Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сопряжение переноса электронов и протонов в бактериальных фотосинтетических реакционных центрах и цитохромных bc1-комплексах

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Блох, Дмитрий Арнольдович, Москва



МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В.ЛОМОНОСОВА

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

Блох Дмитрий Арнольдович

СОПРЯЖЕНИЕ ПЕРЕНОСА ЭЛЕКТРОНОВ И ПРОТОНОВ В БАКТЕРИАЛЬНЫХ ФОТОСИНТЕТИЧЕСКИХ РЕАКЦИОННЫХ

ЦЕНТРАХ

И ЦИТОХРОМНЫХ 6сгКОМПЛЕКСАХ

03.00.04 - биохимия

Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: д. б. н. А.Ю.Семенов

Москва - 1999 г.

- 2 -СОДЕРЖАНИЕ

стр.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ..................................................................... 4

ВВЕДЕНИЕ ........................................................................................... 6

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ...................................................................... 8

1.1. Фотосинтетическая и дыхательная цепи переноса электрона хроматофоров Rb. sphaeroides ................................................... 8

1.2. Фотосинтетические реакционные центры (ФРЦ) Rb. sphaeroides ... 12

1.2.1. Структура ФРЦ .......................................................................... 12

1.2.2. Поглощение света и разделение зарядов в ФРЦ ............................... 16

1.2.3. Хинонный акцепторный комплекс (ХАК) и цикл восстановления вторичного хинонного акцептора (Qb) ............................................ 18

1.2.4. Методические подходы к изучению свойств хинонных акцепторов

ФРЦ ........................................................................................ 27

1.3. Цитохромные ¿^-комплексы Rb. sphaeroides .............................. 36

1.4. Генерация трансмембранного потенциала (А\у) ФРЦ и бс^-комплексами........................................................................ 40

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ................................... 43

2.1. Объекты исследования ............................................................... 43

2.1.1. Бактериальные штаммы ................................................................ 43

2.1.2. Культивирование бактерий ............................................................ 45

2.1.2.1. Питательные ростовые среды................................................... 45

2.1.2.2. Поддержание, хранение и контроль чистоты штаммов................ 45

2.1.2.3. Культивирование в жидкой среде и получение биомассы............... 47

2.2. Препаративные методы ............................................................... 48

2.3. Аналитические методы ................................................................ 49

2.3.1. Измерение спектров оптического поглощения .................................. 49

2.3.2. Регистрация быстрой кинетики переходных процессов ...................... 50

2.3.2.1. Светоиндуцированные изменения оптического поглощения ........... 50

2/3.2.2. Светоиндуцированные изменения трансмембранного потенциала .. 51

2.3.2.3. Источники импульсного и стаъщонарного возбуждающего

освещения ............................................................................... 52

2.3.2.4. Регистрация сигналов .............................................................. 52

2.4. Численный анализ данных и моделирование кинетических процессов.. 53

2.5. Список используемых реактивов ................................................. 54

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ ................................................ 55

3.1. Перенос электронов и протонов в ФРЦ Rb. sphaeroides................ 55

3.1.1. Выбор точечных замен аминокислотных остатков в ФРЦ .................. 55

3.1.2. Рекомбинация зарядов между Р,+ и (QaQb)* .................................. 60

3.1.2.1. Измерение кинетики рекомбинации в препаратах хроматофоров .. 60

3.1.2.2. Зависимость от рН константы равновесия L переноса первого электрона между QA и Qg ........................................................ 74

3.1.3. Электрогенный перенос электронов и протонов в ФРЦ ..................... 83

3.1.4. Кинетическая модель сопряжения переноса электронов и протонов в ХАК .......................................................................................... 93

3.1.4.1. Перенос первого электрона ....................................................... 93

3.1.4.2. Перенос второго электрона ...................................................... 91

3.2. Перенос электронов и протонов в цитохромных бс^-комплексах

Rb. sphaeroides .................................................................... 105

3.2.1. Выбор точечных замен аминокислотных остатков в ¿»«^-комплексах ... 105

3.2.2. Электрогенный перенос электронов и протонов в цитохромных

bc-i -комплексах .......................................................................... 106

3-2.2.1. Электрогенные реакции в хроматофорах, содержащих Ьс-[-

комплексы дикого типа .......................................................... 106

3.2.2.2. Электрогенные реакции в хроматофорах, содержащих

мутантные be-[-комплексы ...................................................... 110

4. ВЫВОДЫ ...................................................................................... 112

5. СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ .................................... 114

СПИСОК СОКРАЩЕНИИ

-m

н+

¿AB

km

kAP

P Pï

йд1, йА2, «Bi, «B2 ~ амплитуды кинетических фаз \|/A1, \|/A2, \|/вь VB2 Ejj - кажущийся окислительно-восстановительный потенциал среды

Е„, - стандартный потенциал полувосстановления

, H+jj- первый и второй протоны при восстановлении Qb

^АВ2 " наблюдаемые константы скорости переноса 1-го и 2-го электрона &Н2 - наблюдаемые константы скорости захвата протона в ответ на 1-ю и 2-ю вспышки

/?в2 - наблюдаемые константы скорости кинетических фаз \|/bi и \|/в2 k-Qp - наблюдаемые константы скорости рекомбинации зарядов между Р,+ и Qa" , и Р'+ и QB-

- специальная пара (димер) бактериохлорофилла

- значение рН в изоэлектрической точке белка ФРЦ

рК0х, pKRed - кажущиеся рК группы при окисленном и восстановленном QA или Qb

Q - убихинон-50 (коэнзим Qjq)

Qa. Ob ~~ первичный и вторичный хинонные акцепторы ФРЦ

Qo, Qj - убихинол-оксидазный и убихинон-редуктазный сайты Ьс^-комплекса

CAPS - З-циклогексиламино-1-пропансульфоновая кислота

CHES - 2-[циклогексиламино]этансульфоновая кислота

LDAO - лаурилдиметиламино-Ы-оксид

LH1, LH2 - 1-й и 2-й светособирающие (антенные) комплексы хроматофоров MES - 4-морфолинэтансульфоновая кислота MOPS - 3-[К[-морфолино]-пропансульфоновая кислота HEPES - 4-[2-гидроксиэтил]-1-пиперазинэтансульфоновая кисолта Tris - К(-трис-[гидроксиметил]-аминометан WT ДС

АВ

- штамм дикого или псевдо-дикого типа АСАв2 - изменения свободной энергии при переносе 1-го и 2-го

электронов

ДрК - изменение кажущегося рК группы

Дц/ - трансмембранная разность электрических потенциалов

е - диэлектрическая проницаемость среды

х - характеристическое время релаксации переходного процесса

6 - интервал времени между 1-й и 2-й вспышками света

Уаъ Ч;а2> Увъ ¥в2> ~ кинетические фазы изменений А\|/

ф - величина электростатического (кулоновского) потенциала

БХл - бактериохлорофилл

БФео - бактериофеофитин

ДМФ - диметилферроцен

ДСН - додецилсульфат натрия

МС - метиленовый синий

ТМФД - М,М,М',Н'-тетраметил-р-фенилендиамин

ферроцианид - гексоцианоферрат(П) калия

феррицианид - гексоцианоферрат(Ш) калия

ФРЦ - фотосинтетические (бактериальные) реакционные центры ФС2 - реакционные центры фотосистемы 2 растений и цианобактерий ХАК - хинонный акцепторный комплекс ЭТЦ - электронтранспортная цепь

- 5 -ВВЕДЕНИЕ *

Фотосинтетические реакционные центры (ФРЦ) и цитохромные белком л лексы фотосинтезирующих пурпурных бактерий - энергопреобразующие белки, образующие часть электронтранспортной цепи (ЭТЦ) сопрягающих мембран (хроматофоров). При совместном функционировании они осуществляют циклический (фотосинтетический) транспорт электронов. Светоиндуцированный перенос зарядов в ФРЦ и последующие (темновые) реакции в öci-комплексах сопровождаются генерацией трансмембранного электрохимического градиента протонов, служащего движущей силой синтеза АТФ (см. обзоры: Junge and Jackson, 1982; Ort and Melandri, 1982; Wraight, 1982; Cramer and Crofts, 1982). Разделение зарядов в ФРЦ сопряжено с окислением цитохрома С2, внутрибелковым переносом электронов, захватом протонов и восстановлением молекул пула убихинона до убигидрохинона. В дальнейшем происходит окисление молекул убигидрохинона цитохромными Ьс\-комплексами в процессе Q-цикла, сопряженное с восстановлением цитохрома с 2 и трансмембранным переносом протонов. Окислительно-восстановительные и протолитические превращения молекул убихинона, связанных с ФРЦ или Ъсу комплексами, являются ключевыми при циклическом переносе электронов. Принципиальным отличием свойств убихинона, связанного с белковыми сайтами, от его свойств в растворах является стабильность его промежуточных форм. Второй особенностью является регулярность окружения хинонного ядра и изопреноидной цепи в белке, тогда как в растворе это окружение стохастично. Поэтому изучение свойств убихинона, связанного с белком, позволяет получить важную информацию о функционировании мембранных энергопреобразующих белков при фотосинтезе и дыхании.

Фотосинтетические реакционные центры (ФРЦ) несерных пурпурных бактерий являются наиболее изученными объектами в биоэнергетике. Прогресс в понимании физических и химических свойств первичного (Qa) и вторичного (Qß)

* В руководстве диссертационной работой принимал участие доктор биологических наук Л.А.Драчев.

хинонных акцепторов электрона в ФРЦ обусловлен рядом существенных достижений, таких как:

(а) определение трехмерной структуры ФРЦ с разрешением 2.2 - 3.1 А;

(б) разработка сайт-специфического мутагенеза ФРЦ;

(в) разработка методов химической модификации хинонов в первичном (Qa) и вторичном (Qg) сайтах акцепторного комплекса ФРЦ;

(г) применение кинетического анализа отдельных стадий переноса зарядов в ФРЦ в ответ на одиночные и последовательные вспышки света;

(д) применение магнитных спектральных методов к изучению свойств различных состояний хинонов;

(е) использование выводов теории переноса электрона Маркуса.

Превращения убихинона в процесе двухэлектронного каталитического цикла восстановления вторичного хинонного акцептора QB ФРЦ изучались на протяжении последних 15-20 лет (см. обзоры: Шинкарев, 1990; Feher and Okamura, 1984; Okamura and Feher, 1992; 1995; Sebban et al., 1995a; Shinkarev and Wraight, 1993; Shinkarev et al., 1992). Однако детальный молекулярный механизм внутрибелкового переноса электронов и протонов в ходе цикла остается предметом дискуссий. Так, обсуждаются: роль конформационных переходов в ФРЦ, электростатическое влияние отдельных аминокислотных остатков (как близких к Qg, так и достаточно удаленных от него), структура протон-проводящей сети водородных связей (см. например: Gopta et al., 1997; Gopta et al., 1998; Graige et al., 1996; Stowell et al., 1997), a также кинетический механизм сопряжения восстановления и протонирования Qb (McPherson et al., 1993; 1994; Paddock et al., 1994).

Особенностью исследования бактериальных йс^-комплексов в фотосинтетических мембранах является возможность синхронизации популяции доноров электронов (убигидрохинон) и акцепторов электронов (окисленный цитохром с2) в ответ на импульсное освещение мембран. Кинетику реакций переноса зарядов в Ьс\-комплексе удобно изучать при помощи измерения электрохромного сдвига спектров оптического поглощения каротиноидов, связанных с антенными комплексами LH2 хроматофоров пурпурных бактерий. В течение последних 10 лет прогресс в исследовании Ъс\-комплекса был связан с разработкой точечного мутагенеза этого белка в Rb. sphaeroides и Rb. capsulatus (Crofts et al., 1991; 1992;

1995; Gennis et al., 1993). Определена трехмерная структура митохондриального Ьс\-комплекса (Crofts and Berry, 1998; Iwata et al., 1998; Xia et al., 1997; Yu et al., 1998a; 1998b). Тем не менее, многие функциональные детали переноса зарядов в Ьсг комплексе остаются неясными. Так например, перенос электронов в высокопотенциальной ветви ([Fe2S2]R-c1-C2) сопровождается выбросом протонов во внутренний объем хроматофоров, однако относительный вклад процессов переноса электронов и протонов в наблюдаемую генерацию Д\|/ остается неизвестным.

В связи с этим в настоящей работе рассматриваются кинетические модели реакций переноса электронов и протонов и образования Д\|/ при функционировании ФРЦ и Ье-!-комплекса в хроматофорах несерных пурпурных бактерий Rhodobacter sphaeroides, содержащих точечные замены аминокислот в ХАК ФРЦ и в цитохроме Ь. В работе был применен прямой электрометрический метод регистрации быстрой кинетики образования Ам/, разработанный в НИИ физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского МГУ (см.: Drachev et al., 1974; 1976; 1979; 1981; 1984; 1986а). Данный метод предпочтителен по сравнению с другими кинетическими методами регистрации мембранного потенциала, поскольку он (а) обладает существенно более высокой чувствительностью; (б) позволяет избегать стационарной засветки образцов хроматофоров в процессе измерения и достигать их полной адаптации к темноте.

Изучение процессов переноса зарядов в бактериальных ФРЦ и других электронтранспортных белках имеет большое значение при решении различных фундаментальных и практических задач в таких областях, как: (а) исследование фотосинтеза в высших растениях (см. например: Zheng and Dismukes, 1996); (б) молекулярная инженерия и синтез искусственных белков (Robertson et al., 1994; Gibney et al. 1997); (в) исследование механизмов переноса электрона в биологии (Moser et al. 1992; 1993). Изучение свойств бактериальных ФРЦ позволило разработать новую технологию получения нелинейных оптических сред и производства материалов, высокочувствительных к свету в ближней ИК-области спектра для использования в технической голографии (см. например: Arapov et al., 1995; 1996; 1997; Korolev et al., 1997). Применение направленного мутагенеза ФРЦ позволяет варьировать предсказуемым образом динамические свойства ФРЦ-содержащих оптических сред.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Фотосинтетическая и дыхательная цепи переноса электрона хроматофоров Rb. sphaeroides.

Фотосинтетическая (циклическая) и дыхательная (линейная) электрон-транспортные цепи (ЭТЦ, Рис. 1) пурпурных несерных бактерий Rb. sphaeroides образованы несколькими типами энергопреобразующих белков, расположенных в инвагинациях клеточной мембраны, образующих замкнутые везикулы (внутриклеточные мембраны; хроматофоры; см.: Кондратьева и др., 1989; Kaplan and Arntzen, 1982; Trüper and Pfennig, 1978; Niederman and Gibson, 1978).

цитоплазма

NADH/NAD+ SucH/FumH

ADP/ATP

H

+

H+

H+

H+

н2о / o2 H+

с

ПС] *<~ -

( Г\ ft ] Г

G ФРЦ D ш гГ 1 ----- IV (СОХ) 1 1 (QOX) l 1

периплазма

H+

Рис. 1. Компоненты ЭТЦ в мембране хроматофоров Rb. sphaeroides. Комплекс I (NADH-.убихинон-оксидоредуктаза), комплекс II (сукцинат:убихинон-оксидоредуктаза), комплекс III (убигидрохинон:цитохром с2-оксидоредуктаза), комплекс IV (цитохром С2-оксидаза), QOX - терминальная убигидрохинон-оксидаза.

Перенос электронов, осуществляемый белками ЭТЦ от восстановленных к окисленным клеточным метаболитам сопровождается генерацией трансмембранного электрохимического градиента протонов (А\|/ и АрН) и приводит к фосфорилированию АДФ и образованию АТФ в ходе хемиосмотического сопряжения (Самуилов и Кондратьева, 1969; Baccarini-Melandri et al., 1981; Baltscheffsky, 1978; Ort and Melandri, 1982). Дыхательная ЭТЦ хроматофоров Rb. sphaeroides включает такие мембранные белки, как NADH-дегидрогеназа, сукцинат-дегидрогеназа, цитохромный öct-комплекс и цитохромоксидаза, а также растворимый цитохром

типа с (цит. с2) и молекулы убихинона. Эти компоненты, а также протонная F0Fi-АТФаза, липидный состав и электрохимические характеристики мембран вцелом близки к митохондриальным (Junge and Jackson, 1982), что часто интерпретирут в рамках гипотезы о родственном происхождении пурпурных (серных и несерных) фотосинтитических бактерий (Rhodospirillales) и предшественника митохондрий эукариотических организмов. К особенностям электронного транспорта пурпурных бактерий можно отнести следующие: (1) наличие в фотосинтетических мембранах альтернативных терминальных оксидаз, окисляющих как цитохромом с2, так и убигидрохинон (или его аналоги, см.: Meyer and Donohue, 1995; Muntyan et al., 1997); (2) участие различных (в том числе и мембранных) белков в метаболизме соединений серы и азота разной степени восстановленности и других альтернативных доноров электронов (например, молекулярный водород) или акцепторов электронов (органические N-оксиды) (Кондратьева и др., 1989; Pfennig, 1978; Trüper, 1978; Yoch, 1978).

Фотосинтетическая ЭТЦ хроматофоров образована ФРЦ и Ьс^-комплексом, а также цит. с-) и молекулами убихинона, образующего мембранный пул. Освещение ФРЦ приводит к внутрибелковому разделению зарядов, окислению цит. генерации Д\|/ и восстановлению мембранного пула убихинона. Молекулы убигидрохинона затем окисляются Ьс\-комплексами в ходе Q-цикла (Crofts, 1985; Konstantinov, 1990; Konstantinov and Popova, 1988), при этом происходит восстановление цит. с2 и генерация А\\/ и ДрН (Baccarini-Melandri and Melandri, 1977; Crofts et al., 1983). Циклический перенос электронов является основным источником энергии при бактериальном (аноксигенном) фотосинтезе (Crofts and Wraight, 1983).

Функциональная активность дыхательной и фотосинтетической цепей зависит от условий роста бактериальных клеток и является фактором адаптации бактерий к условиям среды. Важной особенностью клеток Rb. sphaeroides является их способность к фотогетеро(органо)трофному росту в анаэробных условиях и к хемогетеро(органо)трофному росту в темноте в аэробных или микроаэрофильных условиях. В первом случае доминирует циклический, а во втором - линейный перенос электронов (Keister, 1978). Переключение между двумя типами метаболизма зависит от концентрация кислорода и интенсивность света. Регуляция этого процесса может

А

рис риЬ

■си—о-

Ьс/1 сг{ ЬсЬ р^

1 I !—О-

Ш2 (а,Р) ВС (Н)

чувств. К О2

БХл а Кар. БХл а чувств, к 02

ЯС Ш1 X

ри^

О, В А I М X

И~~Н N Н Н~1

18

1

соотношение (<2,В,А) : (Ь,М,Х)

ЬН1

1 Кар.

2 БХл а

1 Кар. 2 Ою 4 БХл а 2 БФео а

Рис. 2. Организация фотосинтетического аппарата в хроматофорах КЬ. зркаеплёез. (А) Кластер генов фотосинтетического аппарата (указаны продукты соответствующих генов). (Б) Мембранные компоненты фотосинтетического аппарата.

происходить как на генетическом, так и физиологическом и поведенческом уровнях; отметим наиболее важные из них:

(а) увеличение концентрации кислорода вы�