Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Вириопланктон в разных пресноводных экосистемах: роль вирусов в смертности гетеротрофных бактерий

ВАК РФ 03.02.10, Гидробиология

Автореферат диссертации по теме "Вириопланктон в разных пресноводных экосистемах: роль вирусов в смертности гетеротрофных бактерий"

На правах рукописи

Стройнов Ярослав Витальевич

ВИРИОПЛАНКТОН В РАЗНЫХ ПРЕСНОВОДНЫХ ЭКОСИСТЕМАХ: РОЛЬ ВИРУСОВ В СМЕРТНОСТИ ГЕТЕРОТРОФНЫХ БАКТЕРИЙ

03.02.10 - гидробиология

Автореферат на соискание учёной степени кандидата биологических наук

- 6 НАР 2014

005545645

Борок - 2014

005545645

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт биологии внутренних вод им. И.Д. Папанина РАН в лаборатории микробиологии

Защита состоится «24» апреля 2014 г. в 10 час. на заседании диссертационного совета ДМ 002.036.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биологии внутренних вод им. И.Д. Папанина РАН по адресу: 152742, Ярославская обл., Некоузский район, п. Борок

Тел./факс: (48547) 24042 e-mail: dissovet@ibiw.yaroslavl.ru С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт биологии внутренних вод им. И.Д. Папанина РАН и на сайте ИБВВ РАН (http://www.ibiw.ru), с авторефератом - в сети Интернет на сайтах ВАК РФ (http://vak.ed.gov.ru1 и ИБВВ РАН (http://www.ibiw.ni).

Научный руководитель:

доктор биологических наук Копылов Александр Иванович

Официальные оппоненты: Вайнштейн Михаил Борисович

доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, заместитель директора по науке

Ведущая организация:

Сажин Андрей Фёдорович

кандидат биологических наук, Федеральное Государственное Бюджетное учреждение науки Институт океанологии им. П.П. Ширшова РАН, старший научный сотрудник

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Московский государственный университет им. М.В.Ломоносова, Биологический факультет

Учёный секретарь

диссертационного совета, доктор биологических наук

Л.Г. Корнева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Введение. Актуальность темы.

Вирусы — мельчайшие существа-иждивенцы с простой биологической структурой, состоящей из одной или нескольких молекул РНК или ДНК, заключенных в защитную белковую оболочку (капсид). Присутствие вирусов в водных объектах известно с середины прошлого века (Крисс, 1959; Spencer, 1955). Однако активные исследования их экологического значения в водных экосистемах начались только с работы Берга с соавторами (Bergh et al., 1989), которые обнаружили очень высокую концентрацию водных вирусов (до 108 частиц/мл), в основном классифицируемых как бактериофаги. В водной среде вирусы существуют в двух фазах: внеклеточной и внутриклеточной. Продуктивное размножение вирусов происходит только внутри живых клеток и, в случае литической инфекции, заканчивается гибелью (лизисом) клетки. Последующие исследования (Proctor, Fuhrman, 1990; Suttle et al., 1990; Нага et al., 1991) подтвердили очень высокую численность вирусов в различных водных местообитаниях и установили, что вирусы могут инфицировать большое количество гетеротрофных бактерий и, в конечном итоге, вызывать высокую смертность бактериопланктона. В результате вирусного лизиса бактерий значительное количество органического вещества не поступает на более высокие трофические уровни планктонной пищевой сети, а вновь используется бактериальным сообществом (Thingstad et al., 1993; Bratbak, Heldal, 2000).

В настоящее время общепризнано, что вирусы являются важной и неотъемлемой частью биологических сообществ водных экосистем. Они влияют на численность, видовой состав и разнообразие планктонных микроорганизмов, а также изменяют потоки вещества и энергии в микробных сообществах (Fuhrman, 1999; Noble et al., 1999; Bratbak, Heldal, 2000; Thingstad, 2000). Кроме того, вирусы являются посредниками генетического обмена внутри вида и между видами через транедукцию (Jiang, Paul, 1998).

Закономерности распределения и функционирования водных вирусов сложны и до сих пор недостаточно изучены. В связи с этим необходимость исследований роли вирусов-бактериофагов в функционировании микробных сообществ в разнотипных водных экосистемах очевидна. Имеющие в литературе заключения о значении вирусов как компонента планктонных сообществ основаны, главным образом, на результатах исследований вириопланктона в морях и озерах и, в меньшей степени, в водохранилищах и реках (Wommack, Colwell, 2000;Weinbauer, 2004).

Исследования вириопланктона в пресноводных экосистемах России начались сравнительно недавно и пока весьма немногочисленны (Сироткин и др., 2001; Дрюккер, Дутова, 2009; Копылов и др., 2007, 2011). В тоже время сведения о количестве и активности

3

вирусов необходимы для адекватной оценки структуры и функционирования планктонных сообществ водоёмов и водотоков. Цель и задачи исследований.

Цель работы - оценить роль вирусов в структуре и функционировании планктонных микробных сообществ в разнотипных водных экосистемах (водохранилища, реки, озеро). Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Определить общую численность, биомассу и продукцию бактерий - основных хозяев планктонных вирусов.

2. Определить общую численность вириопланктона, в том числе: свободноплавающих вирусов; вирусов, прикреплённых к клеткам бактерий; вирусов-бактериофагов, находящихся внутри бактериальных клеток.

3. Определить количество видимых инфицированных клеток бактерий, количество вссх инфицированных клеток бактерий и их доли в общей численности бактсриопланкгона. Выяснить долю разных морфотипов бактерий в общем количестве инфицированных бактериальных клеток.

4. Определить вирус индуцированную смертность бактериопланктона и оценить поступление органического углерода в окружающую водную среду в результате вирусного лизиса.

5. Определить продукцию вириопланктона и время оборота общей численности вирусов.

6. Выяснить вклад вириопланктона в суммарную биомассу планктонных микробных сообществ в разных водных экосистемах. Сравнить гибель бактерий в результате вирусного лизиса с их потреблением простейшими. Оценить выедание вирусных частиц простейшими. Научная новизна и теоретическая значимость работы.

Результаты диссертационной работы существенно дополняют и расширяют имеющиеся в литературе сведения об обилии и активности планктонных вирусов в пресноводных экосистемах. Впервые в исследованиях экологии пресноводных вирусов определены: количество бактериофагов, прикрепленных к бактериальным клеткам, доли бактерий разных морфотипов в общем количестве инфицированных клеток, вклад вирусов в общую биомассу планктонных микробных сообществ. Полученные данные вносят существенные изменения в общепринятую схему потоков органического вещества и энергии в планктонных системах.

Положения, выносимые на защиту.

Вириопланкгон является важнейшим структурно-функциональным компонентом планктонных микробных сообществ водоёмов и водотоков. Вирусы инфицируют и вызывают гибель значительного количества планктонных гетеротрофных бактерий.

4

Практическая значимость.

Выявленные закономерности распространения и активности планктонных вирусов в водоёмах и водотоках могут использоваться для разработки методов управления функционированием водных экосистем, при моделировании и прогнозировании процессов трансформации вещества и энергии в реках, озерах и водохранилищах разного трофического статуса, а также при обосновании и разработке системы мониторинга качества их вод.

Выявленная зависимость численности вирусов от трофического статуса пресноводной экосистемы (первичной продукции фитопланктона) может быть в дальнейшем использована в качестве индикатора экологического благополучия водоёмов и водотоков. Апробация результатов диссертации.

Материалы диссертации доложены и обсуждены на конференции «Молодая наука в классическом университете: секция биология» (Иваново, 2008), на XIV Школе-конференции молодых учёных с иностранным участием (Борок, 2010), международном III Байкальском микробиологическом симпозиуме (Иркутск, 2011), всероссийской конференции «Бассейн Волги в ХХ1-м веке: структура и функционирование экосистем водохранилищ» (Борок, 2012). Публикации.

По теме публикации опубликовано 8 работ. Из них 4 - в профильных научных журналах перечня ВАК РФ. Благодарности.

Автор выражает искреннюю благодарность научному руководителю д.б.н. А. И. Копылову за помощь на всех этапах проведения работы. Выражает глубокую благодарность Д.Б. Косолапову за помощь в сборе и анализу материалов из оз. Севан, глубокую признательность Е.А. Заботкиной за помощь и советы при проведении электронно-микроскопических исследований, а так же оформлении автореферата и диссертации, Т.С. Масленниковой за любезно предоставленные данные по первичной продукции фитопланктона, Тихоненкову Д. В. и Романенко A.B. за любезно предоставленные данные, а гак же всех участников экспедиций по отбору проб для данной работы. Структура и объём работы.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания объектов и методов исследования (глава 2), изложения полученных результатов и их обсуждения (главы 3-5), заключения, выводов и списка литературы, который включает 141 источник, в том числе 128 на иностранном языке. Материалы диссертации изложены на 116 страницах машинописного текста и иллюстрированы 58 таблицами и 17 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В главе приводятся сведения об истории развития водной микробиологии и применяемых в ней методов, а также данные по экологии бактериофагов и их роли в планктонных сообществах. Приводятся известные на данный момент факторы, влияющие на водные вирусы.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования на р. Ильд (притоке Рыбинского водохранилища) проводили в июле 2008 г. на 11 станциях. В оз. Севан апреле-августе 2009 г. изучали сезонную динамику вириопланктопа в прибрежном мелководье открытого типа в Малом Севане. В этом же году исследовали вертикальное распределение вирусов на четырех глубоководных станциях, расположенных в Малом Севане, Большом Севане, а также на соединяющем их перешейке.

В ходе работ комплексной экспедиции ИБВВ РАН во время рейса НЭС «Академик Топчиев» в июле 2010 г. был собран материал" на 17 станциях в Чебоксарском водохранилище, 3 станциях в р. Ока и на 12 станциях в Горьковском водохранилище. Материал по Рыбинскому водохранилищу был собран в ходе стандартных рейсов НЭС «Академик Топчиев» на б станциях в августе 2010 г.

Определение количества вирусов и бактерий осуществляли в интегрированных образцах воды, которые получали смешиванием проб, отобранных через каждый метр от поверхности до дна. Сразу после отбора пробу воды фиксировали глутаральдегидом до конечной концентрации 2%, хранили в темноте при температуре 4°С.

Планктонные вирусные частицы учитывали методом эпифлуоресцентной микроскопии с использованием красителя SYBR Green 1 и фильтров из оксида алюминия Anodisc ("Wathman") с диаметром пор 0.02 мкм (Noble, Fuhrman, 1998). Гетеротрофные бактерии и нанофлагелля гы определяли методом эпифлуоресцентной микроскопии с использованием красителей (DAPI и примулин) и черных ядерных фильтров с диаметром пор 0.2 мкм (Porter, Feig, 1980; Carón, 1983). Препараты просматривали при увеличении хЮОО под эпифлуоресцентным микроскопом Olympus BX5I (Япония) с системой анализа изображений. Содержание углерода в 1 вирусной частице принимали равным 10"'° мкг С (Gonzalez, Suttle, 1993). Содержание органического углерода в сырой биомассе бактерий рассчитывали согласно уравнению, связывающему объем клетки (V, мкм3) и содержание углерода в клетке бактерии (Norland, 1993). Допуская, что гетеротрофный жгутиконосец в час осветляет объем воды равный I05 объема его тела (Fenchel, 1982), ориентировочно рассчитывали скорость потребления бактерий природными популяциями гетеротрофных жгутиконосцев.

Для определения частоты отчетливо видимых инфицированных вирусами гетеротрофных бактерий (Frequency of visibly infected cells (FV1C), % or общего количества бактерий) и среднего количества зрелых фагов в инфицированных бактериях (Burst size (BS), частиц/кл) использовали метод просвечивающей электронной микроскопии. Вирусы и бактерии осаждали центрифугированием при 100000 g (35000 об./мин) в течение часа с использованием ультрацентрифуги OPTIMA L-90k ("Beckman Coulter", США) на никелевые сеточки плотностью 400 мешей, покрытые пленкой из пиолоформа с углеродным напылением. Сеточки просматривали в электронном микроскопе JEM I00C и JEM 1100 ("JEOL", Япония) при увеличении в 20000-150000 раз. Для расчета доли всех инфицированных клеток от общей численности гетеротрофных бактерий (Frequency of infected cells (FIC), %) использовали уравнение FIC = 7.1 » FVIC - 22.5 * FVIC2 (Binder, 1999). Гибель бактериопланктона, вызванную вирусным лизисом (Viral-mediated mortality of bacteria (VMB), %), определяли по формуле VMB = (FIC + 0.6 х FIC2)/(I -1.2* FIC) (Binder, 1999). Скорость вирус-индуцированной смертности бактерий (Virus-induced mortality (VIM), кл/(мл х сут) или мг С/(м3 х сут) рассчитывали с использованием уравнения VIM = VMB х Рв, где Рв - продукция бактериопланктона. Продукцию вириопланктона (Pv) определяли как произведение BS и VIM (Simek et al., 2001). Время оборота численности вирусов получали делением их численности на продукцию. Скорость поступления в окружающую водную среду легкоусвояемого органического вещества в результате вирусного лизиса бактериальных клеток находили по разнице VIM (в мг С/(м3 х сут) и Pv (в мг С/(м х сут).

Первичную продукцию фитопланктона определяли радиоуглеродным методом (Романенко, Кузнецов, 1974). Удельную скорость роста бактерий определяли методом разбавления (Landry, Hassett, 1982) или оценивали по частоте делящихся клеток (FDC) по формуле: In ц = 0.299 х FDC - 4.961 (Newell, Christian, 1981). Продукцию бактериопланктона определяли как произведение удельной скорости роста и биомассы.

Статистический анализ данных проводили с использованием программы Statistica 6.0. При установлении корреляционных зависимостей между параметрами использовали ранговый коэффициент корреляции Спирмена для уровня значимости 0.05.

ГЛАВА 3. ПЕРВИЧНАЯ ПРОДУКЦИЯ И СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ БАКТЕРИОПЛАНКТОНА 3.1. Водохранилища.

В исследованный период во всех трех водохранилищах были зарегистрированы высокие величины продукции фитопланктона (Ррц) (табл. 1). Максимальные значения обнаружены в Чебоксарском водохранилище. Величины РрН, рассчитанные в среднем для

7

водохранилища или участка водохранилища, оказались значительно выше в Чебоксарском водохранилище и озерной части Горьковского водохранилища, чем в Рыбинском водохранилище и речной части Горьковского водохранилища.

Таблица 1. Первичная продукция фитопланктона (£РРН, мг С/(м2 * сут)), общая численность бактериопланктона (N8, 106 кл./мл), средний объём бактериальной клетки (V,

мкм3), биомасса (Вв, мгС/м3), удельная скорость роста (ц, ч"1) и продукция (Рв) бактериопланктона в водохранилищах

Параметры Водохранилища

Рыбинское Горьковское Чебоксарское

Речной участок Озёрный участок

ЕРрн 1554±206* 929±284 2132±499 2711±520

434-2700 246-1962 705-2922 740-8395

N8 6.92 ±0.41 8.94±0.64 16.21±1.29 15.73±0.77

4.95-9.21 6.34-11.27 12.56-18.54 11.54-20.78

V 0.074±0.021 0.079 ±0.01 0.077±0.004 0.098±0.005

0.057-0.087 0.06-0.137 0.067-0.086 0.065-0.142

Вв 125 ±9 167±9 306±24 348±16

79-179 145-198 242-355 265-475

И 0.05 ±0.008 0.033±0.008 0.031±0.007 0.033 ±0.003

(0.011-0.101) 0.017-0.064 0.017-0.047 0.012-0.052

Рв, 7.62±1.08 7.28 ±1.84 12.4±3.1 12.55±1.55

106 кл./(м3 х сут) 2.43-15.37 2.56-16.09 5.03-18.59 4.13-26.14

Рв, 134±17 130±28 237±63 269±32

МГ С/(м3 X сут) 45-231 70-257 97-349 122-574

* Здесь и далее над чертой - среднее ± ошибка среднего, под чертой минимальное и максимальное значения

Численность (N3), биомасса (Вв) и продукция (Рв) бактериопланктона оказались также высокими (табл. 1). Максимальные значения обнаружены в Чебоксарском водохранилище. Средние величины N3, Вц, Рв в Чебоксарском водохранилище и озерной части Горьковского водохранилища превышали таковые в Рыбинском водохранилище и речной части Горьковского водохранилища, соответственно, в 1.4 - 2.3, в 1.8 - 2.7 и 1.8-2.1 раз. Во всех трёх водохранилищах между интегральной первичной и бактериальной продукцией обнаружена слабая положительная взаимосвязь (Я = 0.34 для Рыбинского водохранилища, Я = 0.41 для Горьковского и К — 0.55 для Чебоксарского). Очень высокий уровень развития как фитопланктона, так и бактериопланктона, зарегистрированный в период исследования, по

видимому, в значительной степени связан с аномально высокой температурой воды в водохранилищах летом 2010 г. 3.2 Реки

В малой реке Ильд на большинстве станций обнаружены низкие величины первичной продукции фитопланктона (табл. 2). В тоже время, в реке были зарегистрированы высокие численность и биомасса бактериопланктона. По-видимому, важными дополнительными источниками питания для гетеротрофных бактерий являются поступающее в малую реку аллохтонное органическое вещество и растворенное органическое вещество, продуцируемое многочисленными макрофитами. В р. Ильд получены низкие величины удельной скорости роста бактерий, и, соответственно, суточная продукция бактериопланктона оказалась невысокой.

Таблица 2. Первичная продукция фитопланктона (£Ррн, мг С/(м2 х сут)), общая численность бактериопланктона (N6,106 кл./мл), средний объём бактериальной клетки (V,

мкм3), биомасса (Вв, мг С/м3), удельная скорость роста (ц, ч"') и продукция (Рв) бактериопланктона в реках и оз. Севан

Параметры р. Ильд р. Ока оз. Севан

1Ррн 264±59 1212±23

26-900 1189-1234

N8 8.27±0.84 13.2±3.99 6.53±0.3

3.34-19.62 7.59-20.92 3.7-12.46

V 0.131±0.014 0.074±0.01 0.122±0.005

0.07-0.328 0.062-0.093 0.054-0.223

Вв 210±23 232±55 162±7

111-511 166-341 88-321

Ц 0.01±0.0004 0.034±0.004 0.0120±0.0004

0.008-0.014 0.026-0.04 0.008-0.022

Рв,10ь клДм-1 х 1.89±0.17 11.24±4.32 1.83±0.08

сут) 1.01-3.63 6.85-19.89 1.02-3.05

Рв мг С/(м3 х 48±4 197±64 46±2

сут) 24-94 119-324 22-94

* - определения не проводились.

В устьевом участке р. Ока первичная продукция фитопланктона была значительно выше, чем в малой реке (табл. 2). В тоже время величина численности бактериопланктона, в среднем, была больше таковой в р. Ильд в 1.6 раз, а биомасса - лишь в 1.1 раз, поскольку средний объем бактериальной клетки в малой реке был выше в 1,8 раз. Однако, удельная скорость и продукция планктонных бактерий были существенно выше (табл. 2).

3.3 Озеро Севан

Численность и биомасса бактериоплаиктона в высокогорном оз. Севан достигали высоких значений (табл. 2). Величины ^ и Вв, в среднем для озера, оказались близкими к таковым в мезотрофно-эвтрофном Рыбинском водохранилище. Высокое количество планктонных бактерий в озере, по-видимому, связано с сильной антропогенной нагрузкой на оз. Севан, однако, в исследованный период величины удельной скорости роста и продукции бактериоплаиктона в большинстве случаев были ниже, чем в Рыбинском водохранилище (табл. 2).

ГЛАВА 4. ЧИСЛЕННОСТЬ И ПРОДУКЦИЯ ВИРУСОВ В РАЗНЫХ ВОДНЫХ ЭКОСИСТЕМАХ. ВИРУС-ИНДУЦИРОВАННАЯ СМЕРТНОСТЬ ГЕТЕРОТРОФНЫХ БАКТЕРИЙ 4.1. Вириопланктон водохранилищ

В волжских водохранилищах выявлена очень высокая численность вириопланктона, превышающая общее количество бактериоплаиктона в 3-11 раз (табл. 3). Величины общей численности планктонных вирусов были выше в более продуктивных Чебоксарском водохранилище и озерном участке Горьковского водохранилища, чем в Рыбинском водохранилище и речной части Горьковского водохранилища. В Рыбинском и Чебоксарском водохранилищах между численностью вириопланктона и бактериоплаиктона была обнаружена умеренная положительная связь (Я = 0.39 и 0.47 соответственно).

Таблица 3. Общая численность свободных вирусов (Ыу, Юб ч./мл), отношение количества вирусов к общей численности бактериоплаиктона (МуЛ^в), отношение количества бактерий с прикрепленными к ним вирусами к общей численности бактериоплаиктона (ЫщЛ^в), численность вирусов, прикрепленных к клеткам бактерий (Иду, 106фагов/мл) и их соотношение с численностью свободных вирусов %) в водохранилищах

Параметры Водохранилища

Рыбинское Горьковское Чебоксарское

Речной участок Озёрный участок

43±3.9 41±4 62.3±26.1 56.3±2.7

16.5-60.9 24.2-50.2 19.6-140 38.2-77.1

Пу/Нв 6.3±0.6 4.9±0.7 4.4±2.3 3.9±0.2

3.2-10 2.3-7.9 1.6-11.1 2.6-6.6

ЫюМв 27±3 24±3 32±4 25±2

15-43 12-31 21-40 14-45

3.1±1.7 3.4±0.5 3.7±0.3 6.9±0.6

1.1-22.2 2.07-5.43 2.93-4.24 3-12.3

^у/Иу 10±6 8±1 9±2 12±1

2-79 4-10 3-13 6-16

В водной толще водохранилищ обнаружено большое количество бактерий с прикрепленными к их поверхности вирусами-бактериофагами (табл. 3). На одной бактериальной клетке находилось до 32 вирусов. В планктоне водохранилищ численность бактериофагов, ассоциированных с поверхностью бактериальных клеток, в среднем составляло 10% от численности свободных вирусов. Таким образом, большое количество вирусов может поступать на более высокие трофические уровни планктонной пищевой сети при потреблении бактерий с прикрепленными к ним бактериофагами простейшими, коловратками, ракообразными.

Количество потенциальных контактов между вирусами и бактериями (R варьировало от 397 до 5355 контактов/(кл. х сут)) в Чебоксарском водохранилище и озерной части Горьковского R составило, соответственно, 2892±219 и 2892±657 контактов/(кл. * сут), в Рыбинском - 790±84 контактов/(кл. х сут), в речной части Горьковского водохранилища -1059±77 контактов/(кл. х сут).

Количество видимых инфицированных вирусами клеток бактерий (FVTC) в воде волжских водохранилищ достигало 5% от общей численности бактериопланктона (табл. 4). В Рыбинском водохранилище вирусы в среднем инфицировали в 2-3 раза меньше бактерий, чем Горьковском и Чебоксарском водохранилищах. В итоге численность всех инфицированных вирусами бактериальных клеток колебалась от 2.3 до 29.9 % от общей численности бактериопланктона. Содержание бактериофагов внутри инфицированных бактерий (BS) значительно колебалось, достигая в более трофных условиях 123 фагов/кл., хотя значимых различий между водными экосистемами не обнаружено (табл. 4).

В Горьковском и Чебоксарском водохранилищах существовали положительные зависимости между R и FV1C (соответственно, г = 0.62 и г = 0.20, р < 0.05), а также между NIB и FVIC (соответственно, г = 0.39 и г = 0.41,р < 0.05),

В водохранилищах вирусы в разной степени инфицировали гетеротрофных бактерий различной морфологии. Общее количество инфицированных клеток бактерий было представлено в среднем по водоему в Рыбинском водохранилище: 59.4±7.8% - палочками, 26.3±5.4% - вибрионами, 12.2±4.4± кокками и 2.1±2.1% - нитями. В Горьковском водохранилище: 47.4±3.1% - палочками, 28.3±5.2% - вибрионами, 17.7±4.4± кокками и 6.6±2.9% - нитями. В Чебоксарском водохранилище: 45.6+5.9% - палочками, 22.4±4.6% -вибрионами, 25.2±4.8± кокками и 6.8±3.1% - нитями.

В водохранилищах выявлена высокая смертность гетеротрофных бактерий, вызванная вирусным лизисом (VMB). В эвтрофных Горьковском и Чебоксарском водохранилищах VMB достигала половины суточной продукции бактериопланктона. В мезотрофно-эвтрофном Рыбинском водохранилище вирус-индуцированная смертность бактерий была существенно

11

ниже (табл. 4). Точно также, количество бактерий, отмирающих в результате вирусного лизиса (VIM), в Горьковском и Чебоксарском водохранилищах существенно превышало таковое в Рыбинском водохранилище (табл. 4). Вирусный лизис большего количества бактерий в более трофных водохранилищах способствовал поступлению значительно большего количества зрелых вирусов во внешнюю среду (т.е. более высокой продукции вирусов), чем в менее трофных. Время оборота численности планктонных вирусов в более продуктивных водохранилищах было существенно ниже (табл. 4).

Таблица 4. Частота видимых инфицированных клеток бактерий (FVIC, %), частота инфицированных клеток бактерий (FIC, %), количество фагов внутри бактериальной клетки (BS, фагов/кл.), вирус-индуцированная смертность бактерий (VMB, % от Рв), гибель бактерий в результате вирусной инфекции (VIM), продукция вирусов (Pv), время оборота общей численности вирусов (Tv, сут), количество органического углерода, поступающего в водную среду в результате вирусного лизиса бактерий (DOC, мг С/(м3 х сут)). в водохранилищах

Параметры Водохранилища

Рыбинское Горьковское Чебоксарское

Речной участок Озёрный участок

FVIC 1. 1=ь0.2 2.3±0.5 3.7±0.4 2.4±0.2

0.3-2.1 1.3-5 2.8-4.5 0.8-5

FIC 7.3±1.3 14.7±2.7 23.3±1.9 15.8±1.4

2.3-14.4 8.9-29.9 18.1-27.4 5.5-29.9

BS 2б±5 27±8 16±7 28±8

5-58 6-61 7-38 5-123

VMB 8.8±1.8 21.1±5.8 37.3±4.5 22.4±2.7

2.4-18.9 10.5-55 25.6-47.5 6.1-55

VIM, 10° кл./(мл 0.7±0.2 2±1.1 4.3±0.9 2.6±0.3

хсут) 0.1-2.2 0.4-8.9 2.4-6.4 0.7-4.7

VIM, мг С/(м3 х 11.3±2.6 34.7±18.1 82.1±19 56.2±7

сут) 1.1-30.1 9-141.1 46-132 15.2-105

Pv, 10" 18.5±6.3 80±52 64.7±25 54.5±18

частиц/(мл х сут) 0.9-71.1 2.7-389.4 , 16.7-133.6 3.4-300.6

Pv. 1.9±0.6 8±5.3 6.5±2.5 5.4±1.8

мг С/(м3 X сут) 0.09-7.1 0.3-38.9 1.7-13.4 0.3-30.1

Ту 12.2±6.8 4.5±1.6 2.5±2 2.7±0.8

0.5-70.8 0.1-10.2 0.2-8.4 0.2-14.8

DOC 7.7±1.6 26.7±12.9 75.6±19.4 50.9±6.7

1-19.5 8.7-102.2 44.3-127.2 14.9-101.6

В результате вирусного лизиса зараженных бактерий в водную среду попадают как зрелые фаговые частицы, так и продукты распада самих бактериальных клеток. Органическое вещество лизированных бактерий активно поглощается неинфицированными бактериями. Таким образом, в результате вирус-индуцированной гибели бактерий образуется дополнительный источник питательных веществ для гетеротрофных бактерий. Расчеты показали, что в исследованный период после распада инфицированных бактерий в водную толщу водохранилищ поступало существенное количество легкоусвояемого органического вещества (DOC) (табл. 4). Величина DOC составила в Рыбинском водохранилище 6.8±2.4%, в речной и озерной частях Горьковского водохранилища - 14.9±4.8% и 35.7±17.9%, в Чебоксарском водохранилище - 18.7±3.9 % от суточной продукции фитопланктона под единицей (м2) площади водоёма. 4.2. Вирнопланктон рек

Количество планктонных вирусов на исследованных участках р. Ильд было в 2 раза ниже, чем в р. Ока, отношение NV/NB отличалось в меньшей степени (табл. 5). В малой реке между общей численностью бактериопланктона и количеством вириопланктона наблюдалась умеренная положительная связь (г = 0.44).

Доли видимых инфицированных и всех инфицированных клеток бактерий в р. Ильд, по сравнению с таковыми в р. Ока, оказались невысокими (табл. 5). В малой реке зараженные бактерии содержали внутри клеток меньшее число зрелых фагов, чем в р. Ока (табл. 5).

Количество возможных контактов (R) между вирусами и бактериями в р. Ильд (736±132 контактов/(кл. * сут)) было в среднем в три раза ниже, чем в р. Ока (2131*698 контактов/(кл. * сут)).

Смертность бактерий в результате вирусного лизиса (VMB) на исследованных станциях в малой реке не превышала 8% от суточной бактериальной продукции. Величина VMB и количество лизированных за сутки бактерий (VIM) в р. Ильд оказались, соответственно, в 6.8 и 34.9 раза ниже, чем в р. Ока. Время Оборота численности вириопланктона и продукция бактериофагов в реках отличались на порядок (табл. 5).

В результате вирусного лизиса планктонных бактерий в водную среду в р. Ильд поступало небольшое количество органических веществ (табл.5). Отношение DOC к суточной продукции фитопланктона под единицей (м2) площади водотока составляло 4.9±2.1%. В р. Ока в результате лизиса вирусами в воду поступало в 20 раз больше органического вещества, чем в р. Ильд, что составляло 28.1±24.3% от суточной продукции фитопланктона под единицей (м2) площади водотока.

Таблица 5. Общая численность свободных вирусов (Nv, Ю6 ч7мл), отношение количества вирусов к общей численности бактериопланктона (NV/NB), частота видимых инфицированных клеток бактерий (FVIC, %), частота инфицированных клеток бактерий (FIC, %), количество фагов внутри бактериальной клетки (BS, фагов/кл.), вирус-индуцированная смертность бактерий (VMB, % от Рв), гибель бактерий в результате вирусной инфекции (VIM), продукция вирусов (Pv), время оборота общей численности вирусов (Tv, сут). количество органического углерода, поступающего в водную среду в результате вирусного лизиса бактерий (DOC, мг С/(м3 х сут)), в

реках и оз. Севан

Параметры р. Ильд р. Ока оз. Севан

Nv 26.2±4 53.9±2.8 29.3*2.4

2.2-67 48.3-57.3 10.5-75.9

NV/NB 3.6±0.7 4.7±1.1 4.5±0.3

0.4-11 2.7-6.4 2.0-11.2

FVIC 0.5±0.1 2.8±0.3 0.7±0.1

0.2-1 2.3-3.3 0.2-2.2

FIC 3.4±0.6 17.9±1.7 4.7±0.5

1.1-6.9 15.1-21 1.1-14.6

BS 15±4 47±24 J5±i

5-45 7-90 5-38

VMB 3.7±0.7 25.4±3.4 5.3±07

1.1-7.8 20.1-31.6 1.2-19.3

VIM, 106кл./(мл x 0.09±0.03 3.12*1.58 0.11 ±0.02

сут) 0.02-0.3 1.4-6.28 0.02-0.59

VIM, мг С/(м3 x сут) 2.3±0.7 54.3±24.3 2.6±0.5

0.4-7.3 23.8-102.4 0.6-15.2

Pv, 10"фаг/(мл х сут) 1,3±0.5 85±33 1.8±0.4

0.1-4.6 44-151 0.2-10.8

Pv, мг С^м-1 х сут) 0.26±0.09 17±6.7 0.2±0.04

0.02-0.93 8.8-30.2 0.02-1.08

Ту, сут 20.4±4.7 1.8±0.7 39.1±5.3

5.4-44.8 0.9-3.2 3.2-139.9

DOC 1.9±0.6 37.3±28.2 2.3±0.4

0.4-6.7 6.4-93.6 0.5-13.1

4.3 Вириопланктон озера Севан

В апреле-августе 2009г. в прибрежье Малого Севана численность вириопланктона изменялась от 21.4 * 10б ч./мл (27.05.2009) до 75.9 х 106 ч./мл (01.07.2009), составляя в среднем 44.3><106 ч./мл. Отношение Иу^в находилось в пределах 3.2-12.9, в среднем 7.1. Количество контактов между вирусами и бактериями изменялось от 288 (29.04.2009) до 1290 контактов/(кл. * сут) (в июле) составляя, в среднем, 719±76 контактов/(кл. х сут).

Доля видимых инфицированных клеток бактерий в общей численности бактериопланктона колебалась от 0.2% до 2.2% (в среднем 1.0±0.2%), достигая максимальных значений в начале мая и в конце августа. Количество всех инфицированных бактериальных клеток находилось в пределах 1.2-14.6% (в среднем 6.6%) общего количества бактериопланктона. В клетках инфицированных бактерий находилось, в среднем, от 6 (24.06.2009) до 36 (13.05.2009) зрелых фаговых частиц. Величины вирус-индуцированной смертности бактерий изменялись от 1.2% до 19.3% от Рв, среднем 7.8 ± 1.5 % от Рв. В процессе лизиса бактериальных клеток в воду поступало органическое вещество в количестве от 1.8 до 59.9 (в среднем 15.2±4.4) мг С/(м3*сут).

На глубоководных участках оз. Севан в период изучения температура воды на поверхности и в придонном слое отличалась лишь на 3-5°С. В разных участках озера характер вертикального распределения вириопланктона различался. Минимальные и максимальные величины численности вириопланктона в толще воды в Малом Севане отличались в 2.7 раза, в Большом Севане - в 1.3 - 1.5 раз, а на перешейке между ними - в 2.5 раза. Наибольшие значения на станциях в Малом Севане и на перешейке обнаружены на глубинах 15 и 25 м, а на станциях в части озера Большой Севан - в поверхностных водах. Самые низкие значения зарегистрированы в зоне холодного купола в Большом Севане, где температура воды была на 1-3 °С ниже, чем в других районах озера. Величины Ыу, рассчитанные в среднем для столба воды, находились в пределах 20.9-23.9 х 106 ч./мл. В водной толще озера количество планктонных вирусных частиц превышало общую численность бактериопланктона в 2.2-5.8 раз. В Малом Севане наблюдалась умеренная положительная зависимость между вертикальным распределением численности бактериопланктона и вириопланктона (г = 0.54).

В глубоководных районах оз. Севан выявлена невысокая степень зараженности гетеротрофных бактерий вирусами. В толще воды озера величины ИУЮ и Р1С не превышали 1.5% и 10% от общей численности бактерий. Соответственно, значение УМВ находилось в пределах 12% от суточной Рв. В тоже время значения этих параметров на разных глубинах отличались в 3-5 раз. В итоге большое количество бактерий лизировалось вирусами как в поверхностных горизонтах (2.0-4.4 мг С/(м3*сут), так и на глубинах 15-20 м (2.0-5.4 мг С/(м3хсут) (рис. 1). Количество контактов между вирусами и бактериями находилось в пределах 249-345 контактав/(кл. х сут).

»-СТ4

all «--CI22 t—«24

-»-CI4

■* all

Рисунок 1. Глубинные профили распределения общей численности вириопланктона, 106 кл/мл (а); частота инфицированных клеток бактерий (FIC, %) (Ь); продукция вирусов (Pv, 106 фаг/(мл х сут)) (с); количество органического углерода поступающего в водную среду в результате вирусного лизиса бактерий DOC, мг С /(м3 х сут) (d).

Продукция вирусов была невелика и составляла от 0.7 до 1.3x106 частиц/(мл х сут). Значения продукции отличались на разных глубинах в 6-12 раз. Единых закономерностей в распределении продукции вириопланктона не наблюдалось.

В целом, в высокогорном оз. Севан величины численности вириопланктона, частоты видимых инфицированных клеток бактерий и вирус-индуцированной смертности бактерий оказались невысокими и были существенно ниже таковых в более продуктивных волжских водохранилищах (табл. 5).

ГЛАВА 5. ОЦЕНКА ЗНАЧИМОСТИ ВИРУСОВ В СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ ПЛАНКТОННЫХ МИКРОБНЫХ

СООБЩЕСТВ

Несмотря на свои малые размеры, вирусы, благодаря высокой численности, могут вносить существенный вклад в суммарную биомассу планктонного микробного сообщества (Вмс). сравнимый с простейшими (табл. 6). В оз. Севан доля вирусов в В„с была особенно велика. В водных экосистемах с более высоким уровнем первичной продукции фитопланктона (более высокого трофического статуса) доля вирусов в общей биомассе микробного сообщества была ниже в 2-4 раза (табл. 6).

Таблица 6. Вклад (%) вирусов и разных групп микроорганизмов в формирование суммарной биомассы планктонных микробных сообществ (Вмс, мг С/м3) в разных водных экосистемах

Водоём В„с Доля (%) в суммарной биомассе микробного сообщества

Бактерии Вирусы АПП1 ГНФ Инфузории

Рыбинское 181.9 68.8 2.4 15.4 10.7 2.7

Горьковское 276.7 78.7 1.7 4.1 11 4.5

Чебоксарское 425.6 81.7 1.3 4.1 11 1.9

р. Ока 333.3 69.6 1.6 9 16.5 3.3

о. Севан 74.8 69.4 5.3 11.6 9.61 4>

Примечание: 1 - данные A.B. Романенко (2010), 2 - данные Н.Г Косолаповой (2010), 3 -данные Жарикова В.В (2010). АПП - автотрофный пикопланкгон, ГНФ - гетеротрофные нанофлагелляты.

Сравнительная оценка значения вирусов-бактериофагов, бактериального питания гетеротрофных нанофлагеллят и инфузорий в гибели планктонных бактерий в водохранилищах Верхней и Средней Волги показала, что в исследуемый период основными потребителями бактериопланктона оказались бесцветные жгутиконосцы (рис. 2), а вирусы-бактериофаги были вторыми по значимости в контроле численности и продукции планктонных бактерий (рис. 2). Общая смертность бактериопланктона (в) возрастала с увеличением продуктивности водной экосистемы. Вклад разных компонентов планктонного микробного сообщества в общую смертность бактериопланктона, в среднем для трех водохранилищ, составил: ГНФ - 64.6%, вирусы - 30.4%, инфузории - 5%.

В устье р. Ока в была представлена: ГНФ - 80.0%, вирусы - 15.9%, инфузории - 4.1%. В высокогорном оз. Севан вирус-индуцированная гибель бактерий была сравнима с потреблением инфузориями и значительно ниже выедания жгутиконосцами (рис. 2).

0=41 мг С/(м3 сут) 0=135 мг С/(м3 сут)

о С4*111» и

S п 1Ф □ Инфузории

Рисунок 2. Вклад (%) вирусов и простейших в общее количество бактериопланктона потребленного вирусами и простейшими (G, мг С/(м3 * сут) в разных водных экосистемах.

Известно, что планктонные вирусные частицы могут вовлекаться в планктонную пищевую сеть через трофическое звено вирусы - гетеротрофные напофлагелляты. Однако скорость потребления свободных вирусов бесцветными жгутиконосцами (от 1.9 до 3.3 вирусов/(жгутиконосца х час)) невысокая (Suttle, Chen, 1992; Gonzalez, Suttle, 1993; Bettare! et al., 2003). В тоже время, вирусы могут попадать на более высокие трофические уровни, будучи прикрепленными к бактериальным клеткам, при их потреблении простейшими и тонкими фильграторами.

Расчеты показали, что в волжских водохранилищах гетеротрофные нанофлагелляты, питаясь бактериопланктоном, потребляли значительно большее количество прикрепленных

18

вирусных частиц, чем свободных (табл. 7). Общее количество поглощенных вирусов, в среднем для водохранилищ, составляло 14% от суточной продукции вирусов. Таким образом, в исследованных водных экосистемах в трофическую планктонную сеть может вовлекаться значительное количество вирусных частиц.

Таблица 7. Потребление природными популяциями планктонных гетеротрофных нанофлагеллят свободных вирусов (в,, 105 частиц/(мл * сут)) и вирусов, прикрепленных к клеткам бактерий (С2, 105 частиц/(мл х сут)), в водных экосистемах

Водоём б, с2 С1 + 02 в, + С2/Ру, %

Рыбинское водохранилище 1.9-16.1 8.6 ± 1.3 215-5885 1095.2 ± 453.8 221 -5895 1104 ±454 1.0-110.3 19.3 ±9.6

Горьковское водохранилище 6.5-20.9 14.6 ±2.6 608-1862 1157.6 ± 138.5 332- 1877 1172 ± 138 0.2-39.5 11.4 ±4.4

Чебоксарское водохранилище 5.6-35.3 18.1 ± 1.5 691-9054 3732.2 ±616.0 705 - 9080 3750 ±616 I.8-25.7 II.0± 1.6

В итоге, проведенное исследование свидетельствует, что вирусы являются важным структурно-функциональным компонентом планктонных микробных трофических сетей.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Исследования вирусов в разнотипных пресноводных экосистемах выявили их важную роль в структуре и функционировании микробных планктонных сообществ. Вирусы являются наиболее многочисленным компонентом планктона водохранилищ, рек и озер. Их численность значительно превышает численность бактериопланктона. До 90-х годов прошлого века считалось, что основными потребителями бактериопланктона в водных экосистемах являются простейшие, в основном гетеротрофные нанофлагелляты. Проведенные исследования показали, что вирусы-бактериофаги также цграют большую роль в смертности планктонных г етеротрофных бактерий, гибель которых в результате вирусного лизиса может быть сопоставима с потреблением бактериопланктона простейшими.

В результате лизиса бактериальных клеток вместе со зрелыми вирусными частицами в окружающую водную среду поступают легкоусвояемые органические соединения, которые активно используются гетеротрофными бактериями. Таким образом, влияние этих двух факторов гибели бактерий (вирусный лизис и потребление консументами) на планктонные пищевые сети существенно различается: выедание планктонными организмами приводит к переносу углерода и других биогенных элементов на более высокие трофические уровни, в то время как лизис вирусами приводит к рециклингу биогенных элементов в пределах

микробной пищевой сети. Однако существенное количество вирусных частиц (свободных и прикрепленных к бактериальным клеткам) может вовлекаться в планктонную пищевую сеть при их потреблении бактериоядными простейшими и многоклеточными организмами.

Полученные в настоящей работе результаты свидетельствуют о необходимости внесения существенных поправок в схемы структуры и функционирования планктонных микробных сообществ пресноводных экосистем. Количественный учет вирусов и определение вирус-индуцированной гибели микроорганизмов должны учитываться при изучении потоков вещества и энергии в водных экосистемах.

ВЫВОДЫ

1. Вирусы являются наиболее многочисленным компонентом планктонных сообществ исследованных всех исследованных пресноводных экосистем. Количество вириопланктона превышает численность бактериопланктона в 3.6 - 6.3 раз. Количество вирусов выше в водах с более высоким уровнем первичной продукции фитопланктона и большей численностью бактериопланктона. Они вносят заметный вклад (1.3 - 5.3%) в формирование общей биомассы планктонных микробных сообществ.

2. В планктоне численность вирусов, прикреплённых к бактериальным клеткам, составляет 9 - 13% от численности свободных вирусов. Благодаря этому, вирусы могут поступать на более высокие трофические уровни вместе с бактериальными клетками, потребляемыми простейшими, коловратками и ракообразными.

3. Количество инфицированных вирусами клеток бактерий варьирует от 1 до 30% от общей численности бактериопланктона, достигая максимальных значений в наиболее продуктивных водах. Количество зрелых бактериофагов, обнаруженных внутри бактериальных клеток, изменяется от 5 до 123 частиц на бактерию. Максимальные величины были зарегистрированы в эвтрофных водохранилищах.

4. В результате вирусного лизиса погибает в среднем 0.1-4.3 млн. клеток бактерий / (мл * сут), что составляло 3.7-37.3% суточной бактериальной продукции. Смертность бактерий, вызванная лизисом вирусов, оказалась соизмеримой с потреблением бактериопланктона простейшими. В эвтрофных водах вирус-индуцированная смертность бактерий достигает 55% от суточной продукции бактериопланктона, в менее трофных - не более 19.3%.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Публикации в изданиях перечня ВАК РФ

1. Стройное Я.В., Романенко A.B., Масленникова Т.С., Копылов А.И. Вирио- и бактериопланктон малой реки: влияние вирусов на смертность гетеротрофных бактерий // Биология внутр. вод. 2011. № 3. С. 22-29.

2. Копылов А.И., Лазарева В.И., Минеева U.M., Масленникова Т.С., Стройное Я.В. Влияние аномально высокой температуры воды на развитие планктонного сообщества водохранилищ Средней Волги летом 2010 г. // ДАН. 2012. Т. 442. № 1. С. 133-135.

3. Копылов A.U. , Стройное Я.В., Заботкина Е.А., Романенко A.B., Масленникова Т.С. Гетеротрофные микроорганизмы и вирусы в реке Оке и Чебоксарском водохранилище в аномально жаркое лето 2010 года // Известия РАН. Серия биологическая. 2013. № 3. С. 377-382.

4. Копылов А.И., Стройное Я. В., Заботкина Е.А., Романенко A.B., Масленникова Т.С. Влияние аномально высокой температуры воды и «цветения» воды цианобактериями на функционирование гетеротрофных микроорганизмов и вирусов в Горьковском водохранилище летом 2010 года // Биология внутр. вод. 2013. № 2. С. 16-24.

Публикации в прочих изданиях

5. Стройное Я.В. Количественный состав вирусов-бактериофагов и их влияние на смертность гетеротрофного бактериопланктона в различных водоёмах // Вестник молодых учёных ИвГУ. 2008. Вып.8. С. 25-29.

6. Стройное Я.В., Косолапое Д.Б., Копылов А.И. Вирусы в планктоне озера Севан // Экология озера Севан в период повышения его уровня. Результаты исследований Российско-армянской биологической экспедиции по гидроэкологическому обследованию озера Севан (Армения) (2005-2009 гг.). Махачкала: Наука ДНЦ. 2010. С. 115-123.

7. Стройное Я.В., Копылов А.И. Бактериопланктон в водохранилищах Средней волги в период аномально высокой температуры (лето 2010 года) // Бассейн Волги в XXI-м веке: структура и функционирование экосистем водохранилищ: Сб. мат-лов докладов участников Всероссийской конф. Ин-т биологии внутр. Вод им. И.Д. Папанина РАН, Борок, 22-26 октября 2012 г. - Ижевск: Издатель Пермяков С.А., 2012. С. 291-294.

8. Стройное Я.В., Копылов А.И. Структурно-функциональные характеристики бакгериопланктона водохранилищ Средней Волги в период аномально высокой температуры воды 2010 года: Мат-лы 4-го Байкальского Микробиологического Симпозиума с междунар. участием. Иркутск, 2011. - Иркутск: Издательство Института географии им. В.Б. Сочавы СО РАН, 2011 С. 124-125;

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Стройнов, Ярослав Витальевич, Борок

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии внутренних вод им. И.Д. Папанина

Российской академии наук

_ „ На правах рукописи 0420145897? р

Стройнов Ярослав Витальевич

Вириопланктон в разных пресноводных экосистемах: роль вирусов в смертности гетеротрофных бактерий.

Специальность 03.02.10 - гидробиология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель д.б.н. Копылов А.И.

Борок - 2014

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ВВЕДЕНИЕ..................................................................................................................4

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ............................................................................7

ГЛАВА 2. ВОДНЫЕ ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ....................22

2.1. Водные объекты и краткая характеристика условий наблюдений на исследованных станциях......................................................................................22

2.2. Методы исследования....................................................................................27

ГЛАВА 3. СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ Б АКТЕРИОПЛАНКТОНА.......................................................................................31

3.1. Водохранилища..............................................................................................31

3.2. Реки..................................................................................................................41

3.3. Озеро Севан....................................................................................................47

!

ГЛАВА 4. ЧИСЛЕННОСТЬ И ПРОДУКЦИЯ ПЛАНКТОННЫХ ВИРУСОВ В РАЗНЫХ ВОДНЫХ ЭКОСИСТЕМАХ. ВИРУС-ИНДУЦИРОВАННАЯ СМЕРТНОСТЬ ГЕТЕРОТРОФНЫХ БАКТЕРИЙ.................................................55

4.1. Вириопланктон водохранилищ.....................................................................55

4.2. Вириопланктон рек........................................................................................69

4.3. Озеро Севан....................................................................................................75

ГЛАВА 5. ОЦЕНКА ЗНАЧИМОСТИ ВИРУСОВ В СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ ПЛАНКТОННЫХ МИКРОБНЫХ СООБЩЕСТВ ВОДНЫХ ЭКОСИСТЕМ...............................................................84

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.........................................................................................................87

ВЫВОДЫ...................................................................................................................88

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.........................................................................................89

ПРИЛОЖЕНИЯ.......................................................................................................102

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

Ррн - первичная продукция фитопланктона

ЕРрн- первичная продукция фитопланктона в столбе воды, интегральная первичная продукция

Ny - общая численность вирусов FDC - частота делящихся клеток

FVIC - частота отчётливо видимых инфицированных вирусами клеток бактерий

BS - среднее число вирусов в инфицированных клетках бактерий

FIC - доля инфицированных бактериальных клеток в общей численности

VMB - гибель бактерий вызванная вирусным лизисом

VIM - скорость вирус-опосредованной гибели бактерий

Рв- бактериальная продукция

Ру- продукция вириопланктона

Ту- время оборота численности вирусов

Nb - общая численность бактериопланктона

V - средний объём бактериальной клетки

Вв - общая биомасса бактерий

р. - удельная скорость роста

Nib - количество бактерий с прикреплёнными клетками вирусов Nav - количество вирусов прикреплённых к клеткам бактерий R - частота контактов между вирусами и бактериями

I

Ту - время оборота вирусов

DOC - количество органического углерода поступающего в водную среду в результате вирусного лизиса бактерий

Св - скорость потребления органического углерода гетеротрофным бактериопланктоном Вмс - биомасса микробного сообщества

Gi - потребление природными популяциями планктонных гетеротрофных нанофлагеллят свободных вирусов

G2- потребление природными популяциями планктонных гетеротрофных нанофлагеллят

вирусов, прикреплённых к бактериальным клеткам

GcyM - суммарное потребление бактериопланктона в водных экосистемах

кл. - клеток

ч. - частиц

РОС - количество взвешенного органического углерода в воде ГНФ - гетеротрофные нанофлагелляты

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы

Вирусы — мельчайшие существа-иждивенцы с простой биологической структурой, состоящей из одной или нескольких молекул РНК или ДНК (причем оба типа нуклеиновых кислот встречаются как в двуцепочечной, так и в одноцепочечной форме), заключенных в защитную белковую оболочку (капсид). Присутствие вирусов в водных объектах известно с середины прошлого века (Spencer, 1955; Крисс, 1959). Однако активные исследования их экологического значения в водных экосистемах начались только с работы Берга с соавторами (Bergh et al., 1989), которые обнаружили очень высокую концентрацию водных вирусов ((1.5-254) х 106 ч./мл), в основном классифицируемых как бактериофаги. В водной среде вирусы существуют в двух фазах: внеклеточной и внутриклеточной. Продуктивное размножение вирусов происходит только внутри живых клеток и, в случае литической инфекции, заканчивается гибелью (лизисом) клетки. Последующие исследования (Proctor, Fuhrman, 1990; Suttle et al., 1990; Нага et al., 1991) подтвердили очень высокую численность вирусов в различных водных местообитаниях и установили, что вирусы могут инфицировать большое количество гетеротрофных бактерий (до 45.7% общей численности) и вызывать высокую смертность бактериопланктона (до 128.2% суточной бактериальной продукции) (Peduzzi, Luef 2009). В результате вирусного лизиса бактерий значительное количество органического вещества не поступает на более высокие трофические уровни планктонной пищевой сети, а вновь используется бактериальным сообществом (Thingstad et al., 1993; Bratbak, Heldal, 2000).

В настоящее время общепризнано, что вирусы являются важной и неотъемлемой частью биологических сообществ водных экосистем. Они влияют на численность, видовой состав и разнообразие планктонных микроорганизмов, а также изменяют потоки вещества и энергии в микробных сообществах (Fuhrman, 1999; Noble et al., 1999; Bratbak, Heldal, 2000; Thingstad, 2000). Кроме того, вирусы являются посредниками генетического обмена внутри вида и между видами через трансдукцию (Jiang, Paul, 1998). Закономерности распределения и функционирования водных вирусов сложны и до сих пор недостаточно изучены. В связи с этим необходимость исследований роли вирусов-бактериофагов в функционировании микробного сообщества в разных водных экосистемах очевидна. Имеющиеся в литературе заключения о значении вирусов как компонента планктонных сообществ пресноводных

экосистем основаны на результатах исследований вириопланктона, главным образом, в озерах, и в меньшей степени, водохранилищах и реках (\Уоттаск, СоЬуеИ, 2000^етЬаиег, 2004; Рейит, Ьие£ 2009).

Исследования вириопланктона в пресноводных экосистемах России начались сравнительно недавно и пока весьма немногочисленны (Дрюкер, Дутова, 2009; Копылов, Косолапов, 2011). В тоже время сведения о количестве и активности вирусов необходимы для адекватной оценки структуры и функционирования планктонных сообществ водоемов и водотоков.

Цель н задачи исследований.

Цель работы - оценить роль вирусов в структуре и функционировании планктонных микробных сообществ в водохранилищах, реках и озере.

Для достижения цели, были поставлены следующие задачи:

1. Определить общую численность, биомассу и продукцию бактерий - основных хозяев планктонных вирусов.

2. Определить общую численность вириопланктона, в том числе: свободноплавающих вирусов, вирусов прикрепленных к стенкам бактерий и фагов, находящихся внутри бактериальных клеток.

3. Определить количество инфицированных клеток бактерий и их долю в общей численности бактериопланктона. Выяснить доли разных морфотипов бактерий в общем количестве инфицированных бактериальных клеток.

4. Определить вирус индуцированную смертность бактериопланктона и оценить поступление органического углерода в окружающую водную среду в результате вирусного лизиса.

5. Определить продукцию вириопланктона и время оборота общей численности вирусов.

6. Выяснить вклад вириопланктона в суммарную биомассу планктонных микробных сообществ в разных водных экосистемах. Сравнить гибель бактерий в результате вирусного лизиса с их потреблением простейшими. Оценить выедание вирусных частиц простейшими

Научная новизна и теоретическая значимость работы.

Результаты диссертационной работы существенно дополняют и расширяют имеющиеся в литературе сведения об обилии и активности планктонных вирусов в пресноводных экосистемах. Впервые в исследованиях экологии пресноводных вирусов определены: количество бактериофагов, прикрепленных к бактериальным клеткам, доли бактерий разных морфотипов в

общем количестве инфицированных клеток, вклад вирусов в общую биомассу планктонных микробных сообществ. Полученные данные вносят существенные изменения в общепринятую схему потоков органического вещества и энергии в планктонных системах.

Практическая значимость.

Выявленные закономерности распространения и активности планктонных вирусов в водоёмах и водотоках могут использоваться для разработки методов управления функционированием водных экосистем, при моделировании и прогнозировании процессов трансформации вещества и энергии в реках, озерах и водохранилищах разного трофического статуса, а также при обосновании и разработке системы мониторинга качества их вод.

Выявленная зависимость численности вирусов от трофического статуса пресноводной экосистемы (первичной продукции фитопланктона) может быть в дальнейшем использована в качестве индикатора экологического благополучия водоёмов и водотоков.

Апробация результатов диссертации.

Материалы диссертации доложены и обсуждены на конференции «Молодая наука в классическом университете: секция биология» (Иваново, 2008), на XIV Школе-конференции молодых учёных с иностранным участием (Борок, 2010), международном III Байкальском микробиологическом симпозиуме (Иркутск, 2011), всероссийской конференции «Бассейн Волги в ХХ1-м веке: структура и функционирование экосистем водохранилищ» (Борок, 2012).

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Вирусы - мельчайшие существа-иждивенцы, неспособные к самостоятельной жизни вне заражаемых ими клеток (Агол, 1997). Общеизвестно, что вирусы могут вызывать заболевания, и их размеры очень малы. Есть вирусы, размножающиеся в клетках животных (позвоночных и беспозвоночных), другие обитают в растениях, третьи (бактериофаги или просто фаги) паразитируют на бактериях. Состав, размеры и форма вирусов весьма разнообразны. Схематически вирусы представляют собой наследственный материал, помещенный в защитную белковую оболочку (капсид), иногда содержащую также липидные и углеводные компоненты. В наследственном веществе - молекуле или нескольких молекулах РНК или ДНК закодирована «минимальная потребительская корзина»: ферменты для копирования (репликации) этих вирусных нуклеиновых кислот, а также белки, входящие в состав вирусной частицы (вириона). Если у всех невирусных организмов наследственное вещество - это двухцепочечные молекулы ДНК (цепочки которых комплементарны), то вирусы могут содержать не только ДНК, но и РНК, причем оба типа нуклеиновых кислот встречаются как в двуцепочечной, так и в одноцепочечной форме. Для каждого вируса характерна определенная форма нуклеиновой кислоты.

Вирусы-бактериофаги были открыты дважды: Туортом в 1915 и ди Хирелли в 1917 (Duckworth, 1987). Для вирусов, вызывающих лизис бактерий, ди Хирелли предложил название «бактериофаги», что буквально означает «поедатели бактерий».

Присутствие вирусов в водных объектах известно с середины прошлого века (Spencer, 1955, Крисс, 1959), но считалось, что их количество в водной среде не превышает численность бактерий. В тоже время некоторые исследователи предполагали, что вирусы могут оказывать существенное влияние на численность, видовой состав, скорость роста популяции, а так же на биохимические характеристики микроорганизмов (Wiebe, Liston, 1968). Огромный интерес и активные исследования экологического значения вирусов в водных экосистемах начались только с работы Берга с соавторами (Bergh et al., 1989), которые, используя значительно улучшенные методы исследования, обнаружили очень высокую концентрацию водных вирусов ((1.5-254) х 106 ч./мл), в основном классифицируемых как бактериофаги.

Хотя большая часть вирусов в водных средах представлена вирусами прокариот, вирусы эукариот так же вносят значительный вклад в суммарную биомассу вирусов. Размеры их капсидов варьируют от <20 до 400 нм, как правило, 30-70 нм. Доминирование меньших или больших капсидов в разных средах может отражать различия в структуре сообщества хозяев (различные прокариоты, водоросли и т.д.). Обычно для подсчёта вирусов используют два различных подхода. Непрямое определение титра методом посевов, а также методом «наиболее вероятного числа» постоянно используется для анализа качества воды, но редко в вирусной экологии. Поскольку не более 1% бактерий из естественных водоёмов растут на искусственных средах, а для выращивания вирусов необходим специфический хозяин, данные методы, как правило, серьёзно недооценивают общую численность бактериофагов. Несмотря на низкую эффективность культуральных методов в оценке вирусного обилия, они остаются незаменимыми для изоляции и отчистки систем фаг-хозяин (Wommack, Colwell, 2000).

Второй подход основывается на прямом учёте бактерий в пробе воды. В настоящее время есть три способа прямого учёта вирусов: трансмиссионная электронная микроскопия (ТЭМ) с предварительным контрастированием уранилацетатом, эпифлуоресцентная микроскопия и проточная цитометрия. Последние два метода требуют окрашивания флуорохромами, специфичными для нуклеиновых кислот. Для ТЭМ и эпифлуоресцентной микроскопии пробы необходимо предварительно концентрировать посредством

ультрацентрифугирования на сеточки (ТЭМ) или фильтрованием

(эпифлуоресцентная микроскопия). Как правило, подсчет посредством ТЭМ

»

занижает значение по сравненшо с эпифлуоресцентной микроскопией (по техническим причинам) и последний метод чаще используют для подсчёта общего вирусного обилия. Поточная цитометрия позволяет обрабатывать большое количество проб и позволяет обходиться без предварительной концентрации, но требует дорогого оборудования и высокой квалификации, а также не всегда применима в исследовании проб воды из естественных водоёмов. Все три метода имеют преимущества и недостатки. Использование ТЭМ приводит к недооценке вирусного обилия из-за таких технических проблем как неравномерное окрашивание и распределение вирусов на сеточках, смывание вирусов, низкие пределы обнаружения, а также невозможность определения нетипичных вирусных частиц (Нага et al., 1991; Hennes, Suttle, 1995; Weinbauer, Suttle, 1997; Bettarel et al., 2000). Для эпифлуоресцентной

микроскопии и поточной цитометрии одной из проблем является то, что ряд светящихся точек может быть молекулой ДНК, связанной с коллоидами, а не вирусом. Помимо этого сложно отличить крупные вирусы от бактерий. Хотя это и указывалось как проблема прямого подсчёта вирусов (Sommaruga et al., 1995), но если учитывать, что вирусов примерно в 10 раз больше бактерий, и только 10% из них достигают размеров бактерии (что, скорее всего, является преувеличением), то эта потенциальная ошибка измерения скорее является проблемой в оценке численности бактериопланктона, а не бактериофагов (Peduzzi, 2009).

В водной среде методом ТЭМ можно обнаружить различные вирусы, имеющие полигональные головки диаметром 20-160 нм, многие из которых имеют хвостовые отростки длиной 30-160 нм (сем. Myoviridae, Siphoviridae и Podoviridae). Необычно большие вирусоподобные частицы с диаметром капсида 340-400 нм были обнаружены в прибрежных водах Норвегии и Дании (Bratbak et al., 1992). Другие вирусы имеют нитевидную форму (семейство Inoviridae) и представляют собой гибкий стержень, содержащий одноцепочечную ДНК. В некоторых озерах в больших количествах встречаются крупные, нитчатые вирусы, длиной от 460 до 730 нм, паразитирующие на нитчатых гетеротрофных бактериях (Hofer, Sommaruga, 2001).

Численность свободных планктонных вирусов, определяемая с помощью эпифлуоресцентной микроскопии, в различных пресноводных экосистемах колеблется в очень широком диапазоне - от 0.02 х 106 ч./мл в олиготрофном (Hofer, Sommaruga, 2001) до 379 х 106 ч./мл в гипертрофном озере (Wilhelm, Smith, 2000) (табл. 1.1). В пресных водах соотношение вирус/бактерия (VBR) варьирует от 0.03 до 41 (в озерах Антарктики до 141), но, обычно, величина VBR находится в пределах 3-10 (Wommack, Colwell, 2000). В пресноводных экосистемах отношение вирус/бактерия, как правило, выше, чем в морских (Marager, Bird, 1995). Взаимозависимость между обилием бактерий и вирусов в водоёмах очевидна и подтверждается многочисленными сообщениями, однако причинно-следственные механизмы ещё до конца не изучены (Wommack, Colwel, 2000; Danovaro, 2003).

В водных экосистемах разного типа численность и активность вириопланктона регулируется многими биотическими и абиотическими факторами: концентрацией кислорода, уровнем трофии, температурой, светом (особенно ультрафиолетовой частью спектра), содержанием взвешенных органических веществ, концентрацией гуминовых соединений, структурой и

продукцией бактериопланктона, активностью бактериотро