Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение NADH:хинон оксидоредуктазного сегмента электрон-транспортных цепей

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Изучение NADH:хинон оксидоредуктазного сегмента электрон-транспортных цепей"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им МВ ЛОМОНОСОВА

на правах рукописи

Богачев Александр Валерьевич

Изучение МАОН:хинон оксидоредуктазного сегмента электрон-транспортных цепей

03 00 04 - Биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва - 2007

003066237

Работа выполнена в отдаче молекулярной энергетики микроорганизмов Института Физико-химической биологии им АН Белозерского Московского государственного университета им МВ Ломоносова

Официальные оппоненты'

доктор биологических наук, профессор Звягальская Р А

доктор биологических наук, профессор Тихонов А Н

доктор биологических наук, профессор Завильгельский Г Б

Ведущая организация Институт химической физики им НН Семенова РАН

Защита состоится 12 ноября 2007 года в 15 30 на заседании Диссертационного совета Д501 00171 в Московском Государственном Университете им МВ Ломоносова по адресу 119991, Москва, Воробьевы Горы, МГУ, Биологический факультет, аудитория ББА

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им МВ Ломоносова.

Автореферат разослан "_"_2007 года

Ученый се1фетарь диссертационного совета, кандидат биологических наук, // __. МВ Медведева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы В последние десятилетия достигнут значительный прогресс в понимании механизмов трансформации энергии в дыхательных цепях митохондрий и бактерий Так, для многих ферментов электрон-транспортной цепи (таких как цитохром с оксидаза (комплекс IV), ¿cj-комплекс (комплекс III), нитратредуктаза, формиатдегидрогеназа и многих других) на настоящий момент определена их трехмерная структура Более того, для этих ферментов выяснена последовательность окислительно-восстановительных реакций при осуществляемом ими катализе, а для некоторых из них - и механизм генерации протонного потенциала. В тоже время, механизм протекания NADH хинон оксидоредуктазной реакции - первой стадии в функционировании дыхательной цепи - на настоящий момент неизвестен, и эта реакция является наименее изученным участком электронного транспорта. В отличие от митохондрий животных, где функционирует лишь КГ-транслоцирующая NADH хинон оксидоредуктаза (комплекс I), окисление NADH в дыхательной цепи бактерий может осуществляться тремя различными типами ферментов Н+-транслоцирующей (NDH-1), Na^-транслоцирующей (NQR) и несопряженной (NDH-2) NADH хинон оксидоредуктазами У различных бактерий в дыхательной цепи могут функционировать NADH хинон оксидоредуктазы одного, двух и даже всех трех вышеперечисленных типов Для всех этих ферментов на настоящий момент не известен ни механизм окислительно-восстановительного катализа, ни способ генерации мембранного потенциала (для NQR и NDH-1), также неизвестна физиологическая роль различных NADH хинон оксидоредуктаз в клетках микроорганизмов

Цель и задачи исследований. Целью данной работы являлось изучение NADH хинон оксидоредуктазного сегмента дыхательных цепей Особое внимание было уделено исследованию механизма функционирования №+-транслоцирующей NADH хинон оксидоредуктазы из морской бактерии Vibrio harveyi Исследование №+-транслоцируклцих ферментов имеет ряд преимуществ по сравнению с протонными помпами Прежде всего, при изучении №+-помп можно свободно манипулировать концентрацией сопрягающего иона без существенного влияния на стабильность белка, что невозможно в случае НГ-транслоцирующих ферментов В частности, можно исследовать каталитический цикл натрий-зависимого фермента при лимитировании его скорости низкими концентрациями Na+ и выявить в нем стадии, специфически ускоряющиеся этими ионами Такой подход позволяет определить, какие именно окислительно-восстановительные переходы в ферменте сопряжены с транслокацией Na+ С другой стороны, влияние концентрации Na+ на термодинамические свойства натриевой помпы позволяет установить механизм преобразования энергии катализируемой редокс-реакции в трансмембранный натриевый потенциал Также исследовалась регуляция экспрессии генов, кодирующих различные NADH хинон оксидоредуктазы, и определялся фенотип мутантных по этим генам штаммов микроорганизмов, что позволяет приблизиться к пониманию физиологической роли данных ферментов в клетках бактерий

Научная новизна работы. Впервые предложен метод определения стехиометрии Na+/e" для первичных натриевых помп в бактериальных клетках С использованием этого метода установлено, что стехиометрия Na+/e" для NQR равна 1

Показано, что NQR в дополнение к нековалентно связанному FAD содержит также остаток FMN, ковалентно связанный с субъединицей NqrC Установлено, что в окисленных и полностью восстановленных препаратах NQR присутствуют два флавиновых радикала с различными характеристиками Один из них детектируется в окисленном ферменте и является нейтральным флавосемихиноном Второй обнаруживается в полностью восстановленном ферменте и является анионным флавосемихиноном Исследована кинетика восстановления NQR в присутствии NADH при различных концентрациях ионов натрия в среде измерения Показано, что эта кинетика состоит из трех различных фаз Установлено, что скорость первой фазы не зависит от концентрации Na+, в то время как скорости второй и третьей фаз являются натрий-зависимыми Продемонстрировано, что восстановление ковалентно связанных остатков FMN зависит от концентрации ионов натрия с измеряемой константой активации 3,4 мМ Это значение близко к значению Км для Na+ при функционировании фермента в стационарных условиях

Впервые проведено окислительно-восстановительное титрование простетических групп NQR и установлены значения их среднегочечных потенциалов. Найдено, что значения редокс-потенциалов всех оптически-видимых кофакторов NQR. не зависят от концентрации ионов натрия в среде измерения Методом 23Ка-ЯМР определены параметры связывания Na+ с NQR Установлено, что константа диссоциации по Na+ для окисленной формы белка составляет 24 мМ, тогда как для восстановленной NQR - 30 мкМ Таким образом, восстановление NQR приводит к 1000-кратному увеличению сродства фермента к сопрягающему иону Проведено окислительно-восстановительное титрование сродства NQR к ионам натрия при 2 мМ [Na+] Это титрование описывается законом Нернста с Ет около -300 мВ и n = 1 Полученные данные указывают на то, что механизм сопряжения NQR основан на модуляции его ионной аффинности редокс-состоянием простетической группы На основе всех полученных результатов исследования NQR предложен возможный механизм функционирования Ыа+-транслоцирующей NADH хинон оксидоредуктазы

При исследовании электрон-транспортных цепей азотофиксирующей бактерии Azotobacter vinelandu и термогенного растения Arum orientale, показано, что скоординированная индукция активностей компонентов несопряженной альтернативной ветви дыхательной цепи является универсальным механизмом для осуществления ускоренного дыхания, что может быть использовано для теплопродукции, понижения

внутриклеточной концентрации кислорода, регуляции метаболических потоков или каких-либо других функций

Практическая значимость исследования. Научные положения настоящей работы расширяют и углубляют современные представления о механизме функционирования NADH хинон оксидоредуктаз дыхательных цепей Полученные в ходе этой работы данные о влиянии концентрации ионов натрия на кинетические и термодинамические параметры Ка+-транслоцирующей NADH хинон оксидоредуктазы важны для определения принципов запасания энергии окислительно-восстановительных реакций в виде трансмембранного ионного потенциала

Полученные данные о регуляции экспрессии генов, кодирующих различные NADH хинон оксидоредуктазы, и установленный фенотип мутантных по этим генам штаммов микроорганизмов позволяет приблизиться к пониманию физиологической роли данных ферментов в клетках бактерий

Гены, гомологичные nqrA-F из V harveyi, были обнаружены в геномах многих бактерий Оказалось, что NQR широко распространен среди прокариот, в частности, этот белок содержится и у многих патогенных микроорганизмов, таких как V cholerae, Haemophilus influenzae, Klebsiella pneumoniae, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Yersinia pestis, Shewanella putrefaciens, Pseudomonas aeruginosa, Porphyromonas ginginvalis и так далее [Zhou et al, 1999] Более того, в случае V cholerae было показано, что функционирование NQR играет существенную роль в индукции факторов вирулентности [Hase and Mekalanos, 1999] Таким образом, этот фермент может быть использован в качестве мишени при лечении шш предупреждении многих инфекционных заболеваний

Материалы работы используются в учебном процессе на факультете Биоинформатики и Биоинженерии и на Биологическом факультете Московского Государственного Университета. Результаты исследований вошли в курс лекций по «Биоэнергетике»

Апробадия работы. Материалы работы были представлены и обсуждались на XI (Брайтон, Англия, 2000), ХП (Аркашон, Франция, 2002) и XTV Европейской биоэнергетической конференциях (Москва, Россия, 2006), II и III съездах Биохимического общества РАН (Москва, 1997 и Санкт-Петербург, 2001), симпозиуме ИНТАС (Москва, 1997), конференции "Митохондрии, клетки и активные формы кислорода" (Пущино, 2000) Работа также была апробирована на семинаре отдела биоэнергетики НИИФХБ им А Н Белозерского МГУ Результаты, представленные в работе, удостоены Премии Европейской академии для молодых ученых СНГ за 1997 год, Государственной Премии Российской Федерации за выдающиеся достижения в области науки и техники для молодых ученых за 1998 год и премии им И И Шувалова Московского Государственного Университета за 2004 год

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 16 статей в рецензируемых журналах

Структура диссертации Диссертационная работа включает 6 глав, 141 страницу, 55 рисунка и 9 таблиц В работе использовано 210 литературных источников

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Штаммы A vinelandii и V harveyi дикого типа были получены из музея кафедры микробиологии МГУ Штамм К pneumoniae 204 (дикий тип) был получен из коллекции Института стандартизации и контроля биомедицинских препаратов им Л.А Тарасевича. Непатогенный штамм V cholerae 0395Nl-toT lacZ был получен от др Хасе Штаммы А vinelandii DL10, МК5, МК8 и UW136 были любезно предоставлены проф Поулом Культуры клеток V alginolyticus 138-2 и Napl были получены от проф Унемото Штаммы Е cob G0104, MWC215 и MWC217 были любезно предоставлены проф Теннисом, а штаммы AN387 и ANN091 - проф Вейсом

Выращивание V. harveyi, V. cholerae и V. alginolyticus. Клетки этих бактерий выращивали в среде следующего состава 0,5 M NaCl, 10 мМ КС1,15 мМ (NHL^SO,}, 5 мМ MgS04, 0,5 мМ КН2Р04, 0,05% дрожжевой экстракт, 50 мМ трис-HCl (рН 8,2), 0,4% глицерин Клетки растили на качалке при 32°С и 200 об/мин до середины экспоненциальной фазы роста.

Выращивание клеток A. vinelandii проводили в модифицированных средах Бурка BSN и BS [D'Mello et al, 1994] Клетки выращивали на качалке, в зависимости от поставленной задачи - в колбах на 300 мл или в колбах Эрленмейера на 1 л с 40 или 100 мл жидкой среды, соответственно, при 250 об/мин и температуре 30°С Выращивание клеток в среде с пониженной концентрацией кислорода проводили в колбах на 300 мл с 250 мл питательной среды

Хемостатная культура A. vinelandii Клетки A vinelandii UW136 и МК8 выращивали (как описано в [Linkerhagner and Oelze, 1996, Post et al, 1983]) в рН- и 02-контролируемом хемостате (ферментер "Techne" BR-6), в 800 мл питательной среды при 37°С Степень разведения культуры в случае штамма UW136 составляла 0,25 ч"1 (среда BSN) и 0,15 ч'1 (среда BS), а в случае штамма МК8 - 0,125 ч"1

Для выращивания клеток Е. coli и К, pneumoniae различных штаммов использовали богатую среду LB или минеральную среду М9

Измерение соотношения Na+/e\ Клетки V alginolyticus осаждали на центрифуге при 7 000 g в течении 10 мин Замену внутриклеточных ионов К+ на ионы Na+ проводили методом Накамуры [Nakamura et al, 1982] После этого клетки промывали средой инкубации (0,2 M Na2S04, 5 мМ MgS04, 10 мМ глицерин, 0,1 мМ HEPES-NaOH (рН 7,5)), суспендировали в той же среде до концентрации клеточного белка 1,5 мг/мл и помещали в ячейку с рН-электродом (объем ячейки - 1,3 мл) После насыщения клеточной суспензии аргоном ячейку закрывали и доводили рН до значения 7,5 посредством NaOH При проведении экспериментов по измерению соотношения HVe" в ячейку вносили 5 нмолей кислорода. Значения рН измеряли комбинированным рН-электродом Количество протонов, выделяемых суспензией клеток при пульсе 02, определяли, исходя из изменения рН при добавлении 20 нмоль HCI (из насыщенного аргоном раствора) к той же суспензии клеток. Все измерения проводили при рН 7,5

Выделение NQR из клеток V. harveyi. Клетки V harveyi разрушали на прессе Френча при 16 000 р s i Неразрушенные клетки отделяли от лизата центрифугированием при 22 500 g (10 мин) После этого СБЧ осаждали центрифугированием (200 000g, 75 мин), и полученный осадок суспендировали в среде 1 (100 мМ КС1, 0,05 мМ ЭДТА, 10 мМ трис-HCl, рН 7,5) СБЧ солюбилизировали 1% LDAO, и полученную смесь центрифугировали при 200 000g, 60 мин Полученный супернатант наносили на колонку (26 х 60 мм) с анионообменником Fractogel TSK DEAE-650(S), уравновешенную буфером 2 (100 мМ КС1, 0,05 мМ ЭДТА, 10 мМ трис-HCl, 0,1% LDAO, рН 7,5) Колонка промывалась буфером 2, а также буфером 2, содержащим 150 мМ КС1 Связанный с носителем NQR смывали с

колонки линейным градиентом КС1 (150-260 мМ) в буфере 2 Фракции, содержащие NQR, объединяли, разводили в полтора раза буфером 3(10 мМ трис-HCl, 0,05 мМ ЭДТА, 0,05% DM, рН 7,5) и наносили на колонку (16 х 80 мм) с носителем DEAE Sepharose CL-6B, уравновешенную буфером 3, содержащим 100 мМ КС1 Колонка промывалась тремя исключенными объемами этой среды Связанный с носителем NQR смывали с колонки буфером 3, содержащим 450 мМ КС1 Очищенный фермент концентрировали и наносили на градиент плотности сахарозы (8-18% в буфере 3 со 100 мМ КС1) в 12-мл центрифужных пробирках После центрифугирования (16 ч, 100 000 g) NQR обнаруживался в желтой полосе, находящейся в середине градиента Данную полосу разводили в буфере 3 со 100 мМ КС1, концентрировали, замораживали в жидком азоте и хранили при -70°С

Выделение рекомбинантного препарата NQR. Рекомбинантный NQR (NQR-his) был очищен с помощью аффинной хроматографии СБЧ из клеток V cholerae 0395N1-toxТ lac¿ Anqr / pLN52-hisl суспендировали в среде А (350 мМ КС1, 5 мМ имидазоя, 20 мМ трис-HCl, рН 8,0), солюбилизировали 1% DM и центрифугировали при 200 000 g, 60 мин Супернатант наносили на колонку с аффинным носителем Ni-NTA, уравновешенным буфером Б (среда А, содержащая 0,05% DM) Колонку последовательно промывали средой Б с 10 и 20 мМ имидазолом Связанный с носителем NQR-his смывали с колонки буфером Б, содержащим 100 мМ имидазол Активные фракции белка концентрировали и хранили при -70°С

Определение кофакторов NQR. Нековалентно связанные флавины экстрагировали из NQR 5% трифторуксусной кислотой Экстрагированные флавины разделяли с помощью ВЭЖХ на колонке с обращенной фазой "120-5C18AQ" (2 х 75 мм) за счет линейного градиента метанола (10-70%, 25 мин, 0,1 мл/мин) в 5 мМ MES-трис, рН 6,0 Выход флавинов с колонки определяли по поглощению при 360 нм Стандартные образцы FAD, FMN и рибофлавина в этих условиях сходили с колонки на 12,4, 14,0 и 15,1 минуте, соответственно

Ковалентно связанные флавины определяли, как описано в [Zhou et al, 1999] Хиноны определяли, как описано в [Shestopalov et al, 1997] В качестве стандарта Qg использовали экстракт хинонов из СБЧ A vinelandn

Получение NQR-содержащих протеолипосом. Протеолипосомы для изучения генерации ДЧ* получали, смешивая 1,74 мл буфера Г (100 мМ HEPES-Трис, 0,05 мМ ЭДТА, рН 6,5) с 0,26 мл 0,5 M раствора н-октилглюкозида и 20 мг фосфатидилхолина из сои (Type-2S) Смесь обрабатывали ультразвуком до полного растворения фосфолипвдов После этого, к раствору добавляли 0,7 нмоль NQR, и полученную смесь перемешивали в течение 30 мин при комнатной температуре Далее, к смеси добавляли «Bio-Beads» (540 мг) и инкубировали ее при перемешивании 3 часа После этого, раствор отделяли от Bio-Beads и центрифугировали его 90 мин при 127 000 g

Протеолипосомы, содержащие включенный пиранин, получали, как описано выше, за исключением того, что вместо буфера Г использовали буфер Д (100 мМ HEPES, 25 мМ NaOH, 25 мМ КОН, 0,7 мМ пиранин, 0,05 мМ ЭДТА, эту смесь титровали с помощью MES до рН 6,5) Полученные протеолипосомы дополнительно отмывались буфером Д без пиравина

Генерацию АЧ* протеолипосомами исследовали с помощью оксонола VI Образцы содержали 100 мМ HEPES-Трис (безнатриевая среда) или 100 мМ HEPES-NaOH (натриевая среда), рН 7,5, 5 мкг/мл оксонола VI, 100 мкМ Qi и протеолипосомы (28 мкг белка в мл) Эту смесь преинкубировали 5 мин до добавления субстратов Генерацию А4? определяли спектрофотометрически (двуволновое измерение оптической плотности при 625-587 нм) на спектрофотометре Shrmadzu UV-3000 Реакцию начинали добавлением NADH (0,4 мМ)

Генерацию АрН протеолипосомами исследовали за счет измерения флуоресценции включенного пиранина при 510 нм (возбуждение при 458 нм) на флуориметре Hitachi F-2000 Образцы содержали буфер Г без пиранина, 100 мкМ Qi и

протеолипосомы (5 мкг белка в мл) Эту смесь иреинкубировали 5 мин, после чего реакцию запускали добавкой NADH (0,4 мМ)

ЭПР-спектроскопия. Измерение ЭПР-слектров проводили на спектрометрах ESP-300 (Bruker) и Е-109Е (Vanan) при частоте модуляции 100 кГц Температура образца поддерживалась с помощью гелиевого криостата ESR 900 и контроллера температуры ITC4 (Oxford Instruments), либо с помощью азотного криостата. Количественная оценка ЭПР-сигаалов проводилась с помощью двойного интегрирования спектров, полученных при ненасыщающих мощностях, с использованием Weak Pitch (Vanan) в качестве стандарта.

Исследование быстрой кинетики восстановления NQR. Эксперименты по быстрому смешиванию проводили на "Stopped-flow spectrophotometer" (Umsoku Instruments), оснащенному детектором с диодной матрицей, способному определять оптические спектры с интервалами до 1 мс NQR (1-3 мг/мл) в буфере Е (100 мМ КС1, 10 мМ HEPES-Трис (рН 7,5), 0,1% DM) смешивался с буфером Е, содержащим 100 мкМ NADH и различные концентрации NaCl (0-120 мМ) Мертвое время смешивания составляло около 3 мс Эксперименты проводили при 3,5°С или при 25°С В отсутствии добавленного NaCl примесная концентрация ионов натрия в смеси составляла 20-40 мкМ

Спектры NQR и глюкозооксидазы (из Aspergillus mger, Sigma) определяли на спектрофотометрах Сагу 1С или Aminco DW-2000 Анаэробные образцы приготовляли на вакуумной линии, используя несколько циклов дегазации под вакуумом и насыщения аргоном Для создания нейтральной и анионной форм флавосемихинона FAD глюкозооксидазы, анаэробные образцы этого фермента были фотовосстановлены в присутствии ЭДТА при рН 5,8 и 10,2, соответственно [Massey and Palmer, 1966, Murataliev, 1999] Для полного восстановления FAD в глнжозооксидазе анаэробные образцы этого фермента смешивали с 10 мМ глюкозы В работе использовали следующие коэффициенты экстинкции для редокс-переходов в FAD глюкозооксидазы для FI—>РШг, S4¡o = 12,3 мМ'1 см"1, для F1H*-»F1H2, 8570 = 3,9 мМ"1 см"1, для F1-^F1*", S450 = 10,8 мМ"1 см'1 [Massey and Palmer, 1966, Stankovich et al, 1978]

Окислительно-восстановительное титрование NQR при варьировании соотношения NAI)H/NAB Образцы NQR в строго анаэробных условиях смешивали с анаэробными растворами NAD+ (0-10 мМ) и NADH (0,1-10 мМ) Для достижения высоких редокс-потенциалов очень низкое соотношение NADH/NAD+ забуферивалось парой лактат/пируват Для этого NQR смешивали с различными количествами лактата и пирувата (0,1-10 мМ пирувата и 0,1-10 мМ L-лактата) в присутствии NAD+ (5 мМ) и лактатдегидрогеназы (1 U) Во всех экспериментах использовали только трисовые соли NADH, NAD+, лактата и пирувата. В отсутствии добавленного NaCl примесные концентрации ионов натрия в смеси были < 30 мкМ

Спектроэлектрохимическое окислительно-восстановительное титрование NQR проводили при +21°С с использованием пропускающего свет тонкослойного электрода [Collins et al, 1993, Ellis et al, 1986, Arciero et al, 1994] Редокс-потенциал (от -400 до +140 мВ относительно СВЭ) устанавливали с помощью потенциостата PAR263A (Princeton Applied Research) с интервалами ±20 мВ Оптические спектры образцов снимали в диапазоне 350-770 нм Процесс достижения равновесия при каждом заданном потенциале контролировали по прекращению как электрического тока в ячейке, так и оптических изменений при 460 нм (20-35 мин на точку) Для ускорения редокс-обмена между электродом и NQR использовали следующий набор медиаторов гексааминорутений (Ет = +50 мВ), пентааминохлорорутений (Ет = -130 мВ) и метилвиологен (Бщ=-455 мВ) Значения Ещ медиаторов и их стабильность в используемой смеси проверялись с помощью циклической вольтамперометрии Дм спектроэлекгрохимических экспериментов образцы NQR промывались буфером Е (150 мМ КС1, 20 мМ HEPES-Трис, рН 7,5, 0,05% DM, 50 мкМ метилвиологен, 400 мкМ пентааминохлорорутений (Щ) хлорид и 200 мкМ гексааминорутений (III) хлорид) и концентрировались до » 50 мкМ NQR

23Na-iMP спектры определяли при 132,2 МГц на ЯМР-спектрометре Unity INOVA 500 (Varum) Время записи спада индукции составляло 50-250 мс, ширина спектра - 2-10 кГц Интервал между циклами составлял 100-500 мс Измерения проводили при 20°С в среде, содержащей 100 мМ КС1, 20 мМ Hepes-Трис (рН 7,5), 10% D20, 0,1% DM и различные концентрации NaCl и NQR Для восстановления фермента в пробы добавляли 5 мМ дитионит калия Дитионит калия получали, пропуская в анаэробных условиях 1 М раствор дитионита натрия через колонку с калиевой формой катионообменника Dowex 50 WX4

Концентрацию белка измеряли "бицинхониновым методом" как описано в [Smith et al, 1985], используя бычий сывороточный альбумин в качестве стандарта.

Концентрацию натрия определяли с помощью пламенной фотометрии

Клонирование и экспрессия оперона /i^rABCDEF из V. harveyi Оперон ngrABCDEF V harveyi с промотерной областью был амплифицирован с геномной ДНК методом ПЦР с "Long-reading" полимеразой (Силекс) и праймерами dirA 5'-AAACAGCATCAAAACCGGACACT и revF 5'-GCCATAGATTCAATCACTTGCGG Амплифицированный фрагмент (~6 кбп) был клонирован в вектор pGEM-T с получением плазмиды pLN52 Эта плазмида использовалась в качестве матрицы для следующей ПЦР с парой праймеров nqrAdir 5' -С AAGTGCccATgGTTAC ААТА и nqrFrev 5'-CACTTGCGGGaATTcACC. содержащих сайты рестрикции для Nco\ и ЕсоШ, соответственно Полученный ПЦР-продукт был клонирован в вектор pBAD/Afye-HisC между его Ncol и iieoRI сайтами с получением плазмиды pBAD/nqr4, несущей оперон nqr (под контролем арабинозного промотера) с гастидиновой ручкой, пришитой к С-концу субъединицы NqrF Данная плазмида была обработана рестриктазами Kpnl и Sspl Фрагмент размером 2,6 кбп, содержащий часть nqr оперона с nqrV His-tag, был вставлен в плазмиду pLN52 между сайтами Kpnl и Sail вместо исходной части оперона nqr Данная процедура привела к клонированию nqr оперона с модифицированным гистагом nqr¥ геном под контролем собственного промотера (плазмида pLN52-hisl). Полученная плазмида была внесена в клетки V cholerae 0395Nl-foxr lacZ Anqr [Barquera et al, 2002] с помощью электропорадии

Конструирование штамма К. pneumoniae с нарушенным синтезом NDH-1. Амплификацию фрагмента пиоА-С К. pneumoniae проводили методом ПЦР с Taq полимеразой и праймерами nuoA 5'- GAGGGTTTTGGCGCTACAC и nuoC 5'-GCCACCTTGAGCATGATGT Амплифицированный 1,6 кбп фрагмент был клонирован в вектор pGEM-T Кассета устойчивости к хлорамфениколу была вставлена между двумя сайгами рестрикции для Ehel, и была отобрана конструкция (плазмида pGnuoCm2) с одинаковым направлением транскрипции фрагмента пиоА-С и кассеты устойчивости Фрагмент пиоА-С Cm из плазмиды pGnuoCm2 был субклонирован в суицидальный вектор pKNOCK-Tc [Alexeyev, 1999] с получением плазмиды pKnuoCm405 Далее, клетки К pneumoniae трансформировали плазмидой рКтооСт405 с помощью электропорадии и отбирали Tcs CmR клон (KNU210) с инактивацией пио генов за счет события двойного кроссинговера

Конструирование штамма К. pneumoniae с нарушенным синтезом NQR.

Амплификацию фрагмента nqrAB К pneumoniae проводили методом ПЦР с Taq полимеразой и праймерами nqrA 5'- CTGAGCAGCCCGGCAAATGAC и nqrB 5'-CGGCGTGTAGAAGATGGTCG Амплифицированный 1,9 кбп фрагмент был клонирован в вектор pGEM-T Кассета устойчивости к канамицину была вставлена в SrnaX сайт этой конструкции, и была отобрана плазмида (pGnqrKml) с одинаковым направлением транскрипции фрагмента nqrAB и кассеты устойчивости Фрагмент nqrAB Km из pGnqrKml был субклонирован в суицидальный вектор pKNOCK-Tc с получением плазмиды pKnqrKm7 Эту плазмиду переносили в клетки К. pneumoniae R150 с помощью конъюгации с использованием штамма Е coh SMIOApir в качестве донора. Был отобран Tcs KmR RJ* клон К. pneumoniae (KNQ197) с инактивацией nqr генов за счет события двойного кроссинговера Эта же самая процедура была проделана и со штаммом К

pneumoniae KNU210 с получением двойного пиоВ Cm nqrA Km мутантного штамма KNN002 Правильность локализации различных мутаций в хромосоме К. pneumoniae проверяли с помощью ПЦР-анализа

Клонирование полного ngrrABCDEF оперона К. pneumoniae. Амплификацию /jgMBCDEF оперона К pneumoniae проводили методом ПЦР с "Long-readmg" полимеразой (Силекс) и праймерами nqrA (см выше) и nqrF 5'-CAAAACCGAAGCAGCTGACCCG Амплифицировавный 6,7 кбп фрагмент был клонирован в вектор pGEM-T с получением плазмиды pG53

Растительный материал. Соцветия Arum orientale (в поздней у- или ранней 8-стадиях как описано ранее [James and Beevers, 1950]) и клубни этого растения собирали в Главном ботаническом саду им HB Цицина (Москва) Цветущие женские соцветия кукурузы собирали в Рамонском районе Воронежской области

Выделение митохондрий. Митохондрии из тканей растений выделяли с использованием метода центрифугирования в градиенте перколла как описано в [Wagner and Moore, 1997, Popov et al, 2002]

Измерение активностей дыхательной цепи растительных митохондрий. Окисление NADH, NADPH и dNADH измеряли при 30°С на спектрофотометре Hitachi-557 при 340 нм Во всех случаях использовали миллимолярный коэффициент поглощения Б340, равный 6,22 мМ"1 см'1

Окисление «внешнего» NAD(P)H измеряли в среде Л, содержащей 0,5 мкМ СССР и 0,12 мМ NADH или NADPH Реакцию начинали добавлением 1 мМ СаСЬ для активации внешних НАЛ(Р)Н-дегидрогеназ [Svensson and Rasmusson, 2001]

Окисление «внутримитохондриального» (d)NADH измеряли в среде Л (в присутствии 0,2 мМ ЭГТА для ингибирования внешних КАО(Р)Н-дегидрогеназ), содержащей 0,12 мМ NADH или dNADH Реакцию начинали добавлением 40 мкг/мл аламетицина (для пермеабилизации митохондриальных мембран) как описано ранее [Gnvenmkova et al, 2001]

Вклад цитохром с-оксидазы в общее дыхание митохондрий нетермогенных тканей определяли по степени ингибирования NADH-оксидазной активности 1 мМ цианидом В случае митохондрий из початка A orientale ингибирование цианидом проводили в присутствии 1 мМ SHAM Суммарное ингибирование окисления NADH в присутствии 1 мМ SHAM и 1 мМ цианида во всех случаях превышало 95% исходной активности

РЕЗУЛЬТАТЫ

Определение стехиометрии Na+/e" для №+-транелоцирующей NADH:xhhoh оксидоредуктазы из Vibrio algmofyticus.

Целью данной части работы было определение соотношения Na+/e" для Na+-транслоцирующей NADH хинон оксидоредуктазы (NQR), знание которого необходимо для дальнейшего изучения механизма генерации A JÍ Na+ этим ферментом

Ранее [Tokuda and Unemoto, 1982, 1984] было показано, что добавление О2 к анаэробной клеточной суспензии V algmofyticus в присутствии лротонофора приводит к защелачиванию среды измерения Было продемонстрировано, что этот процесс связан с №+-транслоцирукяцей активностью NQR Так как у данного микроорганизма генерируется не только за счет трансмембранного транспорта протона, но и за счет экспорта иона натрия, то добавление протонофора приводит к возникновению потока Н1", направленного внутрь клетки Эти наблюдения легли в основу разработанного нами

метода определения стехиометрии Ь'а'/е" для первичных натриевых помп по измерению величины АрН в ответ на пульс О2 Суть метода заключается в том, что когда в экспериментальной системе Н*" является основным ионом, способным свободно проникать через мембрану, количество поглощенных из среды измерения протонов в ответ на внесение Ог должно быть эквивалентно количеству перенесенных через мембрану ионов натрия Таким образом, измеряя количество протонов, перенесенных внутрь клеток V а^то!уПсш при пульсе О2, можно судить о величине соотношения Ка+/е" для N<311 Для предотвращения диссипации ДЧР, генерируемой N(^11, потоком каких-либо других, отличных от протона ионов, из среды измерения были исключены ионы калия и хлора Кроме того, в клетках V а^то1уйсш была произведена замена цитоплазматического К+ на

Как видно на рис 1, пульс Ог в присутствии проникающего катиона ТРР+ приводит к закислению среды измерения за счет протон-транслоцирующей активности ферментов терминального участка дыхательной цепи V а1&по1уйси$ В то же время, при добавлении кислорода в присутствии протонофора СССР наблюдается противоположный

эффект, а именно защелачивание внешней среды Данное

защелачивание достигало максимального значения при концентрациях протонофора, равных 10-20 мкМ, при этом величина Н7е" составляла -0,71 ±0,06 Важно отметить, что скорость возврата протонов в среду измерения была относительно мала, несмотря на высокую протонную проницаемость мембраны клеток V а1&по1уШш в присутствии СССР Такая низкая скорость рассеивания АрН объясняется генерацией А*Р при СССР-зависимом транспорте протонов Так как скорость рассеивания данного трансмембранного электрического потенциала низка, то это означает, что в нашей системе протон является единственным ионом, способным быстро проникать через цитоплазматическую мембрану Поскольку количество перенесенных в цитоплазму V а1&по1уПсш ионов Н* должно быть эквивалентно количеству перенесенных в среду измерения ионов натрия, то измеряемое соотношение Ма+/е" для КОЛ также » 0,71 Следует отметить, что при использовании описанного выше метода определения стехиометрии №+/е" нет необходимости делать

1,25 Н7е rv

1,00 /

0,75

0,50 0,25 Ch ■ \ *—-----

0,00 \ / T?P++ СССР

-0,25 \ СССР

-0,50 -

-10 0 10 20 30 40 Время, сек

Рисунок 1. Соотношение Н7е" при пульсе кислорода на клетках V aJgmofyticus Добавки 5 мМ ТРР+, 15 мкМ СССР

поправку на вклад протон-транслоцирующей активности ферментов дыхательной цепи, так как все ионы Н+, перенесенные во время кислородного пульса во внешнюю среду, тотчас возвращаются в цитоплазму под действием протонофора Так, при пульсе кислорода в присутствии ТРР+ и СССР не наблюдается какого-либо изменения рН среды измерения (рис 1)

Измеряемое соотношение Na+/e" значительно уменьшалось в присутствии низких концентраций HQNO (специфического ингибитора NQR), а также при замене субстрата дыхания с глицерина на лактат (такая замена приводит к преимущественной работе дыхательной цепи в обход NQR посредством мембрансвязанной лактатдегидрогеназы, восстанавливающей убихинон без участия NAD"*) Это свидетельствует о том, что NQR является основным или даже единственным ферментом V algmolyticus, транслоцирующим Na+ в условиях эксперимента В то же время, измеряемая в тех же условиях в отсутствие СССР протон-переносящая активность дыхательной цепи V alginolyticus практически полностью устойчива к используемым концентрациям HQNO, что говорит о специфическом действии этого ингибитора на NQR Также не наблюдалось каких-либо изменений рН при пульсе Ог в присутствии СССР, если использовались клетки мутантного штамма V alginolyticus с нарушенным синтезом NQR В то же время, ТРР+-зависимый выброс Н+ в отсутствии СССР у клеток мутантного штамма не отличался от клеток штамма дикого типа

Измерения дыхания показали, что низкие концентрации HQNO снижают скорость дыхания клеток дикого типа примерно на 70% Для достижения дальнейшего ингибирования требовались намного более высокие концентрации HQNO В то же время, дыхание клеток штамма V alginolyticus с нарушенным синтезом NQR было устойчивым к действию низких концентраций HQNO.

Итак, нами измерено соотношение Na+/e" для NQR порядка 0,7 Данное измеряемое значение должно быть меньше, чем истинная стехиометрия NQR, за счет участия NDH-2 и других несопряженных первичных дегидрогеназ дыхательной цепи V alginolyticus в процессе восстановления хинона при пульсе О2 Вклад этих ферментов, согласно данным по ингибированию дыхания клеток V alginolyticus в присутствии HQNO, должен составлять около 30% Таким образом, полученные результаты позволяют предположить, что соотношение Na+/e" для NQR из V alginolyticus равно 1

Выделение NQR из клеток V. harveyi и изучение фермента в реконструированной системе

В ходе наших работ разработана методика выделения NQR, включающая в себя экстракцию фермента детергентами LDAO или Liponox-DCH, последующее разделение

белков с помощью хроматографии на анионообменниках "Fractogel ТЯК ОЕАЕ-650(8)" и "БЕАЕ БерЬагоэе СЬ-6В" и дополнительную очистку фермента с использованием центрифугирования в градиенте плотности сахарозы (см "Материалы и Методы") Выделенный фермент способен использовать менадион в качестве акцептора электронов и МАПН или (ШАБН (но не ЫАПРН) в качестве доноров электронов Кажущаяся Км для ЫАОН составляла 29,7 мкМ, а для с1КАОН - 80 мкМ Препараты N($1 также были способны восстанавливать СЬ Данная реакция ускорялась при повышении концентрации ионов натрия и была чувствительна к низким концентрациям Н(2НО с 1о 5 = 0,15 мкМ

Определение кофакторов NQR При изучении выделенного фермента было показано, что он содержит следующий набор простетических групп один 2Ре-28 кластер, один нековалентно связанный РАО, два ковалентно связанных остатка БМИ, а также, по-видимому, один прочно связанный убихинон-8 Получены данные, указывающие на то, что присутствие рибофлавина в экстракте N0®, скорее всего, объясняется частичным гидролизом фосфоэфирной связи остатков БЫК либо при функционировании белка, либо во время процедуры экстракции флавинов

Изучение N(211 в реконструированной системе N<311 был встроен в липосомы с использованием детергента н-октилглкжозида и детергент-связывающего носителя Вю-Веаск Полученные протеолипосомы были использованы для изучения генерации ферментом Д*Р и ДрН При осуществлении ИАОН СЬ оксидоредуктазной реакции в натрий-содержащих средах происходило изменение поглощения оксонола VI, что указывает на генерацию Д1Р (положительный заряд внутри протеолипосом) Генерация потенциала прекращалась через ~30 с после добавки ИАОН из-за исчерпания этого субстрата Генерация ДЧ1 стимулировалась моненсином, незначительно ингибировалась протонофором СССР и полностью предотвращалась натриевым ионофором ЕТН-157 или комбинацией СССР + нигерицин Генерация АЧ/ не наблюдалась в средах, не содержащих ионов натрия Эти данные показывают, что N<311 из V Ыпеуг является электрогенной первичной натриевой помпой, а также то, что этот фермент не способен использовать протоны вместо

Генерация ДрН протеолипосомами была исследована с помощью измерения флуоресценции заключенного в протеолипосомы пиранина. В ходе 1МАОН 01 оксидоредуктазной реакции наблюдалось образование ДрН (защелачивание среды внутри протеолипосом, рис 2) Данный процесс стимулировался протонофором СССР, уменьшался в присутствии валиномицина и полностью предотвращался натриевым ионофором ЕТН-157, комбинацией СССР + нигерицин, аламетицином или грамицидином В Наблюдаемое защелачивание среды внутри протеолипосом могло осуществляться

двумя разными механизмами (1) электрофоретическим потоком протонов внутрь липосом под действием электрического потенциала, генерируемым N(211, и(или) (2) поглощением протонов в процессе образования убихинола из убихинона Последний процесс мог бы быть обнаружен только в том случае, если протоны поглощаются из внутренней среды протеолипосом, что соответствует бактериальной периплазме Если генерация ДрН вызвана электрофоретическим током протонов, то она должна стимулироваться протонофорами и полностью ингибироваться натриевым ионофором Если же генерация ДрН вызвана транспортом протонов для образования убихинола, то этот процесс должен быть частично чувствительным к протонофорам и устойчивым к действию натриевого ионофора Так как наблюдаемая генерация ДрН увеличивалась в присутствии СССР (рис 2) и предотвращалась в присутствии натриевого ионофора ЕТН-157 (рис 2), то можно заключить, что этот процесс вызван только электрофоретическим потоком протонов внутрь липосом Эти данные также означают, что необходимые для образования убихинола протоны поглощаются ферментом с внешней стороны протеолипосом, что соответствует бактериальной цитоплазме

грамицидин

грамицидин

2 мин валиномицин

СССР+ нигерицин

грамицидин

СССР

као:

ЕТН 157

ЫАЭН

грамицидин

1МА1)Н грамицидин

аламетицин

КА1)Н грамицидин

Рисунок 2. Генерация ДрН реконструированным N<211, исследованная по измерению флуоресценции включенного пиранина (увеличение флуоресценции соответствует защелачиванию среды внутри липосом) Добавки (обозначены стрелками) грамицидин И 1 мкг/мл, СССР 1 мкМ, валиномицин 1 мкМ, ЕТН-157 5 мкМ, нигерицин 0,5 мкМ, аламетицин 5 мкг/мл

Изучение N<211 методами ЭПР- и оптической спектроскопии.

Изучение N(¿11 с помощью ЭПР-спектроскопии Прежде всего, выделенный фермент был исследован методом ЭПР Было обнаружено, что восстановленные при помощи ИАПН препараты N<311 при 45 К демонстрируют два ЭПР-сигнала с £=2,00 и ^1,94 Сигнал в

области g = 1,94 оказался типичным для железо-серных кластеров [2Ре-28]-типа (рис 3 А_Ь) Исследования при более низких температурах (вплоть до 5 К), а также восстановление белка с помощью дитионита не выявили каких-либо дополнительных ЭПР-сигналов

Рисунок 3. ЭЛР-спектры N0®. Условия ЭПР (А) частота 9,421 ГГц, мощность 2 мВт, температура 45 К, амплитуда модуляции 7,89 Г, (Б) частота 9,15 ГГц, мощность 100 мкВт, температура -40°С, амплитуда модуляции 2 Г

Особое внимание было уделено ЭПР сигналу при g = 2,00 Характерное значение g для этой линии, ее свойства насыщения, а также температурная зависимость указывают на радикальную природу данного сигнала Данный радикал присутствовал в белке при всех исследованных окислительно-восстановительных условиях Так, этот сигнал детектировался в окисленном воздухом препарате фермента (рис 3 А_а), при инкубации NQR с феррицианидом или гексааминорутением (Ш), а также при восстановлении белка с помощью NADH или дитионита (рис 3 А_Ьс) Концентрация спина в радикальном сигнале в случае окисленного NQR была такой же, как и в белке, восстановленном при помощи дитионита (рис 3 Б) Также, концентрация спина в радикальном сигнале не изменялась в зависимости от метода приготовления пробы, в разных препаратах белка (в том числе и с различной степенью очистки), и всегда наблюдалась в стехиометрии 1 1 по отношению к концентрации спина в сигнале от полностью восстановленного 2Fe-2S кластера (3,5 нмоля спина на мг NQR, т е около 0,9 моля спина на моль нековалентно связанного FAD) Таким образом, наблюдаемый радикальный сигнал нельзя объяснить за счет какой-то примеси или за счет окисления фермента в процессе его выделения или при подготовке пробы Радикал в NQR мог быть восстановлен дитионитом только после денатурации белка за счет его обработки 3 М гуанидинхлоридом

Все описанные выше окислительно-восстановительные свойства радикала NQR, возможно, указывают на его недоступность к действию редокс-медиаторов Однако,

несмотря на кажущуюся полную окислительно-восстановительную стабильность радикала NQR, все же были обнаружены небольшие редокс-зависимые изменения в ширине линии и в свойствах насыщения этого сигнала А именно, в восстановленном ферменте радикальный сигнал насыщался при меньших мощностях (Рш для радикального сигнала в восстановленной и в окисленной формах NQR была равна 0,13 мВт и 0,36 мВт, соответственно) Также, радикальный сигнал был более узким в восстановленном белке по сравнению с окисленной формой NQR (полуширина этих линий составляла 14 Гаусс и 19 Гаусс для восстановленного и окисленного фермента, соответственно (рис 3 Б)) Важно отметить, что данные значения полуширины линии радикального сигнала типичны для флавиновых радикалов [Palmer et al, 1971] Более того, линия с полушириной в 19 Г характерна для нейтрального, а линия в 14 Г - для анионного флавосемихинона. Таким образом, можно предположить, что окисленная форма NQR содержит нейтральный флавосемихинон, тогда как восстановленный белок - анионный флавосемихинон

Дшшавалны,нм Длина волны, нм

Рисунок 4. Оптические спектры NQR. (А) Абсолютные спектры окисленной и восстановленной форм NQR (Б) Разностный восстановленный минус окисленный спектр NQR Вставка на рис (Б) показывает оптические изменения в диапазоне 550-700 нм в увеличенном виде

Оптические свойства NQR. Для проверки этого предположения были исследованы

изменения оптического спектра NQR при восстановлении этого белка Нейтральный

радикал флавина имеет очень характерный оптический спектр с длинноволновыми пиками

около 580 и 625 нм, отсутствующими в спектрах полностью восстановленного флавина и

анионного флавосемихинона [Massey and Palmer, 1966] Таким образом, если окисленная,

но не восстановленная форма NQR содержит нейтральный флавосемихинон, то

восстановленный минус окисленный спектр этого белка должен содержать провал в

области 550-650 нм с характерными минимумами около 580 и 625 нм Оптические спектры

окисленной и восстановленной форм NQR представлены на рис 4 Восстановленный

минус окисленный спектр содержит два основных провала при 464 нм и 395 нм (те

спектральные изменения, типичные для процесса восстановления связанных с белком

флавинов) Наряду с описанными выше основными спектральными изменениями, восстановление белка также приводило к уменьшению поглощения в области 550-650 нм с минимумами при 578 и 629 нм

Это наблюдение подтверждает гипотезу о присутствии нейтрального флавосемихинона в окисленном N(211 и исчезновении этого радикала при восстановлении белка Данные ЭПР (рис 3) также указывали на возможность присутствия в восстановленном N<211 анионной формы флавосемихинона Возможны по крайней мере два варианта объяснения этих наблюдений (1) при восстановлении белка изменяется значение рК нейтрального флавосемихинона и происходит его диссоциация с образованием анионной формы флавосемихинона (ГШ* —> + Н+), (2) восстановление N<311 включает в себя одно-электронное восстановление нейтрального флавосемихинона (Р1Н"->ИН2), а также одно-электронное восстановление другого, полностью окисленного флавина с формированием анионного флавосемихинона (Р1->РГ~) Для проверки справедливости этих моделей была исследована кинетика восстановления N011 в присутствии NADH с помощью метода остановленной струи

Изучение кинетики восстановления N(¿11 с использованием метода остановленной струи.

Рисунок 5. Кинетика восстановления N<211 в присутствии ИАВН при 3,5°С, измеренная при 462 минус 535 нм Кинетические фазы отмечены цифрами I, II и Ш Окончательные оптические изменения при полном восстановлении фермента (после 10 сек) были одинаковыми как при высокой (25 мМ), так и при низкой (30 мкМ) концентрации Момент добавления МАБН ^ = 0 с) отмечен стрелкой

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 Время, секунды

Кинетика восстановления фермента была изучена с помощью быстрого смешивания N(211 с NADH и последующим измерением спектров полученной смеси с временными интервалами в 1 мс Для исследования зависимости этого процесса от концентрации ионов натрия в раствор NADH до смешивания добавляли различные количества №С1 В присутствии высоких концентраций Ка+ восстановление фермента было очень быстрым В

I .... I .... I

то же время, в отсутствии добавленного №С1 (примесные концентрации Ыа+ в среде составляли около 30 мкМ) восстановление N<311 значительно замедлялось и могло быть разделено на три кинетические фазы (рис 5) С помощью глобального мульти-экспоненциального анализа были определены оптические спектры этих трех кинетических фаз (рис 6) Было важно установить, какие окислительно-восстановительные переходы входят в состав различных кинетических фаз восстановления N(2 Я. Для этого нами были получены модельные спектры всех возможных редокс-переходов в флавинах (те Р1->Р1Н2, И-^Г, Р1->ИН*, И--»Р1Н2 и Р11Г-»ИН2, см также рис 19) с помощью фотовосстановления глюкозооксидазы, и данные модельные спектры были сравнены с полученными спектрами описанных выше кинетических фаз

Рисунок б. Спектры кинетических фаз восстановления NQR в сравнении с модельными спектрами различных редокс-переходов в FAD глюкозооксидазы (А) спектр фазы I (сплошная линия) и спектр двух-электронного восстановления флавина (3,4 мкМ, пунктир) (Б) спектр фазы П (сплошная линия) в сравнении со спектром одно-электронного восстановления нейтрального флавосемихинона (4,2 мкМ, пунктир) (В) спектр фазы Ш (сплошная линия) и спектр одно-электронного восстановления флавина с образованием анионного радикала (3,9 мкМ, пунктир)

Как видно на рис 5, скорость фазы I очень высока (~150 с"1 при 3,5°С, рН 7,5), и не зависит от концентрации Na+ Для определения спектра этой фазы реакция была проведена при рН 5,5 и 3,5°С, где ее скорость снижается до 40 с"1. На рис 6 А спектр этой фазы приведен в сравнении со спектром двух-электронного восстановления FAD (Fl-^Ffflb) Как видно, эти спектры очень похожи, за исключением длинноволнового сдвига спектра кинетической фазы Таким образом, мы можем заключить, что кинетическая фаза I представляет собой процесс двух-электронного восстановления флавинового кофактора NQR

Константа скорости фазы П увеличивалась при повышении [Na4] с 5 с"1 при 30 мкМ Na+ до 69 с"1 при 25 мМ Na+ (рис 5) Спектр этой фазы представлен на рис 6 Б Как было упомянуто ранее, провалы при 580 и 625 нм характерны для исчезновения нейтрального флавосемихинона Как видно на рис 6 Б, оптический спектр фазы П близок к модельному спектру одноэлектронного восстановления нейтрального флавосемихинона до полностью восстановленной формы флавина (F1H*->F1H2) Небольшая разница между этими двумя

спектрами при 520 нм может быть объяснена длинноволновым сдвигом в спектре флавина NQR по сравнению с флавином глюкозооксидазы Таким образом, мы можем предположить, что кинетическая фаза П представляет собой процесс одноэлектронного восстановления присутствующего в исходном препарате NQR нейтрального флавосемихинона

Как видно на рис 5, скорость фазы III исключительно чувствительна к [Na4] (0,8 с"1 при 30 мкМ Na+ по сравнению с 33 с"1 при 25 мМ Na+ (3,5°С)) Спектр этой фазы демонстрирует провалы при 460-465 нм и при 395 нм и не содержит каких-либо оптических изменений при длинах волн, превышающих 550 нм Как видно на рис 6 В, спектр фазы Ш очень похож на модельный оптический спектр перехода F1->F1*~ в глюкозооксидазе, с единственным отличием, заключающимся в 5 нм красном сдвиге спектра кинетической фазы Таким образом, мы можем заключить, что кинетическая фаза III представляет собой процесс одно-электронного восстановления окисленного флавина NQR с образованием анионного флавосемихинона

Итак, процесс восстановления NQR состоит из трех кинетических фаз, каждая из которых представляет собой восстановление одного из трех различных флавиновых кофакторов этого фермента (Fl—»FIH2, F1H*-»F1H2 и F1-»F1*~) Используя значения коэффициентов экстинкции для различных редокс-переходов в флавине глюкозооксидазы [Massey and Palmer, 1966, Stankovich et al, 1978], можно заключить (см рис 6), что кинетические фазы восстановления NQR протекают с молярным соотношением 0,7 0,9 0,8 в пересчете на моль нековалентно связанного FAD То есть, соотношение этих фаз близко к стехиометрии 1 1 1, и каждая фаза соответствует восстановлению одного моля флавина на моль NQR Небольшое отличие от точного соотношения 111 может быть обменено отличием коэффициентов экстинкции флавинов в NQR по сравнению с глюкозооксидазой

Полученные данные также подтверждают предположение, что при восстановлении NQR, присутствующий в выделенном белке нейтральный флавосемихинон восстанавливается до FIH2, а восстановление другого (окисленного) флавинового кофактора приводит к образованию анионного флавосемихинона Важно отметить, что восстановление F1H* и образование Fl*" происходит в разных кинетических фазах Также, нейтральный флавосемихинон переходит в полностью восстановленную форму флавина, тогда как анионный флавосемихинон образуется из окисленного флавина Эти данные указывают на то, что разные радикалы NQR стабилизированы на разных флавиновых кофакторах этого фермента

Зависимость скорости восстановления NQR от концентрации ионов натрия Как было отмечено выше, скорость кинетических фаз П и III процесса восстановления NQR в присутствии NADH значительно ускоряются при увеличении [Na4] (рис 5) При 25°С

константа скорости фазы 1П увеличивается с 4-6 с"1 при 25 мкМ [Ка+] до 250 с"1 при 50 мМ [Ыа+] Зависимость константы скорости этой фазы от концентрации ионов натрия представляет собой гиперболу (рис 7 А) с константой активации ионами натрия, равной 3,4+0,6 мМ Это значение близко к значениям кажущихся констант Михаэлиса (Км) по ионам натрия для ЫЛПН <31 оксидоредуктазной реакции, катализируемой выделенным N<211 (Км - 3,3+0,4 мМ, рис 7 Б), а также для ¿ИАОН-оксидазной реакции,

Рисунок 7. Зависимость скорости (А) третьей фазы восстановления N(211 в присутствии ИАОН и (Б) СЬ-редукгазной активности фермента от концентрации Иа+

Редокс-титрование ^+-транслоцирующей КАОН:хинон оксидоредуктазы.

Окислительно-восстановительное титрование NQR Титрование проводили с помощью спектроэлектрохимического метода в диапазоне потенциалов от —400 мВ до +140 мВ как в восстановительном, так и в окислительном направлениях Спектральные изменения в белке при окислительном и восстановительном титрованиях практически не отличались друг от друга, гистерезис для всех переходов не превышал 20 мВ Для анализа титрования использовали данные, представляющие собой среднее арифметическое из оптической плотности в точках с одинаковым редокс-потенциалом при окислительном и восстановительном титрованиях

На рис 8 приведены спектральные изменения в N<311 в ходе его редокс титрования при рН 7,5 и в присутствии 50 мМ Во всех случаях уменьшение редокс-потенциала сопровождалось уменьшением поглощения исследуемой смеси Титрование в более широком диапазоне редокс-потенциалов не приводило к появлению дополнительных спектральных изменений в исследуемом белке Анализ производной зависимости оптических изменений от потенциала во всем использованном диапазоне длин волн выявил четыре различных пика, относящихся к четырем различным процессам окисления-восстановления N011. Один острый пик соответствовал двух-электронному переходу, а три более пологих пика - одно-электронным процессам Для иллюстрации этого на рис 9

приведена зависимость оптических изменений при 460 нм от величины редокс-потенциала (те при длине волны, где максимален вклад в поглощение полностью окисленных флавинов) Как видно, на этой длине волны наблюдается два основных процесса - один двух-электронный переход с Ет « -200 мВ и один одноэлектронный переход с Ет « -150 мВ Кривая титрования при 515 нм (где максимален вклад восстановления F1H* и 2Fe-2S-кластера) содержит два дополнительных одно-электронных перехода с Ет около -270 мВ и

Длина волны, нм

Рисунок 8. Разностные (окисленные минус восстановленные) спектры НСЖ-Ьщ, полученные в ходе редокс-титрования фермента в диапазоне потенциалов от +140 до —400 мВ Спектр при потенциале +140 мВ использовался в качестве спектра окисленного фермента В ходе всего титрования восстановление N(211 приводило к уменьшению оптической плотности

Таким образом, при анализе полученной в ходе титрования матрицы данных использовали ее разложение на четыре компонента, соответствующих одному двух-электронному и трем одно-электронным процессам С помощью этого подхода были получены спектры всех редокс-переходов в N<311 (см рис 10), а также определены их значения Ет Как видно на рис 9, используемая модель довольно хорошо описывает кривые титрования N(311 на разных длинах волн (соответствие экспериментальным точкам сплошных линий, являющихся результатом решения разложения матрицы данных на компоненты) Также важно отметить, что сумма спектров всех определенных модельных компонент соответствовала экспериментально-определенному изменению спектра N(31*. при его полном восстановлении Таким образом, выбранная модель из четырех компонент очень хорошо описывает процесс титрования N(211, что означает, что в этом белке

отсутствуют какие-либо другие оптически-детектируемые окислительно-восстановительные переходы

О

• ^460-770

-0.02

о

-0.06

-0.08

-0.035

-400 -300 -200 -100 0 100 Редокс-потснциал, мВ

Рисунок 9. Окислительно-восстановительное титрование препарата NQR-his при 460 нм (•) и при 515 нм (■) Сплошные линии представляют собой сумму четырех теоретических кривых титрования с параметрами, полученным в ходе обработки экспериментальных данных (см текст)

Анализ компонент редокс-титровант NQR Как видно на рис 10 А, спектр наиболее высокопотенциального перехода (+16 мВ) демонстрирует характерные оптические изменения при 510, 575 и 625 нм, и он близок к спектру выявленного нами ранее в NQR Ка+-зависимого процесса восстановления нейтрального флавосемихинона до полностью восстановленной формы флавина (см выше) Таким образом, мы можем описать эту компоненту, как процесс F1H*-»F1H2, что также хорошо согласуется с одноэлектронным характером этой фазы титрования

Как видно на рис 10 В, спектр следующей компоненты характеризуется максимальным провалом при 458 нм с сопутствующими ему небольшими пиками при 370, 400 и 515 нм Этот спектр практически идентичен определенному нами ранее в NQR спектру №+-зависимого процесса восстановления окисленного флавина до анионного флавосемихинона (см выше), а также модельному спектру перехода Fl-^Fl*-, полученному с помощью фотовосстановления глюкозооксидазы Таким образом, компоненту с Ет— -155 мВ (п=1) мы можем описать как процесс F1->F1"~, что опять же хорошо согласуется с одноэлектронным характером титрования этой фазы

Как видно на рис 10 С, спектр следующей компоненты демонстрирует два провала при 380 и 450 нм с характерным плечом при 470 нм Этот спектр очень похож на определенный нами ранее в NQR спектр Ма+-независимого процесса восстановления окисленного флавина до полностью восстановленного флавина, а также модельному спектру перехода Fl—»FIH2, полученному с помощью восстановления глюкозооксидазы

Таким образом, компоненту с Ет~ -209 мВ (п=2) мы можем описать как процесс Р1->Р1Нг, что снова хорошо согласуется с двух-электронным характером этой фазы

Рисунок 10. Спектры компонент окислительно-восстановительного тшрования NQR-his в сравнении с модельными спектрами различных редокс-переходов в флавинах и спектром восстановления [2Fe-2S]-кластера

(A) спектр компоненты с Ет= +16 мВ и п=1 (сплошная линия) в сравнении со спектром одно-электронного восстановления нейтрального флавосемихинона в NQR (пунктир)

(B) спектр компоненты с Ет= —155 мВ и п=1 (сплошная линия) в сравнении со спектром одно-электронного восстановления флавина с образованием анионного флавосемихинона (пунктир)

(C) спектр компоненты с -209 мВ и п-2 (сплошная линия) в сравнении со спектром двух-электронного восстановления флавина (пунктир)

(D) спектр компоненты с Ет= -212 мВ и п=1 (сплошная линия) в сравнении со спектром восстановления ферредоксина из листьев шпината (пунктир)

400 500 600 700

Длина волны, нм

На рис 10 D представлен спектр самой низкопотенциальной компоненты титрования NQR (Ет= -272 мВ, п=1) Этот спектр демонстрирует два провала в области 395 и 480 нм, последний провал имеет шлейф в длинноволновой части спектра Скорее всего, данная компонента может быть связана с процессом восстановления 2Fe-2S-кластера Это предположение подтверждается совпадением редокс-потенциала данной компоненты со значением Ет 2Fe-2S-raacTepa NQR, измеренного нами с использованием ЭПР-спектроскошш (см ниже) Однако спектр этой компоненты в коротковолновой части значительно отличается от модельного спектра восстановления 2Fe-2S-joiacTepa в растительном ферредоксине Данное отличие спектра этой компоненты от модельного спектра восстановления 2Fe-2S-KiiacTepa, возможно, связано с тем, что восстановление 2Fe-2S-icnacTepa в NQR сопровождается спектральным сдвигом в каком-то из флавинов

этого фермента, что приводит к существенным изменениям в финальном спектре восстановления кластера

Таким образом, редоке-титрование NQR выявляет в ферменте четыре редокс-перехода, связанных с восстановлением четырех простетических групп этого белка - трех флавиновых кофакторов и одного Fe-S-кластера Используя известные коэффициенты экстинкции для различных окислительно-восстановительных переходов в FAD глюкозооксидазы, было определено относительное количество каждой из флавиновых компонент редокс-титрования NQR Концентрация компонент F1-»F1H2, F1->F1*~ и FlH*-»-FlH2 в случае нашего эксперимента составляла соответственно 49,43 и 42 мкМ, что очень близко к ожидаемой стехиометрии между ними, равной 111 Небольшое отличие от точного соотношения 111 может быть объяснено отличием коэффициентов экстинкции флавинов в NQR по сравнению с FAD глюкозооксидазы

Наряду с рекомбинантным препаратом фермента (NQR-bis) в данной работе исследовалось титрование NQR, выделенного из клеток V harveyi каноническим способом Титрование этого препарата выявило те же самые спектральные компоненты со сходными значениями Ет (табл 1, различия в значениях Em находятся в области ошибки использованного метода, равной ±20 мВ)

Таблица 1. Среднеточечные окислительно-восстановительные потенциалы кофакторов NQR при рН 7 5*

Редокс переход Препарат

NQR-his NQR

50 мМ Na+ 50 мМ Na+ 50 мкМ Na+ 50MMNa+,200 мкМ NAD+

F1H"->F1H2 F1->F1*~ F1->F1H2 [2Fe-2S]2+-> [2Fe-2Sf +16 мВ (n= 1) -155мВ(п= 1) -209 мВ (n = 2) -272 мВ (n=l) +25 мВ (n = 1) +10мВ(п=1) +23 мВ (n = 1) -133 мВ (n = 1) —161 мВ (n = 1) -136 мВ (h = 1) —182 мВ (n = 2) -207 мВ (n = 2) -183мВ(п = 2) -267 мВ (n = 1) -272 мВ (n = 1) -307мВ(п=1)

♦Значения потенциалов приведены относительно стандартного водородного электрода (СВЭ)

Зависимость окислительно-восстановительных потенциалов кофакторов N(211 от концентрации ионов натрия. Наиболее важная часть редокс-титрования заключалась в определении зависимости редокс переходов в N0^ от [Ыа4], т к этот подход мог выявить редокс-переходы данного фермента, термодинамически сопряженные с трансмембранной транслокацией ионов натрия Для решения этого вопроса нами были проведены титрования в «безнатриевой» среде, содержащей лишь 40-60 мкМ №+ в качестве примеси Как видно из табл 1, результаты этих титрований практически не отличались от

результатов восстановления N(211 при 1000-кратно более высокой концентрации ионов натрия Таким образом, потенциалы всех установленных в данной работе редокс-переходов в диапазоне исследованных концентраций не зависят от [На1]

Зависимость редокс-потенциалов кофакторов КОЯ проверялась также методом сдвига равновесия Для этого N(311 в анаэробной безнатриевой среде уравновешивался при потенциалах, равных -220 мВ, -190 мВ и -160 мВ, используя различные соотношения NADH/NAD+ После достижения равновесия к смеси добавляли ИаС1 до конечной концентрации 50 мМ Если бы какой-то из кофакторов N(211 имел бы зависимость величины Ет от [№+], то на добавку этого катиона при одном из этих потенциалов мы должны были бы наблюдать существенные изменения оптического спектра белка. Однако, каких-либо спектральных изменений в N(211 при повышении концентрации ионов натрия не наблюдалось, что также подтверждает отсутствие термодинамической натриевой зависимости у оптически-видимых кофакторов N011 600 г

5

X

6

5 400

ii

о)

§ 200

ж 1_

о ■

о. с:

со л

Е_= -267 мВ п=1

Рисунок 11. Редокс-титрование Ре-Б кластера N<311 из V Ъагчеуг Титрование было проведено за счет варьирования соотношения

КА1Ш/ЫА1>+ (•), или соотношения лактат/пируват в присутствии и лактатдегидрогеназы (■) Сплошная линия представляет собой теоретическую кривую одно-электронного титрования с Ет= -267 мВ

-350 -325 -300 -275 -250 -225 -200 Редокс-потенциап, мВ

Окислительно-восстановительное титрование [2Ре-28] кластера с

использованием ЭПР-спектроскопии Из-за того, что восстановление железо-серных кластеров сопровождается лишь небольшими спектральными изменениями в видимом диапазоне, нами было проведено окислительно-восстановительное титрование [2Ре-28] кластера N(£1?. также и с использованием метода ЭПР-спектроскопии Для этого N011 в строго анаэробных условиях инкубировали при различных соотношениях NADH/NAD+, далее замораживали образцы и определяли их ЭПР-спекгры На рис 11 представлены данные зависимости интенсивности полосы с g = 1,94 от величины редокс-потенциала Как видно, эти данные хорошо описываются однокомпонентной кривой титрования с Ет « -270 мВ и п=1 Данное титрование проводили как в присутствии, так и в отсутствии ионов натрия в инкубационной среде Результаты этих двух титрований между собой не

различались Таким образом, при использовании ЭПР-спетроскопии установлено, что [2Fe-2S] кластер NQR имеет Бщ « -270 мВ (п=1), и данная величина не зависит от концентрации Na+

Исследование связывания ионов натрия с NQR

Измерение связывания Na+ с NQR представляет собой непростую задачу Ион натрия, будучи субстратом изучаемого фермента, должен обмениваться с NQR со скоростями не меньшими, чем скорость каталитического оборота этого белка То есть, время жизни комплекса [NQR-Na+] должно быть < 3 мс Это обстоятельство делает невозможным использование обычных методик изучения связывания лиганда с белком (например, методик удаления несвязанного с ферментом Na+ с помощью отмывки, центрифугирования, колоночной хроматографии и тд) Поэтому, для определения сродства NQR к Na+ нами был использован метод 23Na-5MP, успешное применение которого возможно как раз лишь в случае очень быстрого химического обмена между связанной и свободной формами этого иона

Теория. В настоящий момент теория ЯМР-спектроскопии квадрупольных ядер со спином 3/2 довольно хорошо разработана [Hubbard, 1970, Bull, 1972, Urry et al, 1989] В данном разделе будут вкратце изложены лишь некоторые ее аспекты, имеющие отношения к нашим исследованиям

Для водных растворов ионов натрия, т е в условиях, когда скорость вращения этих ионов очень велика, выполняются условия для так называемого экстремального сужения «V. « 1 (где to — резонансная Ларморова частота, а гс - время корреляции) В этом случае релаксация поперечной намагниченности 23Na является моноэкспоненциальным процессом с характерным временем Тгйю, что соответствует одиночной Лоренцовой линии в 23Na-5MP спектре с полушириной Av°i/2

. о 1 2ж о

JLl 2 free J

гдех — квадрупольная константа

При связывании Na+ с белком значительно замедляется подвижность этого иона и усиливается квадрупольная релаксация

Оба эти эффекта приводят к ускорению релаксации поперечной намагниченности ^Na, тек уширению лини В№-ЯМР Для связанного с белком иона натрия условия экстремального сужения уже не выполняются (т е coVc » 1) Поэтому, релаксация поперечной намагниченности 23Na в данном случае представляет собой двух-экспоненциальный процесс [Hubbard, 1970] Быстрая компонента релаксации в этом случае составляет 60% от общей амплитуды и характеризуется релаксационным временем Т'2ЬоШ

7"

1 гьота

'

Ж 1

"Т* V

•3 V

Медленная компонента составляет 40% от общей амплитуды и имеет релаксационное время Т"2Ьои^'

\

1

2 Ьоиги!

<г2 '

ж ■)

=тх

1 + 4® У 1 + О)1 г.

+ -

2,2

(3)

Данный двух-экспоненциальный процесс релаксации поперечной намагниченности 23№ соответствует ЯМР-спектру, являющемуся суперпозицией двух Лоренцовых линий с одной и той же резонансной частотой, но с разными значениями полуширины

В присутствии бежа (Е), способного связывать ионы натрия, когда [Е] « [Иа*], кинетика релаксации поперечной намагниченности 23Иа может быть описана схемой, представленной на рис 12

Б

Е*Ыа

Ыа

Рисунок 12. Схема релаксащш поперечной намагниченности 23Ыа в присутствии натрий-связывающего белка при (А) коВ» кь, (Б) при Ке « кь Иа* и N8- соответственно возбужденные и релаксированные ионы натрия, к[ - константа релаксации для свободных ионов натрия, кь -константа релаксации для связанных с белком ионов натрия, к^ и км - константы скорости для связывания натрия с ферментом и выхода его из комплекса с белком

Если кдц» къ (рис 12 А), то измеряемая в эксперименте константа релаксации ,, 1

поперечной намагниченности № (¿аРР = —) будет равна [Шу ег а1,1989]

Тг

1 = к = к , ЧЕМ\ _ 1 1 [Еш] Т2 арр / К0+[Ыаш] Т2/гее Т2Ьоипс1 К0+№аш] (4)

где [£,„,] и [Мя,,,,] - тотальные концентрации белка и ионов натрия, а Кц - константа диссоциации для комплекса [№+-белок] Константа релаксации для связанного натрия (кь

= -) будет состоять из двух компонент (к'ь и к"ь), определяемых уравнениями (2) и

^Ibound

(3) В этом случае зависимость кажущейся константы релаксации поперечной намагниченности 23Na от концентрации ионов натрия позволяет определить такие параметры как Кц, к'ь, и к"ь

Если кок« кь, то схема релаксации может быть упрощена до представленной на рис 12 Б В этом случае измеряемая в эксперименте константа релаксации будет равна [Urry etal, 1989, Suefuji et al, 2002]

i=kvm=±+ix_&L

T2 " f KD+[NqJ T^, V АГ„+[№,„] <!>

В данных условиях релаксация поперечной намагниченности 23Na будет моноэкспоненциальной (в отличие от рассмотренного выше случая), и зависимость кажущейся константы релаксации поперечной намагниченности MNa от концентрации ионов натрия позволяет определить такие параметры как Ко, коп, и кф

Определение сродства окисленного NQR к Na+ Для того, что бы избежать неспецифического связывания ионов натрия с белком, все измерения проводились в присутствии высокой концентрации К+ (100 мМ КС1) В наших условиях спад поперечной намагниченности 23Na в случае растворов NaCl в буфере, не содержащем белка, являлся моно-экспоненциальным процессом с характеристическим Тг ~ 40 мс при всех использованных концентрациях этого иона (2-400 мМ) Таким образом, 23Ка-ЯМР спектр раствора NaCl представлял собой одиночную Лоренцову линию с Av0</, ~ 8 Hz (см рис 13)

Рисунок 13. 23№-ЯМР спектры 4 мМ растворов N801 в отсутствии (штрих) или в присутствии 120 мкМ окисленного (пунктир) или восстановленного (сплошная линия) N0®. Во всех случаях значения интегралов ^а-ЯМР спектров было одинаковым На вставке показана увеличенная версия спектров в присутствии окисленного и восстановленного N(^11.

В то же время в пробе, содержащей 120 мкМ окисленного препарата N<311, спад поперечной намагниченности ^а значительно ускорялся и являлся уже суммой двух

экспоненциальных процессов с соотношением амплитуд быстрой и медленной компонент равным 0,6 0,4 То есть, как видно на рис 13,23№-ЯМР спектр в этом случае представлял собой сумму двух Лоренцовых линий с различными ширинами и с одинаковой резонансной частотой В соответствии с изложенным выше, это означает, что в среде измерения ионы натрия находятся как в свободной, так и в связанной с белком формах, а обмен между этими двумя формами быстрее наблюдаемых скоростей релаксации

Для определения параметров связывания Na+ с окисленным NQR было проведено измерение спада поперечной намагниченности 23Na при различных соотношениях NQR°X/Na+ Увеличение концентрации ионов натрия в среде измерения от 4 до 400 мМ при постоянной концентрации NQR0X (120 мкМ) приводило к плавному сужению как широкого (AvVj), так и узкого (Av" у„ см рис 14 А) компонент сигнала 23Na. Обработка полученных зависимостей согласно уравнению (4) дает значение KDNa, равное ® 24 мМ и значения к'ь ~ 1,6х105 с"1 и к"ь ~ 8,2х103 с"1 Таким образом, полученные результаты означают, что окисленный NQR связывает Na+, но с относительно невысоким сродством Важно отметить, что в случае окисленного белка KoNa ~ 24 мМ относится к месту связывания натрия с наибольшим сродством Так как зависимость упшрения полосы 23Na-£MP (рис 14 А) не достигала нуля при высоких концентрациях Na+, то это означает, что в NQR0X присутствуют и другие натрий-связывающие сайт(ы) со значительно меньшим сродством к этому иону

Рисунок 14. (А) Зависимость упшрения узкого компонента ^а-ЯМР линии (Ду"сх = Ду'й - Ду°й) от концентрации Ыа+ в присутствии 120 мкМ окисленного N<28. (Б) Зависимость упшрения линии 23На-ЯМР (Дусх = - Ду°у0 от концентрации в присутствии 10 мкМ восстановленного NQR

Определение сродства восстановленного NQR к АТа*

Восстановление N(211 с помощью дитионита приводило к еще большему уширению линии 23Ыа по сравнению с окисленным NQR (рис 13) Этот эффект можно объяснить как увеличением константы скорости релаксации связанного иона натрия, так и увеличением сродства к Иа+ у восстановленной формы (см уравнения (4-5)) Для выбора одной из этих альтернативных моделей было проведено измерение спада поперечной намагниченности 23Иа при различных соотношениях КОЯге11/На+ Оказалось, что увеличение концентрации (от 0,1 до 14 мМ) при постоянной концентрации N0^'' (10 мкМ) приводит к резкому сужению линии ^Ыа-ЯМР (рис 14 Б) Обработка полученных данных согласно уравнения (5) давало решение с Кп4'5 ~ 30 мкМ и кь~ 1,2x103 с"1 Таким образом, полученные данные означают, что восстановление N(^11 приводит к очень большому (приблизительно 1000-кратному) увеличению сродства этого фермента к транспортируемому иону

Опять же важно отметить, что также как и в случае окисленного N<311, зависимость уширения полосы 23№-ЯМР в присутствии восстановленного фермента не достигала нуля при высоких концентрациях (рис 14 Б) Это означает, что в NQRгed присутствуют и другие натрий-связывающие сайт(ы) с К0№ » 30 мкМ

э

и

а

5 10

Время, мс

15

5 10

Время, мс

15

Рисунок 15. Спад поперечной намагниченности 23Ка в 2 мМ растворах ЫаС1, содержащих 100 мкМ окисленного (А) или восстановленного (В) N(21*. Точки представляют собой экспериментальные данные, а сплошные линии - теоретические кривые для двух-экспоненциального (А) и моноэкспоненциального (В) процессов В случае двух-экспоненциального процесса, соотношение амплитуд быстрой и медленной фаз равнялось 0,6 0,4, соответственно

Определение кинетических параметров связывания ионов натрия с N(211 Как было описано выше, в присутствии окисленного NQR спад поперечной намагниченности 23Ка

является суммой двух экспоненциальных процессов с соотношением амплитуд быстрой и медленной компонент равным 0,6 0,4 (рис 15 А) Соотношение величин констант этих компонент (къ/кь, так называемое соотношение Булла [Urry et al, 1989]) составляло 19,5 Данное соотношение с использованием уравнений (2) и (3) позволяет рассчитать значение времени корреляции (хс), приблизительно равное в этом случае 36 не Эти данные также позволяют определить (см уравнения (2) и (3)) квадрупольную константу для связанного с NQR иона 23Na % я 1,5 МГц, что хорошо соответствует значениям этой константы в случае связывания 23Na с различными ионофорами и белками [Grandjean and Laszlo, 1977, Cornells and Laszlo, 1979]

Время корреляции является наименьшим временем из всех процессов, приводящих к флуктуации градиента электрического поля в области 23Na, таким образом, тс < ад Наличие двух компонент релаксации поперечной намагниченности 23Na в присутствии окисленного фермента означает, что т0® < Т'гь, Т'2ь [Grandjean and Laszlo, 1977] Эти соотношения позволяют определить интервал возможных значений для ¿ья" 2,8x107 > ¿off > 1,6x10 с и, принимая во внимание значение KDn'd = 24 мМ, также и для бимолекулярной константы скорости связывания натрия с окисленным белком 1,2х109 > коп > 7х106 М"1 с"1

В отличие от окисленного фермента, спад поперечной намагниченности 23Na в присутствии восстановленного NQR является моно-экспоненциальным процессом (см рис 15 Б) Это означает, что в данном случае релаксация лимитирована скоростью выхода ионов натрия из места их связывания с белком (см теоретический раздел) Так как для восстановленного фермента была определена кажущаяся константа релаксации для связанного приблизительно равная 1,2х103 с"1, то, в случае связывания одного иона натрия в данном сайте белка, мы можем заключить, что для [Na+-NQRred] комплекса ¿off» 1,2x103 с"1 Принимая во внимание значение Ко1" = 30 мкМ можно определить и бимолекулярную константу скорости связывания натрия с восстановленным белком ¿on я 3,6x108 М-1 с"1

Редокс титрование спада поперечной намагниченности 23Na в присутствии NQR Как было описано выше, восстановление NQR в присутствии дитионита приводит к значительному уширению линии ^а, вызванному увеличением сродства фермента к иону натрия Было бы важным установить, какой окислительно-восстановительный потенциал необходим для достижения этого эффекта9 Для ответа на этот вопрос было проведено редокс титрование NQR при концентрации Na+ равной 2 мМ за счет изменения соотношений концентраций NADH/NAD+ Как видно на рис 16, зависимость полуширины узкого сигнала ^а (Av"i/2) титруется по закону Нернста с Ет ~ -300 мВ (относительно СВЭ) и n = 1 Важно отметить, что максимальное уширение линии 23Na можно было

достичь как при восстановлении фермента дитионитом, так и при его восстановлении в присутствии избытка 1МЛОН Таким образом, можно заключить, что изменение сродства МОЯ к иону натрия связано не со связыванием с ферментом какого-то другого лиганда (№А1Ш или дитионита), а с одноэлектронным восстановлением какой-то простетической группы белка, имеющей при 2 мМ [Ыа^] среднеточечный потенциал, равный -300 мВ

Рисунок 16. Окислительно-восстановительное титрование изменения сродства N<311 к Изменение сродства оценивалось по изменению полуширины узкого компонента 23\та->1МР спектра при 2 мМ №+ и 100 мкМ КС>К в зависимости от величины редокс-потенциала Сплошная линия представляет собой теоретическую кривую одно-электронного титрования с Дв = -300 мВ (относительно СВЭ)

65 г

ed-

55 -

50-

а

1—1 45-

> < 40-

35-

30-

25-

-600 -400 -300 -200 -100 0 Редокс-потенциал, мВ

Исследование физиологической роли №*-транслоцирующей NADH:xhhoh-оксндоредуктазы в клетках бактерий Для определения физиологической роли NQR была исследована экспрессия генов, кодирующих этот фермент, у морской бактерии V harveyi и у энтеробактерии Klebsiella pneumoniae Показано, что такие параметры как концентрация NaCl, значение рН и присутствие разобщителя в ростовой среде практически не оказывают влияния на экспрессию этих генов В то же время, экспрессия nqr V harveyi и К. pneumoniae в значительной степени зависит от того, какие субстраты используются этими бактериями в качестве основного источника энергии Особенно сильное влияние на экспрессию nqr V harveyi оказывает доступность акцепторов электронов для дыхательной цепи и значения их окислительно-восстановительных потенциалов

Изучение окисления КАОН в дыхательной цепи азотофиксирующей бактерии

АгоМаЫег \1пе1апЛп. А угпе1апс1п является свободноживущей почвенной азотофиксирующей бактерией Известно, что нитрогеназный комплекс, осуществляющий реакцию восстановления N2,

исключительно чувствителен к повреждающему действию кислорода Поэтому, большинство способных к азотофиксации бактерий осуществляют эту реакцию лишь в анаэробных или микроаэробных условиях Исключением из этого правила является строго аэробный микроорганизм A vinelandii, который способен эффективно фиксировать молекулярный азот даже при очень высоких концентрациях Ог в окружающей среде, несмотря на то, что нитрогеназный комплекс этого микроорганизма также чувствителен к кислороду, как и у других бактерий Была высказана гипотеза о том, что высокие скорости дыхания, характерные для данного микроорганизма, позволяют ему снижать цитоплазматическую концентрацию кислорода до такого низкого уровня, при котором нитрогеназный комплекс уже не испытывает повреждающего действия О2 [Dalton and Postgate, 1968], т е реализовывать так называемый механизм "дыхательной защиты" В данной работе проведено исследование особенностей дыхательной цепи A vinelandii, позволяющих этой бактерии осуществлять механизм дыхательной защиты

Показано, что окисление NADH в дыхательной цепи A vinelandii осуществляется двумя различными ферментами сопряженной NADH хинон оксидоредуктазой (NDH-1) и несопряженной NADH хинон оксидоредуктазой (NDH-2) Были изучены условия экспрессии NDH-2 и показано, что этот фермент индуцируется при повышении концентрации О2 в среде выращивания, и этот ответ усиливается при диазотрофном росте [Bertsova et al, 1998] Таким образом, индукция NDH-2 наблюдается именно в тех условиях, когда необходима реализация дыхательной защиты Эти данные позволяют предположить, что активность NDH-2 является важной для диазотрофного роста А vinelandii при высоких концентрациях кислорода. Для проверки этого предположения с помощью сайт-направленного мутагенеза был получен штамм A vinelandii с инактивированной NDH-2 и исследована его способность к диазотрофному росту В соответствии с нашими предсказаниями было показано, что скорость дыхания клеток этого штамма значительно ниже по сравнению с клетками дикого типа. Также, мутантный штамм полностью утратил способность к диазотрофному росту при повышенной аэрации среды выращивания При этом никаких нарушений в его росте при ассимиляции связанного азота не было обнаружено Более того, мутантный штамм сохранял способность к фиксации N2, но лишь при очень низкой скорости потока кислорода в среду роста Полученные данные позволяют нам сделать вывод о том, что NDH-2 необходима для осуществления механизма дыхательной защиты у A vinelandii [Bertsova et al, 2001]

Таким образом, нами показано, что для дыхательной защиты A vinelandii, наряду с хинолоксидазой М-типа, необходимо функционирование несопряженной NADH-дегидрогеназы Также было показано, что кислород-зависимая регуляция соотношения NADH-дегидрогеназ у данного микроорганизма находится под контролем FNR-подобной

регуляторной системы CydR Хотелось бы отметить, что кислород-зависимая регуляция оксидазы М-типа так же осуществляется белком CydR Таким образом, становится возможной скоординированная экспрессия двух ферментов дыхательной защиты Данный эффект наиболее ярко наблюдается на мутантном штамме А vinelandn МК8 с инактивированным CydR Нарушение регуляторных функций CydR приводит к тому, что при любых концентрациях кислорода в среде роста наблюдается сверхэкспрессия хииолоксидазы М-типа и NDH-2 То есть, в дыхательной цепи этого штамма функционируют всего два фермента, при этом общая эффективность генерации протонного потенциала составляет только лишь 1 Н7е" Именно такой ферментный состав дыхательной цепи характерен для А vinelandu в условиях, когда необходима дыхательная защита, те при повышенном содержании Ог в ростовой среде и при отсутствии источников связанного азота

2 Н7е" 3 Н7е"

2 Низкие концентрации ассимиляция NH3

Высокие концентрации О,, фиксация N2

О Н+/е"

Рисунок 17. Схема дыхательной цепи А vinelandu Qu - убихинон-8, Н7е" - нормированное на количество электронов количество протонов, перенесенных через мембрану ферментом дыхательной цепи

Низкая эффективность генерации протонного потенциала может приводить к тому, что дыхательная цепь А vinelandu при осуществлении дыхательной защиты не испытывает лимитирования дыхательным контролем Преимущество NDH-2 и хинолоксидазы М-типа перед ферментами с высокой эффективностью генерации Д/2н+, очевидно, заключается не только в возможном отсутствии эффекта дыхательного контроля, но и в очень высоких значениях удельной активности, характерных для этих ферментов Так, в случае NDH-2 из Е coli удельная активность этого фермента на 2-3 порядка выше, чем активность NDH-1 [Bjorklof et al, 2000] Очевидно, что такая высокая активность NDH-2 и хинолоксидазы bd-типа связана, прежде всего, с отсутствием протон-помпирующей функции у этих ферментов По-видимому, любой фермент, активность которого связана с транслокацией протонов через мембрану, устроен намного сложнее и функционирует значительно медленнее, чем несопряженный фермент Таким образом, использование ферментов без протон-транслоцирующей функции и позволяет А vinelandu достичь сверхвысоких скоростей дыхания, свойственных для этой бактерии и необходимых для осуществления

дыхательной защиты При обобщении результатов, полученных в наших работах, нами была предложена схема функционирования дыхательной цепи A vinelandii при различных условиях роста данного микроорганизма (рис 17)

Окисление NADH митохондриями термогенного растения Arum orientale, В

дыхательной цепи митохондрий растений NAD(P)H может окисляться по крайней мере четырьмя различными ферментами Внутримитохондриальный NADH окисляется комплексом I, активность которого сопряжена с генерацией протонного потенциала, и несопряженным ферментом (NDin), гомологичным бактериальным ферментам NDH-2 типа [Rasmusson et al, 19995, M0ller, 2002] Растительные митохондрии также способны к прямому окислению цитоплазматического NAD(P)H за счет работы по крайней мере двух несопряженных ферментов - внешней NADH-дегидрогеназы (NDex) и внешней NADPH-дегидрогеназы (NDPex), локализованных во внутренней митохондриальной мембране [Roberts et al, 1995, Rasmusson et al, 1999, Meiler, 2002] В зависимости от вида растения, типа ткани и условий окружающей среды соотношение активностей описанных выше ферментов в митохондриях может значительно варьировать [Meiler, 1997, Svensson et al, 2001, 2002] Однако до настоящего времени неизвестно, какие именно из описанных выше ферментов играют основную роль в окислении NAD(P)H при теплопродукции у термогенных растений Решение этого вопроса и явилось основной целью нашей работы

Для этого был изучен ферментный состав электрон-транспортной цепи митохондрий термогенного растения A orientale Показано, что митохондрии, выделенные из термогенных тканей этого растения (в отличие от нетермогенных тканей A orientale или Zea mays), обладают исключительно высокими активностями двух несопряженных NADH-дегидрогеназ, окисляющих внутримитохондриальный и цитоплазматический пулы NADH [Берцова и соавт, 2004] Высказано предположение, что функционирование полностью несопряженной дыхательной цепи митохондрий, состоящей из несопряженных NADH хинон-оксидоредуктаз и цианид-устойчивой альтернативной хинол-оксвдазы, является основным механизмом термогенеза у растений

При обобщении данных, полученных в ходе изучения электрон-транспортных цепей азотофиксирующей бактерии A vinelandn и термогенного растения A orientale, было выдвинуто предположение, что индукция активности несопряженной альтернативной ветви дыхательной цепи является универсальным механизмом для осуществления ускоренного дыхания, что может быть использовано для теплопродукции, понижения внутриклеточной концентрации кислорода, регуляции метаболических потоков или каких-либо других функций

Измерение Н+/е" стехиометрии для NDH-1 и диметилсульфоксид редуктазы анаэробной дыхательной цепи Escherichia, coli.

Показано, что анаэробно выращенные клетки Е coli закисляют внешнюю среду при пульсе кислорода или ДМСО с соотношением Н+/е" близком к 2,5 и 1,5, соответственно В присутствии ингибитора NDH-1 калсаицина это соотношение снижалось для Ог до 1 а для ДМСО до 0 Такое же соотношение Н7е" (1 для кислорода и 0 для ДМСО) наблюдалось и на мутантных штаммах Е coll, не содержащих NDH-1 Эти данные позволяют предположить, что HVe" стехиометрия при работе анаэробной дыхательной цепи для NDH-1 > 1,5, а для ДМСО редуктазы (при работе с ДМСО в качестве акцептора электронов) равна 0 [Bogachev et al, 1996]

Изучение окисление NADH в дыхательной цепи Klebsiella pneumoniae.

Ранее было показано, что ионы натрия стимулируют окисление NADH в дыхательной цепи энтеробактерив К pneumoniae [Dimroth and Thomer, 1989] Позднее, данный Ш+-зависимый фермент был частично очшцен и охарактеризован как фермент типа NDH-1 [Krebs et al, 1999] Было показано, что активность этого белка осуществляется только в присутствии ионов натрия Встроенный в липосомы, данный фермент оказался способен к транслокации Na+, но не протонов, то есть он является первичной натриевой помпой [Gemperli et al, 2002, 2003] Эти работы в значительной степени перевернули современное представление о механизме работы NDH-1 (комплекса I), так как транслокация столь различных ионов (Н+ либо Na+) очень сходными по структуре ферментами накладывает значительные ограничения на механизм их функционирования [Steuber, 2001] Однако, полученный препарат №+-зависимой NADH хинон оксидоредуктазы из К. pneumoniae не был гомогенным, а довольно низкая специфическая активность этого препарата NDH-1 может быть объяснена лишь небольшой примесью фермента типа NQR Таким образом, мы предприняли попытку заново исследовать природу Ыа+-зависимой NADH хинон оксидоредуктазы из К. pneumoniae

В ходе наших работ [Bertsova and Bogachev, 2004] изучены свойства NADH хинон оксидоредуктазного участка дыхательной цепи К pneumoniae Показано, что в электрон-транспортной цепи этого микроорганизма функционируют три NADH-дегидрогеназы, относящиеся к разным классам NADH хинон оксидоредуктаз Фермент типа NDH-2 не сопряжен с запасанием энергии, фермент типа NDH-1 является первичной протонной помпой, а фермент типа NQR - первичной натриевой помпой Установлено, что сделанный ранее вывод о функционировании NDH-1 К. pneumoniae в качестве первичной натриевой помпы является неверным Этот вывод, по-видимому, ошибочно сделан из-за загрязнения полученных препаратов ферментом типа NQR.

ОБСУЖДЕНИЕ

N3 '"-транспонирующая МАО Н; хин он оксидоредуктаза была выделена из V. Иип'еуг и охарактеризована. Очищенный фермент был тучен с вомошыо ЭПР-спевтрометрш. В восстановленном препарате NQR был обнаружен сигнал от железо-серн ого кластера 2Ге-типа. Однако, наряду с этим сигнала«, а ферменте был также обнйружег шгнаи радикальной природы с концентрацией спина в нем в соотношении 1:1 по сравнению с 2Ре-23 кластером. В окисленном препарате N01^ (ошелеаном воздухом или н присутствии различных медиаторов) сигнал от 2¥е-2В кластера отсутствовал, так как он н этих условиях должен находиться н окисленном {[2Ре-28]2+) состоянии. Однако в таком окисленном ферменте радикальный сигнал по-прежнему детектировался. Более того, конценграция спида п сигнале радикальной природы не изменялась е зависимости ог степени восстановленное™ НОЯ. Исследования фермента с помощью ЭПР- н оптической спектроскопии покачали, что этот радикальный сигнал может быгь связан с присутствием в окисленном ИС>К нейтрального флавоеемихишша, который! при восстановлении фермента переходит в анионную форму.

Фаза 1

ФазаП

Фаза Ш

ПАР Н'АБН |-рмгш* >

•ШИ

Геавн, КА1)Н

FMNH*

1ММ

Е^ЮН! ЫАОН | ГАШГ,

Ьгмш, ЩР1

РМГГ

Рисунок 18. Схеыа предполагаем ьгх окислительно-ьосстанОБИтелышч событий при взаимодействии N(^11 с МОН.

Такая исключительно высокая стабильность флавосемихшюна в очень широком диапазоне окислительпо-восстановительпых потенциалов крайне необычна, и мы попытались исследовать свойства этого радикала более подробно. Д;ш этого методом остановпещой струи была изучена быстрая кинетика восстановления фермента в присутствии МАЛЫ. Оказалось, что этот процесс состоит из трех кинетических фаз. Известно, что ЫОИ из различных микроорт-анизмов содержит по крайней мере три различных флавина в качестве простетяческии групп - один нековалентно связанный РАБ и два ковалентно связанных остатка К ММ (НауазЫ е1 а!.. 2001]. В ходе изучения кинетики восстановлений N011 в присутствии N^311 определены функциональные характеристики всех трех флавиновых кофакторов этого белка {предполагаемая схема этого процесса представлена на рис 18).

нейтральный флавосемихинон

анионный флавосемихинон Рисунок 19. Схема возможных окислительно-восстановительных переходов в флавинах

Как видно на рис 18, первая фаза представляет собой двух-электронное восстановление флавина (Р1-»ИН2), вторая - одно-электронное восстановление присутствующего в окисленном N(211 ней!рального флавосемихинона (ИН'-^ИНг), а третья - одно-электронное восстановление окисленного флавина с образованием анионного флавосемихинона (И->РГ~) Важно отметить, что восстановление ИН* и образование происходит во время различных кинетических фаз Более того, при восстановлении фермента нейтральный флавосемихинон переходит в полностью восстановленную форму флавина, в то время как анионная форма флавосемихинона образуется из окисленного флавина Эти данные указывают на то, радикалы в N<311 образуются на разных флавиновых кофакторах этого белка. Это объясняет уникальную окислительно-восстановительную стабильность радикального сигаала в N<311 На самом деле, в N(211 присутствуют два различных радикала нейтральный флавосемихинон в окисленном ферменте и анионный флавосемихинон - в восстановленном Нейтральный флавосемихинон должен иметь очень высокий окислительно-восстановительный потенциал для пары И/ИН* (переход 2 на рис 19), тогда как анионный флавосемихинон -очень низкий потенциал для пары РР/ИНг (переход 5 на рис 19) Поэтому, при большинстве условий в N(21^ детектируется только один радикальный сигнал

Исследование №+-транслоцнрующих ферментов имеет ряд преимуществ по сравнению с протонными помпами Прежде всего, при изучении №+-помп можно свободно манипулировать концентрацией сопрягающего иона без существенного влияния на стабильность белка, что невозможно в случае Н^транслоцирующих ферментов В частности, можно исследовать каталитический цикл натрий-зависимого фермента при лимитировании его скорости низкими концентрациями и выявить в нем стадии, специфически ускоряющиеся этими ионами Такой подход позволяет определить, какие именно окислительно-восстановительные переходы в ферменте сопряжены с

транслокацией Na\ Подобный подход был применен при изучении описанной выше кинетики восстановления NQR, Оказалось, что ионы натрия значительно ускоряют некоторые фазы этого процесса. Скорость первой фазы (ркс. 5) не чашке па от концентрации Na+. Так как скорость этой фа";и, как и NADH-Дегидрогеназная активность NQR [Hayashj and Unemoto. 1984; Bourne and Rich, 1992; Hayashi et al, 2001 j, очень велика и не зависит от натрия, то мы можем с уверенностью шквгнфшщровазъ эгу фазу как восстановление нековалеитно связанного FAD н NADH-дегидрогеназнон участке фермента [Bogaehev et al., 200]; 2002]. В го же время, вторая и третья фазы значительно ускорялись при повышении концентрации Na". Более того, константа активации нонами натрия фазы III (F1—>Л'~) соответствовала значению Км для Na+ при осуществлении ферментом хинонредуктазтшй реакции в стационарных условиях. Таким образом, этот процесс (F1—>Fl ) является скор ость-лимитирующим при обороте фермента в условиях низкой концентрации Na\ и, возможно, именно этот процесс в каталитическом цикле фермента сопряжен с транслокацией этого иона.

Рисунок 20. Предполагаемый механизм генерации натриевого потенциала Ыа'-транелонирующей N А ОН; хи нон-о кскдоре ду ктазо Й.

Основной целью нашей работы было определение механизма транспорта натрия КОЯ. Простейший механизм преобразования энергии осуществляемых ЫрЯ окислителъно-восстановите;ц,ных реакций в натриевый потенциал представлен на рис. 20. Он заключается в том, что иоестановление какого-то из кофакторов ("сопрягающего кофактора") фермента сопровождается захватом N3 с цитоплазматнческой стороны мембраны [Богачев и Верховский, 2005). Последующее окисление этого кофактора должно приводить к выбросу иона натрия, но уже с другой стороны мембраны. Если использует именно этот механизм зля запасания энергии, то значение Ет "сопрягающего кофактора" обязательно должно зависеть от концентрации ионов натрия н изменяться на 60 мВ при изменении [Ыа'] на один порядок. Поэтому, окислнтслг.гга-лосстшговителыюс

титрование NQR при различных концентрациях Na+ должно значительно помочь в понимании механизма сопряжения этой натриевой помпы

В ходе данной работы проведено спектроэлектрохимическое редокс-титрование всех оптически-детектируемых редокс-активных простетических групп NQR и для них определены значения среднеточечных потенциалов Результаты титрования указывают также на количество флавиновых кофакторов в NQR. Ранее было предположено, что данный фермент содержит четыре различных флавина - один нековалентно связанный FAD, два ковалентно связанных остатка FMN и один нековалентно связанный рибофлавин [Hayashi et al, 2001, Barquera et al, 2002] Однако в наших экспериментах как при кинетическом [Bogachev et al, 2001, 2002], так и при термодинамическом [Bogachev et al, 2006] исследовании фермента детектируется лишь три различных вида флавинов Эти наблюдения подкрепляются также результатами проведенного нами химического анализа флавинов в NQR Исходя из полученных данных, мы можем заключить, что NQR содержит лишь три различных флавиновых кофактора Предположительно, это один нековалентно связанный FAD и два ковалентно связанных остатка FMN, а субстехиометрическое количество рибофлавина определяется в составе данного фермента в результате гидролиза фосфоэфирной связи остатков FMN

Интересно отметить, что в трех различных флавинах NQR при функционировании этого белка используются разные электронные переходы В одном из флавинов реализуется только двух-электронный переход, тогда как два других флавина способны только к одно-электронному восстановлению, что полностью согласуется с полученными результатами анализа кинетики взаимодействия фермента с NADH [Bogachev et al, 2001, 2002] В двух флавинах соответственно наблюдаются лишь переходы FI—>F1* и F1H*-^F1H2, тогда как переходы F1*~->F1H2 и F1-»F1H* в пих не детектируются во всем исследованном диапазоне редокс-потенциалов, те эти переходы термодинамически запрещены Как сказано выше, переход F1—>F1H2 мы можем приписать восстановлению нековалентно связанного FAD в NADH-дегидрогеназном участке NQR, тогда как переходы F1—>F1"~ и F1H"-»F1H2 - восстановлению двух разных ковалентно связанных остатков FMN При взаимодействии NQR с NADH протекание переходов FI—>F1*- и F1H*-»F1H2 (т е перенос электронов от FAD к остаткам FMN) значительно ускоряется ионами натрия Поэтому мы выдвигали предположение, что какой-то из этих переходов может быть сопряжен с трансмембранной транслокацией Na+ В этом случае значение Ещ этого перехода обязательно должно зависеть от концентрации ионов натрия Однако, в ходе данной работы установлено, что редокс-потенциалы всех кофакторов NQR не зависят от [Na+], те кажущееся сродство редокс-зависимой натриевой помпы к электронам не

зависит от концентрации ее сопрягающего иона Конечно же, возникает вопрос, как в этом случае может быть устроен механизм генерации ферментом А/т+, и почему перенос электронов от FAD к остаткам FMN в NQR является натрий-зависимым? Несколько альтернативных объяснений могут выступать в качестве ответа на этот вопрос

1) Возможно примесные концентрации ионов натрия в наших экспериментах (20-50 мкМ) слишком высоки, что бы увидеть зависимость величины Ет от [Na+] Это может быть в том случае, если Ks окисленного фермепта по натрию «50 мкМ Однако при столь низкой Ks по натрию трудно представить эффективную работу фермента при физиологической для V harveyi концентрации ионов натрия, равной 0,5 М (концентрации натрия в морской воде)

2) Вторым объяснением отсутствия Ка+-зависимости значений Ет кофакторов NQR может быть то, что в нашем редокс-титровании определены окислительно-восстановительные свойства лишь оптически видимых простетических групп В то же время, мы не можем исключить существования Ыа+-зависимости у какого-то дополнительного, оптически-недетектируемого кофактора NQR Таким образом, определенная нами ранее №+-зависимостъ скорости переноса электронов от FAD к ковалентно связанным остаткам FMN может объясняться за счет того, что этот перенос осуществляется посредством данного гипотетического Ма+-зависимого, но оптически-труднодетектируемого кофактора.

3) Возможно NQR функционирует по принципу не термодинамической, а кинетической машины В этом случае №+-зависимость значения Ет какого-то кофактора данного фермента может возникать во время каталитического цикла лишь в результате последовательных и упорядоченных событий Другими словами, данная Ка+-зависимостъ реализуется лишь на фиксированной стадии каталитического цикла, которая не может быть достигнута в условиях термодинамического равновесия

Для выяснения справедливости этих альтернативных моделей функционирования NQR было необходимо провести исследование термодинамических параметров связывания сопрягающего иона нагрий-транслоцирующей NADH хинон оксидоредуктазой, а также определить зависимость этих параметров от степени восстановленности данного фермента Предложенный механизм преобразования энергии осуществляемых NQR окислительно-восстановительных реакций в натриевый потенциал (рис 20) предсказывает еще одно уникальное свойство изучаемого фермента Если NQR использует именно этот механизм для запасания энергии, то его сродство к Na+ должно зависеть от степени восстановленности фермента Более того, различие значений Kd№ для окисленной и восстановленной форм NQR должно быть по крайней мере 1000-кратным,

так как A//Na+ на бактериальной мембране может достигать величин 180 мВ В соответствии с этой моделью было показано, что восстановление NQR приводит к очень существенному (приблизительно 1000-кратному) увеличению сродства этого фермента к своему сопрягающему иону Таким образом, полученные данные подтверждают функционирование NQR с использованием механизма, представленного на рис 20

В то же время, полученные параметры связывания натрия для окисленной и восстановленной форм NQR не вполне вписываются в означенную модель Не совсем понятно, зачем данному ферменту иметь столь высокое сродство к натрию в восстановленной форме (KoNa = 30 мкМ) при цитоплазматической концентрации этого иона у морских вибрионов равной 10-30 мМ [Nakamura et al, 1986] Возможно, что место связывания натрия в NQR находится в глубине мембраны В этом случае, транспорт натрия к месту связывания из цитоплазмы должен происходить против ДО, что может объяснить необходимость столь высокого сродства NQRred к Na+

Полученное значение KDNa для окисленной формы (24 мМ) также кажется слишком низким, тк согласно описанному выше механизму данная форма фермента должна свободно высвобождать Na+ во внешнюю среду, те в среду, содержащую 500 мМ NaCl (концентрация хлористого натрия в морской воде) Таким образом, либо в ферменте должен осуществляться какой-то дополнительный механизм, облегчающий высвобождение натрия во внешнюю среду из окисленного белка, либо NQR потенциально содержит несколько мест связывания ионов натрия В последнем случае, натрий-связывающий сайт в окисленном NQR с Kd№ = 24 мМ может располагаться в любом месте белка (например, служить воротами к натриевому каналу с цитоплазматической его стороны) и не иметь отношения к выбросу натрия во внешнюю среду В соответствии с этим было установлено, что и окисленная и восстановленная формы NQR имеют более одного места связывания ионов натрия

В свете изложенного выше механизма транслокации ионов натрия важно установить, восстановление какого из его кофакторов NQR сопровождается изменением сродства фермента к Na+ Данный механизм сопряжения предполагает, что окислительно-восстановительный потенциал одного из кофакторов фермента обязательно должен зависеть от концентрации ионов натрия и изменяться приблизительно на 60 мВ при изменении [Na+] на один порядок Однако, как было описано выше, все оптически детектируемые редокс переходы в NQR не зависят от концентрации Na+ Более того, было установлено, что при 2 мМ [Na+] увеличение сродства фермента к этому иону титруется по закону Нернста с Em ~ -300 мВ В то же время, все определенные в белке окислительно-

восстановительные переходы имеют более положительный редохс-потепциал [Тк^асЬе^' е! а!., 2006].

Для объяснения полученных результатов мы вынуждены предположить, что содержит какую-то дополнительную оптически-недетектируемую простстичсскую группу с натрий-зависимым ре до кс - п отс нциалом, для идентификации которой необходимы дальнейшие исследования.

-400

-300

tf -200

d

К

<р

н

0 и

1

о и о

Рн

-100

О

100

200

NAD'/NADH

FMN/FMN-

l'HcvntiK 21. Схема окислител ьно-воестанови-тельных переходов в NQR и возможная последовательность переноса электронов при функционировании фермента.

Q/QH.

В заключении хотелось бы обобщить все полученные нами данные в виде пред! го латаемой схемы переноса электронов при функционировали!! NQR (рис. 21). Вначале происходит перелое двух электронов с NADH на нековйлентно связанный FAD в МАОН-дегидрогеназном участке фермента. Далее, осуществляется распаривание этих электронов за счет переноса одного электрона от FADH; на 2Fe-2S кластер. Электрон с 2Fc-2S кластера переносится на коваленго связанные остатки FMN и, далее, на убихипон (по-пилимому, вначале электрон переносится на FMN, стабилизирующий анионную форму радикала, а затем на другой FMN, стабилизирующий нейтральную форму флавоеемихинона). Так как перенос электронов от нековалентно связанного FAD к ко валентно связанным остаткам FMN ускоряется ионами натрия, то мы можем

предположить, что гипотетическая дополнительная простетическая группа с натрий-зависимым редокс потенциалом (и имеющая Ет = -300 мВ при 2 мМ [Na+]) должна располагаться между 2Fe-2S кластером и ковалентно связанным остатком FMN

ВЫВОДЫ

1. Предложен метод определения стехиометрии Na+/e" для первичных натриевых помп в бактериальных клетках С использованием этого метода установлено, что стехиометрия Na+/e" для №+-транслоцирующей NADH хинон оксидоредуктазы равна 1

2. №+-транслоцирующая NADH хинон оксидоредуктаза из V harveyi была очищена и охарактеризована Показано, что фермент в дополнение к нековалентно связанному FAD содержит также остаток FMN, ковалентно связанный с субъединицей NqrC

3. Очищенная №+-транслоцирукяцая NADH хинон оксидоредуктаза была встроена в липосомы На данной реконструированной системе была исследована генерация Д*Р и ДрН Показано, что необходимые для восстановления убихинона протоны захватываются ферментом с цитоплазматической стороны мембраны

4. №+-транслоцирующая NADH хинон оксидоредуктаза из V harveyi была изучена с помощью ЭПР- и оптической спектроскопии Показано, что в окисленных и полностью восстановленных препаратах этого белка присутствуют два флавиновых радикала с различными характеристиками Один из них детектируется в окисленном ферменте и является нейтральным флавосемихиноном Второй обнаруживается в полностью восстановленном ферменте и является анионным флавосемихиноном

5. Исследована кинетика восстановления №+-транслопирующей NADH хинон оксидоредуктазы в присутствии NADH при различных концентрациях Na+ Показано, что эта кинетика состоит из трех различных фаз Установлено, что скорость первой фазы не зависит от концентрации Na+, в то время как скорости второй и третьей фаз являются натрий-зависимыми Первая фаза восстановления NQR определена как процесс двух-электронного восстановления нековалентно связанного FAD до FADH2, в то время как вторая и третья фазы представляют собой поочередное одноэлектронное восстановление двух ковалентно-связанных остатков FMN (восстановление нейтрального флавосемихинона до FMNH2 для второй фазы и восстановление окисленнной формы FMN до анионного флавосемихинона для третьей фазы) Восстановление ковалентно связанных остатков FMN зависит от концентрации ионов натрия с измеряемой константой активации

3,4 мМ Это значение близко к значению Км для Na+ при функционировании фермента в стационарных условиях

6. Проведено окислительно-восстановительное титрование простешческих групп Na+-транслоцирующей NADH хинон оксидоредуктазы и установлены значения их среднеточечных потенциалов Найдено, что значения редокс-потенциалов всех оптически-видимых кофакторов NQR не зависят от концентрации натрия в среде измерения.

7. Методом MNa-KMP определены параметры связывания ионов натрия с Na+-транслоцирующей NADH хинон оксидоредуктазой. Установлено, что константа диссоциации по Na+ для окисленной формы белка составляет 24 мМ, тогда как для восстановленной NQR - 30 мкМ Таким образом, восстановление NQR приводит к 1000-кратному увеличению сродства фермента к сопрягающему иону Проведено окислительно-восстановительное титрование сродства NQR к ионам натрия при 2 мМ [Na+] Это титрование описывается законом Нернста с Ет около -300 мВ и n = 1 Полученные данные указывают на то, что механизм сопряжения NQR основан на модуляции его ионной аффинности редокс состоянием простетической группы этого фермента На основе результатов исследования NQR предложен возможный механизм функционирования Na+-транслоцирующей NADH хинон оксидоредуктазы

8 Показано, что такие параметры как концентрация NaCl, значение рН и присутствие разобщителя в ростовой среде практически не оказывают влияния на экспрессию nqr генов V harveyi и К. pneumoniae, кодирующих №+-транслоцирующую NADH хинон оксидоредуктазу В то же время, экспрессия nqr V harveyi и К pneumoniae в значительной степени зависит от того, какие субстраты используются этими бактериями в качестве основного источника энергии Особенно сильное влияние на экспрессию nqr V harveyi оказывает доступность акцепторов электронов для дыхательной цепи и значения их окислительно-восстановительных потенциалов

9. При исследовании электрон-транспортных цепей азотофиксирующей бактерии А vmelandu и термогенного растения A orientale, показано, что скоординированная индукция активностей компонентов несопряженной альтернативной ветви дыхательной цепи является универсальным механизмом для осуществления ускоренного дыхания, что может быть использовано для теплопродукции, понижения внутриклеточной концентрации кислорода, регуляции метаболических потоков или каких-либо других функций

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ по теме диссертации

1. Bogachev AV, Murtasina RA, and Skulachev VP (1996) HVe" stoichiometry for the NADH dehydrogenase I and dunethyl sulfoxide reductase m anaerobically grown Escherichia coll cells J Bacterid, 178,6233-6237

2. Shestopalov AI, Bogachev A V , Murtasina R A, Viryasov M В , and Skulachev V P (1997) Aeration-dependent changes m composition of the qumone pool in Escherichia coh Evidence of post-transcnptional regulation of the qumone biosynthesis FEBS Lett, 404,272-274

3. Bogachev A V, Murtasina R A, and Skulachev V P (1997) The Na+/e" stoichiometry of the Na+-motive NADH qurnone oxidoreductase in Vibrio alginolyticus FEBS Lett, 409,475-477

4. Bertsova Y V , Bogachev A V, and Skulachev V P (1997) Generation of protomc potential by the bd-type qumol oxidase of Azotobacter vinelandn FEBS Lett, 414,369-372

5 Bertsova YV, Bogachev AV, and Skulachev VP (1998) Two NADH ubiquinone oxidoreductases of Azotobacter vinelandu and then- role in the respiratory protection Biochim Biophys Acta, 1363,125-133

6. Zhou W, Bertsova Y V, Feng В , Tsatsos P , Verkhovskaya M L, Genms R В, Bogachev AV, and Barquera В (1999) Sequencing and preliminary characterization of the Na+-translocating NADH ubiquinone oxidoreductase from Vibrio harveyi Biochemistry, 38, 1624616252

7. Манухов И В , Берцова Ю В, Трофимов Д Ю, Богачев А В и Скулачев В.П (2000) Изучение бежа Ш0220 из Haemophilus influenzae - нового структурного и функционального аналога белка АгсВ из Escherichia coli Биохимия, 65,1564-1571

8. Bogachev А V, Bertsova Y V, Barquera В, and Verkhovsky MI (2001) Sodium-dependent steps m the redox reactions of the Na+-motive NADH qumone oxidoreductase from Vibrio harveyi Biochemistry, 40,7318-7323

9. Bertsova Y V , Bogachev A V , and Skulachev V P (2001) Noncoupled NADH ubiquinone oxidoreductase of Azotobacter vinelandn is required for diazotrophic growth at high oxygen concentrations J Bacteriol, 183,6869-6874

10. Берцова Ю В и Богачев А В (2002) Функционирование терминальной оксидазы сЪЪу типа у Azotobacter vinelandn Биохимия, 67,750-756

11. Bogachev А V, Bertsova Y V, Ruuge E К, Wikström M, and Verkhovsky MI (2002) Kinetics of the spectral changes during reduction of the Na+-motive NADH qumone oxidoreductase from Vibrio harveyi Biochim Biophys Acta, 1556,113-120

12 Bertsova Y V and Bogachev A V (2004) The origin of the sodium-dependent NADH oxidation by the respiratory chain of Klebsiella pneumoniae FEBS Lett, 563, 207-212

13. Берцова Ю В , Попов В H и Богачев А В (2004) Окисление NADH митохондриями термогенного растения Arum Orientale Биохимия, 69,712-718

14. Богачев AB и Верховский МИ (2005) №+-транслоцирующая NADHхинон оксидоредукгаза - достигнутый прогресс и перспективы исследований Биохимия, 70, 177 -185

15. Берцова Ю В , Демин О В и Богачев А В (2005) Дыхательная защита шпрогеназного комплекса у Azotobacter vinelandn Успехи биологической химии, 45,205-234

16. Bogachev А V, Bertsova Y V , Bloch D А, and Verkhovsky MI (2006) Thermodynamic properties of the redox centers of Na+-translocating NADH qumone oxidoreductase Biochemistry, 45,3421-3428

Напечатано с готового оригинал-макегга

Издательство ООО "МАКС Пресс" Лицензия ИДИ 00510 ог01 12 99г Подписано к печати 06 09 2007 г Формат 60x90 1/16 Услпечл 2,0 Тираж 100 экз Заказ 416 Тел 939-3890 Тел/Факс 939-3891 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им М В Ломоносова, 2-й учебный корпус, 627 к

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Богачев, Александр Валерьевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. ]\Га+-транслоцирующая ИАВН:хинон оксидоредуктаза

2. Физиологическая роль несопряженной КАОН:хинон оксидоредуктазы 13 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 34 РЕЗУЛЬТАТЫ

1. 1Ча+-транслоцирующая ИАВН:хинон оксидоредуктаза

2. Несопряженная NADH:xинoн оксидоредуктаза

3. Н+-транслоцирующая НАОН:хинон оксидоредуктаза 101 ОБСУЖДЕНИЕ 112 ВЫВОДЫ 125 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография; ДМСО - диметилсульфоксид, ДТТ - 1,4-дитио-ОЬ-треитол; пиранин - 8-гидрокси-1,3,6-пиренетрисульфоновая кислота; капсаицин - 8-метил-Н-ваниллил-6-ноненамид; Кз - менадион (Витамин Кз); оксонол VI -1.5-бис[5-оксо-Зпропилизоксазол-4-ил]пентаметиноксонол; п.н. - пары нуклеотидов; ПЦР - полимеразная цепная реакция; СБЧ - суббактериальные частицы; ТМАО - триметил N-оксид; ЭПР - электронный парамагнитный резонанс; ЯМР - ядерный магнитный резонанс; AltOx - альтернативная оксидаза; СССР - м-хлоркарбонилцианид фенилгидразон; DM -додедил мальтозид; dNADH - восстановленный никотинамид гипоксантин динуклеотид; ЕТН-157 - М,Ы'-дибензил-М,Ы'-дифенил-1,2-фенилен диацетамид; F1 - окисленный флавин; FIH2 - восстановленный флавин; F1H* - нейтральный флавосемихинон; Fl*~ -анионный флавосемихинон; HQNO - 2-н-гептил-4-гидроксихинолин N-оксид; Н+/е' -нормированное на количество электронов количество протонов, перенесенных через мембрану ферментом дыхательной цепи; Q - убихинон; QH2 - убихинол; Qi - 2,3-диметокси-5 -метил-6-изопренил-1,4-бегоохинон; LDAO - лаурилдиметиламин N-оксид; Na+/e~ - нормированное на количество электронов количество ионов натрия, перенесенных через мембрану ферментом дыхательной цепи; NDex - внешняя NADH:xhhoh-оксидоредуктаза митохондрий растений; NDH-1 - бактериальная Н+-транслоцирующая NADH:xhhoh оксидоредуктаза, гомолог митохондриального Комплекса I; NDH-2 -бактериальная несопряженная NADH:xhhoh оксидоредуктаза; NDin - внутренняя несопряженная NАВР1:хинон-оксидоредуктаза митохондрий растений; NQR - Na+-транслоцирующая NADH:xhhoh оксидоредуктаза; SHAM - салицилгидроксамовая кислота, АрН - трансмембранная разность значений рН; Д//н+ ~ трансмембранная разность электрохимических потенциалов ионов водорода; Д ~Ji ыа - трансмембранная разность электрохимических потенциалов ионов натрия; Av[/ - трансмембранная разность значений электрических потенциалов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение NADH:хинон оксидоредуктазного сегмента электрон-транспортных цепей"

В последние десятилетия достигнут значительный прогресс в понимании механизмов трансформации энергии в дыхательных цепях митохондрий и бактерий. Так, для многих ферментов электрон-транспортной цепи (таких как цитохром с оксидаза (комплекс IV), ¿>c i-комплекс (комплекс III), нитратредуктаза, формиатдегидрогеназа и многих других) на настоящий момент определена трехмерная структура. Более того, для этих ферментов выяснена последовательность окислительно-восстановительных реакций при осуществляемом ими катализе, а для некоторых из них - и механизм генерации протонного потенциала.

В тоже время, механизм протекания NADH:xhhoh оксидоредуктазной реакции -первой стадии в функционировании дыхательной цепи - на настоящий момент неизвестен, и эта реакция является наименее изученным участком электронного транспорта. В отличие от митохондрий высших животных, где функционирует лишь Н+-транслоцирующая NADH'.xhhoh оксидоредуктаза (комплекс I), окисление NADH в дыхательной цепи бактерий может осуществляться тремя различными типами ферментов: Н+-транслоцирующей (NDH-1), Ка+-транслоцирующей (NQR) и несопряженной (NDH-2) NADH:xhhoh оксидоредуктазами. У различных бактерий в дыхательной цепи могут функционировать NADH:xhhoh оксидоредуктазы одного, двух и даже всех трех вышеперечисленных типов. Для всех этих ферментов на настоящий момент не известен ни механизм окислительно-восстановительного катализа, ни способ генерации мембранного потенциала (для NQR и NDH-1), также неизвестна физиологическая роль различных NADH:xhhoh оксидоредуктаз в клетках микроорганизмов.

Целью данной работы являлось изучение NADH:xhhoh оксидоредуктазного сегмента дыхательных цепей. Особое внимание было уделено исследованию механизма функционирования Ыа+-транслоцирующей NADH:xhhoh оксидоредуктазы из морской бактерии Vibrio harveyi. Исследование Ка+-транслоцирующих ферментов имеет ряд преимуществ по сравнению с протонными помпами. Прежде всего, при изучении Na^-помп можно свободно манипулировать концентрацией сопрягающего иона без существенного влияния на стабильность белка, что невозможно в случае Н+-транслоцирующих ферментов. В частности, можно исследовать каталитический цикл натрий-зависимого фермента при лимитировании его скорости низкими концентрациями Na+ и выявить в нем стадии, специфически ускоряющиеся этими ионами. Такой подход позволяет определить, какие именно окислительно-восстановительные переходы в ферменте сопряжены с транслокацией Иа+. С другой стороны, влияние концентрации Иа+ на термодинамические свойства натриевой помпы позволяет установить механизм преобразования энергии катализируемой редокс-реакции в трансмембранный натриевый потенциал.

Также исследовалась регуляция экспрессии генов, кодирующих различные ЫАОН:хинон оксидоредуктазы, и определялся фенотип мутантных по этим генам штаммов микроорганизмов, что позволяет приблизиться к пониманию физиологической роли данных ферментов в клетках бактерий.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Бактериальные NADH:xuhoh оксидоредуказы

В дыхательной цепи большинства бактерий присутствуют ферменты, способные осуществлять NADH:xmhoh оксидоредуктазную реакцию. Бактериальные NADH дегидрогеназы можно разделить на три основных класса - протон-транслоцирующие NADHixhhoh оксидоредуктазы (NDH-1), натрий-транслоцирующие NADH:xhhoh оксидоредуктазы (NQR) и несопряженные NADH:xhhoh оксидоредуктазы (NDH-2) [Matsushita et al., 1987; Yagi, 1991; Calhoun and Gennis, 1993; Bertsova and Bogachev, 2004]. Эти ферменты значительно отличаются друг от друга по своей структуре, субстратной специфичности и чувствительности к различным ингибиторам. Основное отличие этих ферментов заключается в их различной способности к транслокации ионов через мембрану.

NADH:xhhoh оксидоредуктаза I (NDH-1) по многим своим характеристикам гомологична Комплексу I из митохондрий [Weiss et al., 1991; Гривенникова и Виноградов, 2003]. У Escherichia coli этот фермент представляет собой белок с молекулярной массой около 525 кДа. Он состоит из 13 субъединиц (NuoA-NuoN) и содержит нековалентно связанный FMN и 9 Fe-S кластеров в качестве кофакторов [Weidner et al., 1993; Leif et al., 1995; Гривенникова и Виноградов, 2003; Hinchliffe and Sazanov, 2005]. NADH:xhhoh-оксидоредуктазная активность этого фермента чувствительна к таким ингибиторам, как капсаицин, анонин и пирицидин A [Matsushita et al., 1987; Yagi, 1990; Satoh et al., 1996; Bertsova et al., 1998; Grivennikova et al., 2003; Bertsova and Bogachev, 2004]. Активность NDH-1 сопряжена с генерацией протонного потенциала [Matsushita et al., 1987; Bogachev et al., 1996; Bertsova et al., 1998; Bertsova and Bogachev, 2004]. Было показано, что соотношение Н /е" для митохондриального Комплекса I составляет 2 Н /е" [Wikstrom, 1984; Galkin et al., 1999]. Эффективность генерации Л// н+ бактериальными NDH-1 изучена в значительно меньшей степени, известно лишь, что соотношение Н+/е" для этого фермента из Е. coli составляет по крайней мере 1,5 [Bogachev et al., 1996].

NADH:xhhoh оксидоредуктазы II типа (NDH-2) устроены гораздо проще. Они состоят всего из одной субъединицы (Мг = 47 кД в случае фермента из Е. coli) и содержат только один кофактор (чаще всего - нековалентно связанный FAD) [Yagi, 1991]. Активность этих ферментов не сопровождается переносом ионов через мембрану [Matsushita et al., 1987; Bertsova et al., 1998; Bertsova and Bogachev, 2004]. Ферменты типа NDH-2 не известны в митохондриях высших животных, однако аналогичные белки функционируют в митохондриях некоторых простейших, грибов и растений [Yagi, 1991;

Берцова и Богачев, 2002]. При кажущейся простоте, этот фермент до сих пор малоизучен. На настоящий момент известно, что активность NDH-2, в отличие от NDH-1, практически нечувствительна к таким ингибиторам как пирицидин А и капсаицин [Yagi, 1990; Bertsova et al., 1998].

1. ]Ча+-транслоцирующая NADHíxhhoh оксидоредуктаза

Бактерии могут расти в широком диапазоне значений рН окружающей среды. В кислых и нейтральных условиях дыхательная цепь прокариот способна генерировать высокий протонный потенциал, достаточный для энергообеспечения различного вида работ. Однако, НГ-транслоцирующие ферменты дыхательной цепи алкалотолерантных или алкалофильных бактерий, перенося протоны из цитоплазмы во внешнюю среду против градиента рН, действовали бы в условиях, когда осмотическая компонента Д7/н+ противонаправлена электрической, что должно сильно понизить суммарную протон-движущую силу. В результате алкалофильные бактерии не смогли бы осуществлять зависимые от А~Ц н+ функции, прежде всего - окислительное фосфорилирование. В.П. Скулачевым был предложен принципиально новый механизм запасания энергии при высоких значениях рН, а именно, - функционирование натриевого цикла. Этот механизм подразумевает, что в щелочных условиях ферменты дыхательной цепи бактерий могут транслоцировать ионы натрия вместо протонов, а генерируемый первичными натриевыми помпами натриевый потенциал может быть использован для энергообеспечения основных типов работ, совершаемых клеткой: химической (синтез АТР), осмотической (накопление субстратов) и механической (движение) [Скулачев, 1989; Skulachev, 1984; 1989].

Впервые фермент, запасающий энергию окислительно-восстановительных реакций в виде натриевого потенциала, был открыт в дыхательной цепи морской бактерии Vibrio alginolyticus. В 1977 году Унемото с соавторами показали, что NADH-оксидазная реакция, катализируемая суббактериальными частицами из V. alginolyticus и V. costicola, специфически стимулируется ионами натрия [Unemoto et al., 1977]. Позднее было установлено, что данная №+-стимул:яция происходит на К!АОН:хинон-оксидорсдуктазном участке дыхательной цепи [Unemoto and Hayashi, 1979]. Более того, оказалось, что Na+-зависимость окисления NADH у V. alginolyticus связана не с какой-то аллостерической регуляцией N ADH: хин о 1i -оксидоредуктаз ы, а с тем, что активность этого фермента сопряжена с трансмембранной транслокацией ионов натрия [Tokuda and Unemoto, 1984]. То есть, ЫАОН:хиноп-оксидоредуктаза дыхательной цепи V. alginolyticus является первичной натриевой помпой [Tokuda et al., 1985].

Образованный натриевый потенциал может быть использован у V. alginolyticus для совершения механической (вращение полярного жгутика) [Dibrov et al., 1986] или осмотической (транспорт субстратов) [Tokuda et al., 1982] работы. Таким образом, пример этого микроорганизма подтверждает возможность функционирования у бактерий натриевого цикла преобразования энергии [Skulachev, 1989].

1.1. Первичная последовательность субъединиц ^+-транслоцирующей NADH:xhhoh оксидоредуктазы.

В 1994 г. независимо в двух лабораториях был клонирован и секвенирован оперон, кодирующий у V. alginolyticus Ыа+-транслоцирующую МАОН:хинон-окспдоредуктазу (NQR) [Rich et al, 1995; Hayashi et al., 1995]. Было показано, что этот оперон содержит шесть открытых рамок считывания (nqrA-T). В последствии было установлено, что NQR состоит из шести субъединиц, соответствующих продуктам шести генов nqr-оперона [Nakayama et al., 1998].

Таблица 1. Физико-химические свойства субъединиц N(311 на примере фермента из V. Ьаг\>еу1 и их возможная роль при осуществлении ферментативной активности.

Субъединица Молекулярная Количество Связывание кофакторов и возможная роль в

NQR масса (кДа) трансмембранных ферментативной активности а-спиралей

Nqr А 48,4 0 ?

NqrB 45,4 8 Ковапентно связанный остаток FMN [Nakayama et al., 2000], возможно формирует хинонредуктазный центр фермента [Hayashi et al., 2002]

NqrC 27,5 1-2 Ковалентно связанный остаток FMN [Zhou et al.,

1999; Nakayama et al., 2000]

NqrD 22,7 б ?

NqrE 21,5 6 ?

NqrF 45,2 1 Место связывания NADH, содержит нековалентно связанный FAD, 2Fe-2S кластер

Rich et al, 1995; Turk et al., 2004]. Ответственна за осуществление NADH-дегидрогеназной активности фермента.

Три субъединицы NQR (^гВ, ^гБ и ^гЕ) очень гидрофобны, в то время как остальные три - относительно гидрофильны (см. табл. 1). Субъединица ЫцгР оказалась гомологичной многим белкам, осуществляющим окислительно-восстановительные реакции. С-концевой домен этой субъединицы сходен с ферредоксин:ЫАОР+ оксидоредуктазами, входящими в семейство FNR. В его первичной последовательности содержатся участки, ответственные за связывание NADH и FAD [Rich et al, 1995; Turk et al., 2004]. N-концевой домен NqrF гомологичен ферредоксинам, содержащим [2Fe-2S] кластер. Его последовательность содержит четыре консервативных остатка цистеина, принимающих участие в формировании железо-серного кластера [Rich et al, 1995; Barquera et al., 2004]. Таким образом, NqrF представляет собой полипептид, объединяющий в своем составе N A D Н: ф е р р е д о к с и н оксидоредуктазу и ферредоксин [Turk et al., 2004]. Остальные пять субъединиц NQR (NqrA-E) не обладают сколь-нибудь существенной гомологией по отношению к другим белкам с известными функциями. Хотелось бы отметить, что NQR полностью отличен как от ферментов класса протон-транслоцирующих NADH:xhhoh-оксидоредуктаз (NDH-1, Комплекс I), так и от ферментов класса несопряженных КАБН:хинон-оксидоредуктаз (NDH-2) [Rich et al., 1995; Hayashi et al., 1995; Bertsova and Bogachev, 2004]. Таким образом, белки типа NQR составляют третий класс NADH:xhhoh-оксидоредуктаз дыхательных цепей, который возник в ходе эволюции независимо от двух других классов этих ферментов.

Интересно отметить, что гены, гомологичные nqrA-F из V. alginolyticus, впоследствии были обнаружены в геномах многих бактерий [Zhou et al., 1999; Hase et al., 2001]. Таким образом, NQR широко распространен среди прокариот, в частности, этот белок содержится и у многих патогенных микроорганизмов, таких как V. cholerae [Hase and Mekalanos, 1999], Haemophilus influenzae [Hayashi et al., 1996], Klebsiella pneumoniae [Bertsova and Bogachev, 2004], Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Yersinia pestis, Shewanella putrefaciens, Pseudomonas aeruginosa, Porphyromonas ginginvalis и т.д. Более того, в случае V. cholerae было показано, что NQR играет существенную роль в индукции факторов вирулентности [Hase and Mekalanos, 1999].

1.2. Простетические группы NQR.

В течение последних лет кофакторный состав NQR изучался в различных лабораториях. Результаты этих исследований были очень противоречивы, а сделанные на сегодняшний день выводы, возможно, еще не являются окончательными. В 1986 году Токуда и Унемото выделили NQR из V. alginolyticus и показали, что он содержит лишь флавины в качестве кофакторов, а именно - один нековалентно связанный FAD и один нековалентно связанный FMN [Hayashi and Unemoto, 1986]. Однако, при анализе первичных последовательностей субъединиц NQR было установлено, что лишь в одной из них (в субъединице NqrF) присутствует мотив для связывания флавина [Rich et al., 1995]. Более того, Пфеннингер-Ли и Димрот показали, что в очищенном препарате NQR содержится лишь один нековалентно связанный флавин, а именно - FAD [Pfenninger-Li and

Dimroth, 1995]. Данное противоречие в результатах было разрешено позднее. Было установлено, что NQR из V. harveyi наряду с нековалентно связанным FAD содержит дополнительно еще один флавин (по-видимому - FMN), ковалентно связанный с субъединицей NqrC [Zhou et al., 1999]. Ковалентный тип связи флавина с белком подразумевает какой-то другой, отличный от классического мотив первичной последовательности флавин-содержащего домена, а также невозможность использования обычно применяемой методики экстракции для его обнаружения.

В последствии Накаяма с соавторами показали, что в состав NQR входит не один, а два ковалентно связанных флавина, и они присоединены к субъединицам NqrB и NqrC [Nakayama et al., 2000]. Было установлено, что эти флавины являются остатками FMN, и в обоих случаях они присоединены к остаткам треонина этих субъединиц посредством фосфоэфирной связи [Hayashi et al., 2001а; 2001Ь]. Хотелось бы отметить, что такой тип ковалентной связи флавина с белком является уникальным и, кроме NQR, не встречается в других ферментах [Hayashi et al., 2001b],

Изучение флавиновых кофакторов NQR получило неожиданное продолжение в самое последнее время. Оказалось, что данный белок наряду с FAD и FMN содержит также и нековалентно связанный рибофлавин [Barquera et al., 2002]. Рибофлавин обычно используется живыми организмами лишь как предшественник для синтеза FAD и FMN, и, за исключением NQR, неизвестны случаи его функционирования в качестве кофактора [Massey, 2000]. Правда, необходимо отметить, что еще не установлено, какая из субъединиц NQR ответственна за связывание рибофлавина. Таким образом, остается возможность, что NQR содержит лишь три флавина, а рибофлавин присутствует в этом ферменте в результате гидролиза фосфоэфирной связи остатков FMN.

Как описано выше, при анализе первичных последовательностей субъединиц NQR было предсказано, что NqrF может содержать железо-серный кластер [Rich et al., 1995]. В соответствии с этими предсказаниями 2Fe-2S кластер был обнаружен как в составе NQR-комплекса [Bogachev et al., 2001; Barquera et al., 2002], так и в изолированном фрагменте субъединицы NqrF [Turk et al., 2004]. Также, наряду с флавинами и 2Fe-2S кластером, NQR содержит одну молекулу прочно связанного убихинона-8 [Pfenninger-Li et al., 1996; Zhou et al., 1999, Barquera et al., 2002]. Таким образом, на сегодняшний день считается, что NQR в качестве кофакторов содержит один 2Fe-2S кластер, один нековалентно связанный FAD, два ковалентно связанных остатка FMN, а также, возможно, один убихинон-8 и один нековалентно связанный рибофлавин.

1.3. Каталитические активности NQR.

При функционировании in vivo NQR окисляет NADH и переносит два электрона на молекулу убихинона с образованием убихинола.

NADH + + Q+ 2Na+i„ NAD+ + QH2 + 2Na+0lIt (1)

Данная окислительно-восстановительная реакция сопряжена с векторным переносом двух ионов натрия через мембрану, т.е. соотношение Na+/e" для NQR равно 1 [Bogachev et al., 1997]. Хотелось бы отметить, что эффективность запасания энергии Na+-транслоцирующими КАВН:хинон-оксидоредуктазами в грубом приближении в два раза меньше по сравнению ВГ-транслоцируюгцими КАОН:хинон-оксидоредуктазами, в случае которых стехиометрия Н7е~ равна 2 [Wikstrom, 1984; Galkin et al., 1999].

Так как ионы натрия являются обязательными участниками катализируемой NQR реакции, то ее скорость зависит от концентрации Na+, и данный процесс практически полностью отсутствует в средах, истощенных по этому иону. При физиологических значениях ионной силы зависимость скорости реакции (1) от концентрации Na+ представляет собой гиперболу [Bogachev et al., 2001]. В этих условиях значения Km(Na+) для NQR из различных объектов находятся в миллимолярной области концентраций [Unemoto et al., 1977; Bogachev et al., 2001], и в случае фермента из V. harveyi это значение равно ~3 мМ [Bogachev et al., 2001]. NQR абсолютно специфичен по отношению к Na+. Все другие исследованные ионы не способны вызывать подобного активирующего действия на реакцию (1). Они лишь оказывают на нее неспецифическое стимулирующее воздействие, так как при увеличении ионной силы повышается сродство NQR к Na+ [Unemoto et al., 1977].

Важно отметить, что NQR даже в отсутствие ионов натрия не способен к транслокации протонов [Tokuda et al., 1985; Zhou et al., 1999]. Транспорт натрия ферментом сопровождается генерацией трансмембранного электрического потенциала (Ay) [Tokuda et al., 1985; Zhou et al., 1999]. В отсутствие Av|/, способного вызвать электрофоретический ток протонов через мембрану, не наблюдается какого-либо катализируемого NQR Na7H+-обмена. Это означает, что во время каталитического цикла NQR протоны, высвобождающиеся при окислении NADH, выделяются в цитоплазму, а протоны, необходимые для образования убихинола, также поглощаются с цитоплазматической стороны мембраны [Zhou et al., 1999]. Таким образом, NQR является первичной электрогенной натриевой помпой.

NQR довольно специфичен по отношению к NADH. Он не окисляет NADPH и из искусственных аналогов взаимодействует лишь с dNADH и тио-NADH [Zhou et al., 1999; Bourne and Rich, 1992].

На настоящий момент известно лишь относительно небольшое количество ингибиторов NQR. Недавно был описан антибиотик корормицин, специфически блокирующий NQR на уровне его взаимодействия с убихиноном [Hayashi et al., 2001b, Yoshikawa et al., 1999]. Корормицин действует на фермент неконкурентно по отношению к хинону, и константа ингибирования для него составляет -0,1 нМ [Yoshikawa et al., 1999]. Похожим действием на NQR обладает и HQNO [Tokuda and Unemoto, 1984], но сродство этого ингибитора к ферменту значительно хуже и приблизительно равно 0,3-0,4 мкМ [Zhou et al., 1999; Yoshikawa et al., 1999]. Также NQR чувствителен к действию низких концентраций ионов серебра [Asano et al., 1985] и некоторых других тяжелых металлов (Cd2+, Pb2+, Zn2+, Cu2+) [Bourne and Rich, 1992]. Эти ионы воздействуют на самые первые реакции каталитического цикла NQR, возможно препятствуя взаимодействию фермента с NADH [Bourne and Rich, 1992].

NQR кроме реакции (1) in vitro может осуществлять трансдегидрогеназную реакцию, перенося электроны с NADH на tho-NAD+. Данная активность не зависит от концентрации ионов натрия, ингибируется ионами тяжелых металлов и не чувствительна к HQNO [Bourne and Rich, 1992].

Выделенный фермент при взаимодействии с растворимыми хинонами кроме хинон-редуктазной реакции (реакции 1) может также осуществлять так называемую NADH-дегидрогеназную реакцию [Hayashi and Unemoto, 1984]. Данная активность заключается в одноэлектронном восстановлении растворимого хинона (менадиона, Qo, Qi и т.д.) или какого-то другого акцептора электронов (гексаамминорутения (III), феррицианида и т.д.). Как и трансдегидрогеназная активность, NADH-дегидрогеназная активность не зависит от концентрации ионов натрия, ингибируется ионами тяжелых металлов и не чувствительна к HQNO и корормицину [Hayashi et al., 2001b; Bourne and Rich, 1992; Hayashi and Unemoto, 1984]. Для осуществления данной реакции, по-видимому, достаточно функционирования одной субъединицы NqrF [Tan et al., 1996; Turk et al., 2004].

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Богачев, Александр Валерьевич

выводы

1. Предложен метод определения стехиометрии NaVe" для первичных натриевых помп в бактериальных клетках. С использованием этого метода установлено, что стехиометрия Na+/e" для N а+-транс л о цируюгцей NADH.xhhoh оксидоредуктазы равна 1.

2. Ка+-транслоцирующая NADH:xhhoh оксидоредуктаза из V. harveyi была очищена и охарактеризована. Показано, что фермент в дополнение к нековалентно связанному FAD содержит также остаток FMN, ковалентно связанный с субъединицей NqrC.

3. Очищенная Иа+-транслоцирующая NADH:xhhoh оксидоредуктаза была встроена в липосомы. На данной реконструированной системе была исследована генерация и ДрН. Показано, что необходимые для восстановления убихинона протоны захватываются ферментом с цитоплазматической стороны мембраны.

4. Иа+-транслоцирующая NADH:xhhoh оксидоредуктаза из V. harveyi была изучена с помощью ЭПР- и оптической спектроскопии. Показано, что в окисленных и полностью восстановленных препаратах этого белка присутствуют два флавиновых радикала с различными характеристиками. Один из них детектируется в окисленном ферменте и является нейтральным флавосемихиноном. Второй обнаруживается в полностью восстановленном ферменте и является анионным флавосемихиноном.

5. Исследована кинетика восстановления Ка+-транслоцирующей NADH:xhhoh оксидоредуктазы в присутствии NADH при различных концентрациях Na+. Показано, что эта кинетика состоит из трех различных фаз. Установлено, что скорость первой фазы не зависит от концентрации Na+, в то время как скорости второй и третьей фаз являются натрий-зависимыми. Первая фаза восстановления NQR определена как процесс двух-электронного восстановления нековалентно связанного FAD до FADH2, в то время как вторая и третья фазы представляют собой поочередное одноэлектронное восстановление двух ковалентно-связанных остатков FMN (восстановление нейтрального флавосемихинона до FMNH2 для второй фазы и восстановление окисленнной формы FMN до анионного флавосемихинона для третьей фазы). Восстановление ковалентно связанных остатков FMN зависит от концентрации ионов натрия с измеряемой константой активации 3,4 мМ. Это значение близко к значению Км для Na+ при функционировании фермента в стационарных условиях.

6. Проведено окислительно-восстановительное титрование простетических групп Na+-транслоцирующей NADH:xmhoh оксидоредуктазы и установлены значения их среднегочечных потенциалов. Найдено, что значения редокс-потенциалов всех оптически-видимых кофакторов NQR не зависят от концентрации натрия в среде измерения.

7. Методом 23№-ЯМР определены параметры связывания ионов натрия с Na+-транслоцирующей NADH:xhhoh оксидоредуктазой. Установлено, что константа диссоциации по Na+ для окисленной формы белка составляет 24 мМ, тогда как для восстановленной NQR - 30 мкМ. Таким образом, восстановление NQR приводит к 1000-кратному увеличению сродства фермента к сопрягающему иону. Проведено окислительно-восстановительное титрование сродства NQR к ионам натрия при 2 мМ [Na4"]. Это титрование описывается законом Нернста с Ет около -300 мВ и n = 1. Полученные данные указывают на то, что механизм сопряжения NQR основан на модуляции его ионной аффинности редокс состоянием простетической группы этого фермента. На основе результатов исследования NQR предложен возможный механизм функционирования Na+-транслоцирующей NADHixhhoh оксидоредуктазы.

8. Показано, что такие параметры как концентрация NaCl, значение рН и присутствие разобщителя в ростовой среде практически не оказывают влияния на экспрессию nqr генов V. harveyi и К. pneumoniae, кодирующих N а+- т р ан ело цир у ю щу ю NADH:xhhoh оксидоредуктазу. В то же время, экспрессия nqr V. harveyi и К. pneumoniae в значительной степени зависит от того, какие субстраты используются этими бактериями в качестве основного источника энергии. Особенно сильное влияние на экспрессию nqr V. harveyi оказывает доступность акцепторов электронов для дыхательной цепи и значения их окислительно-восстановительных потенциалов.

9. При исследовании электрон-транспортных цепей азотофиксирующей бактерии А. vinelandii и термогенного растения A. orientate, показано, что скоординированная индукция активностей компонентов несопряженной альтернативной ветви дыхательной цепи является универсальным механизмом для осуществления ускоренного дыхания, что может быть использовано для теплопродукции, понижения внутриклеточной концентрации кислорода, регуляции метаболических потоков или каких-либо других функций.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Богачев, Александр Валерьевич, Москва

1. Берцова Ю.В., и Богачев А.В. (2002) Функционирование терминальной оксидазы ¿¿¿з-типа у Azotobacter vinelandii. Биохимия, 67,750-756.

2. Берцова Ю.В., Попов В.Н. и Богачев А.В. (2004) Окисление NADH митохондриями термогенного растения Arum orientale. Биохимия, 69, 712-718.

3. Берцова Ю.В., Демин О.В. и Богачев А.В. (2005) Дыхательная защита нитрогеназного комплекса у Azotobacter vinelandii. Успехи биол. химии, 45, 205-234.

4. Берцова Ю.В., Попов В.Н., и Богачев А.В. (2004) Окисление NADH митохондриями термогенного растения Arum orientale. Биохимия, 69,712-718.

5. Богачев А.В. и Верховский М.И. (2005) Иа+-транслоцирующая NADH:xhhoh оксидоредуктаза достигнутый прогресс и перспективы исследований. Биохимия, 70, 177- 185.

6. Борисов В.Б. (1996) Цитохром bd: структура и свойства. Биохимия, 61, 786-799.

7. Григолава И.В., Константинов А.А., Ксензенко М.И., Рууге Э.К., и Тихонов А.Н. (1982) Взаимодействие убисемихинона с сукцинатдегидрогеназой и с цитохромной цепью митохондрий. Биохимия 47, 1970-1982.

8. Гривенникова В.Г., и Виноградов А.Д. (2003) Митохондриальный Комплекс I. Успехи биол. химии, 43, 19-58.

9. Львов Н.П. (1987) 43е ежегодные Баховские чтения. М.: "Наука", 7-14.

10. Манухов И.В., Берцова Ю.В., Трофимов Д.Ю., Богачев А.В., и Скулачев В.П. (2000) Изучение белка HI0220 из Haemophilus influenzae нового структурного и функционального аналога белка АгсВ из Escherichia coli. Биохимия, 65, 1564-1571.

11. Скулачев, В. П. (1989) Энергетика биологических мембран, М., Наука.

12. Тихонов А.Н., и Самарский А.А. (1972) Уравнения математической физики. М.: "Наука".

13. Хмель И.А., Габинская К.Н., и Иерусалимский Н.Д. (1965) Рост и азотфиксация Azotobacter vinelandii в условиях различной аэрации Микробиология. 34, 689-694.

14. Хмель И.А., и Габинская К.Н. (1965) Влияние аэрации на рост Azotobacter vinelandii при использовании различных соединений углерода. Микробиология, 34, 763-767.

15. Ackrell, В.А., and Jones, C.W. (1971) The respiratory system of Azotobacter vinelandii. I Properties of phosphorylating respiratory membranes. Eur. J. Biochem., 20, 22-28.

16. Ackrell, B.A., and Jones, C,W. (1971) The respiratory system of Azotobacter vinelandii. 2. Oxygen effects. Eur. J. Biochem., 20, 29-35.

17. Ackrell, B.A., Erickson, S.K., and Jones, C.W. (1972) The respiratory-chain NADPH dehydrogenase of Azotobacter vinelandii. Eur. J. Biochem., 26, 387-392.

18. Affourtit, C., Albury, M. S., Crichton, P. G., and Moore, A. L. (2002) Exploring the molecular nature of alternative oxidase regulation and catalysis. FEBS Lett., 510, 121126.

19. Alexeyev, M.F. (1999) The pKNOCK series of broad-host-range mobilizable suicide vectors for gene knockout and targeted DNA insertion into the chromosome of gramnegative bacteria. Biotechniques, 26, 824-828.

20. Asano, M., Hayashi, M., Unemoto, T„ and Tokuda, H. (1985) Ag+-sensitive NADH dehydrogenase in the Na+-motive respiratory chain of the marine bacterium Vibrio alginolyticus. Agric. Biol. Chem., 49, 2813-2817.

21. Barquera, B., Hase, C.C., and Gennis, R.B. (2001) Expression and mutagenesis of the NqrC subunit of the NQR respiratory Na+ pump from Vibrio cholerae with covalently attached FMN. FEBSLett., 492, 45-49.

22. Barquera, B., Zhou, W., Morgan, J.E., and Gennis, R.B. (2002) Riboflavin is a component of the Na+-pumping NADH-quinone oxidoreductase from Vibrio cholerae. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 10322-10324.

23. Bauer, C.E., Elsen, S., and Bird, T.H. (1999) Mechanisms for redox control of gene expression. Annu. Rev. Microbiol, 53, 495-523.

24. Bergman, B., Gallon, J.R., Rai, A.N., and Stal, L.J. (1997) N2 fixation by non-heterocystous cyanobacteria. FEMSMicrobiol. Rev., 19, 139-185.

25. Bertsova, Y.Y., Bogachev, A.V., and Slculachev, Y.P. (1997) Generation of protonic potential by the bd-type quinol oxidase of Azotobacter vinelandii. FEBS Lett., 414, 369372.

26. Bertsova, Y.V., Bogachev, A.V., and Skulachev, V.P. (1998) Two NADH ubiquinone oxidoreductases of Azotobacter vinelandii and their role in the respiratory protection. Biochim. Biophys. Acta, 1363, 125-133.

27. Bertsova, Y.V., Bogachev, A.V., and Skulachev, V.P. (2001) Noncoupled NADH:ubiquinone oxidoreductase of Azotobacter vinelandii is required for diazotrophic growth at high oxygen concentrations. J. Bacteriol, 183, 6869-6874.

28. Bertsova, Y.V., and Bogachev, A.V. (2004) The origin of the sodium-dependent NADH oxidation by the respiratory chain of Klebsiella pneumoniae. FEBS Lett., 563, 207-212.

29. Bilous, P.T., and Weiner, J.H. (1985) Dimethyl sulfoxide reductase activity by anaerobically grown Escherichia coli HB101. J. Bacteriol, 162, 1151-1155.

30. Bilous, P.T., and Weiner, J.H. (1985) Proton translocation coupled to dimethyl sulfoxide reduction in anaerobically grown Escherichia coli HB101. J. Bacteriol, 163, 369-375.

31. Bilous, P.T., Cole, S.T., Anderson, W.F., and Werner, J.H. 1988. Nucleotide sequence of the dmsABC operon encoding the anaerobic dimethylsulfoxide reductase of Escherichia coli. Mol. Microbiol., 2, 785-795.

32. Bjorklof, K., Zickermann, V., and Finel, M. (2000) Purification of the 45 kDa, membrane bound NADH dehydrogenase of Escherichia coli (NDH-2) and analysis of its interaction with ubiquinone analogues. FEBSLett., 467, 105-110.

33. Bogachev, A.V., Murtazina, R.A., and Skulachev, V.P. (1996) H+/e" stoichiometry for the NADH dehydrogenase I and dimethyl sulfoxide reductase in anaerobically grown Escherichia coli cells. J. Bacteriol, 178, 6233-6237.

34. Bogachev, A. V., Murtazina, R. A., and Skulachev, V. P. (1997) The Na+/e" stoichiometry of the Na+-motive NADH:quinone oxidoreductase in Vibrio alginolyticus. FEBSLett., 409, 475-477.

35. Bogachev, A.V., Bertsova, Y.V., Barquera, B., and Verkhovsky, M.I. (2001) Sodium-dependent steps in the redox reactions of the Na+-motive NADH:quinone oxidoreductase from Vibrio hcirveyi. Biochemistry, 40, 7318-7323.

36. Bogachev, A.V., Bertsova, Y.V., Ruuge, E.K., Wikstrom, M., and Verkhovsky, M.I. (2002) Kinetics of the spectral changes during reduction of the Na+-motive NADH:quinone oxidoreductase from Vibrio harveyi. Biochim. Biophys. Acta, 1556, 113120.

37. Bogachev, A.V., Bertsova, Y.V., Bloch, D.A., and Verkhovsky, M.I. (2006) Thermodynamic properties of the redox centers of Na+-translocating NADH:quinone oxidoreductase. Biochemistry, 45, 3421-3428.

38. Brigle, K.E., Newton, W.E., and Dean, D.R. (1985) Complete nucleotide sequence of the Azotobacter vinelandii nitrogenase structural gene cluster. Gene, 37, 37-44.

39. Bull, T.E. (1972) Nuclear magnetic relaxation of spin-3/2 nuclei involved in chemical exchange. J. Magn. Reson., 8, 344-353.

40. Calhoun, M.W., and Gennis, R.B. (1993) Demonstration of separate genetic loci encoding distinct membrane-bound respiratory NADH dehydrogenases in Escherichia coli. J. Bacteriol, 175, 3013-3019.

41. Collins, M. J., Arciero, D. M., and Hooper, A. B. (1993) Optical spectropotentiometric resolution of the hemes of hydroxylamine oxidoreductase. Heme quantitation and pH dependence ofEn. </ Biol. Chem., 268, 14655-14662.

42. Cook, N. D., and Cammack, R. (1985) Effects of temperature on electron transport in Arum maculatum mitochondria. Biochim. Biophys. Acta, 827, 30-35.

43. Cornelis A., Laszlo P. (1979) Sodium binding sites of gramicidin A: sodium-23 nuclear magnetic resonance study. Biochemistry, 18, 2004-2007.

44. Cotter, P.A., Chepuri, V., Gennis, R.B., and Gunsalus, R.P. (1990) Cytochrome o (cvoABCDE) and d icydAW) oxidase gene expression in Escherichia coli is regulated by oxygen, pH and the fnr gene product. J. Bacteriol., 172, 6333-6338.

45. Cotter, P.A., and Gunsalus, R.P. (1989) Oxygen, nitrate, and molybdenum regulation of dmsABC gene expression in Escherichia coli. J. Bacteriol., 171, 3817-3823.

46. Cottingham, I. R., and Moore, A. L. (1984) Partial purification and properties of the external NADH dehydrogenase from cuckoo-pint {Arum maculatwri) mitochondria. Biochem. J., 224, 171-179.

47. Couperwhite, I., and McCallum, M.F. (1975) Polysaccharide production and the possible occurrence of GDP-D-mannose dehydrogenase in Azotobacter vinelandii. Antonie Van Leeuwenhoek, 41, 25-32.

48. Dalton, H., and Postgate, J.R. (1969) Growth and physiology of Azotobacter chroococcum in continuous culture. J. Gen. Microbiol., 56, 307-319.

49. DeLuca, G., Asso, M., Belaich, J.P., and Dermoun, Z. (1998) Purification and characterization of the HndA subunit of NADP-reducing hydrogenase from Desulfovibrio fructosovorans overproduced in Escherichia coli. Biochemistry, 37, 26602665.

50. Dimroth, P., and Thomer, A. (1989) A primary respiratory Na+ pump of an anaerobic bacterium: the Na+-dependent NADH:quinone oxidoreductase of Klebsiella pneumoniae. Arch Microbiol, 151, 439-444.

51. Duffy, E.B., and Barquera, B. (2006) Membrane topology mapping of the Na+-pumping NADH: quinone oxidoreductase from Vibrio cholerae by PhoA-green fluorescent protein fusion analysis. J. Bacteriol., 188, 8343-8351.

52. Ellis, W. R„ Jr., Wang, H., Blair, D. F„ Gray, H. B., and Chan, S. I. (1986) Spectroelectrochemical study of the cytochrome a site in carbon monoxide inhibited cytochrome c oxidase. Biochemistry, 25, 161-167.

53. Erickson, S.K., Ackrell, B.A., and Jones, C.W. (1972) The respiratory-chain dehydrogenases of Azotobacter vinelandii. Biochem. J., 127, 73-74.

54. Fay, P. (1992) Oxygen relations of nitrogen fixation in cyanobacteria. Microbiol. Rev., 56, 340-373.

55. Ferguson, S.J. (1998) Nitrogen cycle enzymology. Curr. Opin. Chem. Biol., 2, 182-193.

56. Friedrich, T., and Scheide, D. (2000) The respiratory complex I of bacteria, archaea and eukarya and its module coMMon with membrane-bound multisubunit hydrogenases. FEBS Lett, 479, 1-5.

57. Fu, H.-A., Iuchi,S., and Lin, E.C.C. (1991) The requirement of ArcA and Fnr for peak expression of the cyd operon in Escherichia coli under microaerobic conditions. Mol. Gen. Genet., 226, 209-213.

58. Galkin, A.S., Grivennikova, V.G., and Vinogradov, A.D. (1999) H+/2e" stoichiometry in NADH-quinone reductase reactions catalyzed by bovine heart submitochondrial particles. FEBSLett., 451, 157-161.

59. Gemperli, A.C., Dimroth, P., and Steuber, J. (2002) The respiratory complex I (NDH I) from Klebsiella pneumoniae, a sodium pump. J. Biol. Chem277, 33811-33817.

60. Gemperli, A.C., Dimroth, P., and Steuber, J. (2003) Sodium ion cycling mediates energy coupling between complex I and ATP synthase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100, 839844.

61. Georgellis, D„ Kwon, O., Lin, E.C., Wong, S. M., and Akerley, B. J. (2001) Redox signal transduction by the ArcB sensor kinase of Haemophilus influenzae lacking the PAS domain. J. Bacteriol., 183, 7206-7212.

62. Goin, J.T., and Olson, J.S. (1979) The rate of oxygen uptake by human red blood cells. J. Biol. Chem., 254, 1178-1190.

63. Gostimskaya, I. S., Grivennikova, V. G., Zharova, T. V., Bakeeva, L. E., and Vinogradov, A. D. (2003) In situ assay of the intramitochondrial enzymes: use of alamethicin for permeabilization of mitochondria. Anal. Biochem., 313,46-52.

64. Grandjean, J., and Laszlo, P. (1977) Sodium complexation by the calcium binding site of parvalbumin. FEBS Lett., 81, 376-380.

65. Grivennikova, V. G., Kapustin, A. N., and Vinogradov, A. D. (2001) Catalytic activity of NADH-ubiquinone oxidoreductase (complex I) in intact mitochondria. Evidence for the slow active/inactive transition. J. Biol. Chem., 276, 9038-9044.

66. Haddock, B.A., and Jones, C.W. (1977) Bacterial respiration. Bacteriological Reviews, 41,47-99.

67. Hase, C. C., and Mekalanos, J. J. (1999) Effects of changes in membrane sodium flux on virulence gene expression in Vibrio cholerae. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 3183-3187.

68. Hase, C.C., Fedorova, N.D., Galperin, M.Y., and Dibrov, PA. (2001) Sodium ion cycle in bacterial pathogens: evidence from cross-genome comparisons. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 65, 353-370.

69. Hayashi, M., and Unemoto, T. (1984) Characterization of the Na+-dependent respiratory chain NADH:quinone oxidoreductase of the marine bacterium, Vibrio alginolyticus, in relation to the primary H" pump. Biochim. Biophys. Acta, 767, 470-478.

70. Hayashi, M., Hirai, K., and Unemoto, T. (1995) Sequencing and the alignment of structural genes in the nqr operon encoding the Na+-translocating NADH-quinone reductase from Vibrio alginolyticus. FEBS Lett., 363,75-77.

71. Hayashi, M., Nakayama, Y., and Unemoto, T. (2001b) Recent progress in the Na+-translocating NADH-quinone reductase from the marine Vibrio alginolyticus. Biochim. Biophys. Acta, 1505, 37-44.

72. Hill, S. (1988) How is nitrogenase regulated by oxygen? FEMSMicrobiol. Rev., 54, 111130.

73. Hill, S., Austin, S., Eydmann, T., Jones, T., and Dixon, R. (1996) Azotobacter vinelandii NIFL is a flavoprotein that modulates trancriptional activation of nitrogen-fixation genes via a redox-sensitive switch. Proc. Natl. Acad Set. USA, 93, 2143-2148.

74. Hinchliffe, P., and Sazanov, L.A. (2005) Organization of iron-sulfur clusters in respiratory complex 1. Science, 309, 771-774.

75. Hoefnagel, M. H. N., Rich, P. R., Zhang, Q., and Wiskich, J. T. (1997) Substrate kinetics of the plant mitochondrial alternative oxidase and the effects of pyruvate. Plant Physiol., 115, 1145-1153.

76. Hoffman, P.S., Morgan, T.V., and DerVartanian, D.V. (1979) Respiratory-chain characteristics of mutants of Azotobacter vinelandii negative to tetramethyl-p-phenylenediamine oxidase. Eur. J. Biochem., 100, 19-27.

77. Hoffman, P.S., Morgan, T.Y., and DerVartanian, D.V. (1980) Respiratory properties of cytochrome c-dificient mutants of Azotobacter vinelandii. Eur. J. Biochem., 110, 349354.

78. Hubbard, P.S. (1970) Nonexponential nuclear magnetic relaxation by quadrupole interactions. J. Chem. Phys., 53, 985-987.

79. Ingledew, W.J., and Poole, R.K. (1984) The respiratory chains of Escherichia coli. Microbiol. Rev., 48, 222-271.

80. Ito, K. (1999) Isolation of two distinct cold-inducible cDNAs encoding plant uncoupling proteins from the spadix of skunk cabbage (Symplocarpus foetidus). Plant Sci., 149, 167173.

81. Ito, K., Abe, Y., Johnston, S. D., and Seymour, R. S. (2003) Ubiquitous expression of a gene encoding for uncoupling protein isolated from the thermogenic inflorescence of the dead horse arum Helicodiceros muscivorus. J. Exp. Bot., 54, 1113-1114.

82. James, W. O., and Beevers, H. (1950) The respiration of Arum spadix. A rapid respiration, resistant to. cyanide. New Phytol, 49, 353-374.

83. Jasaitis, A., Borisov, V.B., Belevich, N.P., Morgan, J.E., Konstantinov, A.A., and Verkhovsky, M.I. (2000) Biochemistry, 39, 13800-13809.

84. Jones, R.W. (1979) Hydrogen-dependent proton translocation by membrane vesicles from Escherichia coli. Biochem. Soc. Trans., 7, 1136-1137.

85. Jones, R.W. (1980) Proton translocation by the membrane-bound formate dehydrogenase of Escherichia coli. FEMS Microbiol. Lett., 8, 167-171.

86. Jones, C.W., and Redfearn, E.R. (1966) Electron transport in Azotobacter vinelandii. Biochim. Biophys. Acta, 113, 467-481.

87. Jones, C.W., and Redfearn, E.R. (1967) The cytochrome system of Azotobacter vinelandii. Biochim. Biophys. Acta, 143, 340-353.

88. Jones, C.W., Ackrell, B.A., and Erickson, S.K. (1971) Respiratory control in Azotobacter vinelandii membranes. Biochim. Biophys. Acta, 245, 54-62.

89. Jones, C.W., Brice, J.M., Wright, V., and Ackrell, B.A. (1973) Respiratory protection of nitrogenase in Azotobacter vinelandii. FEES Lett., 29, 77-81.

90. Junemann, S. (1997) Cytochrome bd terminal oxidase. Biochim. Biophys. Acta, 1321, 107-127.

91. Junemann, S., Butterworth, P.J., and Wrigglesworth, J.M. (1995) A suggested mechanism for the catalytic cycle of cytochrome bd terminal oxidase based on kinetic analysis. Biochemistry, 34, 14861-14867.

92. Junemann, S., and Wrigglesworth, J.M. (1996) Cytochrome bd oxidase from Azotobacter vinelandii. Purification and quantitation of the oxygen reduction site. J. Biol. Chem., 270, 16213-16220.

93. Jurtshuk, P.Jr., Mueller, T.J., and Wong, T.Y. (1981) Isolation and purification of the cytochrome oxidase of Azotobacter vinelandii. Biochim. Biophys. Acta, 637, 374-382.

94. Kolonay Jr.J.F., Moshiri, F., Gennis, R.B., Kaysser, T.M., and Maier, R.J. (1994) Purification and chracterization of the cytochrome bd complex from Azotobacter vinelandii: comparison to the complex from Escherichia coli. J. Bacteriol., 176, 41774181.

95. Kolonay, J.F., and Maier, R.J. (1997) Formation of pH and potential gradients by the reconstituted Azotobacter vinelandii cytochrome bd respiratory protection oxidase. J. Bacteriol, 179,3813-3817.

96. Kranz, R.G., and Gennis, R.B. (1985) Immunological investigation of the destribution of cytochromes related to the two terminal oxidases of of Escherichia coli in the other gram-negative bacteria. J. Bacteriol, 161, 709-713.

97. Leif, H, Sled, V.D., Ohnishi T., Weiss, H., and Friedrich, T. (1995) Isolation and characterization of the proton-translocating NADH: ubiquinone oxidoreductase .rom Escherichia coli. Eur. J. Biochem., 230, 538-548.

98. Lemasters, J.J., Grunwald, R., and Emaus, R.K. (1984) Thermodynamic limits to the ATP/site stoichiometrics of oxidative phosphorylation by rat liver mitochondria. J. Biol. Chem., 259, 3058-3063.

99. Lin, E.C.C., and Iuchi, S. (1991) Regulation of gene expression in fermentative and respiratory systems in Escherichia coli and related bacteria. Annu. Rev. Genet., 25, 361 -387.

100. Linkerhagner, K., and Oelze, J. (1996) Cellular ATP levels and Nitrogenase switchoff upon oxygen stress in chemostat cultures of Azotobacter vinelandii. J. Bacteriol., 177, 5289-5293.

101. Malpica, R„ Sandoval, G.R., Rodriguez, C., Franco, B., and Georgellis, D. (2006) Signaling by the arc two-component system provides a link between the redox state of the quinone pool and gene expression. Antioxid. Redox. Signal., 8, 781-795.

102. Massey, V. (2000) The chemical and biological versatility of riboflavin, Biochem. Soc. Trans., 28, 283-296.

103. Massey, V., and Palmer, G. (1966) On the existence of spectrally distinct classes of flavoprotein semiquinones. A new method for the quantitative production of flavoprotein semiquinones. Biochemistry, 5, 3181-3189.

104. Matsushita, K., Ohnishi, T., and Kaback, H.R. (1987) NADH-ubiquinone oxidoreductases of the Escherichia coli aerobic respiratory chain. Biochemistry, 26, 7732-7737.

105. Maynard, R.H., Premakumar, R., and Bishop, P.E. (1994) Mo-independent nitrogenase 3 is advantageous for diazotrophic growth of Azotobacter vinelandii on solid medium containing molybdenum. J. Bacteriol, 176, 5583-5586.

106. Mcintosh, L. (1994) Molecular biology of the alternative oxidase. Plant Physiol., 105, 781-786.

107. M0ller, I. M. (2002) A new dawn for plant mitochondrial NAD(P)H dehydrogenases. Trends Plant Sci., 7, 235-237.

108. Monoi, H. (1985) Nuclear magnetic resonanceof Na ions interacting with thegramicidin channel. Biophys. J., 48, 643-662.

109. Moshiri, F., Chawla, A., and Maier, R.J. (1991) Cloning, characterization, and expression in Escherichia coli of the genes encoding the cytochrome d oxidase complex from Azotobacter vinelandii. J. Bacteriol, 173, 6230-6241.

110. Murataliev, M.B. (1999) Application of electron spin resonance (ESR) for detection and characterization of flavoprotein semiquinones. Methods Mol. Biol., 131, 97-110.

111. Nakamura, T., Tokuda, H., and Unemoto, T. (1982) Effect of pH and monovalent cations on the potassium ion exit from the marine bacterium Vibrio alginolyticus, and the manipulation of the cellular cation contains. Biochim. Biophys. Acta, 692, 389-396.

112. Nakamura, T., Tokuda, H., and Unemoto, T. (1986) N-ethylmaleimide desensitizes pH-dependence of K+/H+ antiporter in a marine bacterium, Vibrio alginolyticus. Biochem. Biophys. Res. Commun., 136, 1030-1035.

113. Nakayama, Y., Hayashi, M., and Unemoto, T. (1998) Identification of six subunits constituting Na'-translocating NADH-quinone reductase from the marine Vibrio alginolyticus. FEBSLett., 422, 240-242.

114. Nakayama, Y., Yasui, M., Sugahara, K., Hayashi, M., and Unemoto, T. (2000) Covalently bound flavin in the NqrB and NqrC subunits of Na+-translocating NADH-quinone reductase from Vibrio alginolyticus. FEBSLett., 474, 165-168.

115. Osborne, J.P., and Gennis, R.B. (1999) Sequence analysis of cytochrome bd oxidase suggests a revised topology for subunit I. Biochim. Biophys. Acta, 1410, 32-50.

116. Padan, E., Venturi, M., Gerchman, Y., and Dover, N. (2001) Na+/H+ antiporters. Biochim. Biophys. Ada, 1505,144-157.

117. Palmer, G., Muller, F., and Massey, Y. (1971) Electron paramagnetic resonance studies on flavoprotein radicals, in: H. Kamin, (Ed.), Flavins and Flavoproteins, University Park Press & Butterworths, Baltimore & London, pp. 123-139.

118. Pfenninger-Li, X.D, and Dimroth, P. (1995) The Na+-translocating NADH-ubiquinone oxidoreductase from the marine bacterium Vibrio alginolyticus contains FAD but not FMN. FEBS Lett, 369, 173-176.

119. Pfenninger-Li, X.D., Albracht, S.P.J., van Belzen, R,, and Dimroth, P. (1996) NADH:ubiquinone oxidoreductase of Vibrio alginolyticus: purification, properties, and reconstitution of the Na+ pump. Biochemistry, 35, 6233-6242.

120. Poole, R.K. (1994) Oxygen reactions with bacterial oxidases and globins: binding, reduction and regulation. Antonie van Leewenhoek, 65, 289-310.

121. Poole, R.K., and Hill, S. (1997) Respiratory protection of nitrogenase activity in Azotobacter vinelandii roles of the terminal oxidases. Biosci. Rep., 17, 303-317.

122. Popov, V. N., Markova, O. V., Mokhova, E. N., and Skulachev, V. P. (2002) Effects of cold exposure in vivo and uncouplers and recouplers in vitro on potato tuber mitochondria. Biochim. Biophys. Acta, 1553,232-237.

123. Post, E., Golecki, J.R., and Oelse, J. (1982) Morphological and ultrastructural variations in Azotobacter vinelandii growing in oxygen-controlled continous culture. Arch. Microbiol., 133, 75-82.

124. Post, E,, Kleiner, D., and Oelse, J. (1983) Whole cell respiration and nitrogenase activities in Azotobacter vinelandii growing in oxygen controlled continuous culture. Arch. Microbiol, 134, 68-72.

125. Pozzan, T., Miconi, V., DiVergilio, F., and Azzone, G.F. (1979) H+/site, charge/site, and ATP/site ratios at coupling sites I and II in mitochondrial e" transport. J. Biol. Chem., 254, 10200-10205.

126. Rey, L., and Maier, R.J. (1997) Cytochrome c terminal oxidase pathway of Azotobacter vinelandii-. analysis of cytochrome c4 and c5 mutants and up-regulation of cytochrome independent pathways with N2 fixation. J. Bacteriol, 179, 7191-7196.

127. Rich, P.R., Meinier, B., and Ward, B. (1995) Predicted structure and possible ion-motive mechanism of the sodium-linked NADH-quinone oxidoreductase of Vibrio alginolyticus. FEBSLett, 375, 5-10.

128. Roberts, T. H., Fredlund, K. M., and Moller, I. M. (1995) Direct evidence for the presence of two external NAD(P)H dehydrogenases coupled to the electron transport chain in plant mitochondria. FEBS Lett., 373, 307- 309.

129. Robson, R.L., and Postgate, J.R. (1980) Oxygen and hydrogen in biological nitrogen fixation. Annu. Rev. Microbiol., 34, 183-207.

130. Sabra, W., Zeng, A.P., Lunsdorf, H., and Deckwer, W.D. (2000) Effect of oxygen on formation and structure of Azotobacter vinelandii alginate and its role in protecting nitrogenase. Appl. Environ. Microbiol., 66, 4037-4044.

131. Sambasivarao, D., and Weiner, J.H. (1991) Dimethyl sulfoxide reductase of Escherichia coli: an investigation of function and assembly by use of in vivo complementation. J. Bacteriol, 173, 5935-5943.

132. Satoh, T., Miyoshi, H., Sakamoto, K., and Iwamura, H. (1996) Comparison of the inhibitory action of synthetic capsaicin analogues with various NADH-ubiquinone oxidoreductases. Biochim. Biophys. Acta, 1273, 21-30.

133. Seymour, R. S. (2001) Biophysics and physiology of temperature regulation in thermogenic flowers. Biosci. Rep., 21, 223-236.

134. Shah, V.K., and Brill, W.J. (1977) Evidence for multiple substrate-reduction sites and distinct inhibitor-binding sites from an altered Azotobacter vinelandii nitrogenase MoFe protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 3249-3253.

135. Shen, J., Dean, D.R., and Newton, W.E. (1997) Evidence for multiple substrate-reduction sites and distinct inhibitor-binding sites from an altered Azotobacter vinelandii nitrogenase MoFe protein. Biochemistry, 36, 4884-4894.

136. Shi, N.Q., Cruz, J., Sherman, F., and Jeffries, T.W. (2002) SHAM-sensitive alternative respiration in the xylose-metabolizing yeast Pichia stipitis. Yeast, 19, 1203-1220.

137. Siedow, J. N., and Umbach, A. L. (1995) Plant mitochondria. electron transfer and molecular biology. Plant Cell, 7, 821-831.

138. Skulachev, V.P. (1984) Sodium bioenergetics. Trends Biochem. Sci., 9,483-485.

139. Skulachev, V. P. (1989) The sodium cycle: a novel type of bacterial energetics. J. Bioenerg. Biomembr., 21, 635-647.

140. Sled, V.D., Friedrich, T„ Leif, H., Weiss, H., Meinhardt, S.W., Fukumori, Y., Calhoun, M.W., Gennis, R.B., and Ohnishi, T. (1993) Bacterial NADH quinone oxidoreductases: iron-sulfur clusters and related problems. J. Bioenerg. Biomembr., 25, 347-356.

141. Smith, P.K., Krohn, R.I., Hermanson, G.T., Mallia, A.K., Gartner, F.H., Provenzano, M.D., Fujimoto, E.K., Goeke, N.M., Olson, B.J., and Klenk, D.C. (1985) Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem., 150, 76-85.

142. Spiro, S., Roberts, R.E., and Guest, J.R. 1989. Fnr-dependent repression of the ndh gene of Escherichia coli and metal ion requirement for /w-regulated gene expression. Mol. Microbiol., 3,601-608.

143. Stankovich, M.T., Schopfer, L.M., and Massey, V. (1978) Determination of glucose oxidase oxidation-reduction potentials and the oxygen reactivity of fully reduced and semiquinoid forms. J. Biol Chem., 253,4971-4979.

144. Steuber, J. (2001) The Na+-translocating NADH:quinone oxidoreductase (NDH I) from Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli: implications for the mechanism of redox-driven cation translocation by complex I. J. Bioenerg. Biomembr., 33, 179-186.

145. Steuber, J., Rufibach, M., Fritz, G„ Neese, F., and Dimroth, P. (2002) Inactivation of the Na+-translocating NADH ubiquinone oxidoreductase from Vibrio alginolyticus by reactive oxygen species. Eur. J. Biochem., 269, 1287-1292.

146. Svensson, A. S., and Rasmusson, A. G. (2001) Light-dependent gene expression for proteins in the respiratory chain of potato leaves. Plant J., 28, 73-82.

147. Svensson, A. S., Johansson, F. I., Moller, I. M., and Rasmusson, A. G. (2002) Cold stress decreases the capacity for respiratory NADH oxidation in potato leaves. FEBS Lett., 517, 79-82.

148. Suefuji, K., Lin, S.J., Wakagi, T., Matsuzawa, H., and Yoshimura, E. (2002) Sodium-23 and lanthanum-139 nuclear magnetic resonance studies of cation binding to aqualysin I, a thermostable serine protease. Biosci. Biotechnol. Biochem., 66, 1281-1286.

149. Thony-Meyer, L., Beck, C., Preisig, O., and Hennecke, H. (1994) The ccoNOQP gene cluster codes for a cb-type cytochrome oxidase that functions in aerobic respiration of Rhodobacter capsulatus. Mol. Microbiol., 14, 705-716.

150. Timonin, I.M., Dvoryantsev, S.N., Petrov, V.Y., Ruuge, E.K., and Levitsky, D.O. (1991) Interaction of alkaline metal ions with Ca -binding sites of Ca2+-ATPase of sarcoplasmic reticulum: Na-NMR studies. Biochim. Biophys. Acta, 1066, 43-53.

151. Tokuda, H., and Unemoto, T. (1981) A respiration-dependent primary sodium extrusion system functioning at alkaline pH in the marine bacterium Vibrio alginolyticus. Biochem. Biophys. Res. Commun., 102,265-271.

152. Tokuda, H., and Unemoto, T. (1982) Characterisation of the respiration-dependent Na+ pump in the marine bacterium Vibrio alginolyticus. J. Biol. Chem., 257, 10007-10014.

153. Tokuda, H., and Unemoto, T. (1984) Na+ istranslocated at NADH:quinone oxidoreductase segment in the respiratory chain of Vibrio alginolyticus. J. Biol. Chem., 259, 7785-7790.

154. Tokuda, H., Sugasawa, M., and Unemoto, T. (1982) Roles of Na+ and K+ in a-aminoisobutyric acid transport by the marine bacterium Vibrio alginolyticus. J. Biol. Chem., 257, 788-794.

155. Turk, K., Puhar, A., Neese, F., Bill, E., Fritz, G., and Steuber, J. (2004) NADH oxidation by the Na+-translocating NADH:quinone oxidoreductase from Vibrio cholerae: functional role of the NqrF subunit. J. Biol Chem., 279,21349-21355.

156. Unden, G., Becker, S., Bongaerts, J., Holighaus, G., Schirawski, J.,-and Six, S. (1995) 02-Sensing and 02-dependent gene regulation in facultatively anaerobic bacteria. Arch. Microbiol., 164, 81-90.

157. Urry, D.W., Trapane, T.L., Venkatachalam, C.M., and McMichens, R.B. (1989) Ion interactions at membranous polypeptide sites using nuclear magnetic resonance: determining rate and binding constants and site locations. Methods Enzymol., 171, 286342.

158. Vercesi, A. E., Martins, I. S., Silva, M. A. P, Leite, H. M. F., Cuccovia, I. M., and Chaimovich, H. (1995) PUMPing plants. Nature, 375, 24.

159. Vinogradov, A.D. (1993) Kinetics, control, and mechanism of ubiquinone reduction by the mammalian respiratory chain-linked NADH-ubiquinone reductase. J. Bioenerg. Biomembr., 25, 367-375.

160. Wagner, A. M., and Moore, A. L. (1997) Structure and function of the plant alternative oxidase: its putative role in the oxygen defence mechanism. Biosci. Rep., 17, 319-333.

161. Werner, J.H., Maclsaac, D.P., Bishop, R.E., and Bilous, P.T. (1988) Purification and properties of Escherichia coli dimethyl sulfoxide reductase, an iron-sulfur molybdoenzyme with broad substrate specificity. J. Bacteriol., 170, 1505-1510.

162. Weiss, H., Friedrich, T., Hofhaus, G., andPreis, D. (1991) The respiratory-chain NADH dehydrogenase (complex I) of mitochondria. Eur. J. Biochem., 197, 563-576.

163. Wikstrom, M. (1984) Two protons are pumped from the mitohondrial matrix per electron transfered between NADH and ubiquinone. FEBSLett., 169, 300-304.

164. Wikstrom, M., and Penttila, T. (1982) Critical evaluation of the proton-translocating property of cytochrome oxidase in rat liver mitochondria. FEBS Lett., 144, 183-189.

165. Wikstrom, M., Bogachev, A., Finel, M., Morgan, J.E., Puustinen, A., Raitio, M., Verkhovskaya, M., and Verkhovsky, M.I. (1994) Mechanism of proton translocation by the respiratory oxidases. The histidine cycle. Biochim. Biophys. Acta, 1187, 106-111.

166. Williams, A.M., and Wilson, P.W. (1954) Adaptation of Azotobacter cells to tricarboxylic acid substrates. J. Bacteriol, 67, 353-360.

167. Wissenbach, U., Ternes, D., and Unden, G. (1992) An Escherichia coli mutant containing only demethylmenaquinone, but no menaquinone: effects on fumarate, dimethylsulfoxide, trimethylamine N-oxide and nitrate respiration. Arch. Microbiol, 158, 68-73.

168. Wu, G., Hill, S., Kelly, M.J.S., Sawers, G., and Poole, R.K. (1997) The cydR gene product, required for cytochrome bd expression in obligate aerobe Azotobacter vinelandii, is an FNR-like protein. Microbiology, 143, 2197-2207.

169. Yagi, T. (1990) Inhibition by capsaicine of NADH quinone oxidoreductases is correlated with the presence of energy-coupling site I in various organisms. Arch. Biochem. Biophys., 281, 305-311.

170. Yagi, T. (1991) Bacterial NADH-quinone oxidoreductases. J. Bioenerg. Biomembr., 23, 211-225.

171. Yates, M.G. (1988). The nitrogen and sulphur cycles. I.A. Cole and S.I. Ferguson (ed.), University Press, Cambridge, 42, 386-416.

172. Young, I.G., Rogers, B.L., Campbell, H.D., Jaworowski, A., and Shaw, D.C. (1981) Nucleotide sequence coding for the respiratory NADH dehydrogenase of Escherichia coli. Eur. J. Biochem., 116, 165-170.

173. Zambrano, M.M., and Kolter, R. (1993) Escherichia coli mutants lacking NADH dehydrogenase I have a competitive disadvantage in stationary phase. J. Bacteriol., 175, 5642-5647.

174. В заключении мне хотелось бы выразить сердечную благодарность Владимиру Петровичу Скулачеву и Михаилу Иосифовичу Верховскому, которых я рассматриваю как основных моих научных Учителей, и без которых представленная работа была бы невозможной.