Обобщенная модель первичных процессов фотосинтеза

Беляева, Наталья Евгеньевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Обобщенная модель первичных процессов фотосинтеза
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Обобщенная модель первичных процессов фотосинтеза"

На правах рукописи

БЕЛЯЕВА НАТАЛЬЯ ЕВГЕНЬЕВНА

ОБОБЩЕННАЯ МОДЕЛЬ ПЕРВИЧНЫХ ПРОЦЕССОВ ФОТОСИНТЕЗА

Специальность 03.00.02. - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

МОСКВА- 2004

Работа выполнена на кафедре биофизики биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова.

Научный руководитель:

доктор физико-математических наук, профессор Г.Ю. Ризниченко

Научный консультант:

доктор биологических наук, член-корреспондент РАН А.Б. Рубин

Официальные оппоненты:

доктор физико-математических наук, профессор А.К. Кукушкин

доктор биологических наук Н.Г. Бухов

Ведущая организация:

Институт биохимии им. Баха РАН

Защита диссертации состоится 19 февраля 2004 г. в 15ч.30м. на заседании диссертационного совета Д 501.001.96 биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992 Москва, Ленинские горы, МГУ, биологический факультет, кафедра биофизики, ауд. «Новая».

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан 19 января 2004 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук профессор

2004-4 21193

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность. Первичные процессы фотосинтеза включают сопряженные стадии преобразования энергии, протекающие в компартментах, которые образованы тилакоидными мембранами хлоропластов. Механизмы отдельных стадий достаточно подробно изучены экспериментально и теоретически. Вместе с тем, существует проблема регуляции целостной системы первичных процессов фотосинтеза, решение которой должно быть основано на совокупности данных о механизмах отдельных стадий процессов, протекающих в системе.

(ФС2) вносят основной вклад в регистрируемую флуоресценцию. Особенности процессов ИФ и генерации обусловлены совокупным взаимодействием всех

стадий переноса электронов в ФС2, ФС1, цитохромном ¿в/комплексе и сопряженными процессами переноса протонов и других ионов в компартментах тилакоида. Для теоретического анализа результата взаимодействия этих процессов и их влияния на форму кривой ИФ, регистрируемой в эксперименте, используются методы математического моделирования.

1 Принятые сокращения: ИФ - индукция флуоресценции; ДД//+ - трансмембранная разность электрохимических потенциалов протонов; ДЧ* - трансмембранный электрический потенциал; Hi — протоны в люмене; Hs* - протоны в строме; &pH=pHs-pHi. - трансмембранная разность рЯ; ПБК - пигмент- белковый комплекс; ЭТЦ - электронно транспортная цепь; ФС2, ФС1 - фотосистема 2, фотосистема 1; РЦ - реакционный центр; КВК - кислородовыделяющий комплекс; Phe - феофитин; Chi - хлорофкллы антенны и РЦ; QAnQg- первичный и вторичный хинонные акцепторы ФС2; Рш - хлорофилл РЦ ФС2; Рш - хлорофилл РЦ ФС1; PQHi -пластохинол; АТФ - аденозинтрифосфат; ДGATF - разность свободной энергии синтеза АТФ; ГА - гидроксиламин; Fd - ферредоксин; NADP - никотинамидадениндинуклеотидфосфат.

РОС НАЦИОНАЛЬНаТ]

библиотека

1992) световых интенсивностях на интервале времени от 0 до 0.5 с. Модели, которые можно назвать обобщенными, не детализируют процессы в пределах одного комплекса, а рассматривают перенос электрона между ФС2 и ФС1. Это позволяет описать кинетику ИФ, а также анализировать влияние цикла Кальвина - на ход индукции флуоресценции на временах больше секунды (Караваев, Кукушкин 1993). Известны также работы по моделированию светоиндуцированных потоков протонов и ионов, позволяющие описать кинетику формирования Д^Р (Van Kooten et al. 1986), либо ДpH (Вершубский и др. 2003) либо ДДН+ (Cruz et al. 2001).

В настоящей работе мы исходили из того, что полное кинетическое описание начальных стадий фотосинтеза возможно лишь в рамках единой модели, описывающей перенос электронов, процессы трансмембранного переноса ионов и генерацию светоиндуцированного ДД//+.

Цели и задачи исследования. Основная цель работы - разработать обобщенную модель кинетики первичных процессов фотосинтеза для описания индукционных явлений флуоресценции и генерации , наблюдаемых экспериментально.-.

Для достижения этой цели решались задачи:

1) Дать полное описание процессов переноса электрона в ФС2, ФС1, цитохромном комплексе и процессов сопряженного трансмембранного переноса протонов и

противоионов, синтеза-гидролиза АТФ в комплексе АТФ синтазы с учетом буферных свойств люмена и стромы. Проверить адекватность полной модели по ее соответствию кинетическому ходу экспериментальных кривых ИФ как на малых (микросекунды), так и на более длительных (секунды) временах при различных световых интенсивностях.

2) В рамках единой модели учесть процессы ИФ, формирования , включив в модель в явном виде генерацию Д*Р и ДpH и их влияние на реакции переноса заряда.

3) Дать описание полного цикла функционирования ФС2, рассмотрев процессы разделения зарядов, стабилизации электрона и переноса его в пул хинонов. Определить временную область и диапазон световых интенсивностей, в которых применима модель изолированной ФС2.

Научная новизна. На основе детального рассмотрения механизмов первичных процессов, протекающих в компартментах хлоропластов и участвующих в создании , разработана обобщенная модель первичных процессов фотосинтеза. Дано

количественное описание семейства кривых индукции флуоресценции и процессов генерации Дрн*, наблюдаемых при действии света от низких до высоких интенсивностей. Найдены значения констант переноса зарядов, которые не могут быть определены в прямых экспериментальных измерениях. Результаты расчетов в модели выявляют вклады отдельных стадий в ИФ при разных интенсивностях света, роль ФС2 при высоких интенсивностях, цитохромного комплекса, ФС1, ДЧ* и переноса ионов при низких. Определены количественные параметры влияния Д*Кна кинетику ИФ. Путем анализа модели характерным стадиям кинетических кривых ИФ удается сопоставить соответствующие кинетики редокс-состояний в процессе переноса электрона, генерации трансмембранных потоков ионов, образования и

Практическая значимость. Результаты анализа обобщенной модели позволяют проводить определение констант отдельных стадий переноса электронов и ионов, протекающих в конкретных экспериментальных условиях при воздействии света различной интенсивности и под влиянием ингибиторов. Модель позволяет выявить отдельные стадии фотосинтетических процессов, которые чувствительны к модификациям условий среды (интенсивное освещение, голодание, вредные экологические воздействия). Модель тилакоида может быть использована для преподавания по курсам «Фотосинтез» и «Математическое моделирование в биологии».

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Результаты работы представлены на IV Съезде Общества физиологов - растений. России (Москва, 1999); на 2-м Съезде биофизиков России (Москва, 1999); на 3-м Съезде фотобиологов России (Воронеж, 2001); на 8-10 конференциях «Математика. Компьютер. Образование.» (Пущино, 2001,2003, Дубна 2002); на конференции «Первичные процессы фотосинтеза» (Пущино, 2003). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, главы 1 — обзора литературы, главы 2 - описания модели, глав 3, 4 - описания и обсуждения результатов моделирования, выводов, списка литературы.

ФОРМУЛИРОВКА МОДЕЛИ.

Разработанная модель первичных процессов фотосинтеза описывает события, происходящие в трех компартментах хлоропласта - строме хлоропласта, тилакоидной мембране и люмене тилакоида. Схема моделируемых процессов представлена на рис.1.

Светоиндуцированный перенос электронов в мультиферментных мембранных комплексах (ФС2, ФС1, цитохромный, Ьв/ комплекс) и сопряженные процессы активного и пассивного переноса заряда (подвижные переносчики, АТФ синтаза, утечки протонов и противоионов, буфер протонов) формируют на мембране электрохимический градиент протонов ДДн», имеющий электрическую (ДЧО и

концентрационную (Др//) составляющие. Как основа для моделирования выбраны экспериментальные данные по индукции флуоресценции и ДД//» (см. вставки рис. 1).

Рис.1. Общая схема процессов, рассматриваемых в комплексной модели первичных процессов, фотосинтеза. ФС1, ФС2 - фотосистемы. 1 и . 2, bf - цитохромный bef комплекс, Chi - хлорофилл антенны, Peso и Р700 - пигменты реакционных центров фотоситем 2 и 1. Qa - первичный хинонный акцептор электронов ФС2, Ь| и Ьь - низко-и высокопотенциальный.гемы• цитохрома b, FeSu -железосерный. центр Рйске, f -цитохром f, FeSi - акцепторный комплекс ФС1, PQ - пластохинон; PQH2 -пластохинол; Fd - ферредоксин, Рс - пластоцианин. R-COO" - буферные группы. Знаки «+» и «-» показывают,. что в результате светоиндуцированных процессов люмен тилакоида заряжается положительно, а строма хлоропласта - отрицательно. Жирные стрелки обозначают, кванты света и флуоресценции. Тонкими стрелками показан перенос электронов по цепи электронного транспорта и потоки ионов Н\ К* и СГ после включения освещения. На вставках.приведены: (1)схема кривой индукции флуоресценции Хл а с общепринятыми обозначениями фаз; (2) схема кривой индукции ДЧ^Г). Стрелкой на оси абсцисс показан момент включения постоянного освещения.

Модель является кинетической и представляет собой систему обыкновенных дифференциальных уравнений для концентраций метаболитов как функций времени:

(1)

X/ - концентрация ьго метаболита системы, мМ; Упр(.Х,) и - суммарные

скорости его производства и потребления, мМ/с. Способы описания скоростей реакций в (1) соответствуют различным механизмам моделируемых процессов.. Мультиферментный комплекс включает переносчики электронов, редокс-состояния которых определяют набор кинетических состояний комплекса. Переменные при этом имеют смысл вероятности ьго состояния комплекса, умноженной на общую концентрацию данного комплекса в системе. Перенос электрона от ПБК на подвижный переносчик описывали по закону действующих масс с бимолекулярными константами скоростей реакций. Для моделирования хлоропластного комплекса АТФсинтазы типа применили выражение скорости АТФ-синтазной реакции,

выведенное для минимальной кинетической схемы синтеза-гидролиза АТФ (Холоденко 1988) и включающее зависимость как от АСЛТР, так и от компонент (ДЧ7 и ДрН).

Пассивные утечки ионов калия, хлора и протонов через мембрану тилакоида моделировали, используя аналитические выражения, принятые для описания транспорта ионов через канал для трехбарьерного механизма (МкМк 1974). Буфер протонов компартментов люмена и стромы описывали реакциями ассоциации -диссоциации для трех протон- связывающих групп. Изменение электрического потенциала в модели определяли согласно уравнению: {сЛЩхЩА ¥0/Л)=у(<?/„»,™) - \'((1,,Гпп,а) (2)

ст - удельная емкость мембраны, Ж - постоянная Фарадея; v(qs) — односторонние

потоки зарядов для ионов в люмене и строме измеряемые в мМ*с-1 .

Каждую стадию переноса электрона характеризовали изменением среднеточечного редокс- потенциала, Для реакций переноса электрического заряда через мембрану учитывали влияние локальных электрических полей и трансмембранного электрического потенциала (ДЧ7):

"%Г' ^т - разность свободной энергии переноса заряда в отсутствие приложенного электрического поля. - степень электрогенности - определяет, какая доля от общего

значения ДЧ* влияет на данную реакцию (Reynolds et al. 1985).

Численное решение системы дифференциальных уравнений (1) проводили в пакете SCAMP,' специализированном для расчетов задач химической кинетики.

—ь*

г I

г j

сы

Phe

Ga, О.

сы*

Phe Qa

z j

г«

сы +

Phe ~

Q\ Q*

Chl Phe Сл"

O.2'

"l >

Chl Phe Qa'

Q.2'

Chl* Phe

e.2-

Chl +

Phe' Q<

e.2-

PQH,

r 2H»

PQHj

V22

PQH -

jll

Chl Phe Qa

Chl* Phe Qa

Si.

Chl ' Phe" Ол

Chl 4

Qa'

pqh2

«L*

г гн»

pqhj

li-

Chl Phe Qa'

* PQHj gt

; * 2H\

v27

PQHj

СЫ» Phe

QA'

CM ■ Phe'

QA'

7* PQ 36

Chl 1 Chl* Chl * Chl * V Chl Chl* Chl +

Phe Phe Phe' Phe Л .. Phe Phe Phe '

Qa Qa -- Qa -»-- Qa' Qa' Qa' Qa '

Св Q» e„ С. C. Q.

Chl Phe Qa

Q.-

V2 У*

Chl* Chl + Chl +

Phe Phe' Phe

Qa -- Qa Qa~

С." o.- Й."

t—

JLl

Chl Phe Qa~

Q.-

2±-

Chl* Phe Qa' 0."

Chl + Phe~ Qa~

a.-

k................—................—...—...—...—.—------------

■ i

Рис.2. Схема каталитического цикла фотосистемы. 2. Каждый прямоугольник представляет собой одно из кинетических состояний. ФС2, определяемое • редокс состоянием входящих в него переносчиков - электрона. Затененными показаны состояния, способные к испусканию квантов флуоресценции. СМ - весь хлорофилл ФС2, включая пигменты. антенны и пигмент реакционного центра Р680; РНе -первичный акцепторэлектронов феофитин; Ол и бв - первичный и вторичный хинонные акцепторы. Р() - пластохинон; РОНг - пластохинол; И С - протоны, выделяемые в люмен, Н£ — протоны, поглощаемые • из стромы тилакоида. Пунктирными стрелками показаны быстрые (с характерным временем менее 0.1 мс) стадии цикла, сплошными стрелками - медленные (с характерным временем не менее 1 мс) стадии, жирными стрелками - световые стадии. Цифры рядом со стрелками соответствуют номерам реакций, буквы над прямоугольниками (х,, я, а, #, »=1, -Л) -обозначениям переменных модели.

РЕЗУЛЬТАТЫ МОДЕЛИРОВАНИЯ и ОБСУЖДЕНИЕ. РЕЗУЛЬТАТЫ. ПОЛУЧЕННЫЕ В МОДЕЛИ ИЗОЛИРОВАННОЙ ФС2.

Описание модели изолированной ФС2. Одной из поставленных задач было описание особенностей быстрой ИФ, регистрируемой экспериментально. Этим обусловлено подробное модельное рассмотрение процессов переноса электрона в ФС2.

Кинетические состояния ФС2 (рис.2) определены состоянием четырёх включенных в ФС2 переносчиков электрона: хлорофилла Рб80. феофитина (Phe), первичного (Qa) и вторичного (Qb) хинонных акцепторов. На схеме введено обозначение Chi для всех пигментов антенны и РЦ ФС2, включая Рбво, так как в модели использована концепция быстрого (за времена -пс) экситонного уравновешивания возбуждения по всему пулу пигментов. Столбцы соответствуют номерам, а строки - типам кинетических состояний ФС2 Сайт связывания пластохинона может быть пустым

или занятым вторичным хинонным акцептором который может быть не восстановлен нести один или два электрона.

После темновой адаптации в комплексе ФС2 заполнены состояния xi и g 1, между которыми устанавливается равновесие. При включении света последовательности реакций (1-4; 8-11; 28-31; 15-18) приводят к стабилизации электрона на Q/Г . Вслед за возбуждением пигмента (Chi*) происходит первичное разделение зарядов, перенос-электрона на донирование электрона от КВК на с выделением одного

протона в люмен. Повторное возбуждение Chl и разделение заряда в закрытых РЦ (реакции 5-6, 12-13, 19-20, 32-33) приводит к заполнению 7-х форм (Phe~QÄ~). Для форм

возможен также перенос электрона от на с образованием состояний (реакции 7 и 14). В состояниях может происходить высвобождение

пластохинола (PQHj) (реакции 21-27) с поглощением двух протонов (Hs*) из стромы хлоропласта и образованием состояний gi с пустым Qb -сайтом, связывание с которым пластохинона PQ (реакции 34-40) приводит к образованию состояний Xt, что и замыкает каталитический цикл ФС2. Модель ФС2 рассматривает в качестве закрытых РЦ (Qa~) полный набор состояний с 4-х по 7-е.

Переход Chi в возбуждённое состояние Chi* задавали световой константой kL^k/, /=1,5,8,12,15,19,28,32. Количество попаданий квантов света в РЦ в секунду kL=1500 с-1 сопоставляли интенсивности света (600нм) 1000 Вт/м2. Обратный процесс распада Chi* происходит с испусканием квантов флуоресценции (константа флуоресценции

Выход флуоресценции вычисляли как сумму концентраций флуоресцирующих состояний ФС2, умноженную на отношение констант флуоресценции и световой: Р = к1/к1(.Х2 + у1 + 12 + 82+хь + уб + гб + 8б) ' (4)

Рис.3, (а) Экспериментальные кривые быстрой ИФ Хл а, измеренные для листьев Риит хаПуип, прошедших темновую- адаптацию и освещенных светом- (650нм) интенсивностью 12 Вт-м""2, 600 Вт-м"2, и 600 Вт м*2 в присутствии БСМи. Цитируется по (ЭигЬе! е! а1. 1998). (6, в,г) Результаты расчетов в модели ФС2. (б) ИФ, рассчитанная для уровней освещенности 20 Вт-м~2и 800 Вт-м"2 (£¿=30 и 1200 с"1) - кривые 2 и 1. Для. ¿¿=1200 с"1 рассчитаны концентрации различных форм закрытых состояний РЦ ФС2: (вл'вв) ~ 3, (&Г ) - 4, «За'(За') - 5, (Сл~()а2~) - 6; и степень окисленности пула хинонов - 7. (в) Для ¿¿=1200 с"' даны кривые ИФ: без дополнительных воздействий -1; при блокирования реакций ■ переноса на (2В - 2, при введении дополнительных реакций взаимодействия с ОСМ11 в ()в сайте - 3. (г) Теоретические кривые ИФ (1,2,3) и концентраций закрытых РЦ (4,5,6), содержащих окисленный хлорофилл РЦ (Рбяо*(}л~) при ¿¿=1200 с"1: контроль ([//¿+]=0.0001мМ) - 1,4, рассчитаны при уменьшении константы донирования от КВК - 2, 5, при увеличении концентрации. протонов в люмене до [//¿+]=0.001мМ - 3,6.

В описаниях реакций модели изолированной ФС2 учтена зависимость от ДЧ*, введены концентрации протонов в строме ([Я$+]) и люмене ([Я^]), но эти величины рассматриваются как параметры. Повторное окисление PQHt описывали одной реакцией (41). Для формализации процессов схемы ФС2 задавали матрицу скоростей переходов между состояниями комплекса и получали систему дифференциальных уравнений (1) для 30 переменных ФС2.

Моделирование ИФ при различных интенсивностях света. В эксперименте особенности быстрой фазы ИФ зависит от интенсивности света. Для листьев in vivo, как показано на рис.3а (Stiibet et al. 1998) при низкой интенсивности характерны O-I-P-уровни (12 Вт/м2 ), а при высокой - О^-1^-уровни (600 Вт/м2).

. Модель ФС2 адекватно описывает O-J-I-Р-кинетику для высокой световой интенсивности (рис.Зб, кривая 1, kL=1200 с-1) и позволяет сопоставить особенностям быстрой ИФ ход заполнения 5-х форм закрытых РЦ с различными редокс- состояниями QB (кривые 3,4,5,6). Стадия J на временах порядка ~1 мс соответствует локальному максимуму закрытых РЦ без электрона на и с пустым - сайтом -

кривые 3,4. Подъем от J уровня до стадии I связан с заполнением форм, содержащих один и два электрона на - кривые 5,6. Стабилизация ИФ на стадии I на временах ~10 мс обусловлена переносом электрона на подвижный пул - кривая 7 (степень окисленности пула PQ). Выход на стационарный уровень максимума Р происходит за -100 мс и сопровождается максимальным накоплением закрытых РЦ с преобладанием форм zs , содержащих два электрона на QB2' - кривая 6. Таким образом, модель ФС2 описывает O-J-I-P- паттерн высокой световой интенсивности, объясняя его процессами, происходящими в пределах ФС2, что согласуется с выводами, полученными экспериментально (Neubauer, Schreiber 1987; Stiassei et al. 1995).

Однако, при малых интенсивностях света результат такого рода расчета ИФ (kL=30 с-1,3б, кривая 2) не соответствует экспериментальному (3а, 12 Вт/м2 ). Ниже мы покажем, что ход ИФ при низкой интенсивности света, можно описать, лишь учитывая процессы, протекающие в других комплексах, а также потоки ионов через мембрану. Влияние на ИФ ингибиторов и изменений рН было экспериментально изучено при высокой световой интенсивности (Neubauer, Schreiber 1987). Соответственно этому, проводили моделирование, выбрав основой для сравнения при вычислении

теоретическую кривую ИФ номер 1 для кЬ=1200 с-1 на рис.Зг. Кинетические изменения флуоресценции на быстрой стадии ИФ и заселенность форм закрытых РЦ (кривые 4,5,6), с окисленным хлорофиллом РЦ (.Pш*PheQ^'), рассчитаны как при уменьшении константы скорости донирования электрона от КВК (кривые 2,5), что имитирует ингибирующее воздействие гидроксиламина (БШуЛеу, УгесЪпЬег* 2001), так и при понижении величины параметра рН в люмене (кривые 3,6). Видно, что увеличение заселенности форм с окисленным хлорофиллом РЦ (Рбво^ЛейО (от 4 к 5) коррелирует с понижением флуоресценции на всех стадиях ИФ (от 1 к 2).

Рис.4, (а) Эксперимент, воздействие ионофоров на кривые ИФ тилакоидов, обработанных 0.1 мМ ГА и суспендированных в 0.1М К*- содержащей среде, (1)без добавок; (2) в присутствии 2/лМ вапиномицина и 1/¿M нигерицина. (Bulychev, Vredenberg 2001): (б) Теоретические кривее (£¿=900 с"1), рассчитанные при моделировании двух-уровней мембранного потенциала - ДУ=0 (кривые 1,3,5) и Д¥=200мВ (кривые 2,4,6). Даны: ИФ - 1 и 2; концентрации закрытых состояний с окисленным хлорофиллом РЦ {P(,m*PheQ¿) - 3 и 4; с восстановленным Qg~ - 5 и 6.

Влияние диурона на ИФ. Кривая 1 («контроль») на рис.Зв рассчитана для тех же значений параметров, что на рис.Зб, при световой интенсивности kL= 1200c-1. Моделирование воздействия диурона посредством блокирования переноса на QB, как принято в (Stiibet et al. 1998; Lazar 2003), описывает O-J=P- паттерн с более высоким уровнем Р- максимума, чем в «контроле» (3в , кривая 2). При введении в модели ФС2 дополнительных реакций взаимодействия с диуроном в QB- сайте можно моделировать воздействие переменной концентрации диурона и описать экспериментальную «диуроновую кривую» (За, DCMU) с главным максимумом пониженным до величины I- уровня (Зв, кривая 3, моделирование [DCMU]=10jxM).

Воздействие потенциала на. характеристики ИФ. Ряд переходов на схеме функционального цикла ФС2 (рис.2) соответствуют переносу заряда перпендикулярно плоскости мембраны, то есть являются электрогенными стадиями. Например, стадии переноса от хлорофилла РЦ на феофитин, а затем на QA~ характеризовали (см. 3) суммарной степенью электрогенности, равной 0.8, при полном переносе электрона через всю мембрану. Постоянный уровень потенциала мембраны задавали величиной параметра ДЧ^О (3). Это позволило исследовать действие потенциала на тилакоидной мембране на процессы переноса электрона в ФС2, определяющие особенности быстрой фазы ИФ.

Влияние ДЧ^О на J-I стадии ИФ. В эксперименте (Bulychev, Vredenbelg 2001) увеличение уровня ИФ на малых временах (1+20 мс) и снижение уровня главного максимума (100 мс) ИФ (рис.4а) наблюдалось при К - зависимом подавлении ДЧ* в присутствии валиномицина. Фронт ИФ «запаздывает» при воздействии потенциала ДЧ^О, и модель ФС2 адекватно описывает и объясняет этот эффект. На рис.4б кривая 1 дает рассчитанный ход ИФ для ДЧ^О («контроль»), а кривая 2 - при ДЧ'=200мВ. Появлению перегиба на J-стадии ИФ предшествует во времени образование локального максимума заполненности 4-х форм, в которых электрон перенесен на а хлорофилл РЦ окислен (Pbm*PheQA~). Количество этих форм увеличивается при нарастании ДЧ* (от кривой 3 к 4), приводя при к замедлению появления закрытых РЦ, что видно из

сопоставления кривых 5 (ДЧ^О) и 6 (ДЧ/=200мВ), которые представляют сумму закрытых РЦ с восстановленным

Влияние ДЧ' на величину максимальной флуоресценции для ИФ. В модели изолированной ФС2 интенсивность флуоресценции характеризуется монотонным возрастанием до стационарного состояния Р- уровня на кривой ИФ. При этом достигается максимальная заполненность закрытых РЦ (восстановленность ФС2)

которая зависит от

интенсивности света, превышая 90% для kL>1000 с -1.

В эксперименте (Dau, Sauer 1991) при разной интенсивности света измеряли максимальную величину флуоресценции, определяя зависимости относительного

изменения выхода флуоресценции от потенциала,

создаваемого «солевым ударом». В диапазоне значений потенциала от -70 мВ до + 165 мВ и для разных световых интенсивностей получены линейные зависимости Д/7^ = /(ДЧ,,А£.). Известны результаты другого экспериментального подхода (Би1усИеу & а1. 1986) (рис.5а), когда симметричные изменения флуоресценции (кривая 2) для одинаковых по величине и разных по знаку сдвигов Д*Р (положительного или отрицательного в люмене) переходят в асимметричные в условиях воздействия БСМУ

(кривая 1) или ГА (кривая 3).

Рис.5, (а) Изменения флуоресценции хлорофилла хлоропластов мха Anthoceros, вызываемые пропусканием тока различной полярности: 1- в присутствии lCtyiM диурона, 2- контроль; 3- в присутствии 1 мМ гидроксиламина и 0,1 мМ метилвиологена. На нижней кривой дана диаграмма импульсов тока; отклонение вниз от нулевого уровня соответствует отрицательному смещению мембранного потенциала. Стрелкой отмечен момент включения света. Цитируется по (Bulychev et al. 1986). (б,в) Теоретические зависимости относительных приращений флуоресценции от потенциала на стационаре,- (б) Кривые 1 ,2 ,3 - световые интенсивности принимают значения iti^4000,400 ,40 с"' соответственно, (в) Для света средней интенсивности (£¿=400 с"1) воздействия потенциала моделировали: 1 - для параметров модели ФС2, задающих воздействие концентрации диурона 10/JM; 2- для контроля, 3- при уменьшении константы скорости донирования КВК от к03=5000 с-1 до 250 с"1.

В модели изолированной ФС2 стационарные зависимости относительного изменения выхода флуоресценции AF / F = f{i^¥,kL) рассчитали в интервале значений Д¥ от -150 мВ до +150 мВ для различной величины световой константы kL. Оказалось, что существует диапазон средних световых интенсивностей (200 с-1>кЬ<600 с-1), в котором зависимости AF/F = /(ДЧ*) близки к линейным, причем при нарастании kL (рис.5б от кривой 3 до 1) флуоресценция в меньшей степени зависит от ДЧ^О. Эти результаты модели совпадают с экспериментальными (Dau, Sauer 1991). При малой и высокой световой интенсивности, для kL<200c-1 и kL>600c-1,

модельные зависимости Д/"- / = /(ДЧ*. кЬ) становятся нелинейными. Кроме того, при кЬ=400 с-1 (рис.5в) исходная линейная зависимость ДР//1, =/(ДЧ^ (кривая, 2) переходит в нелинейную, при воздействии БСМи (кривая 1) либо уменьшении донирования электрона в ФС2 от КВК (кривая 3). Такой результат качественно совпадает с экспериментальным (Би1усИеу е^ а1. 1986) (рис.5а). Как видно при действии БСМи флуоресценция может только уменьшиться (кривая 2), а при добавлении ГА -только увеличиться (кривая 3), в то время как изменения флуоресценции на исходной «контрольной» кривой симметричны. Асимметричные, изменения могут быть связаны со степенью восстановленности ФС2, которая зависит от интенсивности света либо от действия диурона.

Из расчетов следует, что при увеличении потенциала всегда происходит перераспределение заселенности различных редокс-состояний РЦ, при котором уменьшается относительное количество форм, содержащих электрон как на Рке~, так и на б/ (7-е формы в модели ФС2). Такой характер воздействия ДЧ* на заселенность редокс- состояний ФС2 особенно проявляется при повышении световой интенсивности и объясняет характер нелинейности зависимости ДР/Р = /(ДЧ',££,). Таким образом, проведенное моделирование процессов ФС2 позволило получить описание быстрой фазы. ИФ на высокой световой интенсивности и объяснить воздействие ДЧ' на кинетику ИФ. Однако, таким способом мы не можем описать процессы тушения флуоресценции после достижения ИФ максимального уровня (на временах больше 1 сек). Кроме того, невозможно описать ход ИФ при низких интенсивностях света, поскольку при этом перенос электрона в ФС2 не является узким местом, и поэтому необходимо описать процессы переносов электронов на следующих участках ЭТЦ - цитохромном Ьв/ комплексе, ФС1. В связи с этим в дальнейшем в общую модель были включены процессы с участием комплексов ФС2, ФС1, Ьь/ а также формирования светоиндуцированных и за счет переноса протонов и других ионов через мембрану.

ОБОБЩЕННАЯ КОМПАРТМЕНТАЛЬНАЯ МОДЕЛЬ ТИЛАКОИДА. Структура модели.

Изолированная модель ФС2 и потоки ионов. В описанную выше модель ФС2 включили следующие процессы изменения концентраций протонов и противоионов в

компартментах стромы и люмена: протолитические реакции ФС2 в £?в--сайте и в КВК; пассивный перенос ионов (НК*, СГ) через мембрану; реакции буфера протонов в люмене (Н¡.*) и в строме (Я$+); потребление ДД«» в АТФазной (С/^ - С/'";) реакции. Тем самым, от расчетов в модели изолированной ФС2, когда ДЧ" задавали в качестве параметра, переходим к переменной величине ЛЧ'(Г), которая в каждый момент времени определяется совокупностью значений переменных, описывающих изменения концентраций протонов и противоионов.

Блок цитохромного ¿в/ комплекса включает перенос электронов от Р(2Нг, восстановленного на стромальной стороне ФС2 согласно схеме процессов, называемой Q-циклом (рис.6).

После восстановления в ФС2 пластохинол РС^Нз диффундирует в мембране (реакция 41). При окислении РС^Нг в люменальном сайте Ь«/ комплекса один электрон

поступает на железосерный центр Риске (высокопотенциальный путь), другой - на окисленный гем • ¿>/ (низкопотенциальный путь). Электрогенными полагали стадии: (1) выделение двух протонов в люмен (реакции 43-48), сопутствующее окислению Р()Нг до РО, (2) поглощение двух протонов (Я$+) из стромы (реакции 55-60) в стромальном сайте, (3) трансмембранный перенос электрона от гема Ь/ к окисленному высокопотенциальному гему Ън (реакции 61-63). Исходная модель Ьь/ комплекса была редуцирована с сохранением трех электрогенных стадий:

Последовательное включение блоков ФС2+потоки+(АТФ-аза)+(Ьв/комплекс) позволяет перейти от моделирования процессов в изолированной ФС2 на интервале времени до 1с, к расчету теоретических кривых, характеризующих процессы генерации и потребления ДДЯ. на временах до 2 с. Включение в обобщенную модель

блока ФС1 даст возможность выявить влияние на ИФ процессов как линейного, так и циклического транспорта электронов.

Рис.7. Схема процессов переноса электрона в ФС1. Р700 - хлорофилл реакционного центра. Ре5г и Ре801, Й' и Р<1°\ Рсг и Рсох - акцепторный комплекс ФС1, ферредоксин и пластоцианин в восстановленном (г) и окисленном (ох) состояниях. Обозначения РБ!,, 1 = 1, 2,... 5, соответствуют переменным модели.

Блок модели ФС1 включает 5 возможных кинетических состояний ФС1 пигмента реакционного центра Р700 и акцепторного комплекса FeS. Первичный и вторичный акцепторы и а также железосерные кластеры рассматривались как единый акцепторный комплекс, поскольку перенос электрона по цепи Ао - А( - Бх осуществляется очень быстро (за времена порядка 10-12 - 10-9 с) (BIettel 1997). Предполагав, что комплекс акцепторов может находиться в двух состояниях - окисленном Ре50,< и восстановленном Ре5г. Образование возбужденного состояния Р700* приводит к разделению зарядов (реакции 68,69) и формированию состояния Распад этого состояния ФС1 происходит либо процессах

донирования электрона от пластоцианина на окисленный пигмент либо

восстановления ферредоксина акцепторным FeS комплексом (реакции 70,73 и 71,72).

Итак, в рамках единой модели тилакоида объединены блоки ФС2, потоки ионов, АТФ-аза, Ьб/ комплекс, ФС1. Подробное описание каждого из блоков дано в работах (Лебедева и др. 2000; Лебедева и др. 2002). Для 67 переменных обобщенной модели тилакоида получили систему дифференциальных уравнений (1). Для моделирования изменения, состояния фотосинтетической системы при включении освещения необходимо было выбрать такие начальные значения переменных, которые соответствовали бы«темновому» состоянию объекта. Было получено стационарное решение исследуемой системы для случая, когда все световые константы равны нулю, и найденный набор значений переменных использовали в качестве начального при проведении всех дальнейших расчетов. В модели тилакоида использованы оценки: средний объем хлоропласта 40 цм3; содержание Р700 - 2 ммоль на 1 моль хлорофилла; соотношение объемов стромы, люмена и тилакоидной мембраны. 10:1:1; содержание комплексов ФС2, Ьб/, ФС1, молекул пластохинона PQ и пластоцианина Рс 1:1:1:6:2 .

Необходимо определить интервал времени, на котором обобщенная модель способна описать результаты экспериментальных исследований. Известно (Ireland et al. 1984), что после переноса листа из темноты на свет существует лаг период в ассимиляции соответствующий по времени подъему флуоресценции быстрой ИФ на O-J-I-P стадиях на временах до нескольких секунд (средние интенсивности света). Следовательно, описание быстрых процессов ИФ и генерации A*F(0 (схема рис.1) на интервале времени - несколько секунд можно проводить без учета фиксации в цикле Кальвина.

Моделирование ИФ при различных интенсивностях света. Известно, что ход ИФ интактного фотосинтезирующего образца в экспериментах определяется интенсивностью освещения, изменявшейся от 12Вт/м2 до 5200 Вт/м2 для интактных хлоропласте® шпината (Neubauer, Schreiber 1987) или от 6 Вт/м2 до 600 Вт/м2 для листьев гороха (Pisum sativum) (Strasser et al. 1995).

Результаты (Strasser et al. 1995), полученные во временном диапазоне от 40/лек до 120сек и приведенные на рис.8а, сопоставим с ходом теоретических кривых ИФ, рассчитанным в модели тилакоида для трех значений kL=15 , 150, 1500 с-1 (рис.8б) на интервале времени до 10 секунд. Модель демонстрирует качественное соответствие теоретических и экспериментальных кривых. Ход ИФ (8а,б) с возрастанием интенсивности света не только ускоряется, но характеризуется появлением

дополнительных фаз. Для низкой интенсивность света (1%) характерны O-I-P- уровни ИФ, промежуточная I-стадия наблюдается на временах порядка 200 мс, а максимум флуоресценции на 1-2 с. При средней интенсивности света (10%) промежуточные фазы ИФ не столь явно выражены, а максимум флуоресценции достигается за времена ~500мс. Для высокой интенсивности света (100%) четко выявляются две промежуточные фазы (J- около 2 мс, и I - около 20 мс), а Р-максимум ИФ достигается за время порядка 100-200 мс (O-J-I-P- уровни паттерна насыщения (Stiasser et al. 1995; Viedenbeig 2000)).

Рис.8. ИФ хлорофилла при разных интенсивностях освещения, (а) Кривые ИФ, полученные в эксперименте: при освещении адаптированных. к темноте листьев гороха красным (650 нм) светом интенсивностью 600 (100%), 60 (10%) и 6 (1%) Вт м"2. Цитируется по (Strasser et al. 1995). (б) Кривые ИФ, рассчитанные с помощью модели. Расчеты производились для трех разных уровней освещения объекта: 1000 (100%), 100 (10%) и 10 (1%) Вт-м"2, которым соответствовали значения световых констант ФС2, равные 1500, 150 и 15 с"1..

Экспериментально показано (Neubauer, Schreiber 1987), что каждый из J-I-P-уровней- характеризуется собственной зависимостью от интенсивности света, достигая максимально возможной амплитуды при насыщении. Семейство кривых, полученное в модели тилакоида для задаваемых от kL=3 с-1 до kL=9000 с-1 (до 6000 Вт/м2) интенсивностей света, позволило описать этот эффект.

Моделирование кинетических компонент ИФ при различных интенсивностях света.. Увеличение частоты. попадания квантов энергии света в РЦ ФС2 задавали набором констант kL=15 , 150, 1500с-1 для начальных условий темновой адаптации (рис.9а,б,в). При анализе кривых ИФ ограничивались рассмотрением кинетики флуоресцирующих состояний ФС2 с восстановленным - (рис.9б), что

согласуется с представлениями о пропорциональности интенсивности флуоресценции концентрации закрытых РЦ ФС2 (Stiasser et al. 1995; Stürbet et al. 1998). В самом деле, при

Время: (ис)

любой интенсивности освещения вклад, во флуоресценцию состояний ФС2 с окисленным (¡л («вторые» формы — хг, . Уг, гг) на несколько порядков меньше по сравнению с вкладом состояний, содержащих в своем составе восстановленный О («шестые» формы,

1=10 №т'2 1=100 Шп.'2 1=1000 Ют'1

02 2 20 200 2000 20000 0.2 2 20 200 2000 20000 02 2 20 200 2000 20000

Время (мс) Время (мс) Время (мс)

Рис.9. Индукционные эффекты, рассчитанные с помощью модели первичных процессов фотосинтеза для трех разных интенсивностей освещения объекта: 1000, 100 и 10 (1%) Втм"2. Рисунки, расположенные в одном столбце, соответствуют одинаковому уровню освещенности. Результаты показаны на логарифмической шкале времени, (а) относительный выход флуоресценции (Р) и значение трансмембранного электрического потенциала (ДЧО; (б) концентрации различных возбужденных состояний ФС2; (в) скорости процессов, генерирующих и потребляющих электрический заряд в люмене тилакоида: Н+ы - поток протонов в люмен при окислении пластохинола на люменальной стороне ЬГ комплекса; Н\вк - поток протонов в люмен от кислородвыделяющего комплекса ФС2; Н\тф - скорость потребления протонов люмена в АТФ-синтазной реакции; К+|«,к — скорость утечки ионов К* из люмена тилакоида.

При низкой интенсивности света частота попадания квантов (кЬ=15 с-1) в РЦ значительно ниже величин констант скоростей реакций переноса электрона на акцепторной стороне ФС2 и сравнима с константой скорости,

характеризующей диффузию молекул хинонов

Процессы диффузия в мембране и окисление хинолов в люменальном сайте ¿6/ комплекса не ограничивают перенос электрона в ФС2. Модель тилакоида показывает (рис.10), что после переноса двух электронов на акцепторную сторону ФС2, происходящего за время Тгл»'~2х70>100мс, существует интервал времени (от ~100мс до ~500мс ), на котором скорости освобождения и заполнения, (2в-сайга. (VI, V4), диффузии в мембранной фазе (У2, V?) и окисления хинолов в люменальном сайте Ьб/ комплекса (~V2) близки по величине и принимают значение ~(90мс)-1. На этом интервале времени, когда достигается квазистационарное состояние, закрытые РЦ не накапливаются, и флуоресценция остается постоянной (рис.9а',а",б',б"). Однако, продолжается заполнение электронами компонент ЭТЦ: восстановление Ьн гема, линейный перенос электрона от ФС2 на пластоцианин, на ФС1 и светоиндуцированный перенос на ферредоксин. Циклический поток электронов при донировании от ферредоксина на Ъ/, гем увеличивается. Как следствие, возникает конкуренция за свободный - хинон, необходимый для посадки в стромальных сайтах ФС 2 и Ьв/ комплекса. За счет накопления g-форм ФС2 (пустой @в-сайт) на временах ~1 с нарастает флуоресценция Согласно такому подходу, в

рассмотренной выше модели изолированной ФС2 свободные хиноны участвуют только в реакции -сайта ФС2, и флуоресценция на низкой интенсивности света не достигает Р-уровня, оставаясь на 1-уровне (рис.Зб, кривая 2).

Рис.10. Для кЬ*15 с"' скорости процессов ФС2 и Ьв/комплекса: VI, У4 -освобождения и заполнения бв-сайта, У2, УЗ - диффузии в мембранной фазе, ~У2 - повторного окисления хинолов в люменальном сайте, У5 - образования. хинолов' в стромапьном сайте, ¿б/ комплекса. - флуоресценция.-

При средней интенсивности света частота попадания квантов (кЬ=150 с-1) в РЦ сравнима с величиной констант скоростей реакций освобождения пластохинола или захвата хинона в -сайте и значительно ниже

констант скоростей реакций переноса электрона на £1В (!&,« к(, I =7, 14).

При высокой интенсивности света частота поступления квантов (kHz1500 с"1)

превышает величины констант скоростей реакций переноса электрона с QA на QB. Вклад во флуорисценцию состояний x.i и (QB и Qa~) на J- уровне становится сравнимым по величине с вкладом г^ (QB~) (рис.9а",б"). Скорости переноса на подвижный пул достигают максимально возможных величин, так что происходит накопление z- форм ФС2 (содержащих QB ~) (рис.9б"). Относительная стабилизация на стадии I-уровня возможна при достаточном количестве молекул хинона на стромальной стороне ФС2. Учет конкуренции за свободный хинон (время >20мс) между ФС2 и срэмальным сайто^^омплекса вносит дополнительный вклад в процесс нарастания флуоресценции до главного максимума Р-уровня посредством накопления g форм с пустым рв-сайтом.

Таким образом, анализ обобщенной модели показал: (1) Амплитуда Р-уровня ИФ с ростом интенсивности достигает максимальной величины при значениях световой константы (световая интенсивность />100 Вт/м2), причем дальнейшее

увеличение освещенности приводит к «насыщению» пика ИФ в эксперименте (Neubauer, Schreiber 1987). (2) Характер быстрой стадии ИФ (О-У-1-Р-уровни) определяется тем, что при высокой интенсивности света скорость переноса электрона ограничена процессами на акцепторной стороне ФС2. (3) Максимальное восстановление ферредоксина ФС1 происходит на разных временах в интервале -5+10 с в зависимости от интенсивности света. При этом, во временном интервале -5+10 с не происходит существенного воздействия интермедиатов цикла Кальвина на перенос электронов с Fd на. NADP. Этот результат согласуется с литературными данными (Dau H. 1994).

Моделирование генерации электрохимического потенциала. Перенос протонов и противоионов, сопряженный со светоиндуцированным переносом электронов, ведет к генерации , формируемого вкладами

Результаты моделирования светоиндуцированного - приведены на

для Скорости процессов, участвующих в генерации и

потреблении электрического заряда в люмене определяют согласно (2)

изменение во времени Односторонние потоки протонов (кривые

и ионов могут сильно варьировать в зависимости от частоты попадания

квантов в РЦ. Но при всех интенсивностях начальный пик Д¥(/) (амплитуда -92 мВ) достигается на времени 2 мс за счет поступление протонов в люмен тилакоида от КВК (Н*квк ) с учетом процессов синтеза-гидролиза АТФ (Н%тф ). С п Д<Д!( д о уровня ~8 мВ) обусловлен как диссипацией ДЧ^О в процессе утечки ионов К+ ( К*^), так и потреблением протонов в АТФ- синтазной реакции Кинетика теоретических

кривых соответствует изменениям светоиндуцированного мембранного

потенциала в хлоропластах растений Ргрггот1а т^аШеа (БШусИеу, VIedenbeIg 1999).

Рис.11: Теоретические кривые,

рассчитанные при средней световой интенсивности (£¿=150 с"1) и низкой ([АГ+]=[СГ]=50мМ- кривые 1,2,3) или высокой ([К+]=[С7-]=80мМ - - кривые 4,5,6) величине ионной силы. Кинетическим кривым соответствуют переменные:

(а) светоиндуцированный р/лДО - 1,4; ДрЯ(0 - 2,5; суммарная скорость пассивной утечки и активного потребления протонов комплексом АТФ синтазы - 3, 6.

(б) Д¥(/) -1,4; суммарная концентрация протонированных буферных форм в люмене - 2,5; скорость пассивной утечки ионов К+ - 3, б.

При низких значениях световых констант в модели тилакоида наблюдали появление «второй волны» ДЧ^/) (рис.9а). Известны эксперименты по регистрации так называемой «медленной фазы электрохромных изменений» поглощения каротиноидов, которые приписывают электрогенному переносу электронов вне РЦ ФС2 (Bouge-Bouquet 1981). Наша модель тилакоида следующим образом объясняет формирование этой медленной фазы ДЧ'(г). Для kL=15c-1 вслед: за восстановлением пула хинолов на стромальной стороне ФС2 в интервале 50+200 мс возрастает поток протонов в люмен, обусловленный окислением пластохинола на люменальной стороне -комплекса (Н+м , рис.9в). При этом, в условиях квазистационарного состояния от 100 до 500 мс скорости генерации и потребления заряда в люмене «уравновешивают» друг друга, создавая постоянный уровень второй волны

Время, сек.

Светоиндуцированный электрохимический потенциал ДДИ» , выраженный через «протон движущую силу»: />/я/(/) = ДЧ^) + 59.42-Др//(0 в мВ, рассчитывали, увеличивая величину ионной силы от [АГ+]=[С/"]=50мМ (кривые 1,2,3 ) до 80мМ (кривые 4,5,6). Вклад в генерацию рт() (рис. 11 а, кривые 1 и 4) составляющей электрического потенциала ДЧ*(0 (11б, кривые 1 и 4) уменьшался, а вклад ДрЯ(х) (11а, кривые 2 и 5) увеличивался при нарастании ионной силы. Это соответствует результатам, полученным в (Ош е^ а1. 2001).

Согласно модели тилакоида при переходе от низкой ионной силы к высокой скорость утечки через мембрану ионов К+ увеличивается (11б, от кривой 3 к 6 ), а скорость потребления протонов (пассивная утечка + АТФ синтаза) падает (11а, от кривой 3 к 6). В условиях высокой ионной силы буфер протонов в люмене насыщается на более ранних временах (11б, кривая 5 по сравнению с 2), и нарастание концентрации протонов в люмене на временах >2с приводит к увеличению вклада ДрЯ(г) в ртД0-

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

светоиндуцированных изменений редокс состояний компонентов ЭТЦ позволяет найти значения констант отдельных стадий переноса электронов и ионов. В том числе могут быть определены константы реакций, которые не поддаются прямому экспериментальному определению. Анализ обобщенной модели позволяет в явном виде представить зависимости во времени различных процессов, сопровождающих

индукцию флуоресценции: изменения во времени редокс состояний переносчиков электронов, образования ДЧ* ирН, трансмембранных потоков ионов.

1. Разработана обобщенная модель первичных процессов фотосинтеза (модель тилакоида), которая включает процессы переноса зарядов в ФС2, ФС1, цитохромном Ь6/ комплексе, подвижными переносчиками, трансмембранный перенос ионов и протонов в АТФ синтазе,. а также зависимость процессов переноса зарядов от трансмембранного ДЧ*.

2. Результаты анализа обобщенной модели позволяют проводить определение констант отдельных стадий переноса электронов и ионов, протекающих в конкретных экспериментальных условиях при воздействии света различной интенсивности и под влиянием ингибиторов.

3. Показано, что динамика накопления флуоресцирующих состояний определяется интенсивностью света (низкая, средняя, высокая), при которой получены кривые ИФ.

3.1. При высоких интенсивностях света характер изменения выхода флуоресценции на О-М-Р-стадиях ИФ определяется главным образом переносом электрона на акцепторной стороне ФС2.

3.2. При низких интенсивностях света кинетика изменения флуоресценции на О-1-Р-стадиях ИФ определяется уже совокупностью процессов переноса с участием ФС2, комплекса, ФС1 и циклического транспорта, а, следовательно, может быть описана только в обобщенной модели.

4. Как показано в модели ФС2, влияние ДЧ* тилакоидной мембраны (в люмене ДЧ^О) приводит к замедлению роста флуоресценции на М-стадиях ИФ, что обусловлено торможением переноса электрона на первичный хинонный акцептор Од. В тех же условиях увеличение амплитуды главного максимума на Р-уровне ИФ вызвано усилением степени обратимости реакции разделения зарядов в закрытых РЦ.

5. На временах в диапазоне от микросекунд до 10 секунд анализ обобщенной модели позволил представить в явном виде изменения во времени редокс состояний переносчиков электронов, образования и рН, трансмембранных потоков ионов, которые сопровождают изменения флуоресценции в процессе ИФ.

выводы

Список публикаций по теме диссертации.

1. Lebedeva G.V., Beljaeva N.E., Riznichenko G.Yu. and Demin O.V. Modeling of the primary events of photosynthesis and the fast phase of fluorescence induction. Theoretical Biophysics International School. P.90, Moscow, 1998.

2. Lebedeva G.V., Beljaeva N.E., Riznichenko G.Yu. and Demin O.V. Modelling of the primary events of photosynthesis and the fast phase of fluorescence induction.// in:C.Larsson, I.Pahlman and L.Gustafsson (eds.) BioThermoKinetics in the post genomic era, Chalmers Reproservice, Goteborg, 1998. P. 196-199.

3.Беляева Н.Е., Дёмин О.В., Лебедева Г.В., Ризниченко Г.Ю., Рубин А.Б. Математическая модель фотосистемы II высших растений. Тезисы IV съезда общества физиологов растений России. Москва 1999, стр.22-23.

5. Лебедева Г.В., Дёмин О.В., Беляева Н.Е., Ризниченко Г.Ю., Рубин А.Б., Кинетическая модель каталитического цикла фотосистемы II высших растений. Тезисы II съезда биофизиков России. Москва 1999.

6. Ризниченко Г.Ю., Лебедева Г.В., Демин О.В., Беляева Н.Е., Рубин.А.Б. Уровни регуляции процессов фотосинтеза. Биофизика, 2000, т.45, №3,452-460.

7. Г.В. Лебедева, Н.Е. Беляева, Г.Ю. Ризниченко, А.Б. Рубин, О.В. Дёмин Кинетическая модель фотосистемы II высших растений. Физ. химия. 2000. Т.74, 10, с.1897-1906.

8. Беляева Н.Е., Лебедева Г.В., Ризниченко Г.Ю., Рубин А.Б., Дёмин О.В. Кинетическое моделирование индукции флуоресценции высших растений. В сб. «Математика. Компьютер. Образование.» Вып.7, М., 2000, 606-614.

9. Беляева Н.Е., Дёмин О.В., Лебедева Г.В., Ризниченко Г.Ю., Рубин А.Б. Кинетическая модель первичных процессов фотосинтеза, в хлоропласте зеленых растений. (Кинетическое моделирование индукции флуоресценции и электрохимического потенциала в тилакоидной мембране.) В сб. «Математика. Компьютер. Образование.» Вып.8, М., 2001, 587-595.

10. Беляева Н.Е., Лебедева Г.В., Ризниченко Г.Ю., Рубин А.Б., Демин О.В. . Кинетическая модель первичных процессов фотосинтеза в хлоропласте. В сб.: Материалы III съезда фотобиологов России. Воронеж 2001, стр.17.

11. Riznichenko G., Belyaeva N.. Lebedeva G., Demin О. Mathematical model of photosynthetic processes on the thylakoid membrane of chloroplasts. in Abstracts of 5th conference of the European society of the mathematical and theoretical biology. Milano, 2002.

12. Лебедева Г.В., Беляева Н.Е., Дёмин О.В., Ризниченко Г.Ю., Рубин А.Б. Кинетическая модель первичных процессов фотосинтеза в хлоропластах. Описание быстрой фазы индукции флуоресценции хлорофилла при различной интенсивности света. Биофизика, 2002, том 47, вып.6, с.1044-1058.

13. Беляева Н.Е., Лебедева Г.В., Ризниченко Г.Ю. Кинетическая модель первичных процессов фотосинтеза в хлоропласте зеленых растений. Моделирование электрического потенциала тилакоидной мембраны. В сб. «Математика. Компьютер. Образование.» Вып. , М., 2003.

14. Belyaeva N.E., Lebedeva G.V., Demin O.V., Rubin A.B., Riznichenko G.Yu. Kinetic Model of Primary Photosynthetic Processes in Thylakoids. Modeling of Chlorophyll Fluorescence Induction and Electrochemical Potential. В сб. Тезисы конференции «Первичные процессы фотосинтеза». Пущино, 2003, стр. 8.

Типография ордена «Знак почета» издательства МГУ 117234, Москва, Ленинские горы Заказ № Ю05 Тираж 100 экз.

»4 ь 1 78 2

л -тщ

РНБ Русский фонд

2004-4 21193

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Беляева, Наталья Евгеньевна

Введение.

Глава 1. Обзор литературы. Механизмы первичных процессов фотосинтеза в хлоропластах и их математические модели.

Введение.

1.1. Конкуренция процессов захвата и потерь световой энергии в антеннах фотосистем.

1.1.1. Миграция энергии в антенных комплексах и фотохимический захват в РЦ фотосистем 1,2.

1.1.2. Флуоресценция в антенных комплексах фотосистем 1 и 2. Индукция флуоресценции.

1.1.3. Концепция энергетических пулов Батлера

1.2. Стабилизация разделения зарядов в РЦ фотосистемы 2.

1.2.1. Модель обратимой радикальной пары (ОРП) Шатца.

1.2.2. О применимости термодинамических представлений в модели ОРП.'. . . L.

1.2.3. Учет воздействия электрического поля в модели ОРГ7.

1.2.4. Результаты применения модели ОРП.

1.2.5. Область применения модели ОРП.

1.2.6. Значение модели ОРП и выводы.

1.3. Акцепторная и донорная сторона ФС2.

I 1.3.1. Энергетика переноса электронов.

1.3.2. Экспериментальное определение редокс-потенциалов первичных акцепторов ФС 2.

1.3.2.1. Физиологическое значение различий редокс-форм акцепторов электронов

1.3.2.2. Достоверность численных оценок редокс- потенциалов.

1.3.3. Вторичный акцептор электронов ФС2.

1.3.4. Особенности переноса электронов в ФС 2.

1.3.5. Модель двухэлектронных ворот ФС2. Объединение с моделью ОРП.

1.3.6. Математические модели донорных и акцепторных процессов ФС2.

1.3.6.1. Модель, учитывающая процессы КВК.

1.3.6.2. Модель, учитывающая изменение выхода рекомбинации радикальной пары в закрытых РЦ.

1.3.6.3. Модель, учитывающая процессы КВК и рекомбинации радикальной пары в закрытых РЦ.

1.3.7. Выводы о результатах моделирования процессов ФС 2.

1.4. Молекулярные комплексы тилакоидной мембраны - b6f комплекс и фотосистема 1 (ФС1).

1.4.1 .Механизмы переноса электронов и модели цитохромного bf комплекса.

1.4.2. Модели фотосистемы 1 (ФС1) и подвижные переносчики электронов. Циклический транспорт электронов.

1.5. Модели процессов в компартментах тилакоида.

1.5.1. Модель, связывающая световые и темновые процессы фотосинтеза.

1.5.2. Модель, учитывающая протонный транспорт в тилакоидах. . 40 1.5.4. Выводы к пунктам 1.4. и 1.5.

1.6. Электрохимический потенциал мембраны тилакоида.

1.6.1. Электрический потенциал мембраны тилакоида и потоки ионов.

1.6.2. Модель потоков ионов через тилакоидную мембрану Ван Кутена.

1.6.3. рН и буферные системы стромы и люмена.

1.6.4. Составляющие электрохимического потенциала А/лн+

1.6.5. F0F, АТФ синтаза тилакоидной мембраны.

1.6.6. Вывод к пункту 1.6.

1.7. Вывод ко всему лит обзору.

1.8. Постановка задачи создания обобщенной модели первичных процессов фотосинтеза.

Глава 2.Общие теоретические принципы создания модели первичных процессов фотосинтеза.

2.1. Компартментальная схема тилакоида.

2.2. Кинетические механизмы функционирования первичных процессов фотосинтеза.

2.2.1 Описание функционирования мультиферментного комплекса.

2.2.2. Описание функционирования подвижных переносчиков.

2.2.3. Баланс зарядов и электрохимический потенциал в модели тилакоида.

2.3. Способы задания скоростей реакций.

2.3.1 .Константы скоростей и константы равновесия реакций.

2.3.2. Применимость термодинамических представлений в кинетической модели.

2.3.3. Зависимость параметров реакций переноса заряда через мембрану тилакоида от потенциала.

2.3.4. Оценка эффективного сечения поглощения антенных комплексов.

2.4. Модель тилакоида, принципы формирования и отладка блоков модели.

2.4.1. Выбор экспериментальных результатов для отладки модели тилакоида.

2.4.2. Проблемы компьютерной обработки модели тилакоида.

ГлаваЗ. Модель изолированной фотосистемы 2 (ФС2).

3.1. Экспериментальное обоснование структуры модели.

3.1.1. Кинетические и термодинамические характеристики ФС2.

3.1.2. Постановка задачи моделирования ФС2.

3.2. Формулировка модели. (Полная схема и система уравнений).

3.2.1 .„Набор состояний переносчиков ФС2.

3.2.2. Последовательность процессов ФС2.

3.2.3. Математическое описание процессов ФС2.

3.2.4. Учет воздействия потенциала при формировании констант реакций трансмембранного переноса электрона в модели ФС2.

3.2.5. Пулы состояний переносчиков ФС2.

3.2.6. Особенности компьютерного эксперимента для модели ФС 2.

3.3. Результаты расчетов в модели изолированной ФС2. Процессы на донорной и акцепторной сторонах ФС2.

3.3.1. Влияние интенсивности света на быструю фазу ИФ.

3.3.1.1. Изменения выхода флуоресценции

3.3.1.2. Величина выхода флуоресценции на стадиях ИФ при увеличении интенсивности света.

3.3.1.3. Постановка задач для анализа результатов моделирования.

3.3.1.4. Изменение во времени концентраций редокс- форм и степени восстановленности первичного хинонного акцептора.

3.3.2. Моделирование влияния реагентов на донорной и акцепторной сторонах ФС2.

3.3.2.1. Действие диурона на быструю фазу ИФ.

3.3.2.2. Влияние параметров пула подвижных хинонов на быструю фазу ИФ.

3.3.2.3. Моделирование воздействия на КВК. Гидроксиламин. Ограничение допирования электрона от КВК в ФС2.

3.3.2.4. Влияние рН стромы и люмена на быструю фазу ИФ.

3.4. Результаты расчетов в модели изолированной ФС2. Моделирование влияния электрического потенциала на процессы ФС2.

3.4.1. Быстрая фаза ИФ при изменении потенциала.

3.4.1.1. J-1-уровни ИФ при увеличении потенциала. Сравнение с экспериментом.

3.4.1.2. Воздействие потенциала на кинетику редокс-компонент на J-I-уровнях быстрой ИФ в модели ФС2.

3.4.2. Моделирование влияния потенциала на стационарные значения флуоресценции ФС2. Сравнение с экспериментом.

3.4.2.1. Влияние потенциала в условиях средней степени восстановленное™ РЦ ФС2.

3.4.2.2. Влияние потенциала в условиях высокой и низкой степени восстановленное™ РЦ.

3.4.3. Воздействие потенциала на стационарные величины концентраций редокс- состояний в модели ФС2.

3.4.4. Воздействие потенциала на пул рекомбинирующей радикальной пары (РРП).

3.4.5. Воздействие потенциала на потоки электронов в ФС2.

Глава 4. Модель первичных процессов фотосинтеза в хлоропластах (модель тилакоида).

4.0. Постановка задачи разработки обобщенной модели тилакоида.

4.1. Переход от модели ФС2 к модели тилакоида.

4.1.1. Светоиндуцированный потенциал в модели ФС2.

4.1.2. Результаты моделирования процессов ФС2 с учетом потоков ионов.

4.1.3. Моделирование процессов переноса электронов в цитохромном Ьб f комплексе.

4.1.3.1. Экспериментальное обоснование структуры модели b6 f комплекса.

4.1.3.2. Формулировка модели b6 f комплекса.

4.1.3.3. Цели моделирования процессов в цитохромном b6 f комплексе.

4.1.4. Кинетические вклады блоков модели ФС2+потенциал+(АТФ-аза) +( Ьб f комплекс) в энергизацию тилакоидной мембраны.

4.1.4.1. Электрический потенциал.

4.1.4.2. Электрохимический потенциал протонов.

4.1.4.3. Вклады процессов переноса зарядов в формирование

4.1.5. Моделирование процессов ФС1.

4.1.6. Модель потоковых процессов в тилакоиде в темноте.

4.1.7. Выводы о результатах моделирования первичных процессов в блоках мультиферментных комплексов.

4.2. Моделирование первичных процессов фотосинтеза в обобщенной модели тилакоида.

4.2.1. Формулировка модели тилакоида.

4.2.2. Моделирование индукции флуоресценции в модели тилакоида.

4.2.3. ИФ и концентрации редокс- форм, рассчитанные в обобщенной модели при различных интенсивностях света.

4.2.3.1 Динамика заполнения редокс- состояний компонент

ЭТЦ при низких световых интенсивностях.

4.2.3.2 Динамика заполнения редокс- состояний компонент

ЭТЦ при высоких световых интенсивностях.

4.2.3.3 Кинетические компоненты ИФ при увеличении интенсивности освещения.

4.2.4. Моделирование электрохимического потенциала тилакоидной мембраны в модели тилакоида.

4.2.4.1 Светоиндуцированный электрический потенциал.

4.2.4.2 Моделирование светоиндуцированного А]йн+.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Обобщенная модель первичных процессов фотосинтеза"

При изучении фотосинтезирующих объектов имеется возможность количественно регистрировать светоиндуцированные кинетические зависимости, характеризующие перенос электронов и выражающиеся в явлениях индукции флуоресценции (ИФ), генерации А/3/у+ . Известно, что возбужденные состояния хлорофилла фотосистемы 2 (ФС2) вносят основной вклад в регистрируемую флуоресценцию. Особенности процессов ИФ, генерации А/лн + обусловлены совокупным взаимодействием всех стадий переноса электронов в ФС2, ФС1, цитохромном 66/ комплексе, и сопряженными процессами переноса протонов и других ионов в компартментах тилакоида. Для теоретического анализа результата взаимодействия этих процессов и их влияния на форму кривой ИФ, регистрируемой в эксперименте, используются методы математического моделирования.

Большинство имеющихся в литературе моделей, описывающих быструю фазу ИФ (подъем от начального до максимального уровня), подробно рассматривают процессы в фотосистеме 2. Тем не менее, эти модели способны описать только некоторые особенности изменения флуоресценции, регистрируемые в эксперименте при действии диурона (Trissl el а/. 1993), при высокой (Stirbet et al. 1998), при низкой (Baake, Shloeder 1992) световых интенсивностях на интервале времени от 0 до 0.5 с. Модели, которые можно назвать обобщенными, не детализируют процессы в пределах одного комплекса, а рассматривают перенос электрона между ФС2 и ФС1. Это позволяет описать кинетику ИФ, а также анализировать влияние цикла Кальвина на ход индукции флуоресценции на временах больше секунды (Караваев, Кукушкин 1993). Известны также работы по моделированию светоиндуцированных потоков протонов и ионов, позволяющие описать кинетику формирования АЧ* (Van Kooten el ей. 1986), либо АрН (Вершубский и др. 2003) либо А/лн+ (Cruz et al. 2001).

Цели и задачи исследования. Основная цель работы - разработать комплексную модель кинетики первичных процессов фотосинтеза для описания индукционных явлений флуоресценции и генерации AfiH+, наблюдаемых экспериментально. Для достижения этой цели решались задачи:

1) Дать полное описание процессов переноса электрона в ФС2, ФС1, цитохромном b(J' комплексе и процессов сопряженного трансмембранного переноса протонов и противоионов, синтеза-гидролиза АТФ в комплексе АТФ синтазы с учетом буферных свойств люмена и стромы. Проверить адекватность полной модели по ее соответствию кинетическому ходу экспериментальных кривых ИФ как на малых (микросекунды), так и на более длительных (секунды) временах при различных световых интенсивностях.

2) В рамках единой модели учесть процессы ИФ, формирования А/лн+, включив в модель в явном виде генерацию AVF и АрН и их влияние на реакции переноса заряда.

Научная новизна. На основе детального рассмотрения механизмов первичных процессов, протекающих в компартментах хлоропластов и участвующих в создании Д/7Л/+ , разработана обобщенная модель первичных процессов фотосинтеза. Дано количественное описание семейства кривых индукции флуоресценции и процессов генерации А]йИ+, наблюдаемых при действии света от низких до высоких интенсивностей. Найдены значения констант переноса зарядов, которые не могут быть определены в прямых экспериментальных измерениях. Результаты расчетов в модели выявляют вклады отдельных стадий в ИФ при разных интенсивностях света, роль ФС2 при высоких иптенсивностях, цитохромного комплекса, ФС1, AVF и переноса ионов при низких. Определены количественные параметры влияния ДЧ'на кинетику ИФ. Путем анализа модели характерным стадиям кинетических кривых ИФ удается сопоставить соответствующие кинетики редокс-состояний в процессе переноса электрона, генерации трансмембранных потоков ионов, образования Л47 и АрН.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Результаты работы представлены на IV Съезде Общества физиологов растений России (Москва, 1999); на 2-м Съезде биофизиков России (Москва, 1999); на 3-м Съезде фотобиологов России (Воронеж, 2001); на 8-10 конференциях «Математика. Компьютер. Образование.» (Пущино, 2001,2003, Дубна 2002); на конференции «Первичные процессы фотосинтеза» (Пущино, 2003). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, главы 1 - обзора литературы, главы 2 - описания модели, глав 3,4- описания и обсуждения результатов моделирования, выводов, приложений 1 и 2, списка литературы.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Беляева, Наталья Евгеньевна

ВЫВОДЫ.

1. Разработана обобщенная модель первичных процессов фотосинтеза (модель тилакоида), которая включает процессы переноса зарядов в ФС2, ФС1, цитохромном Ь6 f комплексе, подвижными переносчиками, трансмембранный перенос ионов и протонов в АТФ синтазе, а также зависимость процессов переноса зарядов от трансмембранного ДТ.

3.1. При высоких интенсивностях света характер изменения выхода флуоресценции на O-J-I-P-стадиях ИФ определяется главным образом переносом электрона на акцепторной стороне ФС2.

3.2. При низких интенсивностях света кинетика изменения флуоресценции на О-1-Р-стадиях ИФ определяется уже совокупностью процессов переноса с участием ФС2, Ь6 f комплекса, ФС1 и циклического транспорта, а, следовательно, может быть описана только в обобщенной модели.

4. Как показано в модели ФС2, влияние Д^Р тилакоидной мембраны (в люмене Д*Р>0) приводит к замедлению роста флуоресценции на J-I-стадиях ИФ, что обусловлено торможением переноса электрона на первичный хинонный акцептор QA. В тех же условиях увеличение амплитуды главного максимума на Р-уровне ИФ вызвано усилением степени обратимости реакции разделения зарядов в закрытых РЦ.

5. На временах в диапазоне от микросекунд до 10 секунд анализ обобщенной модели позволил представить в явном виде изменения во времени редокс состояний переносчиков электронов, образования ДТ и рН, трансмембранных потоков ионов, которые сопровождают изменения флуоресценции в процессе ИФ.

Заключение и общие выводы.

На основании данных о механизмах фотосинтетических процессов реализовано количественное описание переходов между редокс состояниями мультиферментных комплексов, их взаимодействий с подвижными переносчиками, переноса протонов и других ионов через мембрану тилакоида, а также влияния электрического трансмембранного потенциала ДТ на трансмембранный перенос заряда. Теоретические результаты анализа модели тилакоида и моделей отдельных блоков соответствуют экспериментальным данным, полученным под действием света различной интенсивности, в условиях воздействия потенциала ДТ, рН , а также при действии ингибиторов и модификации условий среды. Теоретический анализ регистрируемых в конкретных условиях эксперимента кривых ИФ, образования AjuH + , а также светоиндуцированных изменений редокс состояний компонентов ЭТЦ позволяет найти значения констант отдельных стадий переноса электронов и ионов. В том числе могут быть определены константы реакций, которые не поддаются прямому экспериментальному определению. Анализ обобщенной модели позволяет в явном виде представить зависимости во времени различных процессов, сопровождающих индукцию флуоресценции: кинетику редокс состояний переносчиков электронов, образования ДТ и рН, трансмембранных потоков ионов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Беляева, Наталья Евгеньевна, Москва

1. Auslander W., Junge W. BBA (1974) 357: 285-298.

2. Baake E., Shloeder J.P. Bull. Math. Biol. 1992. V.54. P.999-1021. Modelling the fast fluorescence rise of photosynthesis.

3. В end all D.S., Manasse R.S., BBA (1995) 1229 23-28. Cyclic photophosphorylation and electron transport.

4. Bernhardt K. Trissl H-W. BBA (1999) 1409, 125-142. Theories for kinetics and yield of fluorescence and photochemistry: how, if at all, can different models.

5. Berry S., Rumberg В. BBA. (1996) 1276, 51-56 НЛАТР ratio at the unmodulated CF0CF,-ATP synthase determined by proton flux measurements.

6. Berry S., Rumberg B. Bioelectrochemistry 2000, 53, 35-53. Kinetic modeling of the photosynthetic electron transport chain.

7. Boork J.,BBA (1984) 767, 314-320 .

8. Bouge-Bouquet B. //Biochim. Biophys. Acta. 1977. V. 462. P.371-379.

9. Bouge-Bouquet В. II Biochim. Biophys. Acta. 1981. V. 635. P.327-340.

10. Bowes J.M., Crofts A.R. BBA (1980) 590 373-384 Binary oscillations in the rate of the reoxidation of the primary acceptor of photosystem II.

11. Boyer P.D. BBA (1993) 1140 215-250.

12. Brettel K. Biochim. Biophys. Acta. 1997. V. 1318. P.322-373. Electron transfer and arrangement of the redox cofactors in photosystem I.

13. Breyton C. BBA (2000) 1459 467-474. The cytochrome 6,5/complex: structural studies and comparison with the b\c complex.

14. Britt R.D. in Advances in photosynthesis. V.4. Oxygenic photosynthesis: the light reactions. Ed. by D.R. Ort and C.F. Yocum. 1996. Oxygen evolution.

16. Brown G.C., Brand M.D. (1986) Biochem. J., 234, 75-81.

17. Bulychev A.A., Vredenberg W.J. BBA (1976) 423 548-556. The effect of cations and membrane permeability modifying agents on the dark kinetics of the photoelectric response in isolated chloroplasts.

18. Bulychev A.A., Vredenberg W.J. Physiologia plantarum (1999) 105, 577-584. Light-triggered electrical events in the thylakoid membrane of plant chloroplast.

19. Bulychev A.A., Vredenberg W.J. Bioelectrochemistry 54 (2001) 157-168 Modulation of photosystem II chlorophyll fluorescence by electrogenic events generated by photosystem I.

20. ButlerW.L., Strasser R.J. Proc.Natl.Acad.Sci. USA 1977, 74, 3382-3385.

21. Cleland R.E., Bendall B.S. Photosynth. Res. 1992, 34, 409-418. Photosystem I cyclic electron transport. Measurement of ferredoxin-plastoquinone reductase activity.23

Информация о работе

Беляева, Наталья Евгеньевна
кандидата физико-математических наук
Москва, 2004
ВАК 03.00.02

Диссертация

Обобщенная модель первичных процессов фотосинтеза - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы