Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Симбиотические связи микроорганизмов в планктонных сообществах соленых водоемов

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Симбиотические связи микроорганизмов в планктонных сообществах соленых водоемов"

На правах рукописи

Селиванова Елена Александровна

СИМБИОТИЧЕСКИЕ СВЯЗИ МИКРООРГАНИЗМОВ В ПЛАНКТОННЫХ СООБЩЕСТВАХ СОЛЕНЫХ ВОДОЕМОВ

03 00 07 - "Микробиология"

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

оозое1500

Оренбург-2007

003061500

Работа выполнена в Институте клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения Российской академии наук

Научный руководитель:

доктор медицинских наук,

профессор Немцева Наталия Вячеславовна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук,

профессор Усвяцов Борис Яковлевич

кандидат медицинских наук,

доцент Валышев Александр Владимирович

Ведущая организация

Челябинская государственная медицинская академия

Защита состоится » C-fct-^faf 2007 года в^^часов на заседании диссертационного совета Д 208 066 03 при Оренбургской государственной медицинской академии (460000, г Оренбург, ул Советская, 6 Тел (3532) 77-5995, факс (3532)77-24-59, e-mail- orgma@esoo ru)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Оренбургской государственной медицинской академии

Автореферат разослан « "/¿>у> г

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор лУ. НемцеваНВ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы Водоемы с повышенной соленостью широко распространены по всему земному шару и в силу своих лечебных свойств широко используются в мировой курортологии (Wilhams W D, 1981) Гиперосмотическая среда является ведущим фактором формирования специфического биоценоза, структура которого значительно отличается от пресноводной биоты (Borowitzka L J , 1981, Ventosa A et al, 1999) Микроорганизмы, населяющие соленые водоемы активно изучаются и описаны в ряде работ (Кашнер Д, 1981, Звягинцева ИС, 1989, Зотина Т А , 2000, Bnsou J , Courtois D , Denis F , 1974, Post F J , 1981, Oren A , 1999, Ventosa A , Arahal D R, 1999, Timms V , 2007) На территории Оренбургской области находится группа соленых озер, являющихся базой для Соль-Илецкого грязе-рапного курорта Хорошо изучены температурный режим, химический состав этих озер, описаны основные представители бактериопланктона озера Развал (Абдрахманов А Р, 2001), водорослей и простейших Соль-Илецких озер (Блюмина Л С, 1958, Шабанов С В , 2001, Плотников А О , 2002), однако комплексную оценку структуры планктонных биоценозов этих водоемов не проводили

Водные микроорганизмы взаимодействуют между собой, формируя тесное сообщество за счет биотических связей, прежде всего трофических (Горленко В M, Дубинина Г А , Кузнецов С И , 1977) Подобные взаимоотношения в экстремальных условиях приобретают особое значение, так как необходимы для выживания микробиоценоза (Дубинин AB и др, 1992) Поэтому представляет интерес оценка численности отдельных эко-лого-трофических групп микроорганизмов, а также интенсивности процессов продукции и деструкции как интегральных параметров трофических взаимодействий в планктонных сообществах соленых озер

Наряду с трофическими связями ранее была показана роль биологических свойств гидробионтов в симбиотических взаимодействиях «лизо-цим - антилизоцим», «гистон - антигистон» (Бухарин OB и др, 2002, 2003) Однако роль этих свойств в симбиотических взаимодействиях микроорганизмов в гипергалинных экосистемах остается неясной

Открытым остается вопрос о самоочищении гипергалинных водоемов Известно, что высокая концентрация соли в воде способствует гибели или значительному замедлению роста бактерий, на чем основаны представления ряда исследователей о способности гиперсоленых водоемов к самоочищению (Бояндин АН и др , 2000) Ранее были определены сроки освобождения озера Развал от энтеробактериального загрязнения (Абдрахманов А Р , 2001) Однако сведения об участии аутохтонных микроорганизмов в этом процессе отсутствуют

Все вышеизложенное определило цель и задачи данного исследования

Цель работы. Оценить роль трофических и симбиотических взаимодействий в выживании аутохтонной и аллохтонной микрофлоры в планктонных биоценозах соленых водоемов (на примере Соль-Илецких озер)

Основные задачи:

1 Охарактеризовать структуру планктонных микробиоценозов соленых озер с разной степенью минерализации

2 Выделить эколого-трофические группы в водоемах с различной соленостью На основании показателей продукции и деструкции органического вещества оценить трофические связи в микробиоценозе

3 Оценить экспрессивность и пенетрантность ряда биологических свойств (антилизоцимной, лизоцимной, антигистоновой, антагонистической активности) доминирующих таксонов гидробионтов

4 В эксперименте оценить роль некоторых биологических свойств в процессах выживания аутохтонной и аллохтонной микрофлоры в планктонных сообществах гипергалинных водоемов

Основные положения, выносимые на защиту:

1 Структура микробиоценозов соленых водоемов, характер трофических и симбиотических взаимодействий микроорганизмов зависят от уровня минерализации

2 Исход симбиотических взаимодействий автохтонных и аллохтон-ных микроорганизмов определяется соотношением протективного и антагонистического эффектов, регулирующих выживание бактерий в гипергалинных водоемах и обуславливающих сроки их самоочищения

Научная новизна. На основании комплексной характеристики планктонных сообществ соленых озер (Соль-Илецк, Оренбургская область) установлена зависимость структуры микробиоценозов от уровня минерализации и трофического статуса водоема Определены доминирующие виды планктонных бактерий, водорослей, простейших, характерные для соленых водоемов Малое Городское, Дунино, Развал В трофической цепи гипергалинного озера Развал наряду с продуцентами и редуцентами, впервые выделено звено консументов, представленных гетеротрофными жгутиконосцами Жгутиковые простейшие Pleurostomum salinum Namyslowski, 1913, «Macropharyngomonas äff halophila», Halocafeteria sp обнаружены впервые на территории России

Определен трофический статус Соль-Илецких водоемов, продуктивность которых по мере увеличения солености снижается

У галофильных и галотолерантных микроорганизмов выявлены биологические свойства (антилизоцимная, антигистоновая активности) Экспрессивность и пенетрантность этих признаков различается у бактерий в зависимости от потребности в органическом веществе, галотолерантности и уровня минерализации водоема В формировании гетерогенности популяции бактерий по персистентным свойствам принимают участие про-

стейшие, роль которых усиливается по мере уменьшения солености У планктонных простейших в гипергалинных водоемах установлено наличие лизоцима и гистонов, а у бактериий - антилизоцимной и антигистоновой активности, являющихся компонентами функциональных систем «лизо-цим-антилизоцим», «гистон-антигистон», участвующих в формировании микробиоценозов

Выявлены разнонаправленные эффекты автохтонных водорослей, гетеротрофных жгутиконосцев и бактерий на выживание аллохтонной микрофлоры в гиперосмотических условиях

Разработан способ выделения и культивирования галофильных и га-лотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев (заявка № 2006143505/13 ФИПС РФ, Бюл № 9 27 03 2007)

Теоретическая и практическая значимость

Получены новые сведения, имеющие теоретическое значение для расшифровки симбиотических взаимоотношений микроорганизмов в планктонных сообществах при экстремальных условиях повышенной солености Новые данные о составе гетеротрофных жгутиконосцев, являющихся единственными консументами в водоемах с экстремальной соленостью, дополняют современные представления об эколого-биологических особенностях этой группы микроорганизмов

Результаты экспериментальных и натурных исследований, свидетельствующие о влиянии автохтонных микроорганизмов на выживание ал-лохтонных бактерий, необходимо учитывать при оценке санитарно-экологического состояния соленых водоемов и планировании природоохранных и противоэпидемических мероприятий

Разработанный способ выделения и культивирования галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев апробирован и внедрен в работу лаборатории природных микробиоценозов Института клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН (Акт внедрения № 16379-2114-65 от 12 04 2007) для выделения галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев из водоемов с различной минерализацией и для культивирования протестов

Выделенные чистые культуры галофильной водоросли Dunaliella salina и гетеротрофных жгутиконосцев включены в коллекцию культур ИКВС УрО РАН как перспективные источники биологически активных веществ (Акт внедрения № 16379-2114-66 от 12 04 2007)

Апробация работы

Основные результаты исследования доложены и обсуждены на конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2004), международной конференции «Природное наследие России изучение, мониторинг, охрана» (Тольятти, 2004), научных конференциях с международным участием «Водные экосистемы и организмы-6» и «Водные экоси-

стемы и организмы-8» (Москва, 2004, 2006), всероссийской конференции молодых ученых «Экология от генов до экосистем» (Екатеринбург, 2005),

V Российской конференции «Персистенция микроорганизмов» (Оренбург, 2006), IX съезде Гидробиологического общества РАН (Тольятти, 2006), III межрегиональной конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 2006),

V European Congress of Protistology (Санкт-Петербург, 2007)

Публикации

По теме диссертации опубликовано 14 научных работ, в том числе 2 работы - в изданиях, рекомендованных ВАК, заявка на изобретение «Способ выделения и культивирования галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев» (заявка № 2006143505/13 ФИПС РФ, Бюл №9 27 03 2007)

Объем и структура диссертационной работы

Диссертация изложена на 186 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, главу по материалам и методам исследования, четыре главы собственных исследований, заключение, выводы, приложения Библиографический указатель содержит 199 источников литературы, из которых 102 отечественных и 97 иностранных Текст иллюстрирован 16 таблицами и 60 рисунками, включая оригинальные микрофотографии и электронограммы

Связь работы с научными программами

Диссертационное исследование является фрагментом работы, проводимой в рамках научно-исследовательской темы открытого плана НИР ИКиВС УрО РАН «Механизмы взаимодействий симбионтов в природных ассоциациях водных микроорганизмов» (№ гос регистрации 01 20 02 16537), программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Научные основы сохранения биоразнообразия России» (проект № БР-9-040), гранта РФФИ «Технология получения из гиперсоленых Соль-Илецких озер (Оренбургская область) культуры и наращивания биомассы водоросли Dunaliella salina» (№ 06-04-96920-р_офи)

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объект и методы исследования. Материалом для работы послужили микроорганизмы - бактерии, водоросли и простейшие, выделенные из соленых озер Соль-Илецкого района Оренбургской области, а также коллекционные штаммы, культивируемые in vitro в лаборатории природных микробиоценозов УрО РАН Отбор планктонных проб воды осуществляли в течение 2004 - 2006 гг ежеквартально в соответствии с общепринятыми методами (СЭВ, 1977) Всего было исследовано 56 проб воды За время исследования было выделено 300 штаммов бактерий, 20 культур водорослей

и 50 культур простейших

Из 6 открытых стоячих соленых водоемов, располагающихся в районе г Соль-Илецка Оренбургской области, подробно были исследованы три озера Развал, Дунино, Малое Городское, а также часть работ была выполнена на грязе-рапном озере Тузлучное Выбранные озера расположены в одинаковых географических условиях и различаются по уровню минерализации, средний уровень которой составил в оз Развал - 290,9 г/л, в оз Дунино -109,9 г/л, в оз Малое Городское -17,5 г/л

Альгологические пробы обрабатывали общепринятым методом (Методика изучения биогеоценозов внутренних водоемов, 1975) Идентификацию водорослей проводили по морфологическим признакам в соответствии с определителями серии «Определитель пресноводных водорослей СССР» Т I-XIV (1951-1986), а также Масюк НП (1973), Царенко ПМ (1990), Komarek J, Anagnostidis К (1999) Численность водорослей определяли в фиксированных формалином и концентрированных седиментаци-онным способом пробах прямым счетом в камере Нажотта с использованием микроскопа Axiostar Plus (Carl Zeiss) Доминирование водорослей оценивали по индексу Палия-Ковнацки (Шитиков В К и др, 2003)

Пробы протистопланктона обрабатывали в соответствии со стандартными методами (Vers N, 1992) Идентификацию простейших различных классов проводили до вида и в некоторых случаях до рода по морфологическим критериям с использованием соответствующих работ (Жуков БФ, 1993, Larsen J, Patterson DJ, 1990, Vors N, 1992, Patterson DJ, Simpson AGB, 1996) Выборочную фоторегистрацию осуществляли с помощью фотокамеры Canon Power Shot G5 У простейших оценивали показатель встречаемости (Н Г Косолапова, 2005) Подсчет численности и идентификацию многоклеточного зоопланктона проводили совместно с к б н Т Г Стойко, к б н Ю А Мазеем (Пензенский государственный педагогический университет им В Г Белинского)

Чистые культуры бактерий получали бактериологическим методом с использованием соответствующих питательных сред Идентификацию проводили по морфологическим, культуральным и биохимическим свойствам, руководствуясь определителем бактерий Берджи (1997) Для выделения денитрификаторов применяли среду Гильтая, нитрификаторов - среду Виноградского, целлюлозоразрушающих бактерий - среду Гетчинсона, тиобактерий - среду Бейеринка, для сульфатредукторов - среду Боарса (Кузнецов СИ, Дубинина ГА, 1989) Количественный учет проводили методом десятикратных разведений с использованием для пересчета таблиц Мак-Креди (Герхардт Ф и др, 1983)

Продукцию и деструкцию органического вещества определяли методом Винберга (Методика изучения биогеоценозов внутренних водоемов, 1975, Бульон В В , 1983) Содержание кислорода измеряли по методу Винклера (Кузнецов С И , Дубинина Г А , 1989)

Антилизоцимную и лизоцимную активность микроорганизмов

оценивали чашечным и фотометрическим методами (Бухарин О В , 1999) Содержание гистонов в клетках простейших определяли цитохимически по Олферту-Гешвинду в модификации Эренпрейса Я Г (1965) с использованием красителя амидо черного 10 Б

Антигистоновую и антагонистическую активность экстрактов исследуемых микроорганизмов определяли фотометрическим методом (Бухарин О В и др , 2000, 2003) Антиоксидантную активность клеточного экстракта водоросли ОипаИеНа Бакпа определяли хемилюминесцентным методом (Владимиров ЮА, Лопухин ЮМ, 1982, Фахрутдинов РР, 2002) на кафедре фармацевтической и общей химии Оренбургской государственной медицинской академии (зав кафедрой д м н , профессор Красиков СИ)

Условно-патогенных бактерий сокультивировали с галофильными микроорганизмами во флаконах при температуре 25 С и 37°С В качестве питательных сред использовали разведенную и неразведенную безбактериальную рапу озера Развал (минерализация 300 г/л), а также питательную среду для водорослей Веп-Ато& Изменение количества бактерий в процессе сокультивирования учитывали по числу выросших колоний на соответствующих твердых средах Динамику численности простейших определяли прямым счетом в камере Нажотга

Результаты исследования Комплексное исследование структуры сообществ в зависимости от солености водоема позволило получить фоновые данные по таксономическому составу, видовому богатству, а также доминирующим формам гидробионтов

Таксономическая и трофическая структура микробиоценозов соленых водоемов

Опираясь на известную модель трофических взаимодействий в биоценозе (Одум Ю , 1986), включающую продуцентов, консументов и редуцентов, была оценена структура каждого звена, формирующего пищевую цепь

В составе альгопланктона озера Развал было обнаружено 3 вида водорослей - представителей отделов СЫогорЬу1а и Вас111апорЬу1а, в озере Дунино - 14 видов, принадлежащих 3 отделам СЫогорЬу1а, СуапорИу1а и Вас111апорЬу1а В озере Малое Городское обнаружено 42 вида водорослей, относящихся к 7 отделам Здесь наряду с увеличением видового богатства СИ1огорИу1а, СуапорЬу1а и Вас111апорЬу1а, в структуре альгопланктона появились еще и Еи§1епорЬу1а, БторЬ^а, СгурШрЬ^а и СЬгуБорЬ^а (рис 1)

45 40

ш 35

0

? 30 m

2 25

Ш

1 20 7

О

15

10 5 0

Рис. 1 -

емОв

ЁЭ ш

вд $ 1 у

ÍÉÍ

§ш

в i

□ Chrysophyta ■ Cryptophyta В Euglenophyta HDinophyta

ЕЭ Bacillariophyta SChlorophyta

□ Cyanophyta

Развал Дунино Малое (290,9 г/л) (109,9 г/л) Городское

(17,5 г/л)

Таксономическая структура альгопланктона СолЪ'Ипецких водо-

Таким образом, таксономическая структура альгопланктона тто мере снижения солености озер усложняется, а видовое богатство водорослей возрастает в ряду озер Развал > Дунино > Малое Городское, что отражает лимитирующее влияние солености и согласуется с результатами исследований других авторов (Шабанов С,В., 2001; Горбулин О.С, и др., 2003; Borowitzka L.J., 1981). Каждое озеро характеризовалось специфическим составом доминирующих видок водорослей, определяющих уникальность сообществ исследуемых экосистем: Развал - Dunaliella salina и Dimaliella viridis, Дун ff но - DunaJ/eJia Viridis, M ai ос Городское - Oscilatoria suhtilissima, Prorocentiim sp,, Cartería salina. Отмечено, что если структура альгоценоза в гипергалинных озерах была относительно стабильной, то в озере Малое Городское доминирующие комплексы изменялись в течение года.

Структура звена консументов, представленных зоопланктоном, также зависела от уровня солености. Подобная зависимость подтверждена рядом исследователей (Локоть Л.И., 1996; Timms B.V., 1993, 2007). В гипер-галинном озере Развал зоопланктон был представлен только гетеротрофными жгутиконосцами, которые здесь выявлены впервые. С понижением минерализации в биоценозе озера Дунино появлялись также амебы, инфузории, рачки-жаброноги и веслоногие рачки. В солоноватом озере Малое Городское структура зоопланктона была максимально разнообразна: зоо-флагеллягы, амебы, инфузории, иептрохелшные солнечники, коловратки, веслоногие и ветвистоусые рачки (рис, 2),

Развал Дунино Малое (290,9 г/л) (109,9 г/л) Городское (17,5 г/л)

Рис. 2 —Таксономическая структура зоопланктона Соль-Илецких водоемов

Гетеротрофные жгутиконосцы в солоноватых и соленых водоемах характеризовались максимальным разнообразием и распространением, что объясняется широкой экологической валентностью этих организмов (Жуков Б.Ф., 1993; Тихонепков Д.В., 2006; Vors К, 1992; Arndt Н. et а),, 2000). 37 видов гетеротрофных флагеллят обнаружено в озере Малое Городское, 19 видов - в Дунино и 5 видов - в Развале. Каждое озеро отличалось специфическим составом постоянно встречающихся, добавочных и редких видов жгутиконосцев. Постоянно встречающимися оказались виды-космополиты, характерные для морских экосистем: для озера Дунино -Cafeteria roenbergensis и Monosiga ovata, для озера Малое Городское - Bodo designis и Cafeteria roenbergensis.

При изучении видовой структуры зоопланктона в озере Развал обнаружены новые для территории России гетеротрофные жгутиконосцы: vMacropharyngomoniu aff, halophila», Plettrostomum salinum Namyslowski, 1913, Halocafeteria sp. (рис. 3).

И многоклеточный

зоопланктон ■ солнечники

ЕЭ амебы

^инфузории

□ гетеротрофные жгутиконосцы

Рис, 3 - « Macrophatyngomonas aff. halophila» (слева), Plettrostomum salinüm Namyslowski, 1913 (в центре), Halocafeteria sp. (справа)

Обнаружение гетеротрофных жгутиконосцев в озере Развал и выделение их чистых культур, а также расширение видового списка протестов в озерах Дунино и Малое Городское, по сравнению с предыдущими исследованиями (Плотников, 2002), стало возможным благодаря разработке нового метода «Способ выделения и культивирования галофильных и гало-толерантных гетеротрофных жгутиконосцев», заключающегося в использовании жидкой питательной среды для предварительного наращивания биомассы жгутиковых Предложенный метод позволил сократить сроки выделения простейших из водоемов с различной минерализацией, повысить эффективность оценки их биоразнообразия, сократить трудоемкость при выделении чистых культур простейших

В структуре бактериопланктона, представляющего трофическое звено редуцентов, в озере Развал преобладали экстремально галофильные бактерии, относящиеся к домену Archaea, меньшую часть составляли умеренно галофильные и галотолерантные бактерии, являющиеся представителями домена Bacteria Тогда как в озере Дунино по численности доминировали умеренно галофильные и галотолерантные бактерии, а в озере Малое Городское - негалофильные бактерии Обнаружение в озеро Развал при минерализации воды свыше 250 г/л экстремально галофильных архей, составляющих значительную часть бактериопланктона, согласуется с данными, полученными для других гипергалинных водоемов (Мертвое море) (Цит по Leuko S , 2007) Доля эвтрофных негалофильных бактерий (в том числе и санитарно-показательных) нарастала по мере уменьшения солености по сравнению с олиготрофными, увеличивался индекс трофности и ухудшалось санитарно-эпидемиологическое состояние водоема (табл 1)

Таблица 1. Некоторые санитарно-микробиологические показатели Соль-Илецких озер (июль 2006)____

—Озера Микробиологй=-—______ ческие параметры --- Развал Дунино Малое Городское

Индекс трофности (эвтрофные / олиготрофные бактерии) 0,11±0,0006 0,32±0,016 2,11±0,11

Колиформные бактерии (в 100 мл воды) 0 200±10 2700±100

Общая численность жизнеспособных бактерий (КОЕ/мл) 2060±103 5980±299 11250±563

Гетеротрофные мезофильные аэробные и факультативно анаэробные бактерии, образующие колонии на МПА (эвтрфные) (КОЕ/мл) 170±8,5 790±39,5 5600±280

Для комплексной оценки трофических функций бактериопланктона была определена численность основных функциональных (эколого-

трофических) групп бактерий, обеспечивающих минерализацию органического вещества (рис. 4).

4.00

хЯ

ÖF

у

Рис. 4 - Численность эколого-трофических групп бактерий в водоемах с различной соленостью

Ш - оз. Развал (290,9 г/л) □ - оз. Дунино {109,9 г/л) □ - оз. Малое Городское (1 7,5 г/л)

Присутствие основных функциональных групп бактерий, осуществляющих круговорот азота, серы и углерода, было выявлено во всех трех исследованных Соль-Илецких водоемах, что согласуется с данными других исследователей (Кузнецов С.И., 1970; Горленко В.М. и др., 1977). При этом численность бактериопланктона во всех функциональных группах находилась в обратной зависимости от уровня солености воды в водоеме.

Таким образом, несмотря на ограниченный спектр гидробионтов, планктонные биоценозы Соль-ИлецкиХ водоемов представляют собой полноценные сообщества, в которых присутствуют продуценты органического вещества, консументы, а также деструкторы, осуществляющие непрерывный круговорот биогенных элементов, В трофической цепи соленых озер численность бактерий И водорослей ограничивают консументы, представленные в водоеме с экстремальной соленостью (оз. Развал) только гетеротрофными жгутиконосцами С. roenbergensis, С. marsupialis, «М. äff. Iialophila», Р, salinum, Halocafeteria sp. В эксперименте показано, что интенсивность «выедания» бактерий зависит от экологической стратегии вида простейших. В присутствии r-стратега «М. äff. baluphila», дающего быструю вспышку роста с последующим быстрым исчезновением, поглощение бактерий происходило интенсивнее, чем а присутствии медленно размножающегося K-стратега Р. salinum (рис. 5).

3£ Сутки

Рис. 5 - Динамика численности Е. coli в рапе в присутствии простейших в присутствии «Мaeropharyngomonas äff. halophila» в присутствии Pleurostomum salin um контроль без простейших

Трофические взаимодействия, интенсивность обменных процессов определяют величину первичной продукции, являющейся интегральной характеристикой интенсивности фотосинтеза (Винберг Г.Г., 1960). В соответствии с этим показателем изученным озерам присвоен трофический статус: Малое Городское - эвтрофное, Дунино - мезотрофное с признаками эвтрофии, Развал — мезотрофное озеро (рис. 6).

í ...........I................................................................................................................ I

gl

-

рЬ

ППлУ i —

Малое Городское Дунино (109,9 г/л) Развал (290,9 г/л) (17,5 г/л) озера

(соленость)

Рис. 6 - Пространственная скорость продукции и деструкции в Соль-Илецких водоемах □ - Суточная продукция П - Суточная деструкция

В озере Малое Городское отмечено значительное превышение скорости деструкционных процессов над продукционными (рис 6), что свидетельствует о неблагоприятной санитарно-экологической обстановке и согласуется с другими признаками антропогенного загрязнения этого водоема (табл 1)

Таким образом, планктонные сообщества микроорганизмов соленых водоемов формируют многоуровневую систему трофических взаимодействий, которая обеспечивает высокую интенсивность продукции и деструкции органического вещества, способствуя самоочищению водоема

Характеристика симбиотических взаимодействий микроорганизмов

На следующем этапе работы мы оценили биологические свойства микроорганизмов, выделенных из Соль-Илецких озер, которые, как было показано для пресных водоемов, участвуют в формировании симбиотических взаимодействий в биоценозах (Бухарин OB и др , 2002, 2003) У простейших в качестве подобных факторов рассматриваются катионные белки - лизоцим и гистоны, а у бактерий - антигистоновая и антилизоцимная активности

У инфузорий Diophrys sp и Cladotricha sp содержание лизоцима составило 0,015х10"3 мкг/кл и 1,36x10° мкг/кл, соответственно У гетеротрофного жгутиконосца «М äff halophila» лизоцимная активность регистрировалась на уровне 0,009х10"3 мкг/кл Полученные значения сопоставимы с уровнем лизоцима в клетках пресноводных простейших (Немцева, 1998, Плотников, 2002) и согласуются с представлением о них как о фаго-цитарноактивных организмах

У галофильных инфузорий Diophrys sp и гетеротрофного жгутикового «М äff halophila» цитохимическим методом выявлены ядерные гистоны, что объединяет их с другими группами эукариотических микроорганизмов, у которых наличие гистонов было показано ранее (Зайцева Г Н, Шанина Н А , 1976, Shen X et al, 1996)

Установлено, что распространенность антилизоцимной активности у бактерий, выделенных из Соль-Илецких озер, составляет 42,3%, а ее средняя выраженность - 3,4±0,3 мкг/мл Антигистоновой активностью обладали 49,3 % исследуемых изолятов Значения антигистоновой активности колебались в диапазоне 1,3-12,8 мкг/мл и составили в среднем 9,1±4,9 мкг/мл

Показано, что выраженность антилизоцимной и антигистоновой активности бактерий различается в зависимости от их гапотолерантности Средние значения антилизоцимной активности умеренных галофилов оказались достоверно ниже, чем у культур, не нуждающихся для своего роста в присутствии NaCl (соответственно 2,3±0,6 мкг/мл и 3,6±0,3 мкг/мл при р<0,01) Антигистоновая активность среди галофилов встречалась реже (40%) и характеризовалась более низкими средними значениями (7,6±5,1 мкг/мл) по сравнению с негалофилами, у которых распространенность

признака составила 66,4%, а средняя выраженность - 10,7±4,8 мкг/мл (р<0,05). Вероятно, наблюдаемые различия связаны с присутствием среди негалофильных микроорганизмов аллохтонных бактерий организменного происхождения с более высоким персистентным потенциалом.

В различающихся по минерализации водоемах с понижением солености воды увеличивалась встречаемость штаммов бактерий, обладающих антилизоцимной активностью и антигистоновой активностью (рис. 7). Полученные результаты, вероятно, объясняются ростом численности и биомассы гидробионтов, продуцирующих лизоцим, в биоценозах водоемов с меньшей соленостью, где создаются условия для преимущественного выживания антилизоцимактивных бактерий.

90

80

_70

„60

а

| 50

¡30 S20 10 0

Рис. 7-

ностей

62.4%

62,2%

43 В%

-— 32,1% + 35,7% -

1 1

_

соленость (г/л) ■ 220-350

□ 40-170

□ 2-17

* р < 0,01 + р < 0,05

АЛА АГА

Распространенность антжизоцимной и антигистоновой актив-бактерий в водоемах с различной соленостью

Для оценки роли персистентных свойств микроорганизмов в условиях повышенной солености было проведено лабораторное со культивирование двух штаммов Е. coli, отличающихся уровнем антилизоцимной активности: 2 мкг/мл (штамм № 1) и 4 мкг/мл (штамм № 2), с представителями галофильных простейших: инфузориями Diophrys sp. и гетеротрофными жгутиконосцами «М. äff. halophila» в стерильной рапе с соленостью 7,5%.

Установлено, что в опытных пробах, по сравнению с контролем, кривая численности падала быстрее за счет поглощения бактерий простейшими (рис. 8). В присутствии инфузорий численность двух штаммов бактерий с разным уровнем антилизоцимной активности отличалась друг от друга в 1,5 раза к первым суткам. Затем разница нарастала и достигала 2,7 раза на третьи сутки. При сокультивировагши Е. coli с гетеротрофными жгутиконосцами наблюдалась аналогичная тенденция, однако разница в численности бактерий проявлялась позже (на 5-е сутки) и была менее выраженной, чем при сокультивировании с инфузориями (рис. 8), Данный факт можно объяснить меньшей фагоцитарной активностью жгутиконос-

цев по сравнению с инфузориями, с одной стороны, а с другой - более низкими значениями их лизоцимной активности Полученные данные свидетельствуют о более интенсивном «выедании» простейшими бактерий с низкой антилизоцимной активностью, по сравнению с «высокоактивным» штаммом

1000000

Рис. 8 - Динамика численности Е coli в зависимости от уровня АЛА при сокультивировании с простейшими в условиях повышенной солености

^ Е. coli штамм № 1 (АЛА 2 мкг/мл) ® Е coli штамм № 2 (АЛА 4 мкг/мл) - в присутствии инфузорий Diophrys sp в присутствии жгутиконосцев «М äff halophila» контроль без простейших

Оценка гетерогенности популяции кишечной палочки по антилизо-цимному признаку в процессе сокультивирования показала преимущественную элиминацию из обеих популяций Е coli клонов с низкой антилизоцимной активностью (1-2 мкг/мл) и повышение доли клонов со средней антилизоцимной активностью (3-4 мкг/мл) В результате средние значения антилизоцимной активности в популяциях обоих штаммов сравнялись на уровне 4 мкг/мл

Полученные данные позволили предположить, что в формировании гетерогенности популяции бактерий по персистентным свойствам принимает участие биотический компонент среды (простейшие), роль которого усиливается по мере уменьшения солености

Наличие лизоцима и гистонов у галофильных простейших, а также антилизоцимной и антигистоновой активностей у бактерий свидетельству-

ет о возможном существовании функциональных систем «лизоцим-антилизоцим», «гистон-антигистон» в галофильных сообществах, аналогично пресноводным экосистемам (Бухарин OB и др , 2002, 2003)

В результате экспериментального исследования процессов самоочищения рапы от условно-патогенных бактерий установлено, что галофиль-ные автохтонные микроорганизмы по-разному влияют на сроки сохранения аллохтонных бактерий

Так, по результатам сокультивирования энтеробактерий с галофиль-ной водорослью D salina было показано, что выживаемость Е coli возрастает в присутствии живой культуры галофильной водоросли D salina почти в два раза по сравнению с контролем (рис 8)

В отличие от живых клеток водоросли экстракт клеток D salina оказывал противоположный эффект на Е coli, укорачивая сроки ее выживания и способствуя более быстрой элиминации (рис 8) Аналогичный эффект клеточного экстракта D salina по отношению к Е coli был выявлен и фотометрически Антагонистическая активность клеточного экстракта D salina закономерна, так как антибактериальные свойства метаболитов зеленых водорослей, в т ч Dunaliella и Haematococcus, известны (Гольдин Е Б, Гольдина В Г , 1999) и, по-видимому, связаны с бактерицидным действием белково-хлорофилльного комплекса (Максимова ИВ и др, 1986, Воль-бергММ, 1988)

Рис. 8 - Динамика численности Е coli при сокулътивировании с галофильной водорослью D salina в среде Ben-Amotz

--Е coli в присутствии живых клеток D salina

---- Е coli в присутствии экстракта клеток D salina

_ контроль без водорослей (среда Ben-Amotz)

Аналогично гапофильным водорослям при экспериментальном со-

культивировании живые умеренно-галофильные бактерии Halovibrio variabilis и Halomonas elongata и экстремально галофильные археи Halobactenum sp и Halococcus sp способствовали удлинению сроков выживания Е coli в рапе в 1,5 - 2 раза по сравнению с контролем

Наблюдаемый протективный эффект по отношению к энтеробакте-риям со стороны живых клеток галофилов, вероятно, связан со способностью галофильных и негалофильных бактерий к обмену осмопротектора-ми Возможность подобного обмена, обеспечивается выделением галофи-лами растворимых метаболитов в среду и способностью многих бактерий, в том числе и негалофильных, получать осмопротекторы извне (Vermeulen V et al, 2004, González-Hernández J С , 2005) В результате микроорганизмы, не имеющие достаточно эффективных собственных клеточных механизмов осморегуляции, выживают в гиперосмотических условиях, что продемонстрировано ранее Jebbar et al (1992) на модели энтеробактерий с осмопротектором эктоином

Таким образом, полученные данные находят объяснение в контексте возможного обмена осмопротекторами и демонстрируют протективное влияние живых галофильных микроорганизмов на выживание условно-патогенных бактерий в рапе

Аналогично описанному выше характеру действия веществ, выделяющихся из клеток водоросли D salina при разрушении, широкая распространенность антагонистической активности по отношению к условно-патогенным бактериям была обнаружена у клеточных экстрактов представителей разных групп галофильных микроорганизмов умеренно галофильных эубактерий, экстремально галофильных архей, водорослей и гетеротрофных жгутиконосцев (табл 2)

Таблица 2. Антагонистическое действие клеточных экстрактов гало-фильных микроорганизмов на условно-патогенные бактерии_

\ Тест-штаммы Снижение интенсивности роста тест-штамма по сравнению с контролем (% 00)

Галофильныеч микроорганизмы\ Е coli К pneumoniae Р aeruginosa S aureus Enterococcus sp 1

Н variabilis 25 13 0 0 26

Н elongata 10 0 0 11 19

Halobactenum sp 29 10 0 8 0

Halococcus sp 0 17 0 16 11

D salina 60 0 15 0 0

«M äff halophila» 68 46 0 24 49

По сравнению с другими галофильными микроорганизмами экстракт клеток гетеротрофного жгутиконосца «М. aff halophila» обладал наиболее выраженным антагонистическим действием по отношению к условно-патогенным бактериям Биологически активные вещества у жгутиконосцев обнаруживали ранее, например, из Trypanosoma cruzi Chagas, 1909 бьш выделен круцин (Калинникова В Д, 2004) Однако наличие антагонистической активности у клеточного экстракта гетеротрофного жгутиконосца «М aff halophila» зарегистрировано впервые, что требует более тщательного изучения этой группы микроорганизмов в качестве источника биологически активных веществ, перспективных для применения в медицине

Учитывая, что в условиях борьбы за экологическую нишу на одну из ведущих позиций выходит антагонизм, обеспечивающий доминирование конкурентоспособных видов в сообществе, можно заключить, что вещества, выделяющиеся из разрушенных клеток автохтонных бактерий и водорослей, обеспечивают резистентность биотопа к заселению аллохтонными микроорганизмами и стабильность структуры биоценоза Скорость элиминации аллохтонных микроорганизмов может значительно ускоряться при массовом отмирании галофильных микроорганизмов, что, наряду с трофической деятельностью консументов, может рассматриваться в качестве механизма самоочищения водоема

Таким образом, симбиотические взаимодействия автохтонных и аллохтонных микроорганизмов, определяемые соотношением протективного и антагонистического эффектов, регулируют выживание микроорганизмов в гипергалинных водоемах и обуславливают сроки их самоочищения Это необходимо учитывать при определении санитарных показателей соленых водоемов, оценке их загрязненности и эпидемиологической безопасности, а также в процессе планирования природоохранных и санитарно-противоэпидемических мероприятий

Другим практическим аспектом работы является возможность использования водорослей рода Dunahella как источника для получения биологически активных веществ с антиоксидантным действием (Borowitzka L J , 1981, Moulton Т Р, Burford М А , 1990, Ben-Amotz А , 1999). Из озера Развал выделена чистая культура Dunahella salina (штамм Р5), у которой наряду с антагонистической активностью выявлена антиоксидантная активность, сопоставимая по силе действия с известными антиоксидантными препаратами (биоастин, ретинол) Добавление клеточного экстракта D salina к стандартной хемилюминесцентной системе приводило к снижению всех основных параметров хемилюминесценции модельной системы, отражающих интенсивность процессов перикисного окисления липидов Эффект тушения процессов свободнорадикального окисления клеточным экстрактом D salina составил 75% Антиоксидантная активность, вероятно, связана с высоким содержанием каротиноидов, преимущественно р-каротина, защищающих клетки Dunahella от кислородных радикалов при фотоокислении (Готгшалк Г , 1982)

Оценивая результаты работы в целом, следует подчеркнуть, что трофические взаимодействия в галофильном сообществе формируются в условиях лимитирующего влияния минерализации, которая определяет количество трофических уровней, интенсивность развития функциональных групп бактерий, трофический статус водоемов Симбиотические взаимодействия микроорганизмов в галофильном сообществе, включая связи «ли-зоцим-антилизоцим», «гистон-антигистон», межмикробный антагонизм и обмен осмопротекторами, определяют выживание микроорганизмов в гиперосмотических условиях, сроки самоочищения и санитарное состояние соленых водоемов

ВЫВОДЫ

1 Структура микробиоценоза соленых водоемов определяется уровнем их минерализации Видовое разнообразие снижается по мере нарастания солености, тогда как численность микроорганизмов преимущественно зависит от действия других абиотических и биотических факторов (антропогенная нагрузка, сезонность, уровень трофии, массовое развитие водорослей, зоопланктона и др)

2 Разработан метод выделения и культивирования галофильных жгутиконосцев, основанный на использовании среды оригинального состава Впервые на территории России обнаружены гетеротрофные жгутиконосцы видов Pleurostomum salmum Namyslovski, 1913, «Macropharyngomonas äff halophila», Halocafeteria sp, которые являются единственными консументами в водоеме с экстремальной соленостью (оз Развал с соленостью около 30 %)

3 По мере увеличения солености интенсивность развития отдельных эколого-трофических групп микроорганизмов, количество звеньев в трофической цепи, а также продуктивность водоемов снижается Определен трофический статус Соль-Илецких озер Малое Городское — эвтроф-ное, Дунино - мезотрофное с признаками эвтрофии, озеро Развал — мезо-трофное, что следует учитывать при осуществлении природоохранных и санитарно-противоэпидемических мероприятий

4 Распространенность антилизоцимной и антигистоновой активности у гидробионтов уменьшается по мере нарастания солености водоема Экспрессивность изученных признаков у галофильных бактерий, обитающих в соленых водоемах, в 1,4 - 1,5 раза ниже по сравнению с негалофиль-ными В формировании гетерогенности популяции бактерий по перси-стентным свойствам принимает участие биотический компонент среды (простейшие)

5 Выявленные у протистопланктона лизоцим и гистоны, а у бакте-риопланктона - антилизоцимная и антигистоновая активности следует расценивать как компоненты функциональных систем «лизоцим-антилизоцим», «гистон-антигистон», участвующих в формировании биоценозов в соленых местообитаниях

6 Разнонаправленное действие живых галофильных микроорганизмов и их клеточных экстрактов, выявленное по отношению к условно-патогенным бактериям в рапе, определяет сроки выживания аллохтонной микрофлоры в гиперсоленых водоемах в процессе их самоочищения

7 Получен и поддерживается в аксенической культуре штамм водоросли Dunahella salina Teod , 1905, обладающий антагонистической и ан-тиоксидантной активностью, а также штамм антагонистически активного жгутикового простейшего aMacropharyngomonas äff halophila»

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Абдрахманов А Р Микробиологическая характеристика озера Развал (Соль-Илецк) /АР Абдрахманов, С В Шабанов, А О Плотников, Е.А. Волкова (Селиванова) и др // Тезисы докладов региональной научно-практической конференции молодых ученых и специалистов Оренбуржья. - Оренбург, 2000 -С 129

2 Абдрахманов А Р Санитарно-гигиенические показатели микрофлоры озера Развал /АР Абдрахманов, Е.А. Селиванова, А О Плотников, Н В Немцева // Тезисы докладов всероссийской конференции «Среда обитания и здоровье населения» — Оренбург, 2001 — С 5-6

3 Волкова Е.А. (Селиванова Е.А.) Биологические свойства микроорганизмов озера Развал / Волкова Е А , Плотников АО// Сборник материалов региональной научно-практической конференции молодых ученых и специалистов - Оренбург, 2003 - С 164-166

4 Плотников А О Протистопланктон соленых Соль-Илецких озер /АО Плотников, Н В Немцева, С В Шабанов, Е.А. Волкова (Селиванова) П Материалы международной конференции «Природное наследие России изучение, мониторинг, охрана» - Тольятти, 2004 - С 212-214

5 Селиванова Е.А. Уникальные соленые озера Оренбуржья и их способность к самоочищению / Е.А. Селиванова, ТН Яценко-Степанова, А О Плотников, С В Шабанов и др // Труды научной конференции «Водные экосистемы и организмы-6» Москва, 2004 - С 91-92

6 Селиванова Е.А. Биологические свойства бактерий соленого озера / Е А Селиванова // Сборник тезисов конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» - Москва, 2004 - С 161-162

7 Селиванова Е.А. Биологическое разнообразие бактерий соленых Соль-Илецких озер / Е А Селиванова // Материалы конференции молодых ученых «Экология от генов до экосистем» - Екатеринбург, 2005 - С 263-266

8. Немцева Н.В. Планктонные сообщества уникальных гипергалин-ных мезогалинных озер Оренбуржья / Н.В. Немцева, А.О. Плотни-

ков, Т.Н. Яценко-Степанова, Е.А. Селиванова и др. // Вестник ОГУ, 2005. - №5. - С. 35-40.

9 Плотников А О Гетеротрофные жгутиконосцы соленых Соль-Илецких озер /АО Плотников, Е.А. Селиванова // Материалы конференции молодых ученых «Экология от генов до экосистем» - Екатеринбург, 2005 - С 211-213

Ю.Немцева Н.В. Роль симбиотических взаимодействий в выживании микроорганизмов в гипергалинных водоемах / Н.В. Немцева, Е.А. Селиванова, А.О. Плотников // Журнал микробиол., эпидемиол. и иммунобиол., 2006. - №4. - С. 117-120.

11 Селиванова Е.А. Биологические свойства водоросли Dunahella salina / Е А Селиванова // Тезисы докладов IX Съезда Гидробиологического общества РАН (том И) - Тольятти ИЭВБ РАН, 2006 - С 145

12 Селиванова Е.А. Взаимодействие микроорганизмов как механизм адаптации к условиям гиперосмолярности / Е А Селиванова, А О Плотников // Материалы III межрегиональной конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» - Саратов, 2006 - С 60-61

13 Немцева Н В Способ выделения и культивирования гапофильных и га-лотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев / Н В Немцева, Е.А. Селиванова, А О Плотников // Заявка № 2006143505/13 ФИПС РФ, Бюл № 9 27 03 2007

14 Plotnikov А О Biodiversity and ecology of planktonic heterotrophic flagellates in saline lakes /AO Plotnikov, E.A. Seiivanova, N V Nemtseva, J D Silberman // Protistology An international journal, 2007 - V 5, № 1 - P 62-63

Благодарности

Автор глубоко признателен к.м.н. А.О.Плотникову, доценту к б.н. Т.Н Яценко-Степановой; к б.н. Ж.В. Корневой (лаборатория экологической паразитологии Института биологии внутренних вод РАН, г. Бо-рок; к.б.н. Т.Г. Стойко и к б.н. Ю.А. Мазею (Пензенский государственный педагогический университет им В.Г. Белинского); к. б.н. Н.В. Шараповой и дм.н., профессору С.И. Красикову (Оренбургская государственная медицинская академия, кафедра медицинской и фармацевтической химии) за помощь при выполнении отдельных фрагментов работы, а также всем сотрудникам Института клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН, оказавшим моральную и техническую поддержку в процессе исследований.

Селиванова Елена Александровна СИМБИОТИЧЕСКИЕ СВЯЗИ МИКРООРГАНИЗМОВ В ПЛАНКТОННЫХ СООБЩЕСТВАХ СОЛЕНЫХ ВОДОЕМОВ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Оригинал макет подготовлен в программе Word for Windows 2003 Подписано в печать 6 06 2006 г Формат 60x84 1/16 Уел печ л 1,0 Печать оперативная, гарнитура Тайме Тираж 100 экз