Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование молекулярных механизмов переноса зарядов в цитохромном bci-комплексе

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Исследование молекулярных механизмов переноса зарядов в цитохромном bci-комплексе"

РГ6 од

^ Московский ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. ЛОМОНОСОВА

Биологический факультет

На правах рукописи

УГУ ЛАВА Наталья Бидзиновна

Исследование молекулярных механизмов переноса зарядов в цитохромном bel-комплексе

03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации па соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1996 г.

Работа выполнена в отделе фотобиохимии Научно-исследовательского института физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского МГУ.

Научный руководитель: доктор биологических наук, зав.лаборатории А.Ю. Семенов

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор В.Д. Самуилов кандидат физ.-мат. наук Д.А. Черепанов

Ведущая организация: Институт биохимии имени А.Н. Баха РАН

Защита состоится « В » октября 1996 года в часов на заседании специализированного совета Д.053.05.32 по адресу: Москва, 119899, Ленинские горы, Биологический факультет МГУ, аудитория М-1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан « /Г » сентября 1996 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

М.В. Иванов

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Хемиосмотическнй принцип энергетического сопряжения окисления и фосфорилирования предполагает существование белковых генераторов электрического тока . Выяснение молекулярных механизмов образования трансмембранпой разности потенциалов (Ау) на сопрягающих мембранах является одной из центральных и наиболее актуальных задач современной биоэнергетики. Функцию преобразования энергии из одной формы в другую осуществляют мембранные белки-генераторы, перенося заряды по электрон-транспортным цепям (ЭТЦ). Одним из таких генераторов трансмембранного потенциала является убихннол.-цнтохром с-оксидоредуктаза (Ьс1-комплекс). В настоящее время установлено значительное сходство между бактериальным и мнтохондриальным Ьс^-комплексом. В связи с этим исследование бактериального Ьс {-комплекса весьма актуально для выяспения механизмов функционирования соответствующего пигмент-белкового комплекса митохондрий.

Цитохромный Ьс|-комплекс хроматофоров содержит один апонротеид с двумя темами типа Ь (высокопотенциальным - Ь^ и визкопотенциальным - Ь[), один цитохром типа с (с^) и белок 2Ре25 (Рев-центр Риске). Согласно модели цикла с работой Ьс^ -комплекса связаны два раздельных каталитических сайта : сайт X , в котором убихннол окисляется белком 2Ре28 и цитохромом Ь|; сайт С , где хшюн восстанавливается цитохромом Ь}, (в митохондриях это сайты "о" и "Г, соответственно).

В свете представления о трапемембранном расположении редокс-переиосчиков Ьс^-комплскса значительный интерес представляет изучение электрогенных стадий при переносе зарядов в комплексе. Для выяснения природы и механизмов элсктрогеипых реакций Ьс^ -комплекса был примепен прямой электрометрический метод регистрации образования Ац/ на сопрягающих мембранах, разработанный в лаборатории новых физических методов НИИ Физико-Химической Биологии им. А.Н. Белозерского МГУ. Кроме этого, остается не до конца решенным вопрос о расположении редокс-центров в Ьс(-комплексе. Не существует прямых доказательств участия Рев-центра Риске в переносе электронов в убихинол.-цитохром с-оксидоредуктазе. Эти и ряд других вопросов делают важным и актуальным исследование цитохромного Ьс^-комплекса. Изучение молекулярных механизмов переноса зарядов в белках-генераторах трансмембранного потенциала вносит значительный вклад в область классических фундаментальных исследований в биохимии.

Целью настоящей работы было выяснение молекулярных механизмов переноса зарядов на высокопотенциальпом участке цепи цитохромного Ьс^-комплекса. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать спектральные и термодинамические свойства железо-серного кластера (РеЯ-центра Риске) в цитохромном Ьс^-комплексе;

2. Использовать метод светозависимого химического восстановления цитохромов для изучения восстановления цитохрома c^ в митохондриальном Ьс^-

комплексе посредством фотовозбужденного редокс-краситсля

феназинметосульфата (ФМС).

3. Установить роль РеБ-центра Риске в процессе переноса зарядов в цитохромном Ьс^-комплексс. Изучить равновесие между железо-серным белком Риске и цитохромом с 1.

4. Выявить алектрогсниые стадии при переносе зарядов на высокопотенциалыюм участке ЭТЦ цитохромного Ьс1-комплекса.

5. Соотнести стадии фотоэлектрического ответа с топологией редокс-центров в Ьс^-комплёксе и описать схему электрогенных реакций в убихинолгцитохром с-оксидореду ктазе.

Научная новизна работы. С помощью кругового дихроизма (КД) показано, что хромоиовый ингибитор стигмателлин полностью восстанавливает РеБ центр Риске в митохондриалыюм Ьсркомплексе. Использование стигмателлина позволило впервые выявить в спектре поглощения цитохромного Ьс1-комплекса полосу, связанную с восстановленным Рев центром Риске.

В работе впервые использован метод фотохимического восстановления цитохрома С! в митохондриалыюм Ьсгкомплсксс. Показано, что нейтральная семихинонная форма красителя феназинметосульфата (ФМС-БО) является непосредственным донором электронов на цкгохром С1- Добавление стигмателлина к митохондриальному Ьсркомплексу приводило к увеличению степени светозависимого восстановления цитохрома с, посредством фотовозбужденного ФМС на 30% . На основе полученных данных посчитана величина среднеточечного потенциала Е'д для Рев центра Риске. Согласно этим расчетам РсБ-Риске находится в быстром равновесии с цитохромом С1 и перенос электрона между жслезо-ссрным кластером и цитохромом - термодинамически выгодный процесс, хотя константа равновесия реакции не превышает 2.

Для исследования электрогенных процессов в Ьс(-комплсксе был использован прямой электрометрический метод регистрации трансмембранного потенциала. Исследование хроматофоров, выделенных из мутантных штаммов НИШ, Е295(} фотосинтезирующих бактерий ШюйоЪасЬег 5рЬаего1с1е5 с точечными заменами аминокислот в цитохромном Ьсгкомплексе позволило выявить электрогеиную стадию, обусловленную депротонированием убихинола в убихинол-оксидазном сайте Ъ. С помощью светозависимого химического восстановления цитохрома С1 в митохондриалыюм (^-комплексе получены данные, согласно которым гем с4 погружен в диэлектрический слой мембраны.

В заключение предложены схемы расположения редокс-центров в цитохромном Ьсркомплексс .

Практическое значение работы. Полученные результаты существенно дополняют современные знания о свойствах и механизме функционирования цитохромного Ьс1-комплекса и могут найти применение в исследованиях дыхательной и фотосинтетической редокс-цепей. Все изложенные экспериментальные данные получены впервые. Они открывают широкие

перспективы для дальнейших исследований структурно-функциональных особенностей цитохромного Ьс^-комилекса.

Изучение КД-спектроскопин Рев-центра Риске открыло широкие возможности для дальнейших исследований железо-серного белка Риске. Принципиально новым подходом является использование хромонового ингибитора стигмателлина для полного восстановления Рев-Риске. Этот подход также в будущем позволит изучать с помощью КД-спектроскошш с высоким разрешением кинетику переноса электрона между Рев-центром Риске и цитохромом с( .

Метод светозависимого химического восстановления растворимых цитохромов, впервые использованный в работе для восстановления цитохрома с{ в митохопдриальном Ьс{-комплексе посредством фотовозбужденного редокс-красителя ФМС, в дальнейшем можпо использовать для исследования молекулярных механизмов переноса зарядов в Ь^-комплексе высших растений. Применение ФМС в качестве допора электронов для цитохрома с^ позволит в дальнейшем более широко использовать другие активируемые светом красители для инициирования восстановления и окисления различных цитохромов. Наконец, использование ФМС открывает возможности для дальнейшего более детального изучения электрогенеза, как в мнтохондриальном Ьс^-комплексе, так и в Ьд^ комплексе высших растений.

Экспериментальные данные, полученные в работе имеют важное научное значение. На основе полученных данных предложены схемы относительного расположения редокс-перепосчикоп в цитохромном Ьс ¿-комплексе. Полученные результаты можно использовать в качестве лекционного материала.

В настоящее время с помощью рептгеиоструктурного анализа расшифрована структура Ьс^-комплекса. Сопоставление данных, полученных с помощью методов, используемых в работе , с результатами рснтгеноструктурного анализа позволит в дальнейшем определить изменение диэлектрической постоянной (Дс) внутри цитохромного Ьс^-комплекса.

Исследование механизмов окисления убихинола может иметь значение для медицинских исследований различных генетических заболеваний, связанных с нарушениями окисления ()Н2-

Апробация работы. Диссертационная работа была апробирована на городском семинаре по биоэнергетике в НИИ физико-химической биологии им, А.Н. Белозерского МГУ (Москва, 1994, 1995). Результаты также были представлены на мини-симпозиуме по биохимии (Оснабрюк, Германия, 1994); на Х-ой Международной Харденовской конференции "Биологический перенос электронов и протонов" (Эшфорд, Апглия, 1994); на Х-ом Международном Конгрессе по Фотосинтезу (Монпелье, Франция,1995); на конференции "Цитохромный Ьб^комплекс- перенос электронов, транслокация протонов и редокс-рецепция" (Регенсбург, Германия, 1996); на 9-ой Европейской Биоэнергетической конференции (Лувеи-ла-Нсв, Бельгия, 1996).

Публикации. По материалам исследований опубликованы 5 печатных работ, 1 работа находится в печати.

Стриктура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения

результатов, их обсуждения, выводов, списка используемых в работе сокращений, приложения и списка цитируемой литературы. Работа иллюстрирована 2-мя таблицами и 35-ью рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Измерения спектров КД проводили на модифицированном Jobin-Yvon Mark III-S спектрофотометре, соединенном с компьютером, при комнатной температуре в 1 см кювете. Спектры были сканированы с 0.25 им интервалом. Белок (bej-комплекс) в конечной концентрации 2-4 мкМ добавляли в кювету (V=1700 мкл) со средой, содержащей 25 мМ Hepes, 2 мМ K-EDTA (рН=7.0).

Изначально bej-комплекс окисляли с помощью 10 мкМ феррицианида и записывали КД-спектр окисленного белка. Затем систему восстанавливали, добавляя 10 мМ аскорбата, либо 10 мкМ стигмателлина и записывали восстаповленный КД-спектр. Анализировали разностный КД-спектр, соответствующий разности восстановленного и окисленного состояний белка.

Кинетику индуцируемых лазерной вспышкой изменений поглощения регистрировали с помощью однолучевого дифференциального спектрофотометра (временное разрешение 100 не). Сигнал с фотоумножителя (ФЭУ-38) поступал на регистратор переходных процессов DL-1080, соединенный с ЭВМ. Для изучения фотохимического восстановления цит cj в Ьс(-комплексе использовали рсдокс-краситель ФМС. Для возбуждения ФМС использовали третью гармонику неодимового лазера (Quantel Nd YAG, 1=353 нм, полуширина 15 нм, энергия импульса 10 мДж).

Оптический спектр записывали с помощью однолучевого спектрофотометра с моыохроматором типа Bentham M300HR по ранее описанной методике (Moody and Rich,1990).

Быструю кинетику генерации трансмембраппой разности потенциалов на протеолипосомах, содержащих митохондриальный Ьсркомплекс, и на хроматофорах мутантных штаммов Rhodobacter sphaeroides GabHlllN и GabE295Q регистрировали с помощью прямого электрометрического метода (временное разрешение метода 100 не) (Drachev et al., 1989). Метод заключается во встраивании замкнутых везикул в искусственную фосфолипидную мембрану и регистрации Ду с помощью хлорсеребряных макроэлектродов обычной электрометрической техникой. Для инициирования реакций в хроматофорах использовали насыщающую лазерную вспышку (Quantel Nd YAG, Х=532 нм, полуширина 15 не).

Редокс-потенциал среды измеряли с помощью хлорсерсбряного и платинового электродов, соединенных с вольтметром В7-27/А1.

Цитохромный be (-комплекс выделяли по методике Ю, Ю, и Кинга (Yu, Yu, and King, 1974). Мутантные штаммы бактерий Rb.sphaeroides H111N и E295Q, любезпо предоставленные А.Р.Крофтсом и Р.Б.Теннисом (Урбана, Иллинойс, США), выращивали на среде Систрома в темноте.

Протеолипосомы, содержащие митохондриальнын цитохромный bej-комплекс, получали методом диализа (Raker, 1972). Получение протеолипосом с митохондриальным Ьс^-комплексом осуществлялось путем смешивания фосфолипидных липосом с препаратом белка в соотношении липид-белок 50:1. Все процедуры приготовления протеолипосом проводились при 0-4°С.

Хроматофоры из бактерий Rb.sphaeroides (мутантные штаммы H111N, E295Q) выделяли по ранее описанной методике (Самуилов, Кондратьева, 1969).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ СПЕКТРАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА FeS ЦЕНТРА РИСКЕ.

1. КД-спектроскопия.

Спектральные свойства FeS центра Риске в митохондриальном bej-комплексе были ранее изучены главным образом с помощью КД-спектроскопии (Esposti et al.,1987; Rich and Wiggins, 1992). Было показано, что цит cf в восстановленном состоянии, а также окисленные b гемовые группы в bej-комплексс не проявляют КД-свойсгва в пределах 450-520 им (Okada and 0kunuki,1970; Yu et al.,1971; Reed et al.,1978), а при восстановлении белка аскорбатом появляется широкая полоса поглощения с максимумом при длине волиы >.=500 им .

На рис.1 представлены КД-спектры окисленного феррицианидом (кривая 1) и восстановленного стигмате л лииом (кривая 2) митохондриального be f-комплекса, а также их разпостный спектр (восстановленный минус окисленный) (кривая 3) в диапазоне 450-580 нм. На разностном спектре проявляется широкая отрицательная полоса поглощения с максимумом при Х=500 им, и полуширипой -30 IIM.

Л , нм

Рис.1. Спектры КД FeS центра Риске митохондриального Ьсркомплекса. Конечная концентрация белка 4 мкМ. Среда измерения содержала 2SmM Hepes, 2мМ K-EDTA, рН=7.0, 0.05% лаурил мальтозид. 1- КД-спектр bci-комплекса в присутствии феррицианида; 2- в присутствии ЮмкМ стигмателлина; 3- разностный КД-спектр (стигмателлин-восстановленный мннус феррицианид-окисленный); 4- разностный спектр КД, полученный вычитанием спектра в присутствии феррицианида (1) из спектра в присутствии 10 мМ аскорбата (на рисунке не приведено).

Эти результаты соответствуют ранее полученным экспериментальным данным по восстановлению FeS центра Риске аскорбатом (Esposti et al.,1987; Rich and Wiggins, 1992). На рис.1, кривая 4 показан разностный спектр аскорбат-восстановленного и феррицианид-окисленного Ьсркомплекса в том же диапазоне. Видно, что добавление стигмателлина к первоначально окисленному Ьс^-комплексу проявляет те же КД-свойства, что и при добавлении аскорбата. Сравнение разностных спектров в присутствии аскорбата и стигмателлина (в обоих случаях отрицательные пики при Я.=500 нм) позволяет предположить, что стнгмателлин полностью восстанавливает FeS центр Риске.

2. Оптическая спектроскопия.

Оптические свойства Рев-Риске были изучены только для изолированного белка (Шевке е1 а!.,1964). Поскольку значения среднеточечных редокс-потенциалов Рев центра и цит с^ очень близки, то поглощение Рев-Риске при л=500 нм маскируется значительно более интенсивным поглощением цитохромов в этой же области, в связи с чем пе представляется возможным исследовать оптические свойства белка в Ьс^-комплексе. Однако теперь, когда показано (рис.1, кривая 3), что стнгмателлин полностью и очень специфически

восстанавливает Рев-кластер, возможно использовать этот подход для выявления спектра поглощения восстановленной формы железо-серного белка.

На рис.2 показано, что добавление стигмателлина к исходно окисленному препарату Ьс^-комплекса приводит к появлению максимума поглощения при Х«500 нм. Эти результаты согласуются с результатами, полученными с помощью КД-спектроскопии в присутствии стигмателлина (рис.1, кривая 3).

,002

ЙЙ .001

0

450 475 500 525 550

X. нм

Рис.2. Изменения в оптическом спектре Ьсркомллекса в области 450-575 нм, вызванные добавлением стигмателлина. 1-базовая линия в отсутствие ингибитора, полученная вычитанием двух последовательно снятых оптических спектров bei комплекса с интервалом 2 мин.; 2- разностный спектр, индуцированный добавлением 10 мкМ стигмателлина; 3- разность кривых (2-1). Конечная концентрация bcj-комплекса 1 мкМ, условия см.рис. 1.

Сравнение изменений поглощения для восстановленного аскорбатом цит с! (АА552-543) и восстановленного стнгмателлином Рев-Риске (АА502-543) позволяет определить коэффициент экстинкции для белка Риске. Амплитуда изменения поглощения восстановленного стнгмателлином Рев центра Риске (АА502-543) составляет 4% от амплитуды изменения поглощения для восстановленного аскорбатом цит с^. Исходя из значения коэффициента молярной экстинкции для цит.с| (е— 17.5 мМ"* см~1) величина б для Рев центра составляет 0.7 мМ"1 см"1. Необходимо отметить, что восстановление Рев-Риске стигмателлином является единственным способом для выявления оптического поглощения восстановленного Ре 5 центра Риске непосредственно в Ьс(-комплексе.

ФОТОХИМИЧЕСКОЕ ВОССТАНОВЛЕНИЕ ЦИТОХРОМА ci И FeS ЦЕНТРА РИСКЕ В bcj-КОМПЛЕКСЕ.

1. Фотохимическое восстаповлепие цит с\ посредством фотовозбуждеиного фспазинметосульфата (ФМС).

Импульсное освещение ФМС синим светом (300-500 нм) приводит к образованию незаряженной семихинонной формы ФМС (ФМС-SQ), которая диспропорционирует при рН выше 6, однако, этот процесс происходит значительно медленнее, чем перенос электрона от ФМС-SQ на цит с (Moody and Rich,1988). ФМС-SQ является первичным восстановителем цит с, поскольку кинетика его исчезновения совпадает с кинетикой восстановления цит с. Нами была проведена одновременная регистрация кинетшс восстановления цит Cf и исчезновения ФМС-SQ. Оказалось, что практически совпадают как кинетики обоих процессов, так и концентрации образующихся при импульсном освещении ФМС-SQ н цит ci2+-

Эти результаты указывают на одноэлектронный механизм восстановления цит cj при импульсном возбуждении ФМС, а также на то, что ФМС-SQ в условиях эксперимента является непосредственным донором электронов для цит cj.

В дайной работе метод светозависимого химического восстановления был применен для регистрации восстановления цит с^ в митохондриальном Ьс(-комплексе при импульсном возбуждении ФМС.

На рис.3 представлен индуцированный лазерными вспышками спектр изменений поглощения цитохромного Ьс^-комплекса в присутствии ФМС.

А, нм

Рис. 3. Индуцированный лазерными вспышками спектр изменений поглощения восстановленного цит с^ в митохондриальном Ьс1-комплексе в присутствии ФМС. Конечная концентрация белка 2 мкМ. Среда инкубации содержала 25 мМ Нерев, 2 мМ К-ЕИТА, рН= 7.0, 0.05% лаурил мальтозид, 0.1 мкМ цит с, 0.1 мкМ цит с оксндазу и 100 мкМ ФМС.

Из рис.3 видно, что максимум поглощения соответствует а-полосе цит С1 (^тах=552 им), а изобестическая точка наблюдается при Я= 543 им.

Рис.4,а демонстрирует кинетики светозависимых изменении поглощения в а-полосе цит с( (ЛЛ552) и в изобестической точке (ДА543). На рис.4,б нредстаилена разность этих кинетик АА552-543 •

í , мс { , мс

Рис.4. Кинетика фотохимического восстановления цит С1 в цитохромном Ьс^-комплексе в присутствии ФМС. Условия см. рис 3. а- изменения поглощения в а-полосе цит с( (при 552 им) и в изобестической точке (при 543 пм). б- разность между индуцированными вспышкой изменениями поглощения при 552 и 543 нм. Здесь и далее стрелками изображены моменты лазерной вспышки.

Из этих экспериментальных данных можно определить характерное время восстановления цит с^, оно равно приблизительно т-25 мс. Необходимо отметить, что относительно медленная кинетика фотовосстановления цит с} обусловлена тем, что в данном эксперименте была использована ненасыщающая концентрация ФМС (100 мкМ) (объяснение см. ниже).

На рис.5,а представлена зависимость степени восстановления цит С( от концентрации ФМС. Видно, что увеличение концентрации ФМС от 50 мкМ до 2 мМ приводит к увеличению степени индуцировапного вспышкой света изменения поглощения цит с(. Дальнейшее увеличение концентрации ФМС не приводит к увеличению степени фотохимического восстановления цит с^, что вероятно обусловлено интенсивным поглощением возбуждающего света редокс-красителем п объеме спектрофотометрической ячейки.

ФМС, мМ ФМС, им

Рис. 5. Зависимости степени (а) и кинетики (б) фотовосстановления цит С( в Ьс)-комплексе ог концентрации ФМС. Условия си. в рис.3.

Мы также изучали зависимость скорости восстановления цит с< от концентрации ФМС. С увеличением концентрации ФМС скорость восстановления цит С1 также растет и достигает насыщения при 2 мМ ФМС (т=1 мс) (рис.5,б).

Чтобы убедиться в том, что регистрируемые нами сигналы непосредственно связаны с восстановлснисм цит с^, мы измеряли фотохимическое восстановление цит с\ с помощью фотовозбужденного ФМС в присутствии цианида натрия, являющегося ингибитором щггохром с оксидазы необходимой для окисления цит с^, и ферроцианида калия, который восстанавливает весь цит с^. В систему были добавлены каталитические количества цит с и цит с оксидазы для того, чтобы поддерживать цит в окисленном состоянии между вспышками света. В этих условиях было показано, что цит с[ реокисляется приблизительно за 1 минуту после вспышки света (рис.7,б).

Добавление ЮмМ - ингибитора цитохром с оксидазы- в

основном предотвращало фотовосстановлепие цит с^, так как он не успевал окисляться цит с оксидазой между двумя вспышками света (рис.6).

t , MC t , MC

Рис. 6. Влияние цианида натрия на фотовосстановление цит с^ посредством ФМС. а: 1-без цианида натрия, 2- в присутствии 10 мМ КаС!^; б- разность кривых 1 и 2 (1-2). Условия см. рис.3.

Из рис.7 видно, что в присутствии 1мМ ферроциапида фотохимическое восстановление цит с{ практически не паблгодается, поскольку весь цит с{ изначально восстановлен.

< а

0.016

0.008

о.ооо

0.012

0.006-

0.000

0 ОД 10 20 t , с.

O.i ' 10 20 t , с

Рис.7. Влияние ферроциапида (Ferro) на фотовосстановление цит cj в присутствии ФМС. а: 1- без ферроцпанида, 2- в присутствии 1мМ ферроцианида; б- разность кривых (1-2).Условия см. рис.3. Кривые получены путем накопления и усреднения S индуцированных вспышкой света сигналов.

Полученные результаты могут служить доказательством того, что мы исследовали непосредственно светозависимое химическое восстановление цит с| в митохондриалыюм Ьс^-комплсксс с помощью фотовозбужденного ФМС . На нротеолиносомах, содержащих Ьс1-комплекс, были получены аналогичные результаты.

2. Равновесие между цитохромом С1 и Рев центром Риске.

Рев центр Риске является наименее полно охарактеризованным компонентом цитохромного Ьс£-комплекса. По литературным данным среднеточечный потенциал для Рев-Риске (Е'о= +280 мВ), измеренный с помощью ЭНР при низкой температуре, на 20 мВ выше такового для цнт с^ (Е'0= +260 мВ) (Клевке еЬ а1,1964). Возникает вопрос о термодинамической выгодности переноса электрона между железо-серным кластером и цит с^. Существуют определенные указания на то, что в митохондриях и в фотоскнтезирующих бактериях центр Риске является редокс-компонентом в электрон-транспортных цепях (Во\ууег е1 а1,1980, с1е Упев 1982). Однако, экспериментальные доказательства существования быстрого равновесия между Рев центром и цит с! являются косвенными. До сих пор не измерена скорость перепоса электрона между этими редокс-центрами. Это представляется на сегодняшний день технически трудным, поскольку наиболее информативный метод низкотемпературной ЭПР-спектроскоиии для исследования центра Риске не позволяет провести прямые измерения, демонстрирующие кинетическое участие белка в переносе электронов между хииол-оксидазным сайтом и цит с£. В нашей работе мы попытались более детально подойти к изучению среднеточечного потенциала Рев центра Риске.

Согласно термодинамическим расчетам, следовало бы ожидать, что приблизительно 70% электронов достигает Рев центра после светоиндуцированпого восстановления цнт с^. Известно, что хромоновый ингибитор стигмателлин ингибирует хшюл-оксидазный центр Ьс^-комплекса, который образован цитохромом Ь и Рев-Риске белком (КпаГ^ЭЭЗ). При посадке стигмателлин влияет на свойства этих белков, в частности резко повышает среднеточечный потенциал Рев-Риске (до 500 мВ), а также, как было показано в предыдущей серии экспериментов, ингибитор полностью восстанавливает центр Риске (рис.1, кривая 3). Исходя из этого, он должен предотвращать перенос электронов от цитохрома с^ на железо-серный кластер. При добавлении стигмателлина степень восстановления цит с£ должна значительно увеличиться, если имеет место быстрое равновесие между цит и центром Риске.

Как иоказано на рис. 8, добавление ингибитора к митохондриальному Ьс(-комплексу приводит к увеличению степени ицдуцированного вспышкой восстановления цит.с^ приблизительно на 30%. Аналогичные результаты получены на цитохромном Ьсркомплексе, выделенном из бактерий ЯЬ. вркае^йев.

Нами была исследована зависимость эффекта стигмателлина от концентрации добавленного ФМС. Оказалось, что при 50 и 100 мкМ ФМС эффект стигмателлина составлял 30±5% и сохранялся в течение 20-30 минут, при

большей концентрации красителя эффект уменьшался. Вероятно высокие концентрации феназинметосульфата частично инактивируют Рев центр Риске.

О 50 100 150 200

I , мс

Рис.8. Влияние стигмателляна на фотохимическое восстановление цнт С( в присутствия ФМС. Условия см. рис.3. 1- без ингибитора, 2- в присутствии 10 мкМ стигмате длина.

Из полученных данных следует, что в отсутствие ингибитора отношение цит /с после лазерной вспышки должно составлять

0.3/0.7. Согласно уравнению Нернста для внутрикомплексных окислительно-восстановительных реакций:

Еь = Е'0(Ее8) + 2.3031ГГ/лР 1ойю (Гс8ох/Ре8гес()= - Е 0(С1) + 2.30311Т/пР \ogio (с1ох / с1ге(]) (1)

Следовательно:

Е'о(РеЗ) - Е 0(С1) = 59 { 1об10 [(с*ох/с1геа) - 1ОД0 1(Р^ох/РеБге(1)1 (2),

где с}ох, С1ге(}, Ре80х, Ре8ге^- это концентрации окислешшх и восстановленных цит С1 и Рев центра Риске, соответственно.

Учитывая, что в условиях эксперимента восстанавливается лишь небольшая доля цит с! в Ьс1-комплексах (рис. 5,а), уравнение (2) может быть упрощено:

Ео(Ре8)-Е о(с1)=59{1о81о[(Ре8ге41/с1геа)]}=59[1о81о(0.3/0.7)]° -22 мВ (3)

Это означает, что величина Е'о РсЯ центра Риске не выше, как было показано с помощью ЭПР, а ниже величины Е'о для цит с^ приблизительно на 20 мВ и составляет +240 мВ. Этот результат также указывает и па то, что Рев центр Риске находится в быстром равновесии с цит с^.

Таким образом, полученные данные показывают, что физиологическая реакция переноса электрона между железо-серным центром Риске и цит с£ в митохондриальном Ьс^-комплексе является термодинамически выгодной, хотя константа равновесия этой реакции мала. Во всяком случае, этот результат хорошо согласуется с порядком расположения компонентов в электрон-транспортных цепях митохондрий и бактерий. Заметим также, что среднеточечный потенциал железо-серного кластера в цитохромном Ь^-комплексе хлоронластов также характеризуется более низким значением, чем для цитохрома { (Норе,1993).

ЭЛЕКТРОГЕННЫЕ РЕАКЦИИ НА ВЫСОКОПОТЕНЦИАЛЬНОМ УЧАСТКЕ ЦИТОХРОМНОГО bci-КОМПЛЕКСА.

1. Исследование электрогенеза в хроматофорах, выделениых из мутантных штаммов Rb.sphaeroides (GabHlllN, GabE295Q).

Для исследования электрогенных реакций в цитохромном Ьс^-комплексе в качестве объекта исследования использовали хроматофоры, лишенные высокопотснциального гема Ь},, что позволило исключить вклад реакций переноса электрона с bj па bfo, а также с b(j на Qc.

В лаборатории профессора Р.Гешшса (Университет штата Иллинойс в Урбана-Шампейн, США) были получены мутанты бактерии Rhodobacter sphaeroides, в которых с помощью сайт-спсцифического мутагенеза His-111 цитохрома b был заменен на Asn (Crofts, Gcnnis, Yun,1991). Как было показано спектральными методами, мутация привела к потере цитохрома b{j. Это подтвердило предположение о том, что His-111 является аксиальным лигаидом гема bh . При этом наблюдалось чувствительное к миксотиазолу восстановление цитохрома bj.

Для исследования электрогенных реакций в Ьс^-комнлексе мутантной бактерии (GabHlllN) применялся прямой электрометрический метод. ; Эксперименты проводились при высоких значениях редокс-потенциала

среды (£¿=+260 мВ), когда все молекулы убихинона в мембране находятся в окисленном состоянии (E0i7 Q/QH2=+90 мВ). В этих условиях под действием нечетных вспышек света образуется семихинон QB", не выходящий за пределы РЦ (Шинкарев и др.,1985; Crofts,Wraight,198S; Mulkidjanian et al.,1986). Образованный под действием четных вспышек света убихинол быстро обменивается на окисленную молекулу убихинона мембранного пула (Следь и др.,1985; Crofts, Wraight,1986), а убихинол, вышедший за пределы РЦ, может быть окислен bci -комплексом.

Как было показано ранее с помощью прямого электрометрического метода (Drachev et al.,1989) в таких условиях в ответ на четные вспышки света наблюдается электрогенез, обусловленный функционированием bct-комплекса. Этот электрогенез частично ингабируется антимицином А и полностью миксотиазолом (в присутствии антимицина А). Антимнцин-чувствительный

электрогенез обусловлен, вероятнее всего, протопированисм убихинона в хинон-редуктазнои сайте С и дополнительными оборотами Ьс(-комплекса. Миксотиазол-чувствитсльпая фаза, по всей видимости, обусловлена реакциями, сопряженными с окислением убихинола в сайте Z, включая перенос электрона между Ь| к bg,, а также, возможно, электрогенным выбросом протонов во внутреннее пространство хроматофоров (Drachev et al.,1989).

Используемые в эксперименте хроматофоры из мутантных бактерий (штамм GabHlllN) лишепы гема bj,, поэтому переноса электрона от Ь] па bfo не происходит (Crofts, Gennis,Yun,1991). На рис.9 представлены фотоэлектрические ответы на первую и вторую вспышки света (рис 9,а), а также разность этих ответов (рис.9,б), полученные на мутантном штамме GabHlllN. Разность фотоответов имеет двухкомпонентный характер. Быстрая (т=90 мке) фаза 1 (рис.9,б, кривая 3) обусловлена электрогенным протонированием вторичного хииоиного акцептора QB2_ в реакционном центре. Медленная электрогенная фаза II мутантпого bej -комплекса в отсутствие ингибиторов (рис.9,б, кривая 3) представляет собой "миксотназол-чувствительную антимицин-резистентную" электрогенпую стадию, в которой устранен вклад, обусловленный переносом электрона между Ь| и Ь^. Наличие электрогенпой реакции с т=10 мс может служить указанием на электрогенный выброс протонов в сайте Z во впутреппкда водную полость хроматофоров . Не исключен также вклад в эту фазу переноса электронов с Qz на Ь] в реакции окисления убихинола в сайте Z, однако эти связанные реакции трудно различить. Выброс одного из двух Н+-ионов должен быть неэлектрогенным за счет проекции вектора переноса электрона в ту же сторону в сайте Z. При этом гидрофобный слой мембраны пересекает атом Н, что не является электрогенной реакцией.

Л? ,мВ

ДТ.нВ

2-1

4

2-

1 -

(KC_)j*_ ICQ мс

бООмкс—jje—Tf мс

Рис. 9. Светоиндуцированные фотоэлектрические ответы хроматофоров ИЬ.

хрЬаегогёез штамма

ОаЬННШ: а-

фотоэлектрические ответы 1-на первую и 2-на вторую вспышки света; б- разность этих ответов (2-1) 3-в отсутствие ингибиторов, 4- в присутствии 5 мкМ мкксотиазола. Среда

измерения содержала 30 мМ Иерея (рН=7.5), 20 мкМ ТМРБ, 200 мкМ

ферроциапида калия,

Еь=+300 мВ.

Амплитуда фазы II составляет 8% от амплитуды фазы разделения зарядов в РЦ , связанной с образованием первичного диполя P+Qa" • Если предположить, что при выбросе 2-х протонов один положительный заряд компенсируется одним электроном, переносящимся в высокопотенциалыюй цепи в том же направлении, то амплитуда электрогенной фазы будет в два раза больше наблюдаемой. Исходя из этого, ожидаемая амплитуда должна равняться 16% от фазы, связанной с первичным разделением зарядов в РЦ.

Добавление антимицина (5 мкМ) не приводило к изменению кинетики и амплитуды фазы II, что согласуется с результатами спсктрофотомстрических исследований на мутантных хроматофорах (Crofts, Gennis,Yun,1991).

На рис.9,б, кривая 4 показана разность фотоответов на первую и вторую вспышки в присутствии миксотиазола (5 мкМ). Видно, что ингибитор сайта "Z" никак не повлиял на "хинониую фазу" (I) в РЦ, однако, наряду с подавлением электрогенной фазы II вызвал появление небольшой фазы обратного знака (фаза III). Фаза III может быть обусловлена: (а) пассивным разрядом хроматофорной мембраны либо (б) частичным депротонированием QH2 в редуктазном центре С. Для ответа на этот вопрос необходимы дополнительные эксперименты.

В качестве контроля нами был изучен мутантный штамм Rb.sphaeroides E295Q, в котором с помощью точечной мутации был заменен Глутамат 295 на глутамин. Эта замена приводит к изменению редокс-потенциала низкопотенциалыюго гема bj и замедляет процесс окисления QH2 в сайте Z в 50 раз (Gennis et al.,1993). Разность фотоответов между второй я первой вспышками света позволила выявить только хинониую фазу с характерным временем нарастания (т= 100 мке) и маленькую электрогепную фазу обратного знака. Ни антимицнн, ни миксотиазол не влияли иа фотоэлектрический ответ. Эти результаты подтверждают наличие электрогенеза, связанного с окислением QZH2 в оксидазном сайте Ьс^-комплекса.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют в пользу того, что выброс протонов при окислении QII2 в центре Z является электрогепной реакцией. Отсюда следует, что сайт Qz локализован в гидрофобной зоне белка, а следовательно, перенос электрона через FeS и цит С( на цит С2 также должен иметь электрогенный характер. При этом соответствующая электрогенная фаза должна иметь полярность противоположную прямым электрогенным фазам в Ьс(-комплексе.

2. Электрогенное восстановление цитохрома с^ в Ьс^-комплексе.

Для проверки возможного электрогенеза, сопровождающего восстановление цит с1 в системе: коллодиевая мембрана - протеолипосомы, содержащие Ьсркомплскс, был применен прямой электрометрический метод в сочетании с методом фотохимического восстановления цит посредством фотовозбужденного ФМС (см. выше).

На рис.10,а приведено светозависимое образование мембранного потенциала в такой системе. В ответ на лазерную вспышку наблюдалось быстрое

образование Ду со знаком плюс внутри протеолипосом, сопровождающееся более медленной фазой генерации Д\|/ противоположной полярности (минус внутри везикул). Фотоэлектрический сигнал уменьшался при понижении концентрации ФМС, поскольку она была ненасыщающей. При более высокой концентрации ФМС амплитуда фотоответа также снижалась из-за поглощения возбуждающего света редокс-краситслем. Добавление ферроцианида, восстанавливающего цит С(, приводило к исчезновению медленной отрицательной фазы генерации Ду и не оказывало влияния на быструю положительную фазу. На рис.10,6 представлена разность кинетических кривых в присутствии и в отсутствие ферроцианида. Кинетика образования Ду, представленная на рис.10,6, совпадает с кинетикой светозависимого восстановления цит с^, регистрируемой с помощью абсорбционной спектрометрии. Полученные данные показывают, что быстрая положительная фаза генерации Ду, наблюдаемая и в том случае, когда цит С{ восстановлен перед вспышкой (рис.Юа, кривая 2), вероятно обусловлена артефактом, связанным с импульсным фотовозбуждением ФМС. В то же время, разность кинетических кривых, представленная на рис. 10,6, отражает электрогенез, обусловленный восстановлением цит с».

ЛУ , мВ

Рис. 10. Электрогенная фаза, связанная с фотовосстановлеписм цит С1 в Ьс1-комплексе. а:1- электрогенная фаза в отсутствие ингибиторов, 2- в присутствии 10 мМ ферроцианида калия; б- разность кривых 1 и 2 (1-2). Конечная концентрация Ьс(-комплекса 2 мкМ. Среда инкубации содержала 25 мМ Нерсв, 2 мМ К-ТШТЛ, рН= 7.0, 0.1 мкМ цит с, 0.1 мкМ цит с оксидаза и 100 мкМ ФМС.

Лотично предположить, что если ФМС-опосредованное фотовосстановленис цит с^ плектрогенпо, то и обратный физиологический процесс переноса электрона от цит С( к цит с (с2)- также электрогенен. Из этого можно сделать вывод, что гем с^ расположен не на поверхности раздела фаз (белок-вода), а погружен в гидрофобную среду белка. К сожалению, в настоящее время не представляется возможным определить степень погружения

гема в гидрофобную область Ьс^-комнлекса, поскольку в искусственной протеолииосомалыюй системе не представляется возможным сопоставить амплитуду регистрируемой фазы с другими электрогенными стадиями.

3.Расположение редокс-центров на шлсокопотенциальиом участке bcj-

комплекса.

Исследования цитохромного bei -комплекса методом каротшюидного сдвига показали отсутствие электрогепеза на участке FeS - цит ci (Robertson, Dutton,1988). Заключение основывалось на том, что в присутствии антимтщна и миксотиазола не наблюдалось элсктрогепной фазы обратного знака. Для изучения возможного электрогенеза на высокопотенциальном участке ЭТЦ был применен прямой электрометрический метод регистрации трансмембрашшго потенциала (Semenov et al.,1995). Эксперименты проводились в условиях, когда FeS центр Риске, цит ct и цит С2 были восстановлены до вспышки света (Е|,< +240 мВ). В этом случае перенос электрона в bcj-комплсксе инициируется окислением специальной парьг бактериохлорофилла Р870. В присутствии антимицина и миксотиазола перенос электрона в bci-комплексе не происходил.

Поскольку величины среднеточечных редокс-потенциалов FeS центра, цит ci и С2 очень близки, то трудно отключить какой-либо центр последовательным редокс-титрованием. Единственной возможностью повлиять на редокс-состояние FeS-Риске, не затрагивая при этом цит cj и С2, является добавление хромонового ингибитора стигмателлшт, который, как известно, резко повышает значение среднеточечного потенциала для FcS-белка (von Jagow and Ohnishi,i985). С другой стороны, нами было показано (рис.1) (Semenov et al.,1996), что стигмателлин полностью восстанавливает железо-серный центр, нарушая быстрое равновесие между FeS и цит cj. Таким образом, сравнение фотоэлектрических ответов в присутствии и в отсутствие стигмателлшт, препятствующего переносу электрона между FeS и цит ci, позволяет выявить возможный электогенез на этом участке ЭТЦ. На хроматофорах Rb.sphaeroides было показано (Semenov et al.,1995), что добавление стигмателлина в присутствии аптимицина и миксотиазола при Е},= +200 мВ (т.е. когда окисление QzH2 в Ьс^-комплексе было полностью заингибировано) не влияло на генерацию Ду, регистрируемую прямым электрометрическим методом. Эти данпые согласуются с предшествующими данными об отсутствии электрогенеза между FeS и цит cj.

На основе полученных результатов и литературных данных можно предложить следующую схему расположения редокс-центров в Ьс^-комплексе (рис.11).

©

2Н +

1

<3с«—ЬН

©

2И

I

ои2^ а

\

»Ь,

« (1) е-|<»>

0.Н2 <2

<2с -—Ьь

I,

1

© (С2У

2Н +

©

\

» Ь,

Р» >- 1

С2 ) 2Н +

Рис.11. Схемы расположения редокс-це!ггров в цитохромном Ьс1-комплексе.

Исследование хроматофоров, выделенных из мутантпых штаммов ОаЬННШ и ОаЬЕ295<2, позволило заключить, что депротонирование хинола <2Н2 в сайте является электрогенным.

В высокоиотснциальной цепи Ьс^комплекса возможны следующие электрогенные реакции, связанные с переносом электронов:

(1) окисление (?7Н2 Рев-Риске белком;

(2) окисление Рев центра цитохромом с^;

(3) окисление цит с^ цитохромом с (сз).

Данные, полученные в работе (вешепоу а!., 1995) исключают реакцию (2). Электрогенная природа реакции (3) следует из результатов, представленных на рис.10. Что касается реакции (1), то ее не представляется возможным отделить от других реакций на этом участке. Учитывая все это, можно предложить две модели относительного расположения редокс-цеитров в белке (рис.11). Согласно первой (рис.11,а) <32-сайт, Рев-Риске и цит с^ погружены в диэлектрический слой белка таким образом, что перенос электрона между этими центрами происходит параллельно плоскости мембраны. В то же время перенос электрона между цит с| и с (с2) является электрогенным со знаком, противоположным знаку общего элсктрогенеза в Ьс^-комплексе. Согласно второй модели (рис.11,6) обе реакции (1) и (3) являются электрогенными, а перенос электрона в реакции (2) не сопровождается генерацией Ду. В этом случае Рев-Риске и цит с( расположены на одпом уровне, а Qz-caйт погружен глубже в диэлектрический слой белка.

Дальнейшие эксперименты необходимы для подтверждения правомерности одной из двух альтернативных моделей.

выводы

I. С помощью КД-спектроскопии показано, что хромоновый ингибитор стигмателлин полностью восстанавливает FeS центр Риске. В спектре поглощения митохоидриального Ьсркомплекса выявлена полоса с максимумом при 500 нм, соответствующая восстановленной форме FeS центра Риске. Коэффициент молярной экстинкции FeS центра Риске составляет s=0.7 мМ~1 см"» .

II. Метод светозависимого химического восстановления применен для изучения восстановления цит С[ и FeS в Ьс^-комплексе посредством фотовозбужденпого ФМС. Показано, что FeS центр и цит cj находятся в быстром равновесии, а величина средиеточечного редокс-потенциала для FeS центра составляет Е'о= +240+10 мВ, что на 30-50 мВ ниже значения Е'0, определенного с помощью ЭПР при низких температурах.

III. В цитохромном bcf комплексе хоматофоров фотоеннтезирующих бактерий Rb.sphaeroides , лишенных гема Ьь, выявлена электрогенная фаза, обусловленная выбросом протонов при окислении убихинола в сайте Qz.

IV. Показано, что фотохимическое восстановление цит cj в митохондриальном beI-комплексе- электрогенный процесс, следовательно, и перенос электрона с цит с£ на цит с (с2) также сопряжен с генерацией трансмембранного потенциала. Это означает, что гем с^ не расположен непосредственно на границе раздела фаз "белок-вода", а погружен в диэлектрический слои bcj-комплскса .

V. На основе полученных и литературных данных предложены две альтернативные схемы расположения редокс-переносчиков в высокопотенциальной цепи переноса электронов митохоидриального bej-комплекса.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Semenov A.Yu., Rich P.R. and Ugulava N.B. PMS-mediated flash-induced reduction of cytochrome cj in the mitochondrial bcj-complex.// Abstracts of the X-th Harden Discussion Meeting "Biological electron and proton transfer", Ashford, England, 1994, C5, p.66.

2. A.Semenov, P. Rich, K. Gurovskaya and N. Ugulava Charge transfer events in the cytochrome bcj-complexcs.// Abstracts of the X-th Int. Photosynth. Congress, Photosynthesis Research, 1995, S-8-04, p.13.

3. A.Yu. Semenov, D.A. Bloch, O.A. Gopta and N.B. Ugulava Elcctrogenic reactions in the high-potential segment of the cytochrome bcj-complex// Proc. of the X-th Int. Congress on Photosynt., Kluwer Acad. Publishers, P.Mathis ed., Photosynthesis: from Light to Biosphere, Vol.II, pp. 513-518.

4, Угулава Н.Б., Рич П.Р. , Семенов А.Ю. Фотохимическое восстановление цитохрома Cj и железо-серного центра Риске и митохоидриалыюм bci-комплексе.// Биохимия, G1, No 6, 1996, стр. 1071-1077.

5. A. Yu. Semenov, P. R. Rich, A. M. Arutunian, S. A. Madgwick and N. B. Ugulava Spectral and thermodynamic features of the FeS-Rieske centre in the mitochondrial bcf-complex// Abstracts of the 9-th European bioenergetics conference, Louven-la-Neuve, Belgium, Biochim.Biophys.Acta., EBEC short reports, Vol.9, 1996, M10, p.202.

6. Alexey Yu. Semenov, Peter R. Rich, Alexander M. Arutunian, Sally A. Madgwick and Natalya B. Ugulava Spectral and thermodynamic features of the iron sulfur ccnter in the mitochondrial bcj-complex// FEBS Lett., in press.