Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Некоторые механизмы регуляции калиевой проницаемости эритроцитов

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Некоторые механизмы регуляции калиевой проницаемости эритроцитов"

ереванский государственный университет

На правах рукопиои

геокчаш гаяне ыкртычевна

некоторые механизмы регуляции калиевой прсницшости эритроцитов

03.00.02 - Биофизика

автореферат '

диосертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1^еван - 1993

Работа выполнена в лаборатории энергообмена и биологически активных веществ Института хирургии им. А.Л.Микаеляна МЗ Республики Армения.

Научный руководитель: кандидат физико-математических,

наук, ГЮЛЬХАВДАНЯН A.B.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

ведущий научный сотрудник ТРЧУНЯН A.A.,

доктор биологических наук, старший научный сотрудник

БАДЖИНЯН С.А.

%

Ведущее учреждение - Институт Кардиологии МЗ Республики Армения.

Защита диссертации состоится "s/9 " /21993г. в/У ^часов на заседании специализированного совета K.055.0I.08 по присуждению ученой степени кандидата биологических наук при Ереванском государственном университете /375049, Ереван,ул.Алека Манукяна,1,Ереванский государственный университет,биологический факультет,кафедра биохимии/.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке университета. Автореферат разослан Ф.А(Х^л 1993г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук,

старший научный сотрудник Л.Г. Ананян

СОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА работы

Актуальность проблем. Основными катион&ми в цитоплазме клеток являются ионы Ca"*"*, К*, Na+, Н+. Потоки этих ионов через мембрану в значительной степени определяют концентрацию ионов в цитоплазме и, таким образом, влияет на активность ряда ключевых ферментов в клетке. Известно, что многие патологии сопровождаются нарушением ионного гомеостаза клетки.

Хорошей moдельной системой для изучения ионного транспорта являются эритроциты. На мембране эритроцитов присутствует ряд систем сопряженного ионного транспорта и ионные каната. Б последнее время интенсивно изучается Са^-зависпмый К^-канал эритроцитов, Ег.арЕке обнаруженный на деэнергизованшдс метках Гардоием (Gardos G., 1958). Механизм функционирования этого канала до с их пор не выяснен. Таким образом, исследование Са^"1"-зависиыого К+-канала на мембране эритроцитов позволит приблизиться к пониманию молекулярных механизмов транспорта ионов через мембрану, а также получить информацию об устройстве и дункционированпм ион-транспортиругацих систем.

Са++-заБисимьч": Х+-канал, помимо энергетического истощения клеток (Gardos G., 1958), можно индуцировать ионофорсм двухвалентных 'катионов А23Г87, з-блокатором пропранололом (ь;anninen v., I97G; Pfeiffer D.H. et al., 1978), а Такне элек-трондонорнок системой аскорбат+ФМС (Garcia-Sancho J. et al., 1979).

Наиболее интересной оказалась взаимосвязь Са++-зависимого К+-каяала с оксидоредуктазной системой мембран эритроцитов.Известно, что в мембранах эритроцитов человека обнаружены НАДН-дегвдрогеназная и НАД11:цитохром с-редуктазная активности и цитохром Bj ( Bruder G. et al., 1980).

В литературе существуют противоречивые мнения относительно связи Са++-завнсимого К+-канала эритроцитов с активностью мембранных оксидоредуктазных компонентов. Инн ер с соавторами отмечено отсутствие корреляции между Са^-зависимым К'-ка-налом и НАЛН-дегвдрогеназной активностью эритроцитов различных видев млекопитающих (Miner С. et al., 1983). По мнению

других исследователей, хотя и Са^-зазисимый К^-канал и мембра носвязанная оксидоредуктаза являются различными белками, активность редокс-компонент модет влиять на канал (Pohlaw Е. ot а1*» 1989). Таким образом, до сих пор не ясно, каковы регуля-торные механизмы функционирования активируемой ионами Са++ калиевой проводимости эритроцитов.

Одним из проявлений патологического cogtohhim организма может являться изменение физико-химических свойств мембран эритроцитов и связанного с этим распределения ионов в клетке.Исследование состояния эритроцитов при патологиях монет дать ценную информацию о протекании патологического процесса и молекулярных механизмах нарушений мембранного транспорта.

Иелъ и задачи исследований. Основной целью настоящей работы является выяснение механизмов регуляции и условий сопряжения Са^-завискыого ^-канала эритроцитов с окислительно-вос-станавительными компонентами мембран, а также изучение взаимосвязи ионной проницаемости клеток с физико-химическими изменениями мембран в норме и при некоторых сердечно-сосудистых патологиях.

В связи с этим были приняты к исследованию следующие задачи: I) изучить характеристики Са++-завиоимого К+-канала, индуцированного электрон-донорной системой аскорбат+ФЫС и оксидан-том пориодагом натрия. 2) Исследовать влияние классических ингибиторов энергетических процессов, ингибитора НАШ-дегидроге-назы плазматических кембраа, SH- реагентов, антиоксидантов и фенольных соединений с различным окислителыю-восстановитель-ным потенциалом на калиевую проницаемость эритроцитарных мембран. 3) Исследовать взаимосвязь калиевой проницаемости с пе-рекианш окислением липидов и зарядом на мембране эритроцитов при сердечных (приобретенные пороки сердца) и сосудистых (об-литерируяшй эндартериит и атеросклероз) заболеваниях.

Научная новизна и практическая ценность работы. В результате проведенных нами исследований было, показано, что увеличение активности Са^-зависимого Ю^-канала, индуцированного электрон-донориой системой аскорбат+ФЫС, не связано с процессами ПОЛ эритроцитов. Установлена функциональная зависимость Са++-завк-симого К+-канала с редокс-компонентами мембран, а также учас-

тие 2Н-груш1 в работе этой системы. Впервые обнаружено модулирующее действие фенольши соединений с различным-, окислительно-восстановительным потенциалом на Са^-зависимую ^-проводимость. Это позволило выявить регуляторную взаимосвязь меяду степенью окислекнссти (восстаноатепнооти) мембранных редокс-кошонеятов и работой Са^-зависимого К^-канала.

Впервые показано, что периодат натрия индуцирует калиевую и Са^-зависимую К+-ироводимость эритроцитов, однако, в данном случае, выход калия не регулируется степенью восстановлен-ности мембранных компонентов.

Выявлено, что при сердечно-сосудистых заболеваниях физико-химические изменения мембран эритроцитов сопровождаются нарушениями ионного транспорта. Полученные данные, наряду с хирургическим лечением этих заболеваний, дают возможность рекомендовать терапию, направленную на коррекцию состояния эритроцитов у предоперационных больных, что позволит уменьшить возможные послеоперационные ослоанения. Результаты исследований внедрены в практику Института хирургии тг.А.Л.Микаеляна МЗ РА.

Аптобшшя работы. Основной материал диссертационной работы обсуждалоя на научных семинарах лаборатории энергообмена и биологически активных веществ и был апробирован на заседании Ученого совета Института хирургии им.А.Л.Ыикаеляна МЗ РА.

Результаты исследований были представлены и доложены на У научной сессии "Актуальные вопросы реконструктивной и восстановительной хирурги;:" (Иркутск, 1987), на всесоюзном совещании "Энергетические аспекты клеточной физиологии" (Пушино, 1988), на всесоюзной конференции "Ионный транспорт к регуляция функции клетки" (Ленинград, 1990).

Публикации. По результатам исследований опубликовало С работ, в том числе 4 статьи.

Объем работы. Диссертация изложена на 116 страницах капи-нописного текста и содержит 7 таблиц и 18 рисунков. Библиография включает 169 наименований литературных источников.

Структура диссертации. Работа состоит из введения, чоткрех глав; I - обзор литературы, П - материалы и к-етоды исследований, Ш - результаты исследований, 1У - обсуждение результатов; выводов и списка использованной литературы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Выделение эритроцитов. Эритроциты, используемые в опытах, выделяли из гепаризлрованноИ крови доноров и крови больных с приобретенными пороками сердца, атеросклерозом и облитерирую-щим эндартериитом.

Измерение концентрации К"1" и Н4. Транспорт ионов X* и Н+ через мембрану эритроцитов изучали потенциометрическиы методом с помощью и Н+-селективных электродов, совмещенных в одной ячейке. Измерение концентрации ионов Н+ проводили стеклянным водородным электродом фирмы "Radi oía éter" (Дания). Концентрацию К* регистрировали с помощью пленочного электрода фирмы "Crytur" (Чехо-Словакия) или стеклянным К+-селективным электродом, изготовленным из стекла марки Над1- 2704.

Опредатение продуктов перэкисного окисления липидов. Одна из конечных продуктов ПОЛ, малоновый диальдегвд (ВДА), определяли ПО методу Стокса И ДормЭНДИ (Stocks J., Dormandy T.L., 1973) с небольшими модификациями, спектрофотометрически по поглощению в области 532 нм на спектрофото

Флуориметрическое исследование мембран эритроцитов о помощью 1-анилино-8-на^талинсульФоната (АНС). Взаимодействие отрицательно заряженного мембранного зонда АНС с эритроцитами определяли согласно методике Кортес и Гофмана (Fortes P.la,, hoffman j.ï.j., 1971). Бремя инкубации было выбрано на основании исследований Черницкого и др. (Черншдкий S.A., Воробей A.B., 1981; Черницкий Е.А., Воробей A.B., Конев C.B., I97B). Интенсивность флуоресценции смотрели на спектрофдуориметре "Karle-1 " фирмы "Farrand" (США) при длине волны возбуждения 370 нм и флуоресценции 470 нм. Сравнивались интенсивности флуоресценции АНС супернатанта эритроцитов в диоксане (I) с контролем (10). Величина 1/10 характеризовала относительное связывание АНС эритроцитами.

Определение относительного количества метгемоглобина в кро-22 проводили по методу Эвелина и Меллой (Покровский A.A.,1969). Исследование проводили при длине волны 630 нм на спектрофотометре №-26 (СССР).

циент молярной экстинкции брался равным

Полученные данные обрабатывали статистически по ^ критерию Стывдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССПЩОШИ'ш И ОБСЯлДШЯ

Изучение Са^-зависимого К^-канала. индуцированного электрон-донорной системой аскорбат+ФМС

Наш было проведено детальное изучение взаимосвязи редокс-системы мембраны эритроцитов человека с Са^-зависимым ^-каналом.

На рисунке I показана типичная запись выхода К+ и кинетика изменения рН среды суспензии эритроцитов под действием элек-трон-донорной системы аскорбат+ФМС. ФМС добавляли после нескольких кинут инкубации эритроцитов с аскорбатом натрия. Из рисунка видно, что в среде без Са++ выходящий поток К4" весьма незначителен. В присутствии жо Са4"4" скорость выхода К1" составляет около 2 ммоль/ыин'л эритроцитов (скорость выхода К* вычислялась как средний поток за 15 минут). Очевидно, при переносе электронов Са++ входит внутрь и активирует Са^-зависимый К+-капал. Изменение рН двухфазное: после внесения ФМС происходит сильное подщелачиваняе среды, сменяющееся через I минуту закислением. При изменении очередности добавок двухфазность изменения рН появляется после аскорбата, это значит, что очередность добавок на изменении рН не отражается. Только аскор-бат или ШС не индуцируют выхода (по кравшей мере в течение 15-20 минут наблюдения).

Ыаг1асппеаи I. еЪ а1. (1983) было показано, что добавление к эритроцитам ФЫС макет вызывать образование свободных радикалов кислорода. Нами были проделаны эксперименты по изучению влияния электрондоноряой системы на окислительные процессы в эритроцитах. Опыты выявили, что относительное количество мет-гемоглобина (относительно присутствующего гемоглобина) при действии аск+ФМС составляло 84%, в необработанных же эритроцитах метгемоглобин практически не выявлялся. >1нтенсифицирова-лось такяе НСЯ мембран. При добавлении аскорбата+4МС количество образовавшегося ВДА., конечного продукта ПОЛ, равнялось 52,88^3,85 мкмоль Ь'ЛА/л эритроцитов (п=5). В контрольных же пробах уровень МДА составлял 6,15±0,53 (п=13) мкмоль МДА/л,

Рис.I. Выход К*" и кинетика изменения pH, индуцированная элек-трондонорной системой аскорбат+ШС. 0,1 ш клеток внесено в 3 мл среда, содержащей 150 мМ НаС1 и 0,1 iM KCl.

---- В среде присутствует тахке I мМ 0аС12.

-.-.- в среде присутствует I Ш 0а012 и ббыкМ ДЦКД. Добавлено 10 мМ аскорбат и 0,1 iM aiG; t = 26±I°C.

Предварительная инкубация клеток в течение 5 минут с анти-оксиданташ ионолом (0,1 мШ и М-токоферолом (0,1 мМ) уменьшала величину ПОЛ практически одинаково, до 42,62±3,04 (п=4) и 41,65^4,0 (п=4) мкмолъ Г,1ДА/л эритроцитов соответственно. В то же время ионол приблизительно на 50% ингибирует ^-проводимость эритроцитов, а «¿-токоферол практически не оказывает влияния на выход К*" (табл.1).

В эритроцитах факт блокирования Са++-зависш<;ого выхода К*", индуцированного аскорбатом +£МС некоторыми ингибиторами энергетических процессов, выпервые был отмечен сагс1а-£адсЪ.о 1. е'Ь а1. (1980).

Нами было проведено исследование влияния ряда ингибиторов олигомицина, ДЩЦ, антшящина и атебрина, на кинетику выхода К1" из эритроцитов.

На рис.1 представлено влияние ДЦВД на Са^-зависимую К1"-

Таблиад I

Влияние различных соединений на Са++-зависимую К*-провода-мость эритроцитов, индуцированную аскорбатом+йЛС и порио-

датом

Исследуемые соединения, Аск+ФМС Ео Периодат натрия

ыкМ мВ с Са++ без Ca4"1"

Сйигомицин (13) +42^8 +39,5±Ю +I±I

ДЩ (66) +67,5-6,5 -8,5±1,5 -35±2

Антимицин (18) +52±4 +45-10,6 +24±7

Атебрин (250) +90±Ю -16±6 -75±I

ТМФД (133) -1,5±0,5 +260

ДХФИФ (100) -2I,5±5,5 +217 +65,5±5 +40±4

ДХФИФ (400) -48,5±3,5 +80±5

Мет^леновык синий +6С£ I,5 * +33,5±17

+11

Ыенадаон (ICC) +20±3 +8 -16,5¿2,5 -33±9

Сафранин Т (100) +37±6 -290 -16,5±5

/-нафтол (100) +38,5±9,5 +57±Ю +52±2

Ионол (100) +47±13 +12,5-2 +40±4

с/-токоферол (100) -5±5 +10±4,5 +33ܱI0

N -этилмалеимид (300) +54±4 +53,5±13 +35±12

ПЛ.® (100) +56±12 +48,5^3,5

Дигиотреитол (350) +10±6 +59±6,5 +28±14

sits (60) +41,5±10

Показан процент ингибирования (+) или активация (-) по отношению к контролю. Даны средаие результаты 3-5 измерений.

проводимость эритроцитов. Как видно из ркс.1 и таблицы I, ДДКД приблизительно на 70£ ингибирует Са^-зависимыН выход К+, стимулированный ьскорбато-.-.+ФМС. Олигомицин, антикицин и атебрин оказывают аналогичное воздействие, подавляя процесс утечки К+ из клеток на 40—90^ (табл.1).

Известно, что в мембранах эритроцитов обнаружены НАДН-де-

гидрогеназная и НАДН:цитохром с-редуктазная активности и цито-хром Би- ( Brudor а., 1980). Антимицин ингибирует перенос элек-

ч)

тронов в митохондриальной цепи на участке от цитохрома С к ци-тохрому В (Лениндаер А., 1974; Slater е.е., 1967). Олкгомицин и ДЦ1Щ, помимо ингибирования Н+-АТФазы митохондрий, могут также связываться с 11АДН-дегидрогеназой (Мецлер Д., I98C; Sclioz М., 1984), и ДЦКД может взаимодействовать с так называемым BCj- комплексом митохондрий. Атебрин же является ингибиторов НАДН-дегидрогеназы плазматических мембран (Sanchez a. et alviydO).

Такт образом, можно думать, что эффекты ингибирования этими соединениями Са++-зависимого выхода К+, индуцированного ас-корбатом-нй.!С, обусловлены их взаимодействием с мембранные редокс-компоненташ.

Alvarez et al. (1984) выявлено, что мембранные компоненты способны акцептировать 2 электрона, причем их кажущиеся стандартный редокс-потеншал (Е^) при рЕ 7,5 около +47 мВ.

С целью выяснения роли окислительно-восстановительных ком-•понентов в механизме регуляции Са++-зависимого К+-каната в ин-тактных эритроцитах нами было изучено действие фенольных соединений с различными окислительно-восстановительнымл потенциалами (Eq) (табл.1) на Са^-зависимую К+-проводимость, индуцированную электрондонорной системой аскорбат+ФМС.

Таким образом, у одних фенольных соединений стандартный окислительно-восстановительный потенциал превышал потенциал мембранных компонентов, у других редокс-потенциал был нуле.

На рис.2 показано действие ДХ®№ (Е^> Е^ мембр.комп.) и менадаона Е^ мембр.комп.) на Са^-зависимый выход JC4", индуцированный аскорбатом+ФМС. Из рисунка видно, что и менадион, ингибирующий выход К+, и ДХФИФ, увеличивающий калиевую проводимость, добавленные после аскорбата, сами вызывают двухфазное изменение рН, при этом менадион угнетает опосредованный ФМС всплеск рН, а ДХФИФ, наоборот, даже несколько увеличивает его, при этом и менадион, и ДХФИй, добавленные до аскорбата, сами по себе всплесков рН не вызывают, хотя и их эффекта сохраняются.

Из табл.1 видно, что соединения, обладающие меньшим окислительно-восстановительным потенциалом по сравнению с мембран-

Рио.2. Влияние фенольных соединений на выход К4" и изменение рН. Условия как под рис.1. В ореде присутству-

ет I мМ 0з01 Добавлено:

2'

10 мМ аскорбат и 0,1 мМ ФМС;

---аскорбат, 0,1 мМ менадисн и <й/!С;

аскорбат, 0,4 мМ ДИШ и <ШС. Стрелка без обозначения между аск' и ®.1С - добавление менадиона или ДШ№.

нши компонентами (менздион, мегиленовый синий, сафранин Т) ингибируют выход К+, а соединения с большим Е' (ТШ>Д, ДХФИО) -увеличивают (ДХ01Ф) или не влияет (ТМЗД) на К -пров одакость. Фенольныз соединения ¿¿-нафтол и ионол ингибируют выход К*»' : Противоположные эффекты фенольных соединений' можно объяснять исходя из следующих соображений. Вещества с отрицательным или относительно небольшим положительным Ед (кетиленоЕый синий, менадаон, сафранин Т) будут находиться в кембране глоток в окисленном состоянии, увеличивая тем самым степень скис-ленности системы (само соедпнение + кембраннне компоненты). ДХФИФ же, имея большой положительный потенциал, будет находиться в восстановленной форме (например, он может восстанавливаться НДПН) и, следовательно, будет повышать степень восста-

новленности системы. Отсутствие влияния ТМФД может объясняться тем, что это соединение не взаимодействует с оксвдоредук-тазными компонентами мембран.

Аналогично этому можно объяонить ингибируквдее действие ан-тиоксидантов ионола и ¿-нафтола. Антиоксиданты могут легко отдавать электроны свободным радикалам и уже в окисленной скорме взаимодействовать с редокс-компонентами,

В литературе существуют противоречивые мнения относительно того, влияют ли £3- реагенты непосредственно на К+-канал или на систему транспорта Са++ в эритроциты (въавг I. et а1., 1977; Уагес1са I. еЬ а1., 1986; Еольханданян А.В., 1989). В связи с этим нами было исследовано действие блокаторов бн-• групп белков и -этилмалеиыида, ПХМБ, а также датиотреитола, предотвращающего окисление ш -групп, на Са++-зависамнй выход

Г.

Как видно из табл.1, и -этилг/алеишщ более чем на 50% ин-гибирует выход К1" из эритроцитов. Аналогичный эффект оказывает также и ПХМБ. Дитиотреитол почти не оказывает влияния на активность К*-канала.

Таким образом, можно придти к выводу, что ¡зн -группы участвуют в регуляции Са^-зависимой К^-проводишсти, индушрован-ной электрондонорной сиотемой. Дитиотреитол же, обладающий восстановительной способностью, оказывает незначительный эффект, очевидно, вследствие того, что мембранные компоненты, а следовательно и сульфгидрильные группы этих компонентов, могут уже быть восстановлены аскорбатш+ШС. В работе Vагента еЪ а1. (1986) на основании изучения влияния на -соединений на вход Са++ в эритроциты было постулировано существование белков-переносчиков, катализирующих транспорт Са4"*", На основании литературных и наших собственных данных можно утверждать, что в данном случае подавление БН -реагентами Са^-за-висимого выхода К1" связано с ингибированием транспорта Са++ в клетки из-за блокировки БН-групп предполагаемого белка-переносчика или мембранных компонентов, регулирующих функции переносчика, а не о влиянием реагентов на калиевый канал.

На основании наших результатов можно утверждать о присутствии в мембране эритроцитов функционального мультиферментно-

Рис.3. Схема функционального сопряжения Са++-зависимого ^-канала с мембранными редокс-комдонентами.

го комплекса, состоящего из мембранной оксидоредуктазы и Са"1"4-зависимого К^-канала. Активность Са^-зависимого К^-канала, индуцированного аскорбатом-нСМС, регулируется степенью окислен-ности (восстановленности) этих мембранных редокс-компонентов. Рис.З иллюстрирует предложенное налги заключение.

Изучение калиевой и Са^-зависимой К*-проводимости эритроцитов. индуцированной пешодатом натшя

Нами была изучена кинетика выхода ионов. К4 из эритроцитов, индуцированная I Ш периодатом в присутствии и отсутствии Са++. Как видно из рис.4, выход К4" происходит не сразу, а через 3-4 минуты после внесения периодата. Возможно, это связа- | но с процессом формирования пор. При этом добавление периодата приводит к быстрому подкислению суспензии эритроцитов,сменяющемуся подщелачиванием. Из рис.4 видно также, что Са** су^ щественно усиливает скорость выхода 1С1" из клеток (0,592 ммоль/ мин*л и 1,16 шоль/мин-л эритроцитов соответственно).

Если концентрацию периодата увеличить до 3 м1Л, то ионы Са*4" перестают влиять на калиевую проводимость. Таким образом, э}-

!

£ е Г

Рис,4. Выход К* и кинетика изменения pH под действием периодага натрия. 0,1 га клеток внесено в 3 мл среды, содержащей 150 мМ хошшхлорид и 0,1 мМ KCl. Добавлен I мЫ периодат.

I ---в среде присутствует I мМ CaCIg

| в среде присутствует СаС12 и эритроциты пред-

I варительно инкубировали о 13,3 мкМ олигоыицина.

I I

j фект увеличения Еыхода К4" проявляется только при сравнительно

I невысоких количествах периодата в среде.

I Интересно было выяснить, с чем связано увеличение ионами

| Ca"4" калиевой проводимости клеток: с активацией Са++-зависимо-

] _ го выхода К1" или с увеличением размера пор под действием Ca44",

з тем более, что как ш отметили, при увеличении концентрации

' периодата в среде Са++ перестает влиять на утечку К4. С этой

целью мы предварительно инкубировали эритроциты с олигомици-ном, который блокирует Са^-завлсишй К* -канал, каким бы способом он ни образовывался (sancbez д. et al., 1980; Шльханда-нян A.B., 1989). На рис.4 показано действие одигомицина на выход К4" из клеток. Олигомишн практически полностью ингибирует | Са^-зависимый выход К*", довода скорость выхода до таковой в

^ среде без Са++. В беокальциевой же среде олигомидан не влияет

) на калиевую проводимость (табл. I). Эти данные в принципе слу-

I жат подтверждением индуцирования канала, а не действия ■ Ca44"

I

\ \

i

- 13 - f

на поры. Можно предположить, что Са++ входит в клетки вслед- j

ствие ингибирования Са++-АК>азы эритроцитов окисленными про- I

дуктами действия периодата или непосредственно черег-i поры и г

"открывает" канал. ?

Heller k.b. et al. (1984) отмечено, что периодат индупиру- t

ет образование мембранных белковых агрегатов, а дитиотреитол |

и N-этилмалеимид предотвращает гтот эффект. .Мы проверили ?

действие этих соединений, а такче другого блокатора зн -групп |

ШЫБ на потерю клетка\щ. J наших опытах цсо эти соодннинич |

ингибировали выток К+ (табл.1). Эти данные доказывают ¿акт f

участия sh -групп в механизме выхода из эритроцитов, т.е. |

для инициирования К+-проницаемости периодатом ваулое значение i

имеет окисление sh -групп мембранных белков к их дальнелиат ^

сшивка. Большая степень ингибирования SH -реагентами общего i

выхода К4 по сравнению с выходом К* в среде без Ca4-1" говорит ;

о том, что эти соединения действуют на Са++-зависимый выход ;

К*. Скорее всего, подавляя образование пор, эти блокаторы J

уменьшают вход Са++ в клетки и, вследствие этого, активность < Са++-зависимого К+-канала.

Из табл.1 видно, что кшгибирование ионолом и «б-токоферо- ;

лом калиевой проводимости существеннее без Ca"1-1", чем в его [■

присутствии. Это говорит о том, что антиоксиданты незначитель- г

но влияют на Са++-зависимув компоненту вытока К+. Ингибирова- I

ние же может происходить вследствие подавления процессов окис- t

ления мембранных тиоловкх групп, участвующих в образовании |

пор. ?

При проверке.действия £енольнкх соединений на калиевую про- ;

водимость были подучены данные, отличающиеся от результатов, j

полученных при индуцировании выхода К+ электрондонорной систе- [

мой (табл.1). Представляется возгонным, что ингкбирование ка- j

лиевой проводимости кетцленсвым синим, ^-наТтолом и ДХЙ1Ф \

. есть результат их действия на тиоловые группы. Не исключено !

также предотвращение окисления этих групп некоторыми указан- I

ними фенольными соединения;,и. • 1

Ингибитор транспорта анионов sits колет уменьшать выход ?

К+, вызванный периодатом (табл.1), очевидно, как из-за пред- :

отвращения проникновения периодата в эритроциты через анион- ;

- 14 -

ную транспортную систему полосы 3 мембраны, так и вследствие подавления выхода СГ", который может служить сопутствующим анионом для К1".

Таким образом, механизм выхода К* из клеток, индуцированный периодатом, отличается от такового, активированного электрон-донорной системой аскорбаг+ФМС. Хотя и в этом случае ингибиторы энергетических процессов митохондрий и НАДИ-дегидрогеназы плазматических мембран подавляют Са++-зависимый выход К+, однако регуляция активности канала степенью восстановленности мембранных редокс-кошюнентов не обнаружена.

Транспорт ионов и (Гизико-уимические изменения мембран эритроцитов при некоторых сердечно-сосудистых патологиях | В ряде работ было показано, что при различных патологиях

часто нарушаются процессы перекисного окисления липидов (Ме-ерсон Ф.З., 1984; Giardini О., 1984; Taccone-Gallucci М., 1986) и транспорта ионов (Брайант С.А., 1980; Uendonca Ы., 1980; Diez J«, 1986; Garay R.P., 1983).

Нами было предпринято исследование ПОЛ и количества К* в эритроцитах больных приобретенными пороками сердца по сравнению с нормой. Были исследованы 26 больных, из них со стенозом • митрального отверстия 15 и 8 с недостаточностью.митрального | клапана, у остальных был сочетанный митральный порок. Был изу-

I чен не только эндогенный уровень ПОЛ, но и изменение его ве-

личины под действием добавленной перекиси водорода. Последняя процедура дает возможность судить о состоянии антиокислительных систем эритроцитов. Результаты исследований приведены в габл.2.Рь'ЯРЛРН0 цосторерное уменмтенир уровней и ПОЛ.

Мазду показателями количества К+ в эритроцитах больных с приобретенными пороками сердца и соответствующими значениями ПОЛ была выявлена отрицательная корреляционная связь. КоэфЗя-! циент корреляции был равен -0,6.

Поскольку в эритроцитах нормальный уровень ПОЛ поддерживается в основном ¿-токоферолом, присутствующим в мембране, а I также ферментами-антиоксидантами супероксиддисцутазой, ката-

| лазой и пероксидазой, то увеличение у больных количества МДА

| как в исходе, так и под действием HgOg говорит о том, что

1 может нарушаться соотношение этих антиокислктельных систем

:4

а

Таблица 2

Количество К*" и величина 110Ш эритроцитов в норме и у больных приобретенными пороками сердца (Ы - средняя величина, т - среднеквадратичное отклонение, п - число пациентов)

Концентрация К+ в ЛОЛ мкколь МДА/л эр. (М±т) •

толь на л эр. (М±ш) без добавок добавлено _ с,I (/л зо;з f Н2°2

Норма' 91,11^2,18 п=24 6,15±С,53 п=13 28,7Ь±1,Ы | п=13 £

Больные 76,52^2,53 п=26 Р< 0,001 8,24±0,32 п=25 Р<0,01 34-2,25 ' [ п=25 Р<0,05 |

или их активность. >

Таким образом, южно утверждать, что уменьшение количества I К4" в эритроцитах при врожденных пороках сердца связано с повреждением липидного бислоя мембран.

В связи о этим наш было проведено изучение влияния некото- |

рых применяющихся в клинике соединений-антиоксидантов, таких ;

как .¿-токоферол (витамин Е) и ионол (в клинике применяется ;

масляный раствор этого вещества под названием дибунол) на ПОЛ ; мембран эритроцитов, вызываемых перекисью водорода в присутствии азида или электрондонорной системой аскорбат+ФМС (табл.3). Из таблицы видно, что и ¿-токоферол, и ионол значительно

снижают величину ПОЛ. Учитывая, что ионы К+ являются одними из [

важнейших катионов в клетке, результаты исследования, призе- I

денные в таблицах 2 и 3, дают нам основание наряду с хирурги- |

ческим лечением больных приобретенными порока;,и сердца реко- !

мендовать антиоксидантную терапию, направленную на улучшение |

состояния эритроцитов. |

Нами исследовано изменение количества К+ в эритроцитах, [ Катаевой проницаемости кембран, связанной с транспорта*/. Са++

внутрь и структурного состояния мембран по данным флуореснен- I:

ции АНС при некоторых сосудистых патологиях по сравнению с ^

нормой. Эритроциты выделялись из венозной крови больных обли- I

Таблица 3

Влияние ангиоксидантоБ на индуцируемое окислительными процессами ПОЛ эритроцитов (М - средняя величина, т -среднеквадратичное отклонение, п - количество пациентов)

азид Н2°2

(4 r.i,i) + (5 мШ

аскорбат (1С Ш U),I ыШ

13,56^2,24 п=4

4I,G5±4,8 п=4

терирукхцшл атеросклерозом и эндартериитом.

В табл.4 представлены результаты расчета концентрации в эритроцитах (функционатыше свойства) и отношение интенсивно-стей флуоресценции, отражающей структурные аспекты, в норме и при сосудистых патологиях.

Как видно из табл.4, количество К+ в норме и при атероскле розе отличается на 1С,3%. В случае же эндартериита концентрация К+ уменьшается по сравнению с нормой почти на 18,8% (в обоих случаях Р<0,05). Эти функциональные изменения коррелируют с показателями флуоресценции ЛНС.

Механизм "выбирания" АНС эритроцитами включает 2 процесса: адсорбцию АБС на поверхности мембраны и перенос красителя внутрь клеток (Fortes G.P.I., 1974). Поскольку меньшая величина 1/1 означает уменьшение количества АНС в супернатанте, то, суда по нашим данным, и при атеросклерозе, и при эндарге-риите увеличивается связывание и проникновение ЛНС в эритроциты. Так как АНС отрицательно заряжен, то с уменьшением отрицательного заряда на мембране АНС будет больше связываться с мембраной и его концентрация в супернатанте будет уменьшаться, т.е. величина I ниже при патологии, чем в контроле. При обеих патологиях по сравнению с нормой есть достоверное различие: Pj-^0,01, P3q^.O,OI, при атеросклерозе и Pj-^0,01

Таблица 4

Количество К* и отношение инголзивностей флуоресценции в норме и при сосудистых патологиях (М - средняя величина, ш - срсдневадратичное отклонение, п - число пациентов)

К+, ммоль/л эри- I/I_.I мин. 1/1о,30 кш

троцитов М^т M+mu Mim

Норма 91,Iii2,18 0,947±0, 009 0,807±0,0с8

п=24 п=5 п=5

Атеросклероз 81,7±2,9 0,87li0, ОН 0,754*0,012

п=17 п=8 п=8

Р^.0, 01 Р^-0,01

Облитерирую- 74±4,4 0,879i0, 009 0,746^0,006

щий эндарте-риит п=12 п=11 п=11

Р^. С ,01 Р^. 0,001

и PgQ^-0,001 при эндартериите (индексы I и 30 указывают вредя инкубации АБС с эритроцитами). Это может быть связано как с уменьшением <]иксировинного отрицательного заряда на мембране, так и с ухудшением состояния мембраны, что приводит к увеличению проницаемости и к большему вхождению АНС внутрь эритроцитов.

Нами был исследован выход К+ из эритроцитов при илгибирова-нии гликолиза метаболическим ингибитором - фторидом натрия.

На рис.5 представлены типичные кривые выхода К* из эритроцитов в условиях ингибирования гликолиза фторидом в присутствии Са'4' в норме и при эндартериите, поскольку Наибольшее отличие от нормы было получено именно в этом случае. Если в норме только второе внесение Са++ приводит к быстрому выходу К* и резкому "всплеску" концентрации Н то при эндартериите быстрый выход К+ получается уже после первой порции Са++, "всплеск" иногда бывает менее выраженным (рис.5). В некоторых случаях уяе после фторида калиевая проницаемость существенно увеличивается и последующие добавки Са++ уже не влияют на скорость выделения К+. "Всплеска" Н+ не отмечается.

К+

Рис.5, Кинетика выхода К+ и "всплеск" Н+ в суспензии эритроцитов под действием Са++ в условиях ингибирования гликолиза в норме'(А) и при эндартериите (Б,В). 0,1 мл эритроцитов инкубировали 10-15 мин в 3 мл среда, содержащей 150 КаС2, I мМ Са++ и 0,1 мМ К+. Затем-добавляли 10 Ш ИаР и I мМ Са++. Т=22°С.

- 19 - ... ,;.

Кажэтоя вероятным, что "всплеок" вызван каким-то структур-. •• ным изменением формы эритроцитов, связанным о транспортом Са"14' внутрь. Очевидно, при эндартериите кембранн эритроцитов в значительной мере нарушены. Не исключено и "ослабление" метаболических процессов, в частности гликолиза, из-за чего в эритроцитах может быть ;,:еньше АТФ. В связи с этим нагл были проведены специальные опыты, в которых с целью увеличения внутри-меточного АТЧ» эритроциты инкубировались с глюкозой. Результаты показали, что при этом происходило уменьшение выхода К1" и ; , -Х всплеск Н+ становился более замедленным. Вышесказанное может "^.7'А-. объяснить инициирование калиевого каната при меньшем числе ' -добавок Са++ по сравнению с нормой.

Таким образом, моано придти к выеоду, что при указанных со- \ ; судистых патологиях функциональные изменения эритроцитов сопряжены со структурными нарушения?/.!! мембран. В свою очередь, эти нарушения г/огут быть связаны с ухудшением процессов гликолиза. Поэтому наряду с хирургическим лечением этих заболе- / ваний можно рекомендовать терапию, направленную на коррекцию состояния эритроцитов. Это может усилить их эластичность и способность к деформации и, таким образом, улучшить проходи- : "-мость через сосуды.

выводи

1. Электрондонорная система аскорбат+феназинметасульфат -.7 (ФМС), восстанавливающая ь.ембраннке компоненты эритроцитов, " активирует Са — зависимый К+-канал. Действие аскорбата+ФМС сопровождается двухфазным изменением рН, интенсификацией пе-рекисного окисления липидов (ПОЛ) мембраны и переходом гемоглобина в метгемоглобин, причем Са++-зависишй выход К+

не зависит от этих процессов. Антиоксиданты ¿-то-

коферол и ионол. в одинаковой степени подавляют ПСИ, в то же время ¿-токоферол не влияет на активность канала, а ионол на 50$ ингибируег его.

2. Ингибиторы энергетических процессов, взаимодействующие - .

с редокс-компонентами мембран Солигомицин, антимицин и ДЦКД), • /| и ингибитор НАДН-дегидрогеназн плазматических мембран (ате- г V

брин) на 40-90$ подавляют Са++-зависимый выход К4, индуцированный аскорО£том-нй,;С.

Бяокаторы сульфгидрильных групп н -этилмалеимид и 11ХМВ подавляют активность Са^-зависимого 1С*-канала, а восстановитель БН -групп датиотреитол не влияет на выход К+.

3. Выявлено модулирующее действие фенольных соединений с различным стандартным окислительно-восстановительны!,: потенциалом (Ед) на Са++-зависимый выход 1С1", индуцированный аскорба-том-нМС: соединения с отрицательным или небольшим положительным Е^ относительно Е^ мембранных окислктатыю-восстановитель-них компонентов шгибпруют, а соединения с больпкм положительным Е^ не влияют или активируют выход К+.

4. Предложена схема сопряжения между индуцированным аскор-батои-^ЗМС Са++-зависишм К+-каналол! и редокс-компонентами мембран, основанная на существовании функциональной связи между эти,31 системами и на регуляции функционирования канала степенью восстановленности оксидоредуктазных кошонентов.

5. Оксидант периодат натрия, образующий поры в мембране, индуцирует калиевую и Са^-зависимую калиевую проводимость эритроцитов. Для активации калиевой проводимости имеет значение сшивка мембранных белков и состояние окисленности сульфгидрильных групп этих белков. Ингибиторы энергетических процессов и НАДН-дегидрогеназы плазматических мембран подавляют Са++-зависимый выход К+, в то же время избирательно действуют

| на калиевую проводимость в бескальциевой среде. Не обнаружена

I связь между Е^ ^енольных соединений и Са^-завксишм К^-кана-

| , лом.

| 6. У больных приобретенными пороками сердца выявлено умень-

| пение количества К+ в эритроцитах, связанное с повреждением

! липидного бислоя мембран вследствие интенсификации процессов

I ПОЛ.

I 7. При некоторых сосудистых патологиях (атеросклероз, об-

3 литерирующий эндартерзшт) происходит уменьшение количества

• К+ в эритроцитах, сопровождающееся большим связыванием и про-

| никновением отрицате.тьно заряженного флуоресцентного зонда

1 1,8-АНС в эритроциты.

Сведения о публикации научных результатов

По теме диссертации опубликованы следующие работы:

1. Калиевая проницаемость и физико-химические характеристики мембран эритроцитов при сосудистых патологиях. Тез.докл. итоговой научной сессии, ч.П, Иркутск, 1987, с.214 (соавт. А.В.Ваяьханданян, А.З.Каралетян),

2. Изучение некоторых функциональных и структурных свойств эритроцитов при сооудиотнх патологиях. I."Кровообращение", т.

20, Jfc 4, 1987, 0.39-46 (соавг. А.В.ГЬльханданян, А.З.Каралетян) .

3. Перекисное окисление липидов и количество К+ в эритроцитах больных приобретенными пороками сердца. 1."Кровообращение", т.23, Ji 6, 1990, с.52-55 (соавт. А.В.Гюльханданян, В.Г. Азатян).

4. Механизмы регуляции индуцированной окисляющими агентами Са++-завиоимой калиевой проводимости эритроцитов. Биолог.ж. Армении, т.43, J6 6, 1990, с.477-483 (ооавг.А.В.Вольхандааян).

5. функциональное сопряжение окоидоредуктазной системы о Са^-зависимым калиевым каналом эритроцитов. Ж."Цитология", т. 32, Ä 9, 1990, 0.927-928 (соавт.А.В.Пзльханданян).

6. Са^-завиоимый выход К4" из эритроцитов, индуцированный окислительными процессами. Ж."Биофизика", т.36, № I, 1991, с.169-171 {соавт. А.В.Гюльханданян).