Популяционная изменчивость и механизм возникновения вариантов PHOTOBACTERIUM LEIOGNATHI

Луцкая, Наталья Ивановна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Популяционная изменчивость и механизм возникновения вариантов PHOTOBACTERIUM LEIOGNATHI
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Популяционная изменчивость и механизм возникновения вариантов PHOTOBACTERIUM LEIOGNATHI"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ОРДЕНА ЛЕНИНА СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ

институт -Жйиздещ

На правах рукописи

_/_

ДОЦКАЯ НАТАЛЬЯ ИВАНОВНА •

ПОШЯЦШШАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ И МЕХАНИЗМ ВОЗНИКНОВЕНИЯ ВАРИАНТОВ РНОТСВАСТЕРаим ЬЕЮСЫАГН1

03.00.02 - биофизика

АВТОШЕРЯ

диссертации на соискание ученой степени какдидит'а биологических наук

Красноярск - 1991

Работа выполнена в Институте биофизики СО Ali СССР и Красноярском Государственном университете.

Научные руководители: академик АН СССР И.И. Гительэон кандидиат биологических коук А.Н. ¡Цензоров

О^.л'чальныа оппоненты: доктор физико-чатематических наук

A.Н. Абросов

кандидат биологических наук

B.Ai Кратасюк

Ведущая организация: Институт микробиологии i. вирусологии

иы.Д.К.Заболотного.ЛН УССР (г. Киев)

Защита состоится "_" ____1991 г. з__часов

на заседании Специализированного совета Д 003.15.01 по защите диссертаций при Институте биофизики СО АН СССР по адресу: 660035, г. Красноярск, Академгородок, МВФ СО АН СССР.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биофизики СО АН СССР.

Автореферат разослан _" __1991 г.

Учений секретарь ''тациалиэированно^о сошта

кандидат биологических наук , /¡Ы"1 Я.Г. КОСОЛАПОВА

Общая характеристика работы Актуальность темы.В настоящее время открываются возможности широкого использования светящихся бактерий для разработки тест-систем, основанных на реакции биолюминесценции» на'разнообразные б-о-логически активные соединения. Это ставит задачу выделения чувствительных, стабяльных ^.гаммов с высоким уровнем синтеза люциферазы. Однако стратегия случайного отбора яркосветящихся клонов приводит к быстрому снижен;.э уровня люминесценции культур после ряда пассажей вследствие накопления темных и тусклых клонов. В сЭягэи с этим очевидно, что отбор яркосветящихся штаммов должен основываться на целенаправленном исследовании закономерностей и условий возникновения гетерогенности в популяции светящихся бактерий.

Кроме этого, светящие-я бактерии представляют собой удобный объект для изучения механизмов поп: ляционной изменчивости микроорганизмов. Это обусловлено уникальной способностью фотобактерий излучать свет в видимой области спектра. Контролируемое изменение внешнего признака (интенсивности свечения) позволяв"' легко регистрировать и отбирать клоны с измененной способностью к люминесценции. Для данных исследований важно также, что уровень люминесценции является показ; гелем общего метаболизма клеток.

Изучение механизмов возникновения гетерогенности в микробных аоцуляциях представляет значительный интерес как для изучения общих законов Микроэволюции, так и для практических приложений в об-псти биотехнолог- -л микробного синтеза и медицинских исследованиях. Цели исследования. Основные задачи 'работы состояли в следующем:

1. Оценить разнообразие и динамику накопления наследственных вариантов, возникающих в популяции И1о-ЬоЬэ.<^ег1ит 1в10епагь1 шт.54.

2. Изучить регуляцию'люминесценции, физиолого-биохимические свойства и стабильность поддержания признаков у выделешшх групп

люминесцентных вариантов.

3. Изучить влияние мутагенов, активаторов и ингибиторов биосинтеза белка на вероятность возникновения люминесцентных вариантов и дать оценку возможного механизма возникновения гетерогенности в популяции светящихся бактерий.

Научная новизна. ' ;

Показано, что гетерогенность исследуемой попуяяцш рьа^ьааегл-

иш 1в1овпагы обусловлена возникновением в конце экспоненциальной фазы роста кул. гуры клонов с измененным уровнем люминесценции. Частота их возникновения на 1-2 порядка превышает обычный уровень спонтанных стаций.

Исследованы физиолого-биохимическиэ свойства и особенности регуляции люминесценции клонов с измененным уровнем свечения. Это позволило выделить 4 группы наследственных; вариантов, возникающих в популяции Из. 1 1оепяСЫ.

Показан плейотропный характер изменений свойств выделенных групп вариантов, затрагивающих не только параметры люминесценции, но и основные показатель внутриклеточного обмена: морфологии колоний, клеточную проницаемость, регуляц- я углеводного и азотного об-мено , чувствительность к катаболитной репрессии. Предполагается, что изменения обчеклеточной регуляции метаболизма в клетках светящихся бактерий определяют различия в эксг. цессии генов люминес-

> - '

центной системы, наблюдаемые у вариантов.

Выделены стабильные и нестабильные группы вариантов. Показано, что нестабильность наследования признаков обусловлена переходом с высокими частотами э разные группы вариантоз, в деленных из исходной популяции.

Показано, что вероятность возникновения вариантов зависит от синтеза белка в клетках светящихся бактер"й и возрастает на 1-2 порядка при добавлении низких концентраций ингибиторов биосинтеза

- 4 -

■ ад та з^тн»« чрютеафщгий и трансляции.

Уатхвят-е-ъ, '-¡п Авэмякиорэ'кп .•л-'чткгсц'-нгтис эт;. •»»-

т-ч» ягдемех »дггадяяпг« тоЛяпзи, которое,однако, но спп!;пно с л стууг^тр? ДТЗС т;:п1 грг.нятр1*, трансворсяЗ ели сдшч * эпигенетический взхшвга во.чмзд'ноР'мт г-пг^ятсв с тжяг.г* у;.-оч'юм экспрессии генов лгоиисарткоА слотами ■та ссаирт «оясгуьяхчюгв д:<ухоперо!птгэ трсггрра.

7К» с г " п - -д ш с г.ь. Нр .ч тплизо спПств лстадгосцемиьч т-тяюяык* цржгшп , те иотошч их достаточно легко пчде-

Ет^Пй-гкя- атряосгете^зтеся т>ариапти с высокой цугствителы-остыо я чятита'лм веществом, которые могут бг.ть вспользоташ

е зггчеетте »г.яи-ултогных ¿ъчур п б!!Олп;:инесцг_,тпчх квтедах ани:и-я у?«»в -тя пгптратоп Л5«кг»|^рпг»н. 2|'аолечмы» ттман

.ггжяздзоузгга ■ Всосотной коллекции мкроопганк.'^эч.

¿л гсие*^ г?к*о*оЗ «•уйсуяягглыюстд к знтлЛлоткям клркп»г>« л».

54-1У ретр*гботгш биолюминесцснтний метод окслр осюго »««яг* í!irasoIwвcro•, лчзжг-оетя шгийитороп тр.лнекрипцип и тр-шс--егг.г*. йетсд 2: тудп г^л гаями пзтореккма с1>!,.,г.втг-;.ъстра,1:[.

Лты>*лчг*1 у&.гл. Результата диссортош'скюй -аботн ;ижла;:м-—- -с*» яи, I Все««5гэтш Г т^иэшйском ст.ездю (Когкгч,1С32)', да Осе-пч^р^гдая *П!»рсшк?вгп соз^ане" гчкарсггешгнх средств с ^лстеэт'олотмч'1,(Москпа,1985), га УП степсе ВМ0(Ал~ ••'•'-1,1955), йктихута <5иофи:зи;:и СО АН СССР, ка$ед~

-•п 'Очога'.'И, л анатомии человека КрасГУ..

По г.^зылтаи исследований опубликсвпчо 9 работ, -} и-, ет»льстра.

"« г гг ■■ • о:, исспоромн;;.*!, трек 1'. 5 1, ио.^О'-'й-

р,е:>.уи::Т,\1;'0£ ч р^'Уотп, ?акл№**чвя и г.ог;. Е1<>1оТ'

изложена на 184 страницах, содержит 35 рисунков, 23 таблицы. Список литературы состоит из 165 наименований, в том числе 104 иностранных источника.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектом исследования служили светящиеся бактерии ию-ЬоЬги^егЗ,-|щ 1е1оБпа1;Ь1 шт. 54 из коллекц ч Института биофизики СО АН СССР. Данный штамм исходно выделен в Тихом океане и далее будет называться диким типом.

Основной средой для культивирования являла« полусинтетическая среда сложного состава с пептоном.

Интенсивность свечения и чувствительность люминесценции к экзогенному альдегиду определяли широко известными методами.

Выделение люминесцентных вариантов проводили в процессе периодического культивирования исследуемого штамма и высева проб на ага-ризированные среды через разные интервалы времени. Просматривалось до Ю5- Ю6 колоний.

Активность глутаминсинте:азы определяли с помощью гамма-глу-тамилтрансфаразного тесга.

Спонтанные частоты возникновения вариантов изучались на культуре темных клеток варианта 54-1 в тесте Лурил-Дельбрюка.

В экспериментах по влиянию мутагенов на вероятность возникновения вариг. тов использовали:5-б^.омУ1 цил ,2-аминопур1.', вызывающие замены .оснований в ДНК (транзиции); 1СЩ91 и акридин оранжевый (интеркаляторы); И-метил- инитро- Ннитрозогуанидин (НГ) и этилен-метан г-ульфонат (ЭМС), вызываю ,ие белее сложные замены оснований в ДНК (граневерски). Мутагены добавлялись как в очень низких концентрациях (до 1мхгД..;), так и в стандартных - до 200 мкг/мл[Ыил -лер, 197^ .В качестве ингибиторов синтеза белка использовали ркфам-пнцин, ингибирующий синтез на уровне -транскрипции, и хлорамфени-

-б-

кол-•ингибитор трансляции,в концентрации до I мкг/мл.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССВДОВАНИЙ И КХ ОБСУЖДЕНИЕ

I. Физиолого-биохимическиь и люминесцентные съ^йства наследств--нкх вариантов РЬ. 1е1огпаьП1. . ¿гуляцкя динамики люминесценции наследств-ь.-сих вариантов. Исследования структуры популяции ."-кого типа Р)1 Ле1оепа№1 пока-

о 5

зали, что в данной популяции с высокими частотами от 10 до 10 могут .возникать колонии, гетерогенные по морфологии и" уровню свечения .Последующий анализ их свойств позволил выделить 4 группы вариантов, наследующих сои свойства при пересевах: группа темного варианта 54-1, группа тусклого варианта 54-П и две группы яркосветя-щихся вариантов 5*-Ш и 54-1У.

Как видно из представленных на рисунке I денных, при культивировании в жидкой среде варианты различаются по уровни интенсивности свечения и динамке развития люминесценции. Уровень свечения темного варианта на 2-3 порядка, а тусклого на 1-2 порядка ниже уровня люминесценции клеток дикого типа. Обличительной особенностью темного варианта 54-1 является чувствительность люминесценции к экзогенному альдегиду, при добавлении которого уроь^нь све гения может возрасти в 5-10 раз. Такая реакция на альдегид возможна либо при снижении концентрации альдегида в клетках вследствие нарушения его биосинтеза, либо при .изменении сродства фермента люцифзразы к данному субстрату. Как показали исследована, кинетические параметра фермента ■ люциферазы не изменены у всех вариантов, так как константы Михаэ -

лиса люциферазы к альдегиду одинаковы у- 'светящихся и темнового ваК

ррантов и соответствуют 10"ЧИ. Таким образом, эффекте ость экспрессии генов люминесцентной системы темного варианта лимитируется концентрацией' внутриклеточного альдегида и связана с нарушением его синтеза .Свечение ту силе:о варианта 54-П возрастает при повышении в

<У//)мкА/огн.ед

РксД. Динамика развития лжжнеспештни г.ае-едствекнкх вариантов Рп.1е1оепа«:Н1

I- интенсивность свечения на среде с глицерином, 2- интенсивность свечения на среде с порыязнной концентрацией зутоиидуктора, 3- интенсивность свечения при добавлении экзогенного альдегида, 4- интенсивность свечения на среде с глюкозой (0,5г/л аммония), Б- интенсивность свечения на средо с глвяоэой (4 г/л аммония)

нулътуральной среде К01. _,ентрацин аутоиндуктора люминесцентной реакции и на средах, подработанных яркосветящимися вариантами может достигать уровня свечения клеток дикого типа.. Экзогенный альдегид ингибирует свечение тусклых клеток на всех фазах роста (рисЛ) Поэтому снижение экспрессии генов люминесцентной системы варианта 54-П, по-видимому, с 'условлено изменением уровня синтеза аутоиндуктора люминесцентной реакции. Люминесценция клеток дикого типа, а также вариантсг 54-1 и 54-П подвержена катаболитной репрессии, и на среде с глюкозой уровень свечения снижается до нуля (рис.1).

¡Слетки яркосветящихся вариантов 54-Ш и 54-1У имеют высокий уровень люминесценции, который на 2-3 порядка превышает уровень свечения клеток дикого типа. В развитии люминесценции клеток данных вариантов отсутствует латентный период. При этом у варианта 54-1У отмечается высокая скорость индукции свечения, уровень которого возрастает в 30-50 раз уже через 2-3 часа культивирования. Необходимо отметить,.что клетки варианта 54-1У утратили способность к росту ,1а минимальных средах и ауксотрсфш пп трем аминокислотам: серулу, треонину и гистидину. Кроме ^гого, яркосветячие-ся варианты отличаются от оп.:сашшх вьшо вариантов и друг от друга по чувствительности люминесценции к глюкозиой репрессии. У варианта 54-1У репрессия" не полная:на среде с глюкозой уровень свечения лишь в 10—15 раз ниже,чем на среде с глиц рином. Клетки же варианта 54-Ш не подвержены катаболитной репрессии. В связи с эткп клетки варианта 54-И легко идентифицировать на индикаторной среде с триптофаном, на которой они образуют окрашенные в коричневый цвет колонии, в отличие от неокрашенных колоний других вариантов.

Известно, что степень катаболитной репрессии зависит от соотношения в среде глюкозы и источников азота. Проведенные исследования показали, что при увеличен!.,! концентрации ешонкя в среде снимается репрессия у клеток дикого' типа, но усиливается у кле-

ток варианта 54-1У и возникает репрессия у варианта 54-Ш (рис.1). Эти данные свидетельствл'ют об изменении регуляции углеводного и • азотного обменов у яркосветящихся вариантов.

Изучение азотного и углеводного обменов у вариантов рь.1е1ой-.Для оценки возможных изменений азотного обмена у всех групп выдел иных вариантов и в клетках пикбто типа измерялась активность глутаминсинтетазы, ключевого фермента- азотного обмена в бактериальных клетках.

Таблица I

• Удельная активность глутаминсинтетазч исследуемых вариантов.

Исследуемые Удельная активность феюмента

культуры среда без аммония среда с аммонии

дикий тип 0,Ь1 0.89

вариант 54-1 0,о4 0,53

вариант 54-Л 0,79 0,85

вариант 54-12 0,28 0,38

вариант 54-1У 0,05 0,28

Как видно из представленных в таблице I данных, варианты

54-Ш и 54-1У характеризуются низкой акти:. гостью глутаминсинтетазы. Наиболее значительное снижение активности данног фермента наблюдается у варианта 54-13', что, возможно, й обуславливает ауксотроф-ность этих клеток. Полученные»данные позволяют предположить, то в клетках яр-осаетящихс вариантов 54-Ш и 54-1У произошли существенные изменения в регуляции азотного ол/ена.

различия в углеводном обмене люминесцентных вариантов проверялись по способь сти утилизировать разные сахара. Эксперименты проводились в жидкой среде. Контрольные среды не содержали источников углерода. Степени утилизации Сахаров оценивали „по отношению оптической плотности и интенсивности евзчения культуры, растущей на среде с у1леводом, к плотности и свечения этой же культуры,зы-

- 10 -

раненной на контрольной среде, через 6 часов культиэироЕания.

Таблица 2

Рост и свчение вариантов на <~ ле,1гх с разными источниками углерода

культ, ры дикий ТИП 54-1 54-П Ч Ш 54-1У

сахара О J О 3 О 3 О / Р . У

рамноза о,: 0,8 1,0 0,9 0,9 2.6, 1,1 1,9 1,2 1,1

лактоза 0,9 0,8 0,9 1,7 0,8 2,7 1,2 2,0 1,2 1,4

сахароза 0,9 0,9 0,» 1,0 0,9 1,4 1Д 2,0 1,2 1,3

арабчноза 0,9 0,3 0,8 0,2 0,8 0,3 1Д 1.3 0,3 1,1

мальтоза 1,2 1,0 1,2 0,2 1,3 1,4 1,5. 2,8 1,4 1,2

фруктоза 1,8 0,3 1,5 0,2 3,0 0,9 1,3 4,6 1,7 0,3

глюкоза 1,6 0,02 1,6 0 2,5 ОД I/ 5/ 1,3 0,3

глицерин 1,3 2,Г 1,6 1,4 2,5 2,0 1,3 2,4 1,6 3,6

Результате! показывают, что существенные отличия в углеродном обмене наблюдаются у вариантов 54-П и 54-Ш (табл.2). Клетки варианта 54-Л имеют более высокую старость роста. по сравнению с исследуемыми вариантами на хорошо утилизируемых сахарах-.фруктозе .глюкозе, глицерине. Груша варианта 54-Ш отличаегся от других вариантов тем, что ни один из используемых Сахаров не ингибируат рост и .свечение этого варианта. Таким образем, в клетках вариантов 54 П и 54-Ш произошли изменения в регуляции углеводного обмена. Такие изменения должны обеспечивать селективные преимущества данных вариантов и, тем самым, увеличивать вероятность их возникновения и накопления в популяции исходного штамма.

Действие антибиотиков на рост люминесцентных вар1—нто в.Нарушения регуляции внутриклеточных обменов могут обуславливать избиение состава поверхностных структур клеток и, следовательно, их проницаемости .Поэтому чувствительность к антибиотикам с разным меха низмом действия может быть использована, как один из показателей

- II -

дкфференцировки вариантов. Эксперименты проводились на твердых средах с использованием стандартных дисков. Чувствительность определялась по размерам зон отсутствия роста вокруг дисков с антибиотиками. Данные представлены в таблице 3.

•Таблица 3

Влияние антибиотиков на рост люминесцентных вариантов

■ Исполь учмые Чувствительность к антибиотикам вариантов:

'антибиотики т,т™г-~—-са—|---1-

дикий тип 04-1 • 54.^ 5454-1У".

канамкцин ~ - + +

олеандомкцин - - ч + ...

эритромицин - - - +

оксациллин - ■ - +

карбенициллин - - +

рифакпицкн ~ +

"з полученных даиних следует, что высокой чувствительность" к рчтибиотнкам обладают клетки вариантов 54 л и что мол;от

быть результатом увеличения их проницаемости. Кроме оть.'о, данные ьарианты характеризуются отсутствуем латентного периода в раыч-

*ии люминесценции и вусоя>м у'розь.и свечения, что позволяет использовать рарианты 54-Ш и 54-1У в качество тест-объектов в (.г '>-люм/шесцек"кь!х ихорах аьллнза.

Таким образом, проведенные послед;: падая покарали, чю у вариантов рь. 1е1оеаабЬ1 , выделенных первоначально как вариант« с измененной счогэбностью к люминесценции, произошедшие изменения носят плейотропный характер. Помимо изучений о экспрессии генов люмиг'сне;иной системы меняются основные показателя ^ утриклеточ-ного обмена. Следовательно, группы варианте характеризуются определенным метаболизмом, который и определяет особенности экспрессии генов люминесцентной системы ка-ядосо варианта.

а. Динамика лэлуляцконной шшяоивостк паслед- • г венных вариантов Г'Ь. ".еЛсц-аг^Ы.

Таблица 4

Структура популяций люминесцентных вариантов при периодическом культивировании

Время 54-1 54-1У 54-П 54-Ш

взятия Часто т ы п е р е х о Т. 0 в

светящиеся тусклые темные яркие темные тусклые темнне

0 Ю-6 Ю"6 Ю"6 Ю"6 Ю"6 Ю"6 Ю-6

, 2-3 Ю"6 3,0-3,5'Ю"4 1,6-2,2-Ю"3 10"5 Ю"5 ю-5 Ю"5

3 5-6. 0,8-1,2-Ю"2 4,7-5,2-Ю"4 1,8-2,2-Ю"3 2,8-3,1-Ю"3 2,4-2,8-10: :3 Ю"5 Ю-5

' 10-13 5,6-6,МО"3 7,0-7,5*10"^ 1,5-1,9-Ю-3 10"^ 2,2-2,6'Ю- ■2 0,8-1,2-10- -3 10-5

24-28 2,6-2,9-Ю"3 1,5-2,МО"4 0,8-1,2-Ю"3 Ю"5 0,8-1,1'10' -3 0,6- 0,3-10 1 10-5

Для ,,олиой оценки возможного разнообразия исследуемой популяции светящихся бактерий необходимо выяснить, насколько стабильно наследуются признак;! у выделенных вариантов. С этой целью изучались структуры популяций кагдого варианта в периодической культуре.

Кдк показали исследования, при культивировании в популяции всех ариантои возникают клоны, отличающиеся по . минесценции и мод-фологи!' колоний от исходно взятых в анализ. Однако варианты различаются по {&с?ото и разнообразию.возникающих клоног (табл.4),

В популяции темного варианта 54-1 возникают тусклые и яркие колонии, Отличается высокая частота их еизш-"новенкя через 5-6 часов культивирования. Анализ свойств измененных колоний позволил устзнозкть, что яркие клоны соответствуют клетка!! В£_х&нта 5-5-11'. Тусклые клоки непщнородны по признакам л соответствуют вариантам С4-П v. 54.-!!. Следовательно, в популяции варианта 54-1 возникают все групп'! вариантов, выделенных из исходной лопуляции (табл.5)

Таблица 5

Возкоаше пгрзходя в популяциях дюмкнесцентнкх вариантов

Возникающие Наследуемые вяоиантн :

варианты Г'-1 Ь4~1! 54-а 54-1У

54-1 + +

54-II ^ +

Ь4-~ .1- +

5-3--1У ■1-

догошщия ту смог о я-га 54-П через 5-6 чпеоо роста ьез~ на.-:.-.: '„сг&ш коле и,-г к чкй.-.га 51-1. г^лзе ркке колонки, которые о:пщу>:.й -ы б популяции '»гаЛл.«!), теряют* аовксвкиыГ: уровень с к "л.слудувг,!-' гсрссокгх л сохраыя? т свойства всх<уэ»И1

гаг ллк»»», Тачки обре*«! » пгоутгси тусклого варианта устакэглег/ :о.м, г^рксо,.: 1/4 ~П I С .1} .

в'.ркагл-д хар-мп-лп!.. сгьОяъйость ь'аедедогешкя ври'.~ г.чхо». &»-!»нгяг а ст^укгур? вгл^кциа данного вариэята рзбяпддоя>-чя нг-сяз ГО-13' 'пссп кулмявгфогмяя ж огишзчадася в везшн,-кс2ем,-нг "елее «от клонен с часгогой Одно к о вновь вочнккп.гг^'.з

тлт:.-.; ^о/Г'Н!"",? огчюгчтнз пр;<здакгг птр.ганта 54-И к отличятотся ?..лм.о "о. уро*'.-»), лг:':',нес!',г.')г,\!'.".- Следсватчт но-» и полуляцот взнг,".::-'гп 64-П но глонсз других ва^азнзгав- к вооможен: только' одк-»

ись'-.уод яркий — &4-12 тускгл.'.П, чяп» к обуславливаем тС-ил -но':::, 'л»;кого варианта ( -¡абл

'л отличие о-гг о:ч, ошсаш-лэт и-жу ¡,- популлц;".-: .рр тч-';-

тл^егзсч варианта Ы-1У тгадо'н чуг:иш ет-зьн. возникая® уве и«?ре* 2-5 часа кухьтяваровчкЕЯ (таЗл .4)\. Текзга клоьы по анч-пи^ир^еум угони. зкац> соотзетгтиу»? варианту £4-5,, а сусял® клонь" соотгдтсгк«— иг группам эаряавгсв 54-11 я 54-ЕГ

Таким обрчэом,' кегле,пуемкз гзряаптк разд'ичоотея по стабильности иасяедогарюг признаков. Цчкбола» ¡згста&Еп.нами является гр.'Ит^г веркпгеоя 54-1 п- 14-1У, а поцуляцклг готарнг с вксокик«- чисто-шет чг;нн/снт ^пчнентгм^ гр'.'гпг ча^кг-пто??« 5' популяции' ту с;:г.с г а. ряг та. 51-П могут- гозкккать то; ько- клетки: те?.<нога г-ркгшта» о. у варианта г--1-1 н^рехогоь ь другие группы не айнаружено. ПроподенигЗ. •*нишз показал яикккичвсеть структур кгеле.пуекьх псгуляциЯ1 гарааю-' •гоь гл -,1.л1 и возможность- ьзгкхопззвходсв когду

н«':;: >•, ,чз~?спо?яг,к?"ус* шркчнт-чки. «кем. переходе у возникая-:н--._■>-рп-г:-я г злы-о урогзнь. к регуляция л»нкн?сц5нцг.иг^кс-я Т-'Л'-" ? сгойссва,. Следовательно,. еззкот-

-пТОЕ V .у раяйкм уровнем свочеиипп .

.-."'■г ■■ "---ть о:' С:]""»'!!. раТИ уетабодияу-, спре-

, ■;> с^з-?-"-"'"-/;/, рту;::*:',::;: !н:р!::и;т-""..

<>:> |"Т гт ' с-т'- —-угтачг -пп'эд;? сне/;' .трМ'-■■ " ' - -уч •?"-"': ■•■•••;•> -Грг --^¿тка

ного теста заключается в том, что одновременно ставится ряд независимых культур, которые после подращивания высеваются на ТЕердкс индикаторные среды. Если новые варианты образуются в процессе роста в результате цутаций, то в отдельных субкультурах это событие может произойти в разное время. Следовательно, при "ысеве на чашки число размножившихся мутантов будет различным в отдельных субкультурах. Иная картина должна наблюдаться, если изменения е.руз'Трь^популяция происходят б результате адаптационных процессов. Адаптация заключается в непосредственной реакции на изменение окрукаюцей среды всех клеток бактериальной культуры.Поэтому при выращивании субкультур в идентичных условиях число возникающих измененных клонов должно быть одинаковым во всех субкулмурах. Следоьательно, при адаптационных изменениях отношение дисперсии к среднему числу возникающих измененных клонов (V/X) по отдельным субкультурам близко к единице, а при мутационной природе изменений это отношение должно • быть больше единицы.

Эксперименты проведены к. клетках темного варианта 54-1. Определялись частоты возникновения тусклых v яркоеветя_,ихся клонов ~рез 5 часов культивирования. Результаты, полученные б трех независимых экспериментах, представлены в таблице 6.

Как видно из представленных данных, частота возникновения люминесцентных вариантов превыдает обычную частому спонтанных мутаций и составляет для тусклых и яркосветщихся вариантов соответственно

3-6*10"^. Отношение дисперсии к среднему числу возникающих измененных клонов больше единицы во всех экспериментах.

Следовательно, возникновение вариантов в популяции светящихся' бактерий имеет мутационную природу, а ие является результатом адаптации клеток к меняющимся условиям среды.

Таблица б

Результаты флуктуационных экспериментов

Измеояетае 1-ый 2-ой

характеристики. опыт опыт

3-ий опыт

//-обцее число клеток

Р -доля субкультур, в которых не обнаружено : тусклых клонов

ярких клонов

А-час^ота возникновения : тусклых клонов

ярких клонов

Х-среднее число

на чашку : тусклых клопов

ярки.; клонов

УД-относэние дисперсии к среднее числу: тусклых клонов

лских клонов

7-10°

1,2-Ю4 1,3-Ю4

0,286 0,313 0,375

0,657 0,719 0,656

1,79'Ю-4 0,97 "10 Г4 0,82'10'

0,6' Ю-4 0,28'Ю-4 0,35*10'

2,64 2,63 21,06

0,9 0,72 1,41

7,93 0,67 530,6

4,64 3,78 10,24

-4 -4

111. Влияние мутагенов и ингибиторов биосинтеза белка яа вероятность возникновения люмикееценгпых ззри&ктоэ.

В связи с полученными данными, которые предполагают ¡.сутацяон-ную приеду возникновения люминесцентных вариантов, были.проведены оксерт/.энты по влиянию >7тагенов на вероятность возникновения светящихся клонов б популяции темного варианта 54-1.

В работе использованы мутагены с разный механизмом действия (табл.7). Как пока?"чо и экспериментах, обработка тзшмх клеток варианта 54-1 в разных концентрациях че влияет или снижает вэроят--ность В03ШХН0В9" "М светящихся клонов. Исключение составляет китро-зогуанидлн, который значительно увеличивав:" выход светящихся гаря-антов (табл.7). Необходимо отметить, что нитрозогуанг чн способен индуцировать возникновение ссотяцихся клеток п очень низких концентрациях (от 0,2 до I >ш7мп). Из литературных источников и''ьестко,

.- 17 -

Таблица 7

Влияние мутагенов на вероятность возникновения, светящихся клонов в популяции варианта 54-1

Концентрация, мкг/мл

мутагены 0 1,0 10 100

Частота возникновения светящихся KJiOHOB

2-аминоцурин 5-броьурацил 1,2-10-^ 1,2-Ю"4 0,3 1,0-io-4 _ 1,4'Ю"4 0,5-10^

акридин оранжевый 1,6-ю-4 1,6-Ю"4 - 1,0-ю-5

ICR 191 0,2-Ю"4 3,8'Ю"6 3,7-Ю-6 • -

этиленметан-сульфонат нитрозо^а -нидин I.I-I0-4" 1,4-ХО-5 о.э-ю*4 2,5-I0"2 0,6-ю-4 2,0-I0"3 г

что нитрозогуанидин в низких дозах является сильным ингибитором -. биосинтеза белка. Можно предположить, что именно это свойство нит-. розогуанидина, как ингибитора биосинтеза белка, обуславливает наблюдаемый эффект.

Для проверки высказанного предположения культура клеток варианта 54-1 обрабатывалась рифампицином (ингибиторам биосинтеза белка иа уровне транскрипции) и хлорамфениколом (ингибитором трансляции). В результате проведенной обработки частота возникновения све-

(Тящихся клоноз в популяции темнового варианта возрасла в 20-50 раз

в зависимости от дозы ингибиторов (рис.2).

i-2

и .

О)

Я (Q

О О

а х.

* о

S §

о к

m d

d s

§ щ

6i fr*

О <b

cd «

tr о

10-

-3

Рис.2. Зависимость частоты возникновения светящихся клонов от концентрации ингибиторов биосинтеза белка: - рифамлицина-1 и хлорамфени-кола-2.

0,2 0,4 0,6 JwKrAuiJ .-. 18 —

Необходимо подчеркнуть, что антибиотики с разным механизмом действия различаются по воздействию на частоту возникновения люминесцентных вариантов. При добавлении ингибитора транскрипции (рифампицина) наблюдается линейное возрастание числа светящихся клонов от концентрации антибиотика. Ингибитор трансляции (хлорам-феникол) оказывает стимулирующее действие олько в узком диапазоне концентраций.

Таким обрезом, проведенные исследования позволили выявить ряд

закономерностей возникновения гетерогенности в популяции светящихся бактерий РЬ.1е1овпа1:М Прежде всего'отмечается высокая частота возникновения вариантов в фазу активного деления клеток (преимущественно через 4-5 часов культигирования). Процесс возникновения юминесцентных вариантов является нутационным событием, которое однако не обусловлено обцчннми мутациями типа транз,_ций, трансверсий или сдвига рамки считывания. У вариантов наблюдается плей-отропный характер изменений, затрагивающих как параметры люминесценции, так и основные показатели внутриклеточного обмена. Варианты различаются по стабильности наследования признаков, а также по разнообразию возможных взаимопереходоэ. Вероятность возникновения люминесцентных вариантов зависит от уровня биосинтеза белка.

Молекулярный двухоперонный триггер, как возможный механизм воь.,икнове*"№ гетерогенности в популяции РЬ.1е1оепа^1 ' На сегодняшни день известно несколько механизмов, обуславливающих высокий уровень спонтанны^- мутаций: инсерционный мутагенез, инверсия контролирующего сегмента и механизм молекулярного триггерного переключения,примером которого служи* переход 1\ фага из лизогенного в литическое состояние. Перечисле ныэ механизмы различаются по действию ингибиторов биосинтеза белка на частоты переходов в новое мутационное состояние.-Добавление ингибиторов увеличивает вероятность переходов в случае триггерного механизма..Это обусловлено - 19 -

тем, что при подавлении синтеза белка снижается число молекул белков репрессоров, участвующих в триггерном переключении и возрастает вероятность их потери в цроцессе деления клеток. Бри Э'.ом частота перехода в ювое, состояние будет возрастать. .

Противоположное действие ингибиторов наблюдается в случае ин-серционного мутагенеза и инверсии контролирующего сегмента. Механизм инверсии осуществляется ферментом мутураэой, а транспозиция инсерционшх элементов - ферментом транспозазой. Поэтому при подавлении синтеза белка будет скитаться концентрация этих ферментов, что приведет к снижению вероятности возникновения вдтантов.

Полученные в работе данные: высокая спонтанная частота возникновения люминесцентных сарианхов, возможность альтернативных, обратимых состояний метаболизма клеток светящихся бактерий, возрастание частоты переходов в новое состояние при кнгибировании синтеза белка, позволяют предположить, что механизм возшршовения вариантов с разным уровнем интенсивности свечения основан на работе молекулярного двухоперошюго триггера.

Модель триггера, построенного кз двух в^аимоиействуюцих сг.еро-нов, предлоквиа Ж.Ыоно и Ф.Какоб[1961] и в дальнейшем разработана, как механизм генетическогс' управления системой редупликации у ]\ ^ага [ Ратнер, Чураев,1971] . Двухоперонный триггер рассматривается как наследственная единица особого рода, когда хранение и передача информации осуществляются наработкой в клетке соответствующего ре-прессорр. и его распредэленкя ыекду потоютши. Переход из состояния в состояниэ возможен при случайной потере репрессора в процессе деления клеток. Двухоперонный триггер обеспечивает два устойчиьлх • состоянья, которые способны, наследовать сл. Возможно неустойчивое состояние систеиы, когда посла потери репрессоров включаютя одновременно оба оперока. При таком включении начнется синтез двух репрессоров, котор^э долк51ы выключить оба оперена.

- £0 -

Рис.З. Схема, переходов кетгду вариантами, зыделенными их популяции ри, при дгухопаронном триггерном переключении.

На- рисунке 3 представлена схема переходов между вариантами при двухоперонном триггерном переключении, контролирующем различгче состояния светящихся клеток. Как видно из прэдлокзнноЯ схемы, в расположении разных групп вариантов наблюдаются определенный закономерности. В верхней частя схемы находятся варианты 54-1 я Б4-П,ко-торкз характеризуются н:'эк;м уровнем свечения, наличием латентного периода з развитии люминесценции, еысоксй чувстаительностьэ к глр-козпой репрессии. В н;гшзй части схемы расположены варианты 54-1П и 54-1У. Сбцими свойствами данных групп вариантов язляятся: высокий уровень интенсивности сквчения, отсутствие латентного периода з развитии люминесценции, повыязнкый уровень синтеза аутоиндуктора, чувствительность вариантов к действию антибиотиков, снитаикз степени глюхозкой репрессия у варианта 54-17 п отсутствие катаболит-1ЮГ1 репрессии глюкозой у варианта 54-Ш. Кроме этих свойстз, общим для данных групп вариантов является низкая активность глютяминсин-тетазы, то есть произсми шкенэийя з рогуллцип азотного обмена.

Если рассмотреть вертикальную симметрия предлагаемой схе:.!ы, то можно отметить, что слева расположены варианты 54-1 и 54-1У, которые способны переходить о внсошаш частотами зо зсэ группы вариантов, выделенных Ьз популяции дикого типа. Спрагл располагаются группы вариантов Б '-П и 54-Ш, характеркзрт^нэся больпей стабильностью наследования признаков. Кроме отого, у вариантов 54-П я 5-141!

-21-

•произошли изменения в регуляции углеводного обмена, которые должны обуславливать их селективное преимущество по (^равнению с другими вариантами. Отсутствие переходов между вариантами 54-П и 54-11' можно объяснить либо принципиальной их невозможностью, либо тем, что переходы происходят с низкими чаототами.

Таким образом, предложенный механизм молекулярного двухоперон-ного триггера позволяет объяснить возникновение в популяц л светящихся бактерий вариантов с разным уровнем люминесценции и возможность их переходов из одного состояния в другое в процессе деления клеток.

основные вывода

1. В популяцииЕ1ю1;оЪя<^ег1ш1 хе1оБй*ьштт.54 выделено 4 группы наследственных вариантов с измененным уровнем люминесценции, кол С

торые возникавт с частотой 10-10 в конце экспоне: ^иальной фазы роста клеток.-

2. Показано, что варианты различаются по регуляции синтеза лю-циферазы, альдегидного фактора и аутоинпуктора люминесцентной реакции. Кинетические параметры люциферазы остаются неизменными у всех вариантов»

3. Установлено, что варианты различаются также по ряду физио-л^го-биохиыических свойств: морфологии колоний, чувствительности люминесценции к катаболитной репрессии глюкозой и кнгибированию антибиотиками, регуляция углеводного и азотного, обменов. Предполагается, чте изменения обцекпеточкой регуляции метаболизма в клетках ' светящихся бактерий определяют различия в экспрессии генов люминес-цзнтной системы, наблюдаемые у вариантов.

4. Выделены стабильные и нестабильные группы вариантов, показано, что нестабильность наследования признаков обусловлена перехо- -дои. с высокими частотами в разные группы вариантов, выделенных из исходной популяции.

5. На основании фдуктуашонного теста показано, что возникновение вариантов в популяции светящихся бактерий является мутационным событием, которое происходит с частотами, на 1-2 порядка прэвызалцими обычнь,п уровень спонтанных муташй. Процесс возникновения вариантов не связан с изменениями в структуре }Щ типа тран-скций, трансверсий или сдвига рамки считывания.

6. Установлено, что частота возникновения лгминесданткых вариантов зависит от синтеза белка в клетках светящихся бактерий. Ингибиторы синтеза белка на уровне транскрипции и трансляции в низких концентрациях увеличивают частоту 1- «никновения вариантов с разным уровнем интенсивности свечения.

7. Предложен эпигенетический механизм возникновенич гетеро -генности в популяции светяцгосся бактерий на основе работы молекулярного двухоперонного триггера, согласно которому наследование состояния обеспечивается распределением молекул белков репрессоров между дочерними клеткамл. Переход из состояния в состояние возможен при случайной потере белков репрессоров в процессе деления клеток.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Попова Л.Б.,Луцкая Н.И.,Шендеров А.Н. Прпуляционные аспекты проявления люминесценции у фотобактерий// Тез. I Биофизического съезда, Москва, 1982. С.351

2. Шендеров А.Н.,Виделец ИЛ). .Гуревич Б.Б. .Луцкая И.И. .Садовская И.Л. Биолюмигэсцентные экспресс методы определения биологической активности антибиотиков//Гез.докл. Всес.когф."Перспективы создания лекарственных средств с использованием бятехнологии",Москва, 1585. - С.Г36

3. Вид>,леп И.р. .Шендеров А.Н.,Луцкая Н.И..Соловьева Т.И. Маха-низмы возникновения и подшзряашя функциональной и метаболической гетерогенности в популяции микрооргакизмов//Тез.докл. ВУО, Алма-Ата, 1985. Т.4. - С.27

6Я4 В.Б. raetet«etorise ieic03«wiiEr.bi»ii',V «

*лчество TtCTf—JCXMQfjjbi рл гг^даиы ^»■""•¡»ижсг/У

Ä.C. IScîSlS.l^.

итхмп'леам'л ект«»а:ял tçfcac^;..-¿в/, Л.с. ifCZ ,1*-3?

v. АЛ'.. .li^ÄciyiLQ. •.¿¿¿.•м-''- ¿l.-'I.XÜ?. Z~,c.-2s

I.íutоCffctоxiua I » v ríer-

KjU.i.ïj'pij д.1.1 ^¿í-vvTJtCijîj.-Ï ¡яямыст . //.'.;. I^KS»

lí'ití

7. HJSÍ. Jfrpas Н-.И

¿Л'!- ль.».1..": ~JJ?-.«COÜ3K>S EHÍ

¿■.'-¡'.«.г.^Й! • Irií-^uiM //»::■ .''rsw î! IFS3.-

"сЗ-"*'."