Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сопряжение между фотосистемой 1 и цитохромным b6f комплексом в модельных системах

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Сопряжение между фотосистемой 1 и цитохромным b6f комплексом в модельных системах"

На правах рукописи

I

Витухновская Лия Алексеевна

СОПРЯЖЕНИЕ МЕЖДУ ФОТОСИСТЕМОЙ 1 И ЦИТОХРОМНЫМ Ь</ КОМПЛЕКСОМ В МОДЕЛЬНЫХ СИСТЕМАХ

03.00.02 - биофизика

Автореферат Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва -2005

Работа выполнена в отделе биоэнергетики НИИ Физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ.

Научный руководитель: доктор биологических наук,

А.Ю. Семенов

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

П.П. Нокс

кандидат физ.-мат. наук, Д.А.Черепанов

Ведущая организация: Институт биохимии имени А.Н. Баха РАН,

г.Москва

Защита диссертации состоится «22» декабря 2005 г. в 15 ч 30 мин на заседании Диссертационного Совета Д.501.001.96 биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова по адресу: 119899, Москва, Воробьевы горы, МГУ, биологический факультет, кафедра биофизики, ауд. «новая».

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан «[£>> г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор биологических наук, профессор

Г?

» ЧУБ=4£ренделева

/Ш

гтмо

2

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Исследование фотосинтеза, как комплекса реакций превращения солнечной энергии в энергию химических связей, представляет собой одну из наиболее актуальных проблем современной биологии.

В фотосинтетической электрон-транспортной цепи (ЭТЦ) высших растений, водорослей и цианобактерий функциональными блоками являются фотосистемы (ФС) 1 и 2, а также цитохромный (цит) b(f комплекс, осуществляющий перенос электронов от липофилъного двухэлектронного донора пластохинола на одноэлектронный водорастворимый белок пластоцианин (ПЦ) или цит с6 (альтернативный переносчик элекгронов у цианобактерий). Согласно классической линейной Z-схеме фотосинтетическая ЭТЦ обеспечивает расщепление воды с образованием кислорода на донорной стороне ФС 2 и восстановление НАДФ до НАДФН на акцепторной стороне ФС1.

В некоторых условиях (присутствие ингибиторов ФС 2, анаэробиоз) наблюдается циклический транспорт электронов, включающий только два пигмент-белковых комплекса фотосинтетической цепи - ФС 1 и цит b(f комплекс. Однако механизм этого процесса недостаточно изучен, поэтому исследование взаимодействия между ФС 1 и цит b$f комплексом представляется важной и актуальной проблемой.

ФС 1 осуществляет фотоиндуцированное трансмембранное разделение зарядов, сопряженное с транспортом электронов от периферических белков - цит сf, или ПЦ к природным акцепторам - ферредоксину (или альтернативному акцептору электронов у цианобактерий - флаводоксину) от первичного донора электронов - димера хлорофилла Р700 через цепь кофакторов - Ао (хлорофилл а), А] (филлохинон или витамин Ki) и железосерньте кластеры Fx, FA, FB.

Цит b(f комплекс, согласно схеме Q-цикла, предложенной Митчелом (Mitchell, 1975), окисляет молекулу пластохинола (PQH2) в хинол-оксидазном Q0-сайте. Окисление PQH2 сопровождается депротонированием, при этом один электрон поступает на высокопотенциальный участок цепи (железо-серный центр Риске - цит У), а другой - на цит Ь, восстанавливая связанную с хинон-редуктазным сайтом Q, молекулу пластохинона (PQ) с образованием семихинона. При повторном обороте фермента семихинон анион-радикал восстанавливается до PQH2. Таким образом, в результате полного цикла работы й</ комплекса происходит окисление двух молекул PQH2, за которым следует выброс 4 Н+ в люмен, поглощение 2 Н+ из стромы и восстановление одной молекулы PQ в Q, сайте.

Значительный прогресс в изучении этих двух белковых комплексов был связан с проведением рентгеноструктурного i HÄÖfeaMiMHi^BMite'^ftIi из термофильной цианобактерии Synechococcus elongatue " 1 ordan et al, 2001), и

цит b(f комплекса из термофильной цианобактерии Mastigocladus laminosus с разрешением 3,5 Ä (Kurisu et al., 2003) и из водоросли Chlamydomonas reinhardtii с разрешением 3,1 А (Stroebel et al., 2003). Были оценены расстояния между кофакторами ферментов, а также выявлены основные структурные особенности ¿></ комплекса, в частности, был найден новый, ковалентно-связанный гем х, по-видимому, относящийся к темам типа с'. Предполагается, что гем х может участвовать в циклическом перенос электронов.

Транспорт электронов между b,f комплексом и ФС 1 ранее изучали, главным образом, на нативных объектах: листьях высших растений, хлоропластах, субхлоропластных частицах и клетках цианобактерий. Перенос электронов между выделенными из высших растений белками ФС 1 и b/f исследовали только в растворе (Rieh et al, 1987). В нашей работе впервые была предпринята попытка изучить взаимодействие между этими двумя пигмент-белковыми комплексами в мембранах протеолипосом с помощью импульсной абсорбционной спектрометрии, ЭПР спектроскопии и прямого электрометрического метода.

Перенос электронов при функционировании b/f комплекса сопряжен с генерацией трансмембранной разности электрических потенциалов (Ду), образование которой до настоящего момента изучалось методом регистрации электрохромного сдвига полос поглощения каротиноидов в тилакоидах хлоропластов (Jones & Whitmarsh, 1988) и целых клетках (Joliot & Joliot, 1994, 1998). Этот метод, несмотря на широкое применение, является косвенным, и при интерпретации данных не вполне однозначным. Было предположено, что основная электрогенная стадия (70-75%) обусловлена переносом электрона между двумя темами Ь, в то время как оставшиеся 25-30% электрогенеза, вероятно, связаны с окислением цитохрома b и/или с поглощением протонов из стромы при восстановлении PQ в сайте Q,. Тем не менее, анализ литературных данных показывает, что как механизмы сопряжения электронного транспорта с образованием Дц/ в цит b(f комплексе, так и природа наблюдаемых электрогенных стадий остаются невыясненными.

Более прямым способом регистрации образования мембранного потенциала в ответ на лазерную вспышку является электрометрический метод, разработанный в НИИ ФХБ им. А.Н. Белозерского МГУ. Ранее этот метод был успешно применен для изучения природы и механизмов электрогенных реакций в функциональном аналоге b/f комплекса - цитохромном bcj комплексе пурпурных фотосинтезирующих бактерий. Однако электрометрический метод не применим к целым клеткам и хлоропластам. Для регистрации мембранного потенциала этим методом необходимо было выделить комплексы и ФС 1, встроить их в мембраны протеолипосом и подобрать условия эффективного взаимодействия. В настоящей работе электрогенные реакции, сопровождающие перенос зарядов в

цит b(f комплексе были впервые исследованы в модельной системе. Применение прямого электрометрического метода позволяет с большей достоверностью определить природу электрогенных реакций в btf комплексе и относительный вклад отдельных реакций переноса зарядов в суммарный электрогенез.

Целью настоящей работы явилось изучение образования генерируемого цит b(f комплексом, с помощью прямого электрометрического метода, разработанного в НИИ ФХБ им А.Н. Белозерского МГУ, в модельной системе, состоящей из выделенных белков ФС 1 и b(f комплекса. Для этого были проведены предварительные эксперименты с использованием методов импульсной абсорбционной спектрометрии и ЭПР спектроскопии.

Были поставлены следующие задачи:

1) Сконструировать функционально-активную гибридную систему, состоящую из ФС 1 и цитохромного b!tf комплекса, а также продемонстрировать ее функционирование с помощью импульсной абсорбционной спектрометрии.

2) Подобрать условия встраивания ФС 1 и цитохромного b(f комплекса в мембраны протеолипосом и определить их ориентацию в мембранах.

3) Исследовать индуцированные светозависимым окислением Р700 в ФС 1 редокс реакции цитохромов Ъ и/ в растворе и в гибридных протеолипомах

4) Продемонстрировать взаимодействие между ФС 1 и цитохромным b/f комплексом в протеолиносомах путем peí истрации светозависимых сигналов ЭПР от катион-радикала Р700+.

5) С помощью прямого электрометрического метода изучить индуцированное лазерными вспышками образование трансмембранной разности электрических потенциалов, генерируемое цит b(f комплексом в гибридных протеолипосомах.

Научная новизна работы. Впервые была сконструирована функционально-активная модельная система, включающая выделенные пигмент-белковые комплексы цит b<f и ФС 1 в мембранах протеолипосом. На основании результатов, полученных с помощью импульсной абсорбционной спектрометрии, продемонстрировано эффективное взаимодействие двух белков в этой системе. Окислительно-восстановительные реакции цит b и / инициировались светоиндуцированным окислением Р700.

Были подобраны условия встраивания, при которых цит / bff комплекса и Р700 ФС 1 оказались локализованными вблизи от внешней поверхности протеолипосомальной мембраны. Это условие бы то необходимо для сопряженного электронного транспорта, опосредованного экзогенным цит с6.

Светозависимый перенос электронов в гибридных протеолипосомах был исследован методом ЭПР спектроскопии в Х- диапазоне. Взаимодействие между белковыми комплексами регистрировали по фотоиндуцированным изменениям сигнала ЭПР (I) от катион-радикала Р700+. Сопряжение между цит b(f комплексом

и ФС 1 наблюдалось только в присутствии цит с6 и химически восстановленного децилпластохинона (DPQH2), служащего донором электронов для цит комплекса. Ингибитор 00 сайта стигмателлин уменьшал амплитуду сигнала ЭПР и замедлял темновой спад, что свидетельствовало о переносе электронов от комплекса к ФС 1.

С помощью прямого электрометрического метода впервые были исследованы электрогенные реакции в гибридных протеолипосомах, содержащих ФС 1 и цит Ъ4- Продемонстрировано наличие, по крайней мере, двух электрогенных стадий, обусловленных работой Ъ4 комплекса: 1) N(^N0- чувешительной, связанной с протонированием Рр в сайте О,; 2) стигмателлин-чувствительной, связанной с переносом электрона между низкопотенциальным гемом Ь/ и высокопотенциальным гемом Ьили с электрогенным выбросом протонов в сайте С?0 при окислении Р<ЗН2.

Практическое значение работы. Результаты исследования существенно углубляют современные знания о природе и механизмах мектрогенных реакций в цит комплексе, а также о возможных взаимодействиях между мембранными белками. Использование модельной системы позволяет более точно выявить относительный вклад отдельных реакций переноса зарядов в суммарный электрогенез в Ь(/ комплексе. Определение оптимальных условий встраивания и взаимной ориентации ФС 1 и комплекса в мембранах протеолипосом может быть использовано для изучения взаимодействия между другими мембранными белками в модельных системах. Кроме того, фотосинтетические модельные системы могут быть использованы для изучения механизмов циклического переноса электронов, регуляции фотосинтетического переноса зарядов, а также для мониторинга окружающей среды, в частности для детектирования загрязнений гербицидами и ионами тяжелых металлов.

Апробаиия работы. Результаты диссертационной работы были представлены на XVII Путинских чтениях по фотосинтезу «Первичные процессы фотосинтеза в бактериальной и растительной фотосистеме II» (Пущино, 2002), на Международной конференции «Молекулярная биоэнер) етика цианобактерий» (Италия, Аквафредца ди Маратеа, 2003), на XVIII Пущинских чтениях по фотосинтезу «Первичные процессы фотосинтеза» (П>щино, 2003), на 13ой Европейской биоэнергетической конференции (Италия, Пиза, 2004), на Московском городском семинаре по биоэнергетике (2004), на Зей Всероссийской школе-симпозиуме «Динамика и структура в химии и биологии» (Черноголовка, 2005) и на семинаре кафедры биофизики МГУ (2005).

Публикации. По материалам исследований опубликовано 8 печатных работ.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, изложения результатов и их обсуждения,

выводов и списка цитируемой литературы. Работа иллюстрирована схемами, таблицами и рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы.

1.1. Культивирование Synechocystis sp. РСС 6803. Клетки цианобактерий Synechocysîis sp. РСС 6803 выращивали аэробно на свету в ферментере при +30 °С в среде BG 11 (Rippka et al., 1979). Клетки, собранные в ci ационарной фазе роста (на 4-5 сутки), осаждали центрифугированием при 5000 к g в течение 15 мин, промывали 2 раза буфером Tris-HCI, pH 7,5-8,0, суспендировали в минимальном объеме того же буфера с 20% глицерином. Хранили при - 70 °С .

1.2. Выделение белковых комплексов ФС 1, цит brf и цит с6. Комплекс ФС 1 выделяли по методу, описанному ранее в работах (Johnson et al., 2000; Shen et al., 2002). После разрушения клеток при помощи пресса Френча, тилакоидные мембраны осаждали центрифугированием при 50000 х g в течении 1 часа. Далее тилакоидные мембраны с концентрацией хлорофилла 0,5-1 мг/мл инкубировали 30 минут с 1 мМ СаС12, после чего проводили солюбилизацию в течение 1 часа с 1% октилглюкозидом при постоянном перемешивании. Для удаления неразрушившихся остатков мембран центрифугировали при 10000 х g 10-15 минут. Супернатант наносили в количестве не более 1 мл на непрерывный сахарозный градиент (5-20 %), в основе которого был 50 mM Tris-HCI буфер, pH 7,5 с добавлением 0,1% октилглюкозида, и центрифугировали при 140000 х g 21 час. Собирали нижнюю фракцию и диализовали против 1 л 50 мМ Tris-Hcl, pH 8,2. После диализа суспен шю вновь наносили на непрерывный градиент плотности сахарозы и центрифугировали при 140000 х g. Собирали нижнюю фракцию, ресуспендировали в буфере 50 мМ Tris-HCI, pH 8,2, содержащем 15% j лицерина и 0,03 % октилглюкозида и хранили при -70 °С.

Цит й</ комплекс из Synechocystis sp. РСС 6803 выделяли как в работе (Pierre et al., 1995). Клетки цианобактерий разрушали, продавливая три раза через ячейку пресса Френча. Тилакоидные мсбраны получали центрифугированием при 50000 х g в течение 1 часа. Солюбилизацию проводили в присутствии 0,2% холата натрия (x-Na) и 28 мМ октилглюкозида в темноте при перемешивании в течение 20-40 мин. Суспензию центрифугировали при 48000 х g. К супернатанту добавляли сульфат аммония до концентрации, составляющей 35% от насыщения. Центрифугировали при 160000 х g 30 минут. Супернаташ наносили на непрерывный градиент сахарозы 10-30%, в составе которою был 30 мМ Tris-HCI, pH 7,5, 5 мМ MgCl2, 5 мМ KCl, 50 мМ NaCl, 1 мМ EDTA с добавлением 0,2% x-Na и 10 мМ октилглюкозида, и центрифугировали при 140000 х g 21 час. Желто-коричневая полоса в середине пробирки, содержащая комплекс, собирали

шприцом. Цит bff комплекс хранили в присутствии 20 мМ сахарозы и 0,02 % октилглюкозида при -70 °С. Препараты h(f комплекса из шпината выделяли как в работе (Hurt & Hauska, 1981).

Цитохром с с выделяли по методу, описанному в работе (Но et al., 1979), хранили при -20 °С.

1.3. Химическое восстановление децилпластохинола (DPQH2).

Химическое восстановление децилпластохинола (C10-PQ, Sigma) проводили, в основном, как описано в работе (Roberts et al., 2002). Для этого раствор 10 мМ DPQH2 в этаноле восстанавливали, добавляя 2 мг боргидрида натрия. После 10 минут инкубации во льду, к раствору добавляли 5 мкл концентрированной НС1 для остановки реакции восстановления. Верхнюю фракцию собирали в отдельную пробирку и использовали для измерений.

1.4. Получение протеолипосом, содержащих ФС 1 и цит bff комплекс. Суспензию азолектина в Tris-HCl буфере, содержащем 2% x-Na, озвучивали 4-5 раз по 10 сек во льду с помощью дезинтегратора УЗДН-2Т (22 кГц, 50 мА) до просветления. Полученную суспензию липосом смешивали с комплексами ФС 1 (250 нМ) и b(f{500 нМ) (соотношение фосфолипид/белок - 30:1 по весу). После инкубации в течение 30 минут при 4 °С суспензию (фосфолипид: детергент: белок) диализовали против буфера Tris-HCl, рН 7,5, содержащего 40 мМ КС1, в течение 24 часов с двумя сменами буфера. После диализа суспензию центрифугировали 20 мин при 150000 х g (ротор Beckman Ti-50) для осаждения протеолипосом со встроившимися белками.

1.5. Измерение поглощения с помощью импульсной абсорбционной спектрометрии. Кинетику изменений оптического поглощения Р700, а так же цит / и цит b в ответ на единичную вспышку лазера регистрировали при помощи однолучевого спектрофотометра, собранного в нашей лаборатории на базе монохроматоров фирмы Jobin Yvon (Франция) и УМ-2, временное разрешение 1 мкс. Измерение оптического поглощения комплексов ФС 1 и цит b(f проводили в кварцевых кюветах объемом 1 мл (длина оптического пути 10 мм) в аэробных условиях при температуре +25°С. Среда измерения содержала 160 мМ сахарозы, 40 мМ КС1, 0,5 мМ EDTA, 7 мМ MgCl2, 10 мМ HEPES, рН 7,2. Концентрация ФС 1 в растворе была 300 нМ, btf комплекса- 1 мкМ. Накопление сигналов (10-100) проводили с интервалом 20 с между вспышками. В качестве источника возбуждающего света использовали импульсный неодимовый YAG лазер (YG-481 Quantel, полуширина импульса 15 не, энергия вспышки 30 мДж).

1.6. Регистрация светоиндуцированной кинетики генерации трансмембранной разности электрических потенциалов в гибридных системах. Кинетику генерации Аф в протеолипосомах регистрировали с помощью прямого электрометрического метода, временное разрешение 100 не (Драчев и др.,

1979; Drachev et al., 1981a, 1981b). При инкубации протеолипосом со встроенными белками в присутствии 25 мМ MgCl2 происходила их ассоциация с поверхностью искусственной липидной мембраны (ИЛМ) - коллодиевой пленки, пропитанной раствором 150 мг/мл азолектина в н-декане. Кинетику светоиндуцированнной генерации Ai/s обусловленной функционированием цит b,f комплекса, регистрировали при помощи хлорсеребряных макроэлектродов, погруженных в раствор по обе стороны от ИЛМ. Электрический сигнал с электродов поступал на операционный усилитель фирмы "Butt Brown" 3554 ВМ (США), а далее на регистрирующую плату GAGE 8012, встроенную в персональный комьпьютер.

1.7. Измерение спектров ЭПР. Спектры ЭПР снимали с помощью спектромера Varían Е-4 в X - диапазоне. Образец помещали в стандартную плоскую кварцевую кювету (внутренняя толщина 0,1 мм), помещенную в резонатор спектрометра ЭПР. Образец освещали насыщающим белым светом от лампы накаливания (100 Вт); инфракрасный свет отсекался водным фильтром (5 см слой воды). Сигналы от фотоокисленного Р700 записывали при 22 °С, при мощности микроволнового излучения 10 мВт и амплитуде ВЧ-модуляции 4 Гс. Для измерения кинетики светоиндуцированных окислительно-восстановительных изменений Р700 магнитное поле фиксировали, как правило, на низко-полевом пике сигнала ЭПР от Р700+.

1.8. Кинетический анализ сигналов. Кинетический анализ сигналов проводили при помощи программы GIM (разработана А.Л. Драчевым), Graph Explorer и Pluk (разработаны Я. Калайдзидис (Kalaidzidis et al., 1997)), а так же программы Origin 6.0 (Microcal, USA).

Результаты и обсуждение. 1. Взаимодействие ФС 1 в гибридной системе с донором электронов цит с6.

Для того, чтобы изучить электро! енные реакции в цит bfJ комплексе с помощью прямого электрометрического метода было необходимо провести предварительные эксперименты с выделенными белками ФС 1 и цит brf в растворе. Для эгого нами была сконструирована гибридная сис1ема, впервые описанная Ричем с соавторами (Rieh et al., 1987), с некоторыми модификациями. В частности, в качестве сопрягающего белка между ФС 1 и b(J комплексом мы использовали цит с6 вместо ПЦ. Гибридная система состояла из следующих компонентов: химически восстановленного DPQH2, цит с6, цит btf комплекса и ФС 1 из цианобактерии Synechocystis sp. РСС 6803. Окисление молекулы пластохинола в 0„-сайте bff комплекса инициировалось индуцированным лазерной вспышкой окислением Р700, который восстанавливался по следующей схеме:

DPQH2-»2Fe-2S-»nm-/-» цит с6-> Р700/Р7004

Для того, чтобы найти оптимальные условия взаимодействия между комплексами в гибридной системе необходимо было подобрать концентрации цит еб, осуществляющего перенос электроны от цит Ьг/ комплекса на ФС 1 и служащего донором электронов для Р700+ (рис.1).

Рис. 1 А показывает типичный фотоответ ФС 1 на единичную вспышку в растворе, содержащем 4 мМ аскорбата и 5 мкМ 2,6- дихлорфенолиндофенола (ОСР1Р). В отсутствие доноров электрона для фотооки с ленного Р700 (Р700+) и экзогенных акцепторов, кинетика восстановления Р700+ имеет характерное время т~ 100 мс (кривая 1). Это обусловлено рекомбинацией заряда между железо-серными центрами (РА/Ри)" и Р700+. Медленная компонента (т~1 с, 20% от общей амплитуды фотоответа), судя по всему, связана с окислением терминального акцептора (РА/Рв)~ кислородом среды инкубации.

При увеличении концентрации цит с6 от 0,6 мкМ (кривая 2) до 30 мкМ (кривая 4) происходил линейный рост константы скорости реакции, сопровождавшийся уменьшением вклада рекомбинации между (РА/РВ)" и Р700+. При конечной концентрации 30 мкМ (кривая 4) кинетика спада была двухфазной, с быстрой начальной фазой т~4 мс (амплитуда 70% от общей амплитуды фотоответа) и медленной фазой т~ 30 мс (амплитуда 30%).

Рис. 1. А. Регистрация индуцированных лазерной вспышкой изменений поглощения при 703 нм ФС 1 в растворе 10 мМ НЕРЕБ, рН 7,2, 160 мМ сахарозы, 40 мМ КС1, 0,5 мМ ЕОТА, 7 мМ МдСЬ- Восстановитель- аскорбат, медиатор-Е)СР1Р. 1- без цит с6; 2- 0,6 мкМ цит с6; 3- 15 мкМ цит с6; 4- 30 мкМ цит с6. Стрелкой показана вспышка лазера. Б. Зависимость константы скорости восстановления окисленного Р700 (регистрируемого по изменению индуцированного лазерной вспышкой изменения поглощения при 703 нм) от концентрации цит с^

0 20 40 60 80

Время, мс

О 5 10 18 20 25 30 35 40 [цит с6], мкМ

Рис. 1Б показывает результат титрования ФС 1 в растворе увеличивающимися концентрациями цит Сц. На начальном этапе титрования характерное время т восстановления Р700+ в присутствии 0,6 мкМ цит С(, составляло приблизительно 60 мс. При концентрации 30 мкМ характерное время г быстрой компоненты составляло ~5 мс, при дальнейшем увеличении концентрации цит с6 константа скорости этой компоненты переставала зависеть от концентрации донора.

В статье Херваса с соавторами (НегуаБ е! а!., 1995) было проведено сравнение кинетических данных по транспорту электронов между цит с</ ПЦ и фотоокисленным Р700 в различных фотосинтезирующих организмах. Было выделено 3 типа взаимодействия: I тип- простой бимолекулярный коллизионный механизм, характеризующийся линейной зависимостью константы скорости восстановления Р700+ от концентрации цит сУПЦ. II тип- двухступенчатый механизм, который включает в себя формирование комплекса с последующим транспортом электрона внутри комплекса. Кинетика транспорта электрона в этом случае является двухэкспоненциальной, и константа скорости псевдо-первого порядка имеет насыщающий профиль. III тип- включает в себя скорость лимитирующие конформационные изменения в комплексе ПЦ/цит с6 -ФС 1, происходящие перед транспортом электрона. Данные, представленные в нашей работе и описывающие транспорт электрона между цит с6 и цианобактериальной ФС 1, судя по всему, относятся к механизму второго типа с насыщающим профилем. С другой стороны, в предыдущих работах (Матес1оуа еТ а1., 1999) было показано наличие небольшой быстрой фазы при высокой концентрации белка-донора, константа скорости которой не зависела от концентрации ПЦ, что указывало на присутствие скорость-лимитируюгцих конформационных изменений, относящихся к механизму типа III. Это противоречие, вероятно, обусловлено значительно более высокой чувствительностью в случае электрометрических измерений по сравнению с оптическими измерениями.

2. Исследование гибридной системы в растворе с помощью импульсной абсорбционной спектрометрии.

Как было отмечено ранее, в ответ на одиночную лазерную вспышку в отсутствие комплекса наблюдалось быстрое фотоокисление Р700, который затем восстанавливался от цит с6. Кинетика восстановления Р700+ имела двухфазный характер. При добавлении цит Ъ6( комплекса и ПР<ЗН2 лазерная вспышка инициировала окисление ОР<ЗН2 6/ комплексом и восстановление фотоокисленного фотосистемой 1 цит Сб-

На рис. 2 А (кривая 1) и рис. 2 Б (кривая 1) представлены окислительно-восстановительные реакции в комплексе в отсутствие иш ибиторов. Окисление цит / происходило с характерным временем г ~6 мс (амплитуда 50% от общего

и

ответа), а его последующее восстановление с т~20 мс. Одновременно происходило быстрое восстановление цит Ъ с т~6 мс (25% от общей амплитуды ответа) с последующим медленным его окислением (т~70мс).

Восстановление цит Ъ-563 (т~6 мс) происходит значительно быстрее, чем восстановление цит / (т~20мс). Полученные нами результаты согласуются сданными Рича с соавторами '(Rich et al., 1987), а так же с рядом других исследований (Selak & Whitmarsh, 1982; Fernandez-Velasco et al., 2001). Более медленное восстановление цит / скорее всего, связано с конформационными изменениями в железо-серном центре Риске, происходящими при переносе электронов на цит / (Soriano et al., 1999; Kurisu et al., 2002). Как известно, восстановление протеида Риске является скорость-лимитирующей стадией транспорта электронов в цит 6</ комплексе. Перенос электрона на цит / осуществляется в три этапа: 1) восстановление железо- серного центра Риске от хинола; 2) поворот белка Риске на -25° и его перемещение на 16 Á по направлению к гему цитохрома f, 3) перенос электрона от центра Риске к цитохрому / Мы можем регистрировать только окислительно-восстановительные изменения в цит/и не можем измерить время, необходимое для восстановления железо-серного протеида Риске. Поэтому остается предположить, что более медленное восстановление/ по сравнению с восстановлением цит Ъ, по-видимому, связано именно с перемещением центра Риске.

А Б

Рис. 2. Регистрация индуцированного лазерной вспышкой изменения поглощения в гибридной системе, содержащей ФС 1, цит b<f комплекс, DPQH2 и цит с6 в растворе 10 мМ HEPES, pH 7,2, 160 мМ сахарозы, 40 мМ KCl, 0,5 мМ EDTA, 7 мМ MgCl2, при 554 нм- 542 нм (цит /) (А) и при 563-572 нм (цит Ь) (Б) 1 - без ингибиторов; 2 - с 8 мкМ NQNO; 3 - с 8 мкМ NQNO и 2 мкМ стигмателлина.

При добавлении ингибитора Q, сайта 2-п-нонил-4-оксихинолин-Ы-оксида (NQNO) в концентрации 8 мкМ в ответ на вспышку лазера наблюдалось быстрое восстановление цит b (т ~ 6 мс, амплитуда 25%), тогда как его окисление

практически полностью ингибировалось, рис. 2 Б (кривая 2). Этот эффект согласуется с данными по ингибированию htf комплекса HQNO (Selak & Whitmarsh, 1982), при добавлении которого в ответ на вспышку происходит полное ингибирование окисления цит Ъ. При данной концентрации NQNO также влиял на восстановление цит / которое замедлялось приблизительно в 4,5 раза (т ~90 мс), рис. 2 А (кривая 2). Полученные данные согласуются с экспериментами Хоучинса и Хинда на бактерии АпаЪаепа sp. 7120 (Houchins & Hind, 1983). Ими было показано, что в присутствии 3 мкМ NQNO в ответ на вспышку лазера происходило ингибирование окисления цит Ь-563. При добавлении 9 мкМ NQNO, ингибитор также замедлял восстановление цит / Селак и Витмарш (Selak & Whitmarsh, 1982) наблюдали такой же эффект в хлоропластах шпината, где добавление 10 мкМ NQNO ингибировало не только окисление цит Ь-563, но влияло также на восстановление цит/

Добавление 2 мкМ ингибитора Qc сайта стигмателлина на фоне NQNO полностью блокировало работу цит b(f комплекса, рис. 2 А (кривая 3), рис. 2 Б (кривая 3).

Таким образом, полученные данные продемонстрировали, что в растворе, содержащем ФС 1, цит bff комплекс, а также цит с6 и DPQH2 наблюдается эффективное взаимодействие между двумя пигмент-белковыми комплексами. При добавлении ингибитора Q, сайта NQNO в ответ на лазерную вспышку наблюдалась блокировка окисления цит Ь; при этом восе гановление цит / также замедлялось приблизительно в 4,5 раза. Добавление ишибиюра Q„ сайта стигмателлина на фоне NQNO полностью блокировало работу b(f комплекса.

3. Ориентация цитохромного bff комплекса и ФС 1 в протеолипосомах.

Следующей нашей задачей было встраивание цит h,f комплекса и ФС 1 в протеолипосомы с целью изучения механизма образования Атр цит b(f комплексом с помощью прямого электрометрического метода. Для решения этой задачи необходимо было определить ориентацию белковых комплексов в мембранах протеолипосом.

Доступность цит f для не проникающих через мембрану восстановителей можно использовать для оценки ориентации bff комплекса в протеолипосомах. Одним из наиболее часто применяемых непроникающих доноров электрона является аскорбат натрия, который в минутной шкале времени способен восстанавливать лишь редокс-центры, расположенные вблизи наружной поверхности мембраны. На рис. 3 А (кривая 2) представлен дифференциальный (восстановленный минус окисленный) спектр цит /в гибридных протеолипосомах максимум при 554 нм соответствует а-полосе восстановленного цит / В таких условиях наблюдается восстановление той фракции цит / в которой гем локализован вблизи наружной поверхности липосомальной мембраны. Полное восстановление цит/наблюдается при добавлении проникающего через мембрану

редокс-медиатора Л^,Лг,ЛгЛг-тетраметил-и-фенилендиамина (ТМФД) (кривая 3). Сравнение степени восстановленное™ цит / в присутствии и в отсутствие ТМФД позволяет определить, что -90% 2></ комплексов локализованы в мембранах протеолипосом таким образом, что, гем цит / расположен вблизи наружной поверхности мембраны.

5

Длина волны, нм Время, мин.

Рис. 3. (А) Разностный спектр комплекса в протеолипосомах, содержащих ФС1 и Ъ<$. 1 - К3[Ре(СМ)б] минус Кз[Ре(СЫ)6]; 2 - аскорбат натрия (2 мМ) минус Кз[Ре(СИ)6] (100 мкМ); 3 - аскорбат натрия (2 мМ), ТМФД (50 мкМ) минус Кз|Ре(СМ)б] (50 мкМ). Среда измерения содержала 0,16 М сахарозу, 40 мМ КС1, 0,5 мМ ЭДТА, 20 мМ МёС12, 20 мМ НЕРЕ8-ЫаОН (рН 7,5) (Б) Восстановление цит / аскорбатом натрия в цит комплексе в растворе (1) и после встраивания в фосфолипидные везикулы совместно с комплексом ФС 1 (2). В начальный момент времени в опытную кювету был добавлен 1 мМ аскорбата натрия и через указанные промежутки времени записаны разностные спектры поглощения против окисленного образца сравнения.

На рис. 3 Б представлена кинетика восстановления цит /аскорбатом натрия в растворе (кривая 1) и в мембранах протеолипосом (кривая 2). Видно, что встраивание цит комплекса в протеолипосомы практически не влияет на скорость восстановления цит / полувремя реакции в обоих случаях составляет 7090 с.

Ориентация комплексов ФС 1 в гибридных протеолипосомах была определена путем изучения влияния добавленного природного донора электронов цит с б на кинетику восстановления фотоокисленного димера хлорофилла Р700. На рис. 4 продемонстрированы кинетики индуцированных лазерными вспышками абсорбционных изменений на длине волны 703 нм, отражающих редокс-состояние Р700. В отсутствие экзогенных доноров и акцепторов электрона (кривая 1) кинетика темнового восстановления Р700+, в основном, обусловлена возвратом

фотомобилизованного электрона от терминальных железо-серных акцепторов РА/РВ с характерным временем -100 мс (УаяБШеу еХ а!., 1997).

-4*10"3-

- 8*10

-0.012

-0.016

2

/

1

\ I I

10 20 30 Время, мс

40

Рис. 4. Индуцированные лазерными вспышками абсорбционные изменения при 703 нм, отражающие редокс - состояние Р700 в гибридных протеолипосомах. 1- в присутствии 2 мМ аскорбата натрия; 2- в присутствии 2 мМ аскорбал а натрия и 30 мкМ цит Сб. Стрелкой показана вспышка лазера.

При добавлении цит с6 (кривая 2) наблюдается существенное ускорение кинетики восстановления Р700+. Очевидно, что не проникающий через липосомальную мембрану цт с6 способен взаимодействовать только с теми редокс-центрами Р700, которые локализованы вблизи наружной поверхности протеолипосом. Кинетический анализ показал, что экспоненциальная компонента с характерным временем <5 мс, обусловленная восстановлением Р700+ от цит с6, составляет -90%.

Таким образом, данные, приведенные на рис. 3 и 4. показывают, что более 90% комплексов ФС 1 и цит комплексов ориентированы в мембранах протеолипосом таким образом, что первичный донор Р700 и цит / доступны для непроникающих доноров.

Определенная нами ориентация пигмент-белковых комплексов ФС 1 и цит в протеолипосомах является удобной для изучения сопряжения между этими комплексами в модельной системе, поскольку экзогенный цит с6 является восстановителем для фотоокисленного Р700 и окислителем для цит Ъ4 комплекса (рис. 5).

2Н*

е'

/

I™ е I

'2

Р700

цит/

-Х-

4Н+

оМ

ЦИТ с6

Рис. 5. Схема переноса электронов в гибридных протеолипосомах. Индуцированное лазерной вспышкой разделение зарядов в ФС 1 вызывает окисление химически-восстановленного ЪР(ЗН2 цит комплексом через цит с&

4. Исследование сопряжения белков в протеолипосомах методом импульсной абсорбционной спектрометрии.

На рис. 6 А представлены изменения поглощения протеолипосом, содержащих ФС 1 и комплекс, индуцированные лазерной вспышкой. Как видно из рисунка, характерное время окисления цит / т составляет ~ 4 мс, а время его восстановления - т~ 40 мс (кривая 1). При добавлении 4 мкМ N(^N0 замедления восстановления цит / не наблюдалось (не показано). Ингибитор стигмателлин (2 мкМ) на фоне МОМО полностью подавлял перенос электронов в 6</ комплексе (рис. 6 А, кривая 3) Если проводить сравнение кинетики восстановления и окисления цит/в протеолипосомах и растворе, можно отметить, что окисление цит / в протеолипосомах ускоряется приблизительно в 2 раза Ускорение окисления цит / можно объяснить тем, что в протеолипосомах ФС 1 и цит 6</ сближены и взаимодействуют через локальный пул цит с6 (обсуждение см. ниже).

На рис. 6 Б представлены изменения поглощения, обусловленные редокс реакциями цит Ь в протеолипосомах в ответ на лазерную вспышку. Восстановление цит Ь происходило с характерным временем т -3,2 мс, тогда как окисление было замедлено (т ~ 90 мс) (кривая 1). При добавлении 4 мкМ N(^N0 происходило практически полное ингибирование окисления цит Ъ (кривая 2), а ингибитор стигмателлин (2 мкМ) полностью подавлял перенос электронов в комплексе (кривая 3).

Таким образом, в гибридных протеолипосомах в ответ на вспышки света мы наблюдаем окислительно-восстановительные реакции цит / и цит Ъ в Ъг(

комплексе, что указывает на эффективное сопряжение между встроенными белками.

Время, мс Время, мс

Рис. 6. Регистрация индуцированных лазерными вспышками изменений поглощения в протеолипосомах, содержащих ФС 1, цит ¿></ комплекс, Е)Р(^Н2 и цит с6 при 554-542 нм (цит¡) (А) и при 563-572 нм (цит Ъ) (Б) 1 - без ингибиторов; 2- с 4 мкМ NQNO; 3- с 4 мкМ ЫОЫО и 2 мкМ стигмателлина.

5. Изучение гибридной системы методом электронного парамагнитного резонанса.

Нами была предпринята попытка продемонстрировать сопряжение между ФС 1 и цит комплексом в протеолипосомах с помощью другого методического подхода - регистрации светозависимого сигнала ЭПР, отражающего редокс

Магнитное поле, Гс

Рис. 7. Спектр ЭПР протеолипосом, содержащих ФС 1 и цит Ь,/ комплекс в темноте и во время освещения.

переходы первичного донора ФС 1 - Р700. Метод ЭПР позволяет изучать процессы переноса электронов при стационарном освещении системы.

На рис. 7 представлены фотоиндуцированные изменения сигнала ЭПР окисленных реакционных центров Р700+ в гибридных протеолипосомах, содержащих ФС 1 и цит комплекс. Для измерения светозависимых изменений сигнала ЭПР протеолипосомы помещали в кварцевую кювету и освещали непрерывным белым светом в течение ~ 30 с. Разностный спектр ЭПР («свет»-«темнота») представляет собой типичный сигнал ЭПР от окисленных центров Р700+ со спектральными параметрами А//рр = 8 Гс, £ = 2.0025 (см\УеЬЬег & ЬиЬкг, 2001). Для того, чтобы регистрировать кинетику светоиндуцированных изменений величины сигнала ЭПР, магнитное поле фиксировали на низкополевом пике сигнала.

На рис. 8 представлены кинетики изменений сигнала ЭПР после выключения света, записанные в быстрой временной развертке. В качестве акцептора электронов для ФС 1 использовали метилвиологен (МВ) После выключения света восстановление Р700+ в гибридных протеолипосомах, характеризуется двухэкспоненциальной кинетикой. Как видно из рис. 8 Б (верхняя кривая), быстрая компонента в кинетике темпового восстановления Р7001" в протеолипосомах с ФС 1 и 6</ комплексом в присутствии цит с6 характеризуется

Время, с Время, с Время, с

Рис. 8. Сравнение кинетик темновых спадов после выключения освещения. А. Темновое восстановление полной системы: гибридные протеолипосомы с цит с6, БРОНг и МВ (нижняя кривая) и гибридных протеолипосом без экзогенных доноров с МВ (верхняя кривая); Б. Вся система (нижняя кривая) и только цит с« (верхняя кривая); В. К полной системе добавлен ингибитор стигмателлин (верхняя кривая).

При добавлении полного набора кофакторов переноса электронов (цит БРОНг и МВ), наблюдается существенное увеличение вклада быстрой

компоненты (до 80%) и заметное ускорение ее кинетики (t1/2 ~ 0,5 с) (нижние кривые на рис. 8 А, Б, В).

Ингибитор стигмателлин замедляет быструю компоненту темнового спада приблизительно в 3 раза (t)/2~l,5 с) (верхняя кривая, рис. 8 В) по сравнению с полной системой в отсутствие ингибиторов. Мы предполагаем, что компонента спада с tj/2 ~ 0,5 с обусловлена восстановлением фотоокисленного Р700 от hrf комплекса.

Таким образом, нам удалось наблюдать светоиндуцированные изменения сигнала ЭПР от Р700+, демонстрирующие перенос электронов от цит Ь/комплекса к ФС 1 в гибридных протеолипосомах. Этот процесс наблюдается только в присутствии цит с6 и химически восстановленного DPQH2. Ингибитор Q„ сайта стигмателлин уменьшает амплитуду ЭПР сигнала и замедляет темновой спад, что также свидетельствует о сопряжении переноса электронов между ФС 1 и цит 6</ комплексом.

Продемонстрированное нами с помощью абсорбционной спектрометрии и ЭПР спектроскопии эффективное взаимодействие между ФС 1 и цит b6f комплексом в протеолипосомах делает возможным исследование этой гибридной системы прямым электрометрическим методом.

7. Регистрация А^ в протеолипосомах с помощью прямого электрометрического метода.

Основная информация об электрогенных событиях, происходящих в цит brf комплексе, была получена на основе анализа медленной фазы электрохромных сдвигов полос поглощения каротиноидов, отражающих образование трансмембранной разности электрических потенциалов (Ау) в тилакоидах хлоропластов и на целых клетках (Jones & Whitmarsh, 1985, 1988; Joliot & Joliot, 1994, 1998). На основании этих измерений в тилакоидных мембранах было предположено, что основная электрогенная стадия (70-75%) обусловлена переносом электрона между двумя темами Ь, в то время как оставшиеся 25-30% элекгрогенеза, вероятно, связаны с окислением цитохрома b и/или с поглощением протонов из стромы при восстановлении PQ в сайте Q, (Jones & Whitmarsh, 1985, 1988).

Следует отметить, что во многих случаях интерпретация результатов, полученных при функционировании hrf комплекса, была основана на данных по механизму электрогенеза в более изученном цит Ьс: комплексе фотосинтезирующих бактерий. В соответствии с результатами, полученными в работе (Robertson & Dutton 1988), основные электрогенные реакции в Ьс/ комплексе были приписаны переносу электрона от гема b, к гему Ъ-п и от гема Ьн на молекулу убихинона в сайте Q,. Однако, согласно данным, полученным в нашей

лаборатории на хроматофорах фотосинтезирующих бактерий, было заключено, что перенос электрона от тема Ь/, на убихинон в сайте О, является электронейтральным, а электрогенные реакции в £сгкомплексе обусловлены тремя реакциями: 1) переносом электрона между темами 6/ и Ь^ 2) выбросом протонов при окислении 0Н2 в сайте С?0 и 3) поглощением протонов при восстановлении О в сайте (см. обзор Бешепоу, 1993).

0.0 - Мр 1 ..............

«с Э<-0 4 -<

-0 8 - (

100 мке —» е- 2 С -5

Время

Рис. 9. Фотоэлектрический ответ протеолипосом, содержащих комплексы ФС 1 и 6/ 1- в присутствии 2 мМ аскорбата натрия: 2 - условия, как на кривой 1, плюс 80 мкМ ОР<ЗН2 и 30 мкМ цит с6. Стрелкой показана вспышка лазера.

На рис. 9 (кривая 1) показано образование Ау в протеолипосомах, содержащих комплексы ФС 1 и ¿/из цианобактерии ВупесЬосувйь яр. РСС 6803, в ответ на лазерную вспышку. Генерация Ду (т< 100 не), со знаком «минус» вну три протеолипосом обусловлена разделением зарядов между первичным донором электрона Р700 и терминальными железо-серными кластерами РА/РВ в комплексах ФС 1 (Матес1оу е1 а1., 1996). Кинетика спада фотоэлектрического ответа с т~10-100 мс обусловлена рекомбинацией зарядов между кластерами (РА/Рв)~ и Р700+, тогда как быстрые компоненты относятся к обратному переносу электронов от более ранних акцепторов во фракциях ФС 1 с поврежденными железо-серными кластерами (УавгШеу et а1., 1997). Фаза спада с т > 300 мс определяется пассивным разрядом через липосомальную мембрану, что обусловлено взаимодействием Р700+ с искусственными донорами электронов вследствие окисления части терминальных акцепторов электронов кислородом.

При добавлении химически восстановленного БРОНг и цит с6 наблюдается существенное замедление спада Ах|/, а в кинетике нарастания фотоэлектрического

ответа, помимо быстрой фазы, появляются дополнительные более медленные фазы (рис. 9, кривая 2).

Рис. 10 (А) Фотоэлектрические ответы протеолипосом, содержащих комплексы ФС 1 и цит Ъ<£. 1 - в присутствии 2 мМ аскорбата натрия, 30 мкМ цит с6 и 80 мкМ ОРС>Н2; 2 - в присутствии 4 мкМ Ы<3>10; 3 - в присутствии 4 мкМ N(^N0 и 3 мкМ стигмателлина. (Б) Разность между фотоответами, изображенными в виде кинетических кривых, представленных на рис. 10. А.: 1- суммарная фаза, обусловленная функционированием Ьг/комплекса; 2 -МС)МО-чувствительная фаза 3 - стигмателлин-чувствительная фаза.

На рис.10 А (кривая 1) данные, представленные на рис. 9 (кривая 2), для наглядности приведены в другой временной развертке. Дополнительное нарастание Д\|/ начинает проявляться на временной развертке 100 мкс и завершается за время ~ 4 мс. Амплитуда этой электрогенной фазы составляет ~ 60% от амплитуды быстрой фазы, обусловленной образованием Р700+(ЕА/РВ)" в комплексах ФС 1. Добавление ингибитора С2, сайта Ь4 комплекса N(^N0 уменьшает медленную фазу нарастания фотоответа примерно на 40% (кривая 2), а последующее добавление ингибитора <3„ сайта стигмателлина приводит к полному исчезновению этой фазы (кривая 3). Проведенный ингибиторный анализ показывает, что наблюдаемая медленная фаза нарастания Ау обусловлена функционированием цит комплекса.

На рис.10 Б представлены разности между кривыми 1, 2 и 3 из рис. 10 А, демонстрирующие кинетику отдельных кинетических фаз, чувствительных к ингибиторам Ь(/ комплекса. Разность между фотоэлектрическими ответами в отсутствие ингибиторов и в присутствии стигмателлина (рис.10 Б, кривая 1) позволяет выделить суммарную фазу, обусловленную функционированием 6</ комплекса. Эта фаза хорошо аппроксимируется двумя примерно равными по

амплитуде экспоненциальными компонентами с характерными временами Т\ -0,1 ит2~2,3мс.

Разность между фотоответами в отсутствие ингибиторов и в присутствии NQNO (рис. 10 Б, кривая 2) позволяет выделить NQNO-чувствительную фазу нарастания Д\|/. Вычитание кинетической кривой в присутствии обоих ингибиторов из кривой в присутствии одного NQNO позволяет выявить стигмателлин-чувствительную фазу, устойчивую к NQNO (рис. 10 Б, кривая 3). Кинетики NQNO- и стигмателлин-чувствительных электрогенных фаз также описываются двумя экспоненциальными компонентами с характерными временами равными 0,1-0,2 и 2-2,5 мс.

Наблюдаемые электрогенные фазы, генерируемые b(f комплексом, в рамках Q-цикла могут быть обусловлены, по крайней мере, следующими процессами: (1) переносом электрона между низко- и высокопотенциальным темами Ь; (2) восстановлением пластохинона PQ в пластохинон-редуктазном сайте Q„ сопровождающемся его протонированием; (3) выбросом протонов при окислении PQH2 в пластохинол-оксидазном сайте Q0. Как было сказано выше, локус ингибирования NQNO в b<f комплексе является недостаточно четко установленным. В соответствии с данными, полученными в работе (Jones & Whitmarsh, 1995), этот ингибитор, подобно антимицину А в be j комплексе, избирательно препятствует восстановлению PQ в сайте Q„ однако, согласно работе (Houchins &, Hind, 1983), NQNO также частично ингибирует окисление PQH2 в сайте Q0.

Если исходить из того, что NQNO является специфическим ингибитором Q, -сайта комплекса brf, то он предотвращает реакцию (2), и в этом случае ингибируемый им электрогенез должен быть обусловлен восстановлением PQ в сайте Q„ сопровождающимся его протонированием. Фаза, чувствительная к NQNO, составляет около 40% от суммарного электрогенеза b<f комплекса. Что касается NQNO-резистентной, но чувствительной к стигмателлину фазы нарастания фотоэлектрического ответа, то она, вероятно, включает перенос электрона между низко- и высокопотенциальным темами Ъ (реакция 1), а также выброс протонов при окислении PQH2 в Qo-сайте (реакция 3). Отметим, что если NQNO частично ингибирует окисление PQH2 в сайте Q0, то относительный вклад реакции (2) в суммарный электрогенез может быть завышен за счет реакций П) и (3). Как указано выше, кинетика электрогенных реакций в цит £</ комплексе аппроксимируется двумя экспонентами с характерными временами Tj -0,1 и т2~2,3 мс. Компонента Т\ представляется слишком быстрой для того, чтобы быть приписанной электрогенным реакциям, непосредственно происходящим в комплексе, и может быть связана с электрогенным восстановлением Р700 от цит с6 (Mamedov et al., 1996).

Электрогенная реакция цит с6 —> Р700 может быть чувствительна к стигмателлину в случае, если ее компенсирует происходящий в противоположном направлении перенос электрона от цит f на цит с6, не сопровождающийся в этих условиях электрогенным выбросом протонов (Semenov et al., 1996). Характерное время компоненты г2 близко к характерным временам восстановления цт Ъ6, и медленной компоненты электрохромного сдвига полос поглощения каротиноидов в хлоропластах (Jones & Whitmarsh, 1988; Finazzi & Rappaport, 1998; Soriano & Cramer, 2001; Hope et al., 1992).

Совпадение характерных времен NQNO-чувствительной и стигмателлин-чувствительной электрогенных фаз указывает на наличие единой для этих реакций скорость-лимитирующей стадии. Такой стадией, в соответствии с моделью, предложенной Хоупом (Норе et al., 1992) является окисление PQH2 в сайге Q0

Существуют различные механизмы взаимодействия и переноса электронов между встроенными в мембрану пигмент-белковыми комплексами и растворимыми белками ПЦ или цит с6 (Musiani et al., 2005). Время существования комплекса между цит / и ПЦ составляет всего ~ 100 мкс (Ubbink, 2004); именно в течение этого времени между ними должен произойти перенос электрона. Поскольку ПЦ функционирует как переносчик элекгронов между цит brf комплексом и ФС 1. то он формирует комплексы с обоими мембранно-связанными белками. Было предположено, что существенная фракция ФС 1 и цит brf комплексов in vivo организована в суперкомплексы, которые включают в себя один цитохромный b(f комплекс, одну ФС 1, один ПЦ и одну молекулу ферредоксина (Joliot & Joliot, 2002). Предполагалось, что именно в этих суперкомплексах и происходит циклический транспорт электронов в листьях высших растений. Ранее, для объяснения того факта, что перенос электронов, вызванный вспышкой света, происходит с большой скоростью (Мамедов и др., 2003) нами было высказано предположение, что в гибридных протеолипосомах также возможно образование суперкомплексов между цит brf, ФС 1 и цит с6.

Однако, на основании моделирования взаимодействия между b(f комплексом из шпината, ПЦ и ФС 1, было показано, что формирование таких суперкомплексов маловероятно (Musiani et al.. 2005). Хотя сайты связывания ПЦ с ФС 1 и b(f комплексом не идентичны, они достаточно близки друг к другу (рис. 11): 1) отрицательно заряженный кластер аминокислотных остатков на поверхности ПЦ взаимодействует с кластером основных аминокислотных остатков вблизи N-терминального участка субъединицы PsaF комплекса ФС 1; почти тот же кластер ПЦ взаимодействует с положительно заряженными остатками, локализованными на поверхности цит /; 2) комплекс с ФС 1 включает в себя всю гидрофобную поверхность ПЦ (между остатками Gly-10 и Ala -90), тогда как комплекс ПЦ с цит f - участок, окружающий Ala -90; 3) оба пути переноса электрона через ПЦ

включают лиганд атома меди - His-87 (Норе, 2000; Illerhaus et al., 2000; Myshkin et al., 2002).

Рис. 11. Схематическое изображение взаимодействия ГГЦ с цит/цит btf комплекса и с ФС 1. G10 = Gly-10, А90 = Ala -90.

Для того, чтобы, с одной стороны, объяснить экспериментальные данные свидетельствующие о возможном образовании суперкомплекса (Joliot & Joliot, 2002), а, с другой стороны, структурные данные о частично перекрывающихся сайтах взаимодействия между ГТЦ-цит/и ПЦ-ФС 1 можно предположить, что:

1) диффузия ПЦ происходит не в объеме, а в плоскости мембраны, что ведет к значительному увеличению скорости переноса электронов между пигмент-белковыми комплексами. Такой механизм был предложен ранее для описания взаимодействия цит с2 с бактериальными реакционными центрами (Overfiel & Wraight, 1980).

2) существует небольшой локальный пул ПЦ, участвующий в переносе электронов между цит h(j'и ФС 1; скорость обмена между локальным и основным пулом ПЦ намного мед.юнее, чем перенос электронов между цит b(f, ПЦ и ФС 1. Другими словами, можно предположить, что цит b<f и ФС 1 не формируют истинного суперкомплекса, так как последний подразумевает одновременное взаимодействие с одной и той же молекулой ПЦ Наличие локального пула убихинона было предложено ранее для описания взаимодействия между цит bct комплексом и фотосинтетическим реакционным центром в хроматофорах пурпурных бактерий (Drachev et al.,1989);

3) окисленный ПЦ может иметь более низкое сродство к ФС 1 и большее сродство к цит / Действительно, было продемонстрировано прочное связывание восстановленного ПЦ и значительно более слабое взаимодействие окисленного ПЦ с ФС 1 (Drepper et al., 1996).

Возможно также, что все три приведенных выше механизма moi ут вносить вклад в эффективное взаимодействие между цит b<f комплексом и ФС 1

Таким образом, в настоящей работе впервые удалось продемонстрировать эффективное сопряжение переноса электронов между ФС 1 и пит b<f комплексом в мембранах протеолипосом и зарегистрировать электрогенные реакции при переносе зарядов в цит b$f комплексе в модельной системе.

ВЫВОДЫ

1. Исследование гибридной системы, содержащей циг Ь(/комплекс, ФС I, цит сй и химически восстановленный депил-пластохинол (ОР0И2), с помощью метода импульсной абсорбционной спектрометрии продемонстрировало светозависимый перенос зарядов в 6</комплексе, обусловленный сопряжением между ФС 1 и циг Ингибитор хинон-редуктазного сайта (О,) N0140 предотвращал окисление цит Ь, а ингибитор хинол-оксидашого сайта (Г)0) стигмателлин на фоне NQNO полностью подавлял работу пит комплекса

2. Показано, что комплексы цит Ьг/ и ФС 1, встроенные в мембраны протеолипосом, ориентированы таким образом, что первичный донор ФС 1 -димер хлорофилла Р700 и цит / доступны для экзогенных непроникающих доноров и акцепторов.

3. Методом ЭПР на гибридных протеолипосом ах продемонстрированы светоиндуцированные изменения редокс-состояния Р700, сопряженные с переносом электронов от цит комплекса к ФС 1. Сопряжение наблюдалось только в присутствии цит с6 и химически восстановленного ПРОН?, донора электронов для циг Ь^комплекса. Ингибитор О0 сайта стигмателлин замедлял кинетику быстрой компоненты спада сигнала ЭПР и сущес гвенно уменьшал ее вклад, что также свидетельствовало о сопряженном переносе электронов от 6</ комплекса к ФС 1.

4. С помощью прямого электрометрического метода на гибридных протеолипосомах выявлены генерируемые цит Ь(комплексом электрогенные фазы, которые обусловлены следующими процессами- (1) переносом электрона между низко- и высокопотенциальным темами Ь и выбросом протонов при окислении РОН2 в пластохинол-оксидазном сайге Оо, (-) восстановлением пластохинона РО в пластохинон-редуктазном сайте 0„ сопровождающимся его протонированием

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Mamedov M.D., Vitukhnovskaya L.A.. Semenov A.Yu. Structural and functional similarities and distinctions between reaction centers from purple bacteria and photosystem I complexes. Abstracts of XYII Puschino Readings in Photosynthesis and International Conference "Primary Processes of Photosynthesis in Bacteria and Plant Photosystem П, Puschino, 2002, p. 28.

2. Trubitsin B.V., Mamedov M.D., Vitukhnovskaya L.A.. Semenov A.Yu., Tikhonov A.N. EPR study of light-induced regulation of photosynthetic electron transport in Synechocystis sp. PCC 6803 cells. FEBS Letters, 2003, vol. 544,15-20.

3. Mamedov M.D., Vitukhnovskaya L.A.. Semenov A.Yu. Flash-induccd voltage changes in proteoliposome containing Photosystem I and cytochrome b(f complexes from cyanobacteria. Conference "Molecular Bioenergetics of cyanobacteria", Acquafredda di Maratea, Italy, 2003, p. 17-22.

4. Mamedov M.D., Vitukhnovskaya. L.A., Semenov, A.Yu. Study of Electrogenic Reactions of cytochrome bff complexes in model systems. Abstracts of XYIII Puschino Readings in Photosynthesis and International Conference "Primary Processes of Photosynthesis", Pushchino, 2003, p 30.

5. Мамедов М.Д., Витухновская JI.A., Засна A.A., Семенов А.ГО. (2003) Исследование электрогенных реакций в цитохромных bff комплексах в модельной системе Биофизика, 44, 1044-1051.

6. Semenov A.Yu, Vitukhnovskaya L.A.. Mamedov M.D. Study of electrogenic reactions of cytoclirome b(f complexes in model system. 13th European bioenergetics conference. Italy, Pisa, 2004, p. 172.

7. Tikhonov A.N., Trubitsin B.N., Ptushenko V.V., Koksharova O.A., Mamedov M.D., Vitukhnovskaya L.A. Oxygen-dependent interrelations between photosynthetic and lespiratory electron transport chains in Synechocystis sp. PCC 6803.13th European bioenergetics conference. Italy, Pisa, 2004, p. 262.

8. Trubitsin B.V., Ptushenko V.V., Koksharova O.A., Mamedov M.D., Vitukhnovskaya LA.. Grigor'ev I. A., Semenov A.Yu. and Tikhonov A.N. (2005) EPR Study of Electi on Transport in Cells of Cyanobacteria Synechocystis sp PCC 6803. Biochim. Biophys. Acta, vol. 1708,238-249.

Подписано в печать 17.11.2005 Формат 60x88 1/16. Объем 1.5 пл. Тираж 100 экз. Заказ № 155 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119992 г.Москва, Ленинские горы, д.1 Главное здание МГУ, к. 102

2 2 В Ь Ь

РНБ Русский фонд

2006-4 26789

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Витухновская, Лия Алексеевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Структурные особенности цитохромного btf комплекса

1.1.1. Дополнительный гем на стромальной поверхности Qj сайта (гем х) и его функции

1.1.2. Хлорофилл а, /?- каротинойд и эндогенные липиды

1.1.3. Сходство и различие цитохромного b$f комплекса с цитохромным Ъс\ комплексом

1.2. Перенос электронов в цитохромном b<f комплексе

1.2.1. Перенос электронов от хинола к высокои низкопотенциальным цепям

1.2.2. Перенос электронов к цитохрому/ через протеид Риске

1.2.3. Электрогенные реакции в к/ и в b$f комплексе

1.2.4. Циклический транспорт электронов

1.2.5. Ингибиторы b$f комплекса

1.3. Перенос электронов от цитохрома/ к фотосистеме

1.4. Структурные аспекты ФС

1.4.1. Строение цианобактериальной ФС

1.4.2. Строение эукариотической ФС

1.5. Электрон- транспортная цепь 35 1.5.1. Современные данные по переносу электронов в ФС

1.5.1.1. Первичный перенос электронов (от возбужденного Р700 черезАокА])

1.5.1.2. Вторичный перенос электронов ( от Ai" к железо- серным кластерам Fx Fa FB)

1.5.1.3. Перенос электронов от FB на ферредоксин/ флаводоксин

1.6. Фотосинтетические гибридные системы в растворе

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. ПРЕПАРАТИВНЫЕ МЕТОДЫ

2.1.1. Используемые реактивы

2.1.2. Выращивание клеток Synechocystis sp. РСС

2.1.3. Выделение фотосистемы

2.1.4. Выделение цитохромного b$f комплекса

2.1.5. Измерение активности цитохромного b$f комплекса

2.1.6. Выделение пластоцианина

2.1.7. Выделение цитохрома ев

2.1.8. Химическое восстановление децилпластохинола

2.1.9. Получение протеолипосом

2.2. АНАЛИТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

2.2.1. Измерение спектров оптического поглощения

2.2.2. Светоиндуцированные изменения оптического поглощения

2.2.3. Регистрация светоиндуцированной кинетики генерации трансмембранного потенциала в гибридных системах

2.2.4. Кинетический анализ сигналов

2.2.5. Измерения спектров ЭПР

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Кинетические исследования переноса электрона в гибридной системе, состоящей из цитохромного b$f комплекса и ФС 1 в растворе.

3.1.1. Взаимодействие ФС 1 в гибридной системе с донором электронов цит ев в растворе

3.1.2. Исследование гибридной системы в растворе с помощью импульсной абсорбционной спектрометрии

3.2. Кинетические исследования переноса электрона в гибридной системе, состоящей из цит btf комплекса и ФС 1 в протеолипосомах.

3.2.1 Ориентация цитохромного b(f комплекса и ФС 1 в протеолипосомах

3.2.2. Исследование сопряжения белков в протеолипосомах методом импульсной абсорбционной спектрометрии

3.2.3. Изучение гибридной системы методом электронного парамагнитного резонанса

3.2.4. Исследование гибридных протеолипосом, содержащих ФС 1 и цит b(f комплекс методом ЭПР

3.2.4.1. Регистрация Д\|/ в протеолипосомах

Введение Диссертация по биологии, на тему "Сопряжение между фотосистемой 1 и цитохромным b6f комплексом в модельных системах"

Актуальность проблемы. Исследование фотосинтеза, как комплекса реакций превращения солнечной энергии в энергию химических связей, представляет собой одну из наиболее актуальных проблем современной биологии.

В фотосинтетической электрон-транспортной цепи (ЭТЦ) высших растений, водорослей и цианобактерий функциональными блоками являются фотосистемы (ФС) 1 и 2, а таюке цитохромный (цит) b$f комплекс, осуществляющий перенос электронов от липофильного двухэлектронного донора пластохинола на одноэлектронный водорастворимый белок пластоцианин (ПЦ) или цит сс (альтернативный переносчик электронов у цианобактерий). Согласно классической линейной Z-схеме фотосинтетическая ЭТЦ обеспечивает расщепление воды с образованием кислорода на донорной стороне ФС 2 и восстановление НАДФ до НАДФН на акцепторной стороне ФС 1.

В некоторых условиях (присутствие ингибиторов ФС 2, анаэробные условия) наблюдается циклический транспорт электронов, включающий только два пигмент-белковых комплекса фотосинтетической цепи - ФС 1 и цит b$f комплекс. Однако механизм этого процесса недостаточно изучен, поэтому исследование взаимодействия между ФС 1 и цит b$f комплексом представляется важной и актуальной проблемой.

ФС 1 осуществляет фотоиндуцированное трансмембранное разделение зарядов, сопряженное с транспортом электронов от периферических белков - цит с6 или ПЦ к природным акцепторам - ферредоксину (или альтернативному акцептору электронов у цианобактерий - флаводоксину) от первичного донора электронов - димера хлорофилла Р700 через цепь кофакторов - Ао (хлорофилл а), Aj (филлохинон или витамин К) и железосерные кластеры Fx, Fa, Fb.

Цит btf комплекс, согласно схеме Q-цикла, предложенной Митчелом (Mitchell, 1975), окисляет молекулу пластохинола (PQH2) в хинол-оксидазном Qo-сайте. Окисление PQH2 сопровождается депротонированием, при этом один электрон поступает на высокопотенциальный участок цепи (железо-серный центр Риске - цит /), а другой - на цит Ъ, восстанавливая связанную с хинон-редуктазным сайтом Q; молекулу пластохинона (PQ) с образованием семихинона. При повторном обороте фермента семихинон анион-радикал восстанавливается до PQH2. Таким образом, в результате полного цикла работы b<f комплекса происходит окисление двух молекул PQH2, за которым следует выброс 4 Yt в люмен, поглощение 2 Н- из стромы и восстановление одной молекулы PQ в Q; сайте.

Значительный прогресс в изучении этих двух белковых комплексов был связан с проведением рентгеноструктурного анализа кристаллов ФС 1 из термофильной цианобактерии Synechococcus elongatus с разрешением 2,5 А (Jordan et al, 2001), и цит b<f комплекса из термофильной цианобактерии Mastigocladus laminosus с разрешением 3,5 A (Kurisu et al., 2003) и из водоросли Chlamydomonas reinhardtii с разрешением 3,1 A (Stroebel et al., 2003). Были оценены расстояния между кофакторами ферментов, а также выявлены основные структурные особенности b$f комплекса, в частности, был найден новый, ковалентно-связанный гем х, по-видимому, относящийся к гемам типа с'. Предполагается, что гем х может участвовать в циклическом перенос электронов.

Транспорт электронов между b$f комплексом и ФС 1 ранее изучали, главным образом, на нативных объектах: листьях высших растений, хлоропластах, субхлоропластных частицах и клетках цианобактерий. Перенос электронов между выделенными из высших растений белками ФС 1 и b<f исследовали только в растворе (Rich et al, 1987). В нашей работе впервые была предпринята попытка изучить взаимодействие между этими двумя пигмент-белковыми комплексами в мембранах протеолипосом с помощью импульсной абсорбционной спектрометрии, ЭПР спектроскопии и прямого электрометрического метода.

Перенос электронов при функционировании b$f комплекса сопряжен с генерацией трансмембранной разности электрических потенциалов (Ау), образование которой до настоящего момента изучалось методом регистрации электрохромного сдвига полос поглощения каротиноидов в тилакоидах хлоропластов (Jones & Whitmarsh, 1988) и целых клетках (Joliot & Joliot, 1994, 1998). Этот метод, несмотря на широкое применение, является косвенным, и при интерпретации данных не вполне однозначным. Было предположено, что основная электрогенная стадия (70-75%) обусловлена переносом электрона между двумя темами b, в то время как оставшиеся 25-30% электрогенеза, вероятно, связаны с окислением цитохрома b и/или с поглощением протонов из стромы при восстановлении PQ в сайте Qj. Тем не менее, анализ литературных данных показывает, что как механизмы сопряжения электронного транспорта с образованием Д\|/ в цит btf комплексе, так и природа наблюдаемых электрогенных стадий остаются невыясненными.

Более прямым способом регистрации образования мембранного потенциала является электрометрический метод, разработанный в НИИ ФХБ им. А.Н. Белозерского МГУ. Ранее этот метод был успешно применен для изучения природы и механизмов электрогенных реакций в функциональном аналоге комплекса - цитохромном bci комплексе пурпурных фотосинтезирующих бактерий. Однако электрометрический метод не применим к целым клеткам и хлоропластам. Для регистрации мембранного потенциала этим методом необходимо было выделить комплексы b$f и ФС 1, встроить их в мембраны протеолипосом и подобрать условия эффективного взаимодействия. В настоящей работе электрогенные реакции, сопровождающие перенос зарядов в цит b$f комплексе были впервые исследованы в модельной системе. Применение прямого электрометрического метода позволяет с большей достоверностью определить природу электрогенных реакций в b$f комплексе и относительный вклад отдельных реакций переноса зарядов в суммарный электрогенез.

Целью настоящей работы явилось изучение генерации трансмембранной разности электрических потенциалов в цит b$f комплексе с промощью прямого электрометрического метода, разработанного в НИИ ФХБ им А.Н. Белозерского

МГУ, в модельной системе, состоящей из выделенных белков ФС 1 и b$f комплекса. Для этого были проведены предварительные эксперименты с использованием методов импульсной абсорбционной спектрометрии и ЭПР спектроскопии.

Были поставлены следующие задачи:

1) Сконструировать функционально-активную гибридную систему, состоящую из ФС 1 и цитохромного b$f комплекса, а также продемонстрировать ее функционирование с помощью импульсной абсорбционной спектрометрии.

2) Подобрать условия встраивания ФС 1 и цитохромного b$f комплекса в мембраны протеолипосом и определить их ориентацию в мембранах.

3) Исследовать индуцированные светозависимым окислением Р700 в ФС 1 редокс реакции цитохромов b и/ в растворе и в гибридных протеолипомах.

4) Продемонстрировать взаимодействие между ФС 1 и цитохромным b$f комплексом в протеолипосомах путем регистрации светозависимых сигналов ЭПР от катион-радикала Р700+.

5) С помощью прямого электрометрического метода изучить индуцированное лазерными вспышками образование трансмембранной разности электрических потенциалов, генерируемое цит b/f комплексом в гибридных протеолипосомах.

Научная новизна работы. Впервые была сконструирована функционально-активная модельная система, включающая выделенные пигмент-белковые комплексы цит b<f и ФС 1 в мембранах протеолипосом. На основании результатов, полученных с помощью импульсной абсорбционной спектрометрии, продемонстрировано эффективное взаимодействие двух белков в этой системе. Окислительно-восстановительные реакции цит b и / инициировались светоиндуцированным окислением Р700.

Были подобраны условия встраивания, при которых цит / b<f комплекса и Р700 ФС 1 оказались локализованными вблизи от внешней поверхности протеолипосомальной мембраны. Это условие было необходимо для сопряженного электронного транспорта, опосредованного экзогенным цит eg.

Светозависимый перенос электронов в гибридных протеолипосомах был исследован с помощью ЭПР спектроскопии в Х-полосе. Взаимодействие между белковыми комплексами регистрировали по изменениям сигналов ЭПР от катион-радикала Р700+ при включении освещения. Сопряжение наблюдалось только в присутствии цит сб и химически восстановленного DPQH2. Ингибитор Q0 сайта стигмателлин уменьшал амплитуду сигнала ЭПР и замедлял темновой спад, что свидетельствовало о сопряженном переносе электронов от b$f комплекса к ФС 1.

С помощью прямого электрометрического метода впервые были исследованы электрогенные реакции в гибридных протеолипосомах, содержащих ФС 1 и цит b<f. Продемонстрировано наличие, по крайней мере, двух электрогенных стадий, обусловленных работой b$f комплекса: 1) NQNO-чувствительной, связанной с протонированием PQ в сайте Qj; 2) стигмателлин-чувствительной, связанной с переносом электрона между высокопотенциальным гемом bi и низкопотенциальным гемом Ьи, или с электрогенным выбросом протонов в сайте Q0 при окислении PQH2.

Практическое значение работы. Результаты исследования существенно углубляют современные знания о природе и механизмах электрогенных реакций в цит b$f комплексе. Использование модельной системы позволяет более точно выявить относительный вклад отдельных реакций переноса зарядов в суммарный электрогенез в b$f комплексе. Определение оптимальных условий встраивания и взаимной ориентации ФС 1 и b$f комплекса в мембранах протеолипосом может быть использовано для изучения взаимодействия между другими мембранными белками в модельных системах. Кроме того, фотосинтетические модельные системы могут быть использованы для мониторинга окружающей среды, в частности для детектирования загрязнений гербицидами и ионами тяжелых металлов.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Витухновская, Лия Алексеевна

ВЫВОДЫ

1. Исследование гибридной системы, содержащей цит b$f комплекс, ФС 1, цит с6 и химически восстановленный децил-пластохинол (DPQH2), с помощью метода импульсной абсорбционной спектрометрии продемонстрировало светозависимый перенос зарядов в b$f комплексе, обусловленный сопряжением между ФС 1 и цит b$f. Ингибитор хинон-редуктазного сайта (Qs) NQNO предотвращал окисление цит Ь, а ингибитор хинол-оксидазного сайта (Q0) стигмателлин на фоне NQNO полностью подавлял работу цит b(f комплекса.

2. Показано, что комплексы цит b$f и ФС 1, встроенные в мембраны протеолипосом, ориентированы таким образом, что первичный донор ФС 1 -димер хлорофилла Р700 и цит / доступны для экзогенных непроникающих доноров и акцепторов.

3. Методом ЭПР на гибридных протеолипосомах продемонстрированы светоиндуцированные изменения редокс-состояния Р700, сопряженные с переносом электронов от цит b$f комплекса к ФС 1. Сопряжение наблюдалось только в присутствии цит с<$ и химически восстановленного DPQH2, донора электронов для цит b<f комплекса. Ингибитор Q0 сайта стигмателлин замедлял кинетику быстрой компоненты спада сигнала ЭПР и существенно уменьшал ее вклад, что также свидетельствовало о сопряженном переносе электронов от btfкомплекса к ФС 1.

4. С помощью прямого электрометрического метода на гибридных протеолипосомах выявлены генерируемые цит b$f комплексом электрогенные фазы, которые обусловлены следующими процессами: (1) переносом электрона между низко- и высокопотенциальным темами b и выбросом протонов при окислении PQH2 в пластохинол-оксидазном сайте Q0, (2) восстановлением пластохинона PQ в пластохинон-редуктазном сайте Qi, сопровождающимся его протонированием.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Целью диссертационной работы явилось изучение образование трансмембранной разности электрических потенциалов в цитохромном b$f комплексе с помощью прямого электрометрического метода, разработанного в НИИ ФХБ им А.Н. Белозерского МГУ. Для этого было исследовано взаимодействие между выделенными пигмент-белковыми комплексами ФС 1 и цит b$f с использованием методов импульсной абсорбционной спектрометрии и ЭПР спектроскопии в растворе и в мембранах протеолипосом.

Значительный прогресс в изучении ФС 1 и цит b$f комплекса был связан с проведением рентгеноструктурного анализа кристаллов ФС 1 из термофильной цианобактерии Synechococcus elongatus с разрешением 2,5 A (Jordan et al, 2001), и цит b$f комплекса из термофильной цианобактерии Mastigocladus laminosus с разрешением 3,5 A (Kurisu et al., 2003) и из водоросли Chlamydomonas reinhardtii с разрешением 3,1 A (Stroebel et al., 2003). Однако транспорт электронов между b$f комплексом и ФС 1 ранее изучали, главным образом, на нативных объектах: листьях высших растений, хлоропластах и субхлоропластных частицах. Перенос электронов между выделенными из высших растений белками ФС 1 и b<f исследовали только в растворе (Rich et al, 1987).

В первом разделе экспериментальной части работы была предпринята попытка сконструировать функционально-активную гибридную систему, содержащую ФС 1 из цианобактерии Synechocystis sp. РСС 6803, b(f комплекс из шпината, цит с6 и химически восстновленный DPQH2. С помощью метода импульсной абсорбционной спектрометрии было показано эффективное сопряжение между белковыми комплексами в растворе. При добавлении NQNO, ингибитора Q; сайта, наблюдалась ингибирование окисления цит Ь, и некоторое замедление восстановления цит f. Добавление ингибитора Q0 сайта стигмателлина на фоне NQNO полностью блокировало работу b<f комплекса.

На втором этапе работы была осуществлена реконструкция цит b$f комплекса и ФС 1 в протеолипосомы. Были подобраны условия встраивания, при которых цит / b<f комплекса и Р700 ФС 1 оказались локализованными вблизи от внешней поверхности протеолипосомальной мембраны. Это условие было необходимо для сопряженного электронного транспорта, опосредованного экзогенным цит с6.

Третьим эпатом работы было исследование светозависимого переноса электронов в гибридных протеолипосомах с помощью ЭПР спектроскопии в 3-х см диапазоне. Взаимодействие между белковыми комплексами регистрировали по изменениям сигнала ЭПР от катион-радикала Р700+ при включении освещения. Сопряжение наблюдалось только в присутствии цит с6 и химически восстановленного DPQH2. Ингибитор Q0 сайта стигмателлин уменьшал амплитуду сигнала ЭПР и замедлял темновой спад, что свидетельствовало о сопряженном переносе электронов от b$f комплекса к ФС 1.

В четвертой части работы исследовались электрогенные реакции в гибридных протеолипосомах, содержащих ФС 1 и цит b$f с помощью прямого электрометрического метода. Нами было продемонстрировано наличие, по крайней мере, двух электрогенных стадий, обусловленных работой b$f комплекса: 1) NQNO- чувствительной, вероятно, связанной с протонированием PQ в пластохинон-редуктазном сайте Qs; 2) стигмателлин-чувствительной, связанной с переносом электрона между темами Ь\ и Ь}„ и с электрогенным выбросом протонов в сайте пластохинол-оксидазном сайте Q0 при окислении PQH2.

Нужно отметить, что при запуске переноса зарядов в b$f комплексе в нативных системах соотношение амплитуд отдельных электрогенных фаз не вполне определено вследствие трудности определения стехиометрии работающих btf комплексов и инициирующих их работу фотосистем. Следствием этого является неопределенность числа оборотов b$f комплекса в ответ на вспышку. В то же время, при запуске b$f комплекса от ФС 1 в модельной системе соотношение электрогенных фаз можно оценить с большей достоверностью. В пользу этого утверждения свидетельствует тот факт, что чувствительная к NQNO электрогенная фаза в модельной системе вносит больший вклад в суммарный электрогенез по сравнению с нативными системами (см. Jones & Whitmarsh, 1985). Действительно, при большем числе оборотов цит b(f комплекса, вероятно происходящих в нативных системах, относительный вклад электрогенного протонирования пластохинона в Q; сайте должен быть меньше, чем в нашей модельной системе.

На основании полученных данных, для объяснения того факта, что кинетика индуцированного вспышкой света переноса электронов в btf комплексе в модельной системе сравнима с кинетикой этого процесса в нативных мембранах, нами было высказано предположение, что в гибридных протеолипосомах либо происходит образование суперкомплексов между цит b$f, ФС 1 и цит с6, либо взаимодействие между цит b$f и ФС 1 осуществляется через локальный пул цит сб.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Витухновская, Лия Алексеевна, Б.м.

1. Драчев Л. А., Каулен А.Д., Самуилов В.Д., Северина И.И., Семенов А.Ю., Скулачев В.П., Чекулаева Л.Н. (1976) Встраивание протеолипосом и хроматофоров в мембраны на основе фильтров. Биофизика, 24, 1035-1042.

2. Драчев Л.А., Мамедов М.Д., Семенов А.Ю. (1987) Электрогенез при трансмембранном переносе зарядов в убихинол: цитохром с2-оксидоредуктазном комплексе хроматофоров Rhodopseudomonas sphaeroides. Биологические мембраны, 4, 825-830.

3. Драчев Л.А., Семенов А.Ю., Скулачев В.П. (1979) Генерация разности электрических потенциалов хроматофорами, индуцируемая лазерной вспышкой. Докл. АН СССР, 245, 991-994.

4. Мамедов М.Д., Витухновская Л.А., Заспа А.А., Семенов А.Ю. (2003) Исследование электрогенных реакций в цитохромных b$f комплексах в модельной системе. Биофизика, 44, 1044-1051.

5. Попова Е.Ю., Константинов А.А. (1986) Исследование ориентации комплекса bci в протеолипосомах. Биологические мембраны, 3, 489-497.

6. Скулачев В.П. (1989) Энергетка биологических мембран Москва, «Наука».

7. Allen J.F. (2002) Photosynthesis of ATP electrons, proton pumps, rotors, and poise. Cell, 110, 273-276.

8. Anderson В., Anderson J.M. (1980) Lateral heterogeneity in the distribution of chlorophyll-protein complexes of the thylakoid membranes of spinach chloroplasts. BBA, 593, 427-440.

9. Anion D.I. (1949) Copper enzymes in isolated chloroplasts Polyphenoloxidase in Beta vulgaris. Plant Physiol., 24, 1-15.

10. Barbagallo R.P., Finazzi G., Forti G. (1999) Effects of inhibitors on the activity of the cytochrome b<f complex: evidence for the existence of two binding pockets in the luminal site. Biochemistry, 38, 12814-12821.

11. Bendall D.S., Manasse R.S. (1995) Cyclic photophosphorilation and electron transport. BBA, 1229, 23-38.

12. Bowyer J.R., Trumpower B.L. (1981) Rapid reduction of cytochrome c} in the presence of antimycin and its implication for the mechanism of electron transfer in the cytochrome bcj segment of the mitochondrial respiratory chain. JBC, 256, 2245-2251.

13. Brandt U., Okun J.G. (1997) Role of deprotonation events in ubihydroquinone: cytochrome с oxidoreductase from bovine heart and yeast mitochondria. Biochemistry, 36, 11234-11240.

14. Brandt U., Schagger H., von Jagow G. (1988) Characterisation of binding of the methoxyacrylate inhibitors to mitochondrial cytochrome с reductase. Eur J Biochem, 173, 499-506.

15. Brettel K. (1997) Electron transfer and arrangement of the redox cofactors in PS1. BBA, 1318, 322-373.

16. Brettel K., Leibl W. (2001) Electron transfer in photosystem I. BBA, 1507, 100114.

17. Brettel K., Setif P. (1987) Magnetic field effects on primary reactions in photosystem I. BBA, 893, 109-114.

18. Brettel K., Vos M.H. (1999) Spectroscopic resolution of the picosecond reduction kinetics of the secondary electron acceptor A1 in photosystem I. FEBS letters, 447, 315-317.

19. Breyton C. (2000) Conformational changes in the cytochrome btfcomplex induced by inhibitor binding. JBC, 275, 13195-13201.

20. Breyton C., Tribet C., Olive J., Dubacq J.-P., Potort J.-L. (1997) Dimer to monomer conversion of the cytochrome b<f complex. JBC, 272, 21892-21900.

21. Carrillo N., Vallejos R.H. (1983) The light -dependent modulation of photosynthetic electron-transport. Trends. Biochem Sci., 8, 52-56.

22. Choquet Y., Zito F., Wostrikoff K., Wollman F.-A. (2003) Chytochrome / translation in Chlamydomonas chloroplast is autoregulated by carboxyl-terminal domain. Plant Cell, 15, 1443-1454.

23. Cramer W.A. Girvin M.E., Widger W.R., Mende D., Black M.T. (1987) On the transmembrane electron transport pathway of cytochrome be in progress, in the Photosynthesis Research (Biggins J., ed.) II, 481-484, Martinus Nijhoff, Dordrecht.

24. Crofts A.R., Wraight C.A. (1983) The electrochemical domain of photosynthesis. BBA, 726, 149-185.

25. Crofts A.R. (2004) The cytochrome bc: complex: function in the context of structure. Annu. Rev. Physiol., 66, 689-733.

26. Ding H., Robertson D.E., Daldal F., Dutton P.L. (1992) Cytochrome Ьсг complex 2Fe-2S. cluster and its interaction with ubiquinone and ubihydroquinone at the Q0 Site: a double-occupancy Q0 site model. Biochemistry, 31, 3144-3158.

27. Drachev L.A., Frolov V.N., Kaulen A.D., Kaulen A.D., Ostroumov S.A., Plakunova V.G., Semenov A.Yu., Skulachev V.P. (1976) Reconstitution of biological molecular generators of electric current. Bacteriorodopsin. JBC, 251, 7059-7065.

28. Drachev L.A., Kaulen A.D., Khitrina L.V., Skulachev V.P (1981a), Fast stages of photoelectric processes in biological membranes. I. Bacteriorodopsin. Eur J. Biochem, 117, 461-470.

29. Drepper F., Hippler M., Nitschke W. and Haehnel W. (1996) Binding dynamics and electron transfer between plastocyanin and photosystem I. Biochemistry, 35, 1282-1295.

30. Finazzi G., Rappaport F. (1998) In vivo characterization of the electrochemical proton gradient generated in darkness in green algae and its kinetic effects on cytochrome Z?</turnover. Biochemistry, 37, 9999-10005.

31. Fischer N., Boudreau E., Hippler M., Drepper F., Haehnel W., Rochaix J.D. (1999) A large fraction of Psa F is nonfunctional in photosystem I complexes lacking the Psa J subunit. Biochemistry, 38, 5546-5552.

32. Fischer N., Hippler M., Setif P., Jacquot J.-P., Rochaix J.-D. (1998) The PsaC subunit of photosystem I provides an essential lysine residue for fast electron transfer to ferredoxin. EMBO J., 17, 849-858.

33. Fromme P., Melkozernov A., Jordan P., Kreuss N. (2003) Structure and function of photosystem I: interaction with its soluble electron carriers and external antenna systems. FEBS Letters, 555, 40-44.

34. Furbacher P.N., Girvin M.E., Cramer W.A. (1989) On the question of interheme electron transfer in the chloroplast cytochrome b6 in situ. Biochemistry, 28, 89908998.

35. Garavito R.M., Ferguson-Miller S. (2001) Detergents as tools in membrane biochemistry. JBC, 276, 32403-32406.

36. Georgova- Kuras M., Boudreaux В., Joliot A., Joliot P., Redding K. (2001) Evidence or two active branches for electron transfer in PS1. PNAS USA, 98, 4437-4442.

37. Golbeck J.H., Bryant D.A. (1991) Photosystem I in Carrent topics in bioenegetics, 16, ( Lee C.P. ed), 83-177, Academic Press, Inc. San Diego, New York.

38. Haehnel W., Ratajczak R., Robenek H. (1989) Lateral distribution and diffusion of plastocyanin in chloroplast thylakoids. J. Cell Biol., 108, 1397-1405.

39. Heber U., Gerset U., Krieger A., Neimains S., Kobayashi Y. (1995) Coupled cyclic electron transport in intact chloroplast and leaves of C3 plants. Does it exists? If so what is its function? Photosynth res., 46, 269-275.

40. Hervas M., Navarro F., Navarro J.A., Chavez S., Diaz A., Florencio F.J., De la Rosa M.A. (1993) Synechocystis 6803 plastocyanin isolated from both the cyanobacterium and E. coli transformed cells are identical. FEBS Letters, 319, 257-260.

41. Hippler M., Reichert J., Sutter M., Zak E., Altschmied L., Schroer U., Herrmann R.G., Haehnel W. (1996) The plastocyanin binding domain of photosystem I. EMBO Journal, 15, 6374-6384.

42. Но K.K., Krogmann D.W. (1984) Electron donors to P700 in cyanobacteria and algae. An instance of unusual genetic variability. BBA, 766, 310-316.

43. Но K.K., Ulrich E.L., Krogmann D.W., Gomez-Lojero C. (1979) Isolation of photosynthetic catalysts from cyanobacteria. BBA, 545, 236-248.

44. Hope A.B., Matthews D.B., Huilgol R.R., Panizza M. and Thompson M. (1992) Flash-induced turnover of cytochrome b-563, cytochrome / and plastocyanin in chloroplasts. Models and estimation of kinetic parameters. BBA, 1100, 15-26.

45. Hope A.B., Matthews D.B., Valente P. (1994) The kinetics of the reaction around the cytochrome bf complex studied in a isolated system. Photosynthesis Research, 40, 199-206.

46. Hope A.B. (2000) Electron transfers amongst cytochrome f, plastocyanin and photosystem I: kinetics and mechanisms. BBA, 1456, 5-26.

47. Houchins J.P., Hind G. (1983) Kinetic evidence for involvement of two cytochrome b-563 hemes in photosynthetic electron transport. BBA, 725, 138-145.

48. Huang D., Everly R.M., Cheng R.H., Heymann J.B., Schagger H., Sled V., Ohnishi Т., Baker T.S., Cramer W.A. (1994) Characterization of the chloroplast cytochrome b$f complex as a structural and functional dimmer. Biochemistry, 33, 4401-4409.

49. Hurt E., Hauska G. (1982) Identification of the polypeptides in the cytochrome b$f complex from spinach chloroplasts with redox-center-carrying subunits. J. Bioenerg. Biomembr., 14, 405-424.

50. Illerhaus J., Altschmied L., Reichert J., Zak E., Herrmann R. G., and Haehnel W. (2000) Dynamic interaction of plastocyanin with the cytochrome bf complex. JBC, 275, 17590-17595.

51. Inoue Т., SugawaraH., Hamanaka S., Tsukui H., Suzuki E., Kohzuma Т., Kai Y. (1999) Crystallization and preminary X-ray analysis of the plastocyanin from cyanobacterium Synecchococcus sp. PCC 7942. Acta Crystal (D), 55, 683-684.

52. Iwata S., Lee J.W., Okada K., Lee J.K., Iwata M., Rasmussen В., Link T.A., Ramaswamy S., Jap B.K. (1998) Complete structure of the 11-subunit bovine mitochondrial cytochrome bcj complex. Science, 281, 64-71.

53. Johnson W., Shen G., Zybailov В., Rolling D., Reategui R., Beauperlant S., Vassiliv J., Bryant D., Jonesy A., J. Golbeck, Chitnis P. (2000) Recruitment of a foreign quinone into Aj site of photosystem I. JBC, 275, 8523-8530.

54. Joliot P., Joliot A. (1986) Proton pumping and electron transfer in the cytochrome b<f complex in algae. BBA, 849, 211-222.

55. Joliot P., Joliot A. (1988) The low potential electron transfer chain in cytochrome b$f complex. BBA, 933, 319-333.

56. Joliot P, Joliot A. (1994) Mechanism of electron transfer in the cytochrome b<f complex of algae: evidence for a semiquinone cycle. PNAS USA, 91, 1034-1038.

57. Joliot P., Joliot A. (1998) In vivo analysis of the effect of dicyclohexylcarbodiimide on electron and proton transfer in cytochrome b(f complex of Chlorella sorokiniana. Biochemistry, 37, 10404-10410.

58. Joliot P., Joliot A. (1999) In vivo analysis of the electron transfer within PSI: are the two phyloquinones involved? Biochemistry, 38, 11130-1136.

59. Joliot P., Joliot A. (2001) Electrogenic events associated with electron and proton transfers within the cytochrome b<f complex. BBA, 1503, 369-376.

60. Joliot P., Joliot A. (2002) Cyclic electron transfer in plant leaf. PNAS USA, 99, 10209-102140.

61. Joliot P., Lavergne J., Beal D. (1992) Plastoquinone- compartmentation in chloroplasts 1. Evidence for domains with different rates of photo-reduction, BBA, 1101, 1-12.

62. Jones R.J., Whitmarsh J. (1985) Origin of the electrogenic reactions in the chloroplast cytochrome b<f complex. Potobiochemystry and Potobiophysics, 9, 119-127.

63. Jones R.W., Whitmarsh J. (1987) The electrogenic reaction and proton release during quinol oxidation by the cytochrome b<f complex. Progress in Photosynthesis Research., 2, 445-452, ed. J. Biggins. Martin Nijhoff Publishers, Dordrecht, The Netherlands.

64. Jones R.W., Whitmarsh J. (1988) Inhibition of electron transport and the electrogenic reaction in the cytochrome b<f complex by NQNO and DBMIB. BBA, 933, 258-268.

65. Jordan P., Fromme P., Witt N.T., Klukas O., Saenger W., Krauss H. (2001) Three-demensional structure of cyanobacterial photosystem I at 2.5 A resolution. Nature, 411, 909-917.

66. Kalaidzidis Ya.L., Gavrilov A.V., Zaitsev P.V., Kalaidzidis A.L. and Korolev E.V. (1997) PLUK-An Environment for Software Development. Programming and Computer Software, 23, 206-212.

67. Karapetyan N.V., Holzwarth A.R., Rogner M. (1999) The photosystem I trimer of cyanobacteria: molecular organization, excitation dynamics and physiological significance. FEBS Letters, 460, 395-400.

68. Kim H., Xia D., Yu C.A., Xia J.Z., Kachurin A.M., Zhang L., Yu L., Deisenhofer J. (1998) Inhibitor binding changes domain mobility in the iron-sulfur protein of the mitochondrial bcj complex from bovine heart. PNAS USA, 95, 8026-8033.

69. Knaff D.B. (1996) Ferredoxin and ferredoxin-dependent enzymes, in: D.R. Ort, C. Yocun (Eds) Oxygenic Photosynthesis: The Light Reactions, Kluwer Academic Publishers, Dordercht, 331-336.

70. Kojima Y., Niinomi Y., Tsuboi S., Hiyama Т., Sakurai H. (1987) Destruction of phototsystem I iron-sulfur centers of spinach and Amacystis niduans by mercurials, Bot Mag. Tokyo, 100, 243-253.

71. Konstantinov A.A. (1990) Vectorial electron and proton transfer steps in the cytochrome be, complex. BBA, 1018, 138-141.

72. Kummerle R., Gaillard J., Kyritis P., Moulis J.-M. (2001) Intramolecular electron transfer in 4Fe-4S. proteins: estimates of the reorganization energy and electronic coupling in Chromatium vinosum ferredoxin. J. Biol. Inorg. Chem., 6, 446-451.

73. Kuras R., de Vitry C., Choquet Y., Girard-Bascou J., Culler D., Buschlen S., Merchant S., Wollman F.-A. (1997) Molecular genetic identification of a pathway for heme binding to cytochrome b6. JBC, 272, 32427-32435.

74. Kurisu G., Zhang H., Smith J.L., Cramer W.A. (2003) Structure of the cytochrome b<f complex of oxygenic photosynthesis: turning the cavity. Science, 302, 10091014.

75. Lavergne J. (1983) Membrane potential-dependent reduction reduction of cytochrome b6 in an algalmutant lacking photosystem I centres. BBA, 725, 25-33.

76. Lavergne J., Bouchaud J.-P., Joliot P. (1992) Plastoquinone- compartmentation in chloroplasts. 2. Theoretical aspects. BBA, 1101, 13-22.

77. Leong С., Setif P., Lagoutte В., Bottin H. (1994) Identification of the amino acids involved in the functional interaction between photosystem I and ferredoxin from Synechocystis sp. PCC 6803 by chemical cross-linking. JBC, 269, 10034-10039.

78. Malkin R. (1986) Interaction of stigmatellin and DNP-INT with the Rieske iron-sulfur center of the chloroplast cytochrome b<f complex. FEBS Letters, 208, 317320.

79. Malkin R. (1992) Cytochrome bcj and b<f complexes of photosynthetic membranes. Photosyn. Research., 3, 121-136.

80. Mamedov M.D., Gourovskaya K.N., Vassiliev L.R., Golbeck J.H., Semenov A.Y. (1998) Electrogenicity accompanies photoreduction of the iron-sulfur clusters FA and FB in photosystem I. FEBS Letters, 431, 219-223

81. Mamedov M.D., Gadzhieva R.M., Gourovskaya K.N., Drachev L.A., Semenov A.Yu. (1996) Electrogenicity at the donor/acceptor sides of cyanobacterial photosystem I. J. Bioenerg. Biomembr., 28, 519-523.

82. Mamedov M.D., Mamedova A.A., Chamorovsky S.K., and Semenov A.Yu. (2001) Electrogenic reduction of the primary electron donor P700 by plastocyanin in photosystem I complexes. FEBS Letters, 500, 172-176.

83. Manasse R.S., Bendall D.S. (1994) Characteristcs of cyclic electron transport in the cyanobacterium Phormidium laaminosum. BBA, 1183, 361-368.

84. Martinez S.E., Huang D., Ponamarev M.V., Cramer W.A., Smith J.L. (1996) The heme redox centre of chloroplast cyt/is linked to buried five- water chain. Protein Science, 5, 1081-1092.

85. Medina M., Diaz A., Hervas M., Navarro J.A., Gomez-Moreno C., De la Rosa M.A., Tollin G. (1993) A comparative laser-flash absorption spectroscopy study of

86. Anabaena PCC 7119 plastocyanin and cytochrome сб photooxidation by photosystem I particles. Eur. J. Biochem., 213, 1133-1138.

87. Metzger S.U., Cramer W.A., Whitmarsh J. (1997) Critical analysis of the extinction coefficient of chloroplast cytochrome f. BBA, 1319, 233-241.

88. Mitchell P. (1975) The protonmotive Q cycle: a general formulation. FEBS Letters, 57, 137-139.

89. Morand L.Z., Krogmann D.W. (1993) Large-scale preparation of pure plastocyanin from spinach. BBA, 1141, 105-106.

90. Musiani F., Dikiy A., Semenov A.Yu, Ciurli S. (2005) Structure of the intermolecular complex between plastocyanin and cytochrome / from spinach. JBC, 280, 18833-18841.

91. Myshkin E., Leontis N.B., and Bullerjahn G.S. (2002) Computational simulation of the docking of Prochlorothrix plastocyanin to photosystem I: modeling the electron transfer complex. Biophys. J., 82, 3305-3313.

92. Overfiel R. E., Wraight C. A. (1980) Oxidation of cytochromes с and by bacterial photosynthetic reaction centers in phospholipid vesicles. 1. Studies with neutral membranes. Biochemistry, 19, 3322-3327.

93. Papa S., Izzo G., Guerrieri F. (1982) The inhibition of the bcj segment on the mitochondrial respiratory chain by quinone analogues and hydroxyquinoline derivatives. FEBS Letters, 145, 93-98.

94. Peschek G.A. (1987) Respiratory electron Transport, in The Cyanobacteria (Fay, P., and Van Baalen, C., Eds.), pp.119-161, Elsevier, Amsterdam, The Netherlands: Schmetterer G.

95. Pierre Y., Breyton C., Kramer D., Popot J.L. (1995) Purification and characterization of the cytochrome b$f complex from Chlamydomonas reinhardtii. JBC, 270, 29342-29349.

96. Pierre Y., Breyton C., Lemoine Y., Robert В., Vernotte C., Popot J.L. (1997) On the presence and role of a molecule of chlorophyll a in the cytochrome b$f complex. JBC, 272, 21901 -21908.

97. Ponamarev M.V., Cramer W.A. (1998) Perturbation of the integral water chain in cytochrome / of oxygebic photosynthesis: loss of the concerted reduction of cytochromes/and b6. Biochemistry, 37, 17199-17208.

98. Prince R.G., Matsuura K., Hurt E., Hauska G., Dutton P. L. (1982) Reduction of cytochrome bg and / in isolated plastoquinol-plastocyanin oxidoreductase driven by photochemical reaction centers from Rhodopseudomonas sphaeroidas. JBC, 257,3379-3381.

99. Ramshaw J., Brown R., Scawen M., Boulter D. (1973) Higher plant plastocyanin. BBA, 303, 269-273.

100. Rich P.R. (1984) Electron and proton transfers through quinones and cytochrome be complexes. BBA, 768, 53-79.

101. Rich P.R., Heathcote P., Moss D.A. (1987) Kinetic studies of electron transfer in a hybrid system constructed from the cytochrome b$f complex and photosystem I. BBA, 892, 138-151.

102. Rich P.R., Madgwick S.A., Brown S., von Jagow G. and Brandt U. (1992) MOA-stilbene a new tool for investigation of the chloroplast cytochrome b(f complex. Photosynth Res., 34, 465-477.

103. Rich P.R., Madgwick S.A., Moss D.A. (1991) The interactions of duroquinol, DBMIB and NQNO with the chloroplast cytochrome b<f complex. BBA, 1058, 312-328.

104. Rippka R., Derulles J., Waterbury J.B., Herdman M., Stanier R.Y. (1979) Generic assignments, strain histories and properties of pure cultures of cyanobacteria. J. Gen. Microbiol., 181, 1-60.

105. Roberts A.G., Bowman M.K., Kramer D.M. (2002) Certain metal ions are inhibitors of cytochrome b$f complex 'Rieske' iron-sulfur protein domain movements. Biochemistry, 41, 4070-4079.

106. Robertson D.E., Dutton P.L. (1988) The nature and magnitude of the charge-separation reactions of ubiquinol cytochrome c2 oxidoreductase. BBA, 935, 273291.

107. Rutherford A.W., Boussac A. and Faller P. (2004) The stable tyrosyl radical in photosystem II: why D? BBA, 1655, 222-230.

108. Salamon Z., Huang D., Cramer W.A., Tollin G. (1998) Coupled plasmon-waveguide resonance spectroscopy studies of the cytochrome 6(j/7plastocyanin system in supported lipid bilayer membranes. Biophys J., 75, 1874-1885.

109. Savikhin S., Xu W., Chitnis P.R., Struve W.S. (2000) Ultrafast primary processes in PS I from Synechocystis sp. PCC 6803: roles of P700 and A0. Biophys. J., 79, pp 1573-1586.

110. Sazanov L.A., Burrows P.A., Nixon P.J. (1998) The plastid ndh genes for an NADH-specific dehydrogenase: isolation of a complex 1 analogue from pea thylakoid membranes. PNAS USA, 95, 1319-1324.

111. Scheller H.V., Jensen P.E., Haldrup A., Lunde C., Knoetzel J. (2001) Role of subunits in eukaryotic Photosystem I. BBA, 1507, 40-60.

112. Schmetterer G. (1994) Cyanobacterial respiration in The Molecular Biology of Cyanobacteria (Bryant, D.A., Ed.), pp.409-435, Kluwer, Dordrecht, The Netherlands.

113. Schoepp В., Brugna M., Riedel A., Nitschke W., Kramer D.M. (1999) The Q0-site inhibitor DBMIB favours the proximal position of the chloroplast Rieske protein and induces a pK-shift of the redox-linked proton. FEBS Letters, 450, 245-250.

114. Selak M.A., Whitmarsh J. (1982) Kinetics of the electrogenic step and cytochrome be and/redox changes in chloroplasts: Evidence for a Q-cycle. FEBS Letters, 150, 286-292.

115. Semenov A.Yu. (1993) Electrogenic steps during electron transfer via the cytochrome bcj complex of Rhodobacter sphaeroides chromatophores. FEBS Letters, 321, 1-5.

116. Sigfridsson K., Hansson O. and Brzezinski P. (1995) Electrogenic light reactions in photosystem I: resolution of electron-transfer rates between the iron -sulfur centers. PNAS USA, 92, 3458-3462.

117. Setif P. (1992) Energy transfer and trapping in photosystem I. in the Photosystems: structure, Function and Molecular Biology (Barber, J. Ed), 471-499, Elsevier Science Publishers, Amsterdam

118. Setif P., Bottin H. (1989) Identification of electron-transfer reactions involving the acceptor Aj of photosystem I at room temperature. Biochemistry, 28, 2689-2697.

119. Setif P., Bottin H. (1994) Lazer flash absorption spectroscopy study of ferredoxin reduction by photosystem I in Synechocystis sp PCC 6803: evidence for submicrosecond and microsecond kinetics. Biochemistry, 33, 8495-8504.

120. Setif P., Brettel K. (1993) Forward electron transfer from phylloquinone Aj to iron sulfur centers in spinach PS 1. Biochemistry, 32, 7846-7854.

121. Shen G., Zhao J., Reimer S, Antonkine M., Cai Q., Weiland S.W., Golbeck J.H., Bryant D.A. (2002) Assembly of photosystem I. JBC, 277, 20343-20354.

122. Shinkarev V.P., Ugulava N.B., Crofts A.R., Wraight C.A. (2000) DCCD inhibits the reactions of the iron-sulfur protein in Rhodobacter sphaeroides. Biochemistry, 39, 16206-16212.

123. Sommer F., Drepper F., Hippler M. (2002) The luminal helix 1 of PsaB is essential for recognition of plastocyanin or cytochrome c6 and fast electron transfer to photosystem I in Chlamydomonas reinhardtii. JBC, 277, 6573-6581.

124. Soriano G., Cramer W.A. (2001) Deuterium kinetic isotope effects in the p-side pathway for quinol oxidation by the cytochrome complex. Biochemistry, 40, 15109-15116.

125. Stroebel D., Choquet Y., Popot J.L., Picot D. (2003) An atypical haem in the cytochrome b<f complex. Nature, 426, 413-418.

126. Sykes G.A., Rogers L.J. (1984) Redox potentials of algal and cyanobacterial flavodoxins. Biochem. J., 44, 845-850.

127. Trebst A. (1980) Inhibitors in electron flow: tools for the functional and structural localization of carriers and energy conservation sites. Methods Enzymol., 69, 675715.

128. Trubitsin B.V., Mamedov M.D., Vitukhnovskaya L.A., Semenov A.Yu. and Tikhonov A.N. (2003) EPR study of light-induced regulation of photosynthetic electron transport in Synechocystis sp. strain PCC 6803. FEBS Letters, 544, 15-20.

129. Turro N.J. (1966) Triplet-triplet excitation transfer in fluid solution: applications to organic chemistry. J. Chem. Ed., 43, 13.

130. Ubbink M. (2004) Complexes of photosynthetic redox proteins studied by NMR Photosynt. Res., 81, 277-287.

131. Vallon О., Bulte L., Dainse P., Olive J., Bassi R., Wollman F.-A. (1991) Lateral redistribution of cytochrome btf complexes along thylakoid membranes upon state transitions. PNAS USA, 88, 8262-8266.

132. Vasiliev I.R., Jung Y.S. Mamedov M.D., Semenov A.Yu and Golbeck J.H. (1997) Near -IR absorbance changes and electorn reactions in the microsecond -to-second time domain in photosystem I. Biophys. J., 72, 301-315.

133. Vassiliev I.R, Jung Y.S., Yang F., Golbeck J.H. (1998) Psa С subunit of photosystem I is oriented with iron-sulfur cluster FB as the immediate electron donor to ferredoxin and flavodoxin. Biophys. J., 74, 2029-2035.

134. Vassiliev I.R., Antonkine M.L., Golbeck J.H. (2001) Iron -sulfur clusters in type I reaction centre. BBA, 1507, 139-160.

135. Von Jagow G., Link T.A. (1986) Use of specific inhibitors on the mitochondrial bei complex. Methods Enzymol, 126, 253-271.

136. Wang Y„ Beattie D.S. (1991) DCCD binds to cytochrome b6 of a cytochrome b<f complex isolated from spinach chloroplasts and inhibits proton translocation. Arch. Biochem. Biophys., 291, 363-370.

137. Webber A.N., Lubitz W. (2001) P700: the primary electron donor of photosystem I. BBA, 1507, 61-79.

138. Wikstrom M. and Krab К. (1986) The semiquinone cycle: a hypothesis of electron transfer and proton translocation in cytochrome be-type complexes. J. Bioenerg. Biomembr., 18, 181-193.

139. Xia D., Yu C.A., Kim H., Xia J.Z., Kachurin A.M., Zhang L., Yu L., Deisenhofer J. (1997) Crystal structure of the cytochrome bci complex from bovine heart mitochondria. Science, 277, 60-66.

140. Xu Q., Yu L., Chitnis V.P., Chitnis P.R. (1994) Function and organization of photosystem I in a cyanobacterial mutant strain that lacks Psa F and Psa J subunits. JBC, 269, 3205-3211.

141. Xue Y. F., Okvist M., Hansson O., Young S. (1998) Crystal structure of spinach plastocyanin at 1,7 A resolution. Protein Sci., 7, 2099-2105.

142. Young S., Sigfridsson K., Olesen K., Hansoon O. (1997) The involvement of the two acidic patches of spinach plastocyanin in the reaction with photosystem I. BBA, 1322, 106-114.

143. Zhang Z., Huang L., Shulmeister V.M., Chi Y.I., Kim K.K., Hung L.W., Crofts A.R., Berry E.A., Kim S.H. (1998) Electron transfer by domain movement in cytochrome bcj Nature, 392, 677-684.

144. Zhang H., Huang D., Cramer W.A. (1999) Stichiometrically bound P carotene in the cytochrome btf complex of oxygenic photosynthesis protects against oxygen damage. JBC, 274, 1581- 1587.