Роль активных форм кислорода в регуляции Са2+-активируемой калиевой проницаемости эритроцитов человека

Трубачева, Оксана Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль активных форм кислорода в регуляции Са2+-активируемой калиевой проницаемости эритроцитов человека
ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Роль активных форм кислорода в регуляции Са2+-активируемой калиевой проницаемости эритроцитов человека"

На правах рукописи

Трубачева Оксана Александровна

РОЛЬ АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА В РЕГУЛЯЦИИ Са2+>' ) АКТИВИРУЕМОЙ КАЛИЕВОЙ ПРОНИЦАЕМОСТИ ЭРИТРОЦИТОВ ( ЧЕЛОВЕКА

03.03.01 - физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Томск-2011 9 ИЮН 2011

160 ---/ - ......

4849683

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования "Сибирский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации " и Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт кардиологии Сибирского отделения РАМН

Научный руководитель:

доктор биологических наук, Петрова Ирина Викторовна

профессор

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, Барбараш Нина Алексеевна

профессор

кандидат медицинских наук, Коноваленко Юлия Александровна

Ведущая организация: ГОУ ВПО Красноярский государственный медицинский университет имени профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого Минздравсоцразвития России

Защита состоится 2011 г. в

часов на заседании

диссертационного совета Д 208.096.01 при ГОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России (634050 г. Томск, Московский тракт, 2)

С диссертацией можно ознакомиться в научно-медицинской библиотеке ГОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России

Автореферат разослан ■ 2011г.

Ученый секретарь диссертационного совета ■ / Федорова Т.С.

'Щ

Актуальность проблемы

К настоящему времени накоплен огромный объем сведений о роли активных форм кислорода (ЛФК) в жизнедеятельности клетки, к которым наряду с супсроксид-анионом, перекисью водорода относят и оксид азота. Хорошо изучено повреждающее действие ЛФК на клеточные мембраны. Однако в последнее время все чаще появляются работы, в которых ЛФК, в том числе супероксид-апиоп, перекись водорода (Н202) и оксид азота (N0) рассматриваются н качестве регуляторов внутриклеточных процессов. Лктииные формы кислорода либо сами выступают в роли вторичных посредников [Das D.K., Maulik N., 1994; Bromine H.J., Molz J., 1996; Дубинина E.li., 2006; Быстрова М.Ф., Буданова E.I I., 2007], либо модулируют действие известных регуляторных каскадов клетки [Drogc W., 2002]. Один из регуляторных путей связан с влиянием ЛФК на ионтранспортныс системы клеток [Adragna N.C. et al., 2000; GuttermanD.D. etal., 2005].

Мембрана эритроцитов содержит только один тип каналов, а именно Са21-активируемые К+ каналы (К+(Са^)-каналы) средней проводимости, или Gardos-каиалы. В связи с этим красные клетки крови служат естественной моделью для изучения каналов этого типа. Кроме того, данное обстоятельство позволяет проводить исследования на суспензии интактных клеток.

Со времени своего обнаружения К+(Са2*)-каналы эритроцитов достаточно интенсивно изучаются, но только недавно была установлена их физиологическая роль. К+(Са2+)-капалы вносят определенный вклад в эриптоз [Lang F. et al., 2006; Poller M. et al., 2008], изменение объема клеток [Begenisich Т. et al., 2004]. He исключено их участие в деформируемости клеток: Са2+-индуцирусмое снижение деформируемости эритроцитов устраняется при выравнивании градиента ионов калия [Dodson R.A. ct al., 1987].

Регуляция К+(Са2+)-каналов эритроцитов осуществляется несколькими путями. Один из них связан с вторичными посредниками, эффект которых реализуется при воздействии активаторов или ингибиторов протсипкиназ А или С [Орлов С.Н. с соавт., 1992; Петрова И.В. с соавт., 1997; Pellegrino М, Pellegrini М, 1998; Del Carlo В, et al., 2003].

Другой путь регуляции осуществляется посредством белков цитоскслета эритроцитов без участия протсипкиназ [Петрова И.В. с соавт., 2002; Ситожевский А.В. с соавт., 2004].

Наконец, мембрана эритроцитов содержит некоторые компоненты электронно-транспортной цепи, обычно присутствующие на внутренней мембране митохондрий (ПЛДН-дегидрогеназа, цитохром с) [Alvarez J. et al., 1984; Kennett E.C., Kuchcll P.W., 2003; Matteucci E., Giampietro O., 2007], которые могут включаться в регуляцию К+(Са2+)-каналов эритроцитов [Alvarez J. et al., 1984].

В эритроцитах, вследствие циклов окси- и дезоксигепации гемоглобина, постоянно происходит образование ЛФК, которые влияют на регуляторные пути этих клеток [Barvitenko N.N. et al., 2005; Matteucci F., Giampietro O., 2007]. Кроме roi o, в процессе своего функционирования эритроциты подвергаются действию

АФК, продуцируемых другими клетками: эндотелиоцитами, иммунокомнетепгными клетками во время так называемого «кислородного взрыва» [Takahashi R. et al., 1991]. Известно, чго АФК, в частности, оксид азота, оказывают влияние на эриптоз [Nicolay J. P. et al, 2008] и деформируемость эритроцитов [Bor-Kucukatay М. et al., 2003].

Эритроциты являются универсальной моделью для оценки степени и глубины повреждения мембран при патологическом процессе [Черницкий Е.А., Воробей А.В., 1987]. С другой стороны, нарушения структурно-функционального состояния мембраны эритроцитов могут рассматриваться как одно из звеньев патогенеза ряда заболеваний.

При патологических процессах, сопровождающихся окислительным повреждением эритроцитов, наблюдаются типовые изменения со стороны клеток красной крови [Новицкий В.В. с соавт., 2004]: повышение внутриклеточной концентрации ионов кальция, снижение их деформируемости и сокращение продолжительности жизни [McMillan D.E. et al., 1978; Fujita J. et al., 1999; Miossec P. et al., 1999]. Нельзя исключить, что в условиях повышенной продукции АФК изменяется как функционирование самих К+(Са2+)-каналов, гак и внутриклеточных сигиальиых систем, участвующих в их регуляции.

Однако данные об участии АФК в регуляции Си2'-активируемых калиевых каналов эритроцитов человека немногочисленны.

В связи с вышесказанным представляется весьма актуальным изучение роли активных форм кислорода в регуляции К+(Са2+)-каналон эритроцитов как в норме, так и при патологическом процессе, сопровождающимся окислительным повреждением эритроцитов.

Цель настоящего исследования - изучить вклад активных форм кислорода в регуляцию Са2н-зависимой К+~проницаемости мембраны эритроцитов здоровых доноров и больных артериальной гипертензией в сочетании с сахарным диабетом 2 типа.

Для достижения указанной цели решались следующие задачи-.

1) исследовать влияние супероксид-аниона, перекиси водорода и оксида азота на С а2' - зависимую К1"- проницаемость мембраны эритроцитов здоровых доноров;

2) изучить влияние перекиси водорода и агониста П|-адренэргических рецепторов фенилэфрииа на Са3' - зависимую К+- проницаемость мембраны эритроцитов здоровых доноров;

3) исследовать влияние повышенной Са2+-зависимой К+-проницаемости на деформируемость и изменение объема эритроцитов здоровых доноров;

4) изучить регуляцию активными формами кислорода Са2+- зависимой К проницаемости мембраны эритроцитов больных артериальной гипертензией в сочетании с сахарным диабетом 2 тина.

Положения, выносимые на защиту

1. Перекись водорода снижает, а оксид азота увеличивает Са2+-зависимую К+-проницаемость мембраны эритроцитов здоровых доноров. Супероксид-анион

при внеклеточной аппликации не изменяет Са2 "-зависимую К+-проницаемость мембраны эритроцитов здоровых доноров, но снижает скорость ее развития.

2. Перекись водорода потенцирует активирующее действие агониста а,-адренэргичееких рецепторов фенилэфрина на Са2+-зависимую К+-проницаемость мембраны эритроците» как здоровых доноров, так и больных артериальной гипертензией в сочетании с сахарным диабетом 2 типа.

3. Повышение Са2"-зависимой К+-проницаемости приводит к снижению деформируемости эритроцитов здоровых доноров. Одной из причин снижения деформируемости является сжатие клеток.

4. В эритроцитах больных артериальной гипертензией в сочетании с сахарным диабетом 2 тина перекись водорода, в отличие от здоровых доноров, существенно увеличивает Са2ч-зависнмую К "-проницаемость мембраны.

Научная повита работы

Впервые показано, что супероксид-аннон, продуцируемый внеклеточным источником (система ксаптип - кеаптиноксидаза), не изменяет, а перекись водорода уменьшает Са2+-зависимую К+-проницаемость мембраны эритроцитов здоровых доноров. Пперные установлено, что увеличение внутриклеточной концентрации перекиси водорода потенцирует активирующее действие фенилэфрина на Са2 "-активируемые К "-капали эри троцитов здоровых доноров.

Установлено, что стимуляция внутриклеточной продукции оксида азота с помощью L-арппшна приводит к повышению Са2"-зависимой «"-проницаемости мембраны эритроцитов здоровых допоров. Сходный эффект оказывает и увеличение внутриклеточной концентрации цГМФ.

Показано, что активация Са2+-зависимой К "-проницаемости мембраны эритроцитов здоровых доноров снижает их деформируемость, что сопровождается уменьшением объема клеток.

Впервые проведено исследование влияния активных форм кислорода на Са2+-активируемые К+-каналы эритроцитов больных артериальной гипертензией в сочетании с сахарным диабетом 2 типа. Установлено, что у данной категории больных в отличие от здоровых допоров перекись водорода увеличивает Са2 -зависимую К+-ироницаемость мембраны эри троцитов.

Научно-практическая значимость работы

Данные, полученные в настоящем исследовании, носят фундаментальный характер и расширяют существующие представления о регуляции и функциональной значимости Са2+-актавируемых К+-каналов эритроцитов. Результаты работы дополняют представления о механизмах регуляции ионной проницаемое™ мембраны клеток активными формами кислорода. Сведения о снижении деформируемости эритроцитов вследствие увеличения Са2+-зависимой «"-проницаемости полезны для разработки молекулярных технологий управления деформируемостью красных клеток крови. Результаты работы, связанные с модулированием активными формами кислорода Са2+-активируемых К+-каналов эритроцитов при артериальной гипертензии в сочетании с сахарным диабетом 2 типа могут быть использованы для фармакологической коррекции

нарушений структурно-метаболического статуса эритроцитов при патологиях, объединенных развитием окислительного стресса.

Основные положения работы используются в курсах лекций и практических занятиях, проводимых на кафедрах биофизики и функциональной диагностики, нормальной физиологии Сибирского государственного медицинского университета, на кафедре физиологии человека и животных Томского государственного университета. Методические приемы и полученные данные используются в научных исследованиях, выполняемых на кафедрах биофизики и функциональной диагностики, нормальной физиологии Сибирского государственного медицинского университета. Областями применения полученных данных являются физиология, патологическая физиология, биофизика.

Апробация работы

Основные положения диссертационной работы доложены на всероссийских и международных научных форумах: XI и X Международном конгрессе молодых ученых и специалистов "Паука о человеке" (Томск, 2008-2009), Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов "Актуальные проблемы современной эндокринологии" (Москва, 2008), VI Сибирском физиологическом съезде (Барнаул, 2008), XVI Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов" (Москва, 2009), XXI Съезде Физиологического общества им. И.П.Павлова (Калуга, 2010), конференции «Современная кардиология: Эра инноваций» (Томск, 2010). Исследование выполнено в рамках реализации ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы ГК№ П445, ГК Кч 02.740.11.5031 и ГК № 14.740.11.0932.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 17 работ, из которых 2 - в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 123 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы,' главы "Материалы и методы", главы собственных результатов, их обсуждения и заключения. Библиография включает 237 ссылок, втом числе 86-работы отечественных авторов и 151 - зарубежных. Работа иллюстрирована 37 рисунками и включает 2 таблицы.

Личное участие автора

Основные результаты исследования, вошедшие в диссертацию, получены лично автором. Анализ данных литературы но теме диссертации, статистическая обработка полученных результатов, их научный анализ, обсуждение и написание диссертации выполнены самостоятельно автором.

МЛ ТЁРИЛЛ И МЕТОДЫ

Объект исследования: в ходе выполнения данной работы было обследовано 89 человек. В контрольную группу вошел 51 практически здоровый доброволец. Группу больных артериальной гипертензией в сочетании с сахарным диабетом 2 тина составили 38 человек. Группы соопоста вимя по полу и возрасту. Клинический диагноз верифицировали с помощью клинико-лабораторных методов исследования на базе отделения атеросклероза и хронической ишемичсской болезни сердца НИИ кардиологии Сибирского отделения РАМИ (руководитель - академик РАМН Р.С. Карпов).

Получение эритроцитов-, кровь забиралась из локтевой вены утром натощак в пробирки с гепарином (25 ед/мл крови). После центрифугирования (lOOOg, 5 мин, 4°С) плазму и клепки белой крови удаляли, а эритроциты дважды промывали 3 частями изоосмотического раствора NaCI (150 мМ), содержащего 5 мМ Na-фосфатный буфер (рН 7,4) при тех же условиях центрифугирования.

Использованные растворы и реактивы:

Использованные растворы: I. Среда отмывания эритроцитов: 5 мМ Na-фосфатный буфер в 150 мМ NaCI. 2. Среда инкубации эритроцитов: 1) изоосмотическая среда 320 моем: 150 мМ NaCI, 1 мМ KCI, I мМ MgCI2, 10 мМ глюкоза, 2) гипероемотическая среда 420 моем: 100 мМ сахароза, 150 мМ NaCI, 1 мМ KCI, 1 мМ MgCl2, И) мМ глюкоза, 3) гиперкалиевая среда 10 мМ NaCI, 140 мМ KCI, 1 мМ MgCh, 10 мМ глюкоза. 3. Вязкая среда для определения деформируемости: 0,2% высокомолекулярного полиэтиленоксида с молекулярной массой М=5,8-105, 2% альбумина и 0,9% натрия хлорида.

Использованные реактивы: NaOH, NaCI, KCI, Na2HP04, NaH2P04, MgCl2, СаС12, глюкоза, СI-ССР (карбонилцианид-т-хлорфепилгидразон), перекись водорода, L-аргинин, нитропруссид натрия, метиленовый синий, З-изобутил-1-метилксангин, запринаст, L-NMMA, ксангин, ксантиноксидаза, цитохром с, аминотриазол, форбол-миристат-ацстат (РМА - phorbol 12-myristate-13-acetatc), L-фенилэфрин гидрохлорид, клотримазол, каталаза, супероксиддисмутаза, альбумин, полиэтиленоксид ("Sigma", США), тритон XI00 ("Merck", Германия), дибутирил-цГМФ (Boehringer Mannheim GmbH, Германия)

Растворы A23I87, С1-ССР, готовились на этиловом спирте. Конечная концентрация растворителя в среде инкубации эритроцитов не превышала 0,5% и не оказывала влияния па активность Са2+-активирусмых К+-каналов. Раствор ксантина готовился па основе 1 мМ NaOH. Все остальные растворы готовили на основе денонсированной воды.

Метод регистрации мембранного потенциала в суспензии эритроцитов.

Для исследования Са2+-активируемых калиевых каналов был применен метод регистрации мембранного потенциала в суспензии эритроцитов по изменениям рН среды инкубации в присутствии протонофора, основанный на том, что в этих условиях распределение прогонов зависит от мембранного потенциала Ет как Ет = RT/F (рН, - рН0). Здесь рН| и рН0 - значения рН цитоплазмы и среды инкубации, соответственно [Орлов С.Н., Петрова И.В. и соавт., I992J. Эксперименты проводились по следующему плану. Для получения

гиперполяризационного ответа к 4,75 мл среды инкубации (среда N), содержащей 150 мМ NaCI, I мМ КС1, 1мМ MgCh, 10 мМ глюкозы и 10 мкМ СаС12, добавляли 0,25 мл упакованных эритроцитов. Через 5 мин инкубации при 37°С и постоянном перемешивании добавляли протонофор CI-CCP до конечной концентрации 20 мкМ и спустя 2 мин добавляли 0,5 мкМ Са"+-ионофора А23187. Добавление кальциевого ионофора А23187 к суспензии клеток, содержащей хлорид кальция, приводило к выходу ионов калия и развитию гиперполяризационного ответа (ГО) мембраны эритроцитов, что находило свое

Рис. I. Типичная кинетика изменения рН0 в суспензии эритроцитов человека в ответ на добавление 0,5 мкМ А23187 в присутствии 10 мкМ СаСЬ (представлена как иллюстрация метода расчета стационарных и кинетических параметров).

Защелачивание среды инкубации соответствовало гиперполяризации мембраны, а восстановление рН - возвращению мембранного потенциала (МП) к исходному значению. При анализе полученных данных использовались следующие стационарные и кинетические параметры (рис. 1.). АЕ - амплитуда ГО, значение мембранного потенциала, соответствующие максимальному уровню гипергюляризации мембраны в ответ на добавление А23187 (мВ); V| -скорость защелачивания среды инкубации, отражающая скорость гиперполяризации (мэкв ОН7мин-л клеток); - скорость закисления среды инкубации, отражающая скорость восстановления мембранного потенциала (МП) (мэкв Н7мин-л клеток). Амплитуда ГО и скорость его развития (V|) характеризуют Са21-зависимую К+-проницаемость, а скорость восстановления мембранного потенциала (V2) - активность Са2+-АТФазы [Орлов С.Н., Петрова И.В. ссоавт., 1992].

Спектрофотометрические методы: I. Определение продукции супероксид-аниона. В кювету объемом 1 мл, содержащую среду N, добавляли 100 мкМ ксантина, 10 mU/ мл ксантиноксидазы и 50 мкМ цитохрома с. Измерения проводились против кюветы, содержащей среду N и цитохром с в концентрации 50 мкМ. Продукцию супероксид-аниона оценивали по степени восстановления цитохрома с при 550 им. Другим продуктом реакции с участием ксантиноксидазы является перекись водорода, что находит свое отражение в

отражение в изменении рН суспензии.

снижении содержания супероксид-аниона. Для подтверждения этого к среде N , содержащей ксантин, ксантиноксидазу и цитохром с в указанных концентрациях, добавляли катализу (50 U/ мл), которая катализирует реакцию разложения перекиси водорода. Это приводило к повышенной наработке суперокид-аниона. 2. Регистрация изменения объема эритроцитов. Для регистрации изменений объёма эритроцитов в условиях варьирования осмолярноети среды инкубации и при активации К+(Са2+)-капалов использовался метод, основанный на том, что при изменении объёма эритроцитов изменяется светорассеяние суспензии клеток [Орлов С.Н. с соавт., 1988].

Исследование деформируемости эритроцитов. Исследование проводили методом лазерной эктацитометрии, основанной па явлении дифракции световых лучей при прохождении через тонкий слой жидкости с взвешенными в ней клетками [Белкин Д.В. с соавг., 1991; Фирсов II.И. с соавт., 1983, Evans Е. et al., 1986; Bessis М. et al., 1975]. Для количественной оценки рассчитывался индекс деформируемости эритроцитов (ИДЭ): ИДЭ=(Е-1 l)/(L+H), где L - больший диаметр эллипса; II - меньший диаметр эллипса. Значения ИДЭ, полученные для клеток нрединкубированных в среде N без добавления агентов, принимали за 100%.

Статистическая обработка. Анализ данных проводили при помощи программы Statistica 6.0 for Windows фирмы Statsoft. Фактические данные представлены в виде "среднее ± ошибка среднего" (Х±т). Для определения характера распределения полученных данных использовали критерий нормальности Колмогорова-Смирнова. Сформированные выборки не подчинялись закону нормального распределения, поэтому для проверки статистических гипотез были использованы непараметрические критерии [Гланц С., I999J. Для проверки гипотезы об однородности двух независимых выборок использовался U-критерий Манпа-Уитпи (Mann-Whitney U-test). Для проверки однородности парных или зависимых выборок был использован Т-критсрий Вилкоксона (Wilcoxon mached pairs test) [Боровиков В. П., 1998]. Различия считали достоверными при уровне значимости р<0,05.

РЕЗУЛЬТА ТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние супероксид-аниона и перекиси водорода па См2*- зависимую К''-проницаемость мембраны эритроцитов

Одним из наиболее значимых АФК является супероксид-анион (02~), продукция которого существенно увеличена при ряде патологических состояний: ишемии, гипоксиях, стрессовых ситуациях, эндокринопатиях, опухолевом процессе, различных бактериальных инфекциях и интоксикациях [Владимиров Ю.А., 2000; Карли Ф„ 1997; Логинов А. С, Маношин Б. П., 1996; Шепелев А.П.с соавт., 2000; Чеснокова Н.П.с соавг., 2001].

Для получения супероксид-аниона был применен подход, описанный в работах [Larsson R. et al., 1987; Tsai К. et al., 1997; Kucicl R., Mazurkiewicz A., 2004], где n качест ве источника 02~ использовалась кеаптипоксидазная реакция.

Как показали предварительные спектрофотометрические исследования в бесклеточной среде, максимальная продукция супероксид-аниона наблюдалась через 10 минут инкубации 10"4 М ксантина и 10 mU/ мл ксантиноксидазы и составила 9 мкМ.

Амплитуда ГО эритроцитов, прединкубированпых в присутствии 10"4 М ксаптипа и 10 mU/ мл ксантиноксидазы в течение 10 минут, не отличалась от контрольных значений и составила 97,57±0,96 % (п=7, р>0,05) (Рис.2). В то же время, наблюдалось снижение скорости развития ГО, которая составила 54,38±1,39% (п= 7, р<0,02) от контрольных значений. Скорость восстановления МП не отличалась от контрольных значений.

Таким образом, оказалось, что при действии супероксид-аниона снаружи клетки Са2+-зависимая К+-проницаемость эритроцитов в целом не изменяется, но значительно снижается скорость ее нарастания.

Другим продуктом ксантинокеидазной реакции является 1Ь02 [Kuciel R., Mazurkiewicz А., 2004], образование которой растет при увеличении времени инкубации.

Увеличение времени прединкубации клеток с ксантином и ксантиоксидазой до 20 и 30 минут вызвало достоверное снижение амплитуды и скорости развития ГО эритроцитов (рис.2).

Эти параметры

составили 91,8±0,84 % (п=7, р<0,05), 65,52±1,39 % (п=7, р<0,02) и 86,36±0,76 % (п=7, р<0,05), 56,39+1,95 % (п=7, р<0,02), соответственно при 20 и 30 минутах инкубации.

Скорость восстановления МП эритроцитов,

отражающая активность Саг+-насоса мембраны этих клеток, достоверно

снижалась до 75,74±2,01% (п=7, р<0,05) только при 30 минутах прединкубации.

Возможно, что

снижение параметров ГО при увеличении времени инкубации эритроцитов с ксантином и ксантиноксидазой обусловлено действием 1Ь02.

В следующей серии экспериментов было изучено влияние перекиси водорода на параметры ГО эритроцитов.

Инкубация эритроцитов с 5-10"8, 10"7и перекиси водорода не привела к

достоверному изменению параметров ГО. Ранее было показано |Ситожевский Л.В. с соавт., 1997; Sitozhevsky A.V. et al., 1997] при низких концентрациях

Рис.2. Зависимость амплитуды гиперполяризационного ответа эритроцитов здоровых доноров от времени инкубации с 10'4 М ксантином и 10mU/mji ксанти ноксидатой. За 100% приняты значения ксантина иксантиноксидазы.

параметра в отсутствии

гидропероксидов плазматическая мембрана эритроцитов становится первым барьером, где происходит расщепление экзогенной перекиси. Ключевую ром в декомпозиции экзогенной перекиси играют гак называемые Ге-связывающие центры мембраны, представленные гемовым и пегемовым железом. Кроме того, для эритроцитов характерна высокая активность каталазы и глутатиоппероксидазы - ферментов, разрушающих перекись водорода, образующуюся в самих эритроцитах или проникающую извне.

Использование более высоких концентраций перекиси водорода оказалось невозможным из-за развивающегося в этих условиях повреждения эритроцитов.

Для увеличения внутриклеточной концентрации Н202 был использован проникающий в клетку ингибитор каталазы амлпотриазол. Обработка эритроцитов амипотриазолом привела к достоверному снижению амплитуды и скорости развития ГО эритроцитов при всех использованных концентрациях перекиси водорода.

Так, параметр АЕ составил 86,8215,69 % (п=5, р<0.05), 85,0510,85% (п=5, р<0,05) и 79,0210,91% (п=5, р<(),05), а скорость развития ГО - 77,08+1,09% (п=5, р<(),05), 74,7314,24% (п=5, р<0,05) и 78,5111,55% (п=5, р<0,05) соответственно при 5-Ю"8, 10"7и 10 бМ Н202.

В то же время оказалось, что скорость восстановления ГО эритроцитов, обработанных амипотриазолом, достоверно увеличивалась и составила при 5-108, 10"7и 10б М М202 соответственно 146,3515,59% (tr-5, р<0,05), 151,0613,52% (п=5, р<0,05) и 146,8513,57% (п= 5, р<0,05).

Полученные данные свидетельствуют о снижении Са2+-зависимой калиевой проницаемости и, напротив, об увеличении активности Са2+-насоса мембраны эритроцитов в условиях повышения внутриклеточной концентрации П202.

Поскольку мишеныо для перекиси водорода являются SH-группы различных белков [Быстрова М.Ф и Буданова Е.Н., 2007], наиболее вероятно, что эффект Н202 связан с модификацией сульфгидрильных групп белков канала или его регуляторных белков. Подтверждением этому являются ранее полученные в пашей лаборатории данные о снижении амплитуды ГО под действием блокатора SH-rpynri N-этилмалеимида [Крсмепо С.В., 2004].

Ранее в работах [Орлов С.П. с соавт., 1992; Петрова И.В., 1999] было показано, что в формировании Са2'-индуцированного ГО эритроцитов участвуют не только К'(Са +)-каиалы, по и Са2+-АТФаза: увеличение ее активности снижает амплитуду ГО эритроцитов. Не исключено, что увеличение активности Са2+-АТФазы под действием Н202 приводило к описанному эффекту.

Еще одной причиной снижения амплитуды ГО может быть ипгибирование АФК Ыа'/К' -ЛТФачы [Болдырев Л.А. с соавт., 1996], что приводит к снижению градиента ионов калия, имеющегося иа мембране эритроцита. Последнее, в свою очередь, приводит к уменьшению Са2+-зависимой калиевой проницаемости мембраны. Действительно, ранее в пашей лаборатории было обнаружено, что диссипация калиевого градиента эритроцитов вследствие ингибирования Na+/K+-АТФазы оубаином приводила к снижению амплитуды ГО эритроцитов [Ситожевский А.В. с соавт. 2006].

Таким образом, в настоящем исследовании обнаружено снижение Са2+-

зависимой К+-проницаемости и стимуляция Са2+-АТФазы перекисью водорода. Наиболее вероятной причиной обнаруженного эффекта 1120> является окисление сульфгидрильных групп белков капала или его регуляторных белков.

Роль перекиси водорода в адренергической регуляции См2+-зависимой К -проницаемости мембраны эритроцитов

В ряде работ показано участие внутриклеточных сигнальных систем в регуляции К+(Са2+)-каналов эритроцитов [Орлов С.Н.с соант., 1992; Петрова И.В. с соавт., 1997; Pellegrino М, Pellegrini М., 1998; Del Carlo В. et al., 2003]. Известно, что активность ряда ферментов, являющихся участниками внутриклеточных регуляторных каскадов, таких как протеинкиназа С, NO-синтаза, гуанилатциклаза и др. модулируются АФК [Sheehan D.W. et al., 1993; Rodriguez-Martinez M.A.et al., 1998; Thakali K.. et al., 2005].

В следующей серии экспериментов было исследовано влияние агониста аг адренэргических рецепторов L-феиилэфрина на К+(Са2+)-каналы в условиях повышенной концентрации Н202. L-фенилэфрип (10 8 М) в отсутствии перекиси водорода приводил к увеличению амплитуды ГО па 9,4 5± 1,69% (п=7, р<0,05), но не изменял параметры V, и V2. Совместное действие Н202 и L-фенилэфрина вызывало существенный рост параметров ГО: амплитуда увеличивалась почти в 2 раза, скорость развития ГО - более чем, в 3 раза, а скорость восстановления - в 5 раз (рис.3).

Одним из ключевых ферментов сигнального пути, опосредованного а|-

адренэргическими рецепторами, является

протеинкиназа С (ИКС). Известно, что в эритроцитах ИКС вызывает увеличение входа ионов кальция, что ведет к активации Са2+-завиеимой К4-проницаемости [Andrews D.A. et al., 2002; Klarl В.A. et al., 2006]. Возможно, в условиях повышения концентрации lli02, увеличивается

активность ПКС, что ведет к возрастанию входа ионов Са2+ и, соответственно, к увеличению Са2+-зависимой К+-проницаемости мембраны эритроцитов.

Подобные результаты получены при обработке эритроцитов активатором ПКС форбол-миристат-ацетатом (ФМА) (10~7 М). ФМА приводил к достоверному увеличению амплитуды и скорости развития ГО до 114,70±12,32 % (п=8, р<0,05)

450- _

400

360 *

эоо

560' * 2)0-

та- Sf! -■■'й

100 -'---,-1—-—I--,---I-,

Д Е V1 V2

1'ис.З. Влияние L-феиилэфрина на параметры гиперполяризационного ответа мембраны

эритроцитов здоровых доноров на фоне повышенной концентрации перекиси водорода * - обозначены параметры, достоверно отличающиеся от контрольных значений с р<0,05

и I32,14±0,39 %(n=8, p<0,05) соответственно. Па фоне повышенной концентрации i ЬСЬ стимулирующее влияние ФМА па К+(Са24)-каналы сохранялось: амплитуда и скорость развития ГО оставались увеличенными.

Таким образом, полученные данные позволяют предположить, что в эритроцитах АФК, в частности, Н202, регулируют сигнальный каскад, опосредованный а|адренэргичсскими рецепторами, реализуя свое действие, скорее всего, через модуляцию активности протеинкиназы С. Результатом является увеличение Са"+-завнсимой К'-проницаемости.

Влияние оксида азота на Саг+-зависим\'ю Кпроницаемость мембраны эритроцитов

Для изучения влияния оксида азота в экспериментальной практике широко используются нитрососдинсния - доноры NO. В проведенных экспериментах был применен питропруссид натрия (МП) [Ignarro L., 1987].

Добавление в среду инкубации эритроцитов НП в концентрациях от 10"8 до 10"6 М не вызывало изменений амплитуды гиперполяризационного ответа (ГО)

Добавление 10'5 М НП к среде инкубации эритроцитов приводило к снижению амплитуды ГО на 20,5±0,84% (п=6, р<0,05) (рис.4). Кроме того, уменьшались и скорость развития ГО (V,), и скорость восстановления МП (V2). Эти параметры составили 42,0±0,49% (п=6, р<0,05) и 87,0±0,04% (п=6, р<0,05), соответственно. При увеличении концентрации НП в среде инкубации до 10"4 - КГ1 М ГО эритроцитов получить не удалось.

Имеется множество данных о стимуляции НП калиевой проводимости мембраны ряда клеток, в первую очередь, гладкомышечпых. Каковы же причины неожиданного влияния НП па К'(Са2+) -каналы мембраны эритроцитов?

Следует отметить, что относительно донорной способности НП не существует единой точки зрения. Некоторые авторы считают, что НП спонтанно освобождает оксид азота Ugnarro L.J. ct al., 2002], который легко проникает внутрь клеток и оказывает свое регуляторное действие. Согласно другой точке зрения, НП подвергается изменениям, в которых участвует мембранносвязанная НАДП-дегидрогеназа [Mohazzab-H. К. М., et al., 1999]. Кроме того, НП

эритроцитов (рис.4).

1 Е.%

~ ' ' ' "* \

в ' 0 1 *

Рис. 4. Влияние нитропруссида натрия (НП) на амплитуду типерполярнзациошюго ответа мембраны эритроцитов здоровых доноров и больных АГ в сочетании с СД 2 типа За 100% приняты значения амплитуды ГО н отсутствии НП.

* - обозначены параметры, достоверно отличающиеся от контрольных значений с р<0,05.

освобождает не только NO, но и ионы ферроцианида и феррицианида [Pasch Т. et al., 1983; Солнцева Е.И. с соавт, 2009; Lockwootl A. et al., 2010], которые вмешиваются в процессы переноса электронов посредством фрагментов электронно-транспортной цепи (НАДН-дегидрогеназа, цитохром с), имеющихся на мембране эритроцитов [Kennct Е., Philip W., 2003]. В ряде работ продемонстрировано, что звенья этой цепи вмешиваются в регуляцию Са2+-зависимой калиевой проницаемости [Alvarez J. et al., 1984; 1992].

Возможно, полученные эффекты НП обусловлены не только NO, по и другими продуктами его диссоциации.

Чтобы избежать NO-нсзависимых эффектов НГ1, мы использовали другой подход для увеличения концентрации оксида азота, связанный с естественным предуктором NO L-аргинином.

Известно, что эритроциты содержат NO-сиптазу - фермент, образующий оксид азота из L- аргинина [Kleinbongard P. et al., 2005; Suhr F. et al.,2009]. В ряде работ показано, что увеличение концентрации L-аргинина приводит к увеличенной продукции NO [Chen L.Y., Mehta J.L.,1998; Nameda Y. et al.,1996; Дмитриенко Н.П., 2008].

Инкубация эритроцитов с L-аргинином (10 й М) вызывала достоверное повышение как амплитуды, так и скорости развития ГО эритроцитов. АЕ увеличился до 124±1,26 % (n=9, р<0,05), а V, - до 113±0,2 % (п=5, р<0,05) (рис.5). Скорость восстановления МП эритроцитов не изменилась и составила 100,67±0,05 % (п=6).

Ингибирование NO-сиитазы с помощью L-NMMA (24 10"5 М) снижало амплитуду ГО до 85,1±2,26 % (п=9, р<0,05) (рис.5).

Таким образом, в проведенных экспериментах установлено, что внутриклеточная продукция N0 увеличивает Са2+-зависимую калиевую проницаемость мембраны эритроцитов. Подтверждением этому являются сведения, что L-аргинин снижает гипотонический гемолиз красных клеток крови вследствие активации выхода ионов калия [Caramelo С. et al., 1994].

В работах по изучению участия N0 в регуляции Na+/I I' -обмена и К+-СГ -котранспорта эритроцитов показан цГМФ-зависимый эффект оксида азота [Petrov V, Lijnen P., 1996; Adragna N.C., Lauf P.K., 1998; Adragna N.C. et al., 2000].

Для выяснения цГМФ-зависимого действия оксида азота обычно применяют ингибитор растворимой гуанилатциклазы - метиленовый синий [Реутов В.П., 1994; Drewett J., 1994]. Однако, предварительные эксперименты показали, что метиленовый синий сам изменяет параметры ГО: и концентрации 1мкМ он увеличивает амплитуду и скорость развития ГО, что свидетельствует о его влиянии на Са2 '-активируемую калиевую проницаемость эритроцитов. Имеются данные о прямом влиянии метиленового синего на Са2+-активируемые К+-каналы высокой проводимости [Stockand J.D., Sansom S.C., 1996].

В связи с этим были проведены эксперименты с агентами, увеличивающими внутриклеточную концентрацию цГМФ:

дибутирил-цГМФ (1С4 М) -проникающим в клетки аналогом цГМФ и

ингибиторами фосфодиэстераз: изобутилметилксантином

(КГ1 М) и запринастом (КГ* М) (100 мкМ) [Petrov V. et al., 1998]. Инкубация эритроцитов со всеми перечисленными веществами приводила к повышению амплитуды ГО на 7,14+0,76% (п=6, р<0,05), 15,03±2,17% (п=6, р<0,05) и 10,14±2,51% (п=6, р<0,05), соответ ственно (рис.5).

Скорость развития ГО достоверно увеличивалась при действии изобутилметилксантина и запринаста и составляла 13210,39 % (п=6, р<0,05) и 114,52±0,25 % (п=6, р<0,05), соответственно. Оказалось, что L-аргинин, дибутирил-цГМФ и ингибиторы ФДЭ действуют однонаправлено, увеличивая активность Са~'-активируемых калиевых каналов, что позволяет предположить наличие цГМФ-опосрсдованного действия оксида азота на каналы.

Таким образом, в настоящем исследовании обнаружено, что донор оксида азота НП в концентрациях выше 10"5М снижает Са2+-зависимую К'-проницаемость эритроцитов, возможно, из-за развития некоторых побочных эффектов. Предуктор NO L-аргинин увеличивает Са2ч-зависимую К+-проницаемость мембраны эритроцитов. К такому же эффекту приводит и увеличение внутриклеточной концентрации цГМФ.

Вклад Са2*-зависимой К'-проницаемости и модулирующих ее агентов в деформируемость эритроцитов здоровых доноров Эритроциты вносят существенный вклад в реологические свойства крови, что во многом определяется их способностью обратимо изменять форму. Известно, что увеличение внутриклеточной концентрации ионов кальция, кроме активации К+(Са^)-каналов ведет к снижению деформируемости красных клеток крови. Не исключено, что этот эффект обусловлен повышением -зависимой К -проницаемости мембраны. Для проверки этого предположения изучено влияние Са2+-зависимой ^-проницаемости и АФК на деформируемость эритроцитов.

130 120 (10 100 ВО

«о

во SO 40

30 20

1 2 3 4 6

Рис. S. Влияние Ь-аргншша (1), дибутирил-цГМФ (2), изобутилметилксантина (3), запринаста(4) и L-NMMA(5) на амплитуду

пшерполяризационного ответа (ГО) мембраны эритроцитов здоровых доноров За 100% принимались контрольные значения амплитуды ГО без добавления агентов. * - обозначены параметры, достоверно отличающиеся от контрольных значений с р<0,05

Деформируемость эритроцитов исследовалась методом лазерной эктацитометрии при скоростях сдвига 90, 180, 360 и 890 с"'.

Для необратимого увеличения Са2+-завиеимой К+-нроницаемости эритроциты предиикубировали в среде N, содержащей 0,5 мкМ Са2н-ионофора А23187 и 300 мкМ СаС12.

В этих условиях индекс деформируемости эритроцитов (ИДЭ) снижался до 70,27±0,2 % (п=7, р<0,()5), 57,54+1,26% (п=7, р<0,05), 50,59±0,40% (п=7, р<0,05) и 55,46±0,46 % (п=7, р<0,05) при скоростях сдвига 90, 180, 360 и 890 с"1, соответственно. Одной из причин снижения деформируемости эритроцитов в этих условиях может быть активация Са; -зависимой К -

проницаемости.

Для проверки этого предположения был

использован подход,

связанный с прекращением выхода ионов калия из клеток: обработка эритроцитов блокатором К+(Са ')-каналов клотримазолом и/или предипкубация эритроцитов в гиперкалиевой среде. Внесение 2 мкМ клотримазола в среду инкубации эритроцитов совместно с А23187 и 300 мкМ СаС12 приводило к достоверному увеличению ИДЭ па 17,18±0,7% (п=7, р<0,05), 16,52 ± 1,72% (п=7, р<0,05), 13,4 ± 0,8% (п=7, р<0,05) и 9,87 ± 0,89% (п=7, р<0,05), соответственно, при скоростях сдвига 90, 180, 360 и 890 с по сравнению со значениями, полученными в отсутствие блокатора (рис.6). Инкубация эритроцитов в гиперкалиевой среде, содержащей 0,5 мкМ Са2+-ионофора А23187 и 300 мкМ СаС12. также вызывала рост ИДЭ по сравнению со значениями, полученными в среде N. Его значения составили 74,08±0,84 % (n=7, р<0,05), 63,05±0,11% (п=7, р<0,05), 69,48±0,23% (п=7, р<0,05) и 67,13±0,76 % (п=7, р<0,05), соответственно, от контрольных значений. Совместное действие клотримазола и гиперкалиевой среды приводило к еще более выраженному увеличению ИДЭ. Однако полного восстановления деформируемости эритроцитов в этих условиях не происходило и при скоростях сдвига 90, 180, 360 и 890 с 1 ИДЭ составил 90,61±0,06 % (п=7, р<0,05), 78,0+2,16% (п=7, р<0,05), 71,58±1,83% (п=7, р<0,05) и 74,98+0,37% (п=7, р<0.05), соответственно, от контрольных значений (рис.6).

Причина этого связана с тем, что увеличение внутриклеточной концентрации ионов кальция, помимо открывания Кн(Са21)-каналов, приводит к нарушению состояния белков мембранного каркаса, изменениям в липидном

Скорость сдвига 890с-1

Среда И Гип,рмптвяя среда

(о"п,5м.М д;3!87»30Си«МСаС12 в 0.5 Д231Е7+300 иМ :.:.! цтримясоп |

Рис.6. Изменения деформируемости эритроцитов в различных средах при скорости сдвига 840 с" *- обозначены ИДЭ, достоверно отличающиеся от значений, полученных в отсутствие клотримазола с р<0,05

#- обозначены ИДЭ. достоверно отличающиеся от значений, полученных в отсутствие клотримазола в различных средах с р<0,05

матриксе мембраны [Lang F. et al., 2004), что играет важную роль в деформируемости эритроцитов [Freedman J.C. et al., 1988; Weed R.I. et al., 1969].

Известно, что изменение транспорта ионов через эритроцитарную мембрану может приводить к изменению объема этих клеток [Орлов С.Н. с соавт., 1988]. Утечка ионов калия из клеток через К+(Са2+)-каналы влечет за собой их дегидратацию и, следовательно, сжатие [Lang F. et al., 2003, 2004].

В настоящей работе спекгрофотометрическим методом было показано сжатие эритроцитов в условиях активации Са2+-зависимой К+-проницаемости, которое устранялось при добавлении блокатора каналов клогримазола.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют об определенном вкладе Са2<"-зависимой (('''-проницаемости в деформируемость эритроцитов. Одной из причин снижения деформируемости эритроцитов в этих условиях может являться сжатие клеток.

Добавление аминотриазола к среде инкубации эритроцитов повышало ИДЭ относительно контрольных значений на 8,11±0,77 % (п=8), 30,69±2,97 % (п=8, р<0,05), 18,9±7,33 % (п=8, р<0,05) и 5,40±2,85 % (п=8) при всех выбранных скоростях сдвига. Возможно, эффект связан со снижением Са2+-зависимой К'-пропицаемости в условиях повышения внутриклеточной продукции перекиси водорода, что было обнаружено в настоящем исследовании.

Влияние активных форм кислорода па Са2-зависимую /{"*"- проницаемость мембраны эритроцитов больных артериальной гипертензией в сочетании с сахарным диабетом 2 типа Многие патологические состояния, в том числе артериальная гипертензия и сахарный диабет 2 типа, сопровождаются развитием окислительного стресса, нарушениями метаоолизма оксида азота [Baynes J.W., 1991; De Mattia G. et al., 1998] и снижением деформируемости эритроцитов [McMillan D.E. et al., 1978; Fujita J. et al., 1996; Miossec P. et al., 1999].

В одинаковых условиях стимуляции Са2,-зависнмой К+-проницаемости амплитуда ГО эритроцитов больных АГ в сочетании с СД 2 типа достоверно снижена по сравнению со здоровыми донорами и составляет 84,35±4,33 % (п=8, р<0,05). Возможная причина этого эффекта - повышенная концентрация ионов кальция в цитоплазме эритроцитов у исследованной категории больных [Fujita J. et al., 1996]. Одинаковая добавка Са2+ приводит к меньшему ответу в условиях повышенной внутриклеточной концентрации ионов кальция. Это может быть связано со снижением чувствительности каналов к Са2+ у больных АГ в сочетании с СД 2 типа.

Прединкубация эритроцитов больных с ксантином (10-4 М) и ксангиноксидазой (10 mU/ мл) в течение 10 минут не изменяла амплитуду и скорость развития ГО, но достоверно увеличивала скорость восстановления МП: этот параметр составил 124,84+0,19 % (п-9, р<0,05), что свидетельствует о возрастании активности Са21-АТФазы.

Увеличение продолжительности инкубации эритроцитов с кеантииом и ксантиноксидазой до 20 и 30 минут привело к росту амплитуды ГО до 114,8+6,14 % (п=9? р< 0,05) и 124,58+4,38 % (п=9, р< 0,05), соответственно (рис.7.А), в то время как у здоровых доноров в этих условиях наблюдалось снижение исследуемого параметра.

Ж.

eptKi лрздиккубации, м

5*10 М 10"7М 10"" М

Koillll'fl I РЛШМГ |1С|К'КИС1! ИОДО|М>ДЯ, М

А Б

Рис.7. Зависимость амплитуды гиперполярнзационного ответа эритроцитов больных АГ в сочетании с СД 2 тина от времени прединкубации с ксантином (I0"4M) и ксантиноксидазой (10 мл/U) (А) и от концентрации перекиси водорода (Б).

За 100% принимались контрольные значения амплитуды ГО без добавления агентов.

* обозначены параметры, достоверно отличающиеся от кон трольных значений с р<0,05

Влияние перекиси водорода на параметры ГО эритроцитов больных также отличалось от результатов, полученных для здоровых доноров. 'Гак, параметр ДЕ достоверно увеличивался до 125,78±2,73% (n=7, р<0,05), 111.15+3,42% (п=7, р<0,05) и 114,94+2,05% (п=7, р<0,05), соответственно при добавлении 5-10-8, 10-7и 10-6 М П202 (рис. 7.Б), тогда как у здоровых доноров наблюдалось снижение амплитуды ГО при этих же концентрациях перекиси водорода, но только в условиях предобработки эритроцитов ингибитором каталазы.

Стимуляция oti-адренэргических рецепторов эритроцитов больных L-фенилэфрином не приводила к изменению параметров ГО. Активатор иротеинкиназы С ФМА также не изменял параметры ГО эритроцитов больных АГ в сочетании с СД 2 типа. Отсутствие влияния L-фенилэфрина и ФМА на К (Са )-каналы эритроцитов больных АГ в сочетании с СД 2 типа может быть связано с тем, что у этой категории больных активность протеинкиназы С изначально повышена [Александровский Я.А., 1998].

Совместное действие Н202 и L-фенилэфрина вызывало повышение ампли туды и скорости развития ГО эритроцитов до 187,72+22,39% (п=6, р<0,05) и 245,78+25,27% (п=6, р<0,05), соответственно. Скорость восстановления мембранного потенциала эритроцитов в описанных условиях также возрастала до 388,89+63,19 % (п=б, р<0,05).

Аналогичный эффект наблюдался и при действии ФМА на фоне повышенной концентрации Н202. Так, амплитуда ГО возрастала до 128.56+13,61% (n=7, р<0,05). а

скорость развития ГО - до 113,64±6,35 % (п=7, р<(),05). Скорость восстановления МП эритроцитов в этих условиях достоверно не изменялась.

Инкубация эритроцитов больных в присутствии 10~7, 10б и Ю"5 М НП достоверно снижала амплитуду ГО ответа эритроцитов. Этот параметр составил 79,47±11,01 % (it- 6, р<0,05), 74,39±8,47 % (п=6, р<0,05) и 80,09±4,26 % (п=6, р<0,05), соответственно (рис.4). Скорость развития ГО и скорость восстановления мембранного потенциала эритроцитов больных АГ в сочетании с СД 2 типа в присутствии НП достоверно не изменялись. Таким образом, эффекты НП оказались однонаправленными и у больных, и у здоровых доноров. Однако у больных снижение амплитуды ГО эритроцитов под воздействием НП происходило уже при концентрации 10"7 М и последующее увеличение концентрации донора NO не приводило к дальнейшим изменениям этого параметра.

В условиях дисбаланса про- и аитиоксидантных систем эритроцитов [Ефимов А.С., Науменко В.Г.,1985; Baynes J.W., 1991; De Mattia G. et al., 1998], усиления перекиспого окисления липидов [Максимов О.В., Солун М.Н., 1989], увеличения степени гликозилирования не только гемоглобина, но и белков мембранного каркаса [Schwartz R.S. et al., 1991; Mahindrakar Y. S, et al.,2007], отмечаемых у больных АГ в сочетании с СД 2 типа, изменение Са2-зависимой калиевой проницаемости мембраны клеток будет являться дополнительным весьма неблагоприятным фактором, ведущим к дальнейшему снижению деформируемости эритроцитов.

Таким образом, в настоящем исследовании установлено, что регуляция активными формами кислорода 1С+(Са2+)-каналов эритроцитов больных АГ в сочетании с СД 2 типа существенно изменена.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

К+(Са2+)-каналы играют важную роль в функционировании эритроцита, в частности, участвуя в изменении объема клеток, а также в процессе эриптоза. В настоящем исследовании установлено, что, кроме этого, Са2+-зависимая проиицаемость мембраны вносит существенный вклад в регуляцию деформируемости красных клеток крови: увеличение в среде инкубации ионов кальция снижает индекс деформируемости эритроцитов, что частично устраняется блокатором каналов клотримазолом или прединкубацией в гиперкалиевой среде. Одной из причин снижения деформируемости эритроцитов при активации К+(Са2+)-каналов может быть дегидратация клеток вследствие утечки ионов калия и их сжатие, что подтверждено спектрофотометрическими исследованиями.

Известно, что на деформируемость эритроцитов, эриптоз оказывают воздействие активные формы кислорода, в частности, оксид азога. В связи с этим важным представляется исследование функционирования К (Са2*)-капалов эритроцитов в условиях повышенной концентрации АФК, тем более, что они могут выступать в роли либо регуляторов, либо повреждающих факторов.

В настоящем исследовании установлено, что АФК, в том числе перекись водорода и NO вмешиваются в регуляцию К(Са2+)-каналов эритроцитов.

Увеличение внутриклеточной концентрации перекиси водорода с помощью ингибирования каталазы приводит к снижению Са2+-зависимой К+-нроницаемости, но к повышению активности Са2+-насоеа мембраны эритроцитов здоровых доноров. Ранее было установлено, что Са21"-А'ГФаза вносит существенный вклад в формирование ГО эритроцитов [Орлов С.Н. с соавт., 1992] и увеличение ее активности приводит к снижению амплитуды ГО. С другой стороны, мишенями для перекиси водорода, являются сульфгидрильные группы белковых молекул, в том числе и белков каналов [Быетрова М.Ф и Буданова Е.Н., 2007]. Возможно, обнаруженное снижение Са2+-зависимой К+-проницасмости эритроцитов здоровых доноров иод действием перекиси водорода можно рассматривать как защитную реакцию, препятствующую преждевременной гибели клеток и снижению их деформируемости в условиях повышенной продукции АФК.

В эритроцитах больных, напротив, при увеличении содержания перекиси водорода отмечается повышение Са2+-зависимой К+-пропицаемости мембраны клеток. Это должно способствовать дальнейшему снижению деформируемости эритроцитов и сокращению времени их жизни, что отмечается при патологиях, объединенных развитием окислительного стресса.

В проведенном исследовании выяснилось, что применение нитропруссида натрия для изучения NO-зависимой регуляции К+(Са2+)-каналов эритроцитов вызывает ряд затруднений. Это связано с тем, что при увеличении его концентрации развиваются побочные NO-независимые эффекты, по-видимому, маскирующие действие самого оксида азота. В связи с этим в качестве источника оксида азота был использован L-аргинин - субстрат для NO-синтазы. Выяснилось, что N0 увеличивал акт ивность К+(Са2+)-каналов здоровых доноров. Свое действие на Си2'-активируемую калиевую проницаемость эритроцитов N0, как и в других клетках, по-видимому, реализует цГМФ-зависимым способом. Это подтверждается полученными данными об однонаправленном действии на К+(Са2+)-каналы L-аргинина, дибутирил-цГМФ и ингибиторов ФДЭ.

Таким образом, АФК модулируют активность К^(Са^)-капалов эритроцитов как здоровых доноров, так и больных артериальной гипертензией в сочетании с сахарным диабетом 2 типа. Эффекты исследованных АФК оказались во многом противоположными для К+(Са +)-каналов эритроцитов больных по сравнению со здоровыми донорами. Окислительный стресс, развивающийся при данной патологии, приводит к существенным изменениям регуляции К+(Са2+)-каналов эритроцитов.

выводы

1. Повышение внутриклеточной концентрации перекиси водорода снижает, а оксида азота увеличивает Са*""-зависимую К"- проницаемость мембраны эритроцитов здоровых доноров. Супероксид-анион при его действии с наружной стороны мембраны, не изменяет активность Са2"активиуемых К+-каиалов эритроцитов здоровых допоров и больных артериальной гипертензией в сочетании с сахарным диабетом 2 типа.

2. Совместное действие перекиси водорода и агониста щадренэргических рецепторов L-фенилэфрина значительно увеличивает Са""- зависимую Непроницаемость мембраны эри троцитов здоровых доноров.

3. Стимуляция Са2'-зависимой «"-проницаемости снижает деформируемость эритроцитов здоровых доноров, что сопровождается уменьшением объема клеток.

4. Под действием перекиси водорода Са2+-завиеимая К+- проницаемость мембраны эритроцитов больных артериальной гипертензией в сочетании с сахарным диабетом 2 типа возрастает.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Роль активных форм кислорода в регуляции Са2+-активнруемых калиевых каналов эритроцитов / 'Грубачева О.А. // Сборник статей но результатам 66-й юбилейной студенческой научной конференции им. П.И. Пирогова, Сибирский медицинский университет, Томск, 23-25 апреля 2007. - С.363-364.

2. Исследование влияния фенилэфрина гидрохлорида на Са2"-активируемых калиевых каналов эритроцитов здоровых доноров и больных артериальной гипертензией в сочетании с сахарным диабетом 2-го типа / Трубачева О.А., Ситожевский А.В., Кремено С.В., Груздева О.В., Петрова И.В. // Материалы 2 съезда кардиологов сибирского федерального округа, ГУ НИИ кардиологии ТНЦ СО РАМН, Томск, 6-7 июня 2007. - С. 121-122.

3. Исследование влияния метаболитов системы ксантин-ксантиноксидаза на Са2+-зависимую калиевую проницаемость мембраны эритроцитов здоровых доноров / Трубачева О.А., Кремено С.В., Ситожевский А.В., Петрова И.В., Груздева О.В., Иванов В.В // Материалы III Всероссийской научно-практической конференции с международным участием "Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов", Сибирский консилиум, Новосибирск, 7-9 ноября 2007. - №7 (62). - С. 50.

4. Внутриклеточные механизмы реализации эффектов оксида азота на Са" "-зависимую калиевую проницаемость мембраны эритроцитов больных сахарным диабетом 2 типа в сочетании с артериальной гипертензией / Трубачева О.А., Кремено С.В., Груздева О.В., Рогачевская И.В. // Материалы IX конгресса молодых ученых и специалистов "Науки о человеке", Томск, 22-23 мая 2008.-С. 94.

5. Вклад активных форм кислорода в регуляции Са2'-активируемых калиевых каналов эритроцитов человека / Трубачева О.А., Петрова И.В., Ситожевский А.В., Кремено С.В., Груздева О.В., Иванов В.В. // Тезисы докладов VI Сибирского физиологического съезда, Барнаул, 25-27 июня 2008. - С. 16-17.

6. Влияние нитропруесида натрия на Са2+-зависимую калиевую проницаемость эритроцитов больных с сахарным диабетом 2 тина в сочетании с артериальной гипертензией / Трубачева О.А., Кремено С.В., Груздева О.В., Рогачевская И.В. // Материалы Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов "Актуальные проблемы современной эндокринологии", Москва, 14 октября 2008. - С. 35.

7. Регуляция Са2+-зависимой калиевой проницаемости мембраны: роль протеинкиназы С / Трубачева О.А., Насанова О.Н., Кремено С.В., Груздева О.В. // Материалы докладов XVI Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов", Москва, 14-17 апреля 2009.-С.40.

8. Участие мембранных редокс-процессов и активированных кислородных метаболитов в регуляции Са2+-зависимой калиевой проницаемости мембраны эритроцитов здоровых доноров и больных с сахарным диабетом 2 типа в сочетании с артериальной гипертензией / Трубачева О.А., Крсмено С.В., Груздева О.В. // Материалы X конгресса молодых ученых и специалистов "Науки о человеке", Томск, 28-29 мая 2009. - С. 87-88.

9. Влияние перекиси водорода и форболового эфира на К+(Са2+)-каналы эритроцитов больных артериальной гипертензией в сочетании с сахарным диабетом 2 типа / Трубачева О.А., Кремено С.В., Груздева О.В., Рогачевская И.В. // Актуальные вопросы современной медицинской науки и здравоохранения: Материалы 64-й всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и студентов с международным участием, Екатеринбург, 28-29 апреля 2009. - С. 577-578.

10. Участие активных форм кислорода в регуляции Са2+-актииируемых К+-каналов эритроцитов / Трубачева О.А., Кремено С.В., Петрова И.В., Ситожевский А.В., Груздева О.В., Иванов В.В., Суслова Т.Е. // Бюллетень сибирской медицины. - 2009. - №2. - С. 56-60.

И. Оксид азота - регулятор Са2-зависимой калиевой проницаемости мембраны эритроцитов человека / Трубачева О.А., Рогачевская И.В., Кремено С.В., Груздева О,В. // Бюллетень северного государственного медицинского университета № I (XXII), Архангельск, - 2009. - С. 236.

12. Вклад протеинкиназы С в регуляцию Са2+-завиеимой К+ проницаемости мембраны эритроцитов у больных АГ в сочетании С СД 2 типа/ Трубачева О.А., Насанова О.Н., Кремено С.В., Груздева О.В. // Материалы IV научно-практической конференции молодых учёных с международным участием "Завадские чтения", Ростов-па-Дону: ГОУ ВПО РостГМУ, 21 марта 2009. - С. 123-124.

13. Оксид азота как регулятор Са2'-зависимой калиевой проницаемости мембраны эритроцитов здоровых допоров/ Трубачева О.А., Кремено С.В., Ситожевский А.В., Суслова Г.Е // Сб.: Нейрогуморальные механизмы регуляции висцеральных органов и систем в норме и при патологии. - Матер, научной конф., Томск, 22-23 октября 2009. - С. 98-100.

14. Изучение влияния донаторов на Са2+-зависимую калиевую проводимость мембраны и способность к деформируемости эритроцитов человека / Трубачева О.А., Васильев А.С. // Материалы IV Международной научной

конференции молодых ученых-медиков, Курск, 25-26 февраля 2010. - Т.2. - С. 269-271.

15. Влияние донатора оксида азота - нитропруссида натрия и пероксида водорода Са2+-зависимую К+- проницаемость мембраны эритроцитов у больных артериальной гипертензией в сочетании с сахарным диабетом 2 типа / Трубачева О.А., Насанова О.Н., Петрова И.В., Суслова Т.Е., Ситожевский А.В., Кремено С.В. // Сибирский медицинский журнал, Томск, - 2010. - Т.25. - №2. - С. 146.

16. Регуляция Са2+-активируемых калиевых каналов: роль оксида азота и пероксида водорода / Петрова И.В., Трубачева О.А., Ситожевский А.В., Суслова Т.Е., Кремено С.В. II XXI Съезд Физиологического общества им. И.П.Павлова, Калуга,-2010.-С. 477.

17. Влияние активных форм кислорода на Са2+-активируемую К+-проницаемость эритроцитов больных артериальной гипертензией в сочетании с сахарным диабетом 2 типа / Трубачева О.А. // Сибирский медицинский журнал, Томск, - 2011. - Т.26. - № 1. - С. 118-122.

СПИСОК испол АГ - артериальная гипертензия АФК - активные формы кислорода ГО - гиперполяризационый ответ ГЦ - гуанилатциклаза ИДЭ - индекс деформируемости эритроцитов

К+(Са:+)-канал - кальций активируемый калиевый канал МН - мембранный потенциал НП - нитропруссид натрия Н2О2 - перекись водорода

\HHLIX СОКРАЩЕНИЙ

0'2- супероксид-анион

СД 2 типа - сахарный диабет 2типа

ПК С - протеинкиназа С

ФЭ-фенилэфрин

ФДЭ - фосфодиэстераза

ФМА - форбол-меристат-ацетат

цГМФ - циклический 3:5-гуанозин-

монофосфат

NO - оксид азота

L-NMMA-N-monomethil-1-argenine

Автор выражает благодарность директору ГУ НИИ кардиологии Томского научного центра Сибирского отделения РАМН, академику РАМН Р.С. Карпову; руководителю клинико-диагностической лаборатории в.н.с., к.м.н. Т.Е. Сусловой; н.с., к.м.н. А.В. Ситожевскому; лаборатории фармакологии кровообращения НИИ Фармакологии СО РАМН профессору, д.б.н. М.Б. Плотникову; н.с., д.м.н. О.И. Алиеву; н.с. А.С. Васильеву; к.б.н., доценту кафедры биохимии и молекулярной биологии В.В. Иванову; н.с. лаборатории клеточных технологий отдела экспериментальной и клинической кардиологии Учреждения РАМН НИИ комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний Сибирского отделения РАМН, к.м.н. С.В. Кремено за оказанное содействие в проведении настоящего исследования.

Подписано в печать 17.05.2011г. Усл. печ. листов 0.65 Печать на ризографе. Отпечатано в лаборатории оперативной полиграфии ГОУ ВПО Сиб ГМУ 634050, г. Томск, Московский тракт, 2,тел. 53-04-08 Заказ №199 Тираж 100 экземпляров

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Трубачева, Оксана Александровна

Оглавление.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Образование и роль активных форм кислорода в клетке.

1.2. Общая характеристика Са2+-активируемых калиевых каналов мембраны эритроцитов.

1.3. Регуляция Са2+-активируемых калиевых каналов эритроцитов

1.4. Нарушение морфофункциональных свойств эритроцитов у больных артериальной гипертензией в сочетании с сахарным диабетом 2 типа.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ.

2.1. Объект исследования.

2.2. Получение эритроцитов.

2.3. Использованные растворы и реактивы.

2.4. Метод регистрации мембранного потенциала в суспензии эритроцитов.

2.4.1. Получение гиперполяризационного ответа эритроцитов, индуцированного кальциевым ионофором А23187.

2.5. Спектрофотометрический метод.

2.5.1. Определение продукции супероксид-аниона.

2.5.2 . Регистрация изменения объема эритроцитов.

2.6. Исследование деформируемости эритроцитов.

2.7. Статистическая обработка полученных данных.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЯ.

3.1. Влияние супероксид-аниона и перекиси водорода на Са~ -зависимую калиевую проницаемость мембраны эритроцитов здоровых доноров.

3.1.1. Роль перекиси водорода в адренэргической регуляции Са~ -зависимой калиевой проницаемости эритроцитов здоровых доноров

3.2. Влияние оксида азота на Са2+-зависимую калиевую проницаемость мембраны эритроцитов здоровых доноров.

3.2.1. Влияние нитропруссида натрия на Са2+-зависимую калиевую проницаемость мембраны эритроцитов.

3.2.2. Влияние Ь-аргинина на Са2+ -зависимую калиевую проницаемость мембраны эритроцитов.

3.2.3. Влияние дибутирил-цГМФ на Са2+-зависимую калиевую проницаемость мембраны эритроцитов.

3.2.4. Влияние ингибиторов фосфодиэстераз на Са2+-зависимую калиевую проницаемость мембраны эритроцитов.

3.3. Вклад Са2+-зависимой К+-проницаемости в деформируемость эритроцитов.

3.4. Влияние активных форм кислорода на Са2+- зависимую калиевую проницаемость эритроцитов больных артериальной гипертензией в сочетании с сахарным диабетом 2 типа.

3.4. Влияние активных форм кислорода на Са - зависимую калиевую проницаемость эритроцитов больных артериальной гипертензией в сочетании с сахарным диабетом 2 типа.

3.4.1. Влияние супероксид-аниона и перекиси водорода на Са2+ -зависимую калиевую проницаемость мембраны эритроцитов больных артериальной гипертензией в сочетании с сахарным диабетом 2 типа.

3.4.2. Роль перекиси водорода в агадренэргической регуляции Са2+-активируемых калиевых каналов эритроцитов больных артериальной гипертензии в сочетании сахарным диабетом 2 типа.

3.4.3. Влияние нитропруссида натрия на Са2+- зависимую К+-проницаемость эритроцитов больных артериальной гипертензией в сочетании с сахарным диабетом 2 типа.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль активных форм кислорода в регуляции Са2+-активируемой калиевой проницаемости эритроцитов человека"

Актуальность проблемы

К настоящему времени накоплен огромный объем сведений о роли активных форм кислорода (АФК) в жизнедеятельности клетки, к которым наряду с супероксид-анионом, перекисью водорода относят и оксид азота. Хорошо изучено повреждающее действие АФК на клеточные мембраны. Однако в последнее время все чаще появляются работы, в которых АФК, в том числе супероксид-анион, перекись водорода (Н202) и оксид азота (N0) рассматриваются в качестве регуляторов внутриклеточных процессов. Активные формы кислорода либо сами выступают в роли вторичных посредников [10, 23, 109, 123], либо модулируют действие известных регуляторных каскадов клетки [129]. Один из регуляторных путей связан с влиянием АФК на ионтранспортные системы клеток [88, 145].

Мембрана эритроцитов содержит только один тип каналов, а именно Са2+-активируемые К+ каналы (К+(Са2+)-каналы) средней проводимости, или ОагёоБ-каналы. В связи с этим красные клетки крови служат естественной моделью для изучения каналов этого типа. Кроме того, данное обстоятельство позволяет проводить исследования на суспензии интактных клеток.

Со времени своего обнаружения К+(Са2+)-каналы эритроцитов достаточно интенсивно изучаются, но только недавно была установлена их физиологическая роль. К+(Са2+)-каналы вносят определенный вклад в эриптоз [134, 169], изменение объема клеток [102]. Не исключено их участие в деформируемости клеток: Са~ -индуцируемое снижение деформируемости эритроцитов устраняется при выравнивании градиента ионов калия [127].

Регуляция К (Са~ )-каналов эритроцитов осуществляется несколькими путями. Один из них связан с вторичными посредниками, эффект которых реализуется при воздействии активаторов или ингибиторов протеинкиназ А или С [54, 60, 126, 199].

Другой путь регуляции осуществляется посредством белков цитоскелета эритроцитов без участия протеинкиназ [61, 76].

Наконец, мембрана эритроцитов содержит некоторые компоненты электронно-транспортной цепи, обычно присутствующие на внутренней мембране митохондрий (НАДН-дегидрогеназа, цитохром с) [91, 160,

Ч* ^Ч*

185], которые могут включаться в регуляцию К (Са~ )-каналов эритроцитов [91].

В эритроцитах, вследствие циклов окси- и дезоксигенации гемоглобина, постоянно происходит образование АФК, которые влияют на регуляторные пути этих клеток [97, 185]. Кроме того, в процессе своего функционирования эритроциты подвергаются действию АФК, продуцируемых другими клетками: эндотелиоцитами, иммунокомпетентными клетками во время так называемого «кислородного взрыва» [222]. Известно, что АФК, в частности, оксид азота, оказывают влияние на эриптоз [194] и деформируемость эритроцитов [107]. I

I Эритроциты периферической крови являются универсальной моделью для оценки степени и глубины повреждения мембран при патологическом процессе [82]. С другой стороны, нарушения структурно-функционального состояния мембраны эритроцитов могут рассматриваться как одно из звеньев патогенеза ряда заболеваний.

При патологических процессах, сопровождающихся окислительным повреждением эритроцитов, наблюдаются типовые изменения со стороны клеток красной крови [47]: повышение > , внутриклеточной концентрации ионов кальция, снижение их деформируемости и сокращение продолжительности жизни [137, 188, 190]. Нельзя исключить, что в условиях повышенной продукции АФК

4* 24* изменяется как функционирование самих К (Са ) -каналов, так и внутриклеточных сигнальных систем, участвующих в их регуляции.

Однако данные об участии АФК в регуляции Са2+-активируемых калиевых каналов эритроцитов человека немногочисленны.

В связи с вышесказанным представляется весьма актуальным

4" изучение роли активных форм кислорода в регуляции К (Са" )-каналов / эритроцитов как в норме, так и при патологическом процессе, сопровождающимся окислительным повреждением эритроцитов.

Цель настоящего исследования - изучить вклад активных форм кислорода в регуляцию Са2+-зависимой К+-проницаемости мембраны эритроцитов здоровых доноров и больных артериальной гипертензией в сочетании с сахарным диабетом 2 типа. I

Для достижения указанной цели решались следующие задачи:

1) исследовать влияние супероксид-аниона, перекиси водорода и оксида азота на Са" - зависимую К - проницаемость мембраны эритроцитов здоровых доноров;

2) изучить влияние перекиси водорода и агониста а1-адренэргических рецепторов фенилэфрина на

Са2+- зависимую К -проницаемость мембраны эритроцитов здоровых доноров;

24~ 4"

3) исследовать влияние повышенной Са -зависимой К -проницаемости на деформируемость и изменение объема эритроцитов здоровых доноров;

4) изучить регуляцию активными формами кислорода Са" -зависимой К+ проницаемости мембраны эритроцитов больных артериальной гипертензией в сочетании с сахарным диабетом 2 типа.

Положения, выносимые на защиту

1. Перекись водорода снижает, а оксид азота увеличивает Са" -зависимую К+-проницаемость мембраны эритроцитов здоровых доноров. Супероксид-анион при внеклеточной аппликации не изменяет Са2+-зависимую К+-проницаемость мембраны эритроцитов здоровых доноров, но снижает скорость ее развития.

2. Перекись водорода потенцирует активирующее действие агониста аг адренэргических рецепторов фенилэфрина на Са2+ -зависимую К -проницаемость мембраны эритроцитов как здоровых доноров, так и больных артериальной гипертензией в сочетании с сахарным диабетом 2 типа.

3. Повышение Са2+-зависимой К+-проницаемости приводит к снижению деформируемости эритроцитов здоровых доноров. Одной из причин снижения деформируемости является сжатие клеток.

4. В эритроцитах больных артериальной гипертензией в сочетании с сахарным диабетом 2 типа перекись водорода, в отличие от здоровых доноров, существенно увеличивает Са2+-зависимую К+-проницаемость мембраны.

Научная новизна работы

Впервые показано, что суперокси-данион, продуцируемый внеклеточным источником (система ксантин - ксантиноксидаза), не изменяет, а перекись водорода уменьшает Са -зависимую;- К -проницаемость мембраны эритроцитов здоровых доноров. Впервые установлено, что увеличение внутриклеточной концентрации перекиси водорода потенцирует активирующее действие фенилэфрина на

Са активируемые К+-каналы эритроцитов здоровых доноров.

Установлено, что стимуляция внутриклеточной продукции оксида азота с помощью Ь-аргинина приводит к повышению Са2+-зависимой К+-проницаемости мембраны эритроцитов здоровых доноров. Сходный эффект оказывает и увеличение внутриклеточной концентрации цГМФ.

Показано, что активация Са2+-зависимой К+-проницаемости мембраны эритроцитов здоровых доноров снижает их деформируемость, что сопровождается уменьшением объема клеток.

Впервые проведено исследование влияния активных форм кислорода на Са" -активируемые К -каналы эритроцитов больных артериальной гипертензией в сочетании с сахарным диабетом 2 типа. Установлено, что у данной категории больных в отличие от здоровых доноров перекись водорода увеличивает Са2+-зависимую Непроницаемость мембраны эритроцитов.

Научно-практическая значимость работы

Данные, полученные в настоящем исследовании, носят фундаментальный характер и расширяют существующие представления о регуляции и функциональной значимости Са -активируемых К -каналов эритроцитов. Результаты работы дополняют представления о механизмах регуляции ионной проницаемости мембраны клеток активными формами кислорода. Сведения о снижении деформируемости эритроцитов вследствие увеличения Са2+-зависимой К+-проницаемости полезны для разработки молекулярных технологий управления деформируемостью красных клеток крови. Результаты работы, связанные с модулированием активными формами кислорода Са" -активируемых К -каналов эритроцитов при артериальной гипертензии в сочетании с сахарным диабетом 2 типа могут быть использованы для фармакологической коррекции нарушений структурно-метаболического статуса эритроцитов при патологиях, объединенных развитием окислительного стресса.

Апробация работы

Основные положения диссертационной работы доложены на всероссийских и международных научных форумах: XI и X Международном конгрессе молодых ученых и специалистов "Наука о человеке" (Томск, 2008-2009), Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов "Актуальные проблемы современной эндокринологии" (Москва, 2008), VI Сибирском физиологическом съезде (Барнаул, 2008), XVI Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов" (Москва, 2009), XXI Съезде Физиологического общества им. И.П.Павлова (Калуга, 2010), конференции «Современная кардиология: Эра инноваций» (Томск, 2010).

Исследование выполнено в рамках реализации ФЦП "Проведение научных исследований коллективами под руководством приглашенных исследователей" ФЦП "Научные и научно-педагогические кадры инновационной России" на 2009-2013 годы ГК № 02.740.11.5031 и «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 гг. ГКП445

Публикации

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 123 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы "Материалы и методы", главы собственных результатов, их обсуждения и заключения. Библиография включает 237 ссылок, в том числе 86 - работы отечественных авторов и 151 - зарубежных. Работа иллюстрирована 37 рисунками и включает 2 таблицы.

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Трубачева, Оксана Александровна

выводы

1. Повышение внутриклеточной концентрации перекиси водорода снижает, а оксида азота увеличивает Са2+-зависимую К+- проницаемость мембраны эритроцитов здоровых доноров. Супероксид-анион при его действии с наружной стороны мембраны, не изменяет активность Са2+активиуемых К+-каналов эритроцитов здоровых доноров и больных артериальной гипертензией в сочетнии с сахарным диабетом 2 типа.

2. Совместное действие перекиси водорода и агониста с^адренэргических рецепторов Ь-фенилэфрина значительно увеличивает Са2+- зависимую К+-проницаемость мембраны эритроцитов здоровых доноров.

3. Стимуляция Са2+-зависимой К+-проницаемости снижает деформируемость эритроцитов здоровых доноров; что сопровождается уменьшением объема клеток.

4. Под действием перекиси водорода Са -зависимая К -проницаемость мембраны эритроцитов больных артериальной гипертензией в сочетании с сахарным диабетом 2 типа возрастает

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

К (Са )-каналы играют важную роль в функционировании эритроцита, в частности, участвуя в изменении объема клеток, а также в процессе эриптоза. В настоящем исследовании установлено, что, кроме этого, Са2+-зависимая К+-проницаемость мембраны вносит существенный вклад в регуляцию деформируемости красных клеток крови: увеличение в среде инкубации ионов кальция снижает индекс деформируемости эритроцитов, что частично устраняется блокатором каналов клотримазолом или прединкубацией в гиперкалиевой среде. Одной из причин снижения деформируемости эритроцитов при активации К (Са" )-каналов может быть дегидратация клеток вследствие утечки ионов калия и их сжатие, что подтверждено спектрофотометрическими исследованиями.

Известно, что на деформируемость эритроцитов, эриптоз оказывают воздействие активные формы кислорода, в частности, оксид азота. В связи с этим важным представляется исследование функционирования К+(Са2+)-каналов эритроцитов в условиях повышенной концентрации АФК, тем более, что они могут выступать в роли либо регуляторов, либо повреждающих факторов.

В настоящем исследовании установлено, что АФК, в том числе

4* 24* перекись водорода и N0 вмешиваются в регуляцию К (Са )-каналов эритроцитов.

Увеличение внутриклеточной концентрации перекиси водорода с помощью ингибирования каталазы приводит к снижению Са2+-зависимой К -проницаемости, но к повышению активности Са" -насоса мембраны эритроцитов здоровых доноров. Ранее было установлено, что Са -АТФаза вносит существенный вклад в формирование ГО эритроцитов [49] и увеличение ее активности приводит к снижению амплитуды ГО. С другой стороны, мишенями для перекиси водорода, являются сульфгидрильные группы белковых молекул, в том числе и белков каналов [10]. Возможно, обнаруженное снижение Са2+-зависимой К+-проницаемости эритроцитов здоровых доноров под действием перекиси водорода можно рассматривать как защитную реакцию, препятствующую преждевременной гибели клеток и снижению их деформируемости в условиях повышенной продукции АФК.

В эритроцитах больных, напротив, при увеличении содержания перекиси водорода отмечается повышение Са2+-зависимой К+-проницаемости мембраны клеток. Это должно способствовать дальнейшему снижению деформируемости эритроцитов и сокращению времени их жизни, что отмечается при патологиях, объединенных развитием окислительного стресса.

В проведенном исследовании выяснилось, что применение нитропруссида натрия для изучения Ж)-зависимой регуляции К (Са~ )-каналов эритроцитов вызывает ряд затруднений. Это связано с тем, что при увеличении его концентрации развиваются побочные МО-независимые эффекты, по-видимому, маскирующие действие самого оксида азота. В связи с этим в качестве источника оксида азота был использован Ь-аргинин - субстрат для 1ЧО-синтазы. Выяснилось, что N0 увеличивал активность К+(Са2+)-каналов здоровых доноров. Свое действие на Са2+-активируемую калиевую проницаемость эритроцитов N0, как и в других клетках, по-видимому, реализует цГМФ-зависимым способом. Это подтверждается полученными данными об однонаправленном действии на К+(Са2+)-каналы Ь-аргинина, дибутирил-цГМФ и ингибиторов ФДЭ.

Таким образом, АФК модулируют активность

-каналов эритроцитов как здоровых доноров, так и больных артериальной гипертензией в сочетании с сахарным диабетом 2 типа. Эффекты исследованных АФК оказались во многом противоположными для К+(Са2+)-каналов эритроцитов больных по сравнению со здоровыми донорами. Окислительный стресс, развивающийся при данной патологии, приводит к существенным изменениям регуляции К (Са )-каналов эритроцитов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Трубачева, Оксана Александровна, Томск

1. Алекандровский, Я.А. Молекулярные механизмы развития диабетических осложнений // Биохимия. 1998. - Т. 63, вып. 11.-С. 1470- 1479.

2. Асташкин, Е.И., Приходько А.З. Влияние нитропруссида натрия и нитросодержащих вазодилататоров на микросомные монооксигеназы печени крыс. // Экспериментальная и клиническая фармакология. 1997. - Т.60. - №.2. - С. 27-29

3. Атаулаханов, Ф. И. Регуляция объема эритроцитов человека. Роль калиевых каналов, активируемых кальцием / Ф. И. Атауллаханов, В. М. Витвицкий, А. Б. Кияткин, и др. // Биофизика. 1993. - Т. 38, №5.-С. 809-821.

4. Атаулаханов, Ф. И. Физиологическая биохимия крови: от описания к пониманию / Ф. И. Атауллаханов, А.А Бутылин, В.М. Витвицкой, и др. // Гематол. и трансфуз. 2008. - Т. 53, № 5. - С. 42-48.

5. Балаболкин, М. И. Роль Na+-H+ обменника в патогенезе сахарного диабета 2 типа / М.И. Балаболкин, М.Ф. Белоярцева // Сахарный диабет. 2001. - №2. - С. 49-55.

6. Белкин, A.B., Сторожок С.А., Катюхин J1.H. Эктацитометрия -объективный метод оценки способности эритроцитов к деформации // Физиол. журн. СССР. 1991. - №1. - С. 133-138.

7. Болдырев, A.A. Карнозин. Биологическое значение и возможности применения в медицине / A.A. Болдырев, под ред.

8. З.Викторов, И. В. Роль оксида азота и других свободных радикалов в ишемической патологии мозга // Вестн. РАМН. 2000. - № 4. -С.5 - 10.

9. Н.Владимиров, Ю.А. Свободные радикалы в биологических системах // Биология. 2000.

10. Владимиров, Ю.А. Свободные радикалы в клетке / Ю.А. Владимиров // Нейрохимия. 1996. - №13. - С.47-54.

11. Владимиров, Ю.А., Свободные радикалы в живых системах / O.A. Азизова, А.И. Деев и др. // Итоги науки и техники. Сер. Бифизика. 1991. — Т.29. - С. 1-249

12. Владимиров, Ю.Ф. Хемилюминесценция клеток животных/ Ю.Ф.Владимиров, М.П. Шерстнев// Итоги науки и техники. Сер. Биофизика. 1989. - Т.24.

13. Гланц, С. Медико-биологическая статистика: Пер. с англ. / С. Гланц // М.: "Практика".- 1999.-459 с.

14. Гольдберг, В.Е., Дыгай A.M., Новицкий В.В. Рак легкого и система крови. Томск - 1992. - 236 с.

15. Гурло, Т. Г. Входящие и выходящие потоки калия (86Rb) в эритроцитах человека и крысы: регуляция при изменении объема клетки / Т. Г. Гурло, С. Н. Орлов, С. Л. Аксенцев и др. // Биол. мембраны. 1991. - Т. 8. - С. 724 - 735.

16. Гюльханданян, A.B. Са2+- зависимый выход К+ из эритроцитов, индуцированный окислительными процессами / А. В. Гюльханданян, Г. М. Геокчакян // Биофизика. 1991. - Т. 36, № 1. -С. 169-171.

17. Джанашия, П. X. Дислипопротеидемии: клиника, диагностика, лечение / П.Х. Джанашия, В. А. Назаренко, С. А. Николенко. // М.: РГМУ. 2000. - 48 с.

18. Дубинина, Е.Е. Продукты метаболизма кислорода в функциональной активности клеток (жизнь и смерть, созидание и разрушение). // Физиологические и клинико-биохимические аспекты. СПб.: Издательство Медицинская пресса. 2006. - 400 с.

19. Казеннов A.M., Маслова М.Н. Влияние мембранного скелета безъядерных эритроцитов на свойства транспортных АТФаз. // Цитология. 1991. - Т. 33, №11. - С. 32 - 41.

20. Клещев, A.JI. Биохимические аспекты действия натрия нитропруссида / А. Л. Клещев, М. Л. Демидов, К. Р. Седов // Экспериментальная и клиническая фармакология. 1994. - Т.133, № 1.-С. 39-43

21. Ковал ев, И.В. Диссертация на соискание ученой степени доктора мед. Наук «Механизмы регуляции оксидом азота электрической и сократительной функции гладких мышц» . 2002.

22. Колосова, М.В. Роль внутриклеточных сигнальных систем в регуляции Са2+-активируемых калиевых каналов эритроцитов /М.В. Колосова, И.Б. Соколова, В.В Новицкий., М.Б. Баскаков,

23. М.А. Медведев // Бюлл. эксперим. биологии и медицины. 1997. -Т.124, №. б.-С. 653 -655.

24. Костюк, П.Г. Кальций и клеточная возбудимость. М.: Наука, 1986.-254 с.

25. Кулинский В.И. Биологическая роль глутатиона / В.И. Кулинский, JI.C. Колесниченко // Успехи соврем, биологии. 1990. - Т.110, выпЛ.-С. 20-23.

26. Лакин Г.Ф. Биометрия / Г.Ф. Лакин М.: «Высшая школа». -1980.-291 с.

27. Логинов, А. С., Матюшин Б. Н. Цитотоксическое действие активных форм кисло рода и механизмы развития хронического процесса в печени при ее патологии // Пат. физиол. и экспер. терапия. 1996. - № 4. - С. 3-6.

28. Максимов, О.В. Особенности липидного состава эритроцитарных мембран у больных сахарным диабетом / О.В. Максимов, М.Н. Солун // Пробл. эндокринол. 1989. - Т.35, № 2. - С. 14-18.

29. Мамедов, М.Н. Тканевая инсулинорезистентность: степень выражения и взаимосвязь с факторами риска сердечнососудистых заболеваний / M. Н. Мамедов, А. М. Олферьев, А. Н.

30. Бритов и др. // Российский кардиологический журнал. 2000. - № 1.-С. 12-15.

31. Марков, X. М. О биорегуляторной системе L-аргинин-окись азота // Патологическая физиология и эксперим. Терапия. — 1996. № 1. -С. 34-39.

32. Маянский, А.Н., Маянский Д.Н. Очерки о нейтрофиле и макрофаге // Новосибирск. 1989.

33. Меерсон, Ф. 3. Феномен адаптивной стабилизации структур и защита сердца / Ф. 3. Меерсон, И. О. Малышев // М.: Наука. -1993.-218 с.

34. Никифоров, Е. А. Стауроспорин ингибирует рецептор-зависимую активацию Na/H-обмена / Е.А. Никифоров, Е.С. Трепанова, В. П. Зинченко // Биол. мембр. 1992. - Т. 9, № 10 -11. - С.28 -31.

35. Новицкий В.В. Физиология и патофизиология эритроцита / В.В.Новицкий, Н.В.Рязанцева, Е.А. Степовая // Томск: Изд-во Том. ун-та. 2004. - 202 с.

36. Новицкий, В. В. Гемопоэз, гормоны, эволюция / В.В. Новицкий, Ю.А. Козлов, B.C. Лаврова, Н.М. Шевцова // Новосибирск: Наука. 1997.-432с.

37. Орлов, С. Н. Са2+-активируемые калиевые каналы эритроцитов, исследованные методом регистрации Са2+-индуцированных изменений мембранного потенциала / С. Н. Орлов, И. В. Петрова, Н. И. Покудин и др. // Биол. мембраны. 1992. - Т. 9, № 9. - С. 885 -903.

38. Орлов, С. Н. Транспорт калия, анионов и активность Na+ -насоса мембраны эритроцитов: три различных механизма регуляции внутриклеточным кальцием / С. Н. Орлов, Н. И. Покудин, Ю. В. Котелевцев // Биохимия. 1987. - Т. 52. - С. 1373 - 1386.

39. Орлов, С. Н. Увеличенный Na+/H+-o6MeH в эритроцитах больных гипертонической болезнью / С.Н. Орлов, И.Ю. Постнов, Н.И.

40. Покудин и др. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 1988. - Т. 106, № 9. - С. 286-288.

41. Орлов, С.Н. (3- адренергические катехоламины активируют К+- насос эритроцитов карпа независимо от стимуляции №7ЬГ-обмена. / С.Н. Орлов, Г.А. Скрябин // Докл. АН СССР. 1991. - Т. 316, №4. -С. 997- 1000.

42. Орлов, С.Н. Рецептор- и обьем-зависимая регуляция Ыа+/К+-насоса и ионных переносчиков в эритроцитах рыбы / С.Н. Орлов, Г.А. Скрябин, Ю.В. Котелевцев и др // Биол. науки. 1990. - № 6. -С. 27-38.

43. Орлов, С.Н. Транспорт одновалентных катионов в эритроцитах человека и крысы: регуляция активаторами протеинкиназ и сжатием / С.Н. Орлов, Н.И. Покудин, Ю.В. Постнов // Кардиология. 1988. - Т. 28, №.3. - С. 91 - 96.

44. Осипов, А.Н., Борисенко Г.Г. Биологическая роль нитрозильных комплексов гемопротеинов // Успехи биологической химии. -2007. Т.47. - С.259 - 292.

45. Петренко, Ю.М. Новые источники окиси азота, их возможная физиологическая роль и значение / Ю. М. Петренко, Д. А. Шашурин, В. Ю. Титов // Экспериментальная и клиническая фармакология. 2001. - Т. 64, № 2. - С. 72 - 79.

46. Петрова, И.В. Роль внутриклеточных сигнальных систем в регуляции Са2+-активируемых калиевых каналов эритроцитов / И. В. Петрова, М.В, Колосова, И. Б. Соколова и др. // Бюлл. эксперим. биологии и медицины. 1997. - Т. 124, № 6. - С 653 -655.

47. Петруняка, В.В. Оценка роли эндогенных регуляторов в активации Са2+- АТФазы мембран эритроцитов /В.В. Петруняка, Е.П. Северина, С.Н. Орлов и др. // Биохимия. 1989. - Т. 54. - С. 974 - 979.

48. Плотников, Е.В. Изучение цитотоксической активности донора оксида азота З-нитро-4-фенилфуроксана на экспериментальноймодели клеток опухолевой линии HELA // Экспериментальная и клиническая фармакология. 2001. - Т. 54, № 2. - С. 68 - 79.

49. Поленов, М.А. Окись азота в регуляции функции желудочно-кишечного тракта // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. 1998. -№ 1. - С.53 - 61.

50. Постнов, Ю.В. Первичная гипертензия как патология клеточных мембран / Ю.В. Постнов, С.Н. Орлов // М.: Медицина. 1987. - С. 189.

51. Рекалов, В. В. Кальциевый ток и сокращение гладкомышечной клетки / В. В. Рекалов, В. В. Татаненко, М. Ф. Шуба // Докл. АН СССР. 1985. - Т. 281, № 2. - С. 462 - 466.

52. Реутов, В. П. Циклические превращения оксида азота в организме млекопитающих / В. П. Реутов, Е. Г. Сорокина, Н. С. Косицын, В. Е. Охотин. М: Наука. - 1998. - 156 с.

53. Реутов, В.П. Физиологическая роль цикла окиси азота в организме человека и животных / В. П. Реутов, JI. П. Каюшин, Е. Г. Сорокина // Физиология человека. 1994. - Т. 20, № 3. - С. 165 -174

54. Реутов, В.П. Физиологическое значение гуанилатциклазы и роль окиси азота и нитросоединений в регуляции активности этого фермента / В. П. Реутов, С. Н. Орлов // Физиология человека. -1993.-Т. 19, № 1.-С. 124- 137.

55. Реутов, В.П., Сорокина Е.Г. NO-синтазная и нитритредуктазная компоненты цикла оксида азота // Биохимия. 1998. -Т.63. -С.874-884.

56. Рябов, Ю. М. Роль N0 как регулятора клеточных процессов при формировании полиорганной недостаточности / Ю. М. Рябов, А. М. и д.р. / Анестезиология и реаниматология. 2001. - № 1. - С. 8- 13.

57. Северина, И.С. Роль растворимой гуанилатциклазы в механизмах ее физиологических эффектов // Вопросы мед.химии. 2002. -Т.48. - вып.1. - С.4-30.

58. Сейфулла, Р.Д. Проблемы фармакологии антиоксидантов / Р.Д. Сейфулла, И.Г. Борисова // Фармакология и токсикология. 1990.- №6. С. 3-10.

59. Солнцева, Е.И. Потенциалзависимый блок К+-тока задержанного выпрямления нитропруссидом и феррицианидом / Е.И. Солнцева, Ю.В. Буканова, В.Г. Скребицкий // Биологические мембраны. -2009. Т. 26, № 6. - С.486-492.

60. Сторожок, С.А. Молекулярная структура мембран эритроцитов и их механические свойства / С.А. Сторожок, А.Г. Санников, Ю.М. Захаров //Тюмень. 1997. - 140 с.

61. Теппермен, Дж., Теппермен X. Физиология обмена веществ и эндокринной системы. М.: Мир. - 1989. - 656 с.

62. Торчинский, Ю. М. Сульфгидрильные и дисульфидные группы белков / Ю. М. Торчинский М.: Наука. - 1971. - С. 290.

63. Фирсов, Н.И., Острейко К.К. Деформация эритроцитов в сдвиговом потоке // Патол. физиол. и эксперим. терапия. 1983. -№4.-С. 29-33.;

64. Черницкий, Е.А., Воробей А.В. Структура и функции эритроцитарных мембран. Минск: Наука и техника. 1981. - С. 214.

65. Чеснокова, Н.П., Афанасьева Г.А., Понукалина Е.В., Киричук

66. B.Ф. Липопероксидация и антиоксидантная система крови в динамике чумной и холерной интоксикации. // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. 2001. - №3. - С. 1718.

67. Шумаев, К.В. Взаимодействие динитрозолых комплексов железа с интермедиаторами окислительного стресса// К.В Шумаев, А.А. Губкин, С.А. Губкина и др. / Биофизика. 2006. - Т.51.вып.З.,1. C.472-477.

68. Яковенко, И.Н., Жирнов В.В. Ферментативно-опосредованный механизм No-донорской активности нитропруссида натрия в аорте крысы // Укр. биохим.журн. 2005. - Т.77, №6. - С.101-104.

69. Adragna, N.C. K-CL cotrsncportit vascular smooth muscle and erythrocytes:possible implication in vasodilation/ N.C. Adragna, R.E. White, S.N. Orlov, P.K. Lauf//Am J Physiol Cell Physiol. 2000. - V. 278 (2).-P. 381 -390.

70. Adragna, N.C., Lauf, P.K. Role of nitrite, a nitric oxide derivative, in K-Cl-cotransport activation af low-potassium sheep red blood cells. //J. Membr. Boil. 1998. - P. 166. - C. 157-167.

71. Ahmmed, G.U. Nitric oxide modulates cardias Na+ channel via protein kinase A and protein kinase C / G.U. Ahmmed, Y. Xu, P. Hong Dong et. al. // Circ Res. 2001. -№.98. - C. 1005-1013.

72. A1 Z., Cohen C.M. Phorbol 12-myristate 13-acetate-stimulated phosphorilation of erythrocyte membrane skeletal proteins in blocked by calpain inhibitors: possible role of protein kinase M. // Biochem. J.- 1993. V. 296 (Pt. 3). - P. 675 - 683

73. Alvarez, J. Effect of electron donors on Ca2+- dependent K+- transport in one step inside - out vesicles from human erythrocyte membrane / J. Alvarez, J. Garcia - Sancho, B. Herreros // Biochim. et biophys. acta.- 1984.-Vol. 771.-P. 23 -27.

74. Alvarez, J. High affinity inhibition of Ca2+- dependent K+- channels by cytochrome P 450 inhibitors. // Montero M., Garcia - Sancho J. J. Biol. Chem. - 1992. - V. 267, № 17. - P. 11789 - 11793.

75. Anderson, E. A. Hyperinsulinemia produces both sympathetic neural activation and vasodilatation in normal humans / E.A. Anderson; R.P. Hoffmann, T.W. Balon et. al. // J. Clin. Invest. 1991. - Vol. 87.' - P. 2246-2252.

76. Barlow, R.S. Hydrogen peroxide relaxes porcine coronary arteries by stimulating BKCa channel activity / R.S. Barlow, R.E. White // Am J Physiol. 2006. - №.75. - P. 1283-1289

77. Barvitenko, N.N. Erythrocyte signal transduction pathways, their oxygenation dependence and functional significance / N.N. Barvitenko, N.C. Adragna , R. E. Weber // Cell Physiol Biochem. -2005. -№.15. C. 1-18

78. Bates, J. N., Baker M. T.Nitric oxide generation from nitroprusside by vascular tissue. Evidence that reduction of the nitroprusside anion and cyanide loss are required // Biochem. Pharmacol. 1991. - № 42. -P.157-165

79. Battinella, E. Induction of platelet formation from megakaryocytion ceiis by nitric oxide / E. Battinella, S. R.Willoghby, T. Foxall et. al. // Proc. Natl. Acad.Sci. USA . 2001. - №.89. - C. 458-463.

80. Baynes, J.W. Role of oxidative stress in development of complications in diabetes.// Diabetes. 1991. №.40(4). - C.405-412.

81. Begenesich, T. Physiological roles of the intermediate conductance, Ca~ -activated potassium channel Kcnn4/ T. Begenesich, T. Nakamoto, C.T. Ovitt, K. Nehrke , C. Brugnara, S.L. Alper, J.E. Melvin // J Biol Chem.- 2004.-№ 12.-P. 681-6887.

82. Bennett, V. The membrane skeleton of human erythrocytes and its implications for more complex cells // Annu. Rev. Biochem. 1985. -Vol. 54. - P.273-304.

83. Bessis, M., Mohandas N. A diffractometric method for the measurement of cellular deformability // Blood Cells. 1975. - Vol. 100.-P. 307-313.

84. Bessis, M., Mohandas N., Feo S. Automated ektacytometry: a new method of measuring red cell deformability and red cell indices // Blood Cells. 1980. - Vol. 6. - P. 315-327.

85. Bogdanova, A. Oxygen-dependent ion transport in erythrocytes / A. Bogdanova, M. Berenbrink, M. Nikinmaa // Am Physiol. 2009. - P. 305-319

86. Bor-Kucukatay, M. Effects of nitric oxide on red blood cell deformability / M. Bor-Kucukatay, B. Rosalinda, et al. // Amer. J. Physiol. 2005. - V.284. - P. 1577-1584.

87. Bourikas, D. Modulation of the Na+-H+ antiport activity by adrenaline on erythrocytes from normal and obese individuals / D. Bourikas, M. Kaloyianni, M. Bougoulia et al. // Mol. Cell. Endocrinol. 2003. - Vol. 205 (1-2). - P. 141-150.

88. Bromme, H.J. and Holz J. Apoptosis in the heart: when and why? // Mol. Cell Biochem. 1996. - №. 163. - P. 261-275.

89. Brown, G.C., Cooper, C.E. Nanomolar concentrations of nitric oxide reversibly inhibit synaptosomal respiration by competing with oxygen at cytochrome oxidase // FEBS Lett. 1994. - Vol.356. -P.295-298.

90. Brugnara, C. Ca~ -activated K transport in erythrocytes: comparison of binding and transport inhibition by scorpion toxins / C. Brugnara, L. de Franceschi, S.L. Alper // J. Biol. Chem. 1993. - Vol. 268, № 12.-P. 8760-8768.

91. Bryk, R. Pharmacological modulation of nitric oxide synthesis by mechanism based inactivators and related inhibitors / R. Bryk, D. J. Wolff// Pharmacol. Ther. - 1999. - Vol. 84. - P. 157 - 178.

92. Burke-Wolin, T.M. Hydrogen peroxide-induced pulmonary vasodilation: role of guanosine 3,5- cyclic monophosphate / TM.

93. Burke-Wolin, CJ. Abate, MS. Wolin, GH. Gurtner // Am J Physiol. -1991.-№5.-P. 393-398.

94. Butler, A.R. Diffusion of nitric oxide and scavenging by blood in the vasculature. / A.R. Butler, I.L. Megson, P.G. Wright // Biochim. Biophys. Acta. 1998. - Vol. 425. - P. 168-176.

95. Candeias, L.P. Formation of hydroxyl radicals on reaction of hypochlorous acid with ferrocyanide, a model iron (II) complex / L.P. Candeias, M.R.L. Stratford, P. Wardman // Free Radical Res. 1994. -Vol. 20.-P. 241-249.

96. Canessa, M. Erythrocyte sodium-lithium countertransport: another linkbetween essential hypertension and diabetes // Curr. Opin. Nephrol. Hypertens.- 1994.-Vol. 3,№5.-P. 511-517.

97. Capaldo, B. Abnormal Vascular Reactivity in Growth Hormone Deficiency / B. Capaldo, V.Guardasole, F. Pardo // Circulation. 2001. -V. 103. - P.520-524.

98. Chen, L.Y., Mehta J.L. Evidence for the presence of L-arginine-nitric oxide pathway in human red blood cells: relevance in the effects of red blood cells on platelet function. // J Cardiovasc Pharmacol. -199.-№. 32(1). C.57-61.

99. Claiborne, A. Protein-sulfenic acids: diverse roles for an unlikely player in enzyme catalysis and redox regulation // A. Claiborne, J. I. Yeh, T. C. Mallett et al. // Biochem. 1999. - Vol. 38. - P. 1540715416.

100. Cooke, J.P., Dzau V.J. Nitric oxide synthase: role in the genesis of vascular disease // Ann. Rev. Med. 1997. - Vol. 48. - P. 489-509.

101. Das D.K., Maulik N. Evaluation of antioxidant effectiveness in ischemia reperfusion tissue injury // Methods Enzymol. 1994. -V. 233.-P. 601-610.

102. De Vriese, A.S. Endothelial dysfunction in diabetes / A.S De Vriese, T.J. Verbeuren, J.V. De Voorde et al. // J. Pharmacol. 2000. - Vol. 130.-P. 963 -974.

103. Del Carlo, B. Modulation of Ca2+-activated K+- channels of human erythrocytes by endogenous protein kinase C / B. Del Carlo, M. Pellegrini, M. Pellegrino // Biochim. Biophys. Acta. 2003. - V. 1612. - C.107-116.

104. Dodson, R.A. Effects of calcium and A23187 on deformability and volume of human red blood cells. / R.A Dodson , T.R. Hinds , F.F. Vincenzi // Blood Cells. 1987. - №.12(3). - C. 555-564.

105. Drewett, J.G., Garbers D.L. The family of guanylyl cyclase receptors and their ligands. // Endocr Rev. 1994. - №.15(2). - C. 135-162.

106. Droge W. Free radicals in the physiological control of cell function // Physiol. Rev. 2002. - Vol. 82, № 1. - P. 47-95.

107. Elmoselhi, A.B. Free radicals uncouple the sodium pump in pig artery/ A.B. Elmoselhi, A. Butcher, S.E Samson et al. /Amer. J. Physiol. 1994. - Vol.266. - P.720-728

108. Espey, M.G. A Chemical perspective on the inter-play between N , reactive oxygen species and reactive nitrogen specios / M.G. Espey,

109. K.M. Miranda, D.D. Tomas et. al. 11 Ann NY Acad Sie. 2002. - Vol. 962.-P. 194-206.

110. Evans, E., Mohandas N. Developments in red cell rheology at the institut de pathologie cellulaire // Blood Cells. 1986. - Vol. 12. - P. 43-45.

111. Feelisch, M. The use of nitric oxide donors in pharmacological studies // Naunyn — Schwiedebergs Arch. Pharmacol. 1998. - Vol. 358.-P. 113 - 122.

112. Foller, M. Eruthrocyte programmed cell death / M. Foller, S.M. Yuber, F. Lang // Depatment of Physiology, University of Tubingen. -2008. -№ . 60. P. 661-668.

113. Freedman, J. C. Membrane potential and cytotoxic Ca2+ cascade of human red blood cell / J. C. Freedman, E. M. Bifano, L. M. Crespo et. al. // Physiol. Blood. 1988. - №. 43. - P. 217-31.

114. Fujimori, H., Hou, H. Augmentation of Cellular Adenosine Triphosphate Levels in PC 12 Cells by Extracellular Adenosine // Brain. Res. 1991.-Vol. 554. - P.355-357.

115. Gao, Y.J. Vascular relaxation response to hydrogen peroxide is impaired in hypertension / Y.J. Gao, Y. Zhang, S. Hirota, L.J. Janssen, R.M. Lee // Br J Pharmacol. 2004. - № 2. - P. 143-149

116. Gorren, A., Mayer B. The versatil and complex enzymology of nitric oxide synthase // Biochemestry (Moscow). 1997. - V.63, № 7. - P.745-755.

117. Goyal, R. Evidence for NO redox form of nitric oxide as nitrergic inhibitory neurotransmitter in gut // Am. J. Physiol. 1998. - V. 275. -P.1185 - 1192.

118. Grover, A.K., Samson S.E. Effect of superoxide radical on Ca2+ pumps of coronary artery// Am. J. Physiol. 1988. - Vol. 255. -P.297-303

119. Grygorczylc, R. Ca2+- activated K+-permeability in human erythrocytes. Modulation of single channels events / R. Grygorczylc, W. Schwarz // Eur. Biophys. J. - 1985. - Vol. 12. - P. 57 - 65.

120. Guggino, S.E. Forscolin and antidiuretic hormone stimulate a Ca -activated K+-channel in cultured kidney cells / S.E. Guggino, B.A. Suares Isla, W.B. Guggino, B. Sactor // Amer. J. Physiol. - 1985. -V. 249.-P. 448 -455.

121. Gutterman, N.N. Redox modulation of vascular tone: focus of potassium channel mechanisms of dilation / N.N.Gutterman, H. Miura, Y. Liu // Arterioscler. Thromd. Vase. Biol. 2005. - №25(4). - C.671-678.

122. Halliwell, B. Free Radicals in Biology and Medicine / B. Halliwell, J. M.C.Gutteridge. Oxford: Clarendon Press. - 1985.

123. Halperin, J. A. Ca activated K efflux limits complement -mediated lysis of human erythrocytes / J. A. Halperin, C. Brugnara, A. Nicholson - Weller // J. Clin. Invest. - 1989. - Vol. 83. - P. 1466 -1471.

124. Hampl, V., Herget J. Role of nitric oxide in the pathogenesis of chronic pulmonary hypertension // Physiol. Rev. 2000. - Vol. 80. -P.1337 - 1372.

125. Hirayama, K. Effect of oxidative stress on interorgan metabolism of glutatione / K. Hirayama, A. Yasutalce, M. Inoue // Medical, Biochemical and Chemical Aspects of Free Radical. Amsterdam: Elsevier. - 1989. - P. 559-562

126. Hobbs, A. J. Inhibition of nitric oxide synthase as a potential therapeutic target / A.J. Hobbs, A. Higgs, S. Moncada // An. R.ev. Pharmacol. Toxicol. 1999. - № 39. - P. 191 - 220.

127. Huang, Y. Biologic activity of hydroxylamine / Y. Huang // Eur. J. Pharm. 1998. -Vol. 349. - P. 53 - 60

128. Ignarro, L. J., Nitric oxide donors and cardiovascular agents modulating the bioactivity of nitric oxide / L. J. Ignarro, C. Napoli, J. Loscalzo // Ibid. 2002. - Vol. 90. - №1. - P. 21-28

129. Ignarro, L. Nitric oxide as a signaling molecule in the vascular system: an overview/ L Ignarro, G. Cirino, A. Casini, C. Napoli // J. Cardiovasc. Pharmacol. 2002. - Vol. 34. - № 6. - P. 879 - 886.

130. Ishida, A. Tumor suppressor p53 but not cGMP mediates NO-induced expression of p21(Wafl/Cipl/Sdil) in vascular smooth muscle cells / A. Ishida, T. Sasaguri, Y. Miwa et all. // Mol. Pharmacol. -1999. Vol. 56. - № 5. - P. 938 - 946.

131. Ishii, T.M. A human intermediate conductance calcium-activated potassium channel / T.M. Ishii, C. Silvia, B. Hirschberg, C.T. Bond, J.P. Adelman // Maylie, J Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. -Vol.651.-C. 94

132. Janssen, L. Regulation of Ca2+.i in canine airway smooth muscle by Ca2+-ATPase and Na+/Ca2+ exchange mechanisms / L. Janssen, D .Walters, J. Wattie // Am. J. Physiol. 1997. - Vol. 373, № 2. - P. 322 - 330.

133. Jones, A.R. Enzymic mechanisms of superoxide production // Biochim. et biophys. Acta. 1991. - Vol. 1057. - P.281-298

134. Keim, M., and Schräder, J. Control of coronary vascular tone by nitric oxide. // Circ. Res. 1990. - №. 66. - P. 1561-1575.

135. Kennett, E., Philip, W. Redox Reactions and Electron Transfer Across the Red Cell Membrane Eleanor Kuchell // UBMBLife. 2003. -№. 55(7).-P 375-385.

136. Kennett, C., Ruchel P.W. Plasma membrane oxidoreducteses: effect on erythrocyte metabolism and redox homeostasis // Antioxid Redox Signal. 2006. - №.8(7). - P. 1241-1247.

137. Kleinbongard, P. Red blood cells express a functional endothelial nitric oxide synthase/ Kleinbongard P., Schulz R., Rassaf T. et. al. // Clin. Lab. Haem. 2006. - Vol. 107. - P. 2943-2951.

138. Kozlov, A.V., Staniek K. Nitrite reductase activity is a novel function of mitochondria // FEBS Letters. 1999. - Vol.454. -P. 127130.

139. Kucherenko, Y. Effect of Peroxynitrite on Passive K+ transport in human red blood cells / Y. Kucherenko, J. Browning, A. Tattersall, E. Clive // Cell. Physiol. Biochem. 2005. - №15(6). - C. 271 - 280.

140. Lackington, I. Inhibition of calcium-activated potassium conductance of human erythrocytes by calmodulin inhibitory drugs / I. Lackington, F. Orrego // FEBS Lett. 1981. - Vol. 133. - P. 103-106.

141. Lancaster, J.R. Nitric oxide: Biology and chemistry / J.R. Lancaster, J.B. Hibbs // Lancet. 1990. - № 335. - C. 669-671.

142. Lang, F. Erythrocyte ion channels in regulation of apoptosis / F. Lang, C. Birlca, S. Myssina,K.S. Lang, P.A. Lang, V. Tanneur, C. Duranton,T. Wieder // Huber SM. Adv Exp Med Biol. 2004. - Vol. 559. - P. 211-217.

143. Lang, F. Mechanisms and significance of eryptosis / K.S. Lang, P.A. Lang, S.M. Huber, T. Wieder // Antioxid Redox Signal. 2006. -№8(8).-C. 1183-92.

144. Larsson, R. Translocation and Enhancement of Phosphotransferase Activity of Protein Kinase C following Exposurein Mouse Epidermal Cells to Oxidants / R. Larsson, P. Cerutti // Cancer research 1989. -V. 49. - P. 5627-5632.

145. Lau, K. Skeletal muscle contractions stimulate cGMP formation and attenuate vascular smooth muscle myosin phosphorylation via nitric oxide / K. Lau, R. Grange, W. Chang., et all. // FEBS Lett. 1998. -V. 431.-№ l.-P. 71 -74.

146. Leavesley, H.B. Interaction of cyanide and nitric oxide with cytochrome c oxidase: implications for acute cyanide toxicity./ H.B. Leavesley, L. Li, K. Prabhalcaran, J.L. Borowitz, G.E. Isom // Toxicol Sci. -2008. -№. 101(1).-C. 101-111.

147. Lefer, A.M. Endothelial dysfunction in myocardial ischemia and reperfusion: role of oxygen-derived radicals / A.M. Lefer, D.J. Lefer // Basic Res. Cardiol. 1991. - Vol. 86.-P. 109-116

148. Leinders, T. Distinct metal ion binding sites on Ca2+-activated K+-channels in inside-out patches of human erythrocytes / T. Leinders, R. G van Kleef, H. P. Vijverberg // Biochim. et biophys. acta. 1992. -Vol. 1112.-P. 75-82.

149. Lew, V. L. Effect of intracellular calcium on potassium permeability of human red cells // J. Physiol. (London). 1970. - Vol. 206. - P. 35 -36.

150. Lew, V. L. On the ATP dependence of the Ca2+- induced increase in K permeability observed in human red cells // Biochim. et biophys. acta. - 1971. - Vol. 233. - P. 827 - 830.

151. Li, H., Forstermann U. Nitric oxide in the pathogenesis of vascular disease // J. Pathol. -2000. Vol 190. - P. 244-254.

152. Low, P. S. Specific cation modulation of anion transport across the human erythrocyte membrane // Biochim. et biophys. acta. 1979. -Vol. 514.-P. 264-274.

153. Low, P. S. The role of hemoglobin denaturation and band 3 clustering in red blood cell aging / P. S. Low, S. M. Waugh, K. Zince // Science. 1985. - Vol. 227. - P. 531 - ,533.

154. Luscher, T.F. The endothelium: modulator of cardiovascular function / T.F. Luscher, G. Noll, P.M. Vanhoutte // J. Hypertens. -1996.-Vol. 14 (5).-P. 383-393.

155. Lyons, T.J. Role of glycation in modification of lens crystallins in diabetic and nondiabetic senile cataracts. / T.J. Lyons, G. Silvestri, J.A. Dunn, D.G. Dyer, J.W. Baynes // Diabetes. 1991. - №. 40(8). - C. 1010-1015.

156. Marques, F., Bicho, M. P. Activation of a NADHdehydrogenase in the human erythrocyte by beta-adrenergic agonists :possible involvement of a G protein in enzyme activation. // Biol. Signalsô. -1997. №.6.-C. 52-61

157. Matteucci, E., Giampietro O. Electron Pathways through Erythrocyte Plasma Membrane in Human Physiology and Pathology: Potential Redox Biomarker? // Biomark Insights. 2007. - № 17(2).1. C.321-329.

158. May, J.M., Qu Z.C. Reduction and uptake of methylene blue by human erythrocytes.// Am J Physiol Cell Physiol. 2004. - №. 286(6). -C. 1390-1398.

159. May, Z.M. Nitrite uptake and metabolism and stress in human erythrocytes / Z.M. May, Z.C. Qo, et. al. // Am J Phusiol CellPhysiol. -2000. Vol. 279. - P. 1946-1964.

160. McMillan, D.E., Reduced erythrocyte deformability in diabetes /

161. D.E. McMillan , N.G. Utterback., J. La Puma // Diabetes. 1978. -Vol. 27(9).-P. 895-901.

162. Miossec, P. Effect of pravastatin on erythrocyte rheological and biochemical properties in poorly controlled Type 2 diabetic patients./ F. Zkhiri, J. Pariés, M. David-Dufilho, M.A. Devynck, P.E. Valensi. // Diabet Med. 1999. - № 5. - P. 424 -430.

163. Mohazzab-H, K.M., Potential role of a membrane-bound NADH oxidoreductase in nitric oxide release and arterial relaxation to nitroprusside. / K.M. Mohazzab-H, P.M. Kaminski, R. Agarwal, M.S. Wolin // Circ Res. 1999. - №.84(2). - C. 220-228.

164. Negresalvayre, A.A delayed and sustained rise of cytosolic calcium is elicited by oxidized by LDL in cultured bovine aortic endothelial cells / A. Negresalvayre, G. Fitousssi, V. Reaud et. al. // FEBS Lett. -1992.-Vol. 299.-P. 60-65.

165. Nicolay, J.P., Inhibition of suicidal erythrocyte death by nitric oxide. / J.P. Nicolay, G. Liebig, O.M. Niemoeller, S. Koka, M. Ghashghaeinia, T. Wieder, J. Haendeler, R. Busse, F. Lang // Pflugers Arch. 2008. - №. 456(2). - C. 293-305.

166. Ohta, K. Oxidation of Hydroxylamine / K. Ohta, G. Rosner, R. Graf // Neuroreport. 1997. - Vol. 8. - P. 2229 - 2235.

167. Oliveira, S. Modulation of erythrocyte deformability by PKC activity / S.Oliveira, A.S.Silva-Herdade, C. Saldanha // Clim. Hemorheol.Microcirc. 2008. - №. 39(1-4). - C.363-373

168. Palek, J. Polymeresation of red cell membrane protein contributes to spheroechinocyte shape irreversibility / J. Palek V. Ohanian, W. Gratzer // Nature. 1978. - Vol. 274. - P. 505 - 507.

169. Pasch, T., Nitroprusside-induced formation of cyanide and its detoxication with thiosulfate during deliberate hypotension. / T. Pasch, V. Schulz, G. Hoppelshauser // J Cardiovasc Pharmacol. 1983. -№.5(1).-C. 77-85.

170. Pellegrino, M., Pellegrini M. Modulation of Ca2+-activated K+ channels of human erythrocytes by endogenous cAMP-dependent protein kinase.// Pflugers Arch. 1998. - №.436(5). -C.749-756.

171. Petrov, V. Protein kinase C induced changes in erythrocyte Na+/H+ exchange and cytosolic free calcium in humans. / V. Petrov, P. Lijnen,

172. D. Echevaria-Vazquez, R. Fadard / Am. J. Hypertens. 1998. - V. 11(1 Pt 1).-P. 81-87.

173. Pinilla, L. Nitric oxode stimulates growth hormone secretion in vitro through a calcium and cyclic guanosine monophosphate-independent mechanism / L. Pinilla, M. Tema-Sempere, E. Aguilar // Horm. 1999. -№. 51. - C.242-247.

174. Pryor, W.A. Oxy-radicals and related species: their formation, lifetimes, and reactions // Ann. Revs. Physiol. 1986. - Vol. 48. -P.657-667

175. Reiter, C. D. Cell-free hemoglobin limits nitric oxide biavailability in sickle-cell disease / C. D. Reiter, X. Wang, J. E. Tanus-Santos // Cell. Mol. Biol. Lett. -2003. № 8. - P. 455 -460.

176. Romero, J. R. Arginine supplementation of sickle transgenic mice reduces red cell density and Gardos channel activity / Romero, J: R., Suzuka S.M, Nagel R.L., Fabry M.E.// Blood. 2002. - № 8. - P. 1103-1108

177. Romero, P.J. Metabolic control on the K+ channel of human red cells / P. J. Romero, C. E. Ortiz, C Melitto // J. Membrane Biol. 1990. -V.116.-P. 19-29.

178. Savineau, J-P. Cytosolic calcium oscillations in smooth muscle cells / J-P. Savineau, R. Marthan // News Physiol. Sci. 2000. -№2. - P. 50 -55.

179. Schroder, R.L. J Pharmacol Exp Ther. Activation of the human, intermediate-conductance, Ca2+-activated K+ channel bymethylxanthines / R.L. Schroder, B.S. Jensen, D. Strabaek, S.P. Olesen // Pflugers Arch. 2000. - №. 440(6). - P. 809-818.

180. Shen, B. W. Ultrastructure of the intact skeleton of the human erythrocyte membrane / B. W. Shen, R. Josephs, T. L. Steele // J. Cell Biol. 1986. - Vol. 1020. - P. 997 - 1006.

181. Shieh, C.C. Potassium channels: molecular defects, diseases, and therapeutic opportunities / C.-C. Shieh, M. Coghlan, J. P. Sullivan, M. Gopalakrishnan // Pharmacol. Rev. 2000. - Vol. 52, № 4. - P.557-593.

182. Sitozhevsky, A.V. Kinetics of tert-butyl hydroperoxide decomposition in erythrocyte suspension / A.V. Sitozhevsky, I.V. Havalkin, V.V. Ivanov, I.V. Kondakova // Membr Cell Biol. 1997. -№. 11(4). - C. 487-95

183. Sohal, R.S., Svensson I., Sohal B.H. Brunk U.T. Superoxide anion radikal production in different animal species // Med. Ageing and Develop. 1989. - №. 49. - P. 129-135.

184. Soto, M.A Ca2+"activated K+ channel inhibition by reactive oxygen species / M.A. Soto, C. González, E. Lissi et. al. // Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 2002. - Vol. 282. - P. C461-C471.

185. Stockand, J.D., Sansom S.C., Activation by methylene blue of large Ca(2+)-activated K+ channels//Biochim Biophys Acta. 1996. - Vol. 1285.-P. 123-126.

186. Stolcand, J.D., Sanson, S.C.Activation by methylene blue of large Ca(2+)-activated K+ channels // Biochem. Biophys. Acta. 1996. - Vol. 1285 (2).-P. 123- 126.

187. Suh, Y-A. Cell transformation by the superoxide-generating oxidase Moxl / Y-A. Suh, R.S. Arnold, B. Lassegue, J. Shi, X. Xu // Nature. -1999.-Vol. 401.-P. 79-82.

188. Suhr, F., Intensive exercise induces changes of endothelial nitric oxide synthase pattern in human erythrocytes / F. Suhr, S Porten., T. Hertrich, K. Brixius // Exp. Biol. Med. 2009. -№ 20(2). - P. 95-103.

189. Suttorp, N. Antioxidant defense mechanisms of endothelial cells: glutathione redox cycle versus catalase / N. Suttorp, W. Toepfer, L. Roka // Am J. Physiol. 1986. - № 251. - P.671-680.

190. Symeonidis, A. Impairment of erythrocyte viscoelasticity is correlated with levels of glycosylated haemoglobin in diabetic patients / A. Symeonidis, G. Athanassiou, A. Psiroyannis et. al. // Clin. Lab. Haem. -2001.-Vol. 23.-P. 103-109.

191. Symeonidis, A. Impairment of erythrocyte viscoelasticity is correlated with levels of glycosylated haemoglobin in diabetic patients / A. Symeonidis, G. Athanassiou, A. Psiroyannis et. al. // Clin. Lab. Haem.-2001.-Vol. 23.-P. 103-109.

192. Takahashi, R., Luminol chemiluminescence and active oxygen generation by activated neutrophils. / R.Takahashi, K. Edashige, E.F. Sato, M. Inoue, T. Matsuno, K. Utsumi //Arch Biochem Biophys. -1991. №. 285(2). - C.325-330.

193. Taylor, B. Inducible nitric ode synthase in the liver: regulation and function / B. Taylor, L. Alarcorn, T. Billiar // Biochemestry (Moscow). 1997.-№ 7.-P. 765-80

194. Tharpl, D.L., Bowles 1 D.K. The Intermediate-Conductance Ca2+-Activated K+ Channel (KCa3.1) in Vascular Disease / Cardiovascular Hematological Agents in Medicinal Chemistry. 2009. - №. 7. - C.l-11.

195. Tsai, K.H., Differences in mechanical response between fractured and non-fractured spines under high-speed impact. / K.H. Tsai, G.L. Chang, R.M. Lin // Clin Biomech . -1997. №. 12(7). -C.445-451.

196. Udupi, V., Rice-Evans C. Thiol compounds as protective agents in erythrocyte under oxidative stress // Free Radical Res. Commun. -1992.-Vol. 16.-P. 315-623.

197. Ursini, F. Diversity of glutathione peroxidases / F. Ursini, M. Maiorino, R. Brigelius-Flohe', K.D. Aumann, A. Roveri // Methods Enzymol. 1995. -Vol. 252. - P. 38-53.

198. Vestergaard Bogind, B. Spontaneous inactivation of the Ca~-fsensitive K channels of human red cells at high intracellular Ca~ activity / B. Vestergaard Bogind // Biochim. et biophys. acta. - 1883. -Vol. 730.-P. 285 -294.

199. Wedel, A. Enzymes acting against reactive oxygen // Enzymes: Tools and Targets.-Basel: Rarger. 1988. - P. 161 - 167.

200. Weiger, T. M. Modulation of calcium-activated potassium channels / T. M. Weiger, A. Hermann, I. B. Levitan // J. Comp. Physiol. A. Neuroethol. Sens. Neural. Behav. Physiol. 2002. - Vol. 188, № 2. -P. 79-87

201. Werlcstrom, V. Inhibitory innervation of the guinea-pig urethra; roles of CO, NO and VIP / V. Werlcstrom, P. Aim, K. Persson, K. Andersson // J. Auton. Nerv. Syst. 1998. - V. 74, № 1. - P. 33 - 42.

202. Wink, D.A. Cytotoxicity related to oxidative and nitrosative stress by nitric oxide / D.A. Wink, K.M. Miranda, M.G. Espsy // Exp. Biol. Med. 2001. - Vol. 226. - P. 621-623.

203. Yong, R.I. Inhibition of inducible nitric oxide synthase by acetamidine derivatives of hetero-sabstituted lysine and homolysine / R. I. Yong, R. M. Beams // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2000. - Vol. 10.-P. 597-600.

204. Zhang, G. Cystein oxidation and rundown of large conductance Ca2+-dependent K+ channels / G. Zhang, R. Xu, S. H. Heinemann, T. Hoshi // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2006. - Vol. 342 (4). - P. 1389- 1395.

205. Zhao, X.J., Sampath, V. On the Mechanism of Inhibition of Cytochrome c Oxidase by Nitric Oxide // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1994. - Vol. 204. - P. 537-543.

Информация о работе

Трубачева, Оксана Александровна
кандидата медицинских наук
Томск, 2011
ВАК 03.03.01

Диссертация

Роль активных форм кислорода в регуляции Са2+-активируемой калиевой проницаемости эритроцитов человека - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы