NqrB и NqrC, не происходит Однако данный ингибитор малоспецифичен Так, известно, что аналог DPI хорошо взаимодействует гакже с ферментами NDH-1 и NDH-2 типа [Majander et al, 1994, Roberts et al, 1995] Таким образом, основным уникальным свойством Na'-NQR, отличающим его от остальных NADH-дегидрогеназ, является специфическая зависимость активности данного фермента от концентрации ионов натрия Однако важно отметить, что и данное свойство Na+-NQR может быть труднодетектируемым, так как сродство к ионам натрия у этого белка может оказаться очень высоким, особенно у бактерий, живущих при низкои концентрации этого иона

Ранее в нашей группе было установлено, что редокс-потенциалы всех оптически детектируемых кофакторов не зависят от концентрации ионов натрия Это противоречило тому факт>, что сродство к Na+ зависело от степени восстановленное!и фермента восстановленный фермент обладал примерно в 1000 раз более высоким сродством по сравнению с окисленным ферментов (30 мкМ по сравнению с 24 мМ) Для объяснения полученных результатов нами было выдвинуто предположение, что Na+-NQR содержит какую-то дополнительную простетическую группу с натрий-зависимым редокс потенциалом Изменение редокс состояния данной группы должно приводить к очень незначительным изменениям поглощен™ света в видимом диапазоне Прежде всего, такими оптическими свойствами обладают некоторые металлы с переходной валентностью, связывание которых с белками чаще всего осуществляется за счет остатков цистеина, а также данные остатки, способные к образованию дисульфидных мостиков При анализе первичных последовательностей субъединиц Na+-NQR из разных организмов были определены 4 консервативных остатка цистеина, расположенные внутри трансмембранных а-спиралей

Нами предполагалось, что изученные консервативные остатки цистеина могут принимать участие в формировании дополнительной редокс-активной простетической группы Na'-NQR Однако, эти остатки оказались необходимы для правильной сборки и (или) стабильности этого фермента, что подтверждает их важность в функционировании фермента Поэтому гипотезу о том, что данные остатки цистеина могут играть роль дополнительного невидимого спектрально редокс кофактора, оказалось невозможно проверить напрямую с помощью саит-специфического мутагенеза Таким образом, необходимы дальнейшие работы для выявления роти этих остатков в электронном транспорте и транслокации ионов натрия

ВЫВОДЫ

1 Такие параметры как концентрация NaCl, значение рН и присутствие разобщителя в ростовой среде практически не оказывают влияния на экспрессию nqr генов V harveyi и К pneumoniae, кодирующих Na+-транслоцирующую NADH хинон-оксидоредуктазу

2 Экспрессия nqr V harveyi и К pneumoniae в значительной степени зависит от того, какие субстраты используются этими бактериями в качестве основного источника энергии Особенно сильное влияние на экспрессию nqr V harveyi оказывает доступность акцепторов электронов для дыхательной цепи и значения их окислительно-восстановительных потенциалов Установлено, что система АгсАВ не участвует в pel уляции экспрессии генов nqr V harveyi

3 Определены кинетические характеристики Ыаь-транслоцирующих NADH хинон-оксидоредуктаз из V harveyi, К pneumoniae и А vmelandii константы Михаэлиса по ионам натрия, а также параметры ингибирования этих ферментов дыхательным ингибитором 2-гептил-4 гидроксихинолин-Ы-оксидом Показано различие действия SH-реагентов (ионов серебра и N-этилмалеимида) на ферменты из этих бактерий

4 Дифенилиодониум модифицирует только нековалентно присоединенный FAD, расположенный на субъединице NqrF, при этом не происходит модификации остатков FMN, принадлежащих субъединицам NqrB и NqrC

5 При анализе первичных последовательностей субъединиц Na+-NQR из разных организмов определены 4 консервативных остатка цистеина расположенные внутри трансмембранных а-спиралей С помощью сайт-направленного мутагенеза показана необходимость этих остатков для правильной сборки и функционирования К'а'-транслоцирующей NADH хинон-оксидоредуктазы

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Фадеева М С (2005) Анализ мембранной топологии субъединицы NqrC натрийтранслоцирующей NADH хинон оксидоредукгазы Сборник тезисов XII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» Секция Биоинженерии и Биоинформатики, Подсекция Биоинженерии, Москва, 12-15 апреля, с 49-50

2 Фадеева М С (2005) Исследование зависимости экспрессии NQR-оперонов Vibrio hatveyi и Klebsiella pneumoniae от усчовий внешней среды Системная биология и биоинженерия Материалы международной школы-конференции молодых ученых Москва, 28 ноября — 2 декабря, с 66-68

3 Fadeeva M.S , Yakovtseva Y А , Bertsova Y V, Bogachev A V (2006) Expression regulation of the идг-operons in Vibrio harveyi and Klebsiella pneumoniae Biochim Biophys Acta, Suppl S, pp 160-161

4 Fadeeva M.S , Yakovtseva Y A , Bertsova Y V , Bogachev A V (2007) Regulation of the «¡yr-operons expression in Vibrio harveyi and Klebsiella pneumoniae FEBSJ, 274, Suppl l,p 226

5 Fadeeva M.S., Yakovtseva E A , Belevich G A , Bertsova Y V , and Bogachev AV (2007) Regulation of expression of Na+-translocating NADH quinone oxidoreductase genes in Vibrio harveyi and Klebsiella pneumoniae Arch Microbiol, 188,341-348

6. Fadeeva M.S., Nunez С, Bertsova Y V , Espin G, and Bogachev A V (2008) Catalytic properties of Na+-transIocating NADH quinone oxidoreductases from Vibrio harveyi, Klebsiella pneumoniae, and Azotobacter vinelandu FEMS Microbiol Zeii, 279,116—123

7 Фадеева M.C., Берцова Ю В , Верховский М И , Богачев А В (2008) Сайт-направленный мутагенез консервативных остатков цис1еина в субъединицах NqrD и NqrE Na' -транслоцирующей NADH хинон-оксидоредуктазы Биохимш, 73, 154-161

Подписано в печать 14 02 2008 Формат 60x88 1/16 Объем 1 75 п л Тираж 100 экз Заказ № 695 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119991 г Москва, Ленинские горы, д 1 Г лавное здание МГУ, к А-102

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Фадеева, Мария Сергеевна

Список сокращений

Введение

Обзор литературы

1. История открытия и изучения натрий-транслоцирующей 8 КАОН:хинон-оксидоредуктазы

2. Субъединичный состав фермента, гомология субъединиц с другими белками

3. Кофакторы

4. Каталитические активности Ыа+-ЫС)

5. Ингибиторы реакций, осуществляемых Ыа+-ЫС)

6. Роль кофакторов и возможные механизмы работы На+-ЫС)

7. Другие КАЭН :хинон-оксидоредуктазы, присутствующие в 31 дыхательной цепи прокариот

Материалы и методы

1. Штаммы микроорганизмов, использованные в работе

2. Выращивание бактериальных штаммов

3. Получение клеточного лизата и суббактериальных частиц

4. Выделение рекомбинантного препарата Ка+-КС)

5. Получение рекомбинантных фрагментов субъединиц ЫцгВ и ЫцгС

6. ЭПР-спектроскопия "

7. Измерение концентрации белка

8. Измерение концентрации натрия

9. Регистрация окисления ИАБН, ИАБРН и с^АБН

10. Генетические методы:

11 Измерение р-галактозидазной активности

12 Определение различных металлов в препаратах N<

13 Электрофоретическое разделение белков

14 Перенос белков методом Вестерн-блоттинга

15 Метод иммуноблоттинга

16 Экспериментальный протеолиз СБЧ.

Результаты

1. Регуляция экспрессии оперонов, кодирующих Ыа+-транслоцирующую ИАОНгхиноп-оксидоредуктазу у V. harveyi и К. pneumoniae

2. Каталитические свойства натрий-транслоцирующей NADH:xhhoh-оксидоредукгазы из V harveyi, К. pneumoniae и A. vinelandii

3. Анализ мембранной топологии субъединицы NqrC натрий-транслоцирующей ЫАОН:хинон-оксидоредуктазы из V. harvey

4. Сайт-напрайленный мутагенез консервативных остатков цистеина в субъединицах NqrD и NqrE

Обсуждение Выводы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Сравнительное изучение Na+-транслоцирующих NADH:хинон оксидоредуктаз из Vibrio harveyi, Klebsiella pneumoniae и Azotobacter vinelandii"

Многие морские и патогенные микроорганизмы содержат уникальный фермент -натрий-транслоцирующую КАОН:хипон-оксидоредуктазу (Na+-NQR) - который создает на цитоплазматической мембране бактерий первичиый электрохимический градиент ионов натрия. Фермент представляет значительный интерес для биоэнергетики, поскольку его сопрягающим ионом является Na+, а не протон. Это позволяет в широких пределах изменять концентрацию сопрягающего иона без существенного влияния на стабильность белка, что невозможно при исследовании протонных помп. Данный фермент устроен значительно проще NADH-дегидрогеназ I типа (Комплекса I), что также является преимуществом при исследовании механизма* преобразования энергии катализируемой редокс-реакции. Кроме того, Na+-NQR широко распространена среди патогенных микроорганизмов, таких как Vibrio cholerae, Haemophilus influenzae, Klebsiella pneumoniae, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Yersinia pestis, Pseudomonas aeruginosa, Porphyromonas ginginvalis и т.д., что делает исследование фермента актуальным и с медицинской точки зрения. При изучении V. cholerae была обнаружена взаимосвязь между уровнем мембранного натриевого потенциала, который является следствием работы фермента, и продукцией факторов вирулентности. Поэтому Na+-NQR можно рассматривать как вероятную мишень для создания новых лекарственных препаратов для лечения или предотвращения многих инфекционных заболеваний.

За последние годы достигнут значительный прогресс в изучении Na+-NQR: полностью определена нуклеотидная последовательность ядг-оперона, установлен субъединичный состав фермента, определена роль некоторых кофакторов в передаче электронов от NADH к хинону и т.д. Тем не менее, в настоящее время исследователи еще очень далеки от полного понимания механизма функционирования Na+-NQR. В том числе, все имеющиеся па настоящий момент данные были получены при изучении Na+-NQR из V. alginolyticus, V. harveyi и V. cholerae. Эти организмы очень близки друг к другу, и гомология нуклеотидных последовательностей соответствующих генов крайне высока. При этом абсолютно ничего не известно о свойствах Na+-NQR из других микроорганизмов. Подобная информация была бы исключительно полезна как для понимания физиологической роли фермента в бактериальной клетке, так и для выявления общих закономерностей функционирования и структурных характеристик Na+-NQR, которые являются принципиальными в осуществлении редокс-реакции и транслокации ионов натрия. различных экологических нишах. Особое внимание было уделено определению физиологической роли и сравнительному изучению кинетических параметров данных ферментов из эволюционно и экологически отдаленных микроорганизмов, а также анализу роли их консервативных аминокислотных остатков в функционировании белка.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Фадеева, Мария Сергеевна

выводы

Такие параметры как концентрация NaCl, значение рН и присутствие разобщителя в ростовой среде практически не оказывают влияния на экспрессию nqr генов V. harveyi и К. pneumoniae, кодирующих Ыа+-транслоцирующую NADH:xhhoh-оксидоредуктазу.

Экспрессия nqr V. harveyi и К. pneumoniae в значительной степени зависит от того, какие субстраты используются этими бактериями в качестве основного источника энергии. Особенно сильное влияние на экспрессию nqr V. harveyi оказывает доступность акцепторов электронов для дыхательной цепи и значения их окислительно-восстановительных потенциалов. Установлено, что система АгсАВ не участвует в регуляции экспрессии генов nqr V. harveyi.

Определены кинетические характеристики Na ^-транслоцирующих NADH:xhhoh оксидоредуктаз из V. harveyi. К. pneumoniae и A. vinelandir. константы Михаэлиса по нонам натрия, а также параметры ингибирования этих ферментов дыхательным ингибитором 2-гептил-4 гидроксихинолин-1\[-оксидом. Показано различие действия SH-реагентов (ионов серебра и N-этилмалеимида) на ферменты из этих бактерий.

Дифенилиодониум модифицирует только нековалентно присоединенный FAD. расположенный на субъединнце NqrF, при этом не происходит модификации остатков FMN. принадлежащих субъединицам NqrB и NqrC.

При анализе первичных последовательностей субъединиц Na+-NQR из разных организмов определены 4 консервативные остатка цистеина, расположенные внутри трансмембранных ex-спиралей. С помощью сайт-направлениого мутагенеза показана необходимость этих остатков для правильной сборки и функционирования №+-транслоцирующей ЫАОН:хинон-оксидоредуктазы.

Ж.'

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Фадеева, Мария Сергеевна, Москва

1. Берцова Ю.В., Попов В.Н. и Богачсв А.В. (2004) Окисление NADH митохондриями 1срмогенного растении Arum orientals. Биохимия, 69. 712-718.

2. Богачсв А.В. и Верховский М.И. (2005) Ыа'-транслоцпрующая NADH:xhhoh оксидоредуктаза достигнутый прогресс и перспективы исследований. Биохимия. 70, 177- 185.

3. Кондратьева И. А, Самуилов В. Д. (ред) (2001). Практикум по иммунологии; М., МГУ, с.114-118.

4. Скулачев, В. П. (1989) Энергетика биологических мембран, М. Паука.

5. Alexeyev, M.F. (1999) The pKNOCK series of broad-host-range mobilizable suicide vectors lor gene knockout and targeted DNA insertion into the chromosome of gram-negative bacteria. Biotechniques. 26, 824-828.

6. Asano M., Hayashi M. Unemoto Tokuda H. (1985) Ag+-sensitive NADH dehydrogenase in the Na+-motive respiratory chain of the marine bacterium Vibrio alginolyticus. Agric. Biol Chem., 49,2813-2817.

7. Barquera, В., Hase, C.C., and Gennis, R.B. (2001) Expression and mutagenesis of the NqrC subunit of the NQR respiratory Na+ pump from Vibrio cholerae with covalently attached FMN. FEBS Lett., 492, 45-49.

8. Barquera В., Zhou W., Morgan J. E., and Gennis, R. B. (2002). Riboflavin is a component of the Na'-translocating NADH-quinone reductase from Vibrio cholerae. PNAS, 99, 10322-10324.

9. Barquera B., Zhou W., Morgan J. E., Gennis R. B. (2002) Riboflavin is a component of Na+-pumpmg NADH-quinone oxidoreductase from Vibrio cholerae. PNAS, 99, 10322-10324.

10. Belevich G., Euro L., Wikström M., Verkhovskaya M. (2007) Role of the conserved arginine 274 and histidine 224 and 228 residues in the NuoCD subunit of complex I from Escherichia coli. Biochemistry, 46, 526-533.

11. Bertsova Y. V. & Bogachev A. V. (2004) The origin of the sodium-dependent NADH oxidation by the respiratory chain of Klebsiella pneumoniae. FEBS Lett., 563, 207-212.

12. Bertsova, Y.V. and Bogachev A.V. (2002) Operation of the cbb^-type terminal oxidase in Azotobacter vinelanclii. Biochemistry (Moscow), 67, 622-626.

13. Bertsova Y.V., Bogachev A.V., and Skulachev V.P. (1998) Two NADH:ubiquinone oxidoreductases of Azotobacter vinelandii and their role in the respiratory protection. Biochim. Biophys. Acta, 1363, 125-133.

14. Bertsova Y.V., Bogachev A.V., and Skulachev V.P. (2001) Noncoupled NADH:ubiquinone oxidoreductase of Azotobacter vinelandii is required for diazotrophic growth at high oxygen concentrations. J. Bacteriol., 183(23), 6869-6874.

15. Bogachev A. V., Bertsova Y. V., Barquera B., Verkhovsky M. I. (2001) Sodium-dependent steps in the redox reactions of the Na+-motive NADH-quinone oxidoreductase from Vibrio harveyi. Biochemistry, 40, 7318-7323.

16. Bogachev A. V., Bertsova Y. V., Rooge E. K., Wikström M„ Verkhovsky M. I. (2000) Kinetics of the spectral changes during reduction of the Na+-motive NADH-quinone oxidoreductase from Vibrio harveyi. Biochim Biophys Acta, 1556, 113-120.

17. Bogachev, A.V., Bertsova, Y.V., Bloch, D.A., and Verkhovsky, M.I. (2006) Thermodynamic properties of the redox centers of Na+-translocating NADH:quinone oxidoreductase. Biochemistry, 45, 3421-3428.

18. Bogachev A.V., Bertsova Y.V., Aitio O., Permi P., and Verkhovsky M.I. (2007) Redox-dependent sodium binding by the Na+-translocating NADH:quinone oxidoreductase from Vibrio harveyi. Biochemistry, 46, 10186-10191.

19. Bogachev A. V., Murtasina R. A., Skulachev V. P. (1997) The Na+/e" stoichiometry of the Na+-motive NADH-quinone oxidoreductase in Vibrio alginolyticus. FEBS Lett., 409, 475477.

20. Bongaerts J, Zoske S, Weidner U, Unden G (1995) Transcriptional regulation of the proton translocating NADH dehydrogenase genes («woA-N) of Escherichia coli by electron acceptors, electron donors and gene regulators. Mol. Microbiol., 16, 521-534.

21. Bourne R. M., Rich P. R. (1992) Characterization of a sodiummotive NADH:ubiquinone oxidoreductase. Biochem. Soc. Trans., 20, 577-582.

22. Chakraborty S. and Massey V. (2002) Reaction of reduced flavins and flavoproteins with diphenyliodonium chloride. J. Biol. Chem., 277, 41507-41516.

23. Curatti L, Brown CS, Ludden PW, Rubio LM. (2005) Genes required for rapid expression of nitrogenase activity in Azotobacter vinelandii. PNAS, 102, 6291-6296.

24. Dibrov P. A., Kostyrko V. A., Lazarova R. L., Skulachev V. P.,Smirnova I. A. (1986) The sodium cycle. I. Na+-dependent motility and modes of membrane energization in the marine alkalotolerant Vibrio Alginolyticus. Biochim Biophys Acta, 850, 449-457.

25. Duffy, E.B., and Barquera, B. (2006) Membrane topology mapping of the Na+-pumping NADH: quinone oxidoreductase from Vibrio cholerae by PhoA-green fluorescent protein fusion analysis. J. Bacteriol., 188, 8343-8351.

26. Duran-Pinedo, A. E., Nishikawa K. and Duncan M. J. (2007). The RprY response regulator of Porphyromonas gingivalis. Mol. Microbiol., 64, 1061-1074.

27. Fadeeva M.S., Yakovtseva E.A., Belevich G.A., Bertsova Y.V., and Bogachev AV. (2007) Regulation of expression of Na+-translocating NADH:quinone oxidoreductase genes in Vibrio harveyi and Klebsiella pneumoniae. Arch. Microbiol., 188, 341-348.

28. Fu H A, Iuchi S, Lin E C (1991) The requirement of ArcA and Fnr for peak expression of the cyd operon in Escherichia coli under microaerobic conditions. Mol. Gen. Genet., 226, 209213.

29. Georgellis D, Kwon O, Lin E C, Wong S M, Akerley B J (2001) Redox signal transduction by the ArcB sensor kinase of Haemophilus influenzae lacking the PAS domain. J. Bacteriol., 183, 7206-7212.

30. Hiise C. C. (2003). Ion motive force dependence of protease secretion and phag transduction in Vibrio cholerae and Pseudomonas aeruginosa. FEMSMicrobiol. Lett., 227, 6571.

31. Hase C. C., Barquera B. (2001) Roles of sodium bioenergetics in Vibrio cholerae. Biochim Biophys Acta, 1505, 169-178.

32. Häse C. C., Fedorova N. D., Galperin M. Y., Dibrov P. A. (2001) Sodium-ion cycle in bacterial pathogens: evidence from cross-genome comparison. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 65, 353-370.

33. Hayashi M., Hirai K., Unemoto T. (1995) Sequencing and the alignment of structural genes in the nqr operon encoding the Na+-translocating NADH:quinone reductase from Vibrio alginolytiens. FEBS Lett, 363, 75-77.

34. Hayashi, M., Miyoshi, T., Sato, M., Unemoto, T. (1992) Properties of respiratory chain-linked Na+-independent NADH-quinone reductase in a marine Vibrio alginoly tiens. Biochim. Biophys. Acta, 1099, 145-151.

35. Hayashi M., Nakayama Y., and Unemoto T. (1996) Existence of Na+-translocating NADH-quinone reductase in Haemophilus influenzae. FEBS Lett., 381, 174-176.

36. Hayashi M., Nakayama Y., Unemoto T. (2001) Recent progress in the Na+-translocating NADH-quinone reductase from the marine Vibrio alginolyticus. Biochim. Biophys. Acta, 1505, 37-44.

37. Hayashi M., Nakayama Y., Yasui M., Maeda M., Furuishi K., Unemoto T. (2001). FMN is covalently attached to a threonine residue in NqrB and NqrC subunits of Na+-translocating NADH-quinone reductase from Vibrio alginoly ticus. FEBS Lett., 488, 5-8.

38. Hayashi M., Unemoto T. (1984) Characterization of the Na+-dependent respiratory chain NADH:quinone oxidoreductase of the marine bacterium, in Vibrio alginolyticus, in relation to the primary Na+ pump. Biochim Biophys Acta, 767, 470-478.

39. Hayashi M., Unemoto T. (1987) Subunit component and their roles in the sodium-transport NADIi:quinone reductase of a marine bacterium Vibrio alginolyticus. Biochim. Biophys. Acta, 890, 47-54.

40. Nakayama, Y., Yasui, M., Sugahara, K., Hayashi, M., and Unemoto, T. (2000) Covalently bound flavin in the NqrB and NqrC subunits of Na+-translocating NADH-quinone reductase from Vibrio alginolyticus. FEBS Lett., 474, 165-168.

41. Jeong H-S., and Jouanneau Y. (2000) Enhanced nitrogenase activity in strains of Rhodobacter capsulatus that overexpresses the rnf genes. J. Bacteriol., 182, 1206-1214.

42. Jouanneau Y., Jeong H-S., Hugo N., Meyer C., and Willson J. (1998). Overexpression in E. coli of rnf genes from Rhodobacter capsulatus. Characterization of two membrane-bound iron-sulfur proteins. Eur. J. Biochem., 251, 54-56.

43. Kerscher S, Drose S, Zickermann V, Brandt U. (2007) Three Families of Respiratory NADH Dehydrogenases. Results Probl. Cell Differ., Springer, in press.

44. Kogure K. (1998). Bioenergetics of marine bacteria. Curr. Opin. Biotechnol., 9, 278-282.

45. Kogure K., and Tokuda H. (1989) Respiration-dependent primary Na+ pump in halophilic marine bacterium, Alcaligenes strain 201. FEBS Lett., 256, 147-149.

46. Koo M.S., Lee J.H., Rah S.Y., Yeo W.S., Lee J.W., Lee K.L., Koh Y.S., Kang S.O., and Roe J.H. (2003) A reducing system of the superoxide sensor SoxR in Escherichia coli. EMBO Jour., 22,2614-2622.

47. Laemmli U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head bacteriophage T-4. (1970) Nature, 227, 680-685.'

48. Li, Q., Li, L., Rejtar, T., Karger, B.L., and. Ferry J.G. (2005) Proteome of Methanosarcina acetivorans part i: an expanded view of the biology of the cell. J. Proteome Res., 4, 112-128.

49. Majander A., Finel M., Wikstrom M. (1994) Diphenyleneiodonium inhibits reduction of iron-sulfur clusters in the mitochondrial NADH-ubiquinone oxidoreductase (Complex I). J. Biol. Chem., 269, 21037-21042.

50. Malpica R, Sandoval G R, Rodriguez C, Franco B, Georgellis D (2006) Signaling by the arc two-component system provides a link between the redox state of the quinone pool and gene expression. Antioxid. Redox Signal., 8, 781-795.

51. Manukhov I V, Bertsova Y V, Trofimov D Y, Bogachev A V, Skulachev V P (2000) Analysis of HI0220 protein from Haemophilus influenzae, a novel structural and functional analog of ArcB protein from Escherichia coli. Biochemistry (Moscow), 65, 1321-1326.

52. Miller S., and Mekalanos J. (1988) A novel suicide vector and its use in construction of insertion mutations: osmoregulation of outer membrane proteins and virulence determinants in Vibrio cholerae requires toxR. J. Bacteriol., 170, 2575-2583.

53. Nakayama Y., Ilayashi M.3 Unemoto T. (1998) Identification of six subunits Na+-translocating NADH-quinone reductase from the marine Vibrio alginolyticus. FEBS Lett., 422, 240-242.

54. Nakayama Y., Yasui M., Suhugara K., Hayashi M., Unemoto T. (2000) Covalenly bound flavin in the NqrB and NqrC subunits of Na+-translocating NADH-quinone reductase from Vibrio alginolyticus. FEBS Lett., 474, 165-168.

55. Park S.J., Tseng C.P., and Gunsalus R.P. (1995) Regulation of succinate dehydrogenase (sdhCDAW) operon expression in Escherichia coli in response to carbon supply and anaerobiosis: role of ArcA and Fnr. Mol. Microbiol., 15, 473-482.

56. Pfenninger-Li X D, Dimroth P (1992) NADH formation by Na+-coupled reversed electron transfer in Klebsiella pneumoniae. Mol. Microbiol., 6, 1943-1948.

57. Pfenninger-Li X. D., Albracht S. P., van Belzen R„ Dimroth P. (1996) NADH:ubiquinone oxidoreductase from Vibrio alginolyticus: purification, properties and reconstitution of the Na+ pump. Biochemistry, 35, 6233-6242. ;,

58. Pfenninger-Li X. D., Dimroth P. (1995) Na+-translocating NADH:Quinone oxidireductase from a marine bacterium Vibrio alginolyticus contains FAD but not FMN. FEBS Lett., 369, 173-176.

59. Proctor L M, Gunsalus R P (2000) Anaerobic respiratory growth of Vibrio harveyi, Vibrio fischeri and Photobacterium leiognathi with trimethylamine N-oxide, • nitrate and fumarate: ecological implications. Environ. Microbiol., 2, 399-406.

60. Rich P. R., Meunier B., Ward F. B. (1995) Predicted structure and possible ionmotive mechanism of the sodium-linked NADH-ubiqinone oxidoreductase of Vibrio alginolyticus. FEBS Lett., 375, 5-10.

61. Singer T. and Mclntire. (1984) Covalent attachment of flavin to flavoproteins: occurrence, assay and synthesis. Methods Enzymol., 106, 369-378.

62. Skulachev V. P. (1989) The sodium cycle: a novel type of bacterial energetics. J. Bioenerg. Biomembr., 21, 635-647

63. Smith, P.K., Krohn, R.I., Hermanson, G.T., Mallia, A.K., Gartner, F.H., Provenzano, M.D., Fujimoto, E.K., Goeke, N.M., Olson, B.J., and Klenk, D.C. (1985) Anal. Biochem., 150, 76-85.

64. Tokuda H. (1984) Solubilization and reconstitution of the Na+-motive NADH oxidase activity from the marine bacterium Vibrio alginolyticus. FEBS Lett., 176, 125-128.

65. Tokuda H., Asano M., Shimamura Y., Unemoto T., Sugiyama S., Unemoto T (1987) Roles of the respiratory Na+ pump in the bioenergetics of Vibrio alginolyticus. J. Biochem., 103, 650-655.

66. Tokuda H, Udagawa T, Unemoto T. (1985) Generation of the electrochemical potential of Na+ by the Na+-motive NADH oxidase in inverted membrane vesicles of Vibrio alginolyticus. FEBS Lett., 183, 95-98.

67. Tokuda H, Unemoto T. (1981). A respiration-dependent primary sodium extrusion system functioning at alkaline pH in the marine bacterium Vibrio alginolyticus. Biochem. Biophys. Res. Commun., 102,265-71.

68. Tokuda H., Unemoto T. (1982) Characterization of the respiration-dependent Na+ pump in the marine bacterium Vibrio alginolyticus. J. Biol. Chem., 257, 10007-10014.

69. Tokuda H., Unemoto T. (1983). Growth of a marine Vibrio alginolyticus and moderate halophilic Vibrio costicola becomes uncoupler resistant when the respiration-dependent Na+ pump functions. J. Bacteriol., 156, 636-643.

70. Tokuda H., Unemoto T. (1984) Na+ is translocated at NADH:quinone oxidoreductase segment in the respiratory chain of Vibrio alginolyticus. J. Biol. Chem., 259, 7785-7790.

71. Tsuchiva T., Shinoda S. (1985). Respiration-driven sodium pump and Na+ circulation in Vibrio parahaemolyticus. J. Bacteriol., 162, 794-798.

72. Turk K., Puhar A., Neese F., Bill E., Fritz G., Steuber J. (2004). NADH oxidation by Na+-transIocating NADH:quinone oxidireductase from Vibrio cholerae. J. Biol. Chem., 279, 21349-21355.

73. Udagawa T., Unemoto T., Tokuda H. (1985). Generation of Na+ electrochemical potential by the Na+-motive NADH-oxidase and Na+/H+-antiport system of a moderate halophilic Vibrio costicola. J. Biol. Chem., 261, 2616-2622.

74. Unemoto T, Hayashi M, Hayashi M. (1977). Na+-dependent activation of NADH oxidase in membrane fractions from halophilic Vibrio alginolyticus and Vibrio costicolus. J. Biochem., 82, 1389-1395.

75. Unemoto. T., Hayashi M. (1979) NADHrquinone oxidoreductase as a site of Na+-dependent activation in the respiratory chain of marine Vibrio alginolyticus. J. Biochem., 85, 1461-1467.

76. Yommitsu T., Homma M. (2001) Na+-driven flagellar motor of Vibrio. Biochim. Biophys. Acta, 1505, 82-93.

77. Yoshikawa K., Takadera T., Adachi K., Nishijima M., Hiroshi S. (1997). Korormicin, a novel antibiotic Specifically active against marine gram-negative bacteria, produced by a marine bacterium. J. Antibiot., 50, 945-953.