Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Природное разнообразие светящихся бактерий и их роль в трансформации биополимеров

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Выдрякова, Галина Александровна, Красноярск

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ ИНСТИТУТ БИОФИЗИКИ

ПРИРОДНОЕ РАЗНООБРАЗИЕ СВЕТЯЩИХСЯ БАКТЕРИЙ И ИХ РОЛБ М ТРАНСФОРМАЦИИ БИОПОЛИМЕРОВ

Н&учшмй рушшфдшгтель гшыдвдшг бшлотчшшх наук НоАо Тмшышга

Крашшр« = 15Ш

ОГЛАВЛЕНИИ

4

ГЛАВА 1 БИОЛОГИЯ МОРСКИХ СВЕТЯЩИХСЯ БАКТЕР1> 1.1. БИОЛОГИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ СВЕТЯЩИХСЯ

ЭКОЛОГИЯ СВЕТЯЩИХСЯ БАКТЕРИИ

МЕТАБОЛИЗМ СЕТЯЩИХСЯ БАКТЕРИЙ

1.4. ХРАНЕНИЕ КУЛЬТУР МИКРООРГАНИЗМОВ

25

ГЛАВА ///. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ. Ш.1. ЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЕ БАКТЕРИИ - СИМБИОНТЫ И КОММЕНСАЛЫ СВЕТЯЩИХСЯ И НЕСВЕТЯЩИХСЯ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ МОРСКОЙ ФАУНЫ ИНДИЙСКОГО

ОКЕАНА. 45

111.2. КОЛЛЕКЦИЯ КУЛЬТУР СВЕТЯЩИХСЯ БАКТЕРИЙ ИБСО. 63

111.3. ХРАНЕНИЕ СВЕТЯЩИХСЯ БАКТЕРИЙ. 66 Ш.4. ТРАНСФОРМАЦИЯ БИОПОЛИМЕРОВ

СВЕТЯЩИМИСЯ БАКТЕРИЯМИ. 84

ЗАКЛЮЧЕНИЕ ПО

ВЫВОДЫ 117

Литература 120

исключительно важна. Кроме того, микроорганизмы являются главным источником биологически активных веществ, которые могут быть полезны и используются человеком.

Сохранение и рациональное использование биологического разнообразия - одна из актуальнейших задач, стоящих перед научным сообществом. Наиболее эффективным способом сохранения микробиологических ресурсов является их поддержание в современных микробных коллекциях, являющихся источником генофонда для проведения фундаментальных и прикладных исследований. Значение и роль микробных коллекций как хранилищ известных микроорганизмов трудно переоценить. Они являются не только центрами по изучению систематики микроорганизмов, разработке методов идентификации и длительного хранения культур, но и банками информации, отражающей историю имеющихся штаммов, их свойства, а также надежным местом хранения культур в условиях нарастающего антропогенного воздействия на их естественную среду обитания [di Gasta, Yoimes, 1990; Grassle et al., 1991; Hawksworth, Colwel, 1992; Ившина, 1993].

В 1991 г. был опубликован совместный меморандум Международных союзов биологических (IXJBS) и микробиологических (IUMS) обществ "Микробное разнообразие - ХХГ? [Hawksworth D.L., Colwell R.R., 1992] с целью координации общих направлений действий на ближайшее десятилетие при решении фундаментальных и, как следствие, практических вопросов. Участие российских ученых предполагалось в выполнении следующих разделов программы "Микробное разнообразие":

функционировании как в лабораторных, так и в природных

По всем этим направлениям ведутся работы в Коллекции

в ои~е г.г.

Коллекции светящихся бактерий. В связи с изменением

многочисленных экспедициях штаммами. Так, светящиеся бактерии выделялись сотрудниками Института биофизики в 1961 г. во время 34= го рейса экспедиционного судна "Витязь55, в 1966 г. - в 38-м, 1969 г.г. - в 44-м его рейсах; в 1979 - 1980 г.г. = в гидрографическом судне "Башкирия55. Психрофильные формы

побережье Охотского моря в 1973 и тихоокеанское побережье Камчатки в 1976 и 1985 годах. Коме того, светящиеся бактерии выделяли в 1983 г. в Зб-й рейсе БИС "Академик Курчатов", в 1984 - в рейсе НИС "акад. Несмеянов55, в 1988 - 1989 - в 17-м рейсе (нового) НИС "Витязь55 и в 1989 - в 44-м рейсе НИС "Дм. Менделеев55. В результате экспедиций светящиеся бактерии были выделены в Индийском и Тихом океанах, Филиппинском, Аравийском, Черном, Средиземном, Охотском, Японском, Южно-Китайском и Тирренском морях. Если первоначально это были культуры светящихся бактерий, выделенные из океанических (морских) вод и светящихся органов морских животных [Чумакова Р.И., Гительзон И.И., 1975], то 80-е годы отмечены выделением светящихся бактерий из внутренних органов морских организмов (в основном, пищеварительной системы) [Гительзон И.И., Воробьева Т.И., 1986, 1988; Выдрякова Г.А. и др. 1995; "Каталог...55, 1997].

Наличие коллекции со значительным количеством культур дает возможность не только детального исследования их метаболизма, но и анализа распространения в естественной среде обитания и адаптивных возможностей светящихся бактерий.

В большинстве своем светящиеся бактерии = обитатели моря.

круговороте веществ. Хотя сведения о трансформации природных

Работа выполнялась в рамках ГНТП «Средства обеспечения исследований в физико-химической биологии», с 1993 по 1997 г.г. поддерживалась Красноярским краевым фондом науки, в 1995 г. была отмечена стипендией фонда Сороса по биоразнообразию, а в 1997 г. - грантом РФФИ.

ГЛШ 1 шшомогшш порою свЕтащюта ШЖТЕРМШ

и втжшчЕстш рйшосбрйше светящихся

БМТЕРЖ,

Светящиеся бактерии в большинстве случаев являются обитателями моря. Условия обитания морских организмов, а именно: высокая соленость среды, недостаточная освещенность, значительное давление толщи воды, узкий диапазон температур сильно отличаются от таковых для наземных организмов, что выражается в существовании ряда особенностей метаболизма в морских организмах. Значительное количество работ по экологии светящихся бактерий расширяет существующее представление о закономерностях их распространения и взаимодействия с другими компонентами включающих их биоценозов. В 80-х г.г. появились работы по изучению вертикального распределения светящихся бактерий в океанических водах [Чумакова Р.И., Гительзон И.И., 1975; Hastings J.W., Ruby E.G. and Gremberg E.P., 1982; Ruby E.G., Greenberg E.P., Hastings J.W., 1980]. Была отмечена смена видов фотобактерий с глубиной. Установлено наличие сезонных флуктуации видов светящихся бактерий [Ruby E.G., Nealson К.Н., 1978; Ruby E.G., Morin J.G., 1979; Ramesh A. et al. 1987; Feldman K.A., Buck I.D., 1984]. В то же время было показано, что видовой состав бактерий-симбионтов не всегда соответствует преобладающему в ареале хозяина виду свободноживущих светящихся бактерий [Lee К.=Н., Ruby E.G., 1992; Reichel! XL., Nealson K.H., Hastings J.W., 1977; Omridorff S.A., Colwell R.R., 1980]. Тем не менее, в 1989 г. Wei S.L. et Young R.E. сообщили о

модельных экспериментах, в которых показали необходимость наличия источника свободноживущих светящихся бактерий и сделали вывод о заражении ими морских обитателей на стадии икры. Хотя вопрос о путях инфицирования люминесцентными бактериями морских животных, обладающих световыми органами, до сих пор остается дискуссионным, видовой состав бактерий-симбионтов, возможно, определяется видовым составом свободноживущих светящихся бактерий бентосной сферы вокруг кладок яиц морских обитателей.

Кроме симбионтов среди светящихся бактерий выделены их сапрофитные формы, обнаружены комменсалы. Было показано, что кишечник морских животных является одним из наиболее благоприятных мест локализации светящихся бактерий [Nealson. K.EL, Hastings J.W., 1979; Ruby E.G., Morn J.G., 1979; Hastings I.W., Nealson K.H., 1981; Примакова Г.А., 1985; Гительзон И.И., Воробьева Т.Н., 1986; Ramesh A., Vemgopalan V.K., 1989(1)].

СИСТЕМАТИКА СВЕТЯЩИХСЯ . БАКТЕРИЙ. В основу современного таксономического деления морских светящихся бактерий положена классификация, предложенная Райхельтом и Бауманом [Reichelt J.L., Вашпапп Р., 1973; Reichelt I.L., Вашпаип Р., Вашиаип. L., 1976], основными критериями которой являются: 1) тип жгутикования; 2) состав оснований ДНК; 3) гомология ДНК и р-РНК; 4) питательные потребности и ферментативная активность.

В настоящее время известны следующие виды светящихся бактерий:

К cholerae (биотип albensis)

больных диареей [Кудрякова ТА., погибших креветок [Sfaimada T. et al.,

•э Л^э

шипе таол.

Туре

мира, в частности, в в Англии - NC1

Таблица 1„ Тшкшшкшмшиесшш© ппргошшш ошсмвшых вид®® мдарошж шетшпршоп бжтершйо

мальтозы

целлобиозы

В-глнжоната

глюкозы с образованием газа

амилазы

40°С жопла

полжоксибут] Наличие; пигмента

Число полярных

+(±) +(±)

-(±) +(±)

-(±)

+

+ + +(±) + + + + +

+(±) +

+

+(±)

+(±) +(±)

+(±) "(±)

+{±)

+(±)

10

+ ВС . _

+(±) > 80% ку-лыур положительны; -(±) большинство культур отрицательны.

+

+ + +

-(±)

+(±)

-с±)

1 -з

+

Industrial and Marine Bacteria), в Канаде = NRC (National Research Council), в Японии - IFO (Institute for Fermentation), Франции - СЕР (Collection de Г Institut Pasteur) и других.

В открытом океане в верхнем слое воды (0 - 30 м) светящиеся бактерии, как правило, отсутствуют. В прибрежных же водах они обнаруживаются с поверхности (0 м), численность их возрастает с глубиной и имеет наибольшее значение в придонном слое. В прибрежных тропических водах концентрация светящихся бактерий в среднем составляет 100 - 10000 КОЕ/л (КОЕ - колониеобразугощих

единиц) [Ruby E.G., Nealson K.H., 1978; Примакова Г.А., Кузнецов A.M., 1990]. В открытых водах их концентрация меньше и составляет от 0=100 КОЕ/л в водах Атлантического океана [Ruby E.G., Greenberg Е.Р., Hastings J.W., 1980] до 100 - 1000 KGE/л (тропические зоны Индийского океана) [Примакова Г.А., 1985; Примакова Г.А., Кузнецов AM., 1990].

В вертикальной стратификации светящихся бактерий в открытом океане выделяются два ярко выраженных слоя, где плотность светящихся бактерий наибольшая: 100 ~ 200 м и 800 - 900 м. Существование первого слоя в распределении светящихся бактерий по вертикали связано, вероятно, с наиболее оптимальными факторами среды для развития микроорганизмов (температура, растворенные кислород и органические вещества). Существование второго слоя обусловлено, как предполагают, выделением их из желудочно-кишечного тракта рыб,' обитающих на этих глубинах [Чумакова Р.И., Гительзон И.И., 1975].

В условиях более низких температур (осенне-зимний период или большие глубины) в пробах морской воды чаще встречаются бактерии P. phosphoreum или V. fischeri. В летний период и в теплых прибрежных водах доминируют V. harveyi, часто встречаются Р. leiognathi [Hastings J.W., Ruby E.G. and Greenberg E.P., 1982; Haygood M.G., Nealson K.H., 1984; Гительзон И.И., Воробьева Т.Н., 1986; Примакова Г.А., Кузнецов A.M., 1990].

обитающих в специализированных светящихся органах. Симбиоз светящихся бактерий с морскими животными = одно из наиболее специфических проявлений эволюции. Особенностью симбиоза рыб и головоногих моллюсков с бактериями является то, что даже в условиях прямого контакта с внешней средой или кишечником в светящихся органах поддерживается чистая культура бактерий одного вида. Существует корреляция между оптимальной температурой роста бактерий-симбионтов и температурой обитания животных-хозяев. Так, в качестве симбионтов глубоководных рыб выделяются бактерии Р. phosphoreum [Reichel! J.L., Вашпашп Р., 1973; Ruby E.G., Morin IG., 1978 и др.]. В случаях симбиоза с рыбами средних глубин и кальмарами выделялись бактерии V. fischeri и P. leiognathi [Ruby E.G., Nealson K.H., 1976; Ruby E.G., Asato L.M., 1993; Boetteher K.J., Ruby E.G., 1995 и др.]. Часто светящиеся бактерии-симбионты представляют собой некультивируемые формы. В последние годы идентификацию таких культур проводят по (16S)rPHK [Haygood M.G., 1993], с использованием hxA-проб (Nealson К.Н., 1993). В качестве симбионтов кальмаров впервые обнаружены V. logei [Fidopiastis P.M., Boletzky §., Ruby E.G., 1998]. Другие виды светящихся бактерий в качестве специфических симбионтов не выделялись. Несмотря на огромное количество работ, опубликованных с момента открытия бактериальной природы свечения в 1912 г. Осорио ["Светящиеся бактерии", 1984], посвященных исследованию природы симбиоза [Ruby E.G., 1996; Haygood M.G., Distel D.L., 1993], истинные его механизмы и роль в физиологии бактерий до сих пор остаются неизвестными.

Отмечаются следующие общие закономерности распространения светящихся бактерий [Нау§оос1 М.С., Меакоп К.Н., 1984]: Р. ркоБркогеит = вид наиболее часто встречающийся в глубоких и холодных водах (рост при температуре от 4° до 25° С); Р. Шо^аШ = широко распространенный в прогреваемых водах вид светящихся бактерий (оптимальная температура роста 25° - 30° С). Бактерии V. кагуеуг и близкие к ним виды (у.зрЫпсИёж, У.опеШаИз) обитают в теплых прибрежных водах, а также встречаются в верхней 100= метровой толще вод открытого океана (растут при температурах от 15° до 40° С). Культуры А. (8.) капеёт впервые были выделены в полярных регионах [1еп§ш М. е! а!., 1980] (рост при 5° - 20 °С).

Тем не менее, следует отметить, что исследование светящихся бактерий, ассоциированных с морской фауной, проводилось фрагментарно, с использованием малого количества представителей фауны или использованием фауны лишь определенных (чаще = средних) глубин. Ни в одной из доступных нам работ не было исследовано видовое распределение ассоциированных форм светящихся бактерий по профилю в целом, что представляется интересным и является одной из задач данной работы.

L3„ ФШЗИОЛОГО-БШОХИМИЧЕСЖИЕ СВОЙСТВА И

L3J„ Меттбтшж ешештщшсм ёшЕшмершт

Как и многие другие морские бактерии, светящиеся бактерии являются галофилами. Лучше всего они растут на средах, содержащих в своем составе ионы натрия (3% хлорида натрия) [Чумакова Р.И., Гительзон И.И., 1975]. При этом ионы натрия не могут быть заменены ионами калия или магния. Если клетки люминесцентных бактерий поместить в гипотоническую среду (дистиллированную воду), они лизируготся.

Светящиеся бактерии - факультативные анаэробы. Для их роста и свечения достаточно незначительных концентраций кислорода. Лишь Ä.(S.) hanedai относится к строгим аэробам [Jensen М. et al, 1980]. Оптимальные значения pH для роста и свечения люминесцентных бактерий находятся вблизи 7,0 и очень редко превышают 7,5.

углеродом и энергией необходимы органические вещества. В качестве таких соединений светящиеся бактерии могут использовать аминокислоты, сахара, глицерин, органические кислоты и др. Интересно отметить, что бактерии V. harveyi способны использовать около 40 различных органических субстратов в качестве источника углерода и энергии, светящиеся бактерии других видов используют лишь порядка двадцати [Reichelt, J.L., Вашааш, Р. 1973]. Светящиеся бактерии используют универсальные пути утилизации углеводов [Чумакова Р.И., Гительзон И.И., 1975], исключением являются бактерии вида A.(S.) hanedlai, не сбраживающие сахара [Jensen MJ. et ai, 1980].

Гексозы расщепляются светящимися бактериями, в основном, по= видимому, в процессе гликолиза (фруктозобифосфатный или путь Эмбдена=Мейергофа=Парнаеа) с участием следующих ферментов: глкжозофосфатизомеразы, фоефофруктокиназы, фруктозофосфат-альдолазы, триозофосфатизомеразы и др.; в некоторой степени = по окислительному пентозофосфатному пути (гексозомонофосфатный путь или схема Варбурга-Диккенса-Хореккера) с участием глюкозофосфатдешдрогеназы, лаюгоназы, фосфоглюконатдегидро -геназы, фосфорибозоизомеразы, рибулозо-фосфат-эпимераза, транскетолазы и трансальдолазы; при расщеплении глкжоната используется встречающийся только у бактерий путь Эшгнера-Дудорова или КДФГ-путь (2=кето=3-дезокси=6=фосфоглюконатный

как донора фосфата. Образующийся глгокозо-б-фосфат представляет собой метаболически активную форму глюкозы в клетке и служит исходным пунктом для любого из трех упомянутых путей распада [Чумакова Р.И., Гительзон И.И., 1975].

Синтез АТР - непосредственного источника энергии, для таких разнообразных процессов, как синтез структурных компонентов макромолекул, механическое движение и осморегуляция, у светящихся бактерий осуществляется в процессе окислительного фосфоршшрования (фосфорилирование в дыхательной цепи) и в процессе фосфоршшрования на уровне субстрата. В первом случае АТР образуется при участии АТР~синтазы. При сбраживании Сахаров образование АТР идет с участием фосфошицераткиназы, пируваткиназы и ацетаткиназы [Чумакова Р.И., Гительзон И.И., 1975].

В анаэробных условиях большинство светящихся бактерий осуществляет муравьинокислое брожение или брожение смешанного типа, как это свойственно Enterobacteriaceae, и образуют муравьиную, уксусную, молочную и янтарную кислоты, спирт, углекислый газ и ацетоин [Шлегель Г., 1987]. Причем сбраживание углеводов у V. fischeri и V. harveyi идет по типу, характерному для E.coli, когда образуются кислоты и совсем не образуется ацетоин и, соответственно, бутандиол (реакция Фогес-Проекауэра отрицательна). Сбраживание Сахаров у Р. phosphoreum, а также у некоторых штаммов Р. leiognathi осуществляется по бутандиоловому типу, характерному для Enterobacter. Основной продукт = бутандиол, образующийся из ацетоина (реакция ФогееЛроскауэра положительна). Кислоты же занимают второе место. Два указанных типа брожения различаются главным образом по реакциям, связанным с превращениями пирувата.

образующегося в ходе катаболизма пирувата до ацетщжофермента А, который поступает затем в цикл трикарбоновых кислот. Тем не менее, пировиноградная кислота ~ один из основных продуктов, выделяющихся в среду при аэробном росте светящихся бактерий на сложных средах ["Светящиеся бактерии'5, 1984]. Незаконченный аэробный катаболизм субстратов у бактерий, приводящий к выделению в среду пирувата, - довольно редко встречающееся явление. Обычно пировиноградная кислота выделяется как основной продукт только в случае несбалансированного роста, неоптимальном значении рН, лимитировании кислородом или метаболического

ингибирования. Возможно, избыточное количество пирувата, образующееся при этом, превосходит потребности в нем клетки, вследствие чего он выделяется в культуральную среду. Дополнительное образование пировиноградной кислоты может происходить при распаде аминокислот, присутствующих в питательной среде: триптофана, серина, аланина, глутаминовой кислоты.

светящихся бактерий, исследованы довольно хорошо. Однако, этот интерес связан, в основном, со способностью светящихся бактерий излучать свет. Изучение ферментов, не имеющих отношения к люминесцентной системе, проводит