Роль люминесцентной реакции в защите фотобактерий от окислительного стресса

Реммель, Наталья Николаевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль люминесцентной реакции в защите фотобактерий от окислительного стресса
ВАК РФ 03.00.16, Экология

Автореферат диссертации по теме "Роль люминесцентной реакции в защите фотобактерий от окислительного стресса"

На правах рукописи

РЕММЕЛЬ Наталья Николаевна

РОЛЬ ЛЮМИНЕСЦЕНТНОЙ РЕАКЦИИ В ЗАЩИТЕ ФОТОБАКТЕРИЙ ОТ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА

03.00.16. —экология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Красноярск - 2003

Рабата выполнена в Институте биофизики СО РАН и Красноярском государственном университете

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Валентина Александровна Кратасюк

Научный консультант: кандидат биологических наук Галина Александровна Выдрякова

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Нина Евгеньевна Судачкова кандидат биологических наук Елена Викторовна Маркова

Ведущая организация: Дальневосточный государственный университет

Защита состоится «29 »декабря 2003 г. в часов на заседании диссертационного совета К 212-099.02 в Красноярском государственном университете (660041, г. Красноярск, пр. Свободный 79, биологический факультет) Факс (3912М4-&6-25

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Красноярского государственного университета

Автореферат разослан « ноября 2003 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета, /

кандидат биологических наук Г.Н. Скопцовз

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

обладающие высокой токсичностью для клетки (Афанасьев, 1984; Владимиров и др., 1991; Зенков, 1993; Владимиров, 1998). В процессе эволюции у некоторых видов бактерий появилась способность к генерации активных форм кислорода (АФК), которую они используют для колонизации других организмов, в межвидовой конкуренции или как сигнальную систему (Denis et.al., 1989; Warren et.al., 1990; Kuo et.al., 1995). Собственную безопасность бактерии обеспечивают с помощью мощных систем антиоксидантной защиты.

Светящиеся бактерии распространены по всему Мировому океану, от тропических до полярных широт, и от поверхностных слоев до глубин в несколько тысяч метров. Фотобактерии выделены свободноживущими из морской воды, с поверхности морских животных н из кишечников рыб, как симбионт из бактериофотофоров рыб и головоногих моллюсков (Nealsojr, Hastings, 1979). Считается, что существование в морской воде в свободном состоянии является транзитной фазой между хозяевами (Гительзон и др., 1985).

В большинстве случаев из одной рыбы выделялся лишь один штамм фотобактерий (Hastings, Mitchell, 1971; Reichelt, Nealson, 1977). Возможно, бактерии обладают определенной антимикробной способностью, в отношении которой у них есть собственные системы защиты, либо хозяин создает условия, в которых выживает только данный вид бактерий. Такая высокая избирательная способность хозяина селектировать вид и штамм симбионта поразительна. Чрезвычайный интерес представляет выяснение ее механизма.

Возможность генерации в среду АФК фотобактериями, по аналогии с иесветящимися видами, предполагают некоторые авторы (Лабас и др. 1996, 1999). Для устранения токсического эффекта молекулярного кислорода и его активных форм у бактерий имеется «классическая» ферментативная антиоксидантная система (АОС). Бактерии с отсутствием такой системы защиты обладают низкой симбиотической способностью (Martin, Frïdovich, 1981; Visick, Ruby, 1998;. Redford et. al.,1990).

Кислород является необходимым компонентом дыхания и люминесцентной реакции. В основе свечения бактерий, как и других живых организмов, лежит катализируемая специфическими ферментами химическая реакция, которая сопровождается излучением квантов видимого света. Ферменты называют люциферазами, а окисляемые ими субстраты — люциферинами (Hastings, Nealson, 1977; Гительзон и др., 1984; Lee, 1985; Tu, Mager, 1995). ■ ■

I U Л У-.'::..i

Хотя люциферазы разных видов светящихся бактерий отличаются по своим физическим и кинетическим свойствам, все они катализируют одну и же реакцию:

люцифераза

ФМНН2 + RCHO + 02 —-► ФМН + RCOOH + Н20 + hv

Здесь ФМН и ФМННз - окисленная н восстановленная форма флавинмононуклеотида, RCHO и RCOOH -дли нноцепочечны й алифатический альдегид и соответствующая жирная кислота. Восстановление ФМН может осуществляться ферментативным путем с помощью НАДН: ФМН-оксндоредуктазы:

НАДН: ФМНюксидоредуктаза ФМН + НАДН + -► ФМН Hi + НАД1

В возбуждении биолюминесценции могут участвовать активные кислородные радикалы (Кратаскж и др., 1977; Watanabe, Nakamura, 1976; Watanabe et.al., 1993; Wada, 1997) и алифатические альдегиды, продукты перекисного окисления липидов (ПОЛ) мембран (Берия и др., 1991; Berkovichet. al., 1991; Ulitzur, 1991). Инициация процессов ПОЛ осуществляется при взаимодействии АФК с полиненасыщенными жирными кислотами. В условиях окислительного стресса происходит увеличение интенсивности ПОЛ (Cross eL al., 1987; Gutteridge, Hat I ¡well, 1990; Hal li well, Chirico, 1993). В связи с вышеизложенным, предполагают, что люминесцентная система является аналогом антиоксидантной и участвует в защите бактерий от окислительного стресса. Антнокскдантный генезис биолюминесценции рассматривают для фотобактерий (Лабас, 1990; Gitelson, Labas, 1993; Watanabe,1993); светляков (Barros, Bechara,1998) н морских эукариот (Rees et al.,1998; 2000). Генерация АФК фотобактериями в условиях высокой активности собственных систем защиты создает огромное преимущество в межвидовой конкуренции и способствует колонизации многоклеточных организмов.

Цель исследования. Изучить роль люминесцентной реакции в защите фотобактерий от окислительного стресса.

Задачи исследования:

1) Исследовать возможность генерации фотобактериями АФК в процессе роста.

2) Определить активность основных ферментов АОС катал азы и супероксиддисмутазы (СОД) у светящихся бактерий видов Phoiobacterium phosphoreum, Phoiobacterium leiognathi, Vibrio fischeri, Vibrio harveyi и рекомбинантного штамма Escherichia colt.

3) Изучить особенности свечения и уровень активности АОС в динамике роста бактерий Vibrio harveyi.

4) В условиях индуцированного окислительного стресса определить кинетические параметры роста, свечения, активность основных ферментов антиоксидантной и люминесцентной систем бактерий Vibrio harveyi.

5) Провести сравнительный анализ активностей ферментов антиоксидантной и люминесцентной систем у светящегося и несветящегося мутантного штаммов Vibrio harveyi.

6) Исследовать возможность участия малонового днальдегида (МДА) в качестве субстрата бактериальной люминесцентной реакции в отсутствии алифатического альдегида in vitro.

7) На основе выявленных закономерностей изучить возможность использования бактериальных люминесцентных систем для мониторинга окислительного стресса в биологических образцах (экстрактах тканей, сыворотке крови, перфузатс).

Научная новизна и теоретическая значимость работы.

1) Впервые показана генерация АФК фотобактериями в экспоненциальной фазе роста.

2) Впервые изучена совместная роль антиоксидантной и люминесцентной систем фотобактерий в механизмах антиоксидантной защиты. Показано, что окислительный стресс является общим пусковым механизме»! для проявления повышенной активности ферментов антиоксидантной и люминесцентной систем, что подтверждается кинетическими параметрами свечения н активностью люциферазы бактерий V. harveyi, увеличивающейся наряду с увеличением активности ферментов антиоксидантной защиты.

3) Впервые проведен сравнительный анализ активности ферментов антиоксидантной и люминесцентной систем у светящегося и несветящегося мутантного штаммов бактерий V. harveyi. Показаны более высокие значения активности антиоксидантных ферментов мутантного штамма, вероятно являющиеся признаком адаптации,

4) Впервые показана возможность участия МДА в качестве субстрата бактериальной люминесцентной реакции в отсутствии алифатического альдегида, что является дополнительным основанием для использования биолюминесценции при изучении окислительных патологических процессов в клетке.

Практическая значимость работы. Впервые предложены методы мониторинга окислительного стресса в биологических образцах (материалах), с использованием бактериальных биолюминесцентных систем in vitro и in vivo.

Положения, выносимые на защиту:

1. Экологическая роль биолюминесцентной реакции состоит в защите фотобактерий от АФК, являющихся результатом собственной цитотоксической секреции.

2. Окислительный стресс является общим пусковым механизмом регуляции антиоксидантной и люминесцентной систем светящихся бактерий.

3. Мониторинг окислительных патологических процессов в биологических образцах может осуществляться с использованием бактериальной биолюминесценци и.

Апробация материалов диссертации. Основные результаты работы доложены и обсуждены на II Съезде биофизиков России (Москва, 1999); 10-ом

Международном симпозиуме по биолюминесценции и хем «люминесценции (Болония, Италия, 199$); XIII Биофизическом конгрессе (Нью Дели, Индия, 1999); 1-м Французском собрании по химии окружающей среды (Нэнси, Франция, 2000); 4-й Международной конференции по биологической физике (Киото, Япония, 2001); VI Международной конференции «Биоанти оксидант» (Москва, 2002); 2-й Европейской конференции по медицинской и биологической инженерии (Вена, Австрия, 2002); Международном Экологическом Форуме (Санкт-Петербург, 2003); а также на ряде Международных и Всероссийских экологических студенческих конференциях (1999,2000,2002).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи и 9 тезисов и материалов конференций.

Структура в объем диссертации.

Диссертационная работа изложена на 118 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, двух глав с изложением результатов работы, заключения, выводов и списка литературы (234 источника, в том числе 178 - зарубежных). Диссертация иллюстрирована 26 рисунками и 11 таблицами.

Работа выполнена при поддержке: Министерства образования Российской Федерации, грант «Университеты России» УР.11.01.016, Красноярского краевого фонда науки, грант № 10F 233С и гранта REC — 002 программы «Фундаментальные исследования и высшее образование» Министерства образования Российской Федерации и Американского фонда гражданских исследований и развития для независимых государств бывшего Советского Союза.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1, Экология светящихся бактерий (обзор литературы). Первая глава диссертационной работы посвящена обзору литературы по экологии светящихся бактерий, их роли в симбиозе с многоклеточными организмами, биохимическим основам бактериального свечения, значению кислорода в метаболизме бактерий и токсическим эффектам его активных форм. Рассмотрены основные механизмы зашиты бактерий от окислительного стресса, особое внимание уделено значению и описанию ферментативных антноксидантных систем. Проведен анализ имеющихся в настоящее время гипотез происхождения и биологического (экологического) смысла биолюминесцентных систем.

* Заключение по главе 1. К настоящему времени четко установлено, что явление светоизлучення присуще физиологически различным группам микроорганизмов, занимающим разные экологические ниши. Фотобактерии, обитающие в световых органах рыб, представляют собой предмет для изучения фундаментального биологического явления коадагггации метаболизма симбионта и хозяина. Изучение этих симбиотических связей в наибольшей степени продвинет

понимание экологической ниши светящихся бактерий и позволит объяснить биологический смысл их способности излучать свет.

Как показывает обзор литературы, в последнее время большинство работ по изучению биологического смысла люминесценции связано с антнрадикальным генезисом биолюминесцентных систем. Кислород является необходимым компонентом люминесцентной реакции и дыхания. Для устранения токсического эффекта молекулярного кислорода и его активных форм у бактерий имеется «классическая» антиоксидантная система. Активные промежуточные кислородные радикалы могут метаболнзироваться и в люминесцентной реакции. В данной ситуации важно иметь представление о взаимоотношениях системы светоизлучения и «классической» антиоксцдантной системы. Вопросу, является ли реакция биолюминесценции дополнительным механизмом детоксикации активных кислородных метаболитов, и какова ее роль з общем метаболизме светящихся бактерий посвящено настоящее исследование.

Глава 2. Объекты и методы исследования. В работе использовали светящихся бактерий из Коллекции культур ИБСО отдела биотехнологии Института биофизики СО РАН Photobacterium phosphoreum, штаммы 677, 189; Vibrio fischerí, штаммы 2088, 1231; Photobacterium leiognathi, штамм 208; Vibrio harveyi, штаммы 1212, 178; рекомбинантный штамм Escherichia coli Z-905 {несущий lux-гены, кодирующие все элементы люминесцентной реакции). В исследованиях генерации фотобактериями АФК использовали также темновых мутантов Р. phosphoreum (1764), V. harveyi (178), Е coli (Z-905). Культивирование бактерий проводили до фазы замедления роста, снимая показатели роста и свечения каждые 30 минут. Рассчитывали удельную скорость роста бактерий ц (Печуркин, Терсков, 1975). Отбор проб для определения активности ферментов и содержания МДА проводили в экспоненциальной фазе н фазе замедления роста. Генерацию бактериями АФК определяли по образованию зерен диформазана при добавлении к бактериям нитро-синего тетразолия.

Все биолюминесцентные измерения проводили на биолюминометрах BLM 8801, 8802 (конструкторское бюро "Наука", Красноярск, Институт биофизики). Активность люциферазы оценивали по максимальной интенсивности люминесценции в моноферментной реакции (Hastings, Gibson, 1963). Активность НАДН: ФМН-оксидоредуктазы и антиоксидантных ферментов определяли спектрофотомегрически по известным методикам (Петушков и др, 1984; Авраамова и др. 1987) на спектрофотометре UVIKON 943 (KONTRON 1NSTUMENTS, Италия) в бесклеточных бактериальных экстрактах, которые получали на ультразвуковой установке Ultrasonic disintegrator type UD- 20 automatic (Techpan, Польша). Индуцирование окислительного стресса и ПОЛ в клетках бактерий вызывали внесением в инкубационную среду ионов двухвалентного железа FeSO* в концентрации 1,5 мМ и Н203 в концентрациях 1 и 2,5мМ.

Изучение МДА в качестве возможного субстрата биолюмннесцентной реакции проводили в моноферментной и биферментной системах in vitro. В биферментной системе измерения проводили в реакционной смеси, содержащей ферменты НАДН:ФМН-Оксидоредуктазу, люциферазу, растворы ФМН, НАДН и 0.1 М фосфатный буфер, рН 6.8-7.0. Вместо мирнстинового альдегида в реакционную смесь вносили коммерческий препарат МДА. Для моноферментной системы ФМН восстанавливали фотовосстановлением (Hastings, Gibson, 1963), при снятии спектров биолюминесценции дитяонитом (Meighen, Hastings, 1971). Измерения спектров биолюминесценции проводили с помощью люминесцентного спектрометра AMINCO -Bowman Series 2 (Thermo Spectronic, США).

Мониторинг окислительного стресса в экстрактах тканей и сыворотке крови и интенсивность патологических окислительных процессов в клетках перфузируемой печени проводили на крысах-самцах линии Вистар. Для моделирования состояния стресса крыс подвергали водно-иммерсионному стрессу, облучению видеотерминалом персонального компьютера, гипертермическому воздействию. В работе использовали лиофипизованные светящиеся бактерии P. phosphoreum (Кузнецов и др, 1996; Кратасюк, Гнтельзон, 1987). В кювету содержащую бактерии вносили исследуемый образец и регистрировали интенсивность свечения. В контрольную кювету вносили физиологический раствор. Рассчитывали бактериальный индекс: БИ = У!,. Контроль интенсивности патологических окислительных процессов при управляемой нерециркуляционной безгемоглобнновой перфузии изолированной печени проводили с использованием выделенной биферментной системы НАДН: ФМН оксидоредуктаза - люцифераза (Кратасюк, Гитеяьзон, .1982; Tyulkova, 1990; Кудряшева и др., 2002). Образец добавляли в кювету после достижения максимального уровня свечения. Отношение интенсивности биолюминесценции после добавления перфузата в реакционную смесь к контрольному свечению определяли как люцнферазный индекс: ЛИ = !„/!,.

Во всех экспериментах проводили измерение концентрации МДА, показателя интенсивности окислительного стресса. МДА определяли спектрофотометрически по реакции с 2 - тиобарбнтуровой кислотой (Ко et.ai.,1990).

Статистический анализ проводили с помощью пакета прикладных программ "Siatistica 5.0". Достоверность различий показателей двух выборок определяли по 1-критерию Стьюдента. Корреляционный анализ проводили, используя коэффициент корреляции Пирсона.

Глава 3. Исследование динамики антнокендантной и люминесцентной систем светящихся бактерий в условиях окислительного стресса.

3.1. Генерация АФК фотобактериям и в процессе роста. Выделение в среду АФК фотобактериями не описано в литературе, но возможность этого явления предполагали ранее некоторые авторы (Лабас и др. 1996, 1999). Известно, что в условиях симбиоза в кишечнике рыб и бактериофотофорах присутствует всегда только один вид или даже штамм фотобактерий. Следовательно, либо бактерии

обладают определенной антимикробной способностью, в отношении которой у них есть собственный "иммунитет", либо хозяин создает условия, в которых выживает только данный вид бактерий. Аналогичные процессы описаны для некоторых видов иесветящихся бактерий (Denis et.al., 1989; Warren et.al., 1990; Kuo et.ai., 1995). Генерация АФК этими бактериями и высокая активность собственных АОС способствует колонизации многоклеточных организмов и селективному преимуществу в межвидовой конкуренции.

В результате проведенных экспериментов была обнаружена генерация АФК в экспоненциальной фазе роста и у фотобактерий. Исследовали следующие виды светящихся бактерий и их несветящиеся мутанты: V, harveyi (1212), V. harveyi (178, темновой), P. phosphoreum (1764), P. phosphoreum (1764, темновой), E.Cofi (Lux +), £ coli (+ ген L, темновой) (Табл. 1.).

Таблица 1

Генерация фотобактериями АФК в процессе роста_

Вид бактерий Фазы роста Удельное значение концентраций АФК, отн. ед. Удельное свечение, отн. ед.

Vibrio harveyi (1212) Экспоненцн альная Замедления роста Стационарная 0.63 87.5

0.49 193.1

0.35 144.2

Vibrio harveyi (178, темновой) Экспоненциальная Экспоненцн ал ьная Замедления роста 0.92 -

0.21 -

0.39 -

Photobactermm phosphoreum (1764) Экспоненцналън ая Замедления роста Стационарная 0.33 11.8

0,07 40.1

0.02 20.8

Photobactermm phosphoreum (1764,тем новой) Экспонен циал ьн ая Экспоненциальная Замедления роста 0,82 -

0.06 -

0.03 -

Escherichia coli (lux+) Экспоненциальная Замедления роста Стационарная 0.37 25 J

0.07 100.4

0.08 218.3

Escherichia coli {■+ ген L, темновой) Экспоненциальная Экспоненциальная Замедления роста 0.85 -

0.13 -

0.06 -

Основной формой секретируемых АФК является, по - внаимому, Oi*, так как используемый для обнаружения краситель нитросиний тетразолий окисляется преимущественно этой формой АФК.

Можно предполагать, что биологический смысл секреции в среду АФК фотобактериями, по аналогии с несветящнмися бактериями, может быть связан с их симбиотнческой способностью. Таким образом, важным элементом метаболизма должны быть и механизмы, с помощью которых бактерии защищают собственные клетки. Известно, что у фотобактерий существуют ферменты "классической" анти оксид антн ой системы - катал аза и СОД. Более того, каталаза с периплазматич еской локализацией требуется для обеспечения нормальной снмбиотической способности (Visick, Ruby, 1998). Мутанты по гену имеют слабую симбиотическую способность. Фермент люминесцентной системы люцифераза также имеет периплазматическую локализацию, а некоторые кислородные радикалы стимулируют люминесценцию. Таким образом, в условиях генерации АФК люминесцентная система может функционировать как А ОС.

3.2. Активность ферментов антиоксидантной и люминесцентной систем в зависимости or фаз роста бактерий. При исследовании основных ферментов АОС катал азы и СОД была показана высокая активность ферментов у всех изученных видов светящихся бактерий (Табл.2),

Таблица 2

Активность ферментов антиоксидантной системы некоторых видов

светящихся и рекомбинантных бактерий (X ± ш) _

Штамм Активность СОД, ед. ист. / мин - мг белка Активность катал азы, мкмоль / мин > мг белка

£. coli (Z-905) 8,84 ± 0,70 1728,5 ± 148,7

P. leiognathi (208) 17,51 ±2,43 738,5 ±56,2

V. fischeri (2088) 4,80 ±0,28 1164,6 ±64,6

V.harveyi( 1212) 8,48 * 0,32 1827,5 ±95,7

P. phosphoreum (677) 9,95 ± 0,45 971,8 ±104,3

V. fischeri {1231) 6,18 ±0,49 2380,0 ±243,9

P. phosphoreum (189) 9,83 ±0,66 840,6 ± 58,3

Интенсивность свечения в процессе роста бактерий изменялась параллельно возрастанию в клетках количества основного фермента люминесцентной реакции люцнферазы. Свечение достигало максимального значения и затем уменьшалось, хотя рост бактерий еще продолжался. Максимальную активность люцнферазы и

максимальную интенсивность свечения наблюдали в экспоненциальную фазу роста бактерий (Рис.1).

Содержание второю фермента люминесцентной реакции НАДН: ФМН-оксидоредуктазы не зависит от содержания люциферазы и интенсивности свечения, поэтому во всех исследованных точках активность этого фермента оставалась в среднем стабильной,

I, отн. ел

Рис.1. Динамика роста и свечения бактерий Vibrio karveyi:

1- удельная скорость роста, ц

2- кривая свечения (зависимость интенсивности свечения I от времени культивирования бактерий)

В условиях генерации АФК и накапливающихся в процессе роста бактерий продуктов оксирадикального метаболизма активность антиоксидантных ферментов в процессе культивирования изменялась. Активность катал азы увеличивалась, что подтверждается данными и других авторов (Visick, Ruby, 1998). Активность СОД к фазе замедления роста снижалась (Рис.2). Наиболее высокую активность СОД наблюдали в экспоненциальной фазе роста бактерий на фоне наибольших значений концентраций генерируемых АФК. Полученные результаты подтверждают предположение о том, что основной формой секретируемых АФК является 02". Вероятно, именно этот радикал стимулирует и свечение. В литературе имеются данные о возможном участии супероксидного анион-радикала (Kurfürst et.al., 1983; Wada et.al., 1997) и другой формы АФК, синглетного кислорода (Кратасюк и др. 1977) в возбуждении бактериальной люминесценции.

Результаты экспериментов показали, что совместная работа двух систем, биолюминесцентной и ДОС, не приводит к окислительному стрессу в условиях

генерации фотобактериями АФК; содержание МДА в рамках выбранного периода культивирования оставалось на стабильно низком уровне.

А-103, моль / КАТАЛАЗА

мнн* мгбелга 4 т

А, ед.акг

СОД

Рис.2. Активность ферментов антиоксидантной системы (А) бактерий Vibrio harveyi в зависимости от фазы роста:

1 - экспоненциальная фаза (максимум интенсивности свечения);

2 - экспоненциальная фаза (падение интенсивности свечения);

3 - фаза замедления роста.

3J. Влияние окислительного стресса на активность ферментов ннтноксндантиой и люминесцентной систем бактерий Vibrio harveyi. Для доказательства взаимного участия антиоксидантной и люминесцентной систем в механизмах антиоксидантной зашиты бактерии подвергали окислительному стрессу. В экспериментах с добавлением в среду культивирования двухвалентного железа было показано, что при совпадении кривых роста опыта и контроля, индукция люминесценции в присутствии железа начинается раньше, а интенсивность люминесценции достоверно выше (^<0,001) (Рис.3).

Активность люциферазы в точке максимальной интенсивности свечения превышала контрольные значения почти в 2 раза (рх < 0,01), постепенно снижаясь к фазе замедления роста (Рис.4). Повышенную активность антиоксидантных ферментов регистрировали на протяжении всего периода культивирования. Особенно высокой была активность СОД (р. < 0,001), что не удивительно, учитывая образование в среде культивирования, главным образом, супероксидного аннон* радикала (Oj~) в реакциях с участием ионов двухвалентного железа (Каган и др., 1986) и генерацию этой же формы АФК самими бактериями. К контрольным значениям активность СОД приближалась только к фазе замедления роста, содержание МДА в этот период превышало контрольные значения (р,г<0,01)-

Увеличенис активности НАДН: ФМН оксидоредуктазы в несколько раз по сравнению с контролем (рк < 0,001) в условиях окислительного стресса наблюдали во время экспоненциальной фазы роста бактерий на фоне падения интенсивности

свечения и в фазе замедления роста. Такое поведение фермента может свидетельствовать о повышенном расходе восстановительных эквивалентов в условиях напряженного метаболизма (Ленинджер, 1985).

Рис. 3. Рост и свечение бактерий Vibrio harveyi в присутствии FeSO^:

1 - удельная скорость роста ¿i в контроле;

2 - удельная скорость роста ц в присутствии FeSO,,;

3 ~ кривая свечения в контроле;

4 - кривая свечения в присутствии FeSO*.

i J люцифераза редукгзза гагалам

сод

МДА

контроль

Рис.4. Изменение активности ферментов антиоксидантной и люминесцентной систем (АУА,) и содержание МДА бактерий С/Ыо Нагчеу! в присутствии РеЗО*:

1 - экспоненциальная фаза роста (максимум интенсивности свечения);.

2 - экспоненциальная фаза роста (падение интенсивности свечения);

3 - фаза замедления роста.

Перекись водорода в концентрации 1мМ практически не оказывала влияния на рост бактерий. Интенсивность свечения в момент внесения перекиси падала и восстанавливалась к фазе замедления роста.

Более значительные изменения наблюдали при определении активности ферме)]тов. Через час после внесения пероксида на фоне тенденции к увеличению содержания МДА (0,05 < р, < 0,1) возрастает активность ферментов как антиоксидантн ой, так и люминесцентной систем (р„< 0,001, р < 0,01; р - по сравнению со значениями параметров до внесения перекиси) (Рнс.5). К фазе замедления роста бактерий активность люминесцентной системы и катал азы снижается, приближаясь к контрольным значениям, активность же СОД еще более возрастает по сравнению с контрольными значениями (р, < 0,001). Вероятно, в системе стали происходить вторичные процессы образования 02" в реакциях перскисного окисления липндов (ПОЛ) на фоне недостоверного увеличения содержания МДА (р* > 0,05). Увеличение активности люциферазы без увеличения свечения подтверждает имеющиеся в литературе сведения об участии Н1О1 в темновой реакции катализируемой люциферазой (\Vatanabe е!.Ы., 1993).

При внесении в среду перекиси водорода в концентрации 2,5 мМ, интенсивность свечения падает, не восстанавливаясь, рост бактерий при этом замедляется. Данная тенденция наблюдается независимо от того, в какой момент экспоненциальной фазы вносили перекись, следовательно, такая концентрация для бактерий оказывается сублетальной.

Ао/Ак

Рис.5. Изменение активности ферментов антиоксидантн о Й и люминесцентной систем (Ач/Ац) и содержание МДА бактерий Шпо Натеуч в присутствии Н2О2:

1- экспоненциальная фаза роста (до внесения НгО?);

2- экспоненциальная фаза роста (через 1 час после внесения НгО0;

3- фаза замедления роста.

3.4. Активность ферментов антнокендантной и люминесцентной систем темнового штамма Vibrio ftarveyl Еще одним подтверждением гипотезы взаимного участия антиоксид антной и люминесцентной систем в защите бактерий от окислительного стресса являются данные по активности антиоксидантных ферментов у темнового (мутантного по альдегиду) штамма бактерий V. harveyi. Показано, что активность антиоксидантных ферментов, и катал азы, и СОД мутантов на фоне повышенного содержания МДА увеличивается в зависимости от фазы роста в 2-6 раз (р < 0.001). Очевидно, при потере люминесцентной системы бактерии вынуждены адаптироваться к повышенному содержанию АФК только с помощью АОС. Темновой штамм теряет резистентность к окислительному стрессу. При летальных концентрациях перекиси водорода для темнового штамма, светящийся не погибает.

Заключение по главе 3. Генерация АФК в экспоненциальной фазе роста фотобактерий сопровождается увеличением активности ферментов АОС, люциферазы н свечения. Основной формой секретеру ем ых АФК является 02\ Главную роль в защите бактерий от 0¿ играют СОД и, вероятно, Люцифер аза. Окислительного стресс, вызывающий образование О/ оказывает влияние на механизмы регуляции двух систем, антиоксид антной и люминесцентной, проявляющиеся в ранней индукции люминесцентного свечения, увеличении интенсивности свечения и увеличении активности люциферазы наряду с активностью антиоксидантных ферментов. При потере люминесцентной системы бактерии вынуждены адаптироваться к повышенному содержанию АФК только с помощью АОС.

Предполагаемая схема взаимодействия люминесцентной и антиоксидантной систем показана ниже. Кислород является общим звеном в реакции люминесценции, оксирадикальном метаболизме и дыхании. В условиях уменьшения анаболических реакций, при снижении потребления кислорода дыхательной цепью появляются продукты одноэлектронного восстановления кислорода и увеличивают свою активность ферменты антнокендантной защиты. В это же время активируется люминесцентная система. С другой стороны, активные формы кислорода вызывают процессы перекисного окисления липндов мембран, продуктами которых являются, в том числе, и длинноцепочечные алифатические альдегиды. Эти альдегиды также могут вступать в реакцию люминесценции.

Глава 4. Использование реакции люминесценции для детекции окислительного стресса в биологических образцах. Интенсивность свечения бактерий при культивировании или индукции окислительного стресса in vivo зависела от концентраций МДА, измеряемых в бактериях. МДА является вторичным продуктом процессов ПОЛ и используется как показатель интенсивности окислительного стресса. ПОЛ рассматривают в качестве альтернативного к существующему механизму образования альдегидного субстрата люциферазной реакции (Берия и др.,1991). Люцифераза обладает узкой субстратной

Предполагаемая схема взаимодействия антмоксидантной и люминесцентной систем

ФМННг.ДСОН . <РМН + дсоон + НЮ + »IV : Л^-инмщтт»«.

СОа

Дыкат»

Окснралнюлъный внтоболцэы

пеон

ц Л»р*<гнсио* Стслимпышй

[ окислен*»« липидов ^ сгркс

специфичностью по отношению к альдегидному субстрату, а длинноцелочечные алифатические альдегиды являются типичными продуктами пероксидации ненасыщенных жирнокислотных остатков. Вероятно, биологические образцы, содержащие АФК и продукты ПОЛ, при добавлении к бактериям будут также стимулировать их свечение.

4.1. Мониторинг окислительного стресса в экстра ютах тканей н сыворотке крови крыс с использованием лиофил тированных фотобактерий.

При исследовании влияния экстрактов тканей и сыворотки крови крыс, подвергавшихся стрессовым воздействиям, на лиофилизированные светящиеся бактерии, нами было показано увеличение интенсивности свечения по сравнению с контролем (Рис.б). Во всех проведенных исследованиях выявлена зависимость между содержанием в биологических образцах МДА и интенсивностью люминесценции бактерий в присутствии биологических образцов. Коэффициент корреляции составил 0.86, р< 0Л01.

Время выхода свечения на максимум зависело <ут концентраций МДА в исследуемых образцах. Чем выше было содержание альдегида, тем быстрее свечение достигало максимального значения. Скорость проникновения алифатических альдегидов через бактериальную мембрану зависит от концентрации и длины цепи альдегида (Маргания и др.,1989). В связи с этим предполагаются два механизма стимулирования люминесценции бактерий биологическими образцами.

Et отя.ед

Рис.6. Динамика изменения интенсивности свечения бактерий при внесении экстрактов тканей или сыворотки крови крыс:

1- свечение в опытной пробе

2-свечение в контроле

Во-первых, прохождение МДА через мембрану и участие в качестве субстрата в люцнферазной реакции, во-вторых, увеличение продуктов ПОЛ мембран самих бактерий, вызванное воздействием образцов.

4.2. Контроль интенсивности патологических окислительных процессов в клетках перфорируемой печени гнпертермнрованкых крыс с использованием биферментной бнолюмннеецснтной системы in vitro. При исследовании влияния перфузата на биолюминесцентную реакцию, катализируемую биферментной системой: НАДИ: ФМН - оксидоредуктаза • люцифераза нами были получены аналогичные результаты. Показания биолюминесцентного теста сравнивали со скоростью выхода МДА в перфузат. Как и в первом эксперименте, проведенный корреляционный анализ показал, что скорость выхода МДА коррелирует с показателями биолюминесцентного анализа, коэффициент корреляции составил 0.84,р<0.001.

43. Изучение МДА в качестве возможного субстрата бактериальной люминесцентной реакции. Изучение МДА в качестве возможного субстрата бактериальной люминесцентной реакции проводили с использованием выделенных ферментов биолюминесценции in vitro. Моноферментная система содержала люциферазу и субстраты ее реакции (ФМН, Си альдегид), биферментная система содержала люциферазу, НАДН: ФМН оксидоредуктазу, ФМН, См альдегид и НАДН.

В результате проведенных экспериментов показана зависимость свечения от концентрации МДА, вносимого вместо тстрадеканаля и для моноферментной, и для биферментной реакций (Рис,7).

Активность люцнферазы, отк.ед.

Рис.7. Зависимость активности люцнферазы от концентрации МДА в моноферментной реакции.

Интенсивность свечения была ниже, чем при использовании экзогенного алифатического альдегида, но затухание свечения было продолжительнее (Табл.3). Кроме того, МДА стимулировал люминесценцию моноферментной реакции и в присутствии в системе альдегида. Спектр излучения моноферментнон реакции в присутствии МДА совпадал со спектром биолюминесценции.

Таблица 3

Сравнение интенсивности свечения моноферментной люминесцентной реакции с

МДА и тетрадеканалем

Реакция 1макс. (отн.ед).

1. Е-ФМННг<- О1 0.005

2. Е- ФМННг Си-ЯСНО + О1 27,6

3. Е-ФМННг^МДА + О1 3,4

Примечание: В присутствии Юр! люциферазы добавляли 0.5 мл ФМНН2,440 мл буфера и 50 альдегида или МДА.

Заключение по главе 4. Полученные результаты показали реальную возможность использования бактериальной биолюминесценции для контроля интенсивности патологических окислительных процессов в биологических образцах при окислительном стрессе. При использовании бактерий, значения биолюминесцентного анализа более наглядно показывают уровень МДА. Предлагаем ьгй метод является интегральным и может использоваться в

экспериментах, не требующих точных значений анализируемых параметров. Биферментнуга биолюминесцентную систему можно использовать для изучения биообразцов с невысоким содержанием белка, т.к. некоторые белки могут ингибировать люциферазу.

Заключение. Широкое распространение биолюминесценции на различных уровнях организации организмов позволяет признать, что в эволюции бактерий свечение дает его обладателям огромное селективное преимущество. На примере рыб с бактериофорамн, сообщающимися с задней кишкой, особенно ясно видно, какая сложная биологическая задача ими решается: создаются абсолютно избирательные условия для роста только определенного снмбионтного вида и, может быть, даже штамма фотобактерий в условиях прямого контакта с кишечником, населенным множеством других бактерий, способных расти на тех же средах.

Иными словами, в световом органе одной рыбы обитает один вид и, почти всегда, один штамм светящихся бактерий; отсутствует контаминация другими видами светящихся и несветящихся бактерий, а различия между изолятами, выделенными из разных рыб одного вида, существуют, но не превышают различий между штаммами, и не выходят за рамки внутривидовых вариантов (Ruby, Nealson, 1976). Для светящихся бактерий или, но крайней мере, для некоторых их видов, существование в морской воде в свободном состоянии является транзитной фазой между хозяевами.

В связи с вышеизложенным, можно предполагать несколько условий поддержания такой избирательности: 1) использование антибиотических свойств самих фотобактерий; 2) создание для фотобактерий таких условий, в которых они обладают селективными преимуществами, т.е. растут быстрее других бактерий; 3) иммунный механизм подавления роста всех видов и штаммов бактерий при толерантности рыбы-хозяина к единственному — культивируемому.

Первый способ подтверждается полученными данными по обнаружению генерации фотобактериями АФК в экспоненциальной фазе роста бактерий. Защита же собственной культуры осуществляется наличием двух систем • антноксидантной и люминесцентной. В условиях окислительного стресса показано как увеличение активности антиоксидантных ферментов, так и интенсивности свечения.

Что касается второго способа, можно заметать, он должен быть расточителен для организма хозяина, от которого требуется большой расход веществ и энергии на поддержание быстрого нелнмитированного роста клеток симбионтов, без чего этот способ неэффективен. Относительно иммунной защиты избранного штамма бактерий организмом рыбы на сегодня ничего не известно.

Открытие аутоиндукции синтеза ферментов люминесцентной системы показало, что свечение начинается только по достижении критической плотности популяции 107-10* клУмл. Стрессовый фактор <з}1 стимулирует высокий уровень люминесценции и экспрессию генов регуляции аутоиндукции (Meighen, 1988). Этот

же фактор стимулирует экспрессию генов и пернплазмати ческой катал азы (Visick, Ruby, 1998). В работе показано, что в условиях индуцируемого окислительного стресса в бактериальной культуре индукция люминесцентного свечения начинается раньше. Таким образом, окислительный стресс является общим пусковым механизмом регуляции двух систем, люминесцентной и антиоксидантной.

Наиболее интересен механизм, обеспечивающий селективное преимущество светящимся бактериям перед темновыми вариантами того же вида. Было показано увеличение активности антиоксид антных ферментов катал азы и супероксиддисмутазы темнового штамма бактерий в несколько раз по сравнению со светящимся штаммом. В отсутствии люминесцентной системы бактерии теряют резистентность к высоким концентрациям перекиси водорода. Анализ полученных в работе результатов позволяет говорить о том, что реакция люминесценции, наряду с АОС участвует в защите фотобактерий от окислительного стресса.

Выводы.

1. Светящиеся бактерии генерируют в среду АФК в фазе экспоненциального роста.

2. У всех изученных видов фотобактерий найдена высокая активность основных ферментов АОС каталазы и СОД.

3. В динамике роста бактерий Vibrio harveyi показано изменение активности ферментов АОС и свечения.

4. Окислительный стресс является общим пусковым механизмом регуляции двух систем, антиоксидантной и люминесцентной, проявляющийся в ранней индукции люминесцентного свечения, увеличении интенсивности свечения и увеличении активности люцнферазы наряду с активностью антиоксид антных ферментов.

5. Активность ферментов АОС темнового штамма бактерий Vibrio harveyi в несколько раз выше по сравнению с аналогичными ферментами светящегося штамма.

6. АФК стимулируют свечение фотобактерий и могут являться субстратами люминесцентной реакции.

7. Существует взаимосвязь между значениями концентраций МДА, показателя интенсивности окислительного стресса и интенсивностью свечения биолюминесцентных систем различной сложности.

8. МДА стимулирует люминесценцию в отсутствии в системе алифатического альдегида, а спектр наблюдаемого свечения совпадает со спектром биолюм ин есценци и,

Список опубликованных работ по теме диссертации.

1. Remmel N.N. Effect of qu ¡nones and phenols on the triple - enzyme bioluminescem system with protease / N.S. Kudryasheva, E.N. Esimbekova, N.N. Remmel, VA. Kratasyuk, A. J.W.G. Visser, A. van Hoek // Luminescence. - 2003. - N18. - P.224-

.228.

2. Реммель H.H. Биолюминесцентный контроль интенсивности патологических окислительных процессов в клетках перфузируемой печени крыс после гипертермического воздействия / Н.Н. Реммель, В.А. Кратасюк, О.М. Мазняк, Е.В. Инжеваткнн, В.П. Нефедов // Бюлл. эксп. биол. и мед. - 2003. - Т. 135, №1. - С.52-54.

3. Реммель Н.Н. Мониторинг окислительного стресса в биологических образцах биолюминесцентным методом i Н.Н. Реммель, Н.М. Титова, ВА. Кратасюк // Бюлл. эксп. бнол. и мед.-2003.-Т. 136, №8. - С. 238 - 240.

4. Remmel N.N. Oxidative stress monitoring of biological samples with the method of bioluminescence / N.N. Remmel, N. M. Titova, V.A. Kratasyuk // Environment and Human Health: The complete Works of International Ecologic Forum. - St Petersburg, Russia, 2003. - P. 536-538.

5. Remmel N.N. Monitoring oxidative stress & lipid peroxidation in biological samples by bioluminescence / N.N. Remmel, N. M. Titova, VA. Kratasyuk // Proceed. 2nd European Medical and Biological Engineering Conference^ - Vienna, Austria, 2002. • Part2.-P,1494-1495.

6. Remmel N.N. Bioluminescence method for determination of stress states of people by saliva / E.V. Gritsenko, N.N. Lipova, O.V. Maznyak, V.A. Kratasyuk // Abstr. 10-th International Symposium on Bioluminescence and Chemi I luminescence. - Bologna, Italy. - 1998. - J. of Bioluminescence and Chemi luminescence. - V.I3, N4. - P.209.

7. Реммель Н.Н. Половые аспекты динамики стрессорных реакций в условиях теплового шока / О.М. Мазняк, Н.Н. Реммель, Е.В. Инжеваткнн, В.А. Кратасюк Т.А.Романова // Экология России н сопредельных территорий. Экологический катализ: Материалы IV Международной экологической студенческой конференции. - Новосибирск, 1999. -С. 159-161.

8. Реммель Н.Н. Биолюминесцентный контроль характеристик перфузионного процесса печени крыс / О.М. Мазняк, НЛ. Реммель, Е.В. Инжеваткнн, ВА. Кратасюк // Студент и научно-технический прогресс: Материалы XXXVII Международной научной студенческой конференции. - Новосибирск, 1999. -С.74-76.

9. Реммель Н.Н. Биолюминесцентный метод изучения динамики стрессорных реакций в условиях теплового шока / О.М. Мазняк, Н.Н. Реммель, Е.В. Инжеваткнн, В.А. Кратасюк // Экология Южной Сибири - 2000 год: Материалы III Южно-сибирской региональной научной конференции студентов и молодых учёных. - Абакан, 1999. - С. 172-173.

10. Remmel N.N, Determination of physical load influence on people by Bioluminescence assay / E.V, Gritsenko, N.N. Remmel, O.V. Maznyak, V.A. Kratasyuk // AbsCr. XIII Int. Biophysics Congress.-New Delhi, India. - J. of Biosciences. -1999, V.24, S.l, -P. 177.

11. Remmel N.N, Bioluminescent assay of lipid peroxidation products during rat liver perfusion / N. Remmel, O. Maznyak, T. Romanova, V. Kratasyuk И Abstr. of 4Л Int. Conference on Biological Physics. - Kyoto, Japan, 2001. - P.157.

12. Реммель H.H. Биолюминесцентный контроль интенсивности патологических окислительных процессов в клетках перфузируемой печени крыс после гипертермического воздействия / Н.Н. Реммель, В.А. Кратасгок, О.М. Мазняк, Е.В. Инжеваткин, В.П. Нефедов // Тезисы докладов 4-го Сибирского физиологического съезда с международным участием. - Новосибирск, 2002. -С.38.

13. Реммель Н.Н. Биолюминесценция как дополнительный механизм антиокси-дантной защиты / Н.Н. Реммель, С.А. Зыкова, Д.А. Котов, В.А. Кратасюк // Тезисы докладов VI Международной конференции «Биоантиоксидант». -Москва, 2002. - С.53.

Список сокращений.

А—относительная активность А ОС - антноксидантная система АФК - активные формы кислорода БИ - бактериальный индекс ДТТ - дитиотрейтол ЛИ - люциферазный индекс МДА- малоновый днальдегнд

НАД*, НАДН — окисленная и восстановленная формы

никотннамидадениндннуклеотида

ОС - окислительный стресс

ПОЛ — перекисное окисление липндов

СОД - суперокснд дисмутаза

ФМН, ФМННг - окисленная и восстановленная формы флавинмононуклеотида ТБК" - тяобарбитуровая кислота ЭДТА - этклендиаминтетраацетат I - интенсивность свечения Ь—люцифераза

ЯСНО, НСООН - длинноцепочечный алифатический альдегид и соответствующая жирная кислота

Л - НАДН:ФМН-оксидореду1стаза

Подписано в печать 22,] 1.2003. Формат 60*84/16.

Бумага "8уе(оСору". Печать офсетная.

Усл.печл. 1Д Тираж 100 экз. Заказ №006.

Издательский центр Красноярского государственного университета. 660041 Красноярск, пр. Свободный, 79.

Отпечатано ИЦ КрасГУ, ООП биологического факультета.

660041 Красноярск, пр.Свободный, 79, офис 44-15. Тел: <3912) 44-67-40 (3).

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Реммель, Наталья Николаевна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ЭКОЛОГИЯ СВЕТЯЩИХСЯ БАКТЕРИЙ обзор литературы)

1.1. Распространение светящихся бактерий и их роль в симбиозе с высшими организмами

1.2. Основы бактериального свечения

1.3. Происхождение и биологический смысл бактериальных люминесцентных систем

1.4. Значение кислорода в метаболизме светящихся бактерий

1.5. Токсические эффекты молекулярного кислорода и его активных форм

1.6. Механизмы защиты бактерий от окислительного стресса

1.7. Использование бактериальных люминесцентных систем в интегральном анализе

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль люминесцентной реакции в защите фотобактерий от окислительного стресса"

Актуальность проблемы. Кислород является необходимым условием существования всех аэробных организмов. В биологических реакциях и под действием различных физико-химических факторов окружающей среды образуются продукты неполного восстановления О2, более реакционно-способные и обладающие высокой токсичностью для клетки (Афанасьев, 1984; Владимиров и др., 1991; Зенков, 1993; Владимиров, 1998). В процессе эволюции у некоторых видов бактерий появилась способность к генерации активных форм кислорода (АФК), которую они используют для колонизации других организмов, в межвидовой конкуренции или как сигнальную систему (Denis et.al., 1989; Warren et.al., 1990; Kuo et.al., 1995). Собственную безопасность бактерии обеспечивают с помощью мощных систем антиоксидантной защиты.

Светящиеся бактерии распространены по всему Мировому океану, от тропических до полярных широт, и от поверхностных слоев до глубин в несколько тысяч метров. Фотобактерии выделены свободноживущими из морской воды, с поверхности морских животных и из кишечников рыб, как симбионты из бактериофотофоров рыб и головоногих моллюсков (Nealson, Hastings, 1979). Считается, что существование в морской воде в свободном состоянии является транзитной фазой между хозяевами (Гительзон и др., 1985).

Возможность генерации в среду АФК фотобактериями, по аналогии с несветящимися видами, предполагают некоторые авторы (Лабас и др. 1996, 1999). Для устранения токсического эффекта молекулярного кислорода и его активных форм у бактерий имеется «классическая» ферментативная антиоксидантная система (АОС). Бактерии с отсутствием такой системы защиты обладают низкой симбиотической способностью (Martin, Fridovich, 1981; Visick, Ruby, 1998;. Redford et. al., 1990).

Кислород является необходимым компонентом дыхания и люминесцентной реакции. В основе свечения бактерий, как и других живых организмов, лежит катализируемая специфическими ферментами химическая реакция, которая сопровождается излучением квантов видимого света. Ферменты называют люциферазами, а окисляемые ими субстраты - люциферинами (Hastings, Nealson, 1977; Гительзон и др., 1984; Lee, 1985; Tu, Mager, 1995).

Хотя люциферазы разных видов светящихся бактерий отличаются по своим физическим и кинетическим свойствам, все они катализируют одну и ту же реакцию: люцифераза

ФМНН2 + RCHO + 02 -► ФМН + RCOOH + Н20 + hv

Здесь ФМН и ФМНН2 - окисленная и восстановленная форма флавинмононуклеотида, RCHO и RCOOH -длинноцепочечный алифатический альдегид и соответствующая жирная кислота. Восстановление ФМН может осуществляться ферментативным путем с помощью НАДН: ФМН-оксидоредуктазы:

НАДН: ФМН-оксидоредуктаза

ФМН + НАДН + Н* -► ФМН Н2 + НАД+

В возбуждении биолюминесценции могут участвовать активные кислородные радикалы (Кратасюк и др., 1977; Watanabe, Nakamura, 1976; Watanabe et.al., 1993; Wada, 1997) и алифатические альдегиды, продукты перекисного окисления липидов (ПОЛ) мембран (Берия и др., 1991;

Berkovich et. al., 1991; Ulitzur, 1991). Инициация процессов ПОЛ осуществляется при взаимодействии АФК с полиненасыщенными жирными кислотами. В условиях окислительного стресса происходит увеличение интенсивности ПОЛ (Cross et. al., 1987; Gutteridge, Halliwell, 1990; Halliwell, Chirico, 1993). В связи с вышеизложенным, предполагают, что люминесцентная система является аналогом антиоксидантной и участвует в защите бактерий от окислительного стресса. Антиоксидантный генезис биолюминесценции рассматривают для фотобактерий (Лабас, 1990; Gitelson, Labas, 1993; Watanabe,1993); светляков (Barros, Bechara,1998) и морских эукариот (Rees et al.,1998; 2000). Генерация АФК фотобактериями в условиях высокой активности собственных систем защиты создает огромное преимущество в межвидовой конкуренции и способствует колонизации многоклеточных организмов.

Цель исследования. Изучить роль люминесцентной реакции фотобактерий в защите от окислительного стресса.

Задачи исследования:

1) Исследовать возможность генерации фотобактериями АФК в процессе роста.

2) Определить активность основных ферментов АОС каталазы и супероксиддисмутазы (СОД) у светящихся бактерий видов Photobacterium phosphoreum, Photobacterium leiognathi, Vibrio fischeri, Vibrio harveyi и рекомбинантного штамма Escherichia coli.

3) Изучить особенности свечения и уровень активности АОС в динамике роста бактерий Vibrio harveyi.

6) Исследовать возможность участия малонового диальдегида (МДА) в качестве субстрата бактериальной люминесцентной реакции в отсутствии алифатического альдегида in vitro.

Научная новизна и теоретическая значимость работы.

1) Впервые показана генерация АФК фотобактериями в экспоненциальной фазе роста.

2) Впервые изучена совместная роль антиоксидантной и люминесцентной систем фотобактерий в механизмах антиоксидантной защиты. Показано, что окислительный стресс является общим пусковым механизмом для проявления повышенной активности ферментов антиоксидантной и люминесцентной систем, что подтверждается кинетическими параметрами свечения и активностью люциферазы бактерий Vibrio harveyi, увеличивающейся наряду с увеличением активности ферментов антиоксидантной защиты.

3) Впервые проведен сравнительный анализ активности ферментов антиоксидантной и люминесцентной систем у светящегося и несветящегося мутантного штаммов бактерий Vibrio harveyi. Показаны более высокие значения активности антиоксидантных ферментов мутантного штамма, вероятно являющиеся признаком адаптации.

Положения, выносимые на защиту:

Апробация материалов диссертации. Основные результаты работы доложены и обсуждены на II Съезде биофизиков России (Москва, 1999); 10-ом Международном симпозиуме по биолюминесценции и хемилюминесценции (Болония, Италия, 1998); XIII Биофизическом конгрессе (Нью Дели, Индия, 1999); 1-ом Французском собрании по химии окружающей среды (Нэнси, Франция, 2000); 4-й Международной конференции по биологической физике (Киото, Япония, 2001); VI Международной конференции «Биоантиоксидант» (Москва, 2002); 2-й Европейской конференции по медицинской и биологической инженерии (Вена, Австрия, 2002); Международном Экологическом Форуме (Санкт-Петербург, 2003); а также на ряде Международных и Всероссийских экологических студенческих конференциях (1999, 2000, 2002).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи и 9 тезисов и материалов конференций. и

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 118 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, двух глав с изложением результатов работы, заключения, выводов и списка литературы (234 источника, в том числе 179 - зарубежных). Диссертация иллюстрирована 26 рисунками и 11 таблицами.

Заключение Диссертация по теме "Экология", Реммель, Наталья Николаевна

ВЫВОДЫ

1. Светящиеся бактерии генерируют в среду АФК в фазе экспоненциального роста.

2. У всех изученных видов фотобактерий найдена высокая активность основных ферментов АОС каталазы и СОД.

3. В динамике роста бактерий Vibrio harveyi показано изменение активности ферментов АОС и свечения.

4. Окислительный стресс является общим пусковым механизмом регуляции двух систем, антиоксидантной и люминесцентной, проявляющийся в ранней индукции люминесцентного свечения, увеличении интенсивности свечения и увеличении активности люциферазы наряду с активностью антиоксидантных ферментов.

6. АФК стимулируют свечение фотобактерий и могут являться субстратами люминесцентной реакции.

8. МДА стимулирует люминесценцию в отсутствии в системе алифатического альдегида, а спектр наблюдаемого свечения совпадает со спектром биолюминесценции.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Широкое распространение биолюминесценции на различных уровнях организации организмов позволяет признать, что в эволюции бактерий свечение дает его обладателям огромное селективное преимущество. На примере рыб с бактериофорами, сообщающимися с задней кишкой, особенно ясно видно, какая сложная биологическая задача ими решается: создаются абсолютно избирательные условия для роста только определенного симбионтного вида и, может быть, даже штамма фотобактерий в условиях прямого контакта с кишечником, населенным множеством других бактерий, способных расти на тех же средах.

Иными словами, в световом органе одной рыбы обитает один вид и, почти всегда, один штамм светящихся бактерий; отсутствует контаминация другими видами светящихся и несветящихся бактерий, а различия между изолятами, выделенными из разных рыб одного вида, существуют, но не превышают различий между штаммами, и не выходят за рамки внутривидовых вариантов (Ruby, Nealson, 1976). Для светящихся бактерий или, по крайней мере, для некоторых их видов, существование в морской воде в свободном состоянии является транзитной фазой между хозяевами.

Первый способ подтверждается полученными данными по обнаружению генерации фотобактериями АФК в экспоненциальной фазе роста бактерий. Защита же собственной культуры осуществляется наличием двух систем - антиоксидантной и люминесцентной. В условиях окислительного стресса показано как увеличение активности антиоксидантных ферментов, так и интенсивности свечения.

Что касается второго способа, можно заметить, он должен быть расточителен для организма хозяина, от которого требуется большой расход веществ и энергии на поддержание быстрого нелимитированного роста клеток симбионтов, без чего этот способ неэффективен. Относительно иммунной защиты избранного штамма бактерий организмом рыбы на сегодня ничего не известно.

Открытие аутоиндукции синтеза ферментов люминесцентной системы показало, что свечение начинается только по достижении

7 Я критическои плотности популяции 10-10° кл./мл. Стрессовый фактор 032 стимулирует высокий уровень люминесценции и экспрессию генов регуляции аутоиндукции (Meighen, 1988). Этот же фактор стимулирует экспрессию генов и периплазматической каталазы (Visick, Ruby, 1998). В работе показано, что в условиях индуцируемого окислительного стресса в бактериальной культуре индукция люминесцентного свечения начинается раньше. Таким образом, окислительный стресс является общим пусковым механизмом регуляции двух систем, люминесцентной и антиоксидантной.

Наиболее интересен механизм, обеспечивающий селективное преимущество светящимся бактериям перед темновыми вариантами того же вида. Было показано увеличение активности антиоксидантных ферментов каталазы и супероксиддисмутазы темнового штамма бактерий в несколько раз по сравнению со светящимся штаммом. В отсутствии люминесцентной системы бактерии теряют резистентность к высоким концентрациям перекиси водорода. Анализ полученных в работе результатов позволяет говорить о том, что реакция люминесценции, наряду с АОС участвует в защите фотобактерий от окислительного стресса.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Реммель, Наталья Николаевна, Красноярск

1. Афанасьев И.Б. Свободные кислородные радикалы в процессах жизнедеятельности / И.Б. Афанасьев // Кислородные радикалы в химии и биологии / Под редакцией Е.Ф. Лунца, И.Б. Афанасьева. - Минск: Наука и техника, 1884. - С. 123-127.

2. Барабой В.А. Механизмы стресса и перекисное окисление липидов / В.А.Барабой // Успехи совр. биологии. 1991. - Т.111. Вып.6. — С.923-931.

3. Берия Л.В. Стимуляция биолюминесцентной активности бактериальной люциферазы продуктами Fe2+ индуцированного перекисного окисления липидов / Л.В.Берия, А.Д.Исмаилов, B.C. Данилов // Биохимия. 1991. - Т. 56. - С. 477 - 485.

4. Вартанян Л.С. Супероксиддисмутаза / Л.С. Вартанян // Пептиды и белки. М.: Наука, 1995. - Т.1. - С. 89-95.

5. Воеводина Т.В. Биолюминесцентный метод оценки степени тяжести состояния больных с выраженной эндогенной интоксикацией организма / Т.В. Воеводина, O.E. Нифантьев, А.Н. Ковалевский // Лаб. дело. 1990. - № 9. - С. 23-25.

6. Виноградова Р.Н. Молекулярные основы действия ферментов / Р.Н. Виноградова. Киев: Вища школа, 1978. — С. 238-240.

7. Владимиров Ю.А. Свободные радикалы в живых системах / Ю.А.Владимиров, О.А.Азизова, А.И. Деев // Биофизика. Итоги науки и техники. ВИНИТИ, 1991.- Т.29. - 252с.

8. Владимиров Ю.А. Свободные радикалы в первичных фотобиологических процессах / Ю.А.Владимиров // Биологические мембраны. 1998. - Т. 15, №5. - С. 517-529.

9. Высоцкий Е.С. Энергетические соотношения между интенсивностью люминесценции, тепловыделением и интенсивность дыхания при периодическом культивировании

10. Photobacterium sp. / E.C. Высоцкий, А.И. Пожидаев, Э.К. Родичева // Биофизика. 1980. - Т. 25, №2. - С. 365-366.

11. Высоцкий Е.С. О механизме синтеза альдегидного фактора у светящихся бактерий / Е.С. Высоцкий, В.В. Заворуев, В.В. Межевикин // ДАН СССР. 1981. - Т. 256, № 4. - С. 995-998.

12. Высоцкий Е.С. О квантовом выходе бактериальной биолюминесценции / Е.С. Высоцкий, Э.К. Родичева, Г.Я. Щербакова// Микробиология. 1981. -Т. 50, Вып. 4. - С. 581-584.

13. Гительзон И.И. Светящиеся бактерии / И.И.Гительзон, Э.К.Родичева, С.Е. Медведева. Новосибирск: Наука, 1984. - С. 108-112, 159.

14. Гительзон И.И. К вопросу об энергетических соотношениях между биолюминесценцией и дыханием светящихся бактерий / И.И. Гительзон, Р.И Чумакова., А.М. Фиш / Биофизика. 1965. -Т. 10, №1.- С. 100-104.

15. Данилов B.C. Бактериальная биолюминесценция / В.С.Данилов, Н.С. Егоров//МГУ. 1990.-С. 133-136.

16. Диксон М. Ферменты. / М.Диксон, Э. Уэбб. М.: Мир, 1982. -Т.1.-312 с.

17. Дубинина Е.Е. Окислительная модификация белков / Е.Е. Дубинина, Д.А. Шугалей // Успехи совр. биол. 1993. - Т. 113, Вып. 1.-С. 71-81.

18. Дубинина Е.Е. Окислительная модификация белков: окисление триптофана и образование битирозина в очищенных белках с использованием системы Фентона / Е.Е.Дубинина, C.B. Гавровская, Е.В. Кузьмич // Биохимия. 2002. - Т.67, № 3. — С.413-421.

19. Заворуев В.В. Непрерывное культивирование светящихся бактерий Photobacterium phosphoreum с управлением полюминесценции / В.В.Заворуев, B.B. Межевикин // Прикл. биохимия и микробиол. 1983. - Т. 19, Вып. 4. - С.564.

20. Зенков Н.К. Активированные кислородные метаболиты в биологических системах / Н.К. Зенков // Успехи совр. биологии.- 1993. Т. 113, Вып. 3. - С. 286-295.

21. Имшеницкий A.A. Ферменты микрооганизмов / А.А Имшеницкий, -М.: Наука, 1973. С. 298 - 300.

22. Илларионов Б. А. Клонирование и экспрессия генов люминесцентной системы Photobacterium leiognathi в плазмидном векторе pUCl8 / Б.А.Илларионов, М.В. Протопопова//Генетика.- 1985.-№6.-С.10-13.

23. Калачева Г.С. Состав липидов люминесцирующего бесклеточного экстракта из светящихся бактерий / Г.С.Калачева, Е.С.Высоцкий, В.В. Межевикин // Биохимия. Т.50, № 11. - С. 1811-1816.

24. Кения М.В. Роль низкомолекулярных антиоксидантов при окислительном стрессе / М.В. Кения, Л.И. Лукаш, Е.И. Гуськов // Успехи совр. биологии. 1993. - Т. 1.13, Вып. 4. - С.456-470.

25. Кратасюк Г.А. О возможном участии синглетного кислорода в возбуждении бактериальной люминесценции / Г.А. Кратасюк, A.B. Подоплелов, В.А. Кратасюк // ДАН СССР. 1977. - Т.236, № 5. -С.1247-1249.

26. Кратасюк В.А. Бактериальная биолюминесценция и биолюминесцентный анализ / В.А. Кратасюк, И.И. Гительзон // Биофизика. 1982. - Т 27, Вып. 6. - С. 937-940.

27. Кратасюк В.А. Использование светящихся бактерий в биолюминесцентном анализе / В.А. Кратасюк, И.И. Гительзон // Успехи микробиологии. 1987. - №21. - С.3-30.

28. Кратасюк В.А. Люциферазное биотестирование: биофизические основы, методы и применение: Автореф. дис. д-ра биол. наук / В.А. Кратасюк. Красноярск, 1994. - 20 с.

29. Кратасюк В.А. Принципы использования светящихся бактерий для анализа / В.А. Кратасюк, И.И. Гительзон. Красноярск, 1993. -С. 4-7.

30. Кудряшева Н.С. Физико-химические основы биолюминесцентного анализа / Н.С. Кудряшева, В.А. Кратасюк, E.H. Есимбекова. Красноярск: Граффити, 2002. - 154с.

31. Кузнецов A.M. Биотест на основе лиофилизированных светящихся бактерий / A.M. Кузнецов, Э.К. Родичева, Е.В. Шилова // Биотехнология. 1996. - №9. - С. 57-61.

32. Лабас Ю.А. Происхождение биолюминесцентных систем / Ю.А. Лабас, Т.А. Телегина, В.А. Захарченко // Тез. докл. 1 Всеросс. конф. по фотобиологии. Пущино, 1996. - С. 95-96.

33. Лабас Ю.А. Происхождение биолюминесцентных систем / Ю.А. Лабас, Т.А. Телегина, А. П. Савицкий // Тез. докл. 2 Съезда биофизиков России. Москва, 1999. - Т.З. - С. 95-96.

34. Лабас Ю.А. Антиоксидантный генезис биолюминесцентных систем / Ю.А. Лабас, Т.А. Телегина // Тез. докл. 3 Съезда фотобиологов России. Москва, 2001. - С. 109-110.

35. Ленинджер А. Основы биохимии / А. Ленинджер. М.: Мир, 1985.-Т. З.-С. 32-48.

36. Маргания В.А. Исследование эффективности проникновения длинноцепочечных алифатических альдегидов через бактериальную мембрану / В.А. Маргания, Ю.А. Малков, B.C. Данилов // Микробиология. 1989. - Т. 4. - С. 79-87.

37. Мажуль М.М. Исследование свойств НАД(Р)Н:ФМН-оксидоредуктазы из морских люминесцентных бактерий Vibrofischeri / М.М.Мажуль, B.C. Данилов // Биохимия. 1994. - Т. 59, № 10.-С. 1608-1614.

38. Меньшикова Е.Б. Антиоксиданты и ингибиторы радикальных окислительных процессов /Е.Б. Меньшикова, Н.К. Зенков // Успехи совр. биологии. 1993. - Т.113, Вып. 4. - С. 442-445.

39. Метелица Д.Н. Активация кислорода ферментативными системами / Д.Н. Метелица. М.: Наука, 1982. - С.62-66.

40. Межевикин В.В. Получение и некоторые свойства «альдегидного фактора» из светящихся бактерий / В.В. Межевикин, В.В. Заворуев, Е.С. Высоцкий // Известия СО АН СССР. 1981. -Вып.З.

41. Мирошниченко О.С. Биогенез, физиологическая роль и свойства каталазы / О.С.Мирошниченко // Биомембраны и клетка. — 1989. — №7. — С. 452-460.

42. Петушков В.Н. Биферментная система NADH: FMN -оксидоредуктаза — люцифераза из светящихся бактерий / В.Н. Петушков, Г.А. Кратасюк, Н.С. Родионова // Биохимия. 1984. -Т. 49, № 4. - С. 699-709.

43. Петушков В.Н. Изучение эффективности работы биферментной системы NADH : FMN- оксидоредуктаза люцифераза светящихся бактерий / В.Н. Петушков, Н.С. Родионова, П.И. Белобров // Биохимия. - 1985. - Т. 50, № 3. - С. 401-405.

44. Печуркин Н.С. Автоселекционные процессы в непрерывной культуре микроорганизмов / Н.С. Печуркин, И.А. Терсковю — Новосибирск, 1973. — 64 с.

45. Попова Л.Ю. Путь синтеза альдегидного фактора — основного субстрата люциферазы / Л.Ю. Попова, А.Н. Шендеров // Биохимия. 1983. - Т.48, № 6. - С. 983-989.

46. Родионова Н.С. Кинетические особенности переключения бактериальной люциферазы с одного альдегидного субстрата надругой / Н.С. Родионова, В.Н. Петушков, П.И. Белобров // Биофизика. Т. 33, Вып. 3. - С. 396-400.

47. Рубин А.Б. Транспорт электронов в биологических системах /

48. A.Б. Рубин, В.П. Шинкарев. М.: Наука, 1984. - 320 с.

49. Сахаров Г.Н. Взаимодействие С14 и С16 — ненасыщенных альдегидов с бактериальной люциферазой / Г.Н. Сахаров, А.Д. Исмаилов, Б.Г. Ковалев // Биохимия. 1986. - Т. 51, № 9. -С.1459-1464.

50. Соболев А.Ю. Кинетика биолюминесценции в реакции бактериальной люциферазы с различными алифатическими альдегидами / А.Ю. Соболев, А.Д. Исмаилов, B.C. Данилов // Биохимия. 1989. - Т.54, № 12. - С. 2061-2065.

51. Фёршт Э. Структура и механизм действия ферментов / Э. Фёршт. -М.: Мир, 1980.-432 с.

52. Фиш A.M. Влияние концентрации кислорода на рост и люминесценцию непрерывной культуры. / А.М.Фиш, Р.И. Чумакова // Микробиология. 1968. - Т 37, № 5. - С. 827-831.

53. Фридович И. Радикалы кислорода, пероксид водорода и токсичность кислорода. / И. Фридович // Свободные радикалы в биологии / Под ред. Н.М. Эммануэля. М.: Мир, 1979. - С. 272307.

54. Чумакова Р.И. Светящиеся бактерии / Р.И. Чумакова, И.И. гительзоню М.: Наука, 1975. - 108 с.

55. Шаронов Б.П. Окислительная модификация и инактивация супероксиддисмутазы гипохлоритом / Б.П. Шаронов, И.В. Чурилова // Биохимия. 1982. - Т.57, № 5. - С.719-727.

56. Шумихин В.Н. Выделение и очистка бактериальной люциферазы из Photobacterium fischeri для аналитических целей /

57. B.Н.Шумихин, B.C. Данилов, Ю.А. Малков, Н.С. Егоров // Биохимия. 1980.-Т. 45, №9.-С. 1576-1581.

58. Шлегель Г. Общая микробиология / Г.Шлегель. М.: Мир, 1987.- С. 246-247.

59. Эрснер JI. Биохимия токсичности кислорода / JI. Эрснер // Перспективы биоорганической химии и молекулярной биологии.- М.: Наука, 1986. С. 207-210.

60. Armstrong D. Free radical and antioxidant protocols. Introduction. / D. Armstrong // Methods Mol. Biol. 1998. - Vol. 108. - P. 5-7.

61. Babbitt P.C. Undestanding enzyme superfamilies. Chemistry as the fundamental determinant in the evolution of new catalytic activities / P.C. Babbitt, J.A. Gerlt // J. Biol. Chem. 1997. - Vol. 202, N 49. - P. 30591-30594.

62. Barros M.P. Bioluminescence as a possible auxiliary oxygen detoxifying mechanism in Elaterid Larvae / M.P.Barros, E.J.H. Bechara // Free Rad. Biol. & Med. 1998. - Vol. 24, N 5. - P.767-777.

63. Barah M. The use of luminous bacteria for determination of phagocytoses / M. Barah, S.Ulitzur, D.Merzbach // Immunol. Methods.- 1983. Vol.64.-P.353-363.

64. Barker M.G. Effect of Cu, Zn superoxide dismutase disruption mutation on replicative senescence in Saccharomyces cerevisiae / M.G. Barker, LJ.E. Brimage, K.A. Smart // FEMS Microbiol. Letters.- 1999. Vol.177. - P. 199-204.

65. Baldwin Т.О. Bacterial luciferase. Biding of oxidized flavin mononucleotide / Т.О. Baldwin, M.Z. Nicoli, J.E. Becvar, J.W. Hastings // J. Biol. Chem. 1975. - Vol. 250. - P. 2763-2768.

66. Balny C. Fluorescence and bioluminescence of bacterial luciferase intermediates / C. Balny, J.W. Hastings // Biochemistry. 1975. — Vol. 14.-P. 4719-4723.

67. Bagyan I. The katX gene, codes for the catalase in spores of Bacillus subtilis, is a forespore-specific gene controlled by aF, and KatX is essential for hydrogen peroxide resistance of the germinating spore / I.

68. Bagyan, L. Casillas-Martinez, P. Setlow // J. Bacteriol. 1998. - Vol. 180,N8.-P. 2057-2062.

69. Beckman K.B. Oxidative decay of DNA / K.B. Beckman, B.N. Ames // J. Biol. Chem. 1997. - Vol. 272, N 32. - P.19633-19636.

70. Belas R. Bacterial bioluminescence: Isolation and expression of luciferase genes from Vibrio harveyi / R. Belas, A. Mileham, D. Cohn // Science. 1982. - Vol. 218. - P. 791-793.

71. Bertsova Y.V. Two NADH: ubiquinone oxidoreductases of Azotobacter vinelandii and their role in the respiratory protection / Y.V. Bertsova, A.V. Bogachev, V.P. Skulachev // Biochem. Bioph. Acta. 1998. - Vol.1363. - P.125-133.

72. Bollomo G. Oxidative stress mechanism of cytotoxity / G. Bollomo // Chemica Scripta. - 1987. - N 27. - P. 117-120.

73. Bourne Y. Novel dimeric interface and electrostatic recognition in bacterial Cu, Zn superoxide dismutase / Y. Bourne, S.M. Redford, H.M. Steinman // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. - Vol. 93. -P. 12774-12779.

74. Bourgois J.J. Kinetics of light emission and oxygen consumption by bioluminescent bacteria / J.J. Bourgois, E.E. Sluse, F. Baquet, J. Mallefet // J. Bioenerg. Biomemr. 2001. - Vol.33, N 4. - P. 353-363.

75. Cadenas E. Biochemistry of oxygen toxicity / E. Cadenas // Annu. Rew. Biochem. 1989. - N58. - P.79-110.

76. Chang T.C. Protein oxidation and turnover / T.C. Chang, W.Y. Chou, G.G. Chang // J. of Biomed. Sci. 2000. - N 7. - P. 357-363.

77. Chen S.X. Hydroxyl-radical production in physiological reactions. A novel function of peroxidase / S.X. Chen, P. Schopfer, H.Y. Cheng // Eur. J. Biochem. 1999. - Vol. 260, N 3. - P. 726-735.

78. Chen L.H. Random and site directed mutagenesis of bacterial luciferase: investigation of aldehyde binding site / L.H. Chen, T.O. Baldwin // Biochemistry. 1989. - Vol. 28, N 6. - P. 2684-2689.

79. Cornish-Bowden A. The amino acid sequences of the copper/zinc superoxide dismutases from swordfish and Photobacter leiognathi confirm the predictions made from the compositions / A. Cornish-Bowden//Eur. J. Biochem. 1985. - Vol.151. - P.333-335.

80. Colepicolo P. Induction of bacterial luciferase by pure oxygen. / P. Colepicolo, V.C.C.P. Camarero, J. Eckstein, J.W. Hastings // J. Gen. Microbiol. 1992. - Vol.138. - P.831-836.

81. Davies K.J. Protein damage and degradation by oxygen radicals. I. General aspects / K.J. Devies, M.E. Delsignore, S.W. Lin // J. Biol. Chem. 1987. - Vol. 262, N 20. - P. 9895-9901.

82. Davies K.J. Protein damage and degradation by oxygen radicals. II. Modification of amino acids / K.J. Devies, M.E. Delsignore, S.W. Lin // J. Biol. Chem. 1987. - Vol. 262, N 20. - P. 9902-9907.

83. Davies K.J. Protein damage and degradation by oxygen radicals. III. Modification of secondary and tertialy structure / K.J. Devies, M.E. Delsignore // J. Biol. Chem. 1987. - Vol. 262, N 20. - P. 9908-9913.

84. Davies K.J. Protein damage and degradation by oxygen radicals. IV. Degradation of denatured protein / K.J. Devies, S.W. Lin, R.E. Pacifici // J. Biol. Chem. 1987. - Vol. 262, N 20. - P. 9914-9920.

85. Davies K.J. Oxidative stress: the paradox of aerobic life / K.J. Devies //Biochem. Soc. Symp. -1995.-Vol. 61.-P. 1-31. '

86. Denis M. Hydrogen peroxide is the end product of oxygen reduction by the terminal oxidase in the marine bacterium Pseudomonas nautical 617 I M. Denis, S. Arnaud, F. Malatesta // FEBS Letts. 1989. -Vol.247, N 2. - P. 475-479.

87. Dix T.A. Mechanisms and biological significance of lipid peroxidation initiation / T.A. Dix, J. Aikens // Chem. Res. Toxicol. -1993.-Vol. 6.-P. 2-18.

88. Demple B. Radical ideas: Genetic responses to oxidative stress / B. Demple // Clin. Exp. Pharm. Phisiol.- 1999. Vol.26. - P.64-68.

89. Duane W. Flavin mononucleotide reductase of luminous bacteria / W. Duane, J.W. Hastings // Mol. Cell. Biochem. 1975. - Vol.6, N 1. - P. 53-64.

90. Douki T. Hydroxyl radicals are involved in the oxidation of isolated and cellular DNA bases by 5-aminolevulinic acid / T. Douki, J. Onuki, M.H.G. Medeiros // FEBS Letts. 1998. - Vol. 428. - P. 93-96.

91. Duke M.V. Isoenzymes of cuprozinc superoxide dismutase from Pisum sativum / M.V. Duke, M. L. Salin // Phytochem. 1983. - Vol. 22, N 11.-P. 2369-2373.

92. Dutton P.L. A reductant-induced oxidation mechanism for complex I / P.L. Dutton, C.C. Moser, V.D. Sled // Biochem. Bioph. Acta. 1998. -Vol.1364.-P.245-257.

93. Esimbekova E.N. Bioluminescent method to determine non-specific endotoxicosis in therapy / E.N. Esimbekova, V.A. Kratasyuk, V.V. Abakumova//Luminescence. 1999. - Vol.14, N 1. - P.197-198.

94. Exton J.H. The perfusion rat liver / J.H. Exton // Methods Enzymol. -1975.-Nl.-P. 75-86.

95. Eberlein G. The chemistry of a 1.5-diblocked flavin. 2. Proton and electron transfer steps in the reaction of dihydroflavins with oxygen /

96. G. Eberlein, T.C. Bruice It J. Am. Chem. Soc. 1983. - Vol. 105. - P. 6685-6697.

97. Francisco W.A. Interaction of bacterial luciferase with aldehyde substrates and inhibitiors / W.A. Francisco, H.M. Abu-Sound, T.O. Baldwin, F.M. Raushel // J. Biol. Chem. 1993. - Vol. 268, N 3. - P. 24734-24741.

98. Fridovich I. Oxygen toxicity: a radical explanation / I. Fridovich // J. Exsp. Biol. 1998. - Vol.201. - P.1203-1209.

99. Fridovich I. The trail to superoxide dismutase / I. Fridovich // Protein Science. 1998. - Vol. 7. - P.2688-2690.

100. Fridovich I. Superoxide anion radical (O2'), Superoxide dismutases, and related matters /1. Fridovich // J. Biol. Chem. 1997. - Vol.272, N 30. - P.18515-18517.

101. Fridovich I. Superoxode radical and superoxide dismuteses / I. Fridovich // Annu. Rev. Biochem. 1995. - N64. - P. 97-112.

102. Fidopiastis P.M. Cryptic luminescence in the cold-water fish pathogen Vibrio salmonicida. / P.M. Fidopiastis, H. Sorum, E.G. Ruby // Arch. Microbiol. 1999. - Vol. 171. - P. 205-209.

103. Fidopiastis P.M. A new niche for Vibrio logei, the predominant light organ symbiont of squids in the genus Sepiola. / P.M. Fidopiastis, S. Boletzky, E.G. Ruby // J. Bacteriol. 1998. - Vol.180, N 1. - P.59-64.

104. Ghadermarzi M. Influence of diffrent types of effectors on the kinetic parameters of suicide inactivation of catalase by hydrogen peroxide / M. Ghadermarzi, A.A. Moosavi Movahedi // Biochim. Biophys. Acta. - 1999. - Vol. 1431, N 1. - P. 30-36.

105. Gort A.S. Balance between endogenous superoxide stress and antioxidant defenses / A.S. Gort, J.A. Imlay // J. Bacteriol. 1998. -Vol.180, N6.-P. 1402-1410.

106. Gott L. Heat and pH dependence of catalase / L. Gott I I Acta Biol. Hung. 1987. - Vol. 36, N 2. - P. 279-285.

107. Gruñe T. Oxidants and antioxidative defense / T. Grune // Hum. Exp. Toxocol. 2002. - Vol. 21, Issue 2. - P. 61-62.

108. Goss S.P.A. Bicarbonate enhances the peroxidase activity of Cu, Zn-superoxide dismutase / S.P.A. Goss, R.J. Singh, B. Kalyanaraman // J. Biol. Chem. 1999. - Vol. 274, N 40. - P. 28233-28239.

109. Gibson Q.H. The oxidation of reduced flavin mononucleotide by molecular oxygen / Q.H. Gibson, J.W. Hastings // Biochem. J. 1962. -Vol. 83. - P.368-377.

110. Gutteridge J.M.C. The measurement and mechanism of lipid peroxidation in biological systems. / J.M.C. Gutteridge, B. Halliwell // TIBS. 1990.-Vol. 15.-P. 129-135.

111. Hart R.S. Recent advanse in the mechanisms of bio and chemiluminescent reaction / R.S. Hart, M. Cormier // Photochem. Photobiol. - 1979. - Vol. 29. - P. 209-215.

112. Hastings J.W. Intermediates in the bioluminescent oxidation of reduced FMN / J.W. Hastings, Q.H. Gibson // J. Biol. Chem. 1963.-Vol. 238.-P. 2537-2554.

113. Hastings J.W. The oxygenated bacterial luciferase-flavin intermediate. Reaction products via the light and dark pathways / J.W. Hastings, C. Balny // J. Biol. Chem. 1975. - Vol. 250. - P. 72887293.

114. Hastings J.W. Spectral properties of an oxygenated luciferase-flavin intermediate isolated by low-temperature chromatography / J.W. Hastings, C. Balny, C. LePeuch, P. Douzou // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1973. - Vol. 70. - P. 3468-3472.

115. Hastings J.W. Bacterial bioluminescence / J.W. Hastings, K.H. Nealson // Ann. Rev. Microbiol. 1977. - Vol. 31. - P. 549-595.

116. Hastings J. W. Intermediates in the bioluminescent oxidation of reduced FMN / J. W. Hastings, Q. Gibson // J. Biol.Chem. 1963. -Vol. 238.-P. 2537-2554.

117. Hastings J.W. Biochemestry and Physiology of Bioluminescent Bacteria / J.W. Hastings, C.J. Potrikus, S.C. Gupta, M. Kurfurst, I.C. Makemson // Adv. Microb. Physiol. 1985. - Vol. 26. - P. 235-291.

118. Hastings J.W. The purification, properties and chemiluminescent quantum yield of bacterial luciferase / J.W. Hastings, W.H. Rilley, I. Massa // J. Biol.Chem. 1965. - Vol. 240. - P. 1473-1481.

119. Hastings J.W. Quorum sensing: the explanation of a curious phenomenon reveals a common characteristic of bacteria / J.W. Hastings, E.P. Greenberg // J. Bacteriol. 1999. - Vol.181, N9. -P.2667-1668.

120. Halliwell B. Lipid peroxidation: its mechanism, measurement and significance / B. Halliwell, S. Chirico // Am. J. Clin. Nutr. 1993. -Vol. 57. - P. 715S-25S.

121. Halliwell B. Mechanisms involved in the generation of free radicals / B. Halliwell // Pathol. Biol. 1996.- Vol. 44. - P. 6-13.

122. Halliwell B. Oxidative stress: adaptation, damage, repair and death / B. Halliwell, M. Gutteridge // Free radical in biology and medicine. -Oxford: University Press, 2003. P. 246-350.

123. Holzman T.F. Reversible inhibition of the bacterial luciferase catalyzed bioluminescence reaction by aldehyde substrate: Kinetic mechanism and ligand effects / T.F .Holzman, T.O. Baldwin // Biochemistry. 1983. - Vol. 22. - P. 2838-2846.

124. Hems R. Gluconeogenesis in the perfusirt rat liver / R. Hems, B.D. Ross, M.N. Berry, H.A.Krebs // J. Biochem. 1966. - Vol. 101. - P. 284-292.

125. Henle E.S. Formation, prevention, and repair of DNA damage by iron/hydrogen peroxide / E.S. Henle, S. Linn // J. Biol. Chem.-1997. -Vol.272,N31.-P. 19095-19098.

126. Hertel C. Oxygen-dependent regulation of the expression of the catalase gene katA of Lactobacillus sakei LTH677 / C. Hertel, G. Schmidt, M. Fischer // Appl. Env. Microbiol. 1998. - Vol.64, N 4. -P. 1359-1365.

127. Hoehler D. Free radical generation as induced by Ochratoxin A and its analogs in bacteria {Bacillus brevis) / D. Hoehler, R.R. Marquardt, A.R. Mcintosh, H. Xiao // J. Biol. Chem. 1996. - Vol. 271, N 44. - P. 27388-27394

128. Hillar A. Intracellular location of catalase-peroxidase hydroperoxidase I of Escherichia coli / A. Hillar, L. VanCaeseele, P.C. Loewen // FEMS Microbiol. Lett. 1999. - Vol.170. - P.307-312.

129. Huang S. Identification and characterization of a catalytic base in bacterial luciferase by chemical rescue of a dark mutant / S.Huang, SC. Tu // Biochemistry. 1997. - Vol. 36. - P. 14609-14615.

130. Jablonski E. Purification and properties of the NADH and NADPH specific FMN oxidoreductases from Beneckea harveyi / E. Jablonski, M. DeLuca // Biochemistry. 1977. - Vol. 16. - P. 2932-2936.

131. Jablonski E. Studies of the control of luminescence in Beneckea harveyi'. properties of the NADH and NADPH:FMN oxidoreductases / E. Jablonski, M. DeLuca // Biochemistry. 1978. - Vol. 17. - P. 672678.

132. Ichise N. A mechanism of resistance to hydrogen peroxide in Vibrio rumoiensis S-l / N. Ichise, N. Morita, T. Hoshino // Appl. Env. Microbiol. 1999. - Vol.65, N 1. - P. 73-79.

133. Inaoka T. Molecular cloning and nucleotide sequence of the superoxide dismutase gene and characterization of its product from

134. Bacillus subtilis / T. Inaoka, Y. Matsumura, T. Tsuchido / J. Bacteriol. 1998. - Vol.180, N 14. - P.3697-3703.

135. Inouye S. NAD(P)H- flavin oxidoreductase from the bioluminescent bacterium, Vibrio ßscheri ATCC7744, is a flavoprotein / S. Inouye // FEBS Lett. 1994. - Vol.347. - P. 163-168.

136. Imlay K.R.C. Cloning and analysis of sodC, encoding the copper-zinc superoxide dismutase of Escherichia coli / K.R.C. Imlay, J.A. Imlay / J. Bacteriol. 1996. - Vol. 178, N 9. - P. 2564-2571.

137. Imlay J.A. A metabolic enzyme that rapidly produced superoxide, fumarate reductase of Escherichia coli / J.A. Imlay // J. Biol. Chem.-1995. Vol. 270, N 34. - P. 19767-19777.

138. Ishikawa T. Increased cellular resistance to oxidative stress by expression of cyanobacterium catalase-peroxidase in animal cells / T. Ishikawa, Y. Ohta, T. Takeda // FEBS Letts. 1998. - Vol. 426. - P. 221-224.

139. Kanter M. Free radicals, exercise and antioxidant supplementation / M. Kanter // Proc. Nutr. Soc. 1998. - Vol. 57. - P. 9-13

140. Kalyanaraman B. Generation of free radical intermediates from foreing compaunds by neutrophil-derived oxidants / B. Kalyanaraman, P.G. Sohnle // J. Clin. Invest. 1985.-Vol. 75.-P. 1618-1625.

141. Key er K. Superoxide and the production of oxidative DNA damage / K. Keyer, A.S. Gort, J.A. Imlay // J. Bacteriol. 1995. - Vol. 177, N 23.-P. 6782-6790.

142. Klotz M.G. Phylogenetic relationships among prokaryotic and eukaryotic catalases / M.G. Klotz, G.R. Klassen, P.C. Loewen / Mol. Biol. Evol. 1997. - Vol.14, N 9. - P. 951-958.

143. Kobayashi H. Induktion of superoxide dismutase in Photobacterium leiognathi / H. Kobayashi, H. Tonokawa, S. Fukasawa, F. Yamakura// Free Rad. Res. Comms. 1991.- Vols. 12,13. - P. 437-441.

144. Kogure K. Bioenergetics of marine bacteria / K. Kogure // Env. Biotech.- 1998. Vol. 9. - P.278-282.

145. Kratasyuk V.A. Principle of luciferase biotesting / V.A. Kratasyuk // Proceeding of the First International School "Biological Luminescence", Wroclaw, Poland, June 20-23, 1989, World Scientific Publishing Co., Singapore. 1990.- P. 550-558.

146. Kirkman N. Catalase: a tetrameric enzyme with four tightly bound molecules of NADPH / N. Kirkman, G. Gaetani // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1984. - Vol. 81, N 14. - P. 4343-4347.

147. Kurfurst M. Bioluminescence emission from the reaction of luciferase-flavin mononucleotode radical with 0{ / M. Kurfurst, S. Ghisla, J.W. Hastings // Biochem. 1983. - Vol. 22, N 7. - P.1521-1525.

148. Koo J.-Y. Chemically initiated electron exchange luminescence. A new chemiluminescent reaction pathway for organic peroxides / J.-Y. Koo, G.B. Schuster // J. Am. Chem. Soc. 1977. - Vol.99. - P. 6107.

149. Kosower E.M. A proposed mechanism for light emission by bacterial luciferase involving dissociative electron transfer / E.M. Kosower // Bioch. Bioph. Res. Comm. 1982. - Vol. 92, N 2. - P. 356-364.

150. Labas J. On the origin of bioluminescent systems / Y.A. Labas, M.V. Matz, V.A. Zakhartchenko // Proc. of 11th Intern. Symp. On Biolum. and Chemolum.,- Singapore, 2000. P. 91 -94.

151. Lamarcq L.H. Induction of a gradual, reversible morphogenesis of its host's epithelial brush border by Vibrio fischeri / L.H. Lamarcq,

152. M.J. McFall-Ngai // Infection and Immunity. 1998. - Vol. 66, N 2. -P. 777-785.

153. Lee J. Bacterial bioluminescence. Quantum yields and stoichiometry of the reactants reduced flavin mononucleotide, dodecanal, and oxygen and of a product hydrogen peroxide / J. Lee // Biochemistry. 1972. - Vol. 11. - P. 3350.

154. Lee J. Mechanism of bacterial bioluminescence / J. Lee // Chemi-and Bioluminescence; Ed. Burr I.C. Morcel.: Bekker, 1985.

155. Lee J. The mechanism of bacterial bioluminescence / J. Lee, I.B.C. Matheson, F. Muller, D. O'Kane, J. Vervoort, A.W.G. Visser // Chemistry and Biochemistry of Flavoenzymes. 1991. - Vol. 2. - P. 109-151.

156. Lei B. Mechanism of reduced flavin from Vibrio harveyi NADH: FMN oxidoreductase to luciferase / B. Lei, S.-C. Tu. // Biochemistry. -1998. Vol. 37. - P. 14623-14629.

157. Liu M. Vibrio harveyi NADPH: FMN oxidoreductase: preparation and characterization of the apoenzyme and monomer — dimmer equilibrium / M. Liu, B. Lei, Q. Ding, J.C. Lee, S-C. Tu // Arch. Biochem. Biophys. 1997. - Vol. 333. - P. 89-95.

158. Liochev S.I. Induction of the soxRS regulon of Escherichia coli by superoxide / S.I. Liochev, L. Benov, D. Touati, I. Fridovich // J. Biol. Chem. 1999. - Vol. 274, N 14. - P. 9179-9181.

159. Lledias F. Oxidation of catalase by singlet oxygen / F. Lledias, P. Rangel, W.Hansberg // J. Biol. Chem. 1998. - Vol. 273, N 17. - P. 10630-10637.

160. Maccarone M. Ultraweak light emission is a common response of bacterial cells to chemicophysical stress / M. Maccarone, A.F. Agro, N. Rosato // J. Biol. Chem. 1998. - Vol. 13. - P.287-293.

161. Maringanti S. An intracellular iron chelator pleiotropically suppresses enzymatic and growth defects of superoxide dismutase-deficient Escherichia coli / S. Maringanti, J.A. Imlay // J. Bacteriol. -1999. Vol. 181, N 12. - P. 3792-3802.

162. Martin J.P. Evidence for a natural gene transfer from the Ponyfish to its bioluminescent bacterial symbiont Photobacter leiognathi / J.P. Martin, I. Fridovich // J. Biol. Chem. 1981. - Vol. 256, N 12. - P. 6080-6089.

163. Martin M.E. A Streptococcus mutans superoxide dismutase that is active with either manganese or iron as a cofactor / M.E. Martin, B.R. Byers, M.OJ. Olson // J. Biol. Chem. 1986. - Vol. 261, N 20. - P. 9361-9367.

164. Maj M. E. coli HPII catalase interaction with higt spin ligands: formate and fluoride as active site probes / M. Maj, P. Loewen, P. Nicholls // Biochim. Biophys. Acta. 1998. - Vol.1384. - P.209-222.

165. Murshudov G.N. Structure of the heme d of Penicillium vitale and Escherichia coli catalases / G.N. Murshudov, A.I. Grebenko, V. Barynin//J. Biol. Chem. 1996. - Vol. 271, N 15. - P. 8863-8868.

166. Massey V. On the reaction of reduced flavins with molecular oxygen / V. Massey, G. Palmer, D. Ballou // Oxidases and Related Redox Systems / Ed. by J.E. King, H.S. Mason, M. Morrison. -Baltimore. MD: University Park Press, 1973. P. 25-43.

167. McElroy W.D. Biological bioluminescence / W.D. McElroy, H.H. Seliger // Sci. Amer. 1962. - Vol. 207. - P. 76-89.

168. Mclntyre T.M. Biologically active oxidized phospholipids / T.M. Mclntyre, G.A. Zimmerman, S.M. Prescott // J. Biol. Chem. 1999. -Vol. 274, N 36. - P.25189-25192.

169. Meighen E.A. Binding site determination from kinetic data / E.A. Meighen, J.W. Hastings // J. Biol. Chem. 1971. - Vol. 246. - P. 7666-7674.

170. Meighen E.A. Enzymes and genes from the lux operons of bioluminescent bacteria / E.A. Meighen // Annu. Rev. Microbiol. -1988.-Vol. 42. P. 151.

171. Michaliszyn G.A. Purification and properties NAD(P)H: flavin oxidoreductase from the luminous bacteria Beneckea harveyi / G.A. Michaliszyn, S.S. Wing, A. Meighen // J. Biol. Chem. 1977. - Vol. 252, N21.- P. 7495-7499.

172. Nealson K.H. Low oxygen is optimal for luciferase synthesis in some bacteria: ecological implifications / K.H. Nealson, J.W. Hastings // Arch. Micribiol. 1977. - Vol. 112. - P. 9-16.

173. Nealson K.H. Alternative strategies of symbiosis of marine luminous fishes harboring light emitting bacteria / K.H. Nealson // Trends Biochem.Sci. 1979. - Vol. 4. - P. 105-110.

174. Nunoshiba T. Role of iron and superoxide for generation of hydroxyl radical, oxidative DNA lesions, and mutagenesis in Escherichia coli / T. Nunoshiba, F. Obata, A.C. Boss I I J. Biol. Chem.- 1999. Vol. 274, N 49. - P. 34832-34837.

175. Nefsky B., DeLuca M. Studies on the NADH and NADPH: riboflavin 5'-phosphate (FMN) oxidoreductases from Beneckea harveyi: characterization of the FMN binding sites / B. Nefsky, M. DeLuca // Arch. Biochem. Biophys. 1982. - Vol. 216, N 1. - P. 1016.

176. Patel M.P. Enterococcus faecalis glutatione reductase: purification, characterization and expression under normal and hyperbaric 02 conditions / M.P. Patel, J. Marcinkeviciene, J.S. Blanchard // FEMS Microbiol. Letts. 1998. - Vol. 166. - P. 155-163.

177. Park J.I. The cytoplasmic Cu, Zn superoxide dismutase of Saccharomyces cerevisiae is required for resistance to freeze-thaw stress / J.I. Park, C.M. Grant, M. Davies, I.W. Jdawes // J. Biol. Chem.- 1998. Vol. 273, N 36. - P.22921-22928.

178. Peterson D.A. Catalase: a biological electron transfer agent / D.A. Peterson, J.W. Eaton // Free Rad. Biol. Med. 1990. - N1. - P. 182189.

179. Porter N.A. Mechanisms of free radical oxidation of unsaturated lipids / N.A. Porter, S.E. Caldwell, K.A. Mills // Lipids. 1995. -Vol. 30.-P. 277-290.

180. Poss K.D. Reduced stress defense in heme oxygenase 1-deficient cells / K.D. Poss, S. Tonegawa // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. -Vol. 94. - P. 10925-10930.

181. Rafii F. Detection and purification of a catalase-peroxidase from Mycobacterium sp. Pyr- / F. Rafii, P. Lunsford, G. Hehman, C.E. Cerniglia // FEMS Microb. Letts. 1999. - Vol. 173. - P. 285-290.

182. Rao A.V.S. Diperoxovadanate participates in peroxodation reactions of H202 in presence of abundant catalase / A.V.S. Rao, H.N. Ravishankar, T. Ramasarma // Bioch. Bioph. Acta. 1998. - Vol. 1381. - P. 249-255.

183. Rappoport S.M. Catalase and glutatione peroxidase / S.M. Rappoport, M.W. Muller // J. Biol. Chem. 1979. - N 14. - P. 176179.

184. Ramesh A. Ecological dynamics of marine luminous bacteria / A. Ramesh, B.G. Loganathan, K. Venkateswaran // J. Basic. Microbiol. -1990. Vol. 30, N 9. - P. 689-703.

185. Redford S.M. Cristallographie Characterization of a Cu, Zn superoxide dismutase from Photobacterium leognathi / S.M. Redford,

186. D.E. McRee, E.D. Getzoff// J. Mol. Biol. 1990. - Vol. 212. - P. 449451.

187. Rees J.F. The origins of marine bioluminescence: turning oxygen defence mechanisms into deep-sea communication tools / J.F. Rees, B. Wergifosse, O. Noiset // J. Exp. Biology. 1998. - Vol. 201. - P. 12111221.

188. Rocha E.R. Oxidative stress response in an anaerobe, Bacteroides fragilis: a role for catalase in protection against hydrogen peroxide /

189. E.R. Rocha, T. Selby, J.P. Coleman, C J. Smith // J. Bacterid. 1996. -Vol. 178, N23. - P. 6895-6903.

190. Rocha E.R. Regulation of Bacteroides fragilis katB mRNA by oxidative stress and carbon limitation / E.R. Rocha, C.J. Smith // J. Bacteriol. 1997. - V. 179, N 22. - P. 7033-7039.

191. Rocha E.R. Characterization of a peroxide-resistant mutant of the anaerobic bacterium Bacteroides fragilis / E.R. Rocha, C.J. Smith // J. Bacteriol. 1998. - Vol. 180, N 22. - P. 5906-5912.

192. Rocha E.R. Biochemical and genetic analyses of a catalase from the anaerobic bacterium Bacteroides fragilis / E.R. Rocha, C.J. Smith // J. Bacteriol. 1995. - Vol. 177, N 11. - P. 3111-3119.

193. Ruby E.G. Oxygen-utilizing reactions and symbiotic colonization of the squid light organ by Vibrio fischeri / E.G. Ruby, M.J. McFall-Ngai // Trends Micribiol. 1999. - Vol. 7, N 10. - P. 414-420.

194. Ruby E.G. The Vibrio fischeri- Euprymna scolopes light organ association: current ecological paradigms / E.G. Ruby, K-H. Lee //Appl. Env. Microbiol. 1998. - Vol. 64, N 3. - P.805-812.

195. Ruby E. Ecology of a benign "infection": Colonization of the squid luminous organ by Vibrio fischeri / E. Ruby // Microbiol. Ecol. Infect. Disease. 1999.-P. 217-231.

196. Ruby E.G. The Euprymna scolopes- Vibrio fischeri symbiosis: a biomedical model for the study of bacterial colonization of animal tissue / E.G. Ruby // J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 1999. - Vol.1, N l.-P. 13-21.

197. Ruby E.G. Symbiotic association of P. Fischeri with the marine luminous fish Monocentris Japonica: a model of symbios based on bacterial stadies / E.G.Ruby., K.H. Nealson // Biol. Bull. Mar. Biol. Lab., Woods Hole.- 1976.-Vol. 151.-P. 574-586.

198. Sankarapandi S. Bicarbonate is required for the peroxidase function of Cu, Zn-superoxide dismutase at physiological pH / S. Sankarapandi, J.L. Zweier // J. Biol. Chem. 1999. - Vol. 274, N 3. - P. 1226-1232.

199. Sankarapandi S. Evidence against the generation of free hydroxyl radicals from the interaction of copper, zinc- superoxide dismutase and hydrogen peroxide / S. Sankarapandi, J.L. Zweier // J. Biol. Chem. -1999. Vol. 274, N 49. - P.34576-34583.

200. Salin M.L. Cloning and determination of the nucleotide sequence of the Mn-containing superoxide dismutase gene from Halobacterium halobium / M.L. Salin, M.V. Duke, D. Oesterhelt, D.P. Ma // Gene. -1988.-Vol. 70.-P. 153-159.

201. Salin M.L. Purification of a manganese-containing superoxide dismutase from Halobacterium halobium / M.L. Salin, D. Oesterhelt // Arch. Biochem. Bioph. 1988. - Vol. 260, N 2. - P.806-810.

202. Seliger H.H. The evolution of bioluminescence in bacteria / H.H. Seliger // Photochem. Photobiol. 1987. - Vol.45, N 2. - P.291-297.

203. Shimomura O. The aldehyde content of luminous bacteria and of an "aldehydeless" dark mutant / O. Shimomura, F.N. Johnson, H. Morise // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1974. - Vol. 71.

204. Shimizu N. The reaction of superoxide radical with catalase. Mechanism of the inhibition of catalase by superoxide radical / N. Shimizu, K. Kobayashi, K. Hayashi // J. Biol. Chem. 1984. - Vol. 259,N7.-P. 4414-4418.

205. Schmucker D.L. An improved system for hemoglobin free perfusion of isolated rat liver / D.L. Schmucker, A.L. Jones, C.E. Michielsen // Lab. Invest. 1975. - Vol. 2. - P. 168-75.

206. Steinert M. Symbiosis and pathogenesis: evolution of the microbehost interaction / M. Steinert, U. Hentschel, J. Hacker // Naturwissenschaften. 2000. - Vol. 87. - P. 1-11.

207. Steinberg D. Low density lipoprotein oxidation and its pathobiological significance / D. Steinberg // J. Biol. Chem. 1997. -Vol. 272, N 34. - P. 20963-20966.

208. Stoppolo M. Cu, Zn superoxide dismutase from Photobacterium leiognathi is an hyperefficient enzyme / M. Stoppolo, M. Sette, P. O'Neill // Biochem. 1998. - Vol. 37. - P. 12287-12292.

209. Strain J. Suppressors of superoxide dismutase (SOD1) deficiency in Saccharomyces cerevisiae / J. Strain, C.R. Lorenz, J. Bode // J. Biol. Chem. 1998. - Vol. 273, N 47. - P. 31138-31144.

210. Tao K. In vivo oxidation-reduction kinetics of OxyR, the transcriptional activator for an oxidative stress-inducible regulon in Escherichia coli / K. Tao // FEBS Letters. 1999. - Vol. 457. - P. 9092.

211. Tamarit J. Identification of the major oxidatively damaged proteins in Escherichia coli cells exposed to oxidative stress / J. Tamarit, E. Cabiscol, J. Ros // J. Biol. Chem. 1998. - Vol. 273, N5. - P. 30273032.

212. Takeuchi T. Induction of oxidative DNA damage in anaerobes / T. Takeuchi, Y. Nakaya, N. Kato, K. Watanabe, K. Morimoto // FEBS Letters. 1999. - Vol. 450. - P. 178-180.

213. Tainer J.A. Structure and mechanism of copper, zink superoxide dismutese / J.A. Tainer, E.D. Getzoff, J.S. Richardson // Nature. -1983. Vol. 306, N 5940. - P. 284-287.

214. Teixeira H.D. Lower intracellular hydrogen peroxide levels in cells overexpressing Cu, Zn-superoxide dismutase / Teixeira H.D., R.I. Schumacher, R. Meneghini // Biochem. 1998. - Vol. 95, N 14. - P. 7872-7875.

215. Trasar-Cepeda C. An improved method to measure catalase activity in soils / C. Trasar-Cepeda, F. Camina, M.C. Leiros, F. Gil-Sotres // Soil Biol. Biochem. 1999. - V.31. - P.483-485.

216. Tatsumi H. Mechanistic study of the autoxidation of reduced flavin and quinone compounds / H. Tatsumi, H. Nakase, K. Kano, T. Ikeda // J. Electroanal. Chem. 1998. - Vol. 443. - P. 236-242.

217. Tu S.-C. Isolation and properties of bacterial luciferase-oxygenated intermediates containing different oxygenated flavins / S.-C. Tu // J. Biol. Chem. 1982. - Vol. 257. - P. 3719-3725.

218. Tu S.-C. Kinetic studies on the mechanism of bacterial NAD(P)H: flavin oxidoreductase / S.-C. Tu, J.E. Becvar, J.W. Hastings // Arch. Biochem. and Biophys. 1979. - Vol. 193. - P. 110-116.

219. Tu S-C. Biochemistry of bacterial bioluminescence / S-C. Tu, H.I.X. Mager // Photochem. Photobiol. 1995. - Vol. 62, N 4. - P. 615-624.

220. Tu S-C. Reduced flavin: donor and acceptor enzymes and mechanisms of channeling / S-C. Tu // Antioxidants & redox sign. -2001. Vol. 3, N 5. - P. 881-897.

221. Ulitzur S. Evidence for tetradecanal as the natural aldehyde in bacterial bioluminescence / S. Ulitzur, J.W. Hastings7/ Proc. Natl. Acad. Sci. 1979. -N 1. - P. 265-267.

222. Venerini F. Characterization of the spectroscopic properties of the Cu, Co cluster in a prokaryotic superoxide dismutase / F. Venerini, M. Sette, V.E. Stroppolo // Arch. Biochem. Bioph. 1999. - Vol. 366, N 1. - P. 70-74.

223. Vogel R. Interaction of bacterial cells with weak light emission from culture media / R. Vogel, R. Sussmuth // Bioelectrochem. Bioenerg. 1998. - Vol. 45. - P.93-101.

224. Wada N. Superoxide anion reacts with enzyme intermediate in the bacterial luciferase reaction competitive with intramolecular electron transfer / N. Wada, J.W. Hastings, H. Watanabe // J. Biol. Chem. -1997.-Vol. 12.- P. 15-20.

225. Waddle J. Individual a and p subunits of bacterial luciferase exhibit bioluminescence activity / J. Waddle, T.O. Baldwin // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1991.-Vol. 178.-P. 1188-1193.

226. Watanabe T. Studies on luciferase from Photobacterium Phosphoreum. VIII. FMN-H202 initiated bioluminescence and thermodynamics of elementary steps of the luciferase reaction / T. Watanabe, T. Nakamura // J. Biochemistry. 1976. - Vol. 79. — P. 489-495.

227. Warren J. Nitric acid is inactivated by the bacterial pigment Pycocianin / J. Warren, R. Loi, N. Rendell, G. Taylor // Biochem. J. -1990.-Vol. 266.-P. 57-62.

228. Wall L.A. In vivo and in vitro acylation of polypeptides in Vibrio harveyi: identification of proteins involved in aldehyde production for bioluminescence / L.A. Wall, D.M. Byers, E.A. Meighen // J. Bacteriol. 1984. - Vol.159, N 2. - P.720-724.

229. Ziegler M.M. Biochemestry of bacterial bioluminescence / M.M. Ziegler, T.O. Baldvin // Current Topics in Bioenergetics. New-York: Academic Press, 1981. - P. 66-113.

230. Yumoto I. Characterization of a facultatively psychrophilic bacterium, Vibrio rumoiensis sp. that exhibits high catalase activity /1. Yumoto, H. Iwata, T. Sawabe // Appl. Env. Microb.- 1999. Vol.65, N l.-P. 67-72.

Информация о работе

Реммель, Наталья Николаевна
кандидата биологических наук
Красноярск, 2003
ВАК 03.00.16

Диссертация

Роль люминесцентной реакции в защите фотобактерий от окислительного стресса - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы