Ферменты анаэробного окисления - восстановления в протонных циклах бактериальных мембран

Баграмян, Каринэ Альбертовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Ферменты анаэробного окисления - восстановления в протонных циклах бактериальных мембран
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Ферменты анаэробного окисления - восстановления в протонных циклах бактериальных мембран"

« 4Р0-ПЬ0-51П/ ЬЧ №5ПМЭ-6ИЪ ЪШииРЦРПЫЭ-ЗЛКЬ

ърьчиъь «ЛЬБи^иЪ <шшииириъ

ЩРКьЬ ШРЬРЭЬ риариизиъ

иъиьрпр о.вдьчл15ит,-чьричиъ<уь1лгъ ЬЬРЦЪЪЗЪЬРС РЦкБЬРЬиЪЬРЬ (Э-иПД'ЬГЭ-ЪЬРЬ ^РПБПЪиЗЬЪ вь^и?рпкг

О-.ООШ-ЦЬОишф^цЭДш ¿шиГииц^ш.ир^йр 1}ЬГшшрш0ш1}ш0 ц1илп1р_|П100Ьр}1 гр^тщф qlllnшllшQ шиш^бшП)! Ииудгёшй штЬСифапипвдшО

иьяитгФ

ЬРЬЧиЪ - 2004

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РА ЕРЕВАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

БЛГРАМЯН КАРИНЭ АЛЬБЕРТОВНА

ФЕРМЕНТЫ АНАЭРОБНОГО ОКИСЛЕНИЯ -ВОССТАНОВЛЕНИЯ В ПРОТОННЫХ ЦИКЛАХ БАКТЕРИАЛЬНЫХ МЕМБРАН

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степеки доктора биологических наук по специальности 03.00.02. - Биофизика

ЕРЕВАН-2004

fBbüiuG ИшишшшЦшб t bpluuüh U|bmuil|ujG huidui|UUiptuGnLü

Q-[immlimG tunphprpuinm'

(Т1ш2шпОш1]шО рйгрфйифтиОйр'

Unuiguimuip ljmqi5ml]hjiujnLpjniQ

llbGutupuiGuiljuiG qJiwinpjniGGhp[i ipil)uinp, щрпфЬипр U.<. 0"n£niGjuiG

1}Ьйишршйш1|шО qfiinrupjruGGbpfi ryilpnnp, щрпфЬипр <УЬ. Оитрп4иЩ1

ljhGuuipujGujl}iuG qJimmpjniGübp}i rpilimnp Ö.IT. U4uiqjuiQ

<iujuiuiniuQ}i Q-UU ШцЬ^тцифй llhGuuipiuGmpjuiG JiGuinlnnnim

.ф iqbmiubuiQ hun5uiiuuipujGni.i5 qnpönn Ö51 ЦшйОшц^тшдЦшй Junphprili "Gjiumntü (375Ö49, bpLuiG, b"K, U)hp UiuGnüjjuiG ф. 1, Ь"1<,

UigbGiufunijmp^iuQ uju^mujujGmpjmGp шЬгф limGbGiu 2004 jp. hmGfiuJi 17-fiG, duiiJp

[ипрИргф Gfiumi UbGuuipiuGnipjujG фшЦтрлЬт):

UmhGmtununipjwGp ЦшрЬф t öuiGnpiuGuii bpLuiG[i ujhmiuliiuG 1иш5ил|ишршО}1 qpuirpupiuGnitf:

Uhi\tfiuqfipG umuipijui& t tfuijtiuti 14 - JiG 2004p.

051 U!uuGiuqluniugi|ui& Junphprili qjiinuiliuiG piupuiinquip, rpighGui'

Тема диссертации утверждена в Ереванском государственном университете

U.U. OnGjiuG

Научный консультант: Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор биологических наук, профессор Трчунян A.A.

академик HAH Армении, доктор биологических наук, Африкян Э.Г.

доктор биологических наук, профессор Островский Д.Н.

доктор биологических наук Авакян Ц.М.

Институт Молекулярной биологии HAH Армении

Защита диссертации состоится 17 июня 2004 г. в 1400 часов на заседании Специализированного совета 051 при Ереванском государственном университете (375049, Ереван, ул. Алека Манукяна 1, ЕГУ, биологический факультет).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ереванского государственного университета.

Автореферат разослан 14 мая 2004 г.

Ученый секретарь Специализированного совета 051, доцент

($С<Ш4

Гонян С.А.

общая Характеристика работы

Актуальность проблемы.. Изучение структуры биологических мембран и принципов их функционирования на молекулярном уровне с помощью современных физико-химических методов и биофизических приемов продолжает занимать ведущее место в проблемах биофизики.

С одной стороны это связано с тем, что биологические мембраны обеспечивают интеграцию метаболизма в клетке, поддерживая ионный, энергетический и другие виды гомеостаза. С другой стороны, они сами непосредственно участвуют в протекании ряда важнейших процессов в клетке, ключевыми из которых являются транспортные и энергозапасающие, и осуществление которых, в принципе, невозможно без создания пространственно ориентированных целостных структур, функционирующих как мулътибелковые ансамбле.

Почти все формы жизни запасают энергию в процессе дыхания, предполагающего спонтанный, термодинамически благоприятный перенос электронов от подходящего донора через комплекс мембранпо-спязанных редокс-белков, ферментов и электронных переносчиков на подходящий акцептор. Векторный перенос протонов через мембрану приводит к запасанию энергии в форме протондвижущей силы с участием АТФсинтетазы, утилизирующей эту энергию для сопряжения обратного переноса протонов через мембрану для синтеза АТФ из АДФ и Ф|г (Mitchell, 1961). Обязательным условием для нормального протекания процесса является, согласно хемиосмотической теории Митчелла (Mitchell, 1968), наличие целостной неповрежденной мембраны.

Высшие формы жизни обычно используют НАДН, образуемый в результате окисления глюкозы, в качестве донора электронов с молекулярным кислородом в качестве их акцептора в процессе работы мультикомплексной митохондриальной дыхательной цепи (Nicholls and Ferguson, 1992; Zaslavsky and Gennis, 2000; Futai et al., 2000; Friedrich, 2001; Roth and Hagerhall, 2001). Вместе с тем, существует огромное количество микроорганизмов, отличающихся по характеру электронных доноров и акцепторов, используемых в дыхательных целях. Некоторые из них содержат дыхательную цепь, использующую вместо донор/акцепторной пары НАДН/кислород такие соединения, как метан, аммиак, диметилсульфоксид (ДМСО), водород или моноксид углерода в качестве доноров, и диоксид углерода, нитрат, сульфат или ион железа в качестве акцепторов (Thauer et al, 1977; Fiala and Stetter, 1986; Yu and Quinn, 1994; Schafer et al., 1996; Unden and Bongaerts, 1998; Ide et al., 1999; Rothery et al., 1999; Biel et al., 2002). В этих случаях специализированные ферменты оксидоредуктазного типа участвуют в передаче электронов в комплексы дыхательных цепей, которые с участием органических (хинонов) и белковых редокс-псреносчиков восстанавливают соответствующий акцептор электронов.

Естественно, что наиболее простым и доступным акцептором электронов для дыхательной цепи является протон и, почему бы ему не быть использованным в качестве терминального акцептора для анаэробного дыхания? Восстановление протона имеет свои преимущества, так как образуемый продукт, высокоэнергетичный восстановитель - газ, молекулярный водород (Н2) (Weaver et al., 1980; Nandi and Sengupta, 1998; Kuenen, 1999), легко удаляется из клетки. Однако Н2 больше производится ферментирующими микроорганизмами (Adams and Stiefel, 1998; Sawers, 1999; Beinert, 2000; Vignas et ah, 2001; Olson and Maier, 2002), чем "дышащими". Первые синтезируют АТФ только за счет прямого, непосредственного фосфорилирования АДФ с использованием высокоэнергетических соединений (Lehninger et ah, 1993; Berry, 2002). В отсутствие дыхательной системы, использующей электроны, эти организмы должны избавляться от избытка таких восстановителей, как восстановленные углеродные соединения, этанол, или же Н2.

Escherichia coli в отсутствие внешних акцепторов электронов дыхательной цепи получает энергию в процессе смешанного сбраживания углеводов (Sawers, 1999). Основным источником восстановительных эквивалентов для производства IL у них служит пируват, образуемый в процессе ферментации (Nicholls and Ferguson, 1992; Lehninger et ah, 1993) с участием анаэробного ферментного комплекса - формиат-водород-лиаза (ФВЛ). Два пути водородного метаболизма, каждый из которых требует гидрогеназной активности в составе ФВЛ, были идентифицированы в анаэробно выращенных Е. coli. В этих условиях бактерии синтезируют три [NiFcJ-гидрогеназы, описанные как гидрогеназа 1 (Нуа), гидрогеназа 2 (Hyb) и гидрогеназа 3 (Нус) (Ballantine and Boxer, 1985; Sawers et ah, 1985; Böhm et ah, 1990; Menon et ah, 1990; Sauter et ah, 1992; Sawers, 1994; Gennis and Stewart, 1996; Sargent et al., 1998). Андрюс с соавторами (Andrews et ah, 1997) обнаружили дополнительный оперон, который, как предполагается, кодирует новую протон-транслоцирующую [NiFeJ-гидрогеназу, названную гидрогеназой 4 (Hyf). Все они катализируют обратимое окисление - восстановление Н2.

Другое интересное наблюдение указывало на связь между активностью ФВЛ, F0F| Н+-АТФазной активностью и поглощением ионов калия (основным внутриклеточным катионом для всех типов клеток) у анаэробных Е. coli, выращенных в условиях ферментации (Bagramyan and Martirosov, 1989; Trchounian, 1997; Trchounian et ah, 1997). Модель мембранного АТФ-зависимого ионного транспортного комплекса (Trchounian, 2004), функционирующего как насос при посредничестве Дцн+, разрабатывалась на протяжении последней четвёрти , века и представляла несомненный биоэнергетический и биофизический интерес. Она указывала на то, что TrkA и F0F| системы сопряжены, по крайней мере в условиях анаэробной ферментации, с формированием АТФ-зависимого насоса, генерирующего высокий градиент ионов К+ через мембрану для стабилизации ДДц+- Механизм,

управляющий таким сопряжением, представляет большой интерес как со структурной, так и энергетической точек зрения.

Исследования, проведенные в нашей лаборатории (Bagramyan and Martirosov, 1989; Trchounian et al, 1997; Trchounian, 1997), показали, что как ФВЛ-активность, так и поглощение ионов К+, опосредованное через TrkA, являются Fo-зависимыми. Более того, предполагалось, что активность гидрогеназы 3, компоненты ФВЛ, абсолютно необходима для поглощения ионов К+ TrkA системой. В штаммах Е. coli, несущих мутации в FoFi-АТФазе, производство Н2 в процессе роста в условиях ферментации резко сокращалось, демонстрируя факт отсутствия активности ФВЛ в них (Trchounian et al., 1997). В мутантах, не способных "производить" ФВЛ, а следовательно, и Н2, поглощение К+ через TrkA-систему теряло характеристики, присущие 2Н+-К+-обмену. Более того, результаты (Bagramyan, Martirosov, 1989; Trchounian et ai, 1997; Trchounian, 1997) объясняли проблему структурного объединения и механизма передачи энергии, указывая на участие SH-rpynn в работе F0Fi и TrkA, а перенос энергии - в рамках модели дитиол-дисульфидных переходов (Martirosov, 1990). При брожении в цитоплазме бактерий содержится больше восстановленных молекул, чем в периплазме, что создает благоприятные условия для функционирования данных белков (Ritz and Beckwith, 2001; Katzen and Beckwith, 2002). Редокс-потенцнал, в принципе, мог бы являться фактором регуляции активности данных транспортных систем и связанных с мембраной ферментов за счет окисления или восстановления этих тиоловых групп.

Таким образом, вся совокупность имеющихся данных косвенно указывала на необходимость ФВЛ в процессе 2Н+-К+-обмена и производства Н2 у анаэробно выращенных, осуществляющих ферментацию Е. coli. Предположение о необходимости FoFi-АТФазы для активности ФВЛ у выращенных анаэробно, осуществляющих брожение Salmonella tiphymurium подтверждалось и данными, приведенными в работе Сасахары с соавторами (Sasahara et al., 1997).

Однако, роль ФВЛ в анаэробном брожении, вообще, и в формировании внутримембранного транспортного механизма, описанного выше, оставалась неясной. Каким образом осуществляется взаимодействие F0F| и TrkA и что обеспечивает пространственную связь этих генетически независимых структур внутри мембраны? Как осуществляется передача энергии от первичной энерго-донорной системы FoF) ко вторичной, энерго-потребляющей системе, является ли F0F| единственным поставщиком энергии для TrkA, переносящей ионы К+ против их концентрационного градиента, поскольку ни одна из этих систем не обладает окислительно - восстановительными локусами, которые могли бы быть потенциальными участниками акта передачи энергии и восстановительных эквивалентов. И последнее, каким образом регулируется работа такого сложного механизма?

Гипертермофильный археон Pyrococcus fiiriosus явился наиболее удобной моделью для развития данных исследований. Во-первых, этот организм считается предком для всех облигатных прокариотических анаэробов (Adams and Stiefel, 1998; Adams, 1999; Silva et al., 2000), получающих энергию только в процессе ферментации. Во-вторых, из него была выделена и очищена мембранно-связанная гидрогеназа (MBH), подобная гидрогеназе 3, части комплекса ФВЛ из Е. coli (Silva et al., 2000; Sapra et al., 2000). Сравнительный анализ гндрогеназ, названных гидрогеназами, подобными гидрогеназе 3 из Е. coli (Kunkel et al., 1998), проведенный в течение последних лет почти одновременно в нескольких лабораториях (Schafer et al, 1996; Ide et al, 1999; Meuer et al, 1999; Sapra et al, 2000; Silva et al, 2000; Friedrich and Scheide, 2000; Poorter and Keltjens, 2001; Zaslavsky and Gennis, 2000; Roth and Hagerhall, 2001; Svetlichnyi et al, 2001; Martinez et al, 2002; Biel et al, 2002) показал, что все они, возможно, транслоцируют (векторно переносят через мембрану (Nicholls and Ferguson. 1992) протоны и, таким образом, участвуют в дополнительном запасании энергии при ферментации. Однако вопрос, способна ли ФВЛ у Е. coli играть роль генератора энергии в условиях брожения, оставался невыясненным.

Цели и задачи исследований. Основная цель данной работы заключалась в изучении взаимосвязи Н+-К+-обмена и производства Нг у Е. coli в условиях дефицита энергии при их росте в анаэробных условиях в процессе ферментации глюкозы, протон-транслоцирующей активности гндрогеназ, подобных гидрогеназе 3, компоненты ФВЛ-комплекса Е. coli и энергозапасающей роли ФВЛ, фермента анаэробного брожения. Предполагалось решить следующие задачи:

1. Изучить роль каждого из участников, TrkA, F0F, и ФВЛ, в формировании мембранного транспортного комплекса с использованием как штаммов Е. coli, несущих мутацию в отдельных субъеднницах этих белковых комплексов, и их делеционных штаммов, так и специфических ингибиторов, блокирующих работу каждого из них по-отдельности.

2. Идентифицировать источник(и) энергии и охарактеризовать природу восстановительных эквивалентов, участвующих в переносе энергии от F0Fi Н+-АТФазы к TrkA системе поглощения ионов К+.

3. Разработать новый подход для установления механизмов дитиол-дисульфидных взаимопревращений, участвующих в переносе энергии от F0F| к TrkA с применением штаммов Е. coli с замененными цистеиновыми остатками или делецией F0Fb а также роли отдельных субъединиц F0F| в осуществлении акта окислительния - восстановления в процессе внутримембранного взаимодействия.

4. Изучить действие некоторых физико-химических факторов среды, pH, осмотичности и редокс-потенциала, в регуляции дитиол-дисульфидной реакции, работы отдельных компонентов, FoFb TrkA и ФВЛ и активности комплекса, в целом.

>. Исследовать энергозапасающую функцию ФВЛ, фермента анаэробного брожения, на основе исследования протонтранслоцируюшей функции гидрогеназы 3.

). Выявить дыхательную роль мембранно-связанной (MBH) гидрогеназы, подобной гидрогеназе 3 ФВЛ у Е. coli, из облигатного гипертермофильного анаэроба P. furiosus. Научная новизна работы. В результате проведенной работы с использованием ингибиторного анализа и широкого набора мутантов накоплен и обобщен новый экспериментальный материал, позволивший попять механизм работы мембранного транспортного комплекса, FnFi - TrkA - ФВЛ. функционирующего в условиях дефицита энергии при ферментации глюкозы у Е. coli.

Впервые показано, что определяющая роль в процессе функционального объединения отдельных компонентов комплекса принадлежит F0. части F0F| Н+-АТФазы, и гндрогеназам 3 или 4 - субъединицам ФВЛ.

Установлены доноры энергии (F0Fi и/или ФВЛ), способы ее передачи (дитиол-дисульфидные взаимопревращения), акцепторы энергии (TrkA) и доноры восстановительных эквивалентов, формирующие механизм транспортного комплекса.

Впервые установлено, что у Е. coli формируются два пути, ФВЛ-1 и ФВЛ-2, ответственных за производство Hi. Экспрессия этих путей и взаимодействие с 2Н+-К+-обменом, каждого в отдельности, зависит от условий pH (слабокислых или слабощелочных), в которых были выращены бактерии.

Впервые, с использованием мутантов, дефектных по отдельной аминокислоте или несущих ее замену, установлена роль SH-групп каждой из компонент F0Fi в процессе передачи энергии на TrkA. Показано, что замена двух цистеинов, по одному на каждые две копии ¿-субъединицы F0 (но не F,), F()Fi Н+-АТФазного комплекса, влияет на осуществление 2Н+-К+-обмена и производство ЬЬ.

Описаны механизмы регуляции работы комплекса, осуществляемые за счет редокс- и осмо- модификации профиля SH-групп F0F(, участвующих во взаимодействии.

На основе экспериментального материала по протонтранслоцируюшей активности гидрогеназы 3, компоненты ФВЛ, сравнительного анализа с экспериментальными данными по дыхательной активности мембранно-связанной (MBH) гидрогеназы, подобной гидрогеназе 3, из Р. furiosus, анализа 2Н+-К+-обмена и выделения Нг и теоретического анализа гидрогеназ, подобных гидрогеназе 3 из Е. coli:

Впервые постулирована энергозапасающая функция ФВЛ, фермента анаэробного брожения и его возможное участие в альтернативном фосфорилированию на субстратном уровне синтезе АТФ по хемиосмотическому механизму.

Впервые установлена способность микроорганизмов с ферментативным типом метаболизма генерировать АТФ в результате производства Н2, имеющая важное значение не только для понимания эволюции дыхательных систем, но также и возникновения жизни как таковой.

Научно-практическое значение работы. Сделанные в работе выводы и обобщения позволяют по-новому взглянуть на организацию и функционирование бактериальных мембран, что может быть использовано при исследовании мембран эукариотических клеток. Информация, полученная в данной работе, будет использована для углубления понимания механизмов белок-белковых взаимодействий внутри липидного бислоя в мембране, с целыо использования их в качестве потенциальных мишеней для имеющихся лекарств и разработки новых антибиотиков для борьбы с бактериальными инфекциями.

Молекулярный водород является важным интермедиатом в деградации органических веществ микроорганизмами, способными получать энергию только за счет ферментативных процессов и использовать водород для того, чтобы избавиться от избытка восстановленных продуктов. Основная часть произведенного Н2 используется как аэробными, так и анаэробными пресноводными обитателями для получения богатых энергией восстановительных эквивалентов, которые позволят им восстановить разнообразные субстраты и генерировать достаточно энергии для синтеза АТФ.

Понимание структурных и функциональных особенностей ферментов анаэробного брожения могло бы способствовать созданию устойчивых гидрогеназ для потенциальных биотехнологических целей. В течение последних лет серьезное внимание уделяется поиску и развитию альтернативных источников энергии. Молекулярный водород является в этом отношении идеально чистым топливом. В этой связи гидрогеназы, в том числе и в составе ФВЛ, представляют значительный интерес для их применения в производстве Н2 и использования в биотехнологии. С другой стороны, детектирование производства Н2 патогенными микроорганизмами человека может служить важным инструментом для ранней диагностики заболеваний органов желудочно-кишечного тракта. Основные положения, выносимые на защиту:

1. Формиат-водород-лиаза (ФВЛ) участвует в N,N'-дициклогексилкарбодиимид (ДЦКД)-чувствительном 2Н+-К+-обмене с фиксированной стехиометрией ионных потоков у выращенных анаэробно и ферментирующих глюкозу Е. coli. В зависимости от условий pH у Е. coli формируются два, ФВЛ-1 и ФВЛ-2, пути.

2. Модулирование сродства F0F,, TrkA и ФВЛ к их субстратам осуществляется за счет восстановления и окисления тиолов. Редокс-потенциал, осмотичность и pH среды регулируют их профиль в составе мембранных белков. Передача энергии осуществляется за счет дитиол-дисульфидных превращений.

3. Цистеин (£>Суя21) в мембранном домене р0р1 АТФазы играет ключевую роль в поглощении К+ и производстве Н2.

4. Формиат, окисляемый ФВЛ в условиях анаэробного брожения, может служить донором восстановительных эквивалентов в процессе передачи энергии от р()р! к ТгкА. Сопряженная с окислением формиата транслокация протонов приводит к генерации А/Хц+ - дополнительного источника энергии при формировании мембранного ионного транспортного комплекса.

5. Гидрогеназы, подобные гидрогеназе 3, являются генераторами электрохимического потенциала в условиях дефицита энергии у анаэробных ферментирующих организмов.

Апробация работы. Материалы работы докладывались и обсуждались на 17-ом Международном симпозиуме по биоэлектрохимии и биоэнергетике (Флоренция, Италия, 2003); 6-ом Международном конгрессе Европейской биоэлектромагнитной ассоциации (Будапешт, Венгрия, 2003); 8-й, 9-й и 12-й Европейских биоэнергетических конференциях (Валенсия, Испания, 1994; Лувен-ля-Нев, Бельгия, 1996; Аркашон, Франция, 2002); 3-ем и 4-ом Европейских биофизических конгрессах (Мюнхен, Германия, 2000; Аликанте, Испания, 2003); Анаэробной 0лимпиаде-2002 (Парк Сити, Юта, США, 2002); 43-ем и 46-ом Ежегодных собраниях Американского биофизического общества (Балтимор, Мериленд, США, 1999; Ныо Орлеан, Луизиана, США, 2002); 101-ом и 102-м Общих собраниях Американского микробиологического общества (Орландо, Флорида, 2001; Солт Лейк Сити, Юта, США, 2002); 27-ом Собрании федерации Европейских биохимических обществ (Лиссабон, Португалия, 2001); 18-ом Международном конгрессе по биохимии и молекулярной биологии (Бирмингем, Великобритания, 2000); 13-ом Международном симпозиуме по биоэлектрохимии и биоэнергетике (Йен-Геди, Израиль, 1996); 2-ом Международном симпозиуме, посвященном памяти акад. Н.М. Сисакяна (Дубна, Москва, 2001); конференции, посвященной 30-й годовщине кафедры биофизики ЕГУ (Ереван, 1996), на 20-м Ежегодном собрании Японской биоэнергетической группы (Япония, 1994). Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, изложения результатов собственных исследований и их обсуждения (6 глав), заключения, выводов и списка цитированной литературы. Диссертация изложена на 259-ти страницах машинописного текста, включая 59 рисунков, 19 таблиц. Список литературы включает 386 названий.

В обзоре литературы приводятся сведения о первичных и вторичных мембранных транспортных системах, принципах их взаимодействия, источниках энергии, обобщаются сведения об анаэробном брожении у бактерий, мембранных ферментах окисления-восстановления, проводятся аналогии с известными эукариотическими и прокариотическими энерго-трансформирующими комплексами. Краткое содержание остальных глав приводится ниже.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ В данной главе диссертации содержится описание: (1) основных объектов исследований - грамотрицательные факультативно анаэробные бактерии Escherichia coli, штаммы: К-12 (А.), природно-лнзогенный штамм;

FM 420, FRAG 90, МС4100, AN346 и W3110 - предшественники, предоставленные проф. А. Боком (Лаборатория Микробиологии Мюнхенского Университета, Мюнхен. Германия), др-ром Г. Розенбергом (Лаборатория Биохимии Австралийского Национального Университета, Канберра, Австралия) и проф. X. Кобаяши (Факультет Фармацевтических наук Университета Чибы, Чиба, Япония).

мутанты FM 911, HD700, HD702, HD705, HD706, HD707 с дефектами в отдельных компонентах ФВЛ(Н), формиат-дегидрогеназе и гидрогеназе 3, полученные от д-ров М. Саутера и Р. Розманна (Лапораторпя МикроБиологии Мюнхенского Университета, Мюнхен, Германия).

мутанты JRG 3615, JRG 3618, JRG 3521, с дефектами в гндрогеназе 4 и JRG 3933, мутант, дслеционныи по гидрогеназе 4 ФВЛ, предоставленные др-ом С. Андрюсом (Школа зоологии и мнкроБиологин Редингского Университета, Рединг, Великовритания).

мутанты FRAG 111, FRAG 115, AN 346, AN 936, AN 817 c дефектами как в отдельных суБъсдишщах Н'-АТФазы FqFj так и с делециямн F0Fb предоставленными проф. В. Эпстаином (кафедра молекулярной генетики и клеточноП биологии Чикагского университета, Чикаго, США).

мутанты ТК 509, ТК 1001, ТК 1110, ТК 2420, ТК 2076, ТК 2265, ТК 2654, ТК 2240, ТК 2242, ТК 2685 с дефектами как в отдельных сувъединицах Trk - системы, так н дслеционныи по Trk, предоставленными профессором В. Эпстаином (кафедра молекулярной генетики п клеточноП биологии Чикагского университета, Чикаго, США).

мутанты DK.8/pACWU1.2, предшественник с делецией д//>-оперона (atp ABC) и встроенной pACWUl.2 плазмидой, состоящей из 8 структурных генов F0F¡, и мутанты DOpACWU 1.2AcysF(j, DK8pACWU1.2AcysF, и DK8pACWUI.2AcysFoF,, у которых в олигоиуклеотидах встроенной pACWUl.2 плазмиды все цистсины заменены на апаним, сконструированные проф. А. Трчуняном (Департамент Молекулярной Физиологии п Биологической Физики Университета Вирджинии, Шарлотсвил, Вирджиния, США).

мугант JW136, предоставленный др-ром Р. Хеддерихом (Институт Микробиологии Макса-Планка, Марбург, Германия) через д-ра К.Т. Шанмугам (Департамент МнкроБиологин и КлеточноП сиологпи института питания и сельскохозяйственных наук. Университет Флориды, Гсппсвпл, Флорида, США).

Pyrococcus furiosas, археон, штамм DSM 3638, предоставленный проф. М. У. Адамсом (Департамент Биохимии н Молекулярной биологии Университета Джорджии, Агенс, Джорджия, США). Описаны условия культивирования микроорганизмов, оценки жизнеспособности, определение белка, сухого веса; (2) методы получения протопластов (Reenstra et al, 1980) правильно ориентированных (Konings and Kaback, 1973) и вывернутых мембранных везикул (Altendorf and Staehelin, 1974); (3) описаны методы определения ферментативных активностей: определение формиат-дегидрогеназной активности с бензилвиологеном, гидрогеназной активности регистрацией окисления восстановленного дитионитом метилвиологена и формиат-водород-лиазной активности как формиат-зависимое производство Н2 в газовой фазе методом

газовой хроматографии, Н+-АТФазной и АТФ-сингетазной активностей (Tausski and Shorr, 1953; Hutchins et al., 2001); (4) количественные - газовая хроматография (Kunkel et al, 1998; Sapra et al., 2000) и потенциометрический методы (Bagramyan, Martirosov, 1989; Trchounian et al, 1997), и качественные методы определения Н2 (Barret et al, 1984; Bagramyan et al, 2002); (5) определение нитратов (Лурье, 1973), количественное определение SH-групп (Торчинский, 1977; Riddles et al, 1983); (6) потенциометрические методы определения потоков ионов К+ и Н+ с помощью ион-селективных электродов, расчет их кинетических параметров (Мартиросов, Трчунян, 1986), определение мембранного и окислительно-восстановительного потенциалов (Гришос и др., 1980; Шульц и др., 1984); (7) описаны электрохимические методы определения градиента протонного потенциала с помощью формиатных пульсов (Ide et al,

1999), флуоресцентные методы измерения транслокации протонов (Rottenberg and Moreno-Sanchez, 1993), спектрофлуорометрические методы определения градиента pH и мембранного потенциала (Bertsova et al., 1997; Bragadin at el,

2000) и ряд других методических приемов, использованных в работе.

СОПРЯЖЕНИЕ МЕЖДУ ИОННЫМИ ТРАНСПОРТНЫМИ СИСТЕМАМИ

И ХАРАКТЕР КЛЕТОЧНОГО МЕТАБОЛИЗМА 1Г-К*-обмен и образование Н? в мутантах Е. coli, дефектных по FnF^ Н"1"-АТФазному комплексу и калиевому транспорту. Н+-К+-обмен в анаэробно выращенных ферментирующих Е. coli осуществляется посредством двух различных механизмов, функционирующих независимо друг от друга. Первый механизм включается при положительном осмошоке и значениях pH выше 7,0, действует с устойчивой стехиометрией ДЦКД-чувствительных катионных потоков, не функционирует не только при trkA мутации, но и в дГр-мутантах, дефектных по отдельным субъединицам F0 (AN 936) или несущих делециго п д//>опероне (FRAG 115) (Trchounian et al, 1997). Формирование H2 за счет ФВЛ-реакции в этих мутантах также подавлено. Оно наблюдается в мутантах Е. coli в двух случаях: (1) когда функционирует «дефектная Trk» и Н+-К+-обмен осуществляется через второй механизм - систему антипорта (Е. coli ТК 509 (2242)); (2) когда нарушение касается белков трех основных К+ -транспортирующих систем, Kdp, TrkA и TrkD, одновременно (Е. coli ТК509(2242). Секреция Н+ и образование Н2 подавляются с помощью ДЦКД и отрицательного осмошока, ингибирующих функции F()F|. Не только мутация trkH-тепа, исследованная ранее (Martirosov, Trchounian, 1981), или его делеция, но также и делеция trkE-ттг подавляют первый механизм Н+-К+-обмена (табл. 1), что позволяет предположить, что все три генопродукта - TrkA, TrkE и TrkH, способны формировать одну единую систему - TrkH, вовлеченную в первый механизм (Trchounian, Ogandjanyan, 1996). atpB- и atpC-мутации также ведут к исчезновению первого механизма. Поглощение К+ в процессе работы второго механизма происходит через TrkG-систему, сформированную TrkA, TrkE- и TrkG- генопродуктами. В таком случае предполагается, что

исследованные мутации и делеции в trkE и trkG, определяющие формированш соответствующих генопродуктов, не влияют на функционирование такоп механизма поглощения К+ у Е. coli, выращенных в анаэробных условиях Одновременные нарушения в TrkA и TrkG генопродуктах приводят i подавлению функций второго механизма. Данные также предполагают, что К* транспортирующие белки ответственны за поглощение К+ с помощыс второго механизма во взаимодействии с KdpA-белком, поскольку при мутацш в kdpA-гене поглощение К+ через этот механизм подавляется. Образование П2 подавляемое ДЦКД, арсенатом и протонофорами, наблюдаемое в анаэробне выращенных trkG и мутантах Е. coli ТК 2685 и ТК 2654, отличается такж( и по характеру Н+-К+-обмена. Он имеет место также и в trkA-мутанте ТК 224( даже при одновременной мутации в kdpA-гене (мутант ТК 2242) (Рис. 1). Е последнем формирование Н2 подавлялось с помощью ДЦКД и не наблгодалоа при аэробном выращивании клеток. В мутантах с одновременными дефектам! в KdpA, TrkA и TrkD- белках, продолжают функционировать F0Fi (шн только F0) и выход Н+ из бактерий подавляется с помощью ДЦКД, т.е образование Н2 в в этих мутантах есть результат взаимодействия F0Fi -АТФазь

Таблица 1.

Структурно-кинетические характеристики Н+-К+-обмена в анаэробне

выращенных trk- мутантах Е. coli._

Км, Н+-К+-обмен

мутант дефектные trk-белки ростовой mM* для поглощения K+, мМ** чувствительность к ДЦКД стехиомст-рия ДЦКД чувст. потоков

ТК100ЦТК2076) TrkD 0,2 2,2 + 2 Н+/К+

ТК 2685 TrkD, 0,5 2,2 + 2 Н+/К+

ТК 2654 TrkGTrkD, 12,0 10,0 + неустойчивая

ТК 509 TrkHTrkA, 31,6*** 13,3 + неустойчивая

FRAG 111 TrkDTrkD, 12,0 4,4 + неустойчивая

TrkE****

*КМ для ионов К+ определяли по удельной скорости бактериального роста в средах с

различным содержанием K+(Dosch et al-, 1991) **Дпя начальных катионных потоков при положительном осмотическом шоке

***Для подобного штамма (£. coli ТК 2205) ****Данный белок отсутствует

с донором восстановительных эквивалентов. Образование Н2 не наблюдалос] как в мутантах с делениями в trkA (ТК 2420), или trkE (FRAG 111), а также i afp-onepone (FRAG 115). Таким образом, анализ штаммов, несущих мутации i К+-транспортирующих системах или в протонной FoFi-АТФаЗ' свидетельствует о том, что образование Н2 комплексом ФВЛ может быт;

ссоциировано с механизмом Н+-К+-обмена у анаэробных ферментирующих Е. ■oli.

арактер поглощения К* и его связь с протонными помпами Е. coli в условиях »аэробного дыхания. Взаимодействие F0F, и TrkA-системы не происходит в »робных условиях (Trchounian, 1997). Поглощение К+ в таких клетках ;уществляется отдельно от F0Fi или дыхательной цепи по принципу унипорта in симпорта с Н+ за счет энергии Дцн+, и АТФ - в качестве регулятора своей стивности. Взаимодействие TrkA с протонными помпами, возможно, зависит г активности дыхательной цепи. В анаэробных условиях такая цепь может ункционировать в клетках, где имеются соответствующие акцепторы 1ектронов, например, нитраты и формируется нитрат/нитритное дыхание, а иггез ФВЛ подавлен (Gottschalk, 1986) или диметил- (диэтил-) сульфоксид IM СО, ДЭСО) - терминальный акцептор анаэробной дыхательной цепи с ночевым ферментом - ДМСО-оксидоредуктазой (Weiner et al., 1993). В ттичие от ферментирующих клеток, анаэробно выращенные, :уществляющие нитрат/нитритное дыхание Е. coli, после положительного :мошока в присутствие глюкозы поглощали К"1" в одну стадию, т.е. TrkA-[стема функционирует как унипортер, использующий АЦц+ в качестве ¡ижущей силы для управления ионным транспортом. Формирование Н2 в ких клетках не наблюдается. Диэтилсульфоксид (ДЭСО), гомолог ДМСО в ду диалкилсульфоксидов, проявлял более выраженные электрон-цепторные свойства по сравнению с ДМСО. В пределах концентраций от 35%-1,0% ДЭСО стимулировал рост клеток: удельная скорость роста зрастала почти в 2 раза, а выживаемость клеток была выше почти на 3

Рис. 1. Кинетика изменений редокс-состояния мембран измеренная титан-силикатным (Eh) и платиновым (Eh') электродами у различных мутантов Е. coli. Положительный осмошок (530 мосМ, стрелки) создавали введением сахарозы, а и b: I, ТК 2240; 2, ТК 2242, выращенные в анаэробных условиях: J, ТК 2240, выращенные в присутствии 0,2 мМ ДЦКД. с:

1, FRAG 111;

2, FRAG 115.

Hju'M'.i. %bm

порядка (в единицах cfu), по сравнению с ДМСО. Величина К+-потока после введения глюкозы была ниже в 1,4 и в 2,3 раза в присутствии ДЭСО и ДМСО, соответственно, хотя скорость секреции Н+ возрастала в 5,1 и 2,4 раза, стехиометрия ДЦКД-чувствительных потоков была нестабильной и варьировала в пределах 14,4 и 11,2, а величина Км, измеренная для поглощения К+ при составляла 4,1 и 3,7 для ДЭСО и ДМСО,

соответственно. Эти данные хорошо сочетаются с таковыми, полученными для Е. coli, осуществляющих нитрат/нитритное дыхание и являются свидетельством того, что ДЭСО также, как и ДМСО, в диапазоне малых концентраций может выступать в роли акцептора е" в анаэробной дыхательной цепи, в условиях, когда энергетические параметры и выход АТФ значительно варьируют, что в свою очередь объясняет их эффект на АТФ-зависимый транспорт К+. Отсутствие производства Н2 свидетельствовало о модулировании активности ФВЛ; эти данные хорошо сочетаются с сообщениями о том, что компоненты диметилсульфоксидредуктазы (DmsABC), индуцируемые с помощью ДМСО, способны напрямую взаимодействовать с [4Fe-4S]-KnaCTepoM FdhF, формиат-дегидрогеназой Н из Е. coli (Rothery et al, 1999).

Поглощение K+ через TrkA-систему в анаэробно выращенных Е. coli осмочувствительно как у ферментирующих, так и у бактерий с нитрат/нитритным дыханием. Такая чувствительность теряется у протопластов, лишенных периплазматического пространства. Поглощение К+ отсутствовало у мутантов Е. coli ТК 2420, где TrkA-система была неактивна.

РЕГУЛЯЦИЯ СОПРЯЖЕННОГО ТРАНСПОРТА ИОНОВ ПРИ АНАЭРОБНОМ БРОЖЕНИИ У Е. coli

Роль редокс потенциала в регуляции анаэробного ферментативного роста Е. coli и транспортных процессов. Одним из параметров, регулирующих бактериальный рост, является редокс-потенциал (Eh) (Breznak and Costilov, 1994). Его положительные значения, создаваемые за счет растворенного 02, ингибируют рост большинства анаэробных бактерий, но такие же значения Е|„ создаваемые в среде присутствием других реагентов, могут не влиять на бактериальный рост. Эффект 02 и Et, на рост и выживаемость Е. coli объяснялся взаимодействием редокс-молекул с электрон-транспортной цепью и последующей модификацией величин Д|Лц+, что в свою очередь определяло так называемый «рсдокс-таксис» бактерий (Bespalov et al., 1996). С одной стороны, в процессе аэробного и анаэробного роста в условиях ферментации Е. coli наблюдалось резкое (до -500 - 600 мВ) падение величины Eh, традиционно объясняемое переходом культуры из логарифмической в стационарную фазу роста. С другой стороны, связь между Eh и ДЦн\ а также уровнем доступных SH-групп обсуждается в качестве предполагаемого механизма влияния Д(Дц+ на активность ферментов. Редокс-состояние этих

групп, в свою очередь, может определять сродство транспортеров и ферментов к своим субстратам (Iwaarden et al., 1992).

Исследование эффектов непроникающего окислителя, феррицианида, на рост и выживаемость Е. coli, выращенных в анаэробных условиях и осуществляющих брожение, показало подавление удельной скорости роста почти на 78%. Выживаемость клеток (с/к) в солевой среде в присутствии 1 мМ феррицианида (Eh около +180 мВ) падает на 2 - 3 порядка после 120 ч роста в анаэробных, но не в аэробных условиях. Рост клеток в присутствие 3 мМ дитиотреитола (ДТТ), обеспечивающего сохранение монотиоловых соединений в полностью восстановленном состоянии, а также количественное восстановление дисульфидов (Е'о = -330 мВ при pH 7,0), сохранялся на уровне, регистрируемом для необработанных реагентом клеток. Скорость секреции Н+ в присутствии феррицианида уменьшалась вдвое, аккумуляция ионов К+ - в 1,5 раза меньше у ферментирующих, выращенных в анаэробных условиях Е. coli по сравнению с аэробными. Стехиометрия Н+- и К+-потоков, при этом, оставалась устойчивой, что свидетельствовало о сохранении ассоциации между F0F, и TrkA даже в присутствии феррицианида. Рис. 2 демонстрирует чувствительность Н+-К+-обмена и производства Н2 к высоким положительным значениям Eh. ФВЛ, катализирующая производство Из, взаимодействуя с Н+-К+-обменом, активна тогда, когда активен и ионный обмен, т.е. подавление

Рис. 2. Кинетические кривые редокс-потенциала, секреции Н+ и поглощения К+ у бактерий Е. coli К-12 (X), выращенных анаэробно в присутствии глюкозы. Клетки отмывали в дистиллированной воде и переносили в экспериментальный раствор, положительный осмошок (300 мосМ) создавали с помощью сахарозы. Глюкозу (Гл, 22 мМ) вводили в момент времени, указанный стрелкой. Ферри-цианид использовали в концентрами 1 мМ. Экспериментальная среда не содержала ионов К+.

функций последнего отражается и на формировании Н2. Во-вторых, образование Н2 может ассоциироваться и со вторым механизмом Н+-К+-обмена, во времени совпадающим с периодом выделения Н2 в присутствии феррицианида. Регуляция активности мембранных систем редокс-погенциалом среды осуществляется, возможно, за счет реакций окисления-восстановления, каковыми являются, например, дитиол-дисульфидные превращения, участвующие в переносе энергии (Deppenmeier et al., 1996). Не

последнюю роль в регуляции работы мембранных систем вместе с редокс-потенциалом играют и такие факторы среды, как рН и осмотичность. Эффект непроникающего окислителя и гиперосмотичности среды на транспорт IГ и К+ и кинетику редокс-потенциала. В гиперосмотической среде в анаэробных и аэробных условиях Е. coli способны расти, несмотря на довольно большую чувствительность к ионам Na+ по сравнению с сахарозой (Trchounian, Kobayashi, 1999; Ouvry et al., 2002). Параллельно подавлению бактериального роста в среде, содержащей 0,5 М NaCl при рН 7,5, значительно падала и интенсивность редокс-процессов: величина Eh оставалась на уровне -180 - -220 мВ и формирование Н2 не фиксировалось; если же осмотичность среды повышали введением 0,75 М сахарозы, формирование Н2 сохранялось при рН 7,5. Однако в средах с низкой осмотичностью (без NaCl или сахарозы) при рН 5,5 интенсивность редокс-процессов была чрезвычайно низкой: падение величины Eh фиксировалось в области величин -100 —115 мВ, не наблюдалось и образования Н2. Результаты подтверждают тот факт, что активность ФВЛ в приводимых условиях чувствительна к осмотическому давлению и рН среды, поскольку в гиперосмотических средах ферментация Сахаров подавлена, блокировано и нитрат/нигритное дыхание (Gouesbet et al., 1993), а ионы К+, аккумулируемые в больших количествах, способны репрессировать гены, «работающие» в анаэробных условиях. Быстрое поглощение, осуществляемое, возможно, через TrkA-систему и ведущее в значительному повышению внутриклеточной концентрации иона, не наблюдается в бактериях в условиях гиперосмотического стресса, индуцированного 0,5 М NaCl при рН 7,5, а в средах с рН 5,5, когда поглощение К+ осуществляется через Kup-систему (Trchounian, Kobayashi, 1999), не наблюдается и производства Н2 ФВЛ.

ВОССТАНОВЛЕНИЕ ПРОТОНОВ ФОРМИАТ-ВОДОРОД-ЛИАЗОЙ, СОПРЯЖЕННОЕ С ТРАНСПОРТОМ ИОНОВ У Е. coli

Модель 2Н+-К+-обмена предполагает процесс прямой, редокс-регулируемой передачи энергии от F0F] Н+-АТФазы на TrkA-систему с одновременным выделением Н2 (Bagramyan, Trchounian, 2003). Для того, чтобы он имел место необходимо наличие восстановительных эквивалентов, таких, как, например, формиат, окисляемый до Н2 и С02 с помощью ФВЛ и/или ДЦц\ определяющих редокс-состояние тиолов на мембранных белках, участвующих в переносе восстановительных эквивалентов от донора к акцептору. Однако, ФВЛ - это сложный мультисубъединичный мембранно-связанный комплекс. В данной главе обсуждается роль его отдельных субъединиц в формировании ионного комплекса и мера их участия в 2Н+-К+-обмене и формировании Н2, а также в процессе взаимодействия только F0 с TrkA(G) при формировании второго механизма, функционирующего как Н+-К+-антипортер с неустойчивой стехометрией для ДЦКД-чувствительных Н+ и К+-потоков.

1 !роизводство I-Ь и Н+-К*-обмен у мутантов с дефектами в формиат-водород-.чиазном комплексе, FnF^ и К+-транспорте. AfdhF мутант Е. coli FM 911 или AhycA-H мутант HD 700 с измененными формиат-дегидрогеназой, ФДН(Н) или гидрогеназой 3 (ГЗ), соответственно (Schiensog, Böck, 1990; Self et al, 2001), не производили H2 (Рис. 3). Однако, первый мутант осуществлял Н+-К+-обмен, нечувствительный к осмошоку, с типичной для TrkA величиной Км. ДЦКД ингибировал поглощение К+, но стехиометрия ДЦКД-чувствительных потоков Н+ и К+ была неустойчивой, а концентрация внутриклеточного К+ достигала величин около 450 ммоль/л (ср. с 740 ммоль/л для предшественника МС4Ю0). Н+-К+-обмен в этом мутанте осуществляется, возможно, посредством FqF| и TrkA, которые функционируют порознь, как у Е. coli, вы-

■4

Е„,

vi!

Рис. 3. Регистрация активностей Н+ и редокс-потенциала (Eh, Eh') у мутантов с дефектами в (а) - ФВЛ (AfdhF) FM 911 (сплошные кривые). AhycA-H HD700 (пунктир); (b) - atpD мутант AN817 (сплошные кривые). trkA trkD ktlpA (ТК2242) (пунктир).

О 10 20 О 10 20

1!,« Mim:

ращенных в присутствии нитратов или кислорода и осуществляющих дыхание. Аккумуляция ионов К+ у второго мутанта не наблюдалась (Рис. 3, а).

Н2 и Н+-1<+-обмен фиксировались у afp-мутанта AN 817 (Рис. 3, Ь) с дефектом в ß-субъединице Ft с теми же характеристиками, что и у AfdhF-мутанта FM911, но с большей величиной Км (11,0). Поглощение К+ и формирование Н2 исчезали в аГ/?-мутанте Е. coli AN 936 с дефектом в с-субъединице или Aatp-мутанте FRAG 115 с делецией FoF|. В trkA trkD kdpA-мутанте ТК 2242 с исфункционирующей TrkA формирование Н2 не было нарушено, однако этсутствовало поглощение К+ (Рис. 3, Ь), хотя величина мембранного потенциала доходила до -121 - -135 мВ. Природа формирования такого потенциала остается еще неясной, хотя есть предположение, что в мутантах он генерируется Fo-субъединицей (Trchounian et al., 1984) или альтернативными мембранными системами, которые будут обсуждаться в следующих главах. Таким образом, анаэробно выращенные ферментирующие Е. coli, (1) производят Н2 за счет ФВЛ, (2) производство Н2 и 2Н+-К+-обмен проявляются тогда, когда функционирует F0F, или только F0. Следовательно, ФВЛ у Е. coli

в приводимых выше условиях, сопряжена с F0Fi и ТгкА или только с F0 и TrkA. В данной главе обсуждается также предполагаемая роль ФВЛ в 2Н+-К+-обмене в качестве донора восстановительных эквивалентов. Образование Н2, ингибируемое ДЦКД, регистрировалось и в протопластах Е. coli, штаммс-предшественнике, с повышенной мембранной проницаемостью, в присутствии восстановленного с помощью ДТТ формиата. Производство Н2 в протопластах наблюдалось и тогда, когда использовали только НАДН. Оно интенсифицировалось с помощью ДТТ и не фиксировалось в ДfdhF, atpE и trkA trkD fa/рД-мутантах. Следовательно, донорами восстановительных эквивалентов для производства Н2 могут быть как специфический субстрат, формиат, так и неспецифический - НАДН, который способен связываться непосредственно с TrkA (Schlosser et al., 1992). В последнем случае путь образования Н2 с помощью ГЗ определяется как равновесие в реакции окисления НАДН и образования Н2.

Таблица 2.

Скорость выделения Н2 ферментирующими бактериями Е. coli (дикий тип, hyc, /¡у/'и ягр-штаммы), выращенными при pH 6,5 и 7,5._

Скорость производства H?

Штам м Генотип MB

MllH ■ мг■cyxeeca

pH 6,5" pH 7,5 a

- ДЦКД +ДЦКД -ДЦКД +ДЦКД

МС4100 дикий тип 6,0 ± 0,2 5,8 ± 0,4 5,2 ±0,2 0,4 ±0,1

5,7 + 0,3е 2,2 ± 0,2 5,5 ± 0,3d 2,8 + 0,2''

6,0 ± 0,2е - 5,2 ± 0,3е -

FM911 fdhF 0,3 ±0,1 - 0,2 ± 0,0 -

HD702 hyc В 0,2 ± 0,0 - 1,1+0,1 -

HD705 hyc Е 0,1 ±0,0 - 3,0 ±0,2 0,1 ±0,0

HD706 hyc F 0,5 ±0,1 - 5,9 ±0,4 0,3 ±0,1

HD707 hyc G 0,3 ±0,1 - 5,1 ±0,3 0,3 + 0,1

JRG3615 hyfA-B 4,8 ±0,1 5,0 + 0,4 0,3 ±0,1 -

JRG3618 hy/R 5,3 ± 0,4 4,7 ± 0,4 0,3 ±0,1 -

JRG3621 hy/B-R 4,6 ± 0,2 4,5 ±0,3 0,6 + 0,1 -

FRAG90 дикий тип 5,4 ±0,1 5,2 ± 0,4 5,2 ±0,3 0,3 ±0,1

FRAG 115 atp B-D 2,8 ± 0,2 2.7 ± 0,2 0,6 ±0,1 -

"Рост клеток и производство Н? измеряли при одинаковых значениях рН 4ДЦКД, 0,2 мМ

'Производство Н2 определяли при pH 7,5 ^Производство Н2 определяли при pH 6,5 "30 мМ формиата добавляли в ростовую среду Роль гидрогеназы 3, гидрогеназы 4 и в производстве 1Ь у Е. coli в условиях щелочного и кислотного pH. Формиат, образуемый в ходе смешанного брожения у Е. coli, метаболизируется до Н2 и С02 мембранно-связанной ФВЛ, состоящей из формиат-дегидрогеназы (ФДН,Н) и гидрогеназы

3 (ГЗ) (Bock, Sawers, 1996; Self and Shanmugam, 2000). Этот, так называемый ФВЛ-1 путь, активен только при низких значениях рН и высокой концентрации формиата. Открытие второй, 112 - выделяющей гидрогеназы 4, (Г4), позволило предположить наличие второго, ФВЛ-2, пути деградации формиата (Andrews et al., 1997). В данном разделе приводятся результаты и обсуждаются условия, когда проявляются активности ГЗ и Г4 и, в связи с этим, модулируется характер Н+-К+-обмена. Образование Н2 (Табл. 2) в условиях анаэробной ферментации при низком рН (рН 6,5) фиксировалось в диком типе Е. coli МС 4100 и /гу/-мутантах (JRG 3615, JRG 3618 и JRG 3621), но было слабым в /г>'с-мутантах (HD 705, HD 706 и HD 707). Образование Н2 наблюдалось при рН 7,5 независимо от hycE, hycF и /zjcG-мутаций, указывая на то, что ГЗ не вовлечена в формирование Н2 при высоком рН. Хотя hxf-мутации не имели значительного эффекта на рост бактерий в условиях ферментации, во всех трех hyf-мутантах при рН 7,5 гидрогеназная активность резко подавлялась (почти в 17 раз). Как и ожидалось, не было значительной разницы в fdhF (FM 911)-мутанте как при рН 6,5, так и при рН 7,5 (Табл. 2). Данные, приведенные в этом разделе, указывают на то, что производство Н2 слабощелочных значениях рН опосредовано Г4 и ФДН,Н, тогда как при слабокислых значениях рН, оно, в основном, ГЗ- и ФДН,Н-зависимо. Хотя производство Н2 бактериями Е. coli при рН 7,5 не зависело по крайней мере от трех субъединиц ГЗ, НусВ-субъединица, являясь переносчиком электронов от ФДН,Н к ГЗ и, сопрягая дегидрогенизацию формиата с образованием С02, была все еще необходима для этой активности уже в составе ФВЛ-2; /гусб-ген мог иметь плейотропный эффект на экспрессию hyf-геиов.

Для выяснения связи между F0Fl-AT®a3Hofi и ФВЛ-активностью, выделение Н2 определяли как в интактных клетках, так и в протопластах Е. coli, (hyc-, hyf-и я//?-мутантах) с повышенной проницаемостью в результате их обработки толуолом (1 дл/мл). Производство Н2 при рН 7,5 в диком типе сопровождалось выходом Н+ и почти полностью подавлялось ингибитором FoF| АТФазы, ДЦКД. Последний ингибировал и секрецию Н+ (-50%), возможно, в результате подавления АТФазной активности (Valiyaveetil et al., 2002). При рН 7,5 выделение Н2 сильно сокращалось (~ в 9 раз) в агрВ-О-мутанте. Секреция Н+ в процессе анаэробного нитрат/нитритного или аэробного дыхания, также, как и формирование Н2 при рН 6,5, не подавлялось с помощью ДЦКД. Суммируя эти данные, можно предположить, что активность Г4 при рН 7,5 сопряжена с FoFi-активностыо. Как и у дикого типа, секреция Н+, связанная с F0Fi, в hyf-мутантах частично подавлялась с помощью ДЦКД. Устойчивое же к ДЦКД производство Н2 при рН 6,5 указывало на то, что активность ГЗ не является, очевидно, F0F,-зависимой. Эффект ДЦКД на производство Н2, напротив, мог быть компенсирован низким рН. ФВЛ-1 и ФВЛ-2 у Е. coli играют различную физиологическую роль. Возможно, формирование альтернативного, ФВЛ-2 комплекса, необходимо для производства С02 в процессе ферментации при высоких значениях рН (выше 7,5) (Futatsugi et al., 1997), при образовании

оксалата фосфоенолпируват-карбоксилазой, который, в свою очередь, может быть использован для биосинтеза или потребления восстановительных эквивалентов и Н2-зависимого фумаратного дыхания. ФВЛ-1 участвует в детоксикации формиата при низких значениях рН. Предполагаемая энергозапасающая роль ФВЛ-2, возможно, необходима для производства С02 при низкой концентрации формиата.

Формиат повышает РпР^-АТФазную активность у Е. соИ, выращенных на глюкозе в анаэробных условиях при щелочных значениях рН. Если Р0Р| и ФВЛ взаимосвязаны и для нормального функционирования ФВЛ требуется активность Р0Р|, что было продемонстрировано и на 5. ¡урЫпшгшт (БазаЬага & а1., 1997), было высказано предположение, что существует, возможно, и обратная связь, т.е. формиат, субстрат ФВЛ, должен каким-то образом модифицировать активность РоРь по крайней мере, в условиях слабощелочного рЫ. В вывернутых мембранных везикулах, полученных из Е. соИ, АТФазная активность повышалась с увеличением концентрации формиата (Рис. 4) и подавлялась (-1,2 раза), когда протонофор карбонилцианид-/>г-хлорфенилгидразон (КХФГ, 1 /хМ) был добавлен в

Рис. 4. АТФазная активность мембранных везикул Е. coli МС4100, определенная при различных концентрациях формиата. Бактерии выращивали в анаэробных условиях в среде с 0,2 % глюкозы без (А) или в присутствии 30 мМ формиата (В). Пунктиром обозначены кривые, полученные для бактерий, выращенных в присутствии 50 мМ нитрата натрия. 0,05 мМ ДЦКД вводили в экспериментальную среду.

экспериментальную среду. Введение толуола (1 ^л/мл) не влияло на изменение ферментативной активности, т.е. формиат, как слабая кислота, не оказывал неспецифического разобщающего действия (Rüssel and DiezGonzalez, 1998) на АТФазную активность. Отсутствие эффекта формиата в hyf, но не /гус-мутантах указывало на ключевую роль Г4. Ионы Na+ (в

0 20 40 60 80 100 120 концентрация формиата, мМ

концентрация формиата, мМ

2Ü

экспериментах использовали Na+-yio соль муравьиной кислоты) или увеличение осмотичности среды (200 мМ сахарозы) не оказывали существенного влияния на АТФазную активность. Ее стимулирование не наблюдалось в клетках, выращенных в анаэробных или аэробных условиях и осуществляющих нитрат/нитритное дыхание. ЛТФазная активность не стимулировалась ионами К+, увеличивалась при введении в экспериментальную среду формиата, если клетки выращивали при рН 7.5 в присутствии 30 мМ формиата. Активность подавлялась с помощью ДЦКД или азида натрия. Эффекты формиата отсутствовали в atp-, hyc- или hyf-мутантах. В последнем, возможно, из-за того, что формиат индуцирует Н2-выделяюшую активность при слабощелочном рН. АТФазная активность у яГ/ьмутанта FRAG 115 не стимулировалась также и ионами К+. Исключается прямое непосредственное влияние формиата на АТФазную активность или субъединичную стехиометрию в FoFi в процессе ферментации, как было показано в работе Шмидта с соавторами (Schemidt et al., 1998) в процессе ферментации глюкозы без или в присутствии формиата, т.к. его эффект, во-первых, не обнаруживался в клетках, осуществляющих дыхание, а во-вторых, зависел отГ4 или ГЗ. Внутриклеточный рН ([рН]ш~7,1), измеренный в клетках, выращенных в присутствии формиата, по сравнению с таковыми, выращенными без формиата ([pH]¡n~7,5) имел более низкие значения, а мембранный потенциал (А\\/), наоборот, превосходил таковой, измеренный для клеток, выращенных без формиата (-150±ЗмВ и -130±3mB, соответственно). Такие изменения внутриклеточного рН и мембранного потенциала могут играть роль в модификации активности FoF| для клеток, выращенных в присутствии формиата; данные хорошо коррелируют и с результатами, полученными для энтерококковой F0F| АТФазы, о том, что ее количество и активность зависят от величины цитоплазматического рН (Kobayashi et al., 1986). Суммируя приведенные данные, можно предположить, что эффект формиата обусловлен взаимодействием F0F| с ФВЛ-2, в отсутствие его необходимого количества, и с ФВЛ-1 - при его наличии.

ПЕРЕНОС ЭНЕРГИИ ВНУТРИ МЕМБРАННОГО ТРАНСПОРТНОГО КОМПЛЕКСА TrkA - F0F, - ФВЛ

Дитиол-дисульфидные взаимопревращения в мембранных белках у Е. coli; роль окислителя и восстановителя. Ранее, было показано (Bagramyan, Martirosov, 1989), что в основе работы механизма ДЦКД-чувствительного 2Н+-К+-обмена и формирования Н2 лежат тиол-дисульфидные взаимопревращения, за счет которых энергия от донора (FoF| АТФазы) может передаваться к ее акцептору (TrkA-системе) при посредничестве ФВЛ (донора восстановительных эквивалентов), а Л/Лц+ играет роль модулятора такой активности. В данном разделе представлены количественные характеристики ионного обмена и производства Н2 в присутствии восстановителя редокс-

потенциала и дисульфидных групп в белках, О.Ь-дитиотреитола (ДТТ), усиливающего процесс ионного обмена. В присутствии непроникающего окислителя, феррицианида (К3[Ре(СМ)6]), с заметной задержкой, вызванной адаптационными процессами, направленными на изменение редокс-профиля поверхности клетки, осуществлялось выделение Н2 (Рис. 5).

м»г

-в- к'

____а—а-

мМ 2.7

-sw.1-

HiieM^l. мпм I" Ь 20 Z.1 .>1) 1.1

4-i-v-i,...

J..1

|| И)

Нрсчл. г.;м

Г'

Рис. 5. Влияние феррицианида на секрецию Н\ поглощение К+ (а) и изменение Eh (b) клетками £. coli МС4100. В Трис-фосфатный буфер вместо KCl введен K3[Fe(CN)6] (1 мМ). Глюкоза (стрелка) добавлена в концентрации 20 мМ.

В безградиентных условиях (в присутствии толуола) протопласты предшественника кус В, fdhF и hyf-мутантов, Е. coli MC 4100 выделяли 1Ь при введении в среду как формиата, так и НАДН, а ДТТ восстанавливал производство Н2, блокированное присутствием КХФГ (10 ¡лМ). В целых клетках НАДН участвует в восстановлении Н+, сопряженном с переносом е" от формиата (Böck, Savvers, 1996). В протопластах НАДН, по-видимому, выступает донором Н. Полученный результат говорит о неспецифичности донора окислительно-восстановительных эквивалентов для выделения Н2 и возможном влиянии других метаболитов, производным которых является формиат. TrkA-белок включает последовательность аминокислотных остатков, гомологичную для многих гидрогеназ, способен к аллостерическому взаимодействию за счет НАД+-связывающего участка, Eh при этом, может выступать в качестве редокс-посредника в регуляции активности TrkA. NEM (0,5 мМ) блокирует выделение Н2 протопластами как в среде с формиатом, так и с НАДН, что указывает на участие SH-групп в этом процессе. Функциональные SH-группы в мембранных везикулах, вовлеченные в АТФ-зависимый Н+-К+-обмен и выделение Н?. Если в процессе 2Н+-К+-обмена через F0F| и TrkA и при формировании Н2 с участием ФВЛ имеет место дитиол-дисульфидный переход, то количество доступных SH-групп должно варьировать в зависимости от экспериментальных условий. Такие группы, обычно входящие в состав цистеина, могут находиться в различных субъединицах F0Fi (Kuo et al., 1998; Kadokura et al„ 2003) и в трансмембранной

спирали TrkH-белка (Schlosser et al., 1995). Повышение количества доступных SH-групп за счет АТФ подавлялось с помощью ДЦКД и не наблюдалось в присутствии феррицианида, замедляющего ионный обмен и выделение Н2. Подобные эффекты не обнаруживались в мембранных везикулах из бактерий с аэробным или анаэробным дыханием. У ßfp-мутанта FRAG 115 не было АТФ-зависимого изменения числа SH-групп, а их общее количество было более чем в 3 раза меньше. Суммируя, можно предположить участие SH-групп во взаимодействии F0F, и TrkA в рамках модели дитиол-дисульфидных переходов, где Eh может являться фактором регуляции активности этих систем и связанных с мембраной ферментов за счет окисления или восстановления тиоловых групп последних.

Роль SH -групп FnF^ в Н+-К+-обмене и выделении Н?. Чтобы убедиться в том, что действие ДТТ связано с восстановлением SH-групп F0F, и TrkA, а эффект АТФ связан с SH-группами именно F0Fi, Н+-К+-обмен и выделение Н2 были исследованы у мутанта Е. coli DK8/pACWU1.2/ßFlag/ACys, у которого все, входящие в состав F0Fi, цистеиновые остатки были заменены на аланин (Kuo et al., 1998). При выращивании в аэробных условиях функции F0Fj у этого мутанта не менялись, хотя по сборке и стабильности F0Fi мутант несколько этличался от своего предшественника (Ketchum and Nakamoto, 1998). Производство Н2 отсутствовало у мутанта, поглощение К+, чувствительное к залиномицину, осуществлялось с более высоким значением Км 6,7 (Км=2,7 -тля предшественника), а стехиометрия ионного обмена была неустойчивой при вменении pH или активности К+ в среде, хотя величина Д\|/ при этом не менялась. Количество доступных SH-групп у мутанта было несколько ниже, 1ем у его предшественника и практически не менялось в присутствии АТФ или ЦТТ. Таким образом, замена всех SH -групп в составе Fori нарушала ззаимодействие F0F, и не только с TrkA, но и с ФВЛ.

Замена bCvs21Ala влияет на функциональные особенности FpF^_Что б ы

установить роль SH-групп каждой из компонент F0Fi (F0 и F,) в процессе 1ередачи энергии на TrkA определялась активность каждой из них с заменой дистеинов в их составе на аланин (один - внутри мембранного сегмента саждой копии ¿-субъединицы, мутант ¿>Cys21Ala), или растворимого сектора "i (всего 19 замен, «безцистеиновый» Fi-мутант). Увеличение количества юступных SH-групп, наблюдаемое при введении 3 мМ АТФ, блокируемое с томощыо ДЦКД и NEM, не только в диком типе, но и в atp- и ¿г&-мутантах, )счезало у ¿>Cys21 Ala -мутанта. Производство Н2 было также подавлено у >того мутанта в отличие от мутанта с замененными цистеинами в Fi-секторе. Замена двух цистеинов, по-одному на каждые две копии ¿-субъединиц и только цистеинов в АТФсинтетазном комплексе внутри бислоя, влияли и на )борачиваемость гидролиза АТФ и общую секрецию Н+. Поскольку F0F, репрессировался, возможно, из мультикопейной плазмиды, его избыток мог гаким-то образом нивелировать эффекты, наблюдаемые за счет паимодействия с TrkA, и разница могла бы быть выше по сравнению с

нормальным гаплоидным штаммом, будь число копий АТФсинтетазного комплекса сравнимо с количеством транспортеров К+.

Замена ¿Cys21 в F0F| приводила к потере активности одной из К+-поглощающих систем. По сравнению с предшественником или «бсзцистеиновым» Fi-штаммом, в ¿Cys21 А1а-мутанте поглощение К+ было нечувствительно к осмотическому шоку, осуществлялось с Км=10,0 и меньшим температурным коэффициентом (Q|0=l,l). ДТТ активизировал поглощение К+ в КХФГ-обработанных клетках дикого типа или «безцистеинового» F,-штамма. Эффект ДТТ отсутствовал в ¿Cys21 А1а-мутанте (Рис. 6), что свиде-

Рис. 6. Эффект ДТТ на поглощение К+ бактериями Е. culi с заменой цистеинов в F0F|. Клетки подвергали гиперосмотическому шоку. 1 дл КХФГ и 20 мМ глюкозы воодили в экспериментальную среду в нулевую минуту. 3 мМ ДТТ (стрелка) добавлены на 2-й минуте.

1 2 3 4 5 6

lipCMÍ!. MíHl

тельствовало о потере ДТТ-стимулируемой TrkA-активности из-за замены цистеинов Ь-субъединицы. ДЦКД-чувствительное выделение Н2 также блокировалось в £>Cys21 А1а-мутанте, как в интактных клетках, так и в протопластах с повышенной мембранной проницаемостью при введении формиата совместно с АТФ. Таким образом, цистеины в составе Fo-сектора АТФсинтетазы, по-одному на каждый мембранно-связанный сегмент каждой ¿-субъединицы, играют ключевую роль в мембранных функциях ферментирующих Е. coli, регулируя АТФ-зависимое взаимодействие мембранно-связанных белков через посредничество АЦн+-

ЭНЕРГОЗАПАСАЮЩАЯ РОЛЬ ФОРМИАТ-ВОДОРОД-ЛИАЗЫ В УСЛОВИЯХ АНАЭРОБНОГО БРОЖЕНИЯ В данной главе приводятся экспериментальные данные, обосновывающие новую роль ФВЛ в ионном обмене не только как донора восстановительных эквивалентов, но и как генератора энергии по хемиосмотическому механизму, способного заменять и/или совмещать энергодонорную функцию F0F, для противоградиентного переноса К+ с помощью TrkA-системы. Два возможных объяснения могут быть предложены в данном случае. Во-первых, в ферментирующих клетках в анаэробных условиях FoFj вносит главный вклад в прогонный поток, ассоциируясь с ФВЛ-реакцией. Во-вторых, если ФВЛ-реакция сопряжена с генерацией протондвижущей силы, функциональная F0F| должна быть необходима для конвертирования энергии, запасенной в виде A|in+, в синтез АТФ. В отсутствие функциональной FoF) Д|ТИ+ не может

использоваться, что, в свою очередь, подавляет ФВЛ-реакцию. Об этом свидетельствуют и данные, приводимые в предыдущих главах, когда в ЛТФазных мутантах функции комплекса ФВЛ также подавлены. Протоп-транслоиирующая функция гидрогеназы 3 формиат-водород-лиазного комплекса; эффект ДЦКД. За генерацию электрохимического потенциала комплексом ФВЛ, вероятно, могут быть ответственны ее субъединицы -гидрогеназы (Г1-4), поскольку только они являются интегральными мембранными белками комплекса. Два пути метаболизма водорода, каждый из которых требует гидрогеназной активности, были идентифицированы в анаэробно выращенных Е. coli. Fl и Г2 являются Нг-окисляющими гидрогеназами и имеют довольно схожую архитектуру, но их физиологическая роль еще недостаточно понята (Blokesch et al., 2001) Андрюс с соавторами (Andrews et al., 1997) предполагают, что гидрогеназа 4 (Г4), часть ФВЛ-2 пути у Е. coli, в естественных условиях, когда ФВЛ-реакция экзэргонична, сопрягает транслокацию протонов с запасанием энергии. Однако, до сих пор фенотип для /¡v/'-оперона, кодирующего Г4, не описан и требует пополнительных исследований.

Энергозапасающую функцию ГЗ исследовали как на целых клетках Е. coli FW 136 (Ahya'Ahyb') (Рис. 7), так и на вывернутых везикулах (Рис. 8) в условиях pH 6,5, когда Г4 не активна. Инкубация везикул с Д1ДКД приводила к ютере 63% ферментативной активности. Возможной мишеныо для ДЦКД, по-зидимому, является HycD-белок, являющийся гомологом ND1-субъединицы Комплекса I. Анализ аминокислотной последовательности гидрогогеиаз, годобных ГЗ, показал, что НусС, HycD и HycF-субъединицы и соответствую-

г,;1| Рис. 7. Регистрация закисленпя

, среды (40 мМ KSCN, 0,5 М

S ^ сахарозы, 10 мМ ДТТ, 1 мг л"1

!* « резазурина) (выраженная в

\ |\ '•» * .1 " единицах активностей Н+), в

Iiis) 11 * 1

J\ ¡L.JÜ

\ j Д || | суспензии целых клеток /:'. coli

JW136 методом формнатных \ \ д \ д пульсов. Стрелки указывают

"чШ ;.5и юо юо 50 (15.4(1 моменты формнатных пульсов

фпрчи.п (в наномолях). Эксперименты

проводили при 37ПС и pH 6,26,3 в атмостфере N2.

цие субъединицы подобных [NiFe]-гидpoгeнaз) содержат скрытые остатки :ислых аминокислот. Три законсервированных глутамата и два аспартата, и )дин глутамат, локализованный в трансмембранной спирали, способные говалентно взаимодействовать с ДЦКД, были идентифицированы в НусЭ-юдобных субъединицах. Транслокацию Н+ через плазматическую мембрану шдуцировали пульсами формиата в отмытую в ЭДТА и ресуспензированную

в раствор сахароза-тиоцианид суспензию клеток, в условиях диссипации А\[/. Степень обратимого закисления зависела от количества формиата, т.е. перенос Н+ был специфично сопряжен именно с окислением формиата. Среднее значение Н+/формиат при обратном закислении среды было близко к 0,8, т.е. при окислении до С02 каждого моля формиата в среду выбрасывалось 0,8 молей Н+. При оценке стехиометрии Н+/формиат учитывался и тот факт, что формиат может поступать в клетку через Н+-симпортный механизм (Suppmann and Sawers, 1994). Следовательно, из среды вместе с одним молем окисляемого формиата удаляется один моль Н+. 0,5 молей Н+ (из диссоциированной почти на 50% Н2С03, образуемой при растворении С02 -продукта окисления формиата) в условиях pH 6,5 и рК 6,3 выбрасывается в среду на один моль окисленного формиата. Оба эти фактора ведут к дефициту 0,5 молей FT в наружной среде, и эта величина должна быть прибавлена к вычисленной ранее. В сумме, полное значение стехиометрии Н+/формиат будет составлять 1,3.

Формиат, добавленный в суспензию вывернутых мембранных везикул из Е. coli JW 136, приводил к защелачиванию среды на очень короткий период благодаря быстрому движению Н+ из среды в полость везикул, а степень защелачивания зависела от количества добавленного формиата. Постепенно энергозапасающий транспорт Н+ подходил к концу, приводя к запаздыванию из-за пассивной диффузии Н+ из полости везикул обратно, в среду (Ide et ai, 1999). Стехиометрия отношения Н+/формиат, после калибрования системы стандартным раствором NaOH, была равна 1,1. В данном случае корректировка производилась с учетом того, что один моль Н+ используется в химической реакции (НСОО" + Н+<=>С02 + Н2) на моль окисленного формиата, т.е. 0,5 молей Н+ образуется в результате образования бикарбоната. Оба этих фактора приводят к тому, что в чистом виде из среды забирается 0,5 молей Н+ (без участия протонной помпы), и эта величина должна быть вычтена из рассчитанной стехиометрии. В итоге, стехиометрия Н+/формиат становится равной 0,6. Вдобавок к этому, необходимо рассматривать и тот факт, что формиатный транспортер FocA катализирует транспорт формиата в обоих направлениях (Suppman and Sawers, 1994). Следовательно, частичное защелачивание может происходить благодаря транспорту формиата в полость везикул, т.е. полный вклад этих процессов в общую алкализацию среды, на самом деле, практически невозможно рассчитать. КХФГ (17 нмоль/мг белка' подавлял транслокацию протонов как у целых клеток, так и у вывернутых везикул. Аккумуляция флуоресцирующих аминов, 9АА и АХМА, в ответ на генерацию АрН после добавления формиата, приводило к тушению флуоресценции (Рис. 8). Образование протонного градиента блокировалось после введения нигерицина.

формиат

iiiircpiimiii

]

Рис. 8. Формиат-зависимая транслокация протонов вывернутыми везикулами Е. coli JW136, определенная методом тушения флуоресценции в смеси флуоресцентных аминов, 4,5 цМ 9-аминоакридина (9-АА) и 0,45 /¿М 9-амино-6-хлоро-2-метоксиакридина (АХМА), а также 1 ßM валиномицииа. Реакцию начинали с инъекции 1 мМ формиата натрия. После введения 0,05 дМ нигерицина, направление протонного потока менялось на противоположное

Время, Мин

Конверсия и СО2 в формиат. Если превращение формиата в Н2 и С02 сопряжено с генерацией протондвижущей силы, очевидно, что обратная реакция, образование формиата из Н2 и С02, должна использовать ту же энергию. Для проверки этой гипотезы анализировали способность клеточной суспензии и вывернутых мембранных везикул из Е. coli JW136 катализировать конверсию Н2 и С02 в формиат. Целые клетки, после инкубации в течение 2 ч в смеси газов Н2/С02, катализировали образование 5мМ формиата со скоростью 0,3 мМ/мин-мг белка. В вывернутых везикулах эта скорость достигала величин 0,2 мМ/мин-мг белка. Гетерогенная популяция (смесь вывернутых везикул, целых клеток, клеточных осколков и правильно ориентированных везикул) могла служить причиной и прямой реакции, т.е. одновременного образования Н2 и С02 из имеющегося в среде формиата. Разобщитель КХФГ, хоть и не полностью, но подавлял процесс образования формиата, подтверждая факт Д[Хц+-зависимой конверсии Н2/С02.

ТРАНСЛОКАЦИЯ ПРОТОНОВ, СОПРЯЖЕННАЯ С ИХ ВОССТАНОВЛЕНИЕМ: БИОЭНЕРГЕТИКА ПРОИЗВОДСТВА Н, В ПРОЦЕССЕ АНАЭРОБНОГО БРОЖЕНИЯ У Pyrococcus furiosus

Ферментирующие микроорганизмы синтезируют АТФ только путем прямого фосфорилирования АДФ с использованием так называемых высокоэнергетических фосфатных соединений, ацетил фосфата или фосфо-енолпирувата в процессе субстратного фосфорилирования, образуемых при окислительном метаболизме Сахаров и аминокислот. В отсутствие дыхательных систем такие организмы вынуждены удалять излишек восстановленных углеродных соединений таких, как этанол или молекулярный водород. Р. furiousus - гипертермофильный археон, представляет собой не

только очень удобную для сравнения модель облигатного анаэроба. Природа метаболических путей и механизмов запасания энергии в условиях ферментации получила новую интерпретацию с открытием Н2-производящей мембранно-связанной гидрогеназы (MBH), подобной ГЗ у Е. coli (Kunkel et eil., 1998; Sapra et al., 2000; Silva et al, 2000). Результаты по исследованию механизмов генерации энергии этой гидрогеназой внесли свой вклад и подтвердили новую, ранее неизученную роль запасания энергии для анаэробного фермента брожения, ФВЛ.

Биоэнергетика производства Н2 у P. furioitsus. Свежеприготовленные вывернутые мембранные везикулы катализировали выделение Н2 при 80° С в присутствии восстановленных фередоксина (1,2± 0,1^М/мин мг белка ) или редокс-красителя, метилвиологена (2,5± O.l/iM/мин мг белка ). Хотя геном Р. furiousus указывает на наличие мембранно-связанной АТФсинтетазы (Silva et al, 2000), активность фермента не была исследована ранее. В отдельных экспериментах измерялась АТФазная активность (1,3± ОД^М/мин мг белка ), подавляемая с помощью ДЦКД и нитратов натрия, ингибитора археальных (А0АО АТФаз вакулярного типа (Wieczorek et al., 1999; Bowman and Bowman, 2002). Хотя гидрогеназная активность не подвергалась влиянию этих ингибиторов, ионы меди (CuCI2) полностью подавляли Н2-выделяющую активность. Мембранные везикулы проявляли очень незначительную (<0,02 /хМ/мин-мг белка) АТФсинтетазную активность (Рис. 9), когда АДФ и Фн

§ *

2 ч

3 » 0.8

Н 1

У I o.fr Ё S < s

5 -0.4^ 2 В

| I 0.2-pi 5

S 5 s a

Рис. 9. Метивиологен- и ферредокст зависимый синтез АТФ, катализируемый вывернутыми мембранными везикулами, МВН-сопряженный синтез АТФ не наблюдался в отсутствии электронно донора для производства Н2, дитиои (ДТ), когда MBH ингибировали иона меди (+СиС12), блокировали АТФсинтетазу с помощью ДЦКД (+ДЦКД) или в отсутствии протондвижущей силы (+КХФГ).

были добавлены в реакционную среду. Однако, синтез АТФ резко возрастал (>40 раз, до 0,8 ¿¿м/мин'мг белка), если в реакционную среду добавляли донор электронов, ферредоксин. В этих же условиях определяли и гидрогеназную активность: выделение Н2 стимулировалось параллельно синтезу АТФ. Сопряжение между АТФсинтетазой и МВН-гидрогеназой нарушалось (синтез

ЛТФ почти полностью подавлялся) с помощью ионов меди, иегибитора гидрогеназ (Adams, 1990). Те же концентрации меди не влияли на АТФазную активность. Синтез АТФ блокировался с помощью ДЦКД и нитрата, не влияющих на гндрогеназную активность.

Электрохимические свидетельства энергозапасающей роли МВН-гидрогепазы. Реверсия работы МВН-гидрогеназы. Прямые свидетельства образования градиента рН (кислого внутри) и мембранного потенциала (положительного внутри везикул) после введения ферредоксина в реакционную среду с сопутствующим формированием Н2 и синтезом АТФ были получены с помощью метода двухволновой спектроскопии (Рис. 10). Оба, и химический и электрический градиенты, диссипировались в присутствии протонофора, КХФГ, хотя выделение Н: при этом стимулировалось. Это напоминает феномен дыхательного контроля, когда в условиях диссипирования энергии Др.ц+, ее первичный генератор, в данном случае МВН-гидрогеназа, функционирует как-бы «вхолостую», чем и вызвано усиление гидрогеназной активности. Поскольку производство Н2 блокировалось ионами меди, это отразилось и на генерации АрН (Рис. 10). АТФ-индуцируемый градиент рН (или электрического поля) не влиял на Фд-индуцируемый градиенты. Анализ полученных результатов позволяет предложить простую хемиосмотическую модель (Рис. 11 ,а), согласно которой производство Н2 МВН-гндрогеназой в присутствии восстановленного ферредоксина (или метилвиологена) ведет к гранслокации Н+ через мембрану и формированию протондвижущей силы (Рис. 10). АТФсинтетаза затем использует эту энергию для управления энергетически благоприятного транспорта Н+ в клетки и синтеза АТФ из АДФ и Ф„. В отсутствие такой силы, АТФсинтетаза не способна катализировать

Рис. 10. Измерения ДрН и Д\|/ методом двухволновой спектрофотометрии в процессе образования Н2 в присутствии вапиномицина или нигерицина. Изменения рН (а и Ь) регистрировали с помощью акридина оранжевого (2 /1М), а изменения мембранного потенциала (с и с1) - Оксонола VI (4 ММ).

синтез АТФ, в отсутствие субстрата (электронов) для гидрогеназы, не происходит выделения Н2 и транслокации Н+, т.е. синтез и АТФ также абсолютно незначителен. Каталитические особенности'MBH из P. furiousus находятся в соответствии с такой моделью, поскольку фермент имеет огромное «предпочтение» в сторону катализа производства Н2 (Sapra et al, 2000). Так, например, когда в условиях in vitro используются искусственные электронные переносчики, стехиометрия выделения Н2 по отношению к его окислению, катализируемому ферментом, >2000, что сравнимо с величинами, полученными в разных условиях для цитоплазматических гидрогеназ из различных микроорганизмов (Albracht, 1994; Albracht and Hedderich, 2000; Sapra et al., 2000). Молекулярный механизм, ответственный за каталитические особенности MBH из P. furiousus еще недостаточно изучен, однако, основным следствием, вытекающим из модели (Рис. 10) является то, что гидролиз АТФ должен стимулировать окисление Н2 за счет реверсии протон-управляемого электронного транспорта. Действительно, MBH проявляет низкую Н2-поглощающую активность и нет влияния АДФ и Ф„. Вместе с тем, введение АТФ стимулировало окисление Н2 почти в 4 раза. Эффект АТФ минимизировался в присутствии нитрата и разобщителя, КХФГ, а также ионами меди, инактивирующими гидрогеназу. Рассчитанная стехиометрия для молей АТФ, производимых на два перенесенных электрона (или один моль Н2) равна 0,3 - 0,4 как для Фд-, так и метилвиологен-зависимых образцов. Интересно, что эти величины сравнимы с таковыми, что приводятся в литературе (Ide et al., 1999). Если предположить, что 3 Н+ транслоцируются на молекулу синтезируемой АТФ (Brune et al., 1987; Nicholls and Fergusson, 1992) приблизительно 1 H+ транслоцируется на молекулу выделяемой Н2.

Ген в МВН-опероне, кодирующий каталитическую субъединицу, ответственную за производство Н2, является одним из тех, чей продукт гомологичен каталитической субъединице хорошо изученной [NiFe]-гидрогеназы (Volbeda et al, 1995), Филогенетическая связь между [NiFe]-гидрогеназами и протонтраслоцирующими ферментами такими, как НАДН:убихинон оксидоредуктаза (Комплекс I) аэробных дыхательных цепей хорошо представлена в литературе (Sauter et al., 1992, Albracht, 1993; Albrachi and Hedderich, 2000; Kashani-Poor et al, 2001; Friedrich, 2001) и также подтверждает факт сопряжения производства Н2 с протонной транслокацией а, значит, и синтезом АТФ МВН-гидрогеназой. Результаты ингибиторногс анализа, проведенного на R. rubrum и генетические исследования М. barker также показали, что существует связь между восстановлением протонов г синтезом АТФ (Meuer et al, 2002). Надо, однако, заметить, что прямот биохимической демонстрации восстановления протонов, сопряженного ( протонной транслокацией и синтезом АТФ, не было.

Более того, понимание биоэнергетики Непроизводящих дыхательных систе\ в этих организмах усложнено тем фактом, что оксидоредуктазы, такие как СО дегирогеназа и формиат-дегидрогеназа, предоставляющие электроны i

ассоциированные с гирогеназами, могли быть также ответственны за транслокацшо протонов в процессе окисления субстрата. Однако, нами показано, что гидрогеназная система Р. /нг10хих существует сама по себе и только она ответственна за запасание энергии, используя маленький (7 кДа) цитоплазматический редокс-белок, восстанавливаемый в процессе первичного метаболизма.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Точный механизм транслокации протонов ГЗ из ФВЛ еще недостаточно ясен. Однако, суммируя приводимые данные, можно предложить некоторую рабочую модель (Рис. 11), предполагающую новую, ранее неизученную, физиологическую роль ионной помпы для ГЗ, компоненты ФВЛ.

I YKY IllycKl

Ч t [4Fe-4S] [4Fe-4S] *ООС- V- н+\ 1 Mil (ll>cl>>

Чч Ч PSST |4Fe-4S] (НусС) le" M15 (lljcC 1

49-bDa ♦ (Н;тЕ) / Q

( ►[NiTe])

аминокислоты сахаря

opiaiiiinecKiie кислоты +

Рис. 1 1

Согласно данной модели (Рис. 11, Ь), восстановительные эквиваленты, производимые дегидрогеназой, катализирующей окисление

гшзкопотенциалыюго электронного донора (формиата, карбонильных групп щетата или моноокиси углерода), переносятся через ферредоксин или другой FeSJ-белок на гидрогеназы. Электрон-переносящий белок (НусВ, в случае Е. :oli) может выполнять ту же функцию, что и НАДН-дегидрогеназный модуль Комплекса I, перенося е" через железо-серные кластеры на большую ;убъединицу, где два Н+ восстанавливаются до Н2. Основным отличием между лщрогеназами, подобными ГЗ из Е. coli и Комплексом I, является, возможно го, что они не требуют хинонов или хинон-подобных соединений, зыполняющих физиологическую роль доноров-акцепторов е", для эсуществления своих функций. 49-кДа субъединица Комплекса I и большая ;убъединица ГЗ выполняют одинаковую роль, формируя терминальную часть знутреннего электрон-переносящего пути (Albracht and Hedderich, 2000; Prieur n al, 2001), хотя первая не содержит законсервированных цнстеиновых остатков, координирующих [NiFeJ-активный сайт, т.е. Комплекс I не обладает лщрогеназной активностью. Конформационные изменения в гидрофильной

части фермента сопряжены с векторной транслокацией Н+ через цитоплазматическую мембрану. Поскольку не было идентифицировано наличия дополнительных редокс-кофакторов, только железо-серные кластеры и [NiFeJ-активный сайт растворимой части белка вовлечены в редокс-реакции, катализируемые ферментом. [FeSI-кластсры играют критическую роль внутри помпирующего механизма (Albracht and Hedderich, 2000). Аминокислотная последовательность субъединиц Комплекса I и субъединиц гидрогеназ, подобных ГЗ из Е. coli, предполагает наличие двух [4Fc-4S]-кластеров на субъединице TYKY и одного [4Fe-4S]- кластера на субъединице PSST. Предполагается (Albracht and Hedderich, 2000), что эти субъединицы Комплекса I формируют электродвижущую компоненту протонной помпы. Все приведенные субъединицы содержат законсервированные глутаматные остатки в каждом из двух [4Fe-4S]- кластеров. Окисление - восстановление одного или обоих кластеров зависит от компенсации зарядов и от того, насколько ближе расположен железо-серный центр. Реакция окисления-восстановления в одном или обоих [4Fe-4S]-KnacTepax протекает по принципу компенсации заряда: восстановление первого [4Ре-45]-кластера (Рис. 11,Ь) требует Н+ от ближайших карбоксильных групп для компенсации отрицательного заряда. Электрон и протон последовательно переносятся на второй |4Fc-4S]-KviacTep. После окисления второго [4Рс-45]-кластсра, электроны и протоны отделяются друг от друга. В гидрогеназах, электрон идет через железо-серный белок на малую субъединицу [NiFeJ-сайта, где протоны восстанавливаются до Н2; в Комплексе I электрон используется для восстанавления убихинона. Однако, необходимо учитывать еще одну ситуацию. Если до последнего времени предполагалось, что Комплекс 1 является главным образом протонной помпой (Nicholls and Ferguson, 1992), то исследования, проведенные в лаборатории Димрота (Krebs et al„ 1999; Steuber et al., 2000) показали, что Комплекс I из Klebsiella pneumonia и E. coli участвует в транслокации Na+, что предполагает несколько более критическую оценку представлений о Комплексе I. С этой точки зрения, нельзя скидывать со счетов и возможность транслокации ионов Na+ гидрогеназами, подобными ГЗ из Е. coli.

Если расщепление формиата до Н2 и С02 сопряжено с генерацией протондвижущей силы, логично было бы предположить возможность обратной реакции - формирование формиата из Н2 и С02, также управляемое протонодвижущей силой. Эксперименты с целыми клетками и вывернутыми везикулами из Е. coli демонстрируют образование от 2 до 5 мМ формиата из Н2 и С02, т.е. реакция, катализируемая ФВЛ, не полностью обратима и является энерго-зависимой (Albracht and Hedderich, 2000). Кроме того, как поглощение ионов К+, опосредованное через TrkA, так и ФВЛ-активность являются не только F0Fr, но и Fo-зависимыми. Активности ГЗ (в условиях слабокислых значений рН), и Г4 (при слабощелочных рН) - компонентов ФВЛ, были абсолютно необходимы для поглощения ионов К+ TrkA-системой: в

штаммах Е. coli, несущих мутацию в F0F, -АТФазе, производство Н2 в процессе роста в условиях ферментации резко сокращалось, демонстрируя факт отсутствия активности ФВЛ в них. В мутантах, не способных производить ФВЛ, а следовательно, и Н2, поглощение К+ через TrkA-систему теряло характеристики, присущие 2Н7К+-обмену. Значит, в ферментирующих клетках в анаэробных условиях, F0F! -АТФаза ответственна за основную часть протонного цикла, но в сопряжении с ФВЛ. Если ФВЛ-реакция сопряжена с генерацией протондвижущей силы, функциональная F0F,- АТФаза необходима для конвертирования энергии, запасенной в электрохимическом протонном градиенте, в синтез АТФ. В отсутствии такой АТФсинтетазы электрохимический протонный градиент не мог бы быть использован, что, в свою очередь, блокировало бы ФВЛ-реакцию. Этот эффект напоминает феномен дыхательного контроля, наблюдаемого в митохондриях (Nicholls, Ferguson, 1992) и был продемонстрирован в данной работе. Сопряжение между ФВЛ и F0Fr АТФазой при ферментации в анаэробных условиях находится под строгим редокс-, pH и осмо- контролем, регуляция активности мембранного комплекса осуществляется на тонком молекулярном уровне с участием SH-групп взаимодействующих белков.

И, наконец, какова роль такого дыхательного механизма для энергетики ферментирующих организмов, живущих в анаэробных условиях?

Во-первых, данный механизм прекрасно объясняет, почему P. furiosits, археон, до последнего времени считающегося облигатным анаэробом, получающим энергию только за счет субстратного фосфорилирования (Adams, 1999), обладает необычным гликолизом, при котором используется ферредоксин вместо ожидаемого НАД в качестве электронного акцептора для окисления глицероальдегид-3-фосфата (ГАФ). Эта реакция катализируется вольфрам-содержащим ферментом, ГАФ:Фд-оксидоредукгазой и генерирует восстановление ферредоксина. Этот восстановленный ферредоксин может быть использован напрямую для синтеза АТФ в процессе образования Н2, тогда как НАДН - нет, поскольку его редоке-потенциал намного выше (Ет= -320 мВ при pH 7,0), чем потенциал редокс-пары Н2/Н+ (Ет= - 420 мВ при pH 7,0).

Во-вторых, такой механизм дыхания объясняет противоречия, имеющиеся при сравнении измеренной и рассчитанной величин «ростового выхода» для P.furiosus (Kengen and Stams, 1994). Например, клеточный выход на моль АТФ в процессе роста на глюкозе или целлобиозе был около 17,8±1,7 г/моль АТФ, что гораздо выше, чем ожидалось (Brune et al, 1987). Такой расчет предполагает то, что только в стадии превращения пирувата и ацетата возможно запасание энергии. Однако, полученные результаты показывают, что 1,2 моля АТФ могут быть образованы в процессе окисления 1 моля глюкозы до 2 молей ацетата в дополнение к 2 молям АТФ, генерируемым на субстратном уровне. Клеточный выход на моль АТФ, следовательно,

понижается до 11,1±1,0 г/моль АТФ, величина, которая более соответствует расчетам, предлагаемым для других организмов (Brune et al., 1987).

Наши исследования Н+-К+-обмена в условиях ферментации позволил! взглянуть иначе на роль ключевых ферментов анаэробного брожения. Ош продолжают обобщать сведения последних лет, внося свой вклад в проблем) изучения анаэробной ферментативной энергетики на примере простейши> дыхательных систем, гидрогеназ, Нус, Hyf, Coo (Fox et al, 1996; Andrews et al. 1997; Kunkel et al, 1998) из бактерий (E. coli, R. rubrum), и Ech, CODH, MBF (Meuer et al., 1999; Svetlichnyi et al; 2001; Sapra et al, 2000; Silva et al, 2000) и: apxea (M. barkeri, C. hydrogenoformans, P. furiosus) - пионеров жизни на Земле Это значит, что все эти гидрогеназы, подобные ГЗ из Е. coli, могли бы бьт предшественниками сложных дыхательных цепей, встречающихся i настоящее время в высших организмах. Эта идея хорошо согласуется с предлагаемой для гипертермофилов ролью в эволюции (Wiegel and Adams 1998).

Способность ферментирующих микроорганизмов генерировать АТФ i результате производства 1Ь, в частности, с участием ФВЛ, имеет огромно! значение не только для понимания эволюции дыхательных систем, но также v возникновения жизни как таковой. Если принять, что жизнь на Земл< развивалась в анаэробных условиях, возможно, в условиях высоки) температур и сильно восстановленной окружающей среды, способност] использовать протоны в качестве терминальных электронных акцепторов i сопрягать их транслокацию с запасанием энергии имела бы чрезвычайны! преимущества.

ВЫВОДЫ

1. Формирование Н2 с помощью ФВЛ у анаэробных Е. coli, осуществляющие брожение, взаимосвязано с Н+-К+-обменом через Н+-К+-помпу и Н+-К+-обме1 через Н+-К+-антипорт. Н2 не образуется в клетках, где нарушена с субъединица F0 Н+-АТФазного комплекса, но производится клетками i дефектами трех основных К+-транспортирующих систем, Kdp, TrkA и TrkD одновременно. Секреция Н+ и формирование Н2 подавляются с помощьн ДЦКД и отрицательного осмотического шока.

2. Все три геноподукта, TrkA, TrkE и TrkH, способны формировать одн; единую систему, TrkH, вовлеченную вместе с F0Fi, в первый механизм чувствительный в ДЦКД и характеризуемый устойчивой стехиометрие1 (2Н+-К+) ионных потоков и сопряженный с производством Н2 комплекс ФВЛ. Поглощение ионов К+ в процессе работы второго механизма вариабельной стехиометрией и отсутствием чувствительности к ДЦК/] происходит по механизму антипорта и не ассоциировано с формирование? Н2.

3. Взаимодействие ТгкА системы поглощения К+ с протонной помпой, F0F, 1Г-АТФазой, при анаэробном дыхании у бактерий Е. coli осуществляется с образованием осмочувствителыюго комплекса, без участия ФВЛ, фермента анаэробного брожения. Поглощение ионов К+ в случае нитрат/нитритного или диметилсульфоксид (диэтилсульфоксид)-редуктазного дыхания осуществляется по механизму унипорта, использующего Д/Хц+ в качестве движущей силы для ионного транспорта.

4. Редокс-потенциал играет детерминирующую роль в ферментативном роете и выживаемости Е. coli. Активность F0Fi, ТгкА и ФВЛ регулируется редокс-потенциалом среды за счет реакций окисления - восстановления: активность Н+-К+-обмена подавляется окислителем, феррицианидом, и стимулируется с помощью ДТТ, модулятора тиоловых групп белков. С повышением значений pH (7,5-9,0) и гиперосмотичности среды подавляются рост клеток Е. coli, интенсивность редокс-процессов и ионный обмен с производством Н2.

5. Производство Н2 с помощью ФВЛ у анаэробно выращенных ферментирующих Е. coli являются FoF,- или только Fo-зависимым. Донором восстановительных эквивалентов для производства Н2 может служить как специфичный субстрат, формиат, так и неспецифичный - НАДН. Производство Н2 при слабокислом (6,5) и слабощелочном (7,5) значениях pH опосредовано комбинациями ГЗ и ФДН,Н и Г4 и ФДН,Н, соответственно, формирующими два, ФВЛ-1 и ФВЛ-2 пути. Формиат стимулирует F0F]-АТФазную активность у Е. coli при ферментации глюкозы в условиях щелочных значений pH.

'■). Передача энергии от первичной, энергодонорной, системы (F()F|) к вторичной, энергоакценторной, системе (ТгкА) осуществляется за счет дитиол-дисульфидных взаимопревращений в мембранных белках. В переносе восстановительных эквивалентов от ФВЛ ключевую роль играют SH-группы F0Fi Н+-АТФазы с участием цистеинов в составе ¿-субъединиц мембранного домена F0. Замена последних на аланин нарушает взаимодействие F0F] - ТгкА и производство Н2 ФВЛ. Д^ц+ в условиях анаэробного роста и ферментации глюкозы осуществляет редокс-регуляцию АТФ-управляемого Н+-К+-обмена.

Гидрогеназа 3, компонент ФВЛ, в условиях слабокислых значений pH обладает чувствительностью к ДЦКД и характеризуется протон-транслоцирующей активностью, функционируя в качестве протонной помпы, генерирующей Ддц+ в процессе окисления формиата до Н2 и С02 и обладающей механизмом обратимой реакции, синтеза формиата из Н2 и С02. Стехиометрия Н+/формиат целых клеток Е. coli составляет 1,3. В процессе взаимодействия FoF] - TrkA ФВЛ в условиях анаэробного брожения, способна совмещать энергодонорную роль с функцией источника восстановительных эквивалентов.

МВН-гидрогеназа из гипертермофильного археона P. furiosus, обладающая подобием с гидрогеназой 3 из Е. coli, чувствительна к ДЦКД, использует

протон (вместе с электроном) как в качестве субстрата для производства IЬ так и в качестве средства для запасания энергии по хемиосмотическому механизму. Производство Н2 с помощью МВН в присутствии восстановленного ферредоксина ведет к транслокации Н+ через мембрану формированию протондвижущей силы и синтезу АТФ со стехиометрией 0,3 моля синтезируемого АТФ на 2 переносимых электрона (или один моль Н£ (АТФ/2е") или 0,4 моля АТФ на 2е" - для метилвиологена.

Гидрогеназы, подобные гидрогеназе 3 из Е. coli, у анаэробных ферментирующих организмов, производящих АТФ, в основном, на уровне субстратного фосфорилирования, могут быть простейшими дыхательным! системами, участвующими в дополнительном синтезе АТФ.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Баграмян К. Лакгат как источник энергии для функционирования мультиэнзимногс комплекса у Е. coli II Биолог, ж. Армении, 1989, т. 42, с. 981 —985.

2. Bagramyan К., Martirosov S. Formation of an ion transport supercomplex in Escherichic coli. An experimental model of direct transduction of energy // FEBS Lett., 1989, v. 246, p 149- 152.

3. Баграмян К., Мартиросов С. Связь между производством Н2 и энергозависимы\ обменом Н+ на К+ в Е. coli II Биофизика, 1990, т. 35, с. 440 - 445.

4. Trchounian A., Ogandjanyan Е., Bagramyan К. and Vassilian A. H+-K+-exchange anc interaction between F0F]-ATPase and K+-transport in anaerobically grown bacteria //71' European Bioenergetics Conference, Helsinki, Finland // Biochim. Biophys. Acta (EBEC Reports), 1992, V. 7, P. 90.

5. Баграмян К., Трчунян А. Н+-К+-обмен, и обоазование Н2 у мутантов Е. coli ( дефектами по Н+-АТФазному комплексу и калиевому транспорту// Биофизика, 1993 т. 38, с. 678 - 683.

6. Trchounian A., Ogandjanyan Е., Bagramyan К., Vassilian A. A role of respiratory chain ii regulation between the F0FrATPase and K+-transporting system in bacterial membrani //8th European Bioenergetics Conference, Valencia, Spain // Biochim. Biophys. Act; (EBEC Reports), 1994, V.8, P. 108.

7. Баграмян К., Василян А., Трчунян А. Характер поглощения К+ и его взаимодействие < протонными насосами мембраны у бактерий Escherichia coli, выращенных [ анаэробных условиях в присутствии нитрата// Биофизика, 1996, т. 41, с. 365-371.

8. Баграмян К., Трчунян А. Роль компонентов формиат-водород-лиазы в образован!» молекулярного водорода и их связь с протонно-калиевым обменом у анаэробне выращенных бактерий Escherichia coli // Биофизика, 1996, т. 41, с. 369-376.

9. Bagramyan К., Poladyan A., Trchounian A. Dithiol-disulfide interconversion and redo) regulation of H+-K+-exchanging mechanisms in the bacterial membrane// ii book"BioThermoKinetics of the Living Cell" p. 475, Eds. Westerhoff H.V. et al. Amsterdam, The Netherlands, 1996, 435-438.

10. Trchounian A., Ogandjanyan E., Bagramyan K. The nature of K+-uptake systems participating in H+-K+-exchange and molecular hydrogen production in anaerobicalb grown Escherichia coli//Membr. Cell Biol., 1996, v. 9, p. 515-528.

1. Bagramyan К. and Trchounian A. A fall of redox potential of bacterial suspension and its relation with cell growth and ion transport across the membrane // 13lh International Symposium on Bioelectrochemistry and Bioenergetics, Ein Gedi, Israel, 1996, P.127.

I. Trchounian A., Bagramyan K., Ogandjanyan E., Vassilian A., Zakharyan E. An electrochemical study of energy-dependent potassium accumulation in E.coli. XIV. Comparison of K+-uptake characteristics in anaerobically grown cells, performing glycolysis or nitrate respiration // Bioelectrochem. Bioenerg., 1996, v. 39, p. 3-19.

5. Bagramyan K., Poladyan A., Trchounian A. Energy transfer to the potassium channel in bacterial membrane by means of dithiol-disulfide interchange //9lh European Bioenergetics Conference, Louvain-la-Neuve, Belgium // Biochim. Biophys. Acta (EBEC Reports), 1996, V.9, P. 187.

1. Trchounian A., Bagramyan K„ Poladyan A. Formate hydrogen lyase are needed for proton-potassium exchange through the F0F|-ATPase and the Trk system in anaerobically grown and glycolysing Escherichia coli II Curr. Microbiol., 1997, v. 35, p. 201-206.

i. Bagramyan K., Trchounian A. Decrease of redox potential in the anaerobically growing Escherichia coli suspension and proton-potassium exchange //Bioelecrochem. Bioenerg., 1997, v. 43, p. 129-134.

). Trchounian A., Bagramyan K., Ogandjanyan, E. et al. Relationship of the Escherichia coli TrkA system of potassium ion uptake with the F0Fi ATPase under growth conditions without anaerobic or aerobic respiration//Biosci. Rep., 1998, v. 18, p. 143-154,

'. Bagramyan K., Galstyan A., Trchounian A. Oxidative stress in Escherichia coli under anaerobic conditions effects of oxidizer on growth and K+-uptake// 43ld Annual Meeting of American Biophysical Society, Baltimore, Mariland, USA // Biophys. J., 1999, A235.

!. Markarian S., Poladyan A., Kirakosyan G. and Bagramyan K. Dimethylsulfoxide affects bacterial survival and regulates the ion transport // 18,h International Congress of Biochemistry and Molecular Biology "Beyond the Genome", Birmingham, UK, Abstracts. 2000, P. 182.

'. Mnatsakanyan N., Zakharyan E., Bagramyan K., Trchounian A. Dithiol-disulfide interchange in operation of the F0FrATPase in fermenting bacteria. 1 llh European Bioenergetic Conference Reports, Sussex, UK // Biochim Biophys. Acta (EBEC Reports), 2000, V.ll. P.90.

. Трчунян А., Баграмян К., Василян А., Поладян А. Взаимосвязь формиат-водород-лпазы с протонно-калиевым насосом при гетероферментативном брожении у Escherichia coli: функциональные мультиферментные ансамбли в мембране // Биолог, мембр., 2000, v. 13, р. 511-526.

. Mnatsakanyan N., Zakharyan Е., Poladyan A., Vassilian A., Bagramyan К., Trchounian А., Nakamoto R., The Escherichia coli F0F| ATPsynthase under fermentation: cysb21 ala replacement perturbs K+ uptake and H2 production, 3rd European Biophysics Congress, Munchen, Germany // Eur. Biophys. J., 2000, 29/4-5, P. 328

. Bagramyan K., Mnatsakanyan N„ Poladyan A., Vassilian A. and Trchounian A. Escherichia coli formate hydrogen lyase pathways: a requirement of the F0F| ATP synthase for the activity of hydrogenase 4. // 18,h International Congress of Biochemistry and Molecular Biology "Beyond the Genome". Birmingham, UK, Abstracts, 2000, P. 175.

. Bagramyan K., Galstyan A., Trchounian A. Redox potential is a determinant in the Escherichia coli growth and survival: effects of impermeable oxidant// Bioelectrochemistry, 2000, v. 51, p. 151-156.

24. Bagramyan К. Regulation of activity of membrane transport proteins by thiol - disulfide exchange. 27lh Meeting of the Fed. Eur. Biochem. Societies, Lisbon, Portugal // Eur. J. Biochem., 2001, V. 268, p. 224.

25. Mnatsakanyan N., Bagramyan K., Trchounian A. Escherichia coli formate hydroghen lyase: formate increases hydrogen gas production by hydrogenase 3 but not by hydrogenase 4. American Society for Microbiology, Washington, DC //101 Gen. Meeting. Abstracts, Orange Country Convention Center Orlando, Florida, 2001, P.453

26. Bagramyan K., Vassilian A., Mnatsakanyan N.. Trchounian A. Participation of hydrogenase 4 in proton-potassium exchange and molecular hydrogen production by Escherichia coli // Membr. Cell Biol., 2001, v. 14, p. 749-764

27. Киракосян Г., Баграмян К., Трчунян А. Редокс-процессы и производство молекулярного водорода у Escherichia coli в гиперосмотической среде // Биофизика,

2001, т. 46, с. 245-250.

28. Bagramyan К., Mnatsakanyan N., Poladyan A., Vassilian A., Nakamoto R., Trchounian A. The role of cysteine residues in the Escherichia coli F0FrATPase operation and in relationship of this ATPase with potassium transport proteins and formate hydrogenlyase // in: "Ploblems of biochemistry, radiation and space biology", Eds. Gazenko O.G., Grigorieva A.U., Popov V.O., Moscow, Dubna, Russia, 2002, v. 2, p. 36 - 41.

29. Маркарян Ш., Баграмян К., Аракелян В. Мембранный потенциал до и после глубокого замораживания Escherichia coli в присутствии диметилсульфоксида и диэтидсульфоксида // Биофизика, 2002, т. 47, с. 315 - 317.

30. Bagramyan К., Mnatsakanyan N., Poladyan A., Vassilian A., Trchounian A. The roles of hydrogenases 3 and 4, and the F0FrATPase in H? production by Escherichia coli at alkaline and acidic pH //FEBS Lett., 2002, v. 516, p. 172-178

31. Bagramyan K„ Trchounian A.A. Functional association of Escherichia coli membrane transport systems: external formate stimulates the F0FrATPase activity at slightly alkaline pH // Biochim Biophys. Acta (EBEC Reports), 2002, V.12. P.57.

32. Poladyan A., Bagramyan K., Trchounian A. Enlerococcis hirae growth and solute transport can be controlled by redox potential and proton motive force // Biochim Biophys. Acta (EBEC Reports), 2002, V.12. P. 143.

33. Баграмян К. Электрохимическое исследование протон-транслоцирующей функцш гидрогеназы 3 // Биофизика, 2002, т. 47, с. 847-85].

34. Bagramyan К. Energy conservation by the anaerobic formate hydrogen lyase enzyme: sorm evidences, Anaerobe Olympiad 2002 // The 6lh Bienn. Congress of the Anaerobe Society ol the Americas, Park City, Utah, USA, 2002, P. 108.

35. Forzi L., Hedderich R., Bagramyan K. Proton translocation by hydrogenase-3 of formate hydrogen lyase. Abstracts, 46lh Ann. Meeting of American Biophys. Society // Biophys. J

2002, v. 82, P. 562a

36. Mnatsakanyan N., Vassilian A, Navasardyan L., Bagramyan K., Trchounian A. Regulatior of Escherichia coli formate hydrogenlyase activity by formate at alkaline pH // Curr Microbiol., 2002, v. 45, p. 281-286.

37. Мнацаканян H., Захарян Э., Баграмян К., Трчунян А. Дитиол-дисульфидньк превращения в мембранных транспортных белках у Escherichia coli II Биол. мембр. 2002, т. 19, с. 181-190

38. Bagramyan К., Mnatsakanyan N., Trchounian A., Effect of formate on the N,N' dicyclohexylcarbodiimide-sensitive F0FrATPase Activity in fermenting Escherichia cah Abstracts, American Society for Microbiology // 102 General Meeting, Salt Lake City Utah, 2002, P. 271.

39. Markarian S., Poladyan A., Kirakosyan G., Trchounian A., Bagramyan K. Effect of diethyl sulphoxide on growth, survival and ion exphange of Escherichia coli // Lett. Appl. Microbiol., 2002, v. 34, p. 417-421.

40. Mnatsakanyan N., Bagramyan K„ Vassilian A, Nakamoto R.K., Trchounian A. F0 cysteine. bCys21, in Escherichia coli ATP-synthase is involved in regulation of potassium uptake and molecular hydrogen production in anaerobic conditions // Biosci. Rep., 2002, v. 22, p. 421-430.

41. Акопян К., Захарян Э„ Киракосян Г., Мнацаканян Н., Баграмян К., Трчунян А. Взаимосвязь протонной проводимости мембраны, мембранного потенциала и окислительно-восстановительного потенциалов у Escherichia coli // Биофизика, 2002, т. 47, с. 1064- 1067.

12. Kirakosyan G., Galstyan A., Bagramyan К., Trchounian A. Redox potential is a determinant in the Escherichia coli anaerobic fermentative growth: effects of oxidants and reducers and external pH, XVII,h International Symposium on Bioelectrochemistry and Bioenergetics, Florence, Italy // Bioelectrochem. Bioenergetics, 2003, P. 64.

13. Mnatsakanyan N.. Bagramyan K., Trchounian A., Nakamoto R. Energy transfer by a dithiol-disulfide interchange within membrane-associated enzyme and transport protein complexes, in fermenting Escherichia coli: accessible SH-groups number of membrane vesicles is increased by ATP and formate, 4,h Eur. Biophys. Congress, Spain // Eur. Biophys. J., 2003, P. 225.

14. Баграмян К., Трчунян А. Особенности структуры и функционирования формит-водород-лиазы - фермента смешанного брожения у Escherichia coli // Биохимия, 2003, т. 68, с. 1445 - 1458.

15. Mnatsakanyan N., Poladyan A., Bagramyan К., Trchounain A. The number of accessible SH groups in Escherichia coli membrane vesicles is increased by ATP or by formate

// Biochem. Biophys. Res. Com., 2003, v. 308, p. 655 - 659.

6. Bagramyan K., Mnatsakanyan N.. Trchounian A. Formate increases the F0FrATPase activity in Escherichia coli growing on glucose under anaerobic conditions at slightly alkaline pH // Biochem. Biophys. Res. Com., 2003, v. 306, p. 361 - 365.

7. Баграмян К. Формиат-водород-лиаза: новый взгляд на энергозапасающую роль фермента анаэробного брожения // Ученые записки ЕГУ, 2003, т. 1, с. 106 - 115.

8. Маркарян Ш., Баграмян К., Аракеляи В. Кинетические параметры роста Е. coli после глубокого замораживания в присутствии диэтилсульфоксида // Теорет. Эксперим. Криобиол., 2003, т. 2, с. 11-15

9. Sapra R., Bagramyan К. and Adams M.W.VV. The simplest respiratory system: proton translocation coupled with proton reduction // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2003, v. 100, p. 7345 - 7350.

0. Mnatsakanyan N., Bagramyan K., Trchounian A. Hydrogenase 3 but not hydrogenase 4 is major in hydrogen gas production by Escherichia coli formate hydrogenlyase at acidic pH and in the presence of external formate II CelJ Biochem. Biophys., 2004, v. 40, p. 253 -261.

PuitipuidjuiQ tiuipliGh Uiphpinji

LLi5i}ini{iaiqtip

<uiGqniguijJiG puinbp' Escherichia coli, iIpgGuippni 2iiiucifiü[]iujq, hJiqpnqbGuiq 3 b 4, F0Fi H+-Ubl>ujq, TrkA, [lnGGhpJi ijintuuiGiulini.pjmG, hpljpjin^-hpljuni^liqiujtiG ijinfuailjhpujmtfGhp, Pyrococcus furiosus, MBH-hlujpnqbGuiq, tGhpqJiuijli dbiuijinfunipjniG:

U2iuuiiniuGpo Gi]i)pijiu& t E. coii-\i piuriiuGpGbpnitf uiGiutpnp futfnpdiuG opuliquigüuiG-ilbpuiliuiGqGüiuG 4>hptfbGui' tfpjGuippni $>puJÖ}iGi]iujqli, tGbpqtiui dbuu|in[uhini uiniuGöGiuhuiuil}nipjniGGbpli nLunu5GuiuJiptfuiG|i: UGuitpnp (Tiilnpiluiü iquijiiuiGGbpmtf E. co!i-[\ piuquiGpGbpnui dliuii|npi[rutf t JinüiujtiG inpuiGuuinpinuijJiG htutfiuiJip, npG IjiuqüiJuig t F0Fi H+-Ub3>uiqjig, K+-inbrpui]in[unq TrkA-huiüuilpupqjig L tfpgGuippni jP^öjiGiliuiqlig: <TluipquapuiG4ui& t hun5aii]ipp limqiünq jnipuipuiGynp lini5uinGbGui]i qbpp, GpuiGg uilpntii(nipjaifl ljiupqiui{npiSuiG ajaijüuaGGbpp' nhiiopu-uininbGgfnuu] iSJiguai[iujp}i ouüninJiljnipjniGi}, pH-p, huitfuiiJipji Gbpunid tGbjiqJiiujJi i^nfuuiqpüuiG öuiGiuupuphGbpp:

Puiguihuijini^b[ t H+-llbl>-uiq]i gtiuuibjiGuij}iG liGuignpr^Gbpli ni huii4uiGuil{uiG bpljp|inL-hpliunt^tiqiujtiG mGgniilGbpfi qbpp H+-K+-uiniiujli ui2fuuiinuiGpnuI: önijg t inpi|bi, np H+-Ub3>-uiqli Foqnp&nGJi b bGpuidfiunjnpli 21-pq qfippnitf g}iuuibJiGiujliG dGuignpqG iuGhpuidb2in t tutfnptfuiG iquijduiGGbpmü U.b3>-li U dpjGuippiUi üuiuGuiljgnipjiudp H+-K+-uinüujli qnp&niGbnipjiuG huiiliup: <{iruinqbGiuq-3 ui}iuj{i iniupphp opquiGJiqiiGbptig (tnLljaip[uiuiQhp|Kj, piuljinhp}iiu Gbpjiy U uippbuiGhpJig) hJiruinqbGuiqGbpJi vnbuuilpuG huitfhüiuinnipjmGGbpp, E. coli-\1 h}ii}pnqbGuiq-3 ni Pyrococcus furiosus- )i puiqiuGpuijliG MBH-hfiryinqbGiuqii ni.uniüGuiulipnipjniGGbp[i ijinpöiupiupiuliLuG mi|jLU[Gbpfi i[hp[ni£rrnpjniGp hGiupunJnpnipjni.G t mi|b[ bGpuiqpbpn, np uiGiutpnp iquijiSuiGGbpniü uiöbgiluid }uünpnq opquiGtiqüGbpJi h[iiyinqhGujq-3 inliuiti hluipnqbGuiqGbpp Ii hbinluupuip, üp2Üujppni 2pui&JiGi2iiuqp, odiniluiö bß tßbpqliui-uiiuhbuinuiilnpnri $niGlig]uujnil:

Информация о работе

Баграмян, Каринэ Альбертовна
доктора биологических наук
Ереван, 2004
ВАК 03.00.02

Автореферат

Похожие работы